LGR5

摘要：文章历史 双特异性抗体（bsAbs）是一类与单特异性单克隆抗体（mAbs）相比可以介导新颖作用机制的抗体。自从20世纪80年代和90年代发现mAbs并将它们作为治疗剂以来，bsAbs的开发一直具有相当的吸引力。尽管如此，截至2020年底，只有三种bsAbs（卡妥珠单抗、贝林妥单抗、艾美珠单抗）获得了批准。然而，自那时以来，已有11种bsAbs获得了监管机构的批准，其中九种（阿米万他单抗、特宾他单抗、莫苏尼单抗、卡多尼利单抗、特利珠单抗、格洛菲他单抗、依匹他单抗、塔尔奎他单抗、艾兰他单抗）被批准用于癌症治疗，另外两种（法利珠单抗、奥扎利珠单抗）用于非肿瘤学适应症。值得注意的是，在目前批准的13种bsAbs中，有两种，艾美珠单抗和法利珠单抗，已经达到了重磅炸弹药物的地位，显示出这类小说类治疗药物的潜力。在2020年代，可以预期在血液恶性肿瘤、实体瘤和非肿瘤学适应症中批准更多的bsAbs，确立bsAbs作为治疗武器库中的重要组成部分。 介绍 自单克隆抗体被发现以来，可以作为治疗药物使用的双特异性版本就引起了极大的兴趣。然而，由于在临床试验中生成和生产双特异性抗体(bsAbs)以及对更复杂的机制（MOAs）的生物学理解方面的挑战，开发进程被放缓了。第一个bsAb，即EpCAM/CD3ε T细胞引导剂卡妥珠单抗，最终在2009年被批准用于治疗恶性腹水患者（图1）。这种bsAb随后在2013年从市场上撤回，可能与其只能腹腔内给药有关，因为当通过静脉给药时，患者会出现严重的输注反应，以及由于其大鼠-小鼠嵌合四价设计的完全功能性Fc部分导致的高免疫原性。从2009年到2020年，只有另外两种bsAbs被批准：(1) 2014年，无Fc串联单链可变片段(scFv)基础的CD19/CD3ε双特异性T细胞引导剂(BiTE)贝林妥单抗(Amgen)用于治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)，和(2) 2017年，人源化异二聚体凝血因子IXa/X双特异性ART-Ig艾美珠单抗(Roche group)，作为凝血因子VIII模拟物用于治疗血友病A（图1）。 图1. 双特异性抗体监管批准的时间线及其相应的作用机制（MOA）。Linvoseltamab、odronextamab和tarlatamab目前正在进行监管审查，预计2024年将有决定。使用Biorender.com创建。 由于对这些分子的极大兴趣以及在过去二十年中用于开发它们的技术的进展，已经描述、设计并临床前开发了数百种bsAbs。其中，超过100种bsAbs已经进入临床试验。基于在开发新型bsAb格式、新颖的靶标组合和双特异性领先分子方面的重大努力，最近的情况已经发生了实质性的变化，自2021年以来bsAb的批准变得频繁。仅在过去三年（2021-2023年），就有11种新的bsAb被美国、欧洲、日本和/或中国的卫生当局批准用于患者（图1，表1）。在这些11种bsAbs中，有九种被批准用于治疗癌症：(1) EGFR/c-MET bsAb amivantamab（强生公司(J&J)）用于治疗带有EGFR外显子20插入突变的非小细胞肺癌(NSCLC)，(2) gp100-pMHC/CD3ε bsAb tebentafusp（Immunocore）用于治疗无法切除或转移性葡萄膜黑色素瘤，(3) CD20/CD3ε T细胞引导剂(TCE) mosunetuzumab（Roche group）用于治疗复发/难治性(R/R)滤泡性淋巴瘤，(4) PD-1/CTLA-4 bsAb cadonilimab（Akeso）用于治疗复发或转移性宫颈癌患者，(5) BCMA/CD3ε TCE teclistamab（J&J）用于治疗R/R多发性骨髓瘤，(6) CD20/CD3ε TCE glofitamab（Roche group）用于治疗R/R弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，(7) CD20/CD3ε TCE epcoritamab（AbbVie/Genmab）用于治疗R/R DLBCL，(8) GPRC5D/CD3ε TCE talquetamab（J&J）用于治疗R/R多发性骨髓瘤和(9) BCMA/CD3ε TCE elranatamab（辉瑞）用于治疗R/R多发性骨髓瘤。 