STING

摘要：近几十年来，疫苗一直是预防病原体传播和癌症的非凡资源。即使它们可以由单一抗原形成，但添加一个或多个佐剂是增强免疫信号对抗原反应的关键，从而加速并增加保护效果的持续时间和效力。它们的使用对于脆弱人群，如老年人或免疫功能低下的人尤其重要。尽管佐剂非常重要，但只是在过去的四十年里，对新型佐剂的寻找才有所增加，发现了新的免疫增强剂和免疫调节剂类别。由于涉及免疫信号激活的级联反应的复杂性，它们的作用机制仍然不甚了解，即使得益于重组技术和代谢组学，最近已经取得了显著的发现。本综述着重于研究中的佐剂类别、近期作用机制研究，以及纳米输送系统和可以化学操纵以创造新型小分子佐剂的新型佐剂类别。 1.引言 佐剂——根据该词的拉丁语词源（adjuvare，意为“帮助”）——被定义为添加到疫苗中以增强免疫系统对抗原的反应并延长其持续时间的物质。在疫苗开发中使用佐剂利用了这些物质可以提供的许多好处，例如减少每次接种剂量所需的抗原量和加强接种的频率，或通过延长其半衰期改善抗原成分的稳定性，从而增强其免疫原性。佐剂可以根据其作用机制、化学性质或来源（合成、天然、内源性）进行分类。佐剂超级家族包括许多不同的物质，特别是能够激活或增强免疫信号或传递系统的小分子或大分子。免疫增强剂是能够在成人或脆弱人群中激活免疫信号的化合物；其中包括模式识别受体（PRRs）的激动剂，如RIG-I样受体（RLR）、干扰素基因（STING）、Toll样受体（TLR）和NOD样受体（NLRs）。传递系统是能够改善和延长疫苗保护的佐剂，如乳液和纳米制剂，类似于脂质体、病毒样颗粒和病毒体。根据所需的免疫反应类型，抗原应与适当的佐剂或佐剂组合正确配制，以获得尽可能少的副作用的最佳反应。到目前为止，已经开发出适当的配方，特别是通过结合不同的佐剂家族，尤其是铝盐与脂质体或乳液。确定适当的佐剂组合可能极为重要，目前许多临床研究正在进行中，以研究它们在不同病理情况下的疗效，特别是在癌症方面。由于佐剂的应用范围从病原体到过敏、自身免疫性疾病和癌症，需要正确理解关键机制，以便只针对特定途径，避免潜在的毒性。即使疫苗试验遵循严格的指导方针，多年来也出现了许多关于其安全性的担忧，特别是在COVID-19疫苗接种活动期间。疫苗的潜在毒性有时归因于所含佐剂。最近还对最成熟和最安全的佐剂，如铝衍生物的潜在毒性表示担忧。即使铝含量在许可的佐剂中每剂从0.8到0.125毫克不等，但近年来出现了关于神经毒性和自闭症的担忧。相比之下，其他研究表明铝的神经毒性是在长期服用后发生的，监管机构将铝在食品中的可容忍周摄入量（TWI）限制在每公斤体重1毫克。有趣的是，有时佐剂由脂质构成，如纳米制剂的脂质体，或其他内源性无风险大分子。EMA和FDA已经批准了47种疫苗，但这些制剂中包含的大多数佐剂是最早的铝佐剂类成员，或脂质体制剂。这种选择可能是由于这些佐剂类的已知耐受性，以及寻找新化合物的相关成本。事实上，近年来发现了不同类别的小分子免疫增强剂；然而，与药物一样，这些化合物需要适当的、耗时的临床前和临床试验来评估它们的疗效和安全性。在最近和最有趣的类别中，报告了几种PRR激动剂，对成人群体具有有希望的结果。最近的研究表明，能够通过线粒体应激途径激活免疫反应的小分子具有通过PRR途径激活免疫反应的效力。本综述着重于作用机制，开发的佐剂类别，特别强调可以针对的新的途径，以创建新的佐剂。 2.佐剂作用机制 尽管佐剂通常用于数十亿剂疫苗的配方中，但其作用机制仍然不甚了解。因此，深入理解作用方式和参与免疫系统对病原体反应的免疫机制是开发新佐剂的关键步骤。最近，人们非常关注更深入地理解疫苗佐剂如何刺激免疫反应。由于最近在免疫学研究方面的进展，已经有可能阐明佐剂作用的一些机制，如储存效应和细胞因子和趋化因子的释放，免疫细胞在注射部位的动员，适应性免疫反应的诱导，增加抗原免疫原性，以及抗原呈递细胞（APCs）的激活。阐明佐剂发挥作用的所有机制将提供关于自适应免疫如何由先天免疫促进的关键信息，并有助于开发新的强效疫苗。可以使用广泛因素对佐剂进行分类，包括它们的物理化学特性、起源和作用模式；最受欢迎的分类方案将疫苗佐剂分为两组，传递系统和免疫刺激剂。另一类佐剂由粘膜佐剂组成，可以作为传递载体或免疫刺激化合物，如壳聚糖及其衍生物（N-三甲基和单-N-羧甲基壳聚糖）、霍乱毒素（CT）和热敏肠毒素（LTK3和LTR72）。表1中报告了新的传递系统佐剂。传统上，传递载体仅作为免疫刺激佐剂的储存库，以激活先天免疫系统的细胞。由于现在有证据表明一些传递机制可以激活先天免疫，这种分类不再准确。事实上，传递载体佐剂既作为抗原载体，又通过激活先天免疫系统引起局部促炎反应，导致免疫细胞被招募到注射部位。抗原-佐剂复合物通过作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRR）途径。这些现象导致先天免疫细胞的激活，导致细胞因子和趋化因子的释放，这是免疫增强剂佐剂利用的相同作用模式。免疫佐剂（表1）是通过直接刺激先天免疫系统来增强抗体产生的免疫增强剂化合物。此外，作为免疫调节剂的佐剂可以刺激特定类型的细胞因子的产生，从而增强免疫系统的反应。例如，铝盐、弗氏佐剂和CpG寡脱氧核苷酸已被报道能够诱导产生和释放一些参与调节先天和适应性免疫的细胞因子，如干扰素（IFNs）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素（IL2和IL12）。已有几种细胞因子被报道作为免疫增强剂佐剂，刺激抗原特异性血清/粘膜抗体和细胞介导的免疫。在这类物质中，最知名的细胞因子佐剂是粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IFN、趋化因子和一些白细胞介素（IL-1, IL-2, IL-12-IL-15, IL-18）[15]。此外，免疫刺激剂对于招募免疫细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞（DCs））、激活APCs以及疫苗在注射部位的长期积累非常有用。最近的研究将Toll样受体（TLR）与自身免疫系统联系起来，发现了TLR激活先天免疫系统导致适应性免疫和炎症反应诱导的机制，确保了持久保护。 佐剂可以作为传递系统，捕获、吸附或聚集抗原，并随时间缓慢释放它们。这种被称为"贮存效应"（图1a）的机制发生在注射部位，佐剂通过防止由于肝脏清除导致的抗原移除，增强了疫苗的半衰期，并确保了免疫系统的持续刺激，从而产生高抗体滴度。多年来，许多通过贮存效应发挥作用的佐剂被描述出来，如脂质体、乳液（油包水和水包油）、病毒体，以及脂质或聚合物纳米颗粒（NPs）。其中一些已被开发来模拟病原体膜，以运输、保存和释放抗原，并同时增强其免疫原性功能。几种类型的脂质体，如传统的脂质体、多层囊泡（MLVs）或固体核心脂质体，也通过促进贮存效应发挥作用。油包水乳液，如完全弗氏佐剂（CFA），以及一些NPs也通过确保持久免疫反应的贮存效应发挥作用。 图1. (a) 贮存效应及细胞因子和趋化因子的募集。(b) 免疫细胞的募集和炎症体的激活。 颗粒佐剂可以通过利用几种机制诱导免疫反应，例如上调细胞因子和趋化因子的释放，诱导注射部位的炎症状态，激活炎症级联反应，并招募先天免疫细胞。例如，油包水（o/w）乳液MF59和AS03刺激免疫细胞（中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞）的募集，这些细胞将抗原和佐剂运输到更接近的淋巴结。免疫细胞在注射部位的募集诱导半胱氨酸蛋白酶的激活，导致进一步释放趋化因子（IL-18、IL-33、IL-1β），吸引其他树突细胞并延长这一现象（图1b）。此外，MF59和AS03在注射部位增加了CCR2、白细胞募集趋化因子（例如CCL2、CCL3和CCL5）以及集落刺激因子3（CSF3）的表达。同样，明矾在注射后诱导局部促炎微环境，引发补体级联反应，导致从血液流中招募免疫细胞。炎症体是先天免疫系统的重要组成部分。它们是针对病原体的有效免疫反应所必需的。当炎症体被激活时，细胞分泌促炎细胞因子，如IL-18、IL-33和IL-1β，这些细胞因子增强适应性免疫反应（图1b）。炎症体是由工作成分组成的细胞质蛋白信号通路，如富含亮氨酸的重复（LRR）C末端或DNA结合域（HIN200）、caspase-1效应物和适配蛋白ASC，这些蛋白激活炎症caspases。粒细胞、T细胞和B细胞、单核细胞、肝细胞、神经元、小胶质细胞和朗格汉斯细胞都表达炎症体，负责识别病原体并启动先天免疫反应。当炎症体被激活时，它蛋白水解裂解前caspase 1，释放活性形式，将前IL-1β和前IL-18转化为活性物种。ILs从细胞释放后，启动炎症并诱导保护免受病原体侵害的免疫反应。此外，IL-18激活淋巴细胞并刺激T细胞和B细胞的增殖，自然杀伤细胞（NKs）的活性，以及IFN-γ、TNF、IL-1和IL-2的分泌。因此，作为炎症体激活剂的佐剂是增强和维持免疫反应强度的成功策略。这些佐剂通过类似的机制激活炎症体，包括溶酶体降解、cathepsin释放和活性氧（ROS）的形成。在炎症体激活剂中，可以找到如铝盐、壳聚糖、皂素、鞭毛蛋白和合成阳离子聚合物等佐剂。铝盐诱导溶酶体损伤，诱导参与炎症体形成的cathepsin B的产生，特别是NOD样受体蛋白3（NLRP3）；活性炎症体触发caspase-1并刺激细胞因子的释放。壳聚糖和由合成阳离子聚合物制成的纳米颗粒激活NLRP3炎症体，并增强多种白细胞介素（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A和TNF）、IFN和IgG滴度的分泌，增强细胞和体液免疫反应。 佐剂可以通过一系列机制增强疫苗的免疫反应，如贮存效应和刺激先天免疫。先天免疫代表了针对病原体的第一道防线。事实上，早期识别病原体是发展适应性免疫反应的关键步骤。佐剂可以通过激活细胞模式识别受体（PRRs），识别PAMPs和损伤相关分子模式（DAMPs），刺激抗原呈递细胞（APCs）。由于在先天免疫系统中的中心作用，PRRs代表了新佐剂的战略目标。在PRRs超家族中，区分为表面和内体受体的Toll样受体（TLRs）是很有前途的佐剂目标，因为它们可以诱导信号通路，从而诱导关键转录因子的产生，如核因子-B（NF-B）。佐剂也可以用于靶向内体PRRs，如寡聚化结构域样受体（NLRs）和视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）（图2a）。定位与它们的性质密切相关；事实上，血浆TLR识别病原体蛋白和脂质，而内体受体则由核酸激活。TLR通过MyD88途径诱导NF-kB，导致促炎细胞因子的释放。基于TLR的佐剂复制了感染期间产生的PAMPs，因此可以非常有效地对抗通常诱导PRRs的病原体或疾病。尽管PRR激动剂具有出色的免疫刺激性效果，但它们作为疫苗佐剂的使用受到高制造成本的限制，这代表了未来临床应用的限制。APCs，如树突细胞（DCs），表达各种PRRs，使它们能够识别多种病原体成分。当PRRs被PAMPs激活时，它们启动复杂的信号级联反应，导致细胞因子和趋化因子的产生，包括干扰素（IFNs），增强抗原呈递能力，以及DCs向淋巴组织的迁移，在那里它们与T细胞和B淋巴细胞相互作用，启动和塑造适应性免疫反应。成熟的DCs也可以刺激naive CD4+ T细胞分化为不同的T辅助（Th）亚群（例如，Th1和Th2细胞），帮助B细胞产生抗体。几种细胞因子调节Th细胞分化；例如，如IL-12、IL-15和IL-27等细胞因子调节naive CD4+ T淋巴细胞向Th1细胞的发展。总之，Th1细胞主要响应于细胞内病原体，如病毒和一些细菌，而Th2细胞主要响应于大型细胞外寄生虫。DCs还能够刺激naive细胞毒性CD8+ T细胞成为活化的CD8+ T细胞。这种现象称为“交叉呈递”，对于诱导针对外源性抗原的强大和持久的细胞免疫，以及有效预防病毒疾病和癌症是必要的。目前尚不清楚外源性抗原是如何在DCs中处理并呈现给MHCI上的CD8+ T淋巴细胞的；然而，已经提出了两种不同的机制。在细胞质途径中，抗原通过内体囊泡进入细胞质，并被蛋白酶体降解。在囊泡途径中，抗原在溶酶体隔室中被降解，独立于蛋白酶体活性。铝、皂素和TLR佐剂可以利用这种机制。 图2. (a) 表面和内体 TLR 激活。(b) 增强抗原呈递。由主要组织相容性复合物（MHC）在抗原呈递细胞（APCs）上呈递的抗原，是激活适应性免疫的关键步骤。许多佐剂，如明矾、乳液和纳米颗粒（NPs），被认为通过"靶向"抗原到APCs，增强MHC的抗原呈递功能。迄今为止，尚不清楚佐剂增加抗原呈递的机制是否有助于适应性免疫系统的发展。例如，明矾已被证明可以增强树突细胞对抗原的摄取，以及延长抗原呈递的持续时间。抗原大小似乎在调节抗原呈递效率方面很重要。在早期内体/吞噬体中发现了大的脂质囊泡，它们增加了抗原呈递，而在晚期溶酶体中发现了较小的囊泡，它们减少了抗原呈递。 3.佐剂类型  3.1.铝盐  基于铝的佐剂（ABA）最早发现于1926年，目前是全球疫苗中最常用的佐剂。最初使用的铝佐剂是硫酸铝钾，通常称为"明矾"，通过将抗原溶液和佐剂与碱直接沉淀制备而成（明矾沉淀疫苗）。今天，抗原被吸附到预先形成的铝盐凝胶上（直接吸附），在商业制剂的标准化和可重复性方面提供了更多的优势。目前，传统使用的明矾几乎完全被类氢氧化铝（Alhydrogel?，Croda，丹麦Frederikssund）和非晶磷酸铝（AdjuPhos?，Croda，丹麦Frederikssund）所取代。两种新型佐剂是硫酸铝羟磷酸盐（AAHS），目前用于某些人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗的配方和Imject? Alum（Pierce，Rockford，美国），由非晶碳酸铝和结晶氧化镁组成。在人类疫苗接种中，ABA主要用于针对破伤风、白喉、百日咳、脊髓灰质炎、甲型和乙型肝炎以及人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗。FDA批准的含有ABA的人类疫苗列表见表2。ABA也在兽医疫苗中广泛应用，用于预防细菌、病毒和寄生虫感染。 尽管使用历史悠久，但关于ABA（铝盐佐剂）免疫刺激特性背后的机制仍需进一步阐明。最初，ABA的佐剂特性首先归因于"贮存效应"。根据这一假设，抗原颗粒从不溶性盐颗粒中缓慢释放到体内，随着时间的推移，允许抗原对免疫系统的长期暴露和强化的免疫刺激，从而产生更高的抗体滴度。然而，最近的发现挑战了这一理论，证明抗原在接种部位的保留并不是免疫反应所必需的，而是接种部位炎症的程度才是佐剂效应的解释。因此，除了作为缓释系统外，ABA对免疫刺激还有其他主要影响，如先天免疫细胞的募集和激活、炎症介质的释放以及通过诱导Th2细胞激活适应性免疫。 给药后，先天炎症细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞（DC）和单核细胞，被招募到注射部位。尽管许多免疫佐剂的活性基于Toll样受体（TLR）信号，但铝盐显然不引起基于TLR的反应。与在细胞损伤后释放到细胞质中的不溶性单体尿酸钠（MSU）晶体的尿酸类似，已经显示ABA的颗粒性质促进了巨噬细胞的吞噬作用和APCs中抗原的摄取。此外，ABA的细胞毒性诱导了热休克蛋白（如hsp70）和其他DAMPs（如MSU形式的尿酸）的分泌。NLR家族含吡啉结构域3（NLRP3）是核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族（NLR）的成员，是一种细胞质模式识别受体（PRR），在调节先天免疫信号中起着至关重要的作用。NLRP3通过钾离子外流激活，作为膜完整性的感应器。当被ATP、石棉、硅石、铝佐剂或MSU等刺激触发时，NLRP3与适配蛋白凋亡相关斑点蛋白含有CARD（ASC）和非活性前caspase-1结合形成NLRP3炎症体多聚体复合物。前caspase-1的自蛋白解剪切为活性caspase-1，将促炎细胞因子前体pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-IL-33裂解为它们的活性和分泌形式。有假设认为，铝盐可能通过直接方式激活NLRP3炎症体，通过吞噬溶酶体损伤和随后的cathepsin B释放，或者通过MSU的间接释放。除了NLRP3介导的炎症外，哨兵细胞极化为活跃的巨噬细胞和APCs，增加了吞噬体活性氧物种（ROS）的产生，吞噬体酸化干扰和通过低氧诱导转录因子-1α（HIF-1α）的细胞代谢重编程，是最近揭示的对ABA免疫刺激特性有贡献的其他机制（图3）。 图 3. 基于铝的佐剂（ABA）的效果。 哨兵细胞激活为抗原呈递细胞（APCs）对适应性反应至关重要，从而将先天免疫与适应性免疫联系起来。ABA通过主要组织相容性复合体II类（MHCII）分子增加活化树突细胞上的抗原呈递。MHCII抗原呈递位点激活CD4+ T细胞，这些细胞分化并激活B细胞，进而主要产生IgG，推动体液免疫。铝盐优先增强抗体介导的免疫反应，通过TFH细胞和IL-4信号，结果产生IgG1并诱导Th2细胞分化，这些细胞通过IgE推动嗜酸性粒细胞炎症反应。与强烈的Th2反应相比，明矾对需要Th1细胞介导保护的感染效果较差。在小鼠研究中，已证明明矾间接抑制Th1反应，原因是IL-4激活。通过Th1反应产生的淋巴因子是补体固定IgG2a抗体的基本诱导因子，因此是巨噬细胞的刺激因子。此外，先天免疫系统的细胞可以发展适应性特性（“训练免疫”），并且铝佐剂可能涉及训练免疫的诱导。然而，NLRP3炎症体和caspase-1在抗体反应诱导中的作用仍然存在争议。经过近一个世纪的使用，铝盐仍然是疫苗佐剂的里程碑，因为它们具有确立的安全性和有效性记录。ABA非常耐受，并且仅报告了一些轻微的局部反应，如注射部位疼痛、肿胀、红斑，以及罕见的肉芽肿和过敏反应，这些反映了它们通过炎症体激活、促炎介质、吞噬细胞积累和抗体产生的作用模式。在一些免疫接种对象中还描述了接触性皮炎的罕见病例，注射后头痛、关节痛和肌痛以及持续性肿胀。有关铝佐剂长期毒性的辩论引起了广泛关注，包括如阿尔茨海默病（AD）、慢性自身免疫和多发性硬化症等影响。由佐剂引起的自身免疫综合征（ASIA）指的是一组不良效应，包括海湾战争综合征、巨噬细胞性肌筋膜炎、硅肺症和与佐剂暴露相关的接种后现象。此外，由于铝离子在AD的发病机制中被牵连，人们对ABA的生物持久性和潜在神经毒性提出了担忧，但这种相关性从未被证明。尽管需要进一步的知识来更新和确认ABA的安全概况，但作为佐剂的铝盐的风险-效益概况仍然极其积极，并确认它们作为疫苗佐剂的黄金标准。 3.2.STING激动剂佐剂 环状GMP-AMP合酶/干扰素基因刺激因子（cGAS/STING）途径是先天免疫系统胞质模式识别受体（PRRs）网络的一部分，监测细胞质以感知危险刺激。途径的刺激激活下游的核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子3（IRF3），增加I型干扰素（IFN-1）和其他促炎细胞因子的转录，从而增强抗原呈递和免疫反应。cGAS/STING在免疫调节中的关键作用使其成为免疫疗法的重要靶点，特别是与癌症相关的，并且是使用STING激动剂作为有前途的疫苗佐剂的理由。STING激动剂（图4）主要在肿瘤学和病毒学中应用，包括环状二核苷酸（CDNs）、非核苷小分子（NCDNs）、胞质双链DNA（dsDNA）、锰离子、可电离脂质和聚合物。如20,3-环状鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）、环状二聚鸟苷酸（c-di-GMP）或环状二聚腺苷酸（c-di-AMP）等环状二核苷酸是途径的天然激动剂，但它们由于高极性和由于外切核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ENPP1）酶降解导致的短半衰期，其药代动力学（PK）特性较差，大大限制了它们的使用。为了改善环状二核苷酸的PK特性，已经测试了如ADU-S100的磷酸衍生物，ENPP1抑制剂也是一个有前途的新策略。为了选择活性更好的候选物，寻找模仿CDNs和STING结合构象的刚性类似物的研究导致了一类新的激动剂，即大环桥接刺激剂（MBS），如E7766。为了克服环状二核苷酸的PK限制，研究还集中在NCDNs上，如黄酮类5,6-二甲基黄酮-4-乙酸（DMXAA）和α-芒果苷，以及二聚酰胺苯并咪唑（diABZI）衍生物，这些在肿瘤免疫疗法和针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）方面取得了有希望的结果。 图 4. 小分子STING激动剂的二维结构 作为触发STING途径的一种方式，诱导细胞质双链DNA (dsDNA) 释放的策略也被采用，例如使用放疗、基于明矾的佐剂，以及化疗药物，如顺铂或多柔比星。无机锰被发现能激活cGAS，并通过增强第二信使cGAMP的产生，充当STING的间接激动剂。