influenza virus M1

摘要传统流感疫苗产生毒株特异性抗体，不能提供针对不同流感病毒毒株的保护。此外，由于流感病毒频繁的抗原变化和漂移，需要每年重新配制和重新接种以匹配流行的毒株。因此，通用流感疫苗(UIV)的开发对于针对所有季节性流感病毒株的长期保护以及针对潜在疫情病毒的保护至关重要。开发UIV的最重要策略之一是选择最佳靶向抗原，以产生针对不同流感病毒株的广泛交叉反应性中和抗体或交叉反应性T细胞应答。然而，每种类型的UIV靶抗原对于产生针对不同流感病毒的足够免疫应答都有优点和局限性。在此，我们回顾了目前关于抗原使用的策略和前景，包括血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白和内部蛋白，用于通用流感疫苗的开发。关键词：流感，通用疫苗，抗原，免疫应答。1.介绍流感病毒是属于正粘病毒科的包膜RNA病毒。根据抗原差异划分，流感病毒有四个属，A、B、C和D。在流感类型中，人类甲型流感病毒和乙型流感病毒都引起季节性流感，而甲型流感病毒(IAVs)是唯一引起大流行的病毒。IAVs分为两个系统发育类群，1和2。类群1病毒包括H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18，而类群2病毒包括H3、H4、H7、H10、H14和H15。乙型流感病毒分为两个谱系，B/Yamagata样和B/Victoria 。C型流感病毒不太流行，据报道仅在人类中引起轻微疾病，而D型流感病毒尚未感染人类，但会感染牛、猪、反刍动物、马和骆驼。接种疫苗被认为是控制流感感染的最有效方法，尽管现有的流感疫苗有一些局限性。目前，季节性流感疫苗主要有三种类型：减毒活疫苗、灭活疫苗和重组疫苗。减毒活流感疫苗(LAIV)被认为是传统灭活流感疫苗的替代品，因为它们能够模拟自然感染并诱导体液、细胞和粘膜免疫反应。40多年前，LAIV首次在俄罗斯使用，2003年在美国获得许可，2012年在欧洲获得许可，并已被证明对甲型流感病毒的抗原变种具有保护作用。季节性疫苗针对的流感病毒株是根据世界卫生组织协调的全球监测来选择的；因此，疫苗的有效性很大程度上取决于疫苗株与流行病毒之间的匹配。由于流感血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)糖蛋白的抗原快速转移和漂移，每年都需要重新配制和重新接种疫苗。尽管季节性流感疫苗每年更新以匹配流行毒株，但2004-2020年流感季节的疫苗有效性仅为10%至60%[10](图1)，据世界卫生组织估计，每年导致25万至50万人死亡。根据初步的季末估计，2019-2020年流感季节的流感疫苗有效性估计仅为39%[10]。除了季节性流行之外，流感大流行也是不可预测的重大全球威胁。1918年西班牙(H1N1病毒)、1957年亚洲(H2N1病毒)、1968年香港(H3N2病毒)和2009年猪(H1N1大流行病毒)流感这四场20世纪和21世纪最大的流行病造成了全球卫生危机，造成了巨大的死亡率和发病率和巨大的经济负担。2009年最近的流感大流行清楚地表明，流感疫苗不足以控制潜在的大流行和季节性流行病。因此，有必要提高目前流感疫苗的免疫原性和效力。此外，由SARS-CoV-2病毒引起并于2019年12月底首次出现的新冠肺炎仍在威胁全球健康，感染患者和死亡人数不断增加。