JAK2 x Syk x SRC

蛋白质对酪氨酸残基的磷酸化在后生动物中进化为一种协调组织生长的机制。多细胞真核生物通常有超过50种不同的蛋白质酪氨酸激酶，它们在整个蛋白质组中催化数千个残基的磷酸化。目前已经对一小部分的酪氨酸磷酸化位点进行了详细研究，但这只触及了庞大且复杂的酪氨酸激酶信号中的表面。鉴于酪氨酸激酶信号的重要性，亟需研究更多乃至全部酪氨酸激酶的磷酸化位点特异性。近日，来自美国威尔康奈尔医学院、麻省理工学院和耶鲁大学医学院的研究团队报道了运用组合肽阵列技术，对78种人类酪氨酸激酶的底物特异性进行了系统性分析，揭示了人类酪氨酸激酶组（Tyr kinome）的内在底物特异性。 首先，为了分析人类酪氨酸激酶组的磷酸化位点基序，研究人员使用了位置扫描肽阵列（Positional scanning peptide arrays，PSPA）。这种组合肽库方法此前已应用于人类丝氨酸/苏氨酸激酶组，并成功构建了人类丝氨酸/苏氨酸激酶组底物特异性图谱 。通过PSPA，他们获得了全部78种具有催化活性的常规酪氨酸激酶的磷酸化位点序列基序，以及15种以前被归类为丝氨酸/苏氨酸激酶但表现出收敛酪氨酸磷酸化活性的非典型激酶的酪氨酸磷酸化基序，包括已知的双特异性激酶，如WEE、LIMK和NEK家族 ，以及新识别出自噬激酶（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）、TNNI3K(cardiomyocyte-specific kinase)和线粒体丙酮酸脱氢酶激酶（mitochondrial pyruvate dehydrogenase kinases，PDHKs） 。 通过对定量PSPA数据对肽序列中所有位置进行层次聚类分析，他们将激酶组底物继续分为15个不同的簇。与普遍看法不同，酪氨酸激酶对磷酸化酪氨酸残基附近的氨基酸表现出高度选择性。多种进化上密切相关的酪氨酸激酶的底物特异性差异很大。例如，同源基因FAK和PYK2分别识别酸性和疏水性基序。这一观察结果与他们之前被报道的底物一致，并解释了为什么PYK2的表达无法恢复FAK缺失细胞的表型。同样，JAK3的基序在特异性空间上与其系统发育的同源基因JAK1、JAK2和TYK2相距较远，这也与他们不同的生物学角色相符。 他们还发现，在酪氨酸激酶组内，磷酸化位点特异性的多样性比预期的要大，选择性主要体现在在相对于磷酸受体酪氨酸−1到+3的位置。例如，酪氨酸激酶通常选择在−1和+3位置的疏水性脂肪族残基，同时不偏爱在−1位置的丝氨酸和+3位置的谷氨酸。+1位置的谷氨酸残基广泛地将激酶组分为两个大组：大多数nRTKs偏爱它，而大多数RTKs不偏爱它。在其他位置，特定的残基偏好可以唯一地识别少数个别激酶。例如，只有四种激酶，包括两种ABL异构体，在+3位置强烈选择脯氨酸。同样，ACK激酶在−1位置独特地偏爱碱性残基。 磷酸化启动（Phosphopriming）是许多人类酪氨酸激酶生化特异性的突出要素。这种现象中，激酶识别底物中已经磷酸化的残基，可以作为信号整合、放大和交叉对话的机制。虽然一些Ser/Thr和酪氨酸激酶已被确定为磷酸化启动的底物，研究人员发现超过一半的常规酪氨酸激酶（47/78）在整个肽阵列中选择磷酸化氨基酸作为它们最偏爱的残基，并且超过90%（72/78）至少在一个位置上磷酸化氨基酸是最被偏爱的。 磷酸化启动选择的特定模式与之前报道的酪氨酸激酶大不相同。例如，SYK和ZAP70在它们的目标位点N末端的几个位置上强烈偏爱磷酸化残基。这些激酶在免疫受体信号级联中与其他激酶顺序发挥作用，磷酸化启动可能有助于确保特定底物的正确磷酸化顺序。几种激酶对磷酸化残基的位置特异性选择可以根据报道的激酶域晶体结构合理化，并且可以通过定向突变消除。这种磷酸化启动选择的生物学相关性尚待探索，但与在磷酸蛋白质组学数据集中通过质谱（Mass Spectrum, MS）观察到的多重磷酸化肽段的丰富性一致。 随后，研究人员将ABL在肽阵列中识别出的其基序特异性与细胞底物上磷酸化位点周围的氨基酸序列进行了比较。PSPA数据显示ABL对−1位置的脂肪族残基、+1位置的丙氨酸和+3位置的脯氨酸的偏好，这与细胞底物的基序特征一致。他们使用之前报道的位点特异性评分矩阵（PSSMs）对人类蛋白质组中的5,431个酪氨酸磷酸化位点，以及仅使用低通量方法鉴定出的1,884个酪氨酸磷酸化位点数据集进行了评分。通过对每个激酶的得分进行百分位数排序，鉴定了每种底物对应的最优激酶。将预测结果与文献中记录的激酶和底物的对应关系相比较时，到那些已被报告的底物在它们相应激酶的高评分位点中出现的频率更高。这种基于基序的评分方法正确地重现了包括胰岛素、JAK-STAT和SRC信号通路在内的一些最早和最确立的激酶-底物关系中的上游激酶。 