在其他激动剂类别中，我们列举了聚合物，如壳聚糖或PC7A，以及基于纳米粒子的可电离脂质。目前在临床试验中的STING激动剂总结在表3中。 cGAS/STING信号的触发因素是细胞质dsDNA，这是细胞损伤的重要标志。因此，cGAS作为直接的DNA受体，催化dsDNA转化为第二信使cGAMP，这诱导了STING的激活和寡聚化。STING寡聚体激活TANK结合激酶1 (TBK1)，它招募IRF3并通过NF-κB诱导I型干扰素刺激基因的转录。下游自噬的诱导和NLRP3炎症体的激活增加了病原体清除，并在自身免疫和炎症性疾病、衰老以及与肿瘤相关的炎症中具有重要意义。STING激动剂通常与环状二核苷酸有关，如cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP，它们作为各种微生物的代谢产物被发现。 STING途径的激动剂能直接诱导树突细胞的成熟和MHCII分子的上调，增加抗原呈递、T细胞的启动，并通过炎症细胞因子间接促进前述效应。STING激动剂还增强适应性免疫反应，通过IgG1和IgG2的产生、脾脏生发中心的诱导以及记忆B细胞的刺激来增强体液免疫。此外，I型干扰素诱导CD4 T细胞分化为Th1和TFH细胞，显著帮助B细胞的启动，也促进CD8 T细胞的激活和增殖，这对抗击耐药肿瘤细胞很重要。通过STING刺激协调的多种免疫反应使得这一途径成为免疫疗法的一个有吸引力的靶点。尽管cGAS/STING的急性激活无疑对病原体和癌细胞有益处，但慢性激活可能导致由IFN驱动的系统性炎症，引发细胞因子风暴（细胞因子释放综合征），类似于败血症。除了可能诱发系统性炎症反应外，STING过度刺激引起的其他主要问题包括缺乏细胞和组织特异性以及淋巴细胞毒性。这些前提，加上具有挑战性的药代动力学特性，使得STING激动剂的全身给药情况复杂化，它们通常在肿瘤内给药。使用药物载体技术，如纳米粒子、基于脂质的载体和抗体至关重要，以实现更选择性的靶向，结合改善的传递和功效。尽管它们的药代动力学具有挑战性，且全身使用的疗效指数较窄，STING激动剂代表了一个非常有前途的佐剂类别，需要优化它们的制剂以进一步提高其佐剂性。 3.3.TLR配体 3.3.1.Toll样受体 市场上的大多数疫苗主要由单一佐剂组成，但通常保护性免疫反应并未达到有效使用疫苗的标准。因此，显著的Toll样受体（TLR）是先天免疫的关键组成部分，提供防御性炎症反应以抵御入侵的病原体。人类TLR包括10个成员（TLR1-10），可以跨越细胞表面（TLR1、2、4、5、6、10）或定位在内质网膜（TLR3、7、8、9）上，并参与不同PAMPs（表4）的识别。PAMPs的结合诱导TLR同二聚体（TLR3、4、5、7、8、9）或异二聚体（TLR1/2或TLR2/6）的形成，将两个toll/IL-1受体（TIR）结构域聚集在一起，允许适配蛋白MyD88（髓样分化初级反应-88）与复合物结合。TLR3是唯一结合不同适配蛋白的受体，即含有TIR结构域的适配蛋白-诱导干扰素-β（TRIF）蛋白。与其他TLR不同，TLR4信号可以通过涉及MyD88信号适配蛋白或TRIF的两条独立途径进行。一旦激活，TLR将增加免疫细胞的迁移并引发适应性免疫反应。 由于TLRs作为免疫增强剂，它们的激动剂可以用作疫苗佐剂。疫苗产生的免疫反应类型取决于由特定TLR及其适配蛋白激活的信号通路。虽然大多数TLR途径导致Th1免疫反应，TLR2诱导Th0、Th1或Th2反应，TLR3激活NF-κB途径。表1总结了疫苗配方中使用的几种TLR激动剂，TLR激动剂的结构报告在图5中，临床试验中的TLR激动剂在表5中。 3.3.2.TLR2激动剂 TLR2可以识别许多PAMPs，因为它们可以与TLR1和TLR6形成异二聚体。L-pampo是由PAM3CSK4（PAM3）、TLR1/2、聚(I:C)和TLR3构成的复杂系统，是一种有效的佐剂。它在乙型肝炎病毒（HBV）疫苗中使用，诱导细胞介导的免疫反应，增加CD4+ T细胞水平。目前，它正在作为使用RBD（受体结合域）、S1抗原和RBD-Fc作为病毒抗原的SARS-CoV-2疫苗的佐剂进行研究，已被证明能引发强烈的体液和细胞免疫反应。 TLR2识别细菌脂蛋白，因此，由细菌LPS衍生的合成脂肽作为疫苗佐剂被开发出来。MALP2（巨噬细胞激活脂肽2，图5）来源于支原体发酵，利用TLR2-MyD88信号通路激活免疫细胞。PAM2CSK4和PAM3CSK4是两种作为疫苗佐剂评估的TLR2激动剂，用于对抗利什曼病、疟疾和流感。由于它们的尺寸、化学复杂性和疏水性，TLR2激动剂通常不用于疫苗开发，即使在固相自动肽合成研究可以帮助发现新的更简单的衍生物。 图5.小分子Toll样受体激动剂的2D结构。TLR2激动剂（紫罗兰色上部） 面板）、TLR4 激动剂（青色，中间面板）、TLR 7/8 激动剂（绿色，下面板）。 3.3.3.TLR3激动剂 TLR3是内体受体，能够检测病毒dsRNA。聚(I:C)是一种结构类似于病毒RNA的佐剂。它能够诱导IFN-I和IFN-III的产生，并刺激Th1细胞因子反应。MVS途径（RIG-1和/或MDA5）的激活会导致人类毒性，因此开发了新的聚(I:C)衍生物，聚(ICLC)和聚(IC12U)。 聚(ICLC)是一种聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，能刺激干扰素的产生。它诱导炎症体和补体系统的表达，并在针对恶性疟原虫、HIV和癌症的疫苗候选中使用，显示出引发Th1反应的强能力。由于这种佐剂的高度免疫刺激性和对血清核酸酶的高抗性，设计了聚(IC12U)。这种新物质显示了尿嘧啶和鸟嘌呤残基的错配，导致毒性较低（不与MDA5结合），以及IFN-I的产生减少。 3.3.4. TLR4激动剂 TLR4通过MD-2（髓样分化因子-2）和CD14识别细菌脂多糖。LPS的免疫刺激性活性是由于脂质A区域，并且脂肪酸链的变化反映了不同的生物活性。Eritoran是一种TLR4-MD2激动剂。它是一种由脂质A衍生的合成物，其特点是含有四个脂质链，其中一个含有顺式双键。3-O-去酰基-40'-单磷酸脂质A（MPLA，图5）和葡萄糖基脂质A（GLA）表现出低致热性和强免疫增强特性。LeIF（利什曼原虫真核起始因子）和neoseptins（合成肽模拟化合物，图5）是两种非糖脂配体，它们不像LPS，但能够像天然配体一样激活TLR4。在THP-1细胞中筛选激活NF-κB途径的小分子化合物，发现了一种属于吡啶并吲哚类的特定TLR4激动剂（1Z105，图5）。1Z105被确定为安全的TLR4激动剂，其他研究目前正在进行中。TLR4可以激活一个强大的TRIF介导的细胞反应，其特征是多能CD8+/CD4+ T细胞的存在和对癌症和传染病的CTL活性增强。 3.3.5.TLR5激动剂 TLR5由多种免疫细胞表达，参与细菌鞭毛蛋白的识别。配体与TLR5的结合诱导炎症途径的激活，释放包括TNFα、IL-1β、IL-6和一氧化氮在内的炎症介质，引发Th1和Th2反应。当与抗原一起给予时，鞭毛蛋白诱导粘膜免疫反应，这对于保护免受呼吸和胃肠道感染至关重要。鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白已与PR8流感病毒（IPR8）、HA（H5N1）或禽流感病毒（AIV）H5N1抗原配方，证明它能引发强烈的免疫反应，包括IgA的产生。对鞭毛蛋白的修改导致了嵌合鞭毛蛋白或活细菌中的鞭毛蛋白抗原复合物，如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌、肠毒素大肠杆菌（ETEC）等，并在动物模型中使用。三种使用鞭毛蛋白作为佐剂的疫苗正在进行临床试验阶段，其中两种针对流感病毒，一种针对鼠疫耶尔森菌。 3.3.6.TLR7/8激动剂 TLR7/8能够诱导Th1免疫反应，并产生高水平的I型干扰素、IL-12、TNF-α和IL-1β。TLR7/8和TLR9激动剂能够激活并促进cDCs（常规树突细胞）和浆细胞样树突细胞（pDCs）的克隆扩展，动员CD14+ CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。Imiquimod（R837，图5）目前已获批准并用于治疗生殖器疣、表浅基底细胞癌和日光角化病。另一种异喹啉衍生物resiquimod（R848）具有抗病毒和抗癌治疗用途，正在评估用于黑色素瘤治疗。已经开发了不同的结构相关的oxoadenine化合物，尽管需要其他临床前研究来证明它们的疗效。CL075是一种结构相关的杂环化合物，具有融合的喹啉-噻唑环。 3.3.7.TLR9激动剂 TLR9识别细菌DNA基序胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸，通过MyD88途径激活免疫系统。CpG是已被修改以防止蛋白酶降解并用作佐剂的分子基序。CpG-CDNs能在自然杀伤细胞、B细胞和pCCS中引起强烈的趋化因子、细胞因子和抗体产生，并引发强烈的Th1型免疫反应。CpG1018是一种能够引发Th1型免疫反应的寡核苷酸。CpG1018是过去20年中批准的四种新型佐剂之一。即使它的使用最初在Hepliisav-B疫苗中受到限制，但目前正在评估用于对抗黑色素瘤和SARS-CoV-2的疫苗。MGN1703属于TLR9激动剂，是一种包含CG基序并呈现线性结构的小DNA分子。它由中间的双链DNA部分构成，两侧是单链结构。它作为疫苗的佐剂在癌症疫苗中进行了测试，在那里它激活了先天和适应性免疫反应，仅有轻微或暂时的副作用。它目前正在作为免疫调节剂单独或联合用于治疗恶性肿瘤，如黑色素瘤、小细胞肺癌和结直肠癌的I/II期研究中进行评估。 3.4.CLR配体 C型凝集素受体（CLRs）是病原体和受损组织来源脂质的免疫传感器，参与激活先天和获得性免疫。免疫反应可以通过CLRs细胞信号通路和其他PRRs（如TLR）的串扰来引发，导致不同信号通路的激活和特定细胞因子的表达。CLR触发的佐剂包括Curdlan、PGA-45、海藻糖二硬脂酸酯（TDB）和海藻糖二肉豆蔻酸酯（TDM），它们诱导强烈的Th17和Th1反应。 Curdlan在铜绿假单胞菌疫苗中使用，并诱导高水平的IL-17A和CD44+ CD62L-CD69+ CD4+ TRM细胞产生。Curdlan还能够激活树突细胞（DCs）并增强基于DC的抗肿瘤免疫，因此正在评估用于抗肿瘤免疫疗法。由于Curdlan的高度疏水性，开发了部分氧化的Curdlan衍生物β-1,3-聚葡萄糖醛酸，PGA-45聚合物，它能够刺激IKK-β的磷酸化并降低磷酸化Akt的表达，表明PGA-45可以激活多种细胞表面受体，包括TLR4和dectin-1。 海藻糖-6,60-二肉豆蔻酸酯（TDM）及其合成类似物海藻糖-6,60-二硬脂酸酯（TDB），能够通过与C型凝集素受体Mincle结合来激活巨噬细胞和树突细胞。TDB在结核病亚单位疫苗的临床研究中。TDB还可以独立于Mincle发挥作用，通过PLC-γ1/钙/CaMKKβ/AMPK途径诱导小胶质细胞极化为M2表型，使这种佐剂成为治疗神经炎症性疾病的治疗剂。 3.5.RLR配体 视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）是病毒感染的传感器，诱导产生I型和III型干扰素和炎症细胞因子，激活参与先天和获得性免疫反应的信号通路。RLRs可以检测病毒和宿主RNA，导致抗病毒反应，但如果RLR途径被无控制地激活，也会导致免疫病理。聚(I:C)激活RLRs途径，因为它模仿细胞中的病毒入侵，导致MAVS-IRF3/7级联的激活和IFN-β和ISGs的产生。IFN-β的表达取决于聚(I:C)的长度；短序列在髓样细胞中诱导IFN-β表达，而长序列在成纤维细胞中诱导IFN-β表达。这意味着使用特定激动剂刺激RLR途径将导致细胞特异性IFN-β表达的诱导，特别是在成纤维细胞中，与单核细胞和巨噬细胞相比，可以赋予更强的抗病毒状态。 4.辅助佐剂和佐剂配方  市场上的大多数疫苗只包含一种佐剂，然而，保护性免疫反应通常不足以实现疫苗的有效性。为了增强疫苗的效果，开发了许多佐剂配方。佐剂和抗原可以一起传递，使用两种流行的方法之一，共价偶联或将抗原和佐剂包装在传递机制中。适当的佐剂组合选择可以导致对疫苗免疫反应的补充或协同改善。例如，AS04中的明矾和MPL的联合使用在乙型肝炎病毒（HBV）和人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗中显示出比仅使用明矾盐的相同疫苗更好的免疫反应。 4.1.脂质体 脂质体是球形颗粒，可以包裹抗原和免疫刺激性分子，保护它们免受降解并将其传递给APCs。脂质体由可生物降解、生物相容、无毒的磷脂组成，允许灵活的结构修改，以实现可调节的特性，如大小、表面电荷、膜柔韧性和药物装载模式。作为疫苗佐剂传递系统（VADS）的脂质体使用带来了许多优点，如高安全性和强烈的免疫反应。市场上的脂质体配方包括Epaxal和inflixal，分别用于对抗甲型肝炎和季节性流感病毒。另一种基于脂质体的疫苗是GSK（GlaxoSmithKline）开发的Shingrix，已获得FDA批准，用于带状疱疹病毒的老年人预防。 4.2.乳液 作为疫苗佐剂开发的乳液可以分为两种主要形式，完全弗氏佐剂（CFA）和不完全弗氏佐剂（IFA）。这两种佐剂都是油包水乳液，具有运输抗原和激活先天免疫系统的能力。CFA由矿物油、乳化剂和热杀死的结核分枝杆菌组成，促进免疫反应的刺激。然而，CFA可能会引起强烈、持久的局部炎症，并有在注射部位形成溃疡的潜力。IFA与CFA的成分相同，但不含有杀死的细菌M. tuberculosis。这种佐剂可以产生比没有它的相同疫苗更强大和持久的抗体反应。然而，IFA在疫苗配方中的使用受到其强烈副作用和毒性的限制，这是由高水平的非生物降解油和质量差引起的。 4.2.1.Montanide Montanide 是一个包括油包水和水包油乳液在内的大型家族，它已被用于兽医和人类疫苗中。MontanideTM 的生物可降解性质减少了与 IFA 类似物理结构的许多细胞毒性特征。在注射部位形成储存库，有助于抗原的逐渐释放，这是这种基于油的佐剂的作用机制的一部分。产生集中并防止恶化的抗原，并促进吞噬作用 。Montanide ISA 51 和 ISA 720 已在涉及癌症、艾滋病、疟疾或自身免疫疾病的疫苗的多项临床试验中使用。Montanide ISA 201 和 ISA 206 则被用于口蹄疫疫苗。 4.2.2.MF59 MF59 是一种水-油乳液佐剂，由角鲨烯组成，角鲨烯是一种生物可降解且与人体兼容的油，是人体的正常成分，在 pH 6.5 的 10 mM 柠檬酸钠缓冲液中通过表面活性剂 Tween 80 和 Span 85 稳定，平均粒径小于 200 纳米。它首次在 1997 年在欧洲被批准用于人类疫苗（Fluad），现在已在超过 30 个国家的超过 1 亿人中使用。其作用机制类似于明矾盐，具有在注射部位的储存活性，刺激局部先天免疫反应。肌肉中 MF59 的给药激活了强大的细胞和体液免疫反应，释放 ATP 并上调细胞因子和趋化因子，这反过来促进了白细胞的募集、抗原摄取和迁移到淋巴结以激活 B 细胞和 T 细胞，结果比明矾盐更有效。MF59 具有可接受的安全性和良好的耐受性，自 1997 年以来已施用了数百万剂。 4.3.AS0佐剂系统 AS0 佐剂系统基于经典佐剂分子的组合，如明矾、乳液和脂质体。它们由葛兰素史克公司开发，以实现最大的佐剂效果和可接受的耐受性，结合免疫刺激分子，如 TLR 配体等。这些经典佐剂和免疫刺激剂的各种组合旨在针对目标人群（包括儿童、老年人和免疫功能低下的个体）的病原体个性化适应性免疫反应。 4.3.1.AS04 AS04 由 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL）组成，这是从革兰氏阴性细菌 Salmonella minnesota 分离出的脂多糖（LPS）的去毒形式，吸附在明矾盐上 。MPL 在保持较低毒性的同时，通过 TLR4 激活保留了 LPS 的免疫刺激性，当吸附在明矾上时。TLR4 在先天细胞上的信号传导介导了 AS04 的佐剂作用，与明矾的内在免疫调节特性相结合。我们可以在乙型肝炎病毒（HBV）Fendrix  和人乳头瘤病毒（HPV）Cervarix  疫苗中找到 AS04，与仅用明矾盐佐剂的相同疫苗相比，显示出更好的免疫反应。 4.3.2.AS03 AS03 是一种角鲨烯油包水乳液佐剂，与 MF59 类似，结合了表面活性剂聚山梨醇酯 80 和 α-生育酚（维生素 E），结果具有较低的反应原性并具有更好的安全性。2009 年，欧洲委员会批准了 AS03 佐剂疫苗 Pandemrix 的商业化，2013 年食品药品监督管理局授权了 AS03 佐剂流感 A（H5N1）单价疫苗 。它也用于 SARS-CoV-2 重组蛋白疫苗（CoV2 preS dTM）。α-生育酚的抗氧化和免疫刺激性特性与 MF59 相比，促进了免疫增强反应，调节了某些细胞因子和趋化因子的表达，如 CCL2、CCL3、IL-6 和 GM-CSF。此外，AS03 通过刺激 NF-κB 激活免疫系统，这导致肌肉和引流淋巴结中细胞因子和趋化因子的释放，并促进先天免疫细胞的迁移。此外，AS03 可以促进 CD4+ T 细胞特异性免疫反应，这可能导致持久的中和抗体产生和更高水平的记忆 B 细胞 。为了增加其免疫原性，使用两种强效免疫刺激剂，QS-21（来自 Quillaja saponaria 的皂苷）和 3-O-去酰基-40'-单磷酸脂 A（MPL），产生了 AS02。 4.3.3.AS01 AS01 佐剂是两种强效免疫刺激组分的组合，TLR4 配体也在 AS04 中使用（MPL）和分离纯化的皂苷部分（QS-21），在脂质体中配制。它用于带状疱疹疫苗 Shingrix 和疟疾疫苗 Masquirix 。临床前研究表明，QS-21 作为佐剂增强了抗体以及细胞介导的免疫反应 ，但作为疫苗中的单一组分佐剂，它的耐受性较差。在 AS01 中，脂质体中的胆固醇允许它结合 QS-21 并抑制其反应原性。MPL 通过 TLR4 激活先天免疫系统，而 QS-21 激活引流淋巴结中副皮质窦巨噬细胞（SSMs）中的 caspase 1。两种已建立的佐剂分子的结合引发了先天免疫的协同激活，结果大于独立组分的总和，激活了不是由任一组分单独触发的新途径，增加了表达 IL-2、IFNγ 和 TNF 的多能 CD4+ T 细胞。AS01 作为佐剂在带状疱疹疫苗中的使用已获批准，该疫苗用于老年人，具有高疗效，并在非洲有限的运动中实施的疟疾疫苗。 4.4.免疫刺激复合物 免疫刺激复合物是另一种具有强大佐剂活性的疫苗传递载体。它们是球形的，笼子状的自组装颗粒，大小约为 40 毫米。ISCOMs 由 Quillaja 皂苷、胆固醇、磷脂和抗原组成。没有抗原的颗粒被称为 ISCOM 基质。ISCOM 抗原可以是原生病毒的包膜蛋白、细胞膜蛋白或通过极性相互作用含有疏水域的肽 。ISCOMATRIX® 是使用与 ISCOMs 相同的材料开发出来的，但没有抗原，可以在疫苗配方中添加，使得使用更加多样化，并消除了疏水抗原的限制。树突状细胞（DCs）和 ISCOM 相互作用可以改善结合抗原的交叉呈递 。因此，有效地诱导了 CD4+ 和 CD8+ 抗原特异性 T 细胞反应。诱导细胞毒性 T 细胞、平衡的 Th1/Th2 反应和持久的抗体反应都是 ISCOM 疫苗的记录效果 。其他 ISCOM/ISCOMATRIX 疫苗已针对 HIV、HPV 和癌症利用抗原 NY-ESO-1 进行了临床试验。在所有情况下，研究都显示出良好的安全性和耐受性，以及诱导体液和细胞免疫反应。尽管具有这些特点，但由于一些皂苷在高浓度下具有毒性，因此对人类疫苗中使用 ISCOMs 的安全性问题已经阻止了其使用 。 4.5.类病毒颗粒 类病毒颗粒（VLPs）是与病毒大小相似的二十面体纳米颗粒（范围在20至800纳米之间），它们具有自我组装衣壳蛋白的能力。它们是非感染性颗粒，因为它们没有遗传物质。VLPs由具有重复表位的外部病毒壳组成，这些表位被免疫系统识别为非自身，并产生快速且持久的免疫反应，即使没有佐剂。它们可以通过使用不同的技术和细胞系统，如大肠杆菌、酵母（酿酒酵母和毕赤酵母）、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞或无细胞系统，由各种病毒类型生产。 历史上的VLPs制造方法包括一个称为“先组装后纯化”的多步骤方法。第一步包括衣壳蛋白在表达细胞载体内的自发组装。第二步则提供新形成颗粒的纯化。有时需要将VLPs拆解后再重新组装，以获得纯化的颗粒并提高质量。另一种VLPs的制造方法提供了使用无细胞体外组装，颠覆了传统的自我组装方法。特别是，体外系统被用作一个平台，在衣壳蛋白表达和纯化后诱导其自发组装，无需拆解新形成的VLPs。