此外，合并感染流感会使新冠肺炎患者的死亡风险增加一倍以上。因此，当新冠肺炎合并感染时，有效的流感疫苗对于限制严重后果至关重要。图1 2010-2020年流感季节的估计疫苗效力(VE)。数据改编自疾病控制和预防中心季节性流感疫苗有效性研究。疫苗效力的定义是，与未接种疫苗的人相比，接种疫苗的人患流感疾病的频率减少了百分比，这是使用美国疫苗效力网络的数据进行估计的。数据显示为调整后的总体VE(%)，可信区间为95%。已经做出了许多努力来开发通用流感疫苗(UIV)，这种疫苗能够对由类群1和类群2流感病毒引起的症状性疾病提供至少75%的效力，并在所有人群中持续保护至少12个月；然而，目前还没有商业UIV可用。已经探索了许多方法，包括靶向保守的抗原，如HA、NA、基质和内部蛋白，以及多个疫苗平台的应用，包括重组抗原/蛋白质疫苗、重组/重组流感病毒疫苗、病毒载体疫苗、病毒样颗粒(VLP)疫苗、纳米颗粒疫苗、DNA/RNA疫苗和多平台疫苗。由于需要针对不同的季节性和潜在的大流行流感病毒株产生广泛的免疫反应，因此慎重选择UIV开发的靶向抗原是当务之急。在这篇综述中，我们总结了目前抗原靶向策略在UIV开发中的优势和局限性。2.基于HA的通用流感疫苗流感HA分子由两个不同的结构域组成，一个是由部分HA1组成的球形头部，另一个是由部分HA1和全部HA2组成的茎结构。传统的IAV疫苗依赖于针对可变HA头部结构域的中和抗体(Abs)的产生，因此该疫苗具有毒株特异性。目前的策略针对变化较小的HA区域，包括茎结构域或/和头部结构域内的保守表位。这些方法包括使用无头HA、嵌合HA、镶嵌HA、计算优化的广谱反应抗原(COBRA)和“呼吸”HA。2.1 无头HA针对保守的茎结构域的广泛中和抗体的发现促进了基于茎结构域的UIVs的发展。Graves等人于1983年首次尝试通过化学去除免疫优势的HA全球头部结构域来生产免疫优势的无头HA。然而，这种处理导致HA2茎结构域的构象变化和HA1茎结构域中构象表位的移除，这是结合广泛活性的抗茎抗体所必需的。其他努力，包括基因治疗和在大肠杆菌或昆虫细胞中表达无头HA；然而，无头HA的构象可能远不是最佳的，尽管它在病毒攻击后提供了同源、异源和异亚型保护。2015年，Imagliazzo等人和Yassine等人通过在分子的膜近端引入稳定元件，独立生成了稳定且正确折叠的无头HA。无头HA通过Fc依赖的机制，如抗原依赖的细胞毒性(ADCC)，诱导茎特异性抗体并保护动物免受H5N1病毒的异亚型攻击，而没有强大的中和抗体效价。这些发现不仅显示了无头HA在UIV发展中的潜在重要性，而且还表明了一种克服该分子构象变化的方法。然而，基于H1 HA柄的构建只提供了对类群1 IAV的保护。2016年，潘的研究小组首次报道，第1组无头HA微茎对类群1(H1和H5)和类群2(H3)流感病毒具有保护作用。此外，邓等人最近的一项研究表明，将由四聚体M2e配制的无头HA用于蛋白质纳米颗粒可以诱导持久的免疫反应，并保护小鼠免受同一组或两组不同IAV的挑战。虽然不断努力开发基于无头HA的UIV，但也有一些人担心HA干细胞特异性抗体诱导抗体依赖增强(ADE)。尽管上述研究值得进一步探索基于HA的无头UIV，但仔细评估无头HA诱导的抗体是否可以增强ADE，从而增加疾病严重程度是一个先决条件。2.2 嵌合HA除了无头HA外，另一种将免疫反应从HA头部转向HA茎的策略是使用嵌合HA(cHA)。