两种额外的双特异性抗体（bsAbs）被批准用于非肿瘤适应症，针对VEGF-A/Ang-2的双特异性抗体faricimab（罗氏集团）用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿和视网膜静脉阻塞后的黄斑水肿，这是首个被批准用于眼科的双特异性抗体，以及针对TNF/人血清白蛋白（HSA）的双特异性抗体ozoralizumab（大正制药）用于治疗难以控制的类风湿性关节炎。罗氏集团与中外制药目前以四种获批的双特异性抗体领先该领域，紧随其后的是强生公司，拥有三种获批的双特异性抗体。值得注意的是，在目前获批的13种双特异性抗体中，有两种，emicizumab和faricimab，已经实现了重磅炸弹的地位，年销售额分别超过四十亿和二十亿美元，突显了这种新型治疗类药物的商业前景。 双特异性抗体格式 开发的双特异性抗体格式的多样性反映了在这些获批的双特异性抗体中应用的技术多样性（图2）。各自的双特异性抗体格式涵盖了非IgG样的双特异性抗体，包括1）安进公司的短半衰期串联scFv基础的BiTE格式，应用于blinatumomab，2）Immunocore公司的T细胞受体（TCR）-scFv融合基础的ImmTac格式，应用于tebentafusp，以及3）Ablynx公司的三价双特异性串联纳米抗体格式，通过HSA结合延长半衰期，应用于ozoralizumab。然而，大多数双特异性抗体是IgG样分子，其药代动力学与抗体相似，因为存在Fc。五种非对称1+1 IgG样双特异性抗体源自于控制的Fab臂交换，基于Duobody技术，应用于amivantamab、talquetamab、辉瑞公司的teclistamab、epcoritamab，或者相关链交换技术，应用于elranatamab。或者，通过中外制药的ART-Ig技术强制正确的链关联，应用于非对称1+1 IgG样双特异性抗体emicizumab以及常见的轻链。正确的重链关联也可以通过应用在mosunetuzumab中的knobs-into-holes技术来确保，或者与CrossMab技术一起应用，以强制正确的轻链关联在1+1 IgG样双特异性抗体faricimab中。最后，Akeso的cadonilimab包含一个对称的四价2+2 C末端IgG-scFv融合。在获批的双特异性抗体中，有四种应用了Genmab的Duobody技术，三种应用了基因泰克的knobs-into-holes技术，以及两种应用了罗氏pRED的CrossMab技术。可用格式的多样性表明“标准化”的双特异性抗体不太可能出现，但近期的批准强调了对经典异源二聚体IgG样双特异性抗体格式的关注。这些双特异性抗体通常显示出IgG样的药代动力学和低发生率的抗药物抗体。 获批双特异性抗体的作用机制 TCE是双特异性抗体，一个特异性结合到细胞表面肿瘤抗原，另一个特异性结合到TCR复合体的一个亚单位，因此在同时结合到肿瘤抗原和TCR时，T细胞随后被激活以杀死肿瘤细胞，分泌细胞因子并开始增殖。显然，T细胞的参与严格依赖于双特异性，并且不能通过两种传统单克隆抗体的组合来实现。在癌症治疗中，占主导地位的作用机制是T细胞的参与，获批和临床试验中最多的双特异性抗体是TCE。图2a显示了获批TCE双特异性抗体格式的演变。这类分子包括用于治疗复发/难治性血液癌症的TCE：1）CD19/CD3ε blinatumomab用于治疗ALL，2）CD20/CD3ε TCE mosunetuzumab用于治疗R/R非霍奇金淋巴瘤（NHL），以及glofitamab和epcoritamab用于治疗R/R DLBCL，3）BCMA/CD3ε TCE teclistamab、elranatamab和GPRC5D/CD3ε talquetamab用于治疗R/R多发性骨髓瘤。