在市场上，两种重要的佐剂疫苗使用这种类型的纳米颗粒，即乙型肝炎（HBV）和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。当前的乙型肝炎疫苗是一种利用酿酒酵母作为表达载体的重组DNA疫苗，包括用于预防乙型肝炎感染的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。这种疫苗已被证明至少可以提供10年的免疫力。 在HPV疫苗中，非包膜HPV病毒颗粒包含双链DNA（dsDNA）。L1和L2蛋白组成衣壳的主要和次要结构蛋白，具有二十面体对称性。酿酒酵母是目前用于表达L1蛋白的载体。VLPs和佐剂（AlP）的结合导致强烈的免疫反应和90%的宫颈癌保护。 4.6.病毒体 病毒体是一种药物传递系统，由病毒包膜和病毒或其他病原体的成分组成。它们由重组流感病毒包膜形成，包含血凝素（HA）、神经酰胺酶（NA）和磷脂，并且像VLPs一样缺乏病毒遗传物质。第一个基于病毒体的疫苗是在1975年开发的，这允许研究这种类型疫苗的有效性。自那以后，有两种疫苗已经上市，用于预防甲型肝炎（Epaxal）和流感（Inflexal）。 病毒体结构中HA的存在允许保持受体结合能力，增加免疫原性和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，病毒体在结合后不能在细胞中诱导感染。病毒体可以将抗原输送到抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞反应，使它们成为完美的传递系统。然而，由于佐剂质量较差，病毒体在激活APCs和鼓励交叉呈递方面效果不佳。使用更强的佐剂可以克服这种固有限制。最近开发了一种基于病毒体的创新流感疫苗，结合了TLR4配体单磷酸脂A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA。病毒体可以诱导强烈的体液和细胞免疫，与自然感染和其他强效佐剂相当。由于其极高的耐受性和安全性，这种传递系统已获得FDA批准用于人类。除了针对流感和甲型肝炎的两种基于病毒体的疫苗外，还有几种疫苗正在进行临床试验，包括针对HIV、HPV、RSV和疟疾的疫苗。 5.佐剂设计和开发的新见解 如前所述，在过去20年中，发现了新的免疫激活佐剂类别，能够增强免疫功能低下和老年人等脆弱人群的免疫反应。有几种佐剂类别可用，每种都有其自身的优势和劣势。油包水乳液等传递系统是有效且安全的系统，尽管有可能产生局部或系统性不良效应。最近的研究表明，PRR信号在几个人群中可以改变，降低了疫苗配方的保护效果。例如，防止胎儿排斥的免疫机制以及老年人中TLR途径的失调或遗传多态性的存在。出于所有这些原因，选择适当的佐剂配方对于提高效果而不降低风险-效益比至关重要。从化学角度来看，蛋白质数据银行存储库上有几种与特定配体共晶的蛋白质晶体结构，有助于通过计算机辅助药物设计寻找新化合物。报道的STING和TLR小分子激动剂的大多数结构是杂环化合物，模仿核苷酸。即使在这种情况下，也已经开发了许多具有不同应用的结构相关化合物，包括在癌症疾病中广泛应用的激酶抑制剂和作用机制不太明确的配体或人类辅因子的配体。另一个需要考虑的方面是存在用于合成肽的高通量全自动仪器。最近已经做出了努力来合成复杂的高分子量肽和糖蛋白。此外，已经开发了使用天然成分的新型复杂纳米配方，如来自昆虫的功能化聚合物。所有这些方面都非常有前景，并为佐剂发现的发展开辟了新的场景。 6.结论 佐剂是疫苗配方的关键组成部分的大家族。它们的使用在历史上最重要的疫苗接种活动中至关重要，包括脊髓灰质炎、猪流感和最近的COVID-19大流行。即使已经取得了良好的结果，但还需要更多的努力来增加疫苗对耐药病毒的保护，并减少额外加强针的需要。重组技术、DNA筛选和生物信息学研究已经阐明了新的机制和免疫信号通路的关键参与者。还需要更多的努力来识别更有效的佐剂，以对抗未来的大流行并增加对抗癌症的成功率。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

NEW YORK, Oct. 23, 2024 (GLOBE NEWSWIRE) -- Indaptus Therapeutics, Inc. (Nasdaq: INDP) announced today that Jeffrey A. Meckler, Chief Executive Officer, will present at two upcoming investor conferences: BioFuture 2024 The conference is being held on October 28 – 30, 2024 at Cure by Deerfield in New York City. Presentation Date:Monday, October 28, 2024Time:3:30 PM ETTrack:12 - B (12th Floor) Mr. Meckler will be available for one-on-one meetings throughout the conference. For more information about BioFuture, click here: https://biofuture.com/ ThinkEquity Conference The conference is being held on October 30, 2024 at the Mandarin Oriental Hotel in New York City. Presentation Date:Wednesday, October 30, 2024Time:12:30 PM ET (South Salon II) Mr. Meckler will be available for one-on-one meetings throughout the conference. Interested investors can register to attend and schedule one-on-one meetings here. About Indaptus Therapeutics Indaptus Therapeutics has evolved from more than a century of immunotherapy advances. The Company’s novel approach is based on the hypothesis that efficient activation of both innate and adaptive immune cells and pathways and associated anti-tumor and anti-viral immune responses will require a multi-targeted package of immune system-activating signals that can be administered safely intravenously (i.v.). Indaptus’ patented technology is composed of single strains of attenuated and killed, non-pathogenic, Gram-negative bacteria producing a multiple Toll-like receptor (TLR), Nucleotide oligomerization domain (NOD)-like receptor (NLR) and Stimulator of interferon genes (STING) agonist Decoy platform. The product candidates are designed to have reduced i.v. toxicity, but largely uncompromised ability to prime or activate many of the cells and pathways of innate and adaptive immunity. Decoy product candidates represent an antigen-agnostic technology that have produced single-agent activity against metastatic pancreatic and orthotopic colorectal carcinomas, single agent eradication of established antigen-expressing breast carcinoma, as well as combination-mediated eradication of established hepatocellular carcinomas, pancreatic and non-Hodgkin’s lymphomas in standard pre-clinical models, including syngeneic mouse tumors and human tumor xenografts. In pre-clinical studies tumor eradication was observed with Decoy product candidates in combination with anti-PD-1 checkpoint therapy, low-dose chemotherapy, a non-steroidal anti-inflammatory drug, or an approved, targeted antibody. Combination-based tumor eradication in pre-clinical models produced innate and adaptive immunological memory, involved activation of both innate and adaptive immune cells, and was associated with induction of innate and adaptive immune pathways in tumors after only one i.v. dose of Decoy product candidate, with associated “cold” to “hot” tumor inflammation signature transition. IND-enabling, nonclinical toxicology studies demonstrated i.v. administration without sustained induction of hallmark biomarkers of cytokine release syndromes, possibly due to passive targeting to liver, spleen, and tumor, followed by rapid elimination of the product candidate. Indaptus’ Decoy product candidates have also produced meaningful single agent activity against chronic hepatitis B virus (HBV) and chronic human immunodeficiency virus (HIV) infections in pre-clinical models. Forward-Looking Statements This press release contains forward-looking statements within the meaning of the Private Securities Litigation Reform Act. These include statements regarding management’s expectations, beliefs and intentions regarding, among other things: our expectations and plans regarding our Phase 1 clinical trial of Decoy20, including the timing and design thereof and expected immune responses as we dose more patients in the multi-dosing part of the trial; the anticipated effects of our product candidates, including Decoy20; the plans and objectives of management for future operations; our research and development activities and costs; the sufficiency of our cash and cash equivalents to fund our ongoing activities and our cash management strategy; and our assessment of financing options to support our corporate strategy. 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These and other important factors discussed under the caption “Risk Factors” included in our Quarterly Report on Form 10-Q for the quarter ended June 30, 2024 filed with the SEC on August 12, 2024, our most recent Annual Report on Form 10-K filed with the SEC on March 13, 2024, and our other filings with the SEC, could cause actual results to differ materially from those indicated by the forward-looking statements made in this press release. All forward-looking statements speak only as of the date of this press release and are expressly qualified in their entirety by the cautionary statements included in this press release. We undertake no obligation to update or revise forward-looking statements to reflect events or circumstances that arise after the date made or to reflect the occurrence of unanticipated events, except as required by applicable law. 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摘要 抗体-药物偶联物(ADC)兼具单克隆抗体的精准靶向性和药物高效杀伤的优势，显示出巨大的临床治疗价值。ADC药物的有效载荷是决定ADC药物疗效的关键因素，受到了业界的高度重视。理想的ADC有效载荷应具有足够的毒性、低免疫原性、高稳定性、功能基团可修饰等特点。常见的ADC有效载荷包括微管蛋白抑制剂和DNA损伤剂，其中微管蛋白抑制剂占临床开发中的ADC药物的一半以上。但由于传统ADC有效载荷在临床上存在疗效不足、易产生获得性耐药等局限性，因此，靶点多样、副作用小、高效新型有效载荷正在被开发。本文综述了近年来传统和新型 ADC 有效载荷的研究进展，主要集中在构效关系研究、共晶结构和设计策略等方面，并进一步探讨了 ADC 有效载荷的未来研究方向，旨在为开发高效、低毒、稳定、不易产生耐药性的新型 ADC 有效载荷提供有价值的参考和未来发展方向。 1. 背景 尽管免疫疗法和细胞疗法最近取得了进展，但化疗仍然是癌症治疗中最常用的策略。然而，由于治疗指数低，传统化疗药物尽管对癌细胞表现出强大的细胞毒性，但往往对健康组织表现出毒性作用，这大大限制了它们的临床疗效。因此，开发高效、系统毒性有限的癌症治疗药物输送系统可能是解决该问题的有效策略。因此，一个新概念——抗体-药物偶联物 (ADC)已被构想和开发 (图1)。ADC通常由针对肿瘤特异性抗原或相关抗原的抗体和若干个有效载荷通过适当的连接子组成，ADC兼具单克隆抗体(mAb)的高靶向性和有效载荷在肿瘤组织中的高效性。由于ADC副作用较小、治疗应用范围较广、治疗指数较高，近年来已成为肿瘤学领域发展最快的药物之一。 图1. ADC的关键结构和作用机制。 (A) ADC的一般作用机制；(B) DNA抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(C) 剪接抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(D) 微管蛋白抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(E) PROTAC分子作为ADC有效载荷的作用机制；(F) Bcl-xL抑制剂和蛋白酶体抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(G) NAMPT抑制剂作为ADC有效载荷的作用机制；(H) NIR-PIT ADC的作用机制。 ADC药物的概念最早由德国诺贝尔奖获得者保罗·埃尔利希于1913年提出，但直到1975年，杂交瘤技术的发展开始用于生产单克隆抗体，才真正开启了ADC药物的开发时代。在日益成熟的技术推动下，ADC药物经历了三代创新(图 2)：第一代ADC药物主要以传统化疗药物如甲氨蝶呤、长春花碱、阿霉素等作为细胞毒性有效载荷，但由于对癌细胞的细胞毒性不足、肿瘤选择性不强、靶细胞蓄积率低，这些第一代ADC药物的疗效甚至比其母体有效载荷更差，导致临床失败。随后，新型高细胞毒性化合物引起了人们的浓厚兴趣，这些化合物的药效比第一代 ADC中使用的传统化疗药物高出 100-1000 倍。当它们作为单一药物用于杀死肿瘤时，它们往往具有难以忍受的副作用。例如，微管蛋白抑制剂美登素对肿瘤细胞表现出极强的抗增殖活性。然而，它的毒副作用，如神经毒性和胃肠道反应，也很严重。因此，它未被批准作为单一药物用于癌症治疗。有趣的是，这些高细胞毒性化合物是 ADC 的理想有效载荷。细胞骨架的主要成分由α-和β-微管蛋白组成，微管蛋白抑制剂可以通过破坏细胞骨架结构和干扰有丝分裂来杀死肿瘤细胞。因此，与正常细胞相比，分裂速度更快的肿瘤细胞对微管蛋白抑制剂更敏感。大多数第二代 ADC 使用明显更有效的微管蛋白抑制剂作为有效载荷。不幸的是，虽然微管蛋白抑制剂对活跃分裂的肿瘤细胞非常有效，但对静止的癌细胞效果要差得多。为了潜在地克服这一限制，大多数第三代 ADC 选择了可以靶向整个细胞周期的 DNA 损伤剂作为细胞毒性载荷，DNA 损伤剂可以通过双链断裂、烷基化、嵌合和交联来破坏 DNA 结构，从而杀死肿瘤细胞，代表性的 DNA 损伤载荷包括烯二炔、拓扑异构酶 I 抑制剂和吡咯并苯二氮卓类 (PBD)。目前，已有 15 种 ADC药物获批，大量 ADC 药物正在临床试验中(表1)，其有效载荷主要来源于天然物质，其中微管蛋白抑制剂占一半以上。 图 2. ADC 有效载荷开发过程中的里程碑。 尽管 ADC 已经历经三代，但当前的有效载荷仍然存在临床局限性，例如严重的副作用和耐药性的产生。