这种方法包括通过与共享相同的茎结构域但不同的头部结构域的cHA连续接种来诱导抗茎抗体(图2)。cHA包括来自当前季节性IAV的HA茎结构域，例如H1、H3或B型流感病毒，以及来自外来禽流感病毒的HA头部结构域。第一次接种cHA可诱导出针对头和茎两个区域的抗体。用包含与第一次接种相同的茎域和不同的头域的另一cHA进行免疫导致对新的头域的初级响应和对固定的茎域的召回响应。用另一种由固定的HA茎结构域和不同的HA头部结构域组成的cHA进行额外的免疫可以进一步增强茎的反应。在不同的疫苗配方中接种cHA，如重组蛋白、病毒载体或基于核苷酸的疫苗，已被证明能诱导高茎反应性抗体，从而保护小鼠免受不同IAV的攻击。此外，连续接种CHA疫苗(CH8/1和CH5/1)在兔身上被证明是局部和系统耐受性良好的。由于这一策略同时诱导抗头和抗茎反应抗体，CHA提供的保护既通过中和抗体又通过非中和抗体(如ADCC活性)。用以CHA为基础的疫苗治疗雪貂可预防大流行性H1N1病毒感染。在雪貂模型中，连续接种CHA疫苗和减毒活疫苗还可以诱导HA茎特异的体液反应，授予针对不同IAV的保护性异型免疫，并诱导针对大流行H1N1病毒感染的长期免疫反应。最近，使用基于CHA的UIV的I期临床试验(NCT03300050)显示，该疫苗对人类使用是安全的(表1)。接种疫苗的健康成年人表现出非常高的抗茎抗体效价和持久的免疫反应图2 嵌合HA疫苗接种方法。在这个例子中，CHA疫苗包含来自H1 HA的茎结构域和来自外来禽类HA亚型的头部结构域。CHA可诱导对杆状H1HA的低抗体反应。然而，用含有相同茎H1HA结构域的其他CHA加强免疫，但外来禽亚型的不同HA头域增加了对H1HA茎结构域的抗体应答。CHA提供的保护是由中和抗体和非中和抗体(如ADCC)介导的。HA的结构采用瑞士模型(2021年4月5日访问https://www.swissmodel.expasy.org/，)。具有代表性的H1 Has来自甲型流感病毒(A/California/07/2009H1N1)，序列来自GenBank(ACQ55359.1)，或来自A型流感病毒(A/GOOSE/广东/1/1996(H5N1)，序列来自GenBank(YP_529486.1)。表1 临床试验中的多种通用流感疫苗。尽管基于CHA的疫苗可以诱导产生抗茎HA的抗体，并对同源和异种病毒攻击提供保护，但这种疫苗的保护效果可能仍然有限，这取决于嵌合抗原亚型。此外，需要对不同的嵌合疫苗进行多剂量疫苗接种，以诱导广谱的疫苗效力。因此，进一步的研究需要有计划的抗原选择和简化的疫苗策略。2.3 马赛克HA马赛克HAS(MHAs)的设计思想是不仅针对保守的茎区，而且针对主要抗原位点外的头部区域的表位产生抗体。鉴于一些单抗与不同流感毒株的HA头部结构域显示出交叉反应[46-48]，MHA被开发来最大限度地交叉反应和最小化遗传差异。MHA可以诱导针对HA头部和茎结构域的免疫反应(图3)。这与替换整个HA头部区域的CHA不同。具体地说，MHA是通过仅将头部HA的主要抗原位点替换为外来禽流感HA亚型的抗原位点来构建的。因此，MHA的保守头部和茎结构域来自H1、H3或B型流感病毒HA。MHA可诱导大量针对HA头区抗原位点的抗体和少量针对HA茎区保守表位的抗体。然而，用另一种不同的MHA(不同的抗原部位)增强可诱导针对HA头部和茎部位的抗原部位和保守表位的抗体。