USP13

引言胶质母细胞瘤是最致命的恶性肿瘤之一，表现出明显的肿瘤内异质性，其中胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）对肿瘤发生和治疗抵抗起着重要作用。泛素连接酶和去泛素化酶的药物调节剂正在开发用于癌症和其他疾病。2024年3月19日，西湖大学谢琦，深圳湾实验室李磊和匹兹堡大学Jeremy N. Rich共同通讯在Cell Discovery 发表题为“RBBP6 maintains glioblastoma stem cells through CPSF3-dependent alternative polyadenylation”的研究论文。该研究进行了并行的体外和体内CRISPR/Cas9敲除筛选，针对人类泛素E3连接酶和去泛素化酶，揭示了E3连接酶RBBP6作为GSC维持的一个必需因子，靶向RBBP6抑制了GSC的增殖和肿瘤起始。在机制上，RBBP6介导CPSF3的K63-链接泛素化，稳定了CPSF3来调节选择性多腺苷酸化事件。RBBP6敲除导致MYC竞争性内源性RNA的3'UTR缩短，从而释放了miR-590-3p从缩短的UTRs中，从而降低了MYC的表达。用小分子抑制剂（JTE-607）靶向CPSF3可以减少GSC的存活率并抑制体内肿瘤生长。总的来说，RBBP6通过调节CPSF3依赖的选择性多腺苷酸化在GSC中维持高MYC表达，为胶质母细胞瘤提供了一个潜在的治疗范例。胶质母细胞瘤是最常见和致命的原发性脑肿瘤，中位生存时间不到两年。目前胶质母细胞瘤的标准治疗包括最大程度的手术切除，联合放疗和化疗，随后进行辅助化疗，只能提供姑息治疗。胶质母细胞瘤表现出肿瘤内异质性，其中自我更新的胶质母细胞处于层级顶端。胶质母细胞以其自我更新和肿瘤起始能力而功能特异化，此外还对肿瘤血管生成、放射抵抗力和化疗抵抗力有额外的贡献。胶质母细胞瘤是最早进行全面遗传分析的肿瘤之一，揭示了导致信号传导失调的频繁变异，包括涉及表观遗传学变化、转录调节因子和转录后调节的变异。然而，基于遗传突变的精准医学对胶质母细胞瘤患者的临床管理影响有限，表明替代的分子靶点可能提供治疗益处。泛素化是调节底物蛋白命运和/或功能的最常见的翻译后修饰之一。泛素-蛋白酶体通路维持大多数蛋白质的稳态。泛素分子通过涉及E1（泛素激活）、E2（泛素连接）和E3（泛素连接酶）酶的催化级联添加到靶标蛋白中，可以通过去泛素化酶（DUBs）逆转。先前的研究已将泛素途径与胶质母细胞瘤的生长总体和GSC的维持特异性联系起来。例如，胶质母细胞瘤可能过表达USP15，该酶结合SMAD7-SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶2（SMURF2）复合物去泛素化并稳定型I转化生长因子-β受体（TβR-I），增强TGF-β信号传导。在GSCs中，USP9x取消乙醛脱氢酶1A3（ALDH1A3）的多泛素化以稳定ALDH1A3并维持GSCs。用USP9x抑制剂WP1130处理GSCs可诱导ALDH1A3降解并抑制GSC的生长。此外，USP13和FBXL14相互调节GSCs中MYC的多泛素化。因此，去泛素化酶和泛素连接酶可能是胶质母细胞瘤的潜在治疗靶点。模式图（Credit: Cell Discovery）CRISPR/Cas9基因敲除（KO）高通量筛选已被证明是癌症治疗中目标基因发现的有效平台。先前的CRISPR筛选研究主要集中在体外培养的细胞模型上，这些模型无法充分代表肿瘤微环境的复杂效应，这种方法可能限制了药物开发的成功。在这里，作者改进了一种更具生理学相关性的体内CRISPR筛选方法，以识别对GSC维持和肿瘤形成至关重要的泛素连接酶和去泛素化酶。原文链接https://doi.org/10.1038/s41421-024-00654-3责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Rainbow 导读： 作为最常见的癌基因突变，KRAS突变驱动非小细胞肺癌（NSCLC）的肿瘤发生、发展和转移。 12月1日,中国药科大学华子春、陈果共同通讯在期刊《Cell Reports》上在线发表题为“Oncogenic KRAS effector USP13 promotes metastasis in non-small cell lung cancer through deubiquitinating β-catenin”的研究论文，研究结果表明， USP13是一个新的KRAS效应因子，并且在KRAS突变的NSCLC组织中特异性上调。突变的KRAS通过转录因子RREB1促进USP13的表达。研究人员证明USP13去除β-连环蛋白的K63-链聚脲化并促进β-连环蛋白/TCF4的结合，从而导致其靶基因的转录，包括波形蛋白和癌转移。因此，靶向USP13将抑制RAS突变肿瘤的转移和进展。 https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)01523-1 研究背景 01 肺癌是全球癌症发病率和死亡率最高的原因，组织学上分为两种亚型：非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC），分别占肺癌病例的85%和15%。