开发更有效的 ADC 有效载荷(最好具有更好的治疗指数)的医疗需求仍然强烈未得到满足，因此，正在设计其他新型 ADC有效载荷，包括 RNA 抑制剂、Bcl-xL 抑制剂、NAMPT 抑制剂和卡马菲星(carmaphycins)。此外，使用免疫调节剂作为有效载荷的免疫 ADC 因其在肿瘤免疫治疗中的关键作用而引起了广泛关注。除了使用单个简单分子作为有效载荷外，还出现了几种使用更复杂有效载荷设计 ADC 的新策略，例如，PROTAC 或光敏剂已被用作 ADC 有效载荷，并且还开发了将多个有效载荷(每个有效载荷具有不同的靶标)整合到单个抗体中的方法，这些突破性的策略可以带来下一代 ADC。 本文从 ADC 有效载荷的重要性和主要特性出发，从晶体结构、ADC 有效载荷与靶标之间的结构-活性关系(structureeactivity relationships, SAR)等方面，综述了各种传统 ADC 有效载荷的发现和主要结构改造。此外，本文还将总结各种基于新药物靶标和创新设计策略的新型 ADC 有效载荷。最后，针对当前有效载荷的局限性，讨论了未来 ADC 有效载荷的主要研究方向，以期为未来设计具有理想特性的新型 ADC 有效载荷提供参考。 2. ADC有效载荷的重要性和特点 ADC药物进入血液循环后，与肿瘤细胞表面的靶抗原受体结合，新形成的ADC-抗原复合物内化后被溶酶体降解，释放出有效载荷，诱导肿瘤细胞死亡(图1)。因此，有效载荷是ADC设计的重要组成部分，有效载荷的活性和理化性质对ADC药物的抗肿瘤疗效有直接的影响，有效载荷的作用机制是决定ADC性能的重要因素(如不良反应)。此外，ADC有效载荷的其他一些特性，如细胞毒性、免疫原性、制备和流通过程中的储存稳定性、水溶性、可改性性等也很重要。 理想的有效载荷应具备以下特点： 第一，它们应该具有足够高的细胞毒性。肿瘤特异性抗原非常有限，尤其是在实体肿瘤中。此外，由于单克隆抗体的渗透性低、内化活性差，能够通过抗体抗原结合内吞到肿瘤细胞中的 ADC 有效载荷数量非常少； 第二，ADC药物要具有足够低的免疫原性。蛋白质药物存在诱导免疫原性的风险，这可能会对ADC疗效产生负面影响，甚至导致接受治疗的患者死亡。虽然目前ADC多采用人源或人源化单克隆抗体和小分子药物，但与治疗性单克隆抗体相比，仍有可能增加免疫原性的风险。为了解决这个问题，一些毒性很大的药物是从植物、动物或微生物中提取的，确保药物在人体内的免疫原性小到可以忽略不计，使用分子较小的药物也是降低免疫原性风险的一种方法； 第三，ADC药物要具有较高的稳定性。由于抗体在循环中的半衰期较长，ADC 应在血液循环中保持稳定，避免释放或分解。有效载荷还应在细胞质和溶酶体中保持稳定，在低 pH 条件下不会发生明显降解； 第四，ADC 有效载荷应具有可修改的功能基团，而不会显著影响其效力。有效载荷必须具有可修改的功能基团或可与单克隆抗体结合的位点，必须仔细选择修改的位点以保留母体药物的效力。更重要的是，当使用不可切割的连接子时，即使在抗体降解后，有效载荷也必须保持其效力； 第五，ADC 有效载荷应具有旁观者杀伤效应。一些 ADC 药物被内化并释放出小的、不带电的、可渗透的膜疏水性分子，这些分子通过细胞膜扩散并杀死邻近抗原表达阴性的肿瘤细胞。这一过程被称为“旁观者杀伤效应”，对抗原表达不均匀的肿瘤细胞具有重要意义。一般而言，促进癌细胞旁观者杀伤效应的有效载荷更适合于靶抗原表达较低或异质性的癌症。要构建具有旁观者效应的ADC药物，其结构必须满足连接子可被切割，以及有效载荷可穿透细胞膜的条件。膜穿透性好的疏水性分子具有很强的旁观者杀伤效应，但这也可能使得药物容易被健康组织吸收，导致严重的全身毒性。因此，两者之间的平衡对于ADC的研发非常重要； 第六，ADC有效载荷应具有适当的水溶性。有效载荷必须具有适当的水溶性以有利于与抗体偶联，并确保偶联物在生理条件下具有足够的溶解性。当过多的疏水性有效载荷与抗体结合时，产生的 ADC 往往会聚集并变得不稳定。此外，有效载荷的亲水性会影响母体 ADC 或其代谢物的细胞膜通透性，从而影响其旁观者杀伤活性。 第七，有效载荷的靶点应该是细胞内的，因为大多数 ADC 需要进入肿瘤细胞才能释放其有效载荷。许多来自微生物、植物和动物的有效载荷具有膜靶向性，例如那些主要通过阻断离子通道或破坏凝血起作用的神经元上的有效载荷，不适合用作 ADC 有效载荷的亲水性会影响亲本 ADC 或其代谢物的细胞膜通透性，从而影响其旁观者杀伤活性。 上述 7 种 ADC 有效载荷特性中，高效力、低免疫原性、药物制剂和血液循环中的稳定性、可修饰的功能基团是 ADC 有效载荷选择时必须考虑的重要因素，而适当的水溶性或旁观者杀伤效应等特性虽然一般不是那么重要，但对 ADC 的有效性也有着重要影响。基于这些特性，总结了现有 ADC有效载荷的有效性，包括靶向微管蛋白/DNA/RNA 的有效载荷、免疫 ADC 有效载荷、新型的潜在 ADC 有效载荷以及在各种新策略指导下用于 ADC 药物设计有效载荷。通过分析各种有效载荷与蛋白的结合方式及其相应的 SAR，希望阐明结构如何决定其生物活性和特性，并为未来产生更多新型ADC有效载荷提供有价值的参考。 3. ADC 的各种有效载荷 3.1. 微管靶向有效载荷 微管是真核细胞中细胞骨架的重要组成部分，是由平行于圆柱轴的α、β微管蛋白异二聚体组成的动态极性聚合物。微管在维持细胞形态、信号转导、细胞器运输、细胞运动、细胞分裂、有丝分裂等多种细胞功能中起着重要作用，是肿瘤治疗的重要靶点。微管蛋白是微管的组成成分，微管蛋白抑制剂通过与微管蛋白结合，干扰微管的动态结合，使细胞停滞在细胞周期的G2/M期，最终导致细胞凋亡。由于微管蛋白抑制剂能破坏有丝分裂纺锤体，起到抗有丝分裂的作用，因此对快速分裂的癌细胞的毒性比大多数生长缓慢的正常细胞更强，成为广受欢迎的 ADC 有效载荷。其中，微管蛋白聚合促进剂，如奥瑞他汀化合物 MMAE 和MMAF，作用于α、β蛋白的β亚基微管蛋白二聚体不能与微管蛋白聚合酶结合，导致微管生长不受调控。而微管蛋白聚合抑制剂，如美登素化合物DM1和DM4，则通过抑制成熟微管的形成，阻止微管蛋白二聚体的聚合，该类微管蛋白抑制剂是目前临床上许多ADC药物中最为常见的第二代有效载荷，并已被多个团队作为先导化合物进行结构改造，进一步改善该类ADC有效载荷的理化性质，使其更适合ADC药物的开发。 3.1.1. 美登素类化合物(Maytansinoids) 美登素(Maytansine) (1) (图 3A)最初从非洲灌木Maytenus ovatus的树皮中分离得到，是一类苯并安息香酸内酯类抗生素，能与微管蛋白结合，抑制微管的组装。在体外细胞活性测定中，其IC50落入皮摩尔(pM)范围，显示出其强大的抑制肿瘤细胞增殖能力，在其他实验中也表现出良好的稳定性和溶解性。但由于其治疗窗口较窄，且由于缺乏选择性而产生神经毒性和胃肠道反应等毒副作用，临床上已禁止直接用于人类治疗。然而，美登素的高细胞毒性完全符合 ADC 有效载荷的要求，使美登素成为 ADC 有效载荷的有力候选者。由于美登素没有反应性官能团，因此它不能与抗体结合。美登素类化合物的结构-活性研究已确定 C3 N-酰基-N-甲基-l-丙氨酰酯侧链、C4–C5 环氧部分、C9 甲醇官能团以及共轭 C11 和 C13 双键的位置是活性的关键要素，这使得苯环和N-酰基成为可化学修饰的实体。用3-甲基二硫丙基取代美登素中的N-乙酰基，可以得到含二硫键的美登素衍生物DM1 (2)(图3A)。DM4 (3)是在DM1二硫键周围加两个甲基得到的。衍生的 DM1 和 DM4带有甲硫基丙酰基，可以通过二硫键与连接子偶联。DM1 和 DM4 是临床实际应用中最常用的两种美登素类 ADC 有效载荷，例如Trastuzumab-SMCC-DM1 就是第一个获批上市的基于美登素衍生物的 ADC 药物。目前，20% 在开发的 ADC 使用美登素衍生物作为有效载荷。 图 3. 美登木素化合物的设计和 SAR 分析。 (A) 美登木素化合物1- 5的化学结构；(B) 美登木素 (1) 与微管蛋白复合的结合模式；(C) 化合物5与微管蛋白复合的结合模式。 2014年，Michel O. Steinmetz 团队研究了美登素及其与微管的作用，发现在β-微管蛋白上，美登素类与微管蛋白有三个关键的相互作用点(图 3B)，包括美登素 1 位羰基与β -微管蛋白残基Asn102 和 Lys105 之间的氢键；1 位羟基/羰基氧与β -微管蛋白 Val181 之间的氢键；以及配体 6a 位甲基与β -微管蛋白残基 Asn101、Asn102、Val182、Phe404 和 Tyr408 形成的口袋之间的疏水相互作用-微管蛋白，这些保守的微管蛋白相互作用点构成了共同的药效团。美登素是最常用的ADC有效载荷，但其合成、中间非对映体产物的分离纯化都很困难。同时，它是多药耐药蛋白1(MDR1)的底物，MDR1是一种转运蛋白，可以降低一些抗体-美登素样偶联物的效力。因此杨金良团队探索了L-DM1-SMe(C3位甲基-L构型DM1)、D-DM1-SMe(C3位甲基-D构型DM1)和β微管蛋白，发现L-DM1-SMe酯基中的羰基氧原子和C3侧链尾部的硫甲基分别与9位羟基和苯环形成较强的分子内相互作用，有助于结合亲和力的增强；而D-DM1-SMe的C3侧链则向相反方向摆动，无法形成分子内相互作用，解释了C3位甲基手性影响抗癌活性的详细机制。该研究为设计下一代具有新型骨架的美登素结合位点抑制剂，改善合成策略，降低MDR1介导的耐药性提供了基础。 美登醇(4)(图3A)最初是通过化学去除疣状Putterlickia verrucose提取物C3位置羟基上的酰基得到的。其对微管蛋白聚合的抑制活性弱于美坦辛，说明美坦辛和美坦素的C3位酯部分对生物活性和细胞通透性起重要作用。酯部分的羰基氧原子与9位的羟基形成强烈的分子内相互作用，固定了生物活性构象。美丹辛醇被认为是一种有价值的先导化合物，通过C3位羟基的酰化，可以很容易地制备出具有不同酯侧链的各种天然和半合成的美坦素类化合物。Daniele Passarella研究组通过对美登醇(4) 进行酰化反应，得到了一个新的美登素化合物5，该化合物具有较强的抑制微管组装能力，对A549 细胞的 IC50为 0.07-1.2 nmol/L，晶体结构 (图 3C) 表明美登素的结合对微管蛋白的整体构象没有影响，美登素化合物在 C1–O 和 Val181 的主链氮原子之间以及 C24-O 和 Lys105 和 Asn102 的侧链之间形成氢键。此外，美登素化合物5通过它们的C9-OH基团与Gly100的主链羰基形成氢键。在所研究的美登木素类化合物中，在 C3 位置引入的所有修饰都指向溶剂，不会干扰美登木素位点的封闭环境。因此，酰化增强了美登木素的全部生物活性，并且在 C3 位置引入的修饰不会干扰化合物与微管蛋白二聚体的结合状态、亲和力或有效性。Regeneron 的团队通过改变环上侧链的长度以及由一级胺和二级胺连接的连接子，研究了N -甲基丙氨酸中氮取代的影响，使用美登素化合物6作为有效载荷获得了 EGFRvIII 靶向 ADC，IC50对于 HEK293、U251 和 MMT 细胞系，浓度为 0.3-0.4 nmol/L，在 U251/EGFRvIII 和 MMT/EGFRvIII 小鼠模型中实现肿瘤消退。 3.1.2. 奥瑞他汀(Auristatin) 多拉司他汀10 (Dolastatin 10) (7) 于1987 年从Dolabella auricularia中分离得到，对多种癌细胞有较强的抗增殖活性，能强烈抑制微管组装，导致细胞周期停滞和细胞凋亡，是一种很有前途的抗癌药物(图 4-1A)。其水溶性合成类似物称为奥瑞他汀，其中应用最广泛的是单甲基奥瑞他汀E(MMAE)(8)和单甲基奥瑞他汀F(MMAF)(9)。它们各自含有一个功能性手柄，能够进行后续结合，进一步提高体内疗效。MMAE由4种氨基酸组成：单甲基缬氨酸(MeVal)、缬氨酸(Val)、多拉索林(Dil)和多拉普罗林(Dap)，以及羧基端胺基去甲麻黄碱。在MMAF中，单甲基缬氨酸的C端被苯丙氨酸取代，其细胞活性显著降低。Andrea E. Prota团队发现与 MMAE 相比，MMAF 对游离微管蛋白的结合亲和力增加了近 5 倍，这主要是由于β1 微管蛋白亚基上的关键 Arg278 残基通过有序水分子暴露于 MMAF。研究还表明，将长春花结构域延伸到肽位的详细结构相互作用不仅在功能上因抑制核苷酸交换而不同，而且还表明肽位抗有丝分裂剂如何比长春花生物碱具有更高的效力，该分析可能为 MMAF 的细胞活性降低的原因提供结构解释。 图 4-1.奥瑞他汀类似物的设计和 SAR 分析。 ( A)奥瑞他汀类似物  7-10、21-24 的化学结构；( B )化合物10与微管蛋白的复合物结合模式。 杨金良团队通过对长春花结构域中MMAE与微管蛋白结合域的结构研究，定义了一个必需的药效基团，该药效基团由两个疏水区I和II以及两个与Asp179β和Asn329α相互作用的氢键区域组成，为合理设计高特异性、强亲和力、高效的ADC有效载荷奠定了基础。2020年，Christopher J. O Donnell 团队设计合成了一个具有N端修饰的奥瑞他汀类似物10 (IC50 =0.2 nmol/L)，并首次通过更高分辨率的奥瑞他汀晶体结构实现了对其结合模式的详细研究，晶体结构显示化合物10的N端二甲基很好地贴合在受体口袋中，并不影响分子的整体结合亲和力(图 4-1B)。此外，还鉴定出关键的极性相互作用，包括末端质子化氨基与位于 T5 环上的Asp β 197 和 Phe α 351 氨基羰基之间的氢键网络、N-2 缬氨酸与 Asn α 329 之间的双焦点相互作用以及化合物10中 Tyr β 224 主链酰胺与 Dap 和 Doe 末端羰基之间的关键氢键相互作用。后者氢键网络使 Tyr β 224中的芳香环与 GDP 的核碱基发生π堆积相互作用，从而防止其从β-微管蛋白，GDP 的捕获被认为是奥瑞他汀发挥其干扰微管蛋白作用的关键机制。此外，所有分析的类似物在其功能相关的微管蛋白结合状态下在 Val-Dil 酰胺键处均具有顺式构型，而在溶液中该键仅处于反式构型。这揭示了奥瑞他汀的首选结合模式，并为基于结构的药物设计提供了有价值的工具。 图4-2. 奥瑞他汀类似物的化学结构11-20。 大多数奥瑞他汀类似物研究都集中在 C 端或 N 端修饰上： ·在 C 端修饰中，Doronina 等人描述了 MMAF 类似物11和12，其中苯丙氨酸的羧酸被四唑和膦酸酯取代。化合物11对H3396 细胞的IC50为 6.0 nmol/L，化合物12对 HCT116 细胞的IC50为 0.09 nmol/L。化合物11和12(游离酸类型)都已用于通过VC-linker与抗 CD70 的 H1F6 抗体结合形成活性ADC，其效力与 MMAF 作为有效载荷的效力相似(IC50=4-10 nmol/L)(图4-2B)。Pettit 等设计了C 端芳香族磷酸酯和喹啉修饰的奥瑞他汀类似物13-15 ，对 MCF-7 细胞的 IC50分别为0.81、0.19 和 6.35 nmol/L。其中，化合物13具有良好的水溶性(>236 mg/mL)，两个喹啉类似物14和15表现出良好的活性，化合物14 的活性明显高于其他类似物(图 4-2A)。Lerchen 等进一步说明了奥瑞他汀C 端结合域允许的修饰程度，通过在 C 端添加取代基，获得了对 768O 细胞有效的奥瑞他汀类似物16-18，IC50分别为 0.5、1.2 和 1.2 nmol/L(图 4-2B)。 ·对于 N 端修饰，Satomaa 等证明，丙醇和叠氮化物衍生物19和20尽管存在亲水侧链，但仍保持了相当大的细胞效力，19和20对 SKOV3 细胞的 IC50分别为 1.0 nmol/L 和 <1.0 nmol/L 。它们的叠氮化物和炔烃可用于后续的环化反应，形成更复杂的亲水“糖交联剂”，能够与各种抗体(赖氨酸、半胱氨酸、聚糖和转谷氨酰胺酶结合物)结合。在此基础上，制备了曲妥珠单抗和 EGFR1 ADC，其体内表现良好，效力为 1.5-10 mg/kg (DAR = 3)(图4-2A)；Doronina通过将对氨基苯甲酸取代N端氨基酸而获得奥瑞他汀类似物21 ，在 Karpas 299 细胞中显示 IC50为0.12 nmol/L，含有有效载荷21的 ADC在剂量为 1 mg/kg 时缩小了 Karpas 299 人 ALCL 异种移植模型中的肿瘤体积。然而，这种 ADC 不如相关的 VC-MMAE ADC 有效(图 4-1A)；2020 年，Svetlana O. Doronina 团队设计了一系列烷基-MMAF 类似物，以研究开发具有可调膜通透性、活性和对外排泵抗性的奥瑞他汀的可能性。MMAF 在 N 端耐受大量取代基的能力提供了一种方便的方法来调节游离药物的疏水性，而不会显着影响细胞活性，他们选择了 C1 至 C12的支链和非支链脂肪族基团作为取代基，并生成了 MMAF N-烷基衍生物22，该系列衍生物的细胞毒性随烷基链长的增加而增大，取代基的空间体积和疏水性的增加均不导致活性的下降。 新型类似物结合了MMAE和MMAF的特点：高效、旁观者活性、克服MDR，这些发现进一步拓展了奥瑞他汀作为ADC载荷的作用。Agensys最近将叠氮基引入P2和P4亚基，得到化合物23 ，在MOLM13细胞中的IC50为0.057 nmol/L，由于P2或P4位点作为ADC药物的结合位点，这为下一代奥瑞他汀衍生物提供了新的方向。Luke R. Odell教授团队开发出一种奥瑞他汀衍生物阿扎他汀(azastatin) (24)，其细胞毒性(IC50=0.13-3.0 nmol/L)高于 MMAE(IC50=0.47–6.5 nmol/L)，这表明 N-二甲胺基团增加了化合物的效力。此外，该衍生物含有中心胺侧链抗体结合位点，适合用于 ADC 开发。 3.1.3. 艾日布林(Eribulin) 聚醚大环内酯类天然产物 Halichondrin B (25) 最初从 Halichondraria Okadai 等分离得到，已被证明具有良好的抗增殖活性 (图 5A)。其结构简化的新型非紫杉烷全合成类似物甲磺酸艾日布林 (26) 是一种具有抗有丝分裂作用的微管动力学抑制剂，已于 2010 年获批用于治疗局部晚期和转移性乳腺癌 (MBC)患者。Michel O. Steinmetz 团队通过晶体结构发现艾日布林与微管蛋白的结合位点是由 β-微管蛋白的螺旋 H1、H6、H7、环 H6–H7、S3–H3 (T3) 和 S5–H5 (T5) 的疏水和极性残基形成的(图 5B)。此外，艾日布林的“笼状”结构与鸟苷酸的核糖部分接触。在微管蛋白-艾日布林复合物中，配体缠绕在Tyr224的侧链上。当艾日布林与微管中两个纵向排列的微管蛋白二聚体结合时，相邻微管蛋白二聚体的α-微管蛋白的S9链、H10螺旋和T7环将与艾日布林分子主体发生碰撞。这些结果表明，艾日布林在高浓度下可将微管蛋白二聚体隔离到组装不完全的微管蛋白-艾日布林复合物中，在低浓度下干扰微管末端原丝的延伸，从而破坏微管稳定性或抑制微管动力学。 图 5. 艾日布林类似物的设计和 SAR 分析。 (A) 艾日布林类似物25-27的化学结构；(B) 艾日布林26与微管蛋白复合的结合模式。 艾日布林在肿瘤生物学中具有很强的抗有丝分裂活性，因此有望作为ADC载荷。Earl F. Albone团队通过在C-35伯胺基团上添加连接子，设计了一种以艾日布林为载荷的ADC，对卵巢癌细胞IGBOV1有很强的作用(IC50为20 pmol/L)。在非小细胞肺癌细胞NCI-H2110异种移植模型中，5 mg/kg ADC剂量可诱导肿瘤完全消除，提示微管靶向药物艾日布林可作为ADC载荷。此外，早在2011年，Sridhar Narayan实验室合成并评价了几种具有中性C32侧链的第二代艾日布林类似物，这些侧链修饰的艾日布林类似物对U-251和SF-295细胞的抑制作用明显强于艾日布林。通过在C32侧链引入低碱性胺或增加艾日布林的亲脂性，得到的化合物27在体内外对多种异种移植肿瘤有抑制作用，具有口服生物利用价值，可增加在脑脊液中的暴露量，可能为治疗脑肿瘤等更多种人类癌症提供候选药物(图 5B)。 3.1.4. 微管溶素(Tubulysins) Tubulysins (28) 是 Hofle 等从粘菌培养基中分离出的一种天然抗有丝分裂肽(图 6)，它是一种由N-甲基-D-哌可酸(Mep)、利索莱恩(L-Ile)、微管蛋白(Tuv)和微管丙氨酸(Tup)组成的线性四肽，又称微管溶素Tut(Tut)，能抑制微管蛋白的聚合，诱导细胞凋亡，对癌细胞包括耐多药KB-V1细胞有较强的抗增殖活性(IC50 = 0.08 nmol/L)，在抗癌药物研发中具有良好的前景。2018年，KC Nicolaou团队合成了高效微管溶素类似物29和30，IC50对于HEK293T 细胞，浓度分别为 6 和 3 pmol/L。2021 年，该团队使用 T2R-TTL 对化合物30进行了晶体学研究，发现化合物30与 Vinca 结构域结合，在核苷酸结合位点附近的β和α微管蛋白分子界面口袋内形成细长的构象，其中分子的苯基氨基甲酸酯部分位于α2-微管蛋白亚基氨基酸残基 L248 的疏水袋上(图 6B)。