虽然通常T细胞参与治疗实体瘤似乎更具挑战性，可溶性的gp100-肽MHC/CD3ε特异性TCR-scFv融合tebentafusp是首个被批准用于治疗葡萄膜黑色素瘤的TCE，为在血液肿瘤之外的使用提供了证据。 血友病A是一种遗传性出血性疾病，其特征是缺乏血液凝固因子VIII。虽然可以给患者注射重组因子VIII，但这与因子VIII生产、短半衰期频繁给药和中和抗体的发展等挑战有关。为此，中外制药设计并优化了IXa/X双特异性抗体emicizumab，使其通过将酶因子IXa和底物因子X拉近，模仿血液凝固因子VIII的功能，同时展现出延长的药代动力学。 单特异性受体酪氨酸激酶阻断单克隆抗体，如抗EGFR的cetuximab和panitumumab或抗HER2的trastuzumab和pertuzumab，已经彻底改变了癌症治疗。尽管在靶向额外RTKs方面进展甚微，但针对两个RTKs同时的EGFR/c-Met双特异性抗体amivantamab最近被批准用于治疗具有EGFR外显子20插入突变的特定亚组NSCLC患者。除了其双重信号抑制功能，包括通过阻断配体结合位点和通过受体下调，amivantamab还包含一个afucosylated Fc部分，以介导增强的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）以促进NK细胞和巨噬细胞/单核细胞的参与。 在过去的十年中，获批的免疫检查点抑制性抗体，包括针对PD-1（nivolumab、pembrolizumab、cemiplimab）、PD-L1（atezolizumab、avelumab、durvalumab）和CTLA-4（ipilimumab、tremelimumab）的抗体，已经彻底改变了癌症治疗领域，并确立了癌症免疫疗法。基于这一经验，设计了双重PD-1/CTLA-4检查点抑制性双特异性抗体cadonilimab，目标是专门且理想地同时结合并抑制抗原特异性T细胞上的PD-1和CTLA-4，以克服检查点抑制。 促血管生成因子VEGF-A和Ang-2通过促进视网膜血管生成和破坏血管稳定性，导致渗漏、随后的水肿和炎症，从而促成视力丧失。VEGF-A和Ang-2在眼睛中干扰血管生成、稳定血管并减少渗漏和炎症（图2e）。为了最小化外周活动并消除FcγR的结合，它被设计为带有工程化的Fc部分，具有Triple A FcRn和P329G LALA突变，以实现FcRn循环。 图2. 获批双特异性抗体（bsAbs）的示意图、适应症和作用机制：a) T细胞引导剂（TCE），b) 因子VIII模拟物，双重信号抑制：c) 双特异性受体酪氨酸激酶（RTK）抑制剂（BsRtki），d) 双特异性检查点抑制剂（BsCPI），e) 双配体抑制剂（DLI），f) 半衰期延长（HLE）配体抑制剂。使用Biorender.com创建。 值得注意的是，双特异性是考虑眼内给药时的一个主要优势。对于TNF配体抑制剂ozoralizumab，应该指出，从功能上讲，这种纳米抗体结构像一个单特异性抗体一样阻断TNF，第二个单一域特异性仅需要通过与HSA结合来实现IgG样的药代动力学，而不依赖于Fc部分，从而实现FcRn循环。 在增强内源性或预先存在的免疫反应的研究领域，另一个主要的研究领域仍然是开发针对例如PD-1和CTLA-4或LAG-3（tebotelimab）的双重靶向检查点抑制性双特异性抗体。这些双重检查点抑制剂中有几个目前正在进行高级临床试验，结果将显示它们在疗效和/或安全性方面是否优于相应的PD-1/PD-L1单克隆抗体与CTLA-4或LAG-3单克隆抗体的组合。值得注意的是，双重靶向PD-1/VEGF抑制性双特异性抗体ivonescimab目前正在中国国家药品监督管理局进行监管审查，用于治疗NSCLC。 展望未来 在这十年中，已经有11种双特异性抗体获得批准，预计未来几年将有更多的具有改变医疗实践潜力的双特异性抗体获得批准。在肿瘤学领域，开发差异化的双重RTK信号抑制剂，并通过双特异性抗体共靶向不同的细胞表面受体，仍然是一个活跃且先进的临床研究领域。一些例子包括：EGFR/LGR5如petosemitab，HER3如zenocutuzumab，HER2或双伞型双特异性抗体靶向HER2如zanidatamab，目前正在美国进行审查。 