在小鼠模型中，发现用B型马赛克流感血凝素连续免疫可以诱导对同源和异种B型流感病毒株的交叉保护。接种马赛克H5 HA可增强抗体和T细胞反应，为小鼠抵御H5N1和H1N1病毒提供保护。接种H1马赛克HA或H3马赛克HA的小鼠也对不同的流感病毒株表现出广泛的免疫保护反应。Kingstad-Bakkle及其同事表明，通过聚酸酐纳米颗粒或改良的病毒Ankara传递的马赛克H5疫苗抗原可以在无特定病原体(SPF)和商业鸡只中诱导体液和细胞免疫反应。Florek等人的一项研究表明，用马赛克H5 HA免疫猕猴可以增加病毒清除，并引发能够介导ADCC活性的交叉反应抗体。最近，美国国家过敏和传染病研究所疫苗研究中心开发了一种镶嵌受体结合结构域(RBD)纳米颗粒，该纳米颗粒显示了来自H1 HA抗原的8个不同HA头域的多个副本。用这些镶嵌RBD纳米颗粒接种小鼠引起交叉反应的B细胞反应。尽管与基于CHA的疫苗相似，基于MHA的疫苗可以针对同源和异种病毒挑战提供更广泛的交叉反应保护，但这种疫苗的保护效果可能仍然有限，这取决于多剂量疫苗接种和选定的抗原亚型。因此，需要有计划的抗原选择和简化的疫苗策略进行进一步研究。2.4 COBRA HACOBRA策略应用一种计算方法来生成来自某一HA亚型的所有菌株的一致序列[57]。这种疫苗策略的主要目的是产生广泛的抗HA-Head反应，并增强HI[血凝抑制]活性。眼镜蛇HA方法已被证明是一种有效的策略，通过在小鼠、雪貂和非人类灵长类动物中诱导广泛反应的抗体，开发针对H1N1、H5N1和H3N1病毒组的流感疫苗。Carter等人报道，COBRA H1 HA抗原可以产生针对自1918年以来分离的17种人类季节性和大流行性H1N1病毒的抗头抗体。最近的一项研究表明，使用使用人和猪H1 HA序列设计的COBRA HA抗原可以保护小鼠免受猪和人来源的病毒。此外，Giles BM等人的动物研究表明，COBRA H5 HA抗原诱导的广谱抗体对25株高致病性禽流感H5N1病毒株具有HI活性。COBRA H3HA抗原已经被证明可以诱导HI抗体来保护小鼠免受一组H3N2型流感病毒的共同变异。最近，Ross等人开发了一种COBRA H3HA疫苗，方法是从2002年至2015年收集的22,144株人A(H3N2)病毒中产生一个一致的序列。与野生型HA疫苗相比，该候选疫苗显示出更高的HI活性。眼镜蛇H2 HA抗原也是使用人和禽类H2 HA序列开发的，使用这种疫苗产生了广泛交叉反应的抗体，可以对抗历史上的人H2病毒、禽类和最近在小鼠中分离的哺乳动物H2病毒。图3 马赛克HA疫苗接种方法。MHA疫苗包含一个头部结构域，其中可变的免疫优势抗原位点被外来禽类HA亚型的抗原位点取代，同时保留了头部和茎部结构域的保守区(在本例中为H1 HA)。MHA诱导的抗体对保守的抗原部位有较强的抗体反应，但对保守的保留区域只有微弱的抗体反应。然而，用来自其他外来禽类HA亚型的抗原位点增强MHA头部结构域可以增强对头部和茎结构域的抗体反应。HA的结构是使用Swiss-Model(https：//www.swissmod.expasy.org/，2021年4月5日访问)构建的。代表病毒为甲型流感病毒(A/California/07/2009(H1N1))，序列从GenBank(ACQ55359.1)获得。总体而言，COBRA HA方法是通过产生广泛反应的抗头HA抗体来预防广泛的流感病毒而开发UIV的有前景的策略之一。