根据该组合模式，设计了一种血浆稳定性好、对NCI-N87小鼠肿瘤模型疗效显著的ADC，在肿瘤靶向治疗研究中具有潜力。 图 6. 微管溶菌素类似物的设计和 SAR 分析。 (A) 微管溶菌素类似物28-34的化学结构；(B) 化合物30与微管蛋白的复合物的结合模式。 对微管溶素的 SAR 研究证明了微管溶素中关键残基修饰的可行性： ·在 N 端，Mep 残基的 6 元环可以有效地被 5 元无环残基N-甲基-D-脯氨酸、N -甲基肌氨酸和N, N-二甲基-D-丙氨酸取代，在大多数情况下活性损失最小； ·Tuv 部分的C11-乙酰基修饰会对活性产生显著影响：乙酰基水解成二级醇将导致活性损失高达 1000 倍，但它可以容忍各种各样的变化，尤其是对N、O-缩醛发生改变； ·相反，Tup 残基是常见的可修饰给药结合位点； ·C13 上的取代基不耐受变化，将异丙基替换为环己基或芳基(苯基和对甲氧基苯基)将导致活性丧失； ·羧酸端是常见的结合位点，因此经常被修饰。 为了克服微管溶素 C-11 乙酸酯水解引起的不稳定性，Patrick J. Burke63设计了一种 C-11 烷氧基类似物31，它表现出与微管溶素 M 相似的生物活性，且显著提高了血浆稳定性(图 6A)。Chakrapani Subramanyam鉴定出一种有效的微管溶素类似物32，该类似物含有α-甲基叔胺，所得ADC在体内和体外均表现出良好的药效。程恒制备了一种含氨基甲酸酯的微管溶素类似物33，其氨基甲酸酯基团在体内稳定，对OVCAR3和N87细胞的IC50分别为0.20和0.23 nmol/L，化合物33与抗meso抗体偶联形成的ADC，0.01 μmol/L可诱导肿瘤生长明显延缓。微管溶素衍生物34含有不可水解的 N 取代基的 tubuvaline (Tuv)，在 HT-29 细胞中的 IC50 < 0.28 nmol/L，也具有作为 ADC 有效载荷的潜力。 3.1.5. 隐藻素(Cryptophycin) Cryptophycin 是由蓝藻产生的天然大环多肽，具有 16 元环，它含有两个羟基酸(A 和 D 单元)和两个氨基酸(B 和 C 单元)。Cryptophycin 不可逆地抑制有丝分裂期间的β-微管蛋白聚合，这可导致细胞周期阻滞在 G2/M 期并激活凋亡途径，从而在体外产生皮摩尔(pM)抗增殖能力。第一个合成并评估的 cryptophycin 类似物 cryptophycin-1 (35) 对 KB 细胞的 IC50为 4.58 pmol/L，对 LoVo 细胞的 IC50 为 7.63 pmol/L (图 7)，但由于大环内酯类化合物在血液循环中不稳定，其体内抗肿瘤活性并不显著。经过进一步的结构修饰，得到了C单元β-丙氨酸的α位上比cryptophycin-1多一个甲基的cryptophycin-52 (36)，增加了空间位阻，明显提高了体内稳定性。极低浓度的cryptophycin-52 (36)在有丝分裂过程中抑制细胞增殖(IC50=11 pmol/L)，而微管长度和质量没有明显变化。cryptophycin-52 (36)与微管蛋白的结合非常紧密，cryptophycin-52 (36)-微管蛋白复合物对微管的结合率非常高 (Kd=47 nmol/L)。虽然 cryptophycin-52 有效，但由于剂量依赖性毒性，它在 II 期临床试验中被终止，使用该化合物作为 ADC 的有效载荷可能会降低其毒性。最近，Paul T. Wingfield 团队在微管蛋白二聚体界面上确定了 cryptophycin-52 (36)及其母体化合物 cryptophycin-1 (35)的结合位点，该位点与美登素部分重叠 (图 7B)，α-微管蛋白和β-微管蛋白的构象均发生了变化，尤其是在螺旋H8和H10中。α、β单体之间以及cryptophycin-52(36)结合和cryptophycin-1结合微管蛋白之间存在显著差异。然后，分析了cryptophycin上合适的位点：在单元A中，对位取代的苯基比邻位取代或间位取代的类似物更有效，对位取代的苯基可作为偶联位点；单元B对细微的修饰比较敏感，比如苯环上的5-氟取代；单元C中，C6位的苄基或异丙基等大取代基会大大降低其活性；而单元D修饰后活性变化不大，单元D中的异丁基可作为偶联位点，单元D的异丁基共轭位点可能优于单元A。该分析为后续以cryptophycin为载荷的ADC设计寻找合适的共轭位点提供了参考。 图 7. 隐藻素类似物的设计和 SAR 分析。 (A)隐藻素类似物35-40的化学结构；(B)隐藻素-52 ( 36 ) 与微管蛋白复合的结合模式。 cryptophycin-52 (36)的类似物37 (IC50 = 33 pmol/L) 是一种非常有前途的临床候选药物，已由 Eli Lilly 公司获得专利(图 7A)。 隐藻素-52 中单元 A 的芳香环可以在不显著影响其生物活性的情况下进行原位修饰，这些修饰被 Sanofi-Aventis 用作抗体偶联的偶联位点。隐藻素-52-氯醇化合物，如隐藻素-55 (38)，在体内的生物活性提高了 100-1000 倍。隐藻素-55 甘氨酸 (39)在体外表现出最高的细胞活性，隐藻素-55 甘氨酸通过可切割的连接子与靶向 HER2 受体的曲妥珠单抗偶联，所得 ADC 对 SK-BR3 细胞表现出纳摩尔活性。 基因泰克将隐藻素-52 中的苯转化为苄胺，获得化合物40，适合通过氨基甲酸酯键连接。杨金良团队将 cryptophycin-52 的前体药物 CR55(在生理条件下可转化为 cryptophycin-52)与曲妥珠单抗偶联，在 HER2 阳性肿瘤细胞株中其 IC50为低纳摩尔水平(0.58-1.19 nmol/L)，10 mg/kg 相应的 ADC 在卵巢癌(SKOV3)和胃癌(NCIeN87)异种移植模型中表现出明显的抗肿瘤活性，为基于 cryptophycin-55 和 cryptophycin-52 的 ADC 抗肿瘤药物的开发提供了思路。 3.1.6. EG5抑制剂 驱动蛋白(Kinesin) (KSP/EG5/KIF11) 是一种 ATP依赖性蛋白，参与细胞周期 G2/M 期着丝粒的分离和双极纺锤体的产生，在有丝分裂中起重要作用。EG5 在血液肿瘤(例如AML 母细胞和弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL))和实体肿瘤(例如乳腺癌、膀胱癌和胰腺癌)中的高表达与其预后不良有关，使其成为一个有吸引力的癌症治疗靶点。几种 EG5抑制剂，如 SB-715992 (Ispinesib) (41) 和 Filanesib (ARRY-520) (42)，已在临床试验中(图 8A)。然而，EG5 抑制剂最常见的副作用，如中性粒细胞减少症、粘膜炎和口腔炎，以及其狭窄的治疗窗口，限制了它们的治疗效果。然而，通过利用 ADC，可以保护健康组织免受细胞毒性化合物的侵害，从而可能降低其总体毒性副作用并扩大化合物的治疗窗口。Dimitrios A. Skoufias 的团队将Eg5 Arry-520 复合物的结构与 Eg5 ispinesib 复合物的结构进行了比较 (图 8B)，两种复合物的叠加表明ispinesib的喹唑啉酮与Arry-520的二氟苯环占据相似的位置，并具有相似的相互作用。在ispinesib中，两个芳香族取代基对甲苯和苄基相互堆叠，与Glu118，Arg119以及Arg119，Trp127和Asp130侧链进一步堆叠来稳定骨架。然而，在Eg5 Arry-520复合物中，这种骨架堆叠要弱得多。此外，对于Arry-520，二氟苯基和异丁基侧链残基之间存在直接的疏水堆叠相互作用，而在ispinesib复合物中，侧链移动2 Å以容纳苄基和对甲苯和苄基-甲苯，从而完全削弱或失去这种相互作用。Arry-520与ispinesib通过Gly117的伯胺与主链氧和Glu116的侧链之间形成氢键相互作用，Arry-520中甲氧基的氧可能与Tyr211(3.63 Å)的羟基发生微弱的相互作用。另外，苯环上的一个氟与Gly217的主链NH(3.03 Å)相互作用，与Arg221(3.69 Å)的侧链发生微弱的相互作用。总的来说，Arry-520的紧密结合是通过一系列与抑制剂结合袋中氨基酸侧链的强或弱的氢键相互作用和疏水相互作用实现的。此外，Eg5变构结合位点的D130A和L214A突变均可使Array-520产生耐药性，而ispinesib对L214A突变体仍然敏感。 图 8. EG5 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A) EG5抑制剂41–45的化学结构；(B) ispinesib (41) 与 EG5复合的结合模式。 诺华公司开发了 EG5 抑制剂43、44，作为有效载荷与抗体结合，使用不可切割的连接子靶向 HER2 (图 8A)。在 HER2 表达的小鼠异种移植模型 (SK-OV-3ip) 中，单剂量静脉 ADC (5 mg/kg) 可使肿瘤生长停止 3 周，效果优于 Kadcyla (5 mg/kg)。使用非细胞渗透性 EG5 吡啶抑制剂作为有效载荷，Anette Sommer开发了一种新型 IL3RA 靶向 ADC，该 ADC 显示出有效和选择性的抗增殖作用。Carsten Terjung研究了一种新的EG5 吡咯亚类抑制剂45作为 ADC 新型有效载荷的适用性，在尿路上皮细胞癌 (UCC) 异种移植模型中，这种 ADC 显示出高效，可完全根除肿瘤。 微管破坏可诱导细胞周期停滞在 G2/M 期，这使得微管成为药物发现的一个有吸引力的靶点。在许多情况下，治疗窗口狭窄和缺乏肿瘤特异性可能导致强效微管蛋白抑制剂单独作为抗癌剂失败。然而，使用 ADC 作为靶向疗法可能是解决微管蛋白抑制剂单一疗法局限性的一种有前途的方法。目前处于临床开发阶段的 ADC 中有一半以上以微管蛋白抑制剂(auristatins和 maytansinoids)作为有效载荷。虽然微管蛋白抑制剂作为 ADC 有效载荷取得了一些商业成功，但它们受到开发过程中各种缺点的限制，例如，它只能靶向处于分裂期的肿瘤细胞，而不能靶向处于非分裂期和静止期的细胞。此外，肿瘤细胞中的微管蛋白抑制剂靶点较多，这意味着需要更大剂量的药物才能阻止微管蛋白的激活，因此这些以微管蛋白抑制剂为有效载荷的ADC药物还远未达到理想的靶向治疗理念。 3.2. DNA 靶向有效载荷 相比于微管蛋白抑制剂，DNA抑制剂能够通过双链断裂、烷基化、嵌合、交联等方式破坏DNA，作用于整个细胞周期，产生细胞毒作用，对实体肿瘤有良好的治疗效果。此外，DNA抑制剂的靶点远少于微管蛋白抑制剂，当ADC携带相同数量的载荷进入细胞时，DNA抑制剂能够表现出更好的杀伤效果。此外，以DNA抑制剂为载荷的ADC可以靶向抗原表达较低的肿瘤细胞，这也是为什么在许多下一代ADC中都选择DNA抑制剂作为载荷的原因。 3.2.1. 烯二炔(Enediyne) 从细菌来源分离的烯二炔是迄今为止发现的最具细胞毒性的天然产物之一，其摄取会通过破坏活细胞中的单链或双链DNA而导致细胞死亡，同时它还对各种细菌和肿瘤细胞具有极强的活性。烯二炔可分为两个亚家族：钙样烯二炔和蒽醌融合烯二炔。剧毒的烯二炔化合物并不适合直接用作抗癌剂，但这些抗肿瘤抗生素的效力和作用机制使它们成为有吸引力的ADC有效载荷。天然烯二炔产物最常用的ADC有效载荷是来自 Cal烯二炔类的钙血霉素(Calicheamicin)γI1(46)和蒽醌稠合烯二炔 Uncialamycin (47) (图 9A)。 图 9. 烯二炔的设计和 SAR 分析。 (A) 烯二炔46-52的化学结构；(B) 卡奇霉素γI1(46) 与 DNA 复合物的结合模式。 Calicheamicin靶向与 DNA 结合的小沟，特异性诱导 DNA 双链断裂，导致细胞凋亡。尽管最初的实验显示出很强的活性，但Calicheamicin对正常细胞 DNA 的破坏阻碍了其临床进展。尽管如此，高细胞毒性、小分子大小和明确的作用机制使Calicheamicin成为有吸引力的 ADC 有效载荷，Calicheamicin γI1(46) 是目前研究最多的Calicheamicin。Dinshaw J. Patel 和他的团队研究了Calicheamicin γI1的高分辨率结构-DNA 双链复合物，并发现Calicheamicin的芳基四糖在以寡嘧啶寡嘌呤束为中心的小沟深处的定向排列，反过来又使附着的烯二炔环定向跨越双链的两条链，在复合物的强度精细结构中(图 9B)。相对于螺旋轴倾斜的烯二炔环在小沟深处取向，允许DNA糖磷酸骨架质子被暴露的三硫键触发物和环芳构化激活后被提取，最终导致DNA链断裂。药物与DNA小沟之间的界面具有紧密的互补性，该界面跨越复合物精细结构中的整个结合位点。该研究提供了一个数据库来解决与Calicheamicin类DNA的鉴定和切割相关的两个问题。Calicheamicin γI1(46)具有强大的细胞作用，以Mylotarg为代表的ADC的出现很大程度上依赖于Calicheamicin γI1(46)的发现，其N-乙酰基衍生物成为Mylotarg的有效载荷。Nicolaou等合成了Calicheamicin γI1的类似物Calicheamicin θI1 (48)，其对多种肿瘤细胞的IC50值<1 pmol/L，也适合作为ADC有效载荷。此外， FDA批准的Inotuzumab Ozogamicin(Besponsa)也是以Calicheamicin作为有效载荷。 Uncialamycin 是从地衣中分离出来的天然烯二炔产物，能引起 DNA 切割，表现出很强的细胞活性。Uncialamycin 强效类似物的共同结构特征之一是 A 环上存在一级或二级苯胺基团，如果将胺转化为相应的苯甲酰胺，并引入末端芳胺，则可以解决不稳定性问题，同时保持活性。Sanjeev Gangwar采用苯酚烷基化法，设计了一种高效且化学稳定的 Uncialamycin 类似物49 (图 9A)。所得 ADC 通过将有效载荷与抗间皮素 (meso) 抗体结合，在 H226 细胞中的IC50为 0.2 nmol/L，在耐受剂量下表现出特异性和持久的肿瘤生长抑制作用。Julia Gavrilyuk 等选择甲胺类似物50作为 uncialamycin ADC 有效载荷，靶向 TL 和 CD46 的 ADC 在 HEK293T 细胞中表现出低皮摩尔效力。Emmanuel N. Pitsinos修饰uncialamycin，从分子的芳香部分去除一个碳，得到化合物51(待测细胞系：IC50 (H226 细胞) = 28 pmol/L； IC50 (N87 细胞) = 11 pmol/L； IC50 (OVCAR3 细胞) = 316 pmol/L； IC50 (Adr 细胞) = 20 pmol/L)。Sanjeev Gangwar将uncialamycin 类似物52与抗间皮素 (meso)抗体结合，所得 ADC 在 H226 肺癌细胞中的 IC50值为 0.98 nmol/L，IC50值为 0.88 nmol/L。 3.2.2. 拓扑异构酶 I 抑制剂(Topoisomerase I inhibitors) 拓扑异构酶 I (TOPO-I) 是一种重要的核酶，对基因组稳定性和 DNA 结构保存至关重要，已成为 ADC 的热门靶点。TOPO-I 抑制剂与先天性和适应性免疫反应有关，这表明针对 TOPO-I 的 ADC 也可能有助于抗肿瘤免疫治疗。Lance Stewart 等报道了 TOPO-I 与双链 DNA 共价连接并与临床批准的抗癌药物拓扑替康(topotecan) (53)联合使用的 X 射线晶体结构(图 10A)，拓扑替康 (53)和人类 TOPO I-DNA 共价复合物表明，拓扑替康是一种非竞争性抑制剂，通过在酶诱导的缺口处在两条 DNA 链之间插入碱基来与酶-底物复合物结合。拓扑替康的结合模式是与 DNA 的堆积相互作用、与 Asp-533 接触的氢键以及与磷酸酪氨酸和 Asn-722 之间的活性位点的水桥接触。天然五环产物喜树碱 (camptothecin, CPT) (54) (图 10B)是拓扑替康 (53)的类似物，是一类特别有吸引力的 ADC 有效载荷，它通过与 TOPO-I 和 DNA 结合形成稳定的复合物，诱导 S 期细胞中的双链 DNA 断裂，从而导致细胞凋亡。然而，喜树碱的溶解度极低，阻碍了其作为癌症治疗药物的广泛使用。SN-38 (56) 是伊立替康(irinotecan) CPT-11 (55)的有效成分，是一种半合成喜树碱，尽管 SN-38 具有所需的效力，但由于其高度疏水性和可用的结合位点数量有限，活性结合物的制备具有挑战性。尽管如此，SN-38 已与针对滋养层细胞表面抗原 2 (Trop-2) 的人源化抗体结合，从而产生 ADC sacituzumab govitecan，该药物正在临床研究中。甲磺酸依沙替康 (DX-8951f) (57) 是一种水溶性 CPT 衍生物，与其他 CPT 类似物相比，具有更强的 TOPO-I 抑制和抗肿瘤活性。DXd (DX-8951 衍生物) (58) 是一种新型、高度膜通透性的拓扑异构酶 I 抑制剂，细胞 IC50为2.05-17.88 nmol/L，可克服P-糖蛋白介导的多药耐药性，对各种肿瘤移植模型有更强的疗效，包括体内CPT-11耐药肿瘤。 图 10. 拓扑异构酶 I 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A) 拓扑替康 (53) 与 TOPO I-DNA复合物的结合模式； (B) 拓扑异构酶 I 抑制剂53-60的化学结构。 DXd (58) 有一个包含第二个手性中心的 F 环，使其合成和衍生化变得复杂。为了简化其结构，Wayne C. Widdison 的SAR 研究表明，C11 位氟取代通常会使细胞毒性增加数倍，而 C20 中心必须处于S构型才能使分子保持活性，依沙替康内酯稳定性的提高归因于 C11 氟取代基和 F 环的作用。衍生自喜树碱衍生物58和59 的ADC能有效释放部分含硫化物或硫醇的喜树碱代谢物，这些代谢物对靶向的抗原阳性细胞有较强的抑制作用，在HSC-2和H1703 EGFR+异种移植模型中均表现出相似的剂量依赖性抗肿瘤活性。有效载荷59中没有F环，但其结合物在体外和体内的药效与含DXd的结合物相似，这种简化使喜树碱A环和B环的衍生化更易于用于构效关系研究和有效载荷优化。余东科通过将DXd与曲妥珠单抗偶联，获得了一种新型的HER2靶向ADC DS-8201a。SAR显示C-10的羟基取代可以增强CPT的抗肿瘤活性，而C-7和C-10的脱取代可以稳定内酯环并提高分子生物学活性。DXd在C-7和C-9位点环化，从而增加了抑制活性。DS-8201a避免了耐药性，并且通过旁观者杀伤效应在治疗异质性肿瘤方面非常有效。Scott C. Jeffrey开发了一种新型亲水性和蛋白酶溶解性谷氨酸三肽配体，使用具有高细胞毒性的7-氨基甲基-10, 11-亚甲基二氧CPT类似物60作为有效载荷，缀合的ADC在CD30高表达菌株和MDR阳性的786-O肾细胞癌裸鼠中均表现出有效的抗肿瘤活性。 3.2.3. PBD 链霉菌中发现的吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮卓类 (PBD) (61)是一类具有抗肿瘤活性的天然产物(图 11)，该类化合物由一个芳香族A环、一个1-4-二氮杂-5-1B环和一个吡咯烷C环组成，其作用方式是在DNA小沟内选择性烷基化，鸟嘌呤的N2与PBD的亲电性N10/C11亚胺形成共价键，DNA链间交联造成持续的DNA损伤，导致细胞周期停滞在G2/M期，引起细胞凋亡，从而表现出强大的细胞毒作用。Klaus Weisz团队的NMR结构数据证实了PBD杂合子与DNA双链小沟的强结合，PBD部分与外环鸟嘌呤氨基之间形成共价键。 图 11. PBD 类似物的设计和 SAR 分析61-72。 PBD二聚体具有作为ADC载荷的潜力，例如以PBD为载荷设计的靶向ROR1的ADC CS5001，在多种表达ROR1的肿瘤细胞系中表现出很强的选择性，并在血液和实体瘤异种移植小鼠模型中表现出显著的体内抗肿瘤活性，目前正在进行临床试验。为了进一步扩展更多PBD类化合物作为ADC载荷，Rahman等对PBD的C8位置进行了修饰，得到化合物62，其偶联物具有临床前活性。基于化合物62，Khondaker Miraz. Rahman合成了PBD核心，并利用苯并呋喃和N-甲基吡咯的组合构建了C8杂化物63(图 11)。随后，通过系统地缩短含有吡咯苯并呋喃结构域的C8连接单体，获得了一系列化合物(例如，化合物64的C8连接单体通过去除酰胺而缩短)。研究发现，PBD在C8位置的相对较短的侧链足以赋予细胞毒性，因此缩短的PBD单体可以用作新的ADC有效载荷。二氢苯并呋喃化合物64在原发性CLL细胞中毒性较大，而打开呋喃环在原发性CLL细胞和JN-3细胞系中也保持较低的纳摩尔活性。