鉴于双特异性抗体的多功能性和介导完全新颖的作用机制的潜力，双特异性抗体领域有望看到新出现的方法和候选药物进入临床试验，希望在未来几年内，在肿瘤学和非肿瘤学适应症中，包括感染/病毒学、自身免疫、代谢、神经学和眼科等领域，提供关键数据。这些新概念包括最近描述的不同方法，包括：1）与TCE不同的效应细胞引导者，如髓系细胞、NK或γδ-T细胞，2）原位组装概念，以特别激活在双重靶标表达细胞上的双特异性抗体或在肿瘤微环境中，3）PROTAC类方法导致膜蛋白的内化和降解，4）基于抗体的细胞因子模拟物触发细胞因子受体，以及5）独特的解决方案，用于传递双特异性抗体超越障碍，如血脑屏障，包括双伞型单特异性双特异性抗体靶向HER2如zanidatamab zovodotin（ZW49）或c-MET与REGN5093。 开发用于治疗不同血液恶性肿瘤的TCE将继续是合成免疫方法领域的一个主要研究领域，因为这类治疗已经证明了其益处。到目前为止，基于Regeneron的VelociBi技术的不对称1+1 TCE odronextamab（CD20/CD3ε）和linvoseltamab（BCMA/CD3ε）目前正在进行监管审查，可能会在2024年获得批准，还有各种其他的TCE正在进行高级临床开发，用于NHL、多发性骨髓瘤和AML。重要的是，新出现的数据显示，TCE将来也可能在实体瘤中找到更广泛的应用。事实上，最近已经发布了针对Amgen的1+1 DLL3/CD3ε Fc-BiTE tarlatamab治疗R/R小细胞肺癌的有希望的临床数据，目前正在进行监管审查，以及Xencor/Amgen的2+1 STEAP1/CD3ε XmAb xaluritamig用于治疗R/R前列腺癌。这些数据支持了这样一个观点，即足够肿瘤特异性以实现强大的抗肿瘤效果，同时限制靶标外肿瘤毒性的实体瘤靶标是可用的。在这种情况下，像蛋白酶激活这样的肿瘤激活机制旨在增加针对实体瘤的TCE的治疗窗口。 基于TCE的作用机制，为T细胞提供TCR信号1，目前正在快速临床采用靶向CD28或4-1BB/CD137的共刺激双特异性抗体，为T细胞提供信号2，从而实现持续和更持久的T细胞反应，这可能对治疗神经退行性疾病和其他疾病有应用。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

引言 癌症，是动态进化的，以选择性地在外来肿瘤环境中茁壮成长，例如癌细胞扩散的侵袭性前沿和远端器官。在进化过程中，肿瘤细胞经常重新利用组织固有的发育和致癌程序来获得生存优势，从而偏离其最初的细胞身份【1】。胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤，其特点是肿瘤细胞具有显著的分子多样性，可以表现出不同的细胞身份。对胰腺癌的分子分类研究识别出不同的分子亚型，这些亚型与肿瘤的侵袭性、化疗反应和疾病预后有关。特别是，研究人员发现了两种主要的分子亚型：一种是保留了大量胰腺导管特征的亚型，另一种是预后较差的亚型，这种亚型的特点是失去了导管谱系的特征，并异常激活了基底细胞或鳞状细胞程序。在胰腺癌的发展过程中，肿瘤细胞可能会经历一种称为鳞状转分化的过程，即从导管细胞表型转变为鳞状细胞表型。这种转变与肿瘤的侵袭性和不良预后有关【2,3】。尽管已经有一些研究关注了这一现象，但关于这一过程的具体分子机制仍然不清楚，而且由于缺乏包含人类胰腺癌分子和组织学谱的实验模型，导管到鳞状谱系转换的生物学相关性和决定因素也尚未确定。 近日，来自日本庆应义塾大学医学院的Toshiro Sato团队在Nature Cell Biology上在线发表题为Wnt-deficient and hypoxic environment orchestrates squamous reprogramming of human pancreatic ductal adenocarcinoma的文章，深入探讨了人类胰腺导管腺癌在Wnt信号缺乏和缺氧环境下，通过分子多样性和表观遗传变化实现从导管细胞到鳞状细胞的转分化的分子机制，证实H3K27me3介导的表观遗传修饰和TP63基因的激活在这一过程中起到了关键作用，并发现EZH2抑制剂可能对治疗特定类型的胰腺癌具有潜力，不仅展示了不利的肿瘤微环境影响人类胰腺癌在分子层面和组织学层面上的演变的过程，而且为理解人类癌症中细胞谱系转换的原则和重要性提供了洞见，对于理解癌症的复杂性和开发新的治疗方法具有重要意义。 