然而，有时产生的共识序列不能产生全功能的HA蛋白，因此它需要使用替代疫苗平台，如VLP。目前，眼镜蛇HA疫苗正处于临床前开发的后期阶段，需要进行临床试验研究，以调查其在人类身上的疫苗效果。2.5 “呼吸”HA基于HA的疫苗的最新进展是利用针对HA区域中隐藏的、保守的表位，称为“呼吸”HA策略[64]。Bangaru等人和Watanabe等人的研究表明，针对HA头部结构域界面中隐藏的、保守的表位的抗体可以提供对广谱IAV亚型的保护。例如，人类单抗fla-20识别位于220环和相邻90环的表位，这些表位通常埋藏在天然的HA三聚体中。这种抗体保护小鼠免受人类H1N1、H5N1、H3N2和H7N9病毒的亚致死和致命攻击。从灭活季节性流感疫苗免疫捐赠者的记忆B细胞中分离出的抗体(S5V2-19、H2214、S1V2-58、S8V2-17和S8V2-37)的集体广度针对HA结构域的界面上的新位点，并在小鼠中提供对第1组(H1、H2、H5和H9)和2组(H3、H7和H14)病毒的保护。然而，揭示隐藏表位的方法还需要进一步探索。据报道，HA结构域的糖基化参与了IAV的抗原漂移，使其能够逃避宿主的免疫反应。有趣的是，HA头部结构域的糖基化位点可以被修饰以暴露隐藏的保守表位，从而引导免疫反应到保守的HA结构域。以前的研究已经报道，接种高糖化HA头部结构域的小鼠表现出增强的、保守的茎结构域定向抗体，并且比接种野生型HA的小鼠具有更好的抗致命病毒攻击的保护。Lin等人的研究表明，以VLP、重组蛋白或腺病毒载体等不同剂型接种高糖化HA可诱导针对禽流感H5N1病毒的广泛中和抗体。另一项研究显示，接种CHO细胞克隆稳定表达的葡聚糖保护的HA抗原可以增加针对异源H5N1病毒的中和抗体的潜力。正如Bajic等人所报道的那样，HA结构域的高糖基化并不会抑制整体体液反应，而是会改变免疫优势模式并引发广泛的保护性抗体。综上所述，这些研究表明，高糖基化可能是一种很有前途的策略，可以在HA头部和茎结构域中发现隐藏的表位，从而促进未来新型UIV的开发。目前，流感疫苗设计中的糖基化仍在争论中。研究表明，糖基化对病毒感染性和宿主免疫反应具有重要作用。Wu等人报道，HA在N-142位的糖基化促进了H1N1流感病毒的传染性，糖位142对病毒逃避人类免疫反应是重要的。在血凝抑制试验和空斑减少中和试验中，在头部HA区域添加N-连接糖基化修饰也降低了抗体效价。因此，有必要确定流感疫苗开发所需的确切糖基。还应该进行各种研究，以更好地了解糖基化对疫苗效力的影响。3.基于NA的UIVs第二种主要糖蛋白NA通过其唾液酸酶和神经氨酸酶活性，在促进流感病毒粒子从感染细胞中释放方面发挥重要作用。NA的酶活性是奥司他韦和扎那米韦等抗病毒药物的关键靶点。与HA相似，NA也经历抗原性漂移，但速度较慢。此外，在小鼠和人类身上的研究表明，与抗HA抗体相比，抗NA抗体的衰退速度较慢。最近，流感病毒NA正在成为识别其活性部位的广泛保护性抗体的靶标。Stadlbauer等人描述了针对NA的人单抗，这种单抗可以中和甲型流感病毒，抑制神经氨酸酶活性，并在体内提供广泛的保护，防止与第1组(人N1和禽类N1、N4、N5和N8)、第2组(人N1、猪N3、禽类N2、N6、N7和N9)和B型流感病毒(B/Victoria/2/87谱系)在小鼠中的攻击。