苯并呋喃中苯元素的变化对细胞毒性影响更显著，去除环的芳香性后细胞毒性明显降低。Jagath R. Junutula鉴定出一种异喹啉苯并二氮卓类 (IQB) 有效载荷65，其 (S, S) 立体化学在 C6a 位对于最佳 IQB 活性至关重要，这是一类新的 PBD二聚体 DNA 损伤有效载荷，在 HEPG2 A704 细胞系中表现出高活性，细胞毒性吡咯并苯二氮卓 (PBD)-二聚体分子经常用作 ADC 的有效载荷。为了进一步探索这种 ADC 有效载荷类别，Peter S. Dragovich通过系统地将酸性和碱性部分引入其化学结构中来修改其物理化学性质，结果表明，含有酸性官能团(包括高度可电离的部分，例如化合物66中存在的磺酸)的PBD-二聚体有效载荷) 能够在抗体介导的递送后有效地从细胞溶酶体转运到细胞质和/或细胞核。修饰的 PBD 二聚体化合物66与 CD22 抗体偶联，得到针对 BJAB 细胞的 IC50为 12 nmol/L 的 ADC，显著提高了未偶联 PBD 二聚体的抗增殖活性。PBD 二聚体有效载荷66将有助于设计出具有更高治疗潜力的新型ADC。Peter S. Dragovich探索了含二硫键前药的PBD二聚体作为抗体-药物偶联物的有效载荷，发现许多含二硫键前药的PBD单体对细胞内GSH水平相对较高的细胞(如KPL-4细胞)表现出较强的抗增殖活性。多种二硫键前体在生理浓度的Cys下稳定，但在肿瘤细胞中存在GSH的情况下不稳定。增加化合物67和68的端隙体积可显著提高其稳定性，例如，得到的化合物69和70含有两个甲基的 PBD 二聚体对 GSH 和 Cys 都具有高度稳定性，噻吩衍生的二硫化物在体内的稳定性得到了改善。在这些常见的 PBD 有效载荷中，PBD 二聚体上的结合位点分为两类：C2 和 N10。C2 结合的一个例子是有效载荷71，它包含一个连接到 PBD C2 位的苯环。靶向 CD19 的 ADCT-402 的有效载荷 SG3199 (72) 通过其 N10 位点进行结合，由于 PBD B 环上的 N10 位点参与与 DNA 的共价结合，因此连接子与 N10 位点的结合比与 C2 位点的结合更安全。在PBD载荷的后续工作中，其共轭位点也可作为影响修饰方向的一个因素。 3.2.4. 多卡米星(Duocarmycin) Duocarmycin A (73) 是从链霉菌中分离出来的一种强效 DNA 烷基化剂，由 DNA 烷基化部分和结合部分组成 (图 12A)。第一个发现的天然多卡米星成员 CC-1065 (74) 通过其高活性的丙烷环与 DNA 微沟结合，并在 N3 位烷基化腺嘌呤，最终导致细胞死亡。尽管 CC-1065 (74)在体外具有很强的效力，但在动物模型中仅显示出中等体内活性和不可逆的肝毒性。为了改善这些化合物的生物学特性，将它们用于 ADC 可能是一个可行的选择。Walter J. Chazin 等描述了 duocarmycin SA 的非天然对映体和 DNA 加合物的结构，发现 duocarmycin SA 的两种对映体可以在 AATTA 双链上共享相同的结合位点和相同的结合方向，但烷基化不同的位点(图 12B)。两种对映体对互补链的烷基化发生在相同的结合方向，但非天然对映体偏移一个碱基对。这种差异对两种加合物的结构具有重要意义，因此会影响它们的相对烷基化效率。对这种与相同 AATTA 双链结合的新结构的分析解释了天然和天然 DNA 位点选择性的相似性和差异性非天然对映体。在duocarmycin/CC-1065 家族的 DNA 加合物的所有结构中都观察到了亚基间扭曲，由于 DNA 具有左手螺旋扭曲，因此 DSA 的三甲氧基吲哚亚基在小沟中结合时相对于烷基化亚基自然倾向于以逆时针方式扭曲。因此，DNA 分子本身的手性对 (+) 对映体药剂施加了重要的限制，而 (-) 对映体药剂则不存在这种限制。两种 DSA 对映体的庞大 C24 甲氧基位于小沟底部的大致相同位置，位于 A16 和 T17 碱基之间的裂缝中。这项研究为控制这些化合物的DNA烷基化率的因素以及DNA结合诱导的烷基化反应激活的重要性提供了新的认识。 图 12. 多卡米星类似物的设计和 SAR 分析。 (A)多卡米星类似物73-80的化学结构； (B) 多卡米星 A (73) 与 DNA 复合物的结合模式。 Patrick H. Beusker开发了一种基于多卡米星的用于还原链间二硫键的新型有效载荷，它与抗 HER2 抗体曲妥珠单抗结合，产生具有良好体内和体外特性的 ADC SYD985。多卡米星 DUBA (75) 具有咪唑 [1, 2-a] 吡啶基，以其无活性的前药形式seco-DIBA (76)掺入结合药物中(75通过76的自发螺环化形成) (图 12A)。化合物76含有两个羟基，每个羟基都可以通过连接子与抗体偶联。Moana Tercel 采用 Pd 催化胺化法将seco-CBI(seco-1,2,9,9a-四氢环丙[c]苯并[e]吲哚-4-酮，一种合成的duocarmycin 天然产物烷基化亚基的类似物)从苯酚转化为氨基形式，然后得到苯酚 CBI 类似物77, 78和氨基 CBI 类似物79, 80。化合物77对6种人类肿瘤细胞系的IC50在 0.1-2 pmol/L 范围内，更换化合物77或78苯酚 CBI 与相应的化合物79和80氨基 CBI 结合可显著降低药效，且对 P-gp 过度表达的敏感性更高。尽管如此，化合物79在大多数测试细胞系中保持了显著较低的皮摩尔细胞毒性，并且与化合物77、78和80一样，在足够高的浓度下完全抑制了所有细胞系的增殖。 ADC领域的一个明显趋势是治疗靶点从血液肿瘤转向实体肿瘤，这一趋势可能将有效载荷的选择从微管靶向抑制剂转向DNA损伤剂，DNA损伤剂通常表现出更高的效力，并符合新一代有效载荷要求比当前有效载荷具有更高治疗指数的标准。此外，使用DNA损伤剂作为有效载荷可以靶向相对低表达水平的肿瘤特异性/相关表面受体。DNA损伤剂作为ADC的有效载荷的使用已经很成熟，但由于DNA损伤难以修复，这可能导致潜在的毒副作用，目前仅有一款以PDB为有效载荷的ADC在临床上使用，因此其安全性/耐药性问题仍需进一步研究，未来还需要研制更多新一代ADC有效载荷。 3.3. RNA 靶向有效载荷 仍有许多肿瘤对 ADC 不产生反应或产生耐药性，生长缓慢的肿瘤细胞通常不像快速分裂细胞那样依赖微管蛋白介导的细胞过程。因此，为了进一步扩大 ADC 有效载荷的范围并识别出对快速和慢速增殖细胞均有效且可以逃避 MDR 介导的耐药性的其他类型 ADC 有效载荷，人们将注意力转向了靶向 RNA 的小分子有效载荷。靶向 RNA 的小分子抑制剂可以杀死分裂和休眠的肿瘤细胞，用作 ADC 有效载荷有望解决无效肿瘤休眠细胞引起的肿瘤耐药性和肿瘤复发和扩散问题。目前可用于ADC有效载荷的RNA抑制剂主要有两种：RNA剪接抑制剂(Thailanstatin及其类似物)和RNA聚合酶II抑制剂(Amatoxins)。 3.3.1. 泰兰他汀(Thailanstatin) RNA剪接主要通过切除负责将RNA转化为mRNA的复杂细胞机制的内含子和外显子来控制代谢、血管生成、癌细胞增殖和转移，它们还可以直接控制转录的起始、延长和终止，这是癌症抑制的生物学靶点。Abdel-Wahab等研究发现在RNA剪接调控药物的干扰下，肿瘤细胞可以产生新抗原，这些新抗原可以通过MHC I类分子以新抗原表位的形式呈递，从而激发抗肿瘤免疫，表明RNA剪接调控可以作为肿瘤抗原的潜在来源，具有应用于肿瘤免疫检查点治疗的潜力。剪接体抑制剂是强效的抗增殖药物，能够靶向活跃分裂和静止的细胞，因此RNA剪接体抑制剂是一类很有前途的ADC有效载荷。Thailanstatin是一种天然产物，最初从泰国布鲁氏菌msmb43中分离得到，通过与剪接体U2 snRNA亚复合物的SF3b亚基结合而被激活。Thailanstatin 家族通过抑制真核生物的 mRNA 剪接途径，对剪接体具有很强的结合和抑制作用，导致低纳摩尔 IC50 个值适用于多种癌细胞系，可用作 ADC的潜在有效载荷。 Yi-Qiang Cheng报道了从MSMB43 中分离得到的三种新的 thailanstatin 化合物：thailanstatin A (81)、thailanstatin B (82) 和 thailanstatin C (83) (图 13)。Thailanstatin A(81)是一种潜在的天然抗癌药物候选物，Thailanstatin药物整体结构与剪接体抑制剂候选物FR901464 (84)相似，不同之处在于Thailanstatin的C1位缺少一个不稳定的羟基，而C17位则多了一个羧基部分，因此Thailanstatin具有更好的稳定性。Thailanstatin A(81)和FR901464 (84) C3位的高活性环氧物对抑制前mRNA剪接和癌细胞增殖至关重要，通过卤化修饰Thailanstatin B(82)和Thailanstatin C(83)可降低化合物的生物活性) 对环氧物的作用，向 Thailanstatin C (83)添加甲基(与 Thailanstatin B (82)相比)对化合物的生物活性没有显著影响。Stephan Rigol合成了 Thailanstatin 类似物85和86，它们的 IC50值为皮摩尔。辉瑞首次探索了 RNA 剪接抑制剂作为抗体药物偶联物的有效载荷，将含羧酸的Thailanstatin 半合成类似物87直接与曲妥珠单抗表面赖氨酸偶联，得到非常有效的 Thailanstatin ADC。化合物87其对应的ADC在HER2高表达的胃癌细胞株N87和MDR1过表达的细胞株中均有效(化合物87在N87细胞中的IC50为1.8 nmol/L)，此外该ADC在胃癌异种移植模型中，低至1.5 mg/kg剂量暴露即可产生优异的药效，优于临床批准的ADC T-DM1。 图 13. 泰兰他汀类似物的设计和SAR分析81-87。 3.3.2. 鹅膏毒素(Amatoxins) 鹅膏毒素于1941年由Heinrich Wieland和Rudolf Hallermayer首次分离出来，鹅膏毒素是由核糖体合成的有毒双环八肽，是真核RNA聚合酶II的选择性抑制剂，可导致细胞凋亡。鹅膏毒素含有八个l构型氨基酸的大环，色氨酸和半胱氨酸残基通过亚砜部分连接，其三个侧链被羟基化，因此具有良好的水溶性。对鹅膏毒素研究最深入的是α-鹅膏毒素(88)，含有6-羟色氨酸(Htp)、反式-4-羟脯氨酸(Hyp)和(3R, 4R)-4,5-二羟基亮氨酸(Dhil)，是迄今为止已知的最有效、最特异的RNA聚合酶II抑制剂，具有突破耐药性或摧毁静息期肿瘤细胞的潜力，有效阻止肿瘤转移和复发(图 14A)。 Roger D. Kornberg团队分析了RNA聚合酶II- α-鹅膏蕈碱的晶体结构，发现抑制剂的位置与Bridge Helix相邻，而Trigger Loo在远离添加位点处主要处于稳定构象(图 14B)。α-鹅膏毒肽环肽骨架形成一个口袋，允许特定的互补氢键与Rpb1 His1085侧链咪唑环结合，为Trigger Loo形成一个约束点，α-鹅膏毒肽口袋对咪唑的特异性主要通过Gly7的酰胺NH与Rpb1 His1085 N(D1)的相互作用以及Asn1的羰基与Rpb1 His1085 NH(E2)的相互作用实现。研究表明，α-鹅膏毒肽通过直接干扰RNA聚合酶II的Trigger Loo来抑制RNA聚合酶II的延伸，并表现出缓慢降低的底物选择性。 图 14. 鹅膏毒肽的设计和 SAR 分析。 (A) 鹅膏毒肽 88、89 的化学结构； ( B ) α-鹅膏毒肽 (88) 与 RNA 复合物的结合模式。 鹅膏毒素引起的细胞凋亡、坏死等毒性阻碍了其临床应用，但由于其分子量小、在水溶液中溶解性好、能抑制RNA聚合酶Ⅱ，近年来作为抗体-药物偶联物的有效载荷在癌症研究中受到越来越多的关注。α-鹅膏毒素ADC很可能同时作用于增殖细胞和静止期肿瘤细胞，在ADC领域，使用鹅膏毒素作为有效载荷是一种比较新的方法。HDP-101，一种由海德堡制药公司开发的以鹅膏毒素为载荷的靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的ADC，目前正处于I/IIa期临床试验，用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤，并于2022年2月15日完成首例患者给药。HDP-102是一种靶向CD37的ADC药物，靶向治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)。HDP-103靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)，靶向适应症为转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)。Steffen Goletz113将β-鹅膏毒肽(89)的羧基与IgG赖氨酸的氨基偶联，得到一种具有良好血浆稳定性和高细胞毒性的ADC(图 14A)。 以泰兰他汀(thailanstatin)和鹅膏毒素为载荷的ADC能够避免耐药性，有效对抗休眠肿瘤细胞，而现有的标准疗法很难达到这一效果，常常导致肿瘤复发和耐药。因此，除了微管蛋白抑制剂和DNA损伤剂作为载荷外，新一代RNA抑制剂作为ADC载荷也越来越受到关注。虽然目前还没有RNA载荷的ADC上市，但其巨大的潜力值得进一步挖掘。 3.4. 免疫 ADC 有效载荷 最初ADC 仅限于肿瘤学，然而它们的临床成功鼓励了 ADC 在其他治疗领域的应用，最引人注目的是免疫学。肿瘤免疫涉及 T 细胞、巨噬细胞、树突状细胞等，它们通过免疫调节将冷肿瘤转化为热肿瘤，最终增强免疫治疗的效果，免疫检查点抑制剂通过消除肿瘤对 T 细胞的抑制来增强 T 细胞的抗癌免疫反应。然而，对于没有自发性 T 细胞反应和肿瘤周围 T 细胞浸润的癌症患者(其肿瘤通常称为冷肿瘤)，免疫检查点抑制剂效果不佳。因此，免疫疗法研发的重点之一是开发能够刺激患者先天免疫反应并促进肿瘤特异性 T 细胞募集的抗癌疗法。与传统ADC不同，免疫刺激抗体偶联物(immune-stimulating antibody conjugates, ISAC)结合了抗体导航靶向的精准性和基于小分子调节先天和适应性免疫系统的强大功能。一方面，抗体偶联免疫激动剂类型的小分子，起到增强免疫反应的作用；另一方面，抗体的肿瘤靶向性降低了小分子免疫激动剂的毒性。在靶标选择方面，传统ADC由于载荷毒性必须严格限制肿瘤特异性抗原，而免疫调节ADC可以拓展更多的肿瘤相关抗原。在内吞作用方面，传统ADC是靶向抗原介导的内吞作用，直接杀死癌细胞，而免疫调节ADC通过免疫细胞表面的FcγR介导的内吞作用激活免疫细胞。目前，多种免疫调节ADC药物正在开发中，新的有效载荷主要包括Toll样受体(TLR)激动剂和干扰素基因刺激剂(STING)激动剂，该领域具有巨大的发展潜力。 3.4.1. Toll 样受体激动剂 Toll 样受体(Toll-like receptors, TLR)是一类重要的参与先天免疫的蛋白质分子，是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障。TLR 受体的激活能够改善肿瘤微环境中树突状细胞和巨噬细胞的抗原呈递，促进 CD8+ T细胞。Toll样受体激动剂作为免疫增强剂，在肺癌、黑色素瘤、白血病、胶质瘤等肿瘤中直接或间接诱导增强的抗肿瘤免疫反应，从而有效抑制肿瘤生长。因此，将TLR激动剂应用于肿瘤免疫治疗，有望激活先天免疫反应，介导获得性免疫反应，使冷肿瘤变热，解决单一免疫检查点抑制剂应答率低的问题，提高免疫治疗的有效性，达到重塑肿瘤微环境的目的。目前，TLR已成为免疫治疗领域的研究热点之一，而在TLR家族成员中，研究者较多关注的是TLR7、TLR8、TLR9。TLR8激动剂(90) (91)激活DC细胞并增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤(图 15)，然而免疫治疗往往伴随副作用，如细胞因子释放综合征，这是一种常见的引起全身炎症的疾病。TLR8激动剂的全身给药也存在相关的毒性，限制了患者可以服用的TLR8激动剂的数量。因此，将TLR8激动剂应用于ADC，可以同时结合抗体的靶向作用和TLR8的免疫调控作用，减少毒副作用。Toshiyuki Shimizu团队发现TLR7 TM螺旋与TLR7-TLR信号调节剂(UNC93B1) TM3和TM6螺旋及近膜区对齐，LRR-CT基序与UNC93B1 N末端六螺旋束的腔侧相互作用。TLR7–UNC93B1复合物的二聚化由TLR7-TLR7和UNC93B1-UNC93B1相互作用介导，它们分别发生在2：2复合物的顶部和底部区域。LRR11从TLR7 ECD中部区域突出的环区主要有助于TLR7的二聚化，而UNC93B1两个原体TM6和TM7连接区域的胞内螺旋以反向平行的方式相互作用，该研究阐明了TLR'的结构基础与 UNC93B1 的相互作用并促进了随后设计针对自身免疫疾病的化合物。 图 15. TLR激动剂的设计和SAR分析90-92。 Silverback 的 SBT6050是一种抗 HER2 抗体结合物，含有 TLR8 激动剂91作为其有效载荷，在体外以HER2依赖的方式驱动多种抗肿瘤免疫机制，并在小鼠肿瘤模型中表现出良好的抗肿瘤作用(图 15)。一类新的TLR7/8双重激动剂已被报道能促进肿瘤对免疫检查点抗体的反应，尤其在冷性肿瘤中。虽然该团队发现的小分子具有显著的抗肿瘤作用，且与PD-1和PD-L1抗体联合使用可观察到显著的协同作用，但与其他已报道的TLR激动剂类似，小分子在外周血中仍然过度暴露，导致更明显的免疫相关不良反应(immune-related adverse reactions, irAE)，如体重减轻和流感样症状。为了避免直接服用TLR7/8激动剂可能引起的不良反应，团队于2015年开始尝试抗体偶联药物策略，经过数年探索，成功构建了一类新型免疫调节抗体偶联药物HE-S2，其以TLR7激动剂 (92)为靶点为有效载荷，动物实验结果显示，HE-S2(150μg/小鼠)具有非常显著的抗肿瘤作用，给药后大部分结肠癌小鼠肿瘤基本消失，而在黑色素瘤模型中，HE-S2治疗效果也优于对照组。重要的是，HE-S2治疗组小鼠没有出现明显的体重下降。此外，给药后小鼠肿瘤虽然有所萎缩，但肿瘤微环境中肿瘤细胞表面及免疫细胞PD-L1表达明显增高，这可能有利于提高后续HE-S2给药的靶向性。新型ADC HE-S2不仅通过阻断PD-1/PD-L1相互作用、激活TLR7/8信号通路诱导强大的抗肿瘤免疫反应，而且还通过表观遗传调控和 IFN-γ，从而赋予 PD-1/PD-L1 阻断更高的敏感性。 Michael N. Alonso团队将 TLR7/8 激动剂与 HER2 抗体偶联，得到一种 ADC 药物，该药物通过识别 FcγR依赖的吞噬作用和 TLR 介导的肿瘤抗原激活，驱动髓系细胞肿瘤杀伤和随后的 T 细胞介导的抗肿瘤免疫，适合全身给药，安全有效。此外，越来越多的公司开始将 TLR激动剂用于抗体药物偶联： Bolt 公司的 BCC-1001，用于治疗 HER2+ 阳性实体瘤，源自 HER2 的 TLR7/8 激动剂偶联，已进入临床研究；Sutro 的 IADC 技术可用于将抗体与 TLR 激动剂偶联；Tallac 的 TRAAC 技术用于位点特异性抗体与 TLR9 激动剂的偶联；ALX Oncology 的 SIRP α与Tallac合作开发的抗体可与TLR9激动剂偶联，恒瑞医药采用TLR7激动剂，百济神州采用TLR7/8激动剂，信达生物引入Bolt技术，采用TLR7/8激动剂进行偶联，Silverback公司的ImmunoTAC技术选择TLR8激动剂作为有效载荷。这些研究提供了一种增强免疫检查点阻断疗法抗肿瘤免疫应答的新型ADC策略，同时该策略也为解决直接使用免疫激动剂导致药物质量不佳的问题提供了一种思路。 3.4.2. STING 激动剂 干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)是天然免疫信号通路中的关键调控因子，具有启动机体天然免疫防御反应、促进T细胞形成适应性免疫的功能。STING介导的I型干扰素信号通路是天然免疫领域的重大发现，为肿瘤免疫治疗提供了新的靶点。激活STING通路可诱导I型干扰素及多种其他细胞因子的表达和分泌，激活天然免疫反应，促进抗肿瘤免疫反应，达到治疗肿瘤的目的。STING激动剂广泛应用于多种研究领域，除了诱导天然免疫反应外，还参与其他DNA或RNA传感信号通路、自噬、ER应激和细胞凋亡。STING激动剂凭借抗肿瘤和免疫原性的特点，也成为新型免疫治疗试验药物和疫苗佐剂。现有的临床研究数据初步证明STING激动剂与免疫检查点抑制剂联合使用可显著增强免疫治疗疗效，有望成为一种创新疗法。非核苷小分子STING激动剂具有良好的稳定性，可以在动物模型中口服或注射给药，并显示出良好的抗癌活性。