为了全面捕捉人类胰腺癌的分子多样性，本文研究人员构建了65个来自患者的胰腺癌类器官系，使用基于生长因子的选择方法来富集癌症类器官，并分析了这些类器官对Wnt-3A和R-spondin（WR，这是两种在细胞信号传导中起重要作用的分泌型蛋白质，在调节肿瘤微环境中的信号传导中扮演着重要角色，在类器官培养中，Wnt-3A和R-spondin也常被用作培养基质成分，以维持类器官的干细胞特性和促进其增殖）的依赖性，将这些类器官分为三类：需要WR的Wnt非分泌（Wnt−）亚型、利用自分泌Wnt但需要R-Spondin的Wnt分泌（Wnt+）亚型、以及在缺乏WR的情况下能够增殖的WR非依赖（WRi）亚型。与已有研究结果一致，包括WRi亚型在内的胰腺癌类器官大多没有Wnt途径突变，提示非遗传因素在WR非依赖性中起作用。同时，根据形态特征可以将这些类器官分为3类：具有极化单层形态的囊性类器官，具有多个腔室和偶尔伪分层的筛状类器官，以及显示出密集堆积的层状外观且没有腔室结构的实体类器官。类器官的形态反映了细胞固有的组织学属性，与它们的分子特征和疾病进展阶段有关。特别是实体类器官表现出对WR的非依赖性，这可能反映了疾病晚期的生物学特性。 随后，研究人员利用RNA测序技术对不同类型和状态的胰腺癌类器官进行了全面的基因表达分析，结果显示胰腺癌类器官的整体转录组模式会随着它们对Wnt信号的依赖性不同而发生变化，不依赖Wnt信号的类器官（如WRi亚型）倾向于表达与基底样和鳞状细胞特征相关的基因，如TP63、KRT5和KRT6A。这些TP63高表达的实体类器官的异种移植瘤都显示出与胰腺腺鳞癌（PASC）类似的组织学特征，包括腺体结构的丧失、多边形细胞的片层组织和鳞状细胞标记的表达，被称为PASC类器官。PASC类器官表现出不可逆的实体结构，且大多数不依赖于WR，而且它们还表现出与内胚层和胰腺发育相关的转录因子的低表达，包括GATA6、LGR5（R-spondin受体和典型Wnt信号的靶标），而这可能与它们对Wnt信号的不活跃反应有关。进一步研究结果显示，ΔNp63（在PASC中表达的TP63亚型，被报道可在癌细胞中促进导管到鳞状的改变）的过表达足以在非PASC肿瘤类器官中诱导出PASC的分子和表型特征。相反，TP63的敲除则导致PASC类器官失去了鳞状细胞属性，恢复了腺体结构，并且对WR的依赖性增加。由此表明TP63是调控人类PASC中鳞状细胞表型的关键分子，并且是PASC发展过程中的一个重要调节因子。 PASC类器官的极端基因表达模式提示在导管到鳞状进展过程中存在广泛的表观基因组重塑，因此通过转座酶可接近的染色质测序（ATAC-seq）和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），研究人员证实PASC类器官具有独特的染色质可接近性模式，而且H3K27me3修饰在PASC类器官中富集于那些在PASC中表达下调的基因，包括GATA6和LGR5等。由此表明在PASC的发展过程中，表观遗传修饰，特别是H3K27me3的沉积，可能在抑制原始导管细胞身份基因的表达中起到了关键作用，从而促进了向鳞状细胞表型的转换。 进一步地，研究人员探讨了H3K27me3沉积在PASC中的分子基础。实验结果显示，在含有WR的培养条件下，敲除GATA6或KDM6A（一种在鳞状亚型中反复突变或缺失的赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶，可使H3K27去甲基化）的类器官没有表现出明显的形态变化。然而，在缺乏WR的条件下，敲除KDM6A和GATA6的双敲除类器官出现了实体化转变，并且变得不再依赖WR信号，而且表现出了与PASC相似的基因表达模式以及染色质可接近性模式，这些变化也与H3K27me3修饰的重新分布有关。