最近，Madsen等人发现，人单抗还可以中和不同的B型流感病毒(IBV)，抑制NA神经氨酸酶活性，诱导ADCC活性，并保护小鼠免受IBV攻击[82]。有了这些新的发现，NA可能是UIV的一个有吸引力的目标。在灭活疫苗中，NA的质量和数量各不相同。此外，这些疫苗可诱导约30%血清转换率的抗NA反应。先前的一项研究报告，NA特异性抗体可以通过干扰病毒出口来抑制流感病毒的复制。此外，针对保守NA表位的单抗还可以诱导ADCC活性，有助于保护小鼠免受B型流感病毒感染。Doyle等人报道，针对IAV保守NA序列的mAb在受到致命剂量H1N1和H3N2病毒攻击的小鼠中提供了异型保护。最近，接种重组B型流感病毒NA的豚鼠表现出病毒滴度降低，抗NA抗体水平高，病毒传播率下降。此外，已经证明一些H3N2病毒使用NA而不是HA来进行细胞附着，这表明NA抗体可能有助于阻止病毒附着。需要进一步的研究来解决这一假设。尽管NA有很多好处，但作为疫苗开发的靶点，它经常被忽视，并且由于标准化问题而没有被批准为有效的疫苗抗原，包括不适合量化NA含量的方法，以及缺乏简单的NA抗体测定方法。值得注意的是，疫苗中NA的含量可能与抗NA抗体反应相关，尽管疫苗中免疫优势HA头域的存在可能导致NA成为免疫亚优势。增加疫苗中NA的含量，同时改进NA定量方法，有助于提高抗NA免疫力。此外，储存的疫苗批次中的神经氨酸酶活性随着时间的推移而下降，这取决于所使用的菌株；因此，需要特定的储存条件来保持其活性。据我们所知，到目前为止还没有开展甲型流感疫苗的临床试验；因此，疫苗的开发变得更具挑战性，需要做出更多努力才能使其可用。应进行甲型流感疫苗的临床试验和观察性研究，以评估其在人类身上的疫苗效果。4.基于M2e的UIVS基质蛋白2(M 2)是一种跨膜蛋白，可分为细胞外N末端结构域(M2e)、跨膜结构域和细胞内C末端结构域。M2蛋白对于甲型流感病毒的适合性是必不可少的，对于病毒进入后内体的脱壳过程也是至关重要的。由于M2e高度保守，它是UIV的潜在靶点。然而，与HA和NA相比，M2e较小，免疫原性较低，导致单独给药时免疫反应较低。为了解决这个问题，研究人员试图通过加入载体蛋白、使用纳米颗粒制剂、呈现在VLP上(包括其他流感蛋白)或添加佐剂来增加M2E的免疫原性。目前认为抗M2e单抗不能中和病毒，但抗M2e单抗可与感染细胞表达的M2e蛋白结合，通过抑制病毒萌发减少病毒复制。其他提供保护的机制包括抗M2e抗体介导的细胞杀伤，通过补体依赖的细胞溶解、ADCC和/或抗体依赖的细胞吞噬作用来消除流感病毒感染的细胞。M2E特异性T细胞也可以介导对流感感染的保护。在动物模型中，基于M2e的多种疫苗配方对不同的流感病毒株显示出交叉保护作用。在小鼠中，显示在重组大肠杆菌来源的外膜囊泡上的M2e疫苗可以诱导抗M2e免疫以控制甲型流感病毒的复制，并对H1N1和H3N2的致命攻击提供100%的保护。含有来自人、猪和禽类IAV的M2e序列串联重复的VLP疫苗诱导细胞(巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和CD11b+树突状细胞)募集，并在感染部位产生炎性细胞因子和趋化因子，提供对H1N1、H3N2和H5N1 IAV亚型的保护。研究表明，含有M2e序列串联重复序列的融合蛋白与分枝杆菌HSP70佐剂片段的N端融合，可增强体液和细胞免疫，减少病毒脱落，保护小鼠免受H1N1、H3N2和H9N2病毒的攻击，并保护小鼠免受H9N2病毒的攻击。