但由于STING蛋白也存在于健康细胞中，因此系统性STING激动剂需要解决的问题之一是如何刺激抗肿瘤免疫反应，而不会引起健康细胞过度的炎症反应。如果这些激动剂能够进一步优化，它们有可能彻底改变免疫治疗领域。 考虑到游离型STING激动剂的全身给药可能受毒性限制，且广泛的生物分布可能并不理想，可以考虑通过ADC实现STING激动剂的肿瘤靶向递送，以降低毒性。环状二核苷酸(CDN)(93)作为STING蛋白的天然配体已被广泛研究(图 16A)。顾立川团队确定了猪STING复合物的CBD(CDN结合位点)，该复合物含有4种CDN：2, 3 cGAMP；3, 3 cGAMP；c-di-GMP和c-di-AMP。其中，不对称配体2, 3 cGAMP与STING的结合亲和力最高(图 16B)。对猪 STING CBD 2′, 3′-cGAMP复合物进行结构分析，发现不对称单元包含两个 STING CBD 分子(原体 A 和 B)，形成二聚体。各个原体通过 α1、α2、α3 和中心β-片层区域相互作用，形成深 U 形裂口。2′, 3′-cGAMP 配体位于裂口处，嘌呤向上，核糖环向下(与膜相关)，碱基、磷酸和核糖基团均有助于与 STING 结合；2′,3′-cGAMP 的嘌呤环与两个启动子的 Tyr167 和 Arg238 堆叠；2′,3′-cGAMP 的磷酸部分通过静电相互作用和氢键被 Arg238 识别，Arg238 还在核苷部分的 Hoogsteen 边缘形成氢键。除了堆叠相互作用外，腺苷和鸟苷部分与 STING 具有不同的相互作用模式。对于两者，相互作用都涉及它们的 Watson-Crick、Hoogsteen 和糖边缘，嘌呤中的所有氮原子(9 位氨基除外)和氧原子都直接或间接(水介导)与 STING 蛋白相互作用，这些广泛的相互作用与配体和猪 STING CBD 之间的高结合亲和力一致。猪 STING CBD-2′, 3′-cGAMP复合物的一个显著特征是两个原体采用不同的构象，从而形成不对称的配体结合口袋。因此，同样不对称的 2′, 3′-cGAMP 在配体结合口袋中保持一种明确的构象。这种独特的结合模式与之前涉及其他物种的 STING 蛋白的结构中看到的结合模式形成鲜明对比，其中 2′, 3′-cGAMP 以两种替代模式与对称 STING 二聚体结合，腺苷和鸟苷部分互换位置。总之，研究发现猪 STING 采用不对称构象与 CDN 结合，对这种不对称构象的分析揭示了 STING 的配体识别和识别机制。 图 16. STING 激动剂的设计和 SAR 分析。 (A) STING 激动剂93-96的化学结构；(B) CDN (93) 与 STING 复合的结合模式。 以CDN作为ADC有效载荷，CDN与抗体可以通过磷酸酯、糖环、碱基等偶联，SPEROVIE将CDN中的硫代磷酸酯或甲酸酯与PD-1或CTLA-4抗体偶联形成ADC药物；Immunesensor从CDN 3′位核糖上引出氨基或巯基，再通过氨基甲酸酯或二硫键与抗体偶联形成ADC药物；MIT和Millennium创新性地将磷脂分子偶联到CDN的磷酸酯上，所得缀合物还可进一步形成脂质体结构，提高其与细胞膜的融合能力。北京宣仪药将TLR9激动剂CpG-DNA与CDN连接形成融合分子，可同时激活TLR和STING免疫信号通路，增强免疫活性。然而，CDN结构中的二磷酸酯会导致药物的生物利用度降低。因此，随着苯并咪唑类化合物的发现，非核酸结构的STING激动剂的研究已经开始。基于二聚苯并咪唑的ADC药物也被设计和合成。Mersana使用STING激动剂94作为有效载荷获得的ADC候选药物XMT-2056已经进入临床前研究阶段(图16A)，其目的是通过刺激肿瘤组织免疫细胞和肿瘤细胞中的STING信号来激活先天免疫系统。与STING激动剂相比，XMT-2056的效力增加了100倍以上。在临床前模型中，XMT-2056在HER2高表达和低表达的模型中均显示出强大的抗肿瘤活性，当与多种批准的药物(包括曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、抗PD-1 mAb或DS-8201)联合使用时，其疗效得到增强。临床前数据表明，XMT-2056具有实现免疫记忆以延长抗肿瘤活性的潜力。今年5月，美国食品和药物管理局授予该药物治疗胃癌的孤儿药称号。Mersana计划在今年晚些时候启动XMT-2056的I期临床试验，以研究其在一系列HER2阳性肿瘤(如乳腺癌、胃癌和非小细胞肺癌)中的治疗潜力；日本小野制药开发了一种非核酸STING激动剂95作为有效载荷，通过药物结构中的吡唑环与连接剂偶联，RYVU是基于公司开发的一类与抗体形成ADC药物的硝基杂环胺STING激动剂96。 3.4.3. 糖皮质激素受体调节剂(GRM) 糖皮质激素受体调节剂 (Glucocorticoid receptor modulator, GRM) 通常用于治疗与各种疾病相关的炎症，有可能在保持 GR 逆转录效应(被认为是预期的抗炎作用的原因)的同时，将 GR 逆转录效应(被认为是不良副作用的原因)降至最低。然而，GRM 还会引起肌肉骨骼、内分泌和胃肠道副作用以及其他毒性，从而限制其治疗效果(尤其是长期使用时)。使用 GRM 作为免疫型 ADC 的有效载荷可能是一种理想的选择，因为靶向给药将最大限度地减少全身对 GRM 有效载荷的暴露，从而可以在不引起有害副作用的剂量下提供显着的疗效，并能够实现慢性给药。这种 ADC将结合单克隆抗体(针对炎症靶点)和选择性糖皮质激素受体调节剂的功效，糖皮质激素有效载荷含有胺基官能团，可用于结合溶酶体可切割抗体连接子。首次报道 GRM 作为 ADC有效载荷时使用了已知的地塞米松(dexamethasone) (97) (图 17A)，GRM ADC抗体组分选择了α-TNF，连接子则连接在地塞米松的C21羟基上。艾伯维正在开发的ABBV-3373也是由α-TNF和GRM组成的ADC药物，可以精准靶向调控活化免疫细胞，调节TNF介导的炎症信号通路，显著降低糖皮质激素相关的全身副作用，并有望治疗类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)。近期，Adrian D. Hobson启动了α-TNF-GRM ADC项目，并获得了α-TNF-GRM ADC (DAR=4)，使用马来酰亚胺-Gly-Ala-ALA 作为连接子。P1NP 和皮质酮生物标志物的分析表明，ADC 在疗效和不良反应之间具有足够的治疗窗口。在慢性小鼠关节炎模型中，α-TNF-GRM ADC 比具有相同 GRM 有效载荷的α-TNF 单克隆抗体和同型对照更有效。 图 17. 糖皮质激素受体调节剂 (GRM)的设计和 SAR 分析。 (A) GRM 97-102的化学结构； (B) 化合物97与 GR 复合的结合模式； (C) 化合物98与 GR 复合的结合模式。 Victor Gualla研究小组确定了 GR 与地塞米松(97) 和98 (前体药物环索奈德的活性代谢物) 的晶体结构，GR 和地塞米松(97) 的结构采用开放构象，GR 在 H6–H7 区域表现出较高的突变频率。对 PDB 共晶体结构进行评估，其中配体在 GR 的配体结合域 (残基 500–777) 中复合，揭示了与 GR 复合的去异丁酰环索奈德的结构 (图 17B 和 C)。Peter S. Dragovich合成测试了多种含有不同胺取代缩醛基团的类似物，其中哌嗪化合物99表现出与地塞米松 (97)和化合物98 (GRE 细胞，+ mTNF，IC50 = 33 nmol/L) 相似的细胞活性。然而，化合物99的渗透性较差，这可能是由于化学结构中存在碱性胺，从而削弱了其细胞功效。化合物99使用二肽基蛋白酶 (Ala-Ala) 可切割连接子与抗 TNF mAb 结合，所得结合物在基于细胞的评估中活性较弱 (IC50 = 8.1 μmol/L)。进一步研究发现含苯胺的化合物100比化合物99更有效，且其 GR 结合和细胞活性与地塞米松 (97)和化合物98 (GRE 细胞，+ mTNF，IC50 =4.0 nmol/L) 相似或更好。随后，通过将化合物100通过含有蛋白酶可切割的二肽部分但缺少氨基苄氧羰基间隔基的连接子与抗 TNF 单克隆抗体结合，所得结合物在含有膜结合 TNF 的细胞中表现出强的 GR 活性，而在外部缺乏该蛋白质的细胞中表现出最小的活性(GRE 细胞，+ mTNF，IC50 = 0.44 μmol/L；GRE细胞，mTNF，IC50>50 μmol/L)。在胶原诱导性关节炎 (CIA) 模型中，以 1、3 和 10 mg/kg 的剂量对小鼠进行腹膜内注射，在 21 天内爪肿胀程度呈剂量依赖性下降。重要的是，这种结合物具有较低的毒副作用。因此，通过抗体结合物靶向递送糖皮质激素可以最大限度地减少不良副作用，同时提高未结合化合物的抗炎活性。 William Olson团队描述了新的糖皮质激素类药物，他们开发 GC 结合物 (GC-ADC) 的策略是确定布地奈德(budesonide)中可以进行修改的区域，以提高结合物对新游离有效载荷的稳定性和滴度。然后评估了两种布地奈德的修饰方法：首先，用胺或苯胺取代 C21 羟基，其次，用氟取代 C9 和 C6 氢。含有胺和苯胺的有效载荷可以通过氨基甲酸酯键与抗体结合，氨基甲酸酯键比羟基提供的碳酸酯或磷酸酯键更稳定。该团队获得了两种先导化合物101和102，通过对布地奈德分子的SAR分析和分子模拟。化合物101、102的功效测试发现，这两种化合物对糖皮质激素受体(GR)的选择性高于其他核激素受体，在细胞试验中具有与布地奈德更好或相同的效力，在hERG中没有心脏毒性，在Ames中没有遗传毒性，并在体内促炎小鼠模型中表现出效力。在脂多糖(LPS)刺激的小鼠中，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的释放) 显著降低。随后通过组氨酸蛋白酶可切割连接子获得的 GC-ADC 在血浆中高度稳定，并特异性地在抗原阳性细胞中释放 GC，这表明这些新型 GC 可以作为 ADC 有效载荷来治疗自身免疫和炎症疾病。 免疫激动剂全身给药时会激活非特异性免疫反应，严重时可引发致命的细胞因子风暴。将免疫激动剂与肿瘤靶向抗体偶联，可将免疫激动剂递送至肿瘤微环境并局部释放，缓解免疫刺激剂全身给药的严重毒性，有助于避免抗肿瘤治疗中的全身副作用。然而，虽然通过诱导免疫机制发挥抗肿瘤作用的免疫刺激ADC药物思路非常清晰，临床前数据也相对较好，但在临床试验中剂量依赖性毒性问题却难以解决。激动剂疗效提升的同时，毒性也会随之提升，难以确保疗效提升的方式能够安全可靠，例如在小鼠肿瘤模型中展现出良好抗肿瘤效果的SBT6050，目前因毒性问题，在临床研究中效果不佳，因此后续研究最重要的考量就是毒性与疗效的平衡，重新设计以减弱毒性、改善给药窗口也是非常有利的。 3.5. 新型潜在 ADC 有效载荷 3.5.1. Bcl-xL 抑制剂 Bcl-xL是一种抗凋亡蛋白，在肿瘤形成、转移和耐药性中起重要作用，理论上，阻断 Bcl-xL 上 BH3 结合域的药物可以引发癌细胞凋亡。然而，Bcl-xL 对血小板存活至关重要，而 Bcl-xL 的泛抑制剂可能会产生血小板毒性。将 Bcl-xL 视为 ADC 药物有效载荷的靶点，可以保留 Bcl-xL 抑制剂的活性，同时降低其对血小板的毒性。Tomoyasu Ishikawa 对 Bcl-xL 抑制剂 ABT-737 (103) 与 Bcl-xL 共结晶，结果表明，化合物的联苯部分(单元 W)在由 Phe146、Leu130、Leu108 和 Phe105 组成的口袋中形成亲脂性相互作用(西部区域；h1 H2)，而化合物的烷基磺酰胺部分(单元 E)在由 Phe97、Tyr195 和 Tyr101 组成的另一个口袋中形成亲脂性相互作用(东部区域；h4)(图 18)。单元E中三个芳香环形成分子内π-π相互作用，形成独特的刚性U型构象，该构象可能增强ABT-737(103)与Bcl-xL的分子间结合。此外，研究了一系列小分子抑制剂的构效关系，发现单元E对Bcl-xL的抑制作用比单元W更重要，尤其是B环。晶体结构和构效关系分析将为设计更有效的抑制剂进行ADC载荷鉴定提供基础。 2017年，AbbVie首次将Bcl-xL抑制剂104与Bcl-xL偶联，作为有效载荷以 ADC 的形式传递给抗 B7H3 抗体，得到针对 EGFR 的 ABBV-155，该药物仍处于临床试验阶段(WO2017214301A1、WO2017214282Al)。 图 18. Bcl-xL 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A) Bcl-xL 抑制剂103、104 的化学结构；( B) ABT-737 (103) 与 Bcl-xL复合的结合模式。 3.5.2. NAMPT 抑制剂 烟酰胺磷酸核糖转移酶 (Niacinamide phosphate ribose transferase, NAMPT) 可将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸，是一种控制细胞内 NAD+ 浓度的限速酶。当 NAMPT 受到抑制时，NAD+ 水平会降至代谢所需的水平以下，从而导致能量危机并最终导致细胞死亡。尽管 NAMPT 抑制剂是有效的细胞毒性分子，但由于其毒性，它们在癌症治疗中用作化疗药物受到阻碍。几种NAMPT 抑制剂，如 FK-866 (105) (图 19A)因剂量依赖性毒性而停止临床试验。但 NAMPT 抑制剂结构简单、药效强，且其激活机制不同于目前的 ADC 有效载荷，因此 NAMPT 抑制剂可作为具有良好活性和耐受性的 ADC 有效载荷，有望改善 NAMPT 抑制剂的治疗窗口，进而应用于临床环境。Chris Tse 及其团队发现了新型非底物 NAMPT 抑制剂，它们具有强大的临床前疗效和药代动力学特性，可实现口服给药，该系列的先导分子A-1293201 (106)，含有异吲哚啉“头部基团”，可有效抑制重组人 NAMPT。通过 X 射线晶体学检查 A-1293201 与 NAMPT 之间的相互作用，发现了几个不同的协同相互作用位点(图 19B)。这些位点包括 PRPP 结合亚位点 A，其本质上是亲水性的，未被烟酰胺占据；烟酰胺结合亚位点 B，在此与烟酰胺进行重要的 pi 堆积和氢键相互作用；系链亚位点 C，其狭窄、亲脂性，未被结合烟酰胺占据；以及远端开口亚位点 D，其加宽并提供多个结合水分子和疏水表面。与 FK866 类似，A-1293201 的异吲哚啉脲部分参与亚位点 B 中的重要 pi 堆积相互作用以及亚位点 C 中的氢键和疏水相互作用。与 FK866 以及最近的第二代 NAMPT 抑制剂相比，异吲哚啉脲化合物是第一种已知的强效非磷酸核糖基化 NAMPT 抑制剂。Carl Uli Bialucha设计的新型 NAMPT 抑制剂107在 nmol/L 范围内对 NCI-H526、MDA-MB453 和 NCI-N87 等多种细胞系有效，构效关系表明吡啶氮可被 NAMPT 酶磷酸化，是药效团的重要组成部分。此外，整个 3-吡啶 (S, S) 环丙基甲酰胺基团对于高水平的细胞活性至关重要。R3 区域可以容忍多种取代基，乙基取代基化合物108是通过替换更刚性的未取代苯环获得的，其对 A2780 和 CORL23 细胞系的作用与化合物107相似。苯环可进一步衍生化，以提供最佳的连接载体，在苯环对位添加哌嗪取代基是耐受性良好的化合物109，哌嗪基团上的游离二级胺可作为连接子的结合点与抗体结合。R3处的苯基哌嗪取代以及R1和R2分别被F和H取代，得到略有改善的类似物110 ，其在nmol/L浓度下对C-Kit和HER2表达细胞系有效。使用不可切割连接子与有效载荷110获得的抗c-Kit缀合物不仅具有低聚集性，而且具有最佳的抗CKIT活性(IC50分别为 9 和 40 pmol/L)，并被证明是 c-Kit 阳性胃肠道间质瘤 GIST-T1 异种移植模型的靶向药物。ADC 的有效载荷需要包含活性杂原子才能结合可切割的连接子，而 FK-866 缺乏氨基、羟基或巯基官能团。为了获得易于集成并保持效力的有效载荷，Peter D. Senter制备了一系列 FK-866 类似物，在芳香尾部的不同位置进行苯胺取代。进一步评估了这些化合物对 L540cy、A549 和 HepG2 细胞系的细胞毒性。化合物111在两种测定中都表现出与 FK-866 相似的效力，NAMPT 和化合物111的晶体结果表明，新加入的苯胺基团通过氢键与 Glu376 的主链酰胺相互作用，可能抵消了添加极性官能团所导致的任何去溶剂化损失。用吡啶基氰基胍基团中发现的强效抑制剂 chs-828 制备的化合物112和用吡啶基方酰胺基团制备的化合物113保留了与NAMPT 的强结合力并具有强细胞毒性，这些化合物已作为 ADC 药物有效载荷进入评估阶段。在耐受性良好的剂量下，在几种肿瘤模型中显示出显著的活性水平。 图 19. NAMPT 抑制剂的设计和 SAR 分析。 (A)NAMPT抑制剂105-113的化学结构；(B)A-1293201(106)与 NAMPT 复合的结合模式。 3.5.3. 卡马霉素(Carmaphycins) 蛋白酶体活性抑制剂是一类新兴的抗癌药物，对某些癌细胞具有超强的细胞毒性，环氧酮蛋白酶体抑制剂carmaphycins就是此类的代表。从海洋蓝藻Symploca sp.中分离鉴定出的carmaphycins A(114)和B(115) ，其α，β-环氧酮直接与甲硫堇亚砜或甲硫堇砜结合，在低纳摩尔浓度下抑制蛋白酶体的β5亚基，对多种癌细胞系有效(图 20)。但由于其选择性较差，常常表现出毒副作用。使用剧毒的carmaphycins衍生物作为ADC有效载荷，既能保持所需的效力，又能获得更好的耐受性。carmaphycins可分为四个不同的部分(P1-P4)，William H. Gerwick通过替换6-氨基己酸链，合成了第一代类似物116，其P4末端带有胺基，这显著降低了对NCI-H460细胞的杀伤作用(IC50 = 860 nmol/L)。第二代carmaphycins类似物在P2处含有2-氨基乙基同型半胱氨酸残基，直链烷基链被芳香族苯基或吡啶环取代，得到类似物117，其对HCT116和NCI-H460的细胞杀伤作用低于carmaphycins B(115)，因为P2的脂肪胺在生理pH下呈碱性且带正电荷，降低了其细胞通透性。为了降低P2处的碱性，该团队将carmaphycin B(115)的P2甲基砜部分替换为4-硫代苯胺或4-磺酰基苯胺，得到化合物118或119。化合物119比118更有效，这意味着碱性胺的效力越少越好。此后，合成了在P1和P2处含有两个亮氨酸-环氧酮药物簇的类似物120，其IC50在HCT116和NCI-H460细胞系中的IC50 分别为0.2和5.4 nmol/L，P1处的环氧酮对化合物120的强效细胞毒活性至关重要。类似物121含有含苯胺的P3侧链，对SKBR3细胞的IC50为21 nmol/L。与化合物121相比，将苯胺官能团置于类似物122的P4位置可更有效地抑制细胞生长。类似物系列中的化合物119保持了较高的细胞效力，但与游离抗体相比，其目前的偶联ADC对所测试的癌细胞系并未表现出更优异的细胞杀伤能力。 图 20. 卡马霉素类似物114–122的设计。 3.6. 新型ADC有效载荷 3.6.1. 以PROTAC分子为有效载荷的ADC ADC 开发的主要挑战与剂量限制性毒性(dose-limiting toxicity, DLT) 有关，这表明很难平衡药物治疗的疗效和脱靶毒性。ADC 实际输送到肿瘤的药物剂量非常小，这意味着药物分子必须具有极强的细胞毒性，尽管这会导致毒性副作用。PROTAC 是一组双功能化合物，由靶向目标蛋白 (POI)的配体、E3 连接酶的配体和连接子组成。PROTAC 将 POI 和 E3 连接酶拉近，用泛素化标记 POI，然后将其由蛋白酶体降解。PROTAC 具有催化作用，因此可以在较低剂量下有效降解目标蛋白。PROTACs可能是ADC理想的有效载荷，将抗体与PROTAC分子偶联形成的抗体PROTAC偶联物可以在特定细胞中特异性降解靶蛋白，实现PROTAC技术在细胞或组织水平的选择性。抗体-PROTAC偶联物将PROTAC的催化特性与ADC的组织特异性相结合，从而克服了传统靶向降解剂和ADC的局限性，具有靶向新靶点的巨大潜力。 将靶向BRD4蛋白的PROTAC 123与HER2抗体连接，可形成分子量约为150kD的抗体PROTAC偶联物，平均每个抗体分子上有4个PROTAC分子(图 21)。抗体PROTAC偶联物能有效降解HER2高表达细胞SK-BR-3中的BRD4蛋白，而对HER2低表达细胞MCF-7中的BRD4蛋白无降解作用。BRD4抑制剂124通过基于马来酰亚胺的偶联反应与HER2靶向mAb的链间Cys残基偶联，得到可降低BT-474(HER2阳性)细胞系中BRD4水平的ADC偶联物。