由此表明KDM6A的单独缺失不足以诱导PASC转化，需要GATA6的共同失活和环境WR的耗尽一起发挥作用，促进胰腺癌细胞向鳞状细胞命运的表观遗传重编程，以实现在Wnt缺陷生态位中的选择性生长。与此同时，氧气对于KDM6A的去甲基化活性也至关重要，而且临床胰腺癌肿瘤已知是低血管化的。研究结果显示，缺氧和Wnt信号缺陷的微环境也可以驱动胰腺癌细胞向鳞状细胞表型的转化，并指导其表观遗传重编程，从而决定PASC的命运。临床数据同样支持了胰腺癌组织的鳞状属性与典型Wnt和氧气利用率低的肿瘤环境之间的关系。单细胞测序结果显示在Wnt缺乏的低氧条件下，从经典导管型到PASC的转换是时间依赖性的，它要通过一个中间状态，而与炎症和应激反应相关的基因在转换过程中被激活，证明从导管谱系到PASC命运的转换特征是导管身份的快速丧失、中间程序的短暂激活和鳞状细胞特征的逐步获得。 最后，研究人员评估了平衡PASC的表观遗传偏倚是否可以对这种致命疾病产生治疗效果。鉴于PRC2和KDM6A在H3K27me3上的相反功能，研究人员检测了EZH2（PRC2的核心组分）抑制对胰腺癌类器官的影响。结果显示，EZH2抑制剂对胰腺癌类器官的生长有明显的抑制作用，尤其是对于那些表现出WR非依赖（WRi）和PASC特征的类器官。此外，对于部分对EZH2抑制剂反应较弱的类器官，通过同时阻断Wnt信号可以增强EZH2抑制剂的效果，提示表观基因组靶向治疗PASC的治疗潜力。 图1 模式图（Credit: Nature Cell Biology） 综上所述，本研究展示了PASC类器官的衍生，随后采用了多层次的方法，整合了基因工程、全面的分子分析和药物测试，揭示了人类胰腺癌中鳞状重编程的分子和环境基础，阐明PASC组织发生的特点在于环境依赖性的表观遗传景观的改变，导致癌细胞导管身份的丧失，而向鳞状细胞谱系的转化，并获得了Wnt信号的非依赖性，而这可能是EZH2抑制的治疗靶点（图1）。由此不仅提供了对人类胰腺癌生物学的基本见解，而且还补充了临床相关PASC模型的缺乏。 参考文献 1. Fujii, M., Sekine, S. & Sato, T. Decoding the basis of histological variation in human cancer. Nat. Rev. Cancer 24, 141–158 (2024). 2. Collisson, E. A. et al. Subtypes of pancreatic ductal adenocarcinoma and their differing responses to therapy. Nat. Med. 17, 500–503 (2011). 3. Hayashi, A. et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nat. Cancer 1, 59–74 (2020). https://doi.org/10.1038/s41556-024-01498-5 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

引言 昼夜节律是机体为了适应环境的节律性变化，进化出的节律性行为、生理和细胞活动，使机体可有效利用营养进行高能量需求的生理行为、抵御病原入侵以及进行自我修复等活动【1】。肠道粘膜免疫的昼夜节律活动可及时响应环境因子的变化如肠道菌群和进食以维持肠道稳态和应对病原威胁【2, 3】。已有报道表明，肠道菌群可通过表观遗传因子，如组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3），节律性驱动基因组水平的组蛋白去乙酰化，从而调控上皮细胞的生理活动【4】。然而，昼夜节律在不同类型肠上皮细胞中调控作用尚不清楚。 簇细胞（Tuft cell）是肠上皮细胞中占比极低的一类分泌型细胞（~1%），该细胞作为“哨兵”细胞，可感应环境来源信号并调控和维持肠道粘膜稳态【5-7】。鉴于肠道簇细胞在抵抗病原微生物感染中的重要作用，如寄生虫和诺如病毒，簇细胞的分化增值一直是科研人员关注的焦点。