为了证明研发现的位置特异性评分矩阵可以预测特定氨基酸替换对激酶底物适用性的影响，研究人员对JAK1和ZAP70的生物衍生底物肽进行了基于基序的氨基酸替换。这些替换能够以可预测的方式改变个别底物对其同系激酶的特异性，这一效应主要但并不完全由Km值的改变驱动。 接下来，他们使用类似于先前用于确定磷酸蛋白质组数据中Ser/Thr激酶基序富集的方法，对每个人类酪氨酸激酶对每个磷酸化位点的氨基酸序列进行评分和百分位排名。通过这一流程对多个已发表的数据集进行分析，作者识别了在不同扰动下激活的特定激酶。例如，在对NIH3T3细胞进行PDGF的急性处理后，最上调的酪氨酸磷酸化基序与PDGF受体亚型相一致。这些新识别的底物不仅与激酶基序匹配，而且在激酶受到扰动时也会发生调节，这增加了它们很可能被相关激酶直接磷酸化的可信度。这些观察结果表明，基于基序的分析能够识别出在癌细胞系中最有可能驱动致癌事件的酪氨酸激酶。     随后，酪氨酸激酶基序图谱被用来分析最近发表的关于肺癌细胞系经靶向抑制剂处理后的磷酸蛋白质组数据。这种方法不仅识别了目标激酶，还发现了药物治疗后诱导的适应性信号响应。例如，用EGFR抑制剂厄洛替尼处理另一种细胞系，导致与EGFR基序相匹配的位点下调，以及BTK偏爱的位点上调，BTK在该细胞系中对EGFR抑制剂有抗性作用。用选择性抑制剂阿法替尼治疗HER2阳性肺腺癌细胞，导致HER2基序下调和MET基序上调，MET是一种与阿法替尼耐药性有关的酪氨酸激酶。这些结果表明，磷酸化位点基序的综合集合足以识别出其活性直接或间接被特定药物靶向的激酶。 根据对人类酪氨酸激酶的百分位排名，他们对已知的人类酪氨酸磷酸化蛋白进行注释，揭示了三大类底物。第一类，约占所有磷酸化位点的三分之一（36%），在六个以上的酪氨酸激酶中得分达到或超过90%，这意味着它们被预测为对广泛的激酶具有亲和性。这些包括以前已知由多种上游激酶产生的磷酸化事件，以及被多个SH2结构域识别的蛋白质上的磷酸化位点，构成了信号通路中的交汇点。第二类包含了报告的磷酸化位点的另外三分之一(34%)，仅与1-5个酪氨酸激酶高度匹配，这意味着激酶-底物关系具有显著的专一性。这一专有类别中的磷酸化位点示例包括免疫细胞中精心编排的调节事件以及特定激酶的特异性磷酸化事件。最一类酪氨酸磷酸化位点（29%）与常规酪氨酸激酶的理想位点都不匹配，这一类底物包括SRC家族激酶的C端磷酸化位点。在这些位点的磷酸化过程中，涉及到与上游激酶CSK的对接表面，这可能抵消了对理想磷酸化位点序列的需求。 由于SH2结构域是一大类选择性识别其磷酸酪氨酸位点C末端氨基酸的适配蛋白，他们系统检查了酪氨酸激酶基序与之前发表的SH2结构域基序特异性的集合之间的关系。酪氨酸激酶与SH2特异性之间的重叠识别了已知的下游效应子，解释了正反馈循环，并合理化了磷酸化级联的顺序信息流。 最后，他们选择了线虫物种秀丽隐杆线虫中的12种激酶，作为人类酪氨酸激酶组不同主要系统发育分支的同源物，使用磷酸化特异性抗体（PSPA）进行了分析，并将它们的目标基序与相应的人类激酶进行了比较。尽管在进化上已经分化了数亿年，大部分线虫激酶的生化特异性与其人类对应物相似。将人类和线虫酪氨酸激酶底物基序的层次聚类将激酶组重新组织成同源群，其中大多数人类和线虫的同源物是最接近的邻居，反映了区分酪氨酸激酶亚组磷酸化位点特异性特征的进化保守性。这种跨动物界的激酶特异性的强烈保守性可能反映了在维持生物体适应性的同时，保留激酶和底物序列特定角色的必要性，这些角色不能独立进化。 综上，确定特定蛋白酪氨酸磷酸酶和激酶之间的底物对应关系，以及理解它们相互调节的活性如何共同塑造酪氨酸磷酸蛋白质组，是未来研究的重要问题。这篇论文种对人类酪氨酸激酶组底物特异性的全面解析代表了对细胞信号机制的理解的重大进展，并为阐明癌症等疾病中失调的激酶活性、发展临床个体化疗法等提供了宝贵的资源。 参考文献 [1] Yaron-Barir, Tomer M et al.“The intrinsic substrate specificity of the human tyrosine kinome.”Nature vol. 629,8014 (2024): 1174-1181. doi:10.1038/s41586-024-07407-y [2] Johnson, Jared L et al. “An atlas of substrate specificities for the human serine/threonine kinome.” Nature vol. 613,7945 (2023): 759-766. doi:10.1038/s41586-022-05575-3 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