KRAS是NSCLC中最常见的RAS基因突变亚型。RAS突变经常损害其GTP酶活性，将蛋白质构象锁定在GTP结合状态，并导致下游信号的持续激活，最终导致恶性转化和转移。 KRAS突变在非小细胞肺癌（NSCLC）中频繁检测到。尽管已经开发了共价结合的KRASG12C抑制剂用于治疗KRASG12C突变的癌症，但对其他KRAS突变的NSCLC仍缺乏有效的治疗方法。因此，识别赋予KRAS突变癌细胞侵袭性表型的新型可靶的KRAS效应因子，将为KRAS相关癌症的治疗提供另一种策略。 泛素化是一种常见的蛋白质修饰类型，其中在泛素激活酶（E1）、泛素连接酶（E2）和泛素连接酶酶（E3）的催化下，泛素（Ub）分子以共价键形式附着到底物蛋白的赖氨酸残基的ε-氨基基团上。去泛素化酶（DUBs）是一类酶，它们催化将泛素链从靶蛋白上移除，并在调节蛋白稳定性、亚细胞定位、酶活性等方面发挥关键作用。泛素特异性蛋白酶13（USP13）是DUBs的泛素特异性蛋白酶（USP）亚家族的成员，它参与调节多种细胞功能。 2-甲氧基雌二醇靶向USP13 有效抑制非小细胞肺癌转移 02 为筛选出有效的USP13抑制剂，研究人员采用了与泛素结合的7-酰胺基-4-甲基香豆素（AMC-Ub）作为底物，该底物可被广泛的DUB水解，如USP13，产生AMC荧光团。在重组USP13和AMC-Ub的培养基中孵育后，USP13活性与AMC荧光强度呈正相关。利用这个检测体系，筛选了一个天然化合物库，发现2-甲氧基雌二醇可以剂量依赖性地抑制USP13引起的AMC释放。2-甲氧基雌二醇对USP13的抑制效力与Spautin-1相当。研究人员使用K63-联锁四泛素（K63-Ub4）作为底物，进一步确认2-甲氧基雌二醇是否能够抑制USP13对K63-联锁多泛素化的催化活性。 研究人员检测到2-甲氧基雌二醇显著抑制了USP13介导的K63-Ub4的裂解。微量热传导（MST）结合实验显示，当2-甲氧基雌二醇与GFP-USP13共同孵育时，存在强有力的结合曲线，而与GFP单独蛋白共同孵育时则没有。然而，USP13抑制剂2-甲氧基雌二醇对于抑制KRAS突变非小细胞肺癌细胞的生长并不如全K-RAS抑制剂BAY293或G12C抑制剂Sotorasib有效，并且在抑制具有KRAS突变的NSCLC细胞的侵袭能力方面，2-甲氧基雌二醇表现更加优异。 研究人员评估了2-甲氧基雌二醇是否能够通过靶向USP13来抑制KRAS突变癌细胞的侵袭能力。转移试验显示，2-甲氧基雌二醇能够强烈地降低携带KRASG12S突变的A549细胞的侵袭能力。为了评估2-甲氧基雌二醇在体内的抗转移作用，研究人员将稳定表达荧光素酶基因（A549-Luc）的A549细胞注射到小鼠尾静脉中。小鼠接受2-甲氧基雌二醇治疗，并通过生物发光成像监测癌细胞的肺转移病灶。 研究人员在所有小鼠细胞移植后1周内没有检测到任何生物发光信号，但在6或7周后，小鼠出现了明显的生物发光信号，并且接受2-甲氧基雌二醇治疗的小鼠的生物发光信号显著减少。肺部的组织学检查也显示，2-甲氧基雌二醇剂量依赖性地减少了A549-Luc转移结节。2-甲氧基雌二醇治疗剂量依赖性地降低了转移肿瘤中的波形蛋白水平。此外，2-甲氧基雌二醇极大地抑制了表达WT但不是K508R β-连环蛋白的A549细胞的转移和波形蛋白表达。同时，在接受2-甲氧基雌二醇治疗的小鼠中没有观察到明显的毒性。 研究结果 03 综上所述，研究结果表明， USP13是一个新的KRAS效应因子，并且在KRAS突变的NSCLC组织中特异性上调。突变的KRAS通过转录因子RREB1促进USP13的表达。研究人员证明USP13去除β-连环蛋白的K63-链聚脲化并促进β-连环蛋白/TCF4的结合，从而导致其靶基因的转录，包括波形蛋白和癌转移。因此，靶向USP13将抑制RAS突变肿瘤的转移和进展。 参考资料： https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)01523-1 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 北京｜12月19日-20日 ▶第四届单细胞测序技术应用研讨会暨单细胞&空间组学研讨会（日程稍后公布） 点击对应文字 查看详情