然而，簇细胞的分化增值是否受昼夜节律的调控仍知之甚少。 近日，卡耐基梅隆大学匡正团队在Science Immunology杂志发表了题为HDAC3 integrates TGF-β and microbial cues to program tuft cell biogenesis and diurnal rhythms in mucosal immune surveillance的研究文章，发现肠道簇细胞的丰度表现出昼夜节律，HDAC3可通过TGF-β—SAMDs信号通路调控簇细胞的分化而调节簇细胞丰度的昼夜节律。值得注意的是，该过程受到肠道菌群和饮食的干预。更有意思的是，簇细胞丰度的昼夜节律变化使宿主对诺如病毒CR6毒株的易感性呈现出昼夜差异，而肠上皮细胞特异性敲除HDAC3小鼠表现为昼夜易感性无差异。此外，肠上皮HDAC3缺失使2型免疫反应受损并降低了宿主的寄生虫清除能力。本研究揭示了表观遗传调控肠上皮细胞的免疫监视以应对食物和微生物的日常波动。 在这项研究中，作者首先通过分析簇细胞相关基因的表达，发现回肠簇细胞相关基因的表达呈现昼夜节律，而簇细胞相关基因的节律性在肠上皮HDAC3缺失的小鼠中丢失。作者进一步通过一系列簇细胞数量分析实验表明，肠上皮HDAC3缺失显著的降低了簇细胞在肠道中的数量。已有报道表明，簇细胞与2型免疫形成正反馈回路，发挥抗寄生虫作用。因此，作者进一步通过小鼠蠕虫感染模型、琥珀酸盐刺激模型（琥珀酸盐可通过簇细胞受体SUCNR1启动簇细胞—2型免疫正反馈回路）和类器官模型，发现肠上皮HDAC3可促进肠道2型免疫以抵抗蠕虫感染。作者进一步通过诺如病毒感染模型揭示了肠上皮HDAC3对簇细胞特异的诺如病毒CR6的感染具有调节作用。 为了回答肠上皮HDAC3是如何调控簇细胞分化的，作者首先分析了流式分选簇细胞的标签基因Dclk1和Pou2f3的表达，发现肠上皮HDAC3缺失显著降低了调控簇细胞分化的转录因子Pou2f3的基因表达，而不影响簇细胞标签基因Dclk1的表达。通过一系列实验作者发现，TGF-β信号可促进Pou2f3的转录，而肠上皮缺失HDAC3显著抑制了TGF-β信号的激活，导致Pou2f3的转录受阻，从而抑制簇细胞分化。运用肠道Lgr5+干细胞特异性缺失HDAC3小鼠模型，作者进一步发现HDAC3-TGF-β信号通路调控簇细胞分化主要发生于肠道干细胞。那么，TGF-β信号调控的簇细胞分化是否会影响簇细胞—2型免疫环路呢？作者通过类器官模型和琥珀酸盐激活2型免疫小鼠模型，发现TGF-β受体抑制剂可显著抑制IL-13和琥珀酸盐引起的簇细胞增殖。可见，肠道干细胞的HDAC3—TGF-β信号通过增强Pou2f3的转录而正向调控簇细胞分化。 由于簇细胞相关基因的表达呈现出显著的昼夜节律，那么，簇细胞的分化是否也具有昼夜节律，以响应肠道环境的昼夜变化？有意思的是，作者通过系列实验表明野生型小鼠的簇细胞丰度在傍晚显著高于凌晨，而肠上皮HDAC3缺失小鼠的簇细胞丰度则失去了昼夜差异。有趣的是，TGF-β受体抑制剂处理的小鼠，簇细胞丰度也不表现出昼夜差异。昼夜差异的肠道簇细胞是否具有生理意义呢？作者首先分析了2型免疫相关基因的表达，发现它们的表达在野生型小鼠中具有昼夜节律，而在肠上皮HDAC3缺失小鼠和TGF-β受体抑制剂处理的小鼠中则降低了，且不表现出昼夜节律。值得一提的是，作者发现野生型小鼠对特异性感染簇细胞的诺如病毒CR6毒株的易感性具有昼夜节律，而肠上皮HDAC3缺失小鼠则表现出易感性降低且无昼夜节律。由此可见，簇细胞在小鼠将进入饮食活跃期时分化增生，以发挥肠道粘膜免疫“哨兵”作用。 肠道菌群的丰度和组成具有昼夜节律，其是否会是引起簇细胞丰度昼夜变化的环境因素呢？为了回答这个科学问题，作者通过无菌小鼠模型和抗生素鸡尾酒小鼠模型，发现无菌小鼠的簇细胞丰度和相关基因表达均不表现出昼夜节律。此外，抗生素鸡尾酒处理的小鼠，其TGF-β—SMADs信号亦显著被抑制，表明肠道菌群可能通过HDAC3—TGF-β信号调节簇细胞丰度的昼夜节律。已有报道表明，饮食可影响肠道菌群。因此，作者也探究了饮食习惯对小鼠簇细胞丰度昼夜节律的作用，发现夜间进食小鼠和日间进食小鼠的簇细胞丰度表现出完全相反的节律性。