一种由乳酸乳球菌表面表达的M2e组成的活细菌疫苗降低了病毒负担，并延长了接种H5N2病毒攻击后的鸡的生存时间。此外，接种了不同M2e表位的鸡对H5N1表现出保护作用。虽然关于M2e疫苗在雪貂中的效力的研究很少，但M2e与携带者结合的免疫增加了抗M2e抗体，并减少了H1N1病毒攻击后雪貂肺内的病毒脱落。此外，最近发现，在大流行H1N1病毒攻击雪貂后，显示在大肠杆菌来源的外膜囊泡上的M2e疫苗可以降低肺病毒滴度。在人类中，M2e串联重复序列与乙肝核心蛋白(NCT00819013)融合的I期临床试验显示，尽管抗体效价随着时间的推移而下降，但可以诱导抗M2e抗体。重组M2e鞭毛蛋白流感疫苗(STF2.4xM2e或VAX102)已被证明是安全的，并在健康成年人(18-49岁)中诱导高水平的抗M2e抗体[114]；然而，该候选疫苗已不再处于开发阶段。另一项研究表明，在H3N2病毒攻击24小时后，静脉注射抗M2e单抗(TCN-032)(NCT01719874)的健康志愿者与安慰剂组相比，症状评分和病毒复制都有所降低。除了使用M2e作为疫苗抗原的研究外，FluGen Inc.(美国)还开发了一种缺乏M2基因的减毒单复制活病毒疫苗(表1)。该疫苗在健康成人(NCT03999554，NCT02822105，NCT03553940，Clinicaltrials.gov)中进行了安全性和免疫原性调查，目前正在50-85岁的成年人(NCT04785794，Clinicaltrials.gov)中进行调查。尽管基于M2e的疫苗显示出一些有希望的结果，但还没有实现商业化。因此，仍然需要对基于M2e的疫苗的有效性进行更广泛的临床研究，以提供证据证明这些疫苗可以保护人类免受不同流感病毒的侵袭。以M2E为基础的疫苗有一些局限性。抗M2e抗体可以预防A型流感病毒，但不能预防B型流感病毒，因为IBV中的M2蛋白结构不同。此外，由于免疫原性低，M2e可能不是一种独立的、通用的疫苗，但可能需要与携带者一起接种或其他疫苗，如季节性疫苗。此外，已有研究表明，融合到载体蛋白上的M2e可以诱导针对载体蛋白的免疫反应，当高剂量给予人类时，这可能会引起意想不到的副作用，如局部和全身不良反应。此外，对人类的临床试验表明，抗体滴度随着时间的推移而下降，这表明M2e应该与其他甲型流感抗原或佐剂一起使用，以实现可持续的免疫反应。5.基于内部蛋白的UIVs流感病毒的内部蛋白，如基质蛋白1(M1)和核蛋白(NP)是高度保守的。与在感染细胞表面表达的HA、NA和M2e不同，M1和NP在感染细胞内产生，由主要的组织相容性复合体分子加工和呈递，用于T细胞识别。因此，靶向内部蛋白也是一种有希望的策略，通过增强T细胞的交叉反应来改进当前的流感疫苗。在小鼠中，用壳聚糖佐剂对大肠杆菌表达的M1蛋白进行鼻腔免疫，分别对异源H1N1和H5N1病毒提供了70%和30%的保护。Liu等人发现，接种含有M1的DNA疫苗并用来自禽类H9N2的重组M1蛋白加强免疫的小鼠，可诱导体液和细胞免疫反应，并对同源病毒感染提供完全保护，对异型H1N1病毒感染提供部分保护。此外，几十年前，基于NP的DNA疫苗在动物模型中被证明对同源和异种流感病毒都具有保护作用。近年来，基于NP的mRNA疫苗已成为一种有吸引力的方法。用编码NP的信使核糖核酸疫苗在小鼠中诱导对流感病毒的跨株免疫。