性别是除年龄和APOE ε4以外的散发性AD的重要风险因素。本研究结果提示，女性大脑中USP11的生理性表达高于男性，更容易受tau蛋白负担的影响。若能抑制USP11介导的tau蛋白去泛素化可能会为A 阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，随着人口老龄化，AD患者人数越来越多，现有研究显示，女性患AD的风险约为男性的两倍[1]。 造成此性别差异的因素一直存在争议。有观点认为，可能是因为有更多的女性活到老年，使得女性患者绝对数自然大于男性[2]。但是，也有研究指出女性特有的激素变化是其具有AD高风险的原因之一[3]。 截至目前，女性高易感AD的分子机制尚未得到阐明。最近，美国凯斯西储大学医学院Jung-A.A.Woo和David E.Kang研究团队在著名期刊Cell上发表重要研究成果[4]。该研究提出了X染色体基因表达的泛素特异性肽酶11（USP11）可能是导致女性AD风险升高的原因。USP11可以使tau蛋白去泛素化，从而导致了tau蛋白的病理性聚集。 更重要的是，研究人员发现雌性小鼠和女性大脑中有着更高的USP11水平，并进一步验证了敲除usp11可以保护雌性小鼠免于tau蛋白病理影响，从而改善认知障碍。 若能抑制USP11介导的tau蛋白去泛素化，会减少女性对tau蛋白病理的易感性。这可能为降低女性患AD的风险提供了一个方向。 论文首页截图 让我们看一下这项研究是如何展开的。 tau蛋白的聚集和清除受到各种翻译后修饰的控制，包括磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化[5-8]。其中泛素化主要通过泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体通路来完成tau蛋白的清除[9]。 一旦tau蛋白的清除过程遭到破坏，那么它就会在神经元内发生病理性聚集，进而导致神经元的破坏。 事实上，人类基因组编码大约100种去泛素酶（DUBs），其中近一半是泛素特异性肽酶（USPs）[10]。为了研究USPs在tau蛋白调控中的作用，研究人员进行了功能性小干扰RNA （siRNA）筛选，确定了tau 蛋白的两个阳性调控因子USP13和USP11。 鉴于USP11位于X染色体上，所以研究人员提出假设，USP11可能是女性对tau蛋白病敏感的原因之一。 研究人员通过细胞转染技术发现， USP11的过表达显著增加了不溶性tau蛋白（神经元纤维缠结的主要成分）而未改变可溶性tau蛋白。这表明USP11促进了tau蛋白的不溶性和病理聚集。 A-B：USP11促进tau蛋白的不溶性 C：USP11增加tau蛋白的病理聚集 当研究人员将USP11加到tau蛋白泛素结合物中24小时后，除赖氨酸254外，几乎所有的泛素结合物都从tau蛋白中去除。这也证实了USP11可以去除tau蛋白泛素结合物导致去泛素化。 USP11去除tau蛋白泛素结合物 在胚胎发育早期，女性有一条X染色体具有转录活性而另一条将失活。然而，有意思的是，有研究曾指出USP11可以逃避这种失活[11-12]。这也就意味着，相对于男性而言，USP11会在女性中存在过表达的现象。 事实也确实如此，研究人员发现，AD女性患者大脑中USP11含量与tau蛋白病理的正相关性确实比男性更高一些( r2=0.5759，P<0.0001)，在多元线性回归分析后，此结果仍有意义。这说明USP11的累积可能是女性tau蛋白病理的驱动因素。 E-F：USP11与女性tau蛋白病理强相关 接下来，研究人员在小鼠中敲除usp11来验证对tau蛋白病理的清除影响。 结果发现，与未敲除usp11的雌鼠（tauP301S）相比，敲除usp11的雌鼠（tauP301S;usp11-/-）大脑中，不溶性的总tau蛋白和磷酸化tau蛋白减少了50%左右。虽然tauP301S;usp11-/-雄鼠的不溶性tau蛋白也有所减少，但其清除效应不及雌鼠。 研究人员进一步对5个月大的雌鼠脑切片进行了电生理记录，来验证USP11的敲除对突触间连接强度的调节影响。 研究人员通过双脉冲易化（PPF）和长时程增强（LTP）实验发现，tauP301S雌鼠的场兴奋性突触后电位（fEPSP）比值显著降低，且tauP301S雌鼠脑切片在1小时内LTP严重钝化。 然而，tauP301S;usp11-/-雌鼠表现出的fEPSP比值与LTP的诱导和维持是正常的。这表明usp11的敲除可恢复突触可塑性，从而改善认知障碍。 C：5月龄雌鼠PPF的定量分析 D：5月龄雌鼠LTP的定量分析 最后，研究人员通过水迷宫的获得性训练和探查试验发现，与tauP301S雌鼠相比，tauP301S;usp11-/-雌鼠发现隐藏平台的时间明显更短，进入靶区平台的时间也更短，空间记忆能力增强，这说明usp11的敲除可以改善雌鼠的空间记忆障碍。然而，usp11的敲除对雄鼠的空间记忆改善意义不大。 总的来说，性别是除年龄和APOE ε4以外的散发性AD的重要风险因素。本研究结果提示，女性大脑中USP11的生理性表达高于男性，更容易受tau蛋白负担的影响。若能抑制USP11介导的tau蛋白去泛素化可能会为AD女性患者的治疗提供一个新的方向。 参考文献： [1] Rajan KB, Weuve J, Barnes LL, McAninch EA, Wilson RS, Evans DA. Population estimate of people with clinical Alzheimer's disease and mild cognitive impairment in the United States (2020-2060). Alzheimers Dement. 