因此，环境因子如肠道菌群和饮食习惯均可调节簇细胞的昼夜生成节律。 模式图（Credit: Science Immunology） 综上所述，本研究通过探究HDAC3对肠道簇细胞的昼夜节律性分化增生的调控作用，揭示了表观遗传因子协同肠道菌群调控簇细胞的昼夜节律生成，以实时监测肠道环境变化以及维持肠道免疫稳态。这项研究为在治疗肠道相关疾病时，选择合适的治疗时间和进食方式提供了一定的参考。 参考文献 1. J. F. Brooks, L. V. Hooper, in Semin. Immunopathol. (Springer, 2020), vol. 42, pp. 697-708. 2. A. Mukherji, A. Kobiita, T. Ye, P. Chambon, Homeostasis in intestinal epithelium is orchestrated by the circadian clock and microbiota cues transduced by TLRs. Cell 153, 812-827 (2013). 3. T. Tuganbaev, U. Mor, S. Bashiardes, T. Liwinski, S. P. Nobs, A. Leshem, M. Dori-Bachash, C. A. Thaiss, E. Y. Pinker, K. Ratiner, Diet diurnally regulates small intestinal microbiome-epithelial-immune homeostasis and enteritis. Cell 182, 1441-1459. e1421 (2020). 4. Z. Kuang, Y. Wang, Y. Li, C. Ye, K. A. Ruhn, C. L. Behrendt, E. N. Olson, L. V. Hooper, The intestinal microbiota programs diurnal rhythms in host metabolism through histone deacetylase 3. Science 365, 1428-1434 (2019). 5. D. M. Barbosa, P. Fahlbusch, D. Herzfeld de Wiza, S. Jacob, U. Kettel, H. Al-Hasani, M. Krüger, D. M. Ouwens, S. Hartwig, S. Lehr, Rhein, a novel Histone Deacetylase (HDAC) inhibitor with antifibrotic potency in human myocardial fibrosis. Sci. Rep. 10, 1-13 (2020). 6. C. B. Wilen, S. Lee, L. L. Hsieh, R. C. Orchard, C. Desai, B. L. Hykes Jr, M. R. McAllaster, D. R. Balce, T. Feehley, J. R. Brestoff, Tropism for tuft cells determines immune promotion of norovirus pathogenesis. Science 360, 204-208 (2018). 7. M. S. Strine, C. B. Wilen, Tuft cells are key mediators of interkingdom interactions at mucosal barrier surfaces. PLoS Pathogens 18, e1010318 (2022). https://www.science.org/doi/10.1126/sciimmunol.adk7387 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述