此外，通过将人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的蛋白转导结构域TAT-NP整合到NP中而产生的重组蛋白TAT-NP，增强了细胞免疫反应，并增强了对同源PR8、异亚型H9N2和H3N2IAV在小鼠中的保护效力。坎波等人。证明用重组NP疫苗OVX836免疫的小鼠表现出对H1N1和H3N2IAV的T细胞反应和保护效力。用第二代脂质佐剂稳定乳剂(SLA-SE)佐剂的NP免疫老龄小鼠，在PR8病毒致死攻击后，病毒清除和存活率都有所提高。将NP+M1+热休克蛋白60与水包油佐剂混合接种，可诱导强大的体液、粘膜和细胞免疫反应，抑制肺部病毒复制，并完全保护小鼠免受H7N9攻击。另一项研究表明，编码NP和M1的改良痘苗病毒安卡拉病毒载体(MVA−NP+M1)可作为佐剂增强小鼠、鸡和猪的抗体和T细胞反应。MVA−NP+M1候选疫苗自2011年以来已在多个临床试验中进行了测试(表1)。接种MVA−NP+M1的志愿者表现出流感症状和病毒脱落时间的减少。另一项临床试验表明，MVA−NP+M1在人类中是安全的，并诱导抗原特异性T细胞反应。该疫苗的安全性和免疫原性也在50岁以上的成年人中得到证实，其增强记忆T细胞和诱导多功能细胞因子的能力。此外，这种疫苗与季节性流感疫苗的结合被证明能增加50-85岁成年人的流感病毒特异性抗体反应和记忆T细胞。MVA-NP+M1疫苗正处于IIb期临床试验(NCT03880474)，以调查其对18岁及以上成年人的疗效。然而，这项试验因无效而被停止(2021年4月26日更新，Clinicaltrials.gov)。用一种新的重组猿腺病毒ChAdOx1NP+M1接种也被发现诱导T细胞免疫原性增加，(表1)。基于NP寡聚体的候选疫苗OVX836也在I期临床试验中进行了测试(NCT04192500和NCT03594890，Clinicaltrials.com，于2021年3月28日访问)，尽管结果尚未报告(表1)。尽管基于内部蛋白的流感疫苗在诱导T细胞免疫反应和交叉保护方面显示出良好的结果，但基于内部蛋白的疫苗诱导的抗体反应较弱，这是阻断流感病毒感染所必需的。此外，开发基于内部蛋白的T细胞疫苗的一个主要挑战是负责抗原肽结合和T细胞呈递的人类白细胞抗原单倍型的多样性。因此，为了生产有效的内部蛋白质疫苗，为所有具有不同人类白细胞抗原多样性的个体提供足够的覆盖，有必要在种族背景下进一步评估反应[134]。6.基于多种蛋白/多肽的UIVs考虑到不同基于蛋白质的疫苗的潜力，包含多个蛋白质或表位多肽的疫苗具有增强广泛交叉反应抗体和T细胞反应的潜力。这一疫苗策略已经用许多不同的疫苗平台和蛋白质组合进行了研究。表达NP和M1的病毒载体疫苗(ChAdOx1 NP+M1)和CHA疫苗的组合免疫诱导了针对分歧组2 IAV的HA、NP和M1的抗体反应，增强了T细胞对NP和M1的反应，并保护小鼠免受H3N2病毒的攻击。Park等人报道了一种表达M2和CHA的重组减毒H3N2型病毒，该病毒可以保护小鼠免受广泛的IAV感染，包括H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2。此外，含有保守的HA、M2e和NP蛋白的嵌合亚单位疫苗被证明可以保护小鼠免受同源和异种IAV的攻击。此外，用含有M2e和HA的双层蛋白纳米粒免疫的小鼠可以免受H1N1、H3