2021;17(12):1966-1975. doi:10.1002/alz.12362. [2] Mielke MM, Ferretti MT, Iulita MF, Hayden K, Khachaturian AS. Sex and gender in Alzheimer's disease - Does it matter?. Alzheimers Dement. 2018;14(9):1101-1103. doi:10.1016/j.jalz.2018.08.003. [3] Wang Z, et al. FSH blockade improves cognition in mice with Alzheimer's disease. Nature. 2022;603(7901):470-476. doi:10.1038/s41586-022-04463-0. [4] Yan Y, Wang X, Chaput D, et al. X-linked ubiquitin-specific peptidase 11 increases tauopathy vulnerability in women. Cell. 2022;185(21):3913-3930.e19. doi:10.1016/j.cell.2022.09.002. [5] Ulrich G, Salvadè A, Boersema P, et al. Phosphorylation of nuclear Tau is modulated by distinct cellular pathways. Sci Rep. 2018;8(1):17702. Published 2018 Dec 7. Doi:10.1038/s41598-018-36374-4. [6] Balmik AA, Chinnathambi S. Methylation as a key regulator of Tau aggregation and neuronal health in Alzheimer's disease. Cell Commun Signal. 2021;19(1):51. Published 2021 May 7. doi:10.1186/s12964-021-00732-z. [7] Esteves AR, Palma AM, Gomes R, Santos D, Silva DF, Cardoso SM. Acetylation as a major determinant to microtubule-dependent autophagy: Relevance to Alzheimer's and Parkinson disease pathology. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2019;1865(8):2008-2023. doi:10.1016/j.bbadis.2018.11.014. [8] Flach K, Ramminger E, Hilbrich I, et al. Axotrophin/MARCH7 acts as an E3 ubiquitin ligase and ubiquitinates tau protein in vitro impairing microtubule binding. Biochim Biophys Acta. 2014;1842(9):1527-1538. doi:10.1016/j.bbadis.2014.05.029. [9] Ciechanover A, Kwon YT. Degradation of misfolded proteins in neurodegenerative diseases: therapeutic targets and strategies. Exp Mol Med. 2015;47(3):e147. Published 2015 Mar 13. doi:10.1038/emm.2014.117 [10] Komander D, Clague MJ, Urbé S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10(8):550-563. doi:10.1038/nrm2731. [11] Li X, Cui XL, Wang JQ, et al. Generation and Application of Mouse-Rat Allodiploid Embryonic Stem Cells. Cell. 2016;164(1-2):279-292. doi:10.1016/j.cell.2015.11.035. [12] Tukiainen T, Villani AC, Yen A, et al. Landscape of X chromosome inactivation across human tissues [published correction appears in Nature. 2018 Mar 7;555(7695):274]. Nature. 2017;550(7675):244-248. doi:10.1038/nature24265