两种降解ERα的ADC最近也在专利文献中被描述，第一种是将基于VHL的PROTAC 125通过以下方式连接到HER2靶向mAb上碳酸盐部分；第二个 ADC 使用含酶可切割的焦磷酸连接子连接到同一 PROTAC 的 VHL 结合区。在 MCF7-neo/HER2 细胞中，两种结合物均表现出有效的抗原依赖性 ERα降解，并且两种结合物在小鼠稳定性和药代动力学试验中均表现出可接受的结果。PROTAC 126具有 CRBN 作为 E3 连接酶并靶向 TGF-β R2 蛋白，可通过不可切割的连接子与抗 HER2 抗体偶联。在转染 HER2 受体的 HEK293 细胞中，0.5 和 1.0 μmol/L 的 ADC 在 24 和 48 h后降解了 TGF-β R2 蛋白。此外，使用PROTAC 127单次静脉注射 1 mg/kg ADC，一种基于 VHL 的可降解 BRM 蛋白，作为有效载荷，在已知表达高 CD22 表面受体的 BJAB 淋巴瘤异种移植肿瘤中实现了 BRM 蛋白的强效、抗原依赖性还原。该结合物在体内表现出所需的生物活性，并进一步多样化了可通过 ADC 模式成功调节的靶蛋白，扩大了将 PROTAC 靶向表达该表面蛋白的细胞的可能性。 图 21. PROTAC 分子123–127的化学结构。 尽管抗体-PROTAC 偶联物领域仍处于起步阶段，但已经创建了一组多样化的此类实体，其成员随后已显示出有意义的体外和/或体内生物活性。与大多数已知的细胞毒性 ADC (DAR=2-4)相比，许多这些新实体采用了更高的有效载荷有效载荷(DAR=6)，但对于典型的抗体-PROTAC 偶联物应用，这种增加是否通常是必需的仍有待确定。在体内和体外都实现了抗原依赖性活性的多个例子抗体-PROTAC 结合物与所述结合物进行了比较，这些结果证明了抗体-PROTAC 结合物能够将其各自的 PROTAC 有效载荷递送至特定肿瘤和/或目标细胞。鉴于这些有希望的初步结果，抗体-PROTAC 结合物似乎为未来的发展和应用做好了准备，预计未来抗体-PROTAC 结合物将应用于组织或生物体，为药物治疗或生物学研究提供新思路。 3.6.2. 以NIR-PIT药物为有效载荷的ADC 近红外光免疫治疗(Near-infrared photoimmunotherapy, NIR-PIT)药物一般由靶向肿瘤的肿瘤特异性单克隆抗体和光激活化学物质通过连接子组成，本质上是ADC药物。NIR-PIT药物可以与照射红外光到肿瘤部位的装置一起，形成一个新的靶向抗癌平台。该平台使抗体介导的靶向递送达到高度的肿瘤特异性，同时利用红外光激活药物的生物物理机制，精准诱导癌细胞快速死亡，而不伤害周围的正常组织。NIR-PIT药物诱导的多克隆免疫反应可以消灭在NIR-PIT药物第一步中存活下来的肿瘤细胞，即使NIR-PIT药物不足、递送不均匀，或由于靶抗原表达不均匀导致剂量不足，因为后续的第二步多克隆免疫反应也会杀死残留的肿瘤细胞。此外，NIR-PIT 药物还可以作为先前存在的 PD-1 单克隆抗体、PD-L1 单克隆抗体或 CTLA-4 单克隆抗体的有益补充，增强其肿瘤免疫反应。NIR-PIT 药物中的有效载荷不是细胞毒性物质，而是水溶性酞菁衍生物(例如硅酞菁衍生物 IR700 (IRDye700DX)(128)(图 22A)。IR700是一种小的光活化分子，可被近红外光激发，无光毒性或生物毒性。当抗体与肿瘤表面抗原结合时，在近红外光的刺激下，IR700发生光诱导配体释放反应，释放亲水侧链，导致剩余部分的疏水性显著增加。这反过来会破坏细胞膜，引发针对癌细胞的快速、高选择性免疫原性细胞死亡(ICD)(图 22B)。NIR-PIT诱导的ICD在直接杀伤癌细胞的同时，可以导致癌细胞接近死亡的未成熟树突状细胞快速成熟，启动宿主的抗癌免疫反应，促进针对死亡癌细胞释放的抗原的CD8+ T细胞重新形成，进一步放大NIR-PIT的治疗效果。 图 22. IRDye700DX (128)的设计与分析。 (A) IRDye700DX (128) 的化学结构；(B) NIR-PIT ADC 的作用机理。 乐天医疗的西妥昔单抗沙罗他洛康于2020年以商品名Akalux获得PMDA加速批准，是一种由西妥昔单抗和水溶性硅酞菁衍生物IRDye700DX组成的抗体偶联药物，靶向表皮生长因子受体，用于治疗无法切除的局部晚期或局部复发性头颈癌，是全球首个获批的光免疫治疗药物。给药24h后，该药物可特异性聚集在EGFR阳性肿瘤细胞表面。使用690nm波长的近红外光照射肿瘤部位，诱导西妥昔单抗沙罗他洛康杀死癌细胞并激活免疫反应，在NIR-PIT药物研究中进展最快的是乐天医疗的ASP-1929(又名RM-1929)。ASP-1929是西妥昔单抗与IR700的结合药物，靶向表皮生长因子受体EGFR，可用于治疗无法切除的局部晚期或复发性头颈癌。除了ASP-1929，乐天医疗还有一款NIR-PIT药物，在临床前研究中与PD-1单克隆抗体联合在晚期肿瘤动物模型中表现出优异的抗肿瘤活性。其他一些NIR-PIT药物研究，包括131I(PcMAb)(CD38单克隆偶联NIR-PIT药物)、TROP-2-IR700、雷莫芦单抗-IR700、偶联物AvIR介导的PIT、抗TF抗体1849-ICG偶联物、MN-14-700DX、Avelumab-IR700等均以IR700为有效载荷。 作为ADC领域的“冷门赛道”，光免疫ADC的临床和市场前景尚需经过时间的考验，但基于相关原理开发新靶点和新型光激活效应分子或将成为ADC赛道新的突破点。 3.6.3. 双载荷ADC 随着 ADC 治疗耐药性的出现，将一种抗体与两种甚至多种不同的细胞毒性有效载荷结合为开发下一代 ADC 提供了一个有吸引力的选择。为了证明双有效载荷药物 ADC 的可能优势，Levengood 等在 2017 年制备了一类含有两种不同微管蛋白聚合抑制剂的 ADC，该团队将具有不同物理和化学性质的 MMAE 和 MMAF 与同一种抗 CD30 抗体结合，以发挥互补的抗癌活性。这项工作清楚地展示了一种构建强效双药 ADC 的潜在有效方法，以及如何递送多种细胞毒性有效载荷来提高 ADC 活性。后来，Kumar 等开发了一种异质三功能连接子，该连接子结合 MMAE 和 PBD二聚体有效载荷以产生双有效载荷药物 ADC。Nilchan 等使用双抗体结合方法，通过在工程硒化半胱氨酸和半胱氨酸残基位点特异性结合HER2 抗体，生成含有靶向微管蛋白有效载荷 MMAF 和 DNA 拓扑异构酶 II 抑制剂 PNU-159682 的双有效载荷 ADC。PNU-159682 由于其 DNA 损伤活性而导致 S 期细胞周期停滞，而 MMAF 同时抑制微管蛋白聚合并导致 G2/M 期细胞周期停滞。双药物 ADC 对 HER2 表达细胞系表现出选择性和强效细胞毒性，并表现出与所连接药物一致的双重作用机制。 ADC药物经常会遇到肿瘤内异质性的问题，例如乳腺癌通常由多种具有不同基因表达谱的细胞组成，其异质性是化疗后产生耐药、复发和转移的主要因素。为了解决这一问题，Kyoji Tsuchikama通过化学酶联法高效构建了一系列具有明确药物抗体比(DAR)的双有效载荷ADC(DAR组合分别为2+2、4+2和2+4)，并且DAR调节的灵活性有利于根据疾病靶点和有效载荷组合精细调节ADC的理化性质、疗效和毒性(图 23)，其中DAR为(4+2)的MMAE/MMAF双药ADC比DAR为4或6的MMAE单药ADC疗效更佳，且具有特异性的HER2细胞杀伤能力、理想的药代动力学性质、最小的炎症反应、治疗剂量下的边缘毒性。此外，在HER2异质性及T-DM1耐药性增加的JIMT-1/MDA-MB-231混合异种移植瘤小鼠模型中，双药有效载荷ADC比两种单药组合有更好的治疗效果和生存获益。原因可能是更强的MMAF分子杀死JIMT-1细胞，有助于结合的MMAE分子有效发挥对邻近的MDA-MB-231细胞的旁观者效应。重要的是，这种显著的疗效无法单独通过MMAF ADC和MMAE ADC的1：1组合来实现。双有效载荷 ADC 的增强疗效还在另一种乳腺癌的 hCC1954-TDR 异种移植小鼠模型中得到证实，这种乳腺癌具有低 HER2、肿瘤内异质性和 T-DM1 耐药性。结果凸显了双有效载荷 ADC 克服乳腺癌异质性和耐药性的潜力，表明同时递送两种具有不同药物特性的有效载荷是一种有希望的 ADC 治疗方法，可用于治疗具有异质性和耐药性的其他难治性癌症，这表明同时递送两种具有不同药物特性的有效载荷是一种有前途的方法。 剑桥大学的研究人员利用他们的Synthemer平台设计了一种双有效载荷ADC，它结合了MMAF羟丙基酰胺(AF-HPA)和DNA单烷基化剂(I-BiP)，表现出很强的细胞毒性，可以发挥两种作用机制。然而，虽然多有效载荷ADC药物可以提高疗效，降低耐药性的可能性，但它们治疗引起的副作用也值得考虑。例如，Mersana开发的靶向NaPi2b的新型ADC药物Upifitamab Rilsodotin(UpRi，XMT-1536)通过抗HER2单抗HT-19的切割连接子与MMAF结合(DAR=12)。XMT-1536具有极强的抗肿瘤活性，尤其是对HER2低表达的癌症，但卵巢癌中期I期临床数据显示，XMT-1536可引起严重的治疗相关副作用，发生率高达48% (47/97)，最常见的副作用为胃肠道梗阻(7%)，发热、肺炎、腹痛发生率为5%。虽然Mersana尝试降低剂量，但治疗窗选择范围较窄，前景不容乐观。因此，对于多有效载荷ADC，安全性控制是进行多类有效载荷组装时需要注意的重要问题，关键是找到并解决治疗窗口狭窄的原因，未来的研究也应继续朝着疗效和毒副作用之间的平衡方向发展。 图 23. 双有效载荷药物 ADC 的模式图(红色和绿色形状表示不同的有效载荷)。 3.6.4. PDC 的有效载荷 肽药物偶联物(Peptide drug conjugates, PDC)是一种新型靶向治疗方法，由连接子、归巢肽和细胞毒性有效载荷组成。与ADC药物相比，PDC药物具有分子量小、肿瘤穿透力强、免疫原性低、可采用固相合成大规模合成、生产成本低、药代动力学相对较好、批次产品相对均匀等优势，是继小分子靶向药物、单克隆抗体、ADC之后的新一代靶向抗肿瘤药物。但PDC作为治疗药物的应用也存在一定的局限性，如口服生物利用度低、半衰期短、部分有效载荷切割不完全导致生物活性与原型药物相比明显降低、靶向性可能不如ADC等。PDC的作用机制根据连接子和归巢肽的不同而不同，一种是PDC被内化并在细胞内释放有效载荷，另一种是在肿瘤微环境中PDC被切割，有效载荷被内化并发挥作用(图 24A)。大多数载荷不仅可以杀死靶标高表达的肿瘤细胞，还可以通过肿瘤微环境中的旁观者效应杀死周围靶标低表达或不表达的肿瘤细胞。多肽可影响PDC内化的效率，理想的PDC多肽应具有靶标结合亲和力强、稳定性高、免疫原性低、内化率高、血浆半衰期相对较长等特点。连接子的选择是PDC设计的关键因素之一，连接子需要平衡稳定性和释放效率，可切割的连接子释放效率较高，不可切割的连接子稳定性较高。载荷的毒性和理化性质可直接影响药物杀伤肿瘤的能力，从而影响其疗效，理想的载荷应具有细胞毒性高(通常IC50较低) 、免疫原性低、稳定性高、疏水性适宜、溶解性好等特点。 图 24. PDC 的关键结构和作用机制。 (A) PDC的一般作用机制；(B) 常见 PDC 有效载荷的化学结构。 PDC有效载荷可分为化学药物(图 24B)、蛋白质类药物、多肽类药物等，其中以化学药物和蛋白质类药物较为常见。常用的化学药物有DM1(2)、MMAE(8)、KSP抑制剂(45)、喜树碱(54)、阿霉素(129)、紫杉醇(130)、甲氨蝶呤(131)、柔红霉素(132)、吉西他滨(133)等；蛋白质类药物主要有干扰素和肿瘤坏死因子；放射性同位素也是PDC常用的有效载荷。PDCs用于癌症诊断时，可用正电子发射放射性同位素(氟-18(18F)、铜-64(64Cu)、镓-68(68Ga))标记，产生PET显像，通过与肿瘤细胞上的靶向受体结合，准确定位恶性组织；放射性同位素标记的PDC也可用于治疗。肽受体放射性核素治疗(PRRT)根据肿瘤细胞过表达的受体，对肿瘤细胞进行靶向和组织特异性放射，最常用的放射性同位素是铟-111(111In)、钇-90(90Y)和镥-177(177Lu)。 截至2023年4月，全球获批上市的PDC药物仅有两种，分别是Lutathera®和Pepaxto®。Lutathera®是诺华公司旗下Advanced Accelerator Applications SA开发的靶向生长激素抑制激素受体的PDC，进入细胞后释放放射性同位素177Lu，通过辐射损伤肿瘤细胞，于2017年9月首次获欧洲药品管理局(EMA)批准。在晚期神经内分泌肿瘤患者中，与高剂量长效奥曲肽相比，Lutathera®具有更长的无进展生存期和更高的反应率，于2018年1月26日获FDA批准。Pepaxto®是Oncopeptides公司开发的靶向氨基肽酶的PDC，由DNA烷化剂Melflufen(134)与氨基肽酶靶向肽共价连接。Melflufen 具有高亲脂性，可被骨髓瘤细胞快速吸收。一旦进入细胞，Melflufen 的结合肽立即被氨基肽酶切割，释放出亲水性烷化剂美法仑(Melphalan) (135)，造成肿瘤细胞DNA损伤，导致肿瘤细胞死亡。Pepaxto®于2021年2月首次获得FDA批准，与地塞米松联合使用，用于治疗成人复发或难治性多发性骨髓瘤。但同年10月，Oncopeptides公司宣布将Pepaxto®撤出美国市场，主要原因是验证性OCEAN研究中死亡率增加。2022年8月，Pepaxto®获得EMA批准。目前，全球共有17个PDC药物处于临床开发中，其中3个处于III期，9个处于II期，5个处于I期。PDC 是一种等效抗体-药物偶联物，克服了 ADC 的部分局限性，具有许多独特的优势。虽然目前上市的 PDC 药物较少，但曾出现过因严重安全性问题而退市的案例。但随着相关技术问题的解决和配套技术的突破，相信 PDC 药物也将成为未来十年拥挤赛道上研究和投资的热点。 4.结论 ADC药物开发前景广阔，因为它整合了特异性抗体以选择性靶向肿瘤细胞，结合了多种强效的细胞毒性有效载荷，并采用多样化的连接子技术来产生有效的癌症治疗药物。从技术角度来看，ADC药物至今已经历三代变革，在抗体、药物载体、连接子等方面均有突破，尤其是在有效载荷的使用上。 虽然新一代ADC载荷的特异性和细胞毒性比早期表现出了明显提升的特性，但目前的载荷仍然存在一些局限性： 首先，它们普遍对实体瘤的通透性和毒性有限，限制了它们在实体瘤中的应用。 其次，部分肿瘤对目前的ADC药物不敏感。 第三，载荷药代动力学的复杂性、肿瘤靶向性和释放不充分都会影响ADC药物的疗效。 第四，和其他抗肿瘤药物一样，ADC药物也会出现耐药性。 最后，早期的载荷选择往往是有毒但有效的药物，但它们较高的毒性限制了载荷的系统应用。 虽然抗体-药物偶联物在治疗中显示出有效性，与高毒性载荷的联用并不一定是极好的，因此其他类型的载荷如RNA抑制剂、免疫激动剂、促凋亡的Bcl-xL抑制剂等正在被开发。尤其是随着免疫检查点阻断疗法被FDA批准，肿瘤免疫治疗时代开始了。免疫激动剂ADC也被开发出来，其可以利用抗体将免疫激动剂运送到肿瘤微环境并局部释放，缓解免疫激动剂全身给药带来的严重毒性问题。免疫激动剂(如Toll样受体、STING激动剂等)作为新型载荷在ADC中也越来越受欢迎，免疫调节ADC有望进一步增强免疫检查点阻断疗法的抗肿瘤免疫应答。虽然免疫ADC尚处于发展初期，尚未取得满意的临床效果，但免疫调节ADC有可能大大拓宽ADC的治疗窗口，提高其抗肿瘤活性，并具有理想的安全性和有效性。相信通过免疫调节载荷修饰设计靶向肿瘤微环境的ADC仍是未来研究领域的热点，尤其是使用对细胞不直接有毒性的载荷(例如可以引导免疫系统攻击癌细胞的载荷)。此外，使用PROTAC分子作为ADC载荷，可以充分结合PROTAC的催化特性与ADC的组织特异性优势，并克服了传统靶向降解剂和ADC的局限性(如耐药性、毒副作用等)。鉴于其良好的效果，PROTAC-ADC是未来ADC药物开发的重要方向。抗体结合载荷还包括来自植物的蛋白衍生酶(例如皂苷、蓖麻毒素A链)或细菌毒素(PE、假单胞菌外毒素、DT、白喉毒素)，通过催化不可逆地抑制蛋白质合成来诱导细胞死亡。新型载荷类别还包括寡核苷酸、siRNA、蛋白质等。为了解决传统ADC载荷的不足，除了开发和修改传统和新型的潜在载荷外，ADC设计也出现了许多新策略。例如，通过将同一抗体与具有不相关机制的不同载荷相结合来设计ADC药物，可以通过最小化耐药性的可能性并同时针对不同的靶点实现协同效应，这为治疗具有异质性和耐药性的其他难治性癌症开辟了新途径，这对于实体瘤尤为重要。此外，在设计混合载荷时，应强调疗效和毒性之间的平衡。此外，通过使用抗体介导的靶向递送，由光激活化学物质作为载荷与特异性单克隆抗体组成的ADC可以实现较高的肿瘤特异性并能利用激光激活的生物物理机制精准诱导癌细胞快速死亡，避免对周围正常组织的伤害，实现精准治疗的要求，也是未来值得探索和期待的发展方向。 ADC虽然发展至今，但其可用的载荷骨架种类并未增加，大部分细胞毒性药物均为前核心骨架的衍生物，目前仅有有限数量的高细胞毒性天然化合物、衍生物或合成类似物有潜力作为ADC的载荷进入临床。虽然新颖的ADC载荷和指导ADC构建的新策略不断涌现，但这些还处于发展的初级阶段，未来的方向还需要通过更多的实验来验证。因此，在下一代ADC中，需要开发结构新颖的高效载荷(例如通过筛选天然产物库、化学合成、天然产物直接衍生化等方法提高活性和耐受性，有望获得结构简单、活性高、作用机制特殊的NAMPT抑制剂(具有多种作用机制、更高疗效和更少副作用的NAMPT抑制剂)。但新的骨架化合物的发现具有挑战性，需要在天然产物鉴定、高通量筛选或基于结构的药物设计等方面进行大量工作。相比之下，对已经获批或研究充分的有效载荷进行结构修改可以更快地识别新型有效载荷。在获得母核化合物后，应充分利用构效关系和晶体学技术，探索靶标与母核化合物的结合方式以及化合物的有效作用位点和有效功能团，才能高效地进行后续母核化合物的优化改造。在修饰有效载荷分子时，调整其理化性质，特别是极性，可以解决ADC制备和应用中的一些难题。连接过多的疏水性有效载荷分子会改变抗体的构象稳定性，增加其聚集沉淀的倾向，最终影响其最大DAR、血浆稳定性、旁观者效应等。疏水性有效载荷分子很容易穿透细胞膜，通过旁观者效应杀死周围的抗原阴性肿瘤细胞，而亲水性有效载荷分子从癌细胞中扩散出来的速度较慢。此外，大部分ADC面临的一大问题是毒副作用较大，其中载荷引起的毒副作用主要体现在对快速增殖的健康细胞的损伤，如淋巴细胞减少、胃肠道反应等。因此可以选择分子量小、组织穿透性好、半衰期短的载荷，释放后可以在靶位快速富集，快速发挥杀伤癌细胞的功能，同时在血液中药物分子可以被快速清除，有利于降低全身毒副作用。也可以对靶点的重要位点进行突变，进而修饰筛选出耐受性更好的化合物。 综上所述，新型ADC有效载荷与传统有效载荷存在一些区别： 1)传统ADC有效载荷多选择药理作用强但毒副作用也较大的小分子，例如PBD，而新型ADC有效载荷则倾向于选择药理作用中等、毒副作用较小的小分子，例如Dxd。 2)传统ADC有效载荷主要以微管抑制剂和DNA损伤剂为主，而新型ADC有效载荷相比传统有效载荷靶点类型更加丰富，选择更多，作用机制也不同，例如使用免疫刺激剂作为ADC有效载荷。 3)传统ADC小分子有效载荷结构一般复杂，合成难度大，新型ADC有效载荷倾向于选择结构简单、分子量较小的小分子，大大降低了合成难度，拓展了ADC有效载荷的应用市场。 4)传统ADC有效载荷一般采用单一类型的小分子化合物通过连接子直接连接抗体，而新型ADC可以组合不同类型的有效载荷，达到1+1>2的效果。除传统小分子化合物外，新型有效载荷还选取PROTAC、光活化分子等新型类型作为有效有效载荷。 虽然ADC药物发展至今，疗效也有了很大的提高，但仍然存在耐药性、不良反应、血液稳定性不够等问题亟待解决。有效载荷在ADC药物的疗效中占有重要的地位，因此结合相关的晶体结构和构效关系研究，对ADC小分子有效载荷及其未来趋势进行综述，旨在为ADC药物有效载荷的未来发展方向以及后续的优化改造提供更多新的参考，从而构建更多的ADC药物，提高其治疗效果，克服耐药性，减少不良反应，促进ADC药物研究的发展。 原文链接 Antibody–drug conjugates: Recent advances in payloads. Acta Pharm Sin B. 2023, 13(10): 4025-4059. doi: 10.1016/j.apsb.2023.06.015 免责声明：公众号推文基于已公开的资料信息撰写，用于传递最新热点资讯，在任何情况下，本文中信息或所表述意见均不构成对任何人的建议。如因版权等存在疑问，请于本文刊发30日内联系本公众号删除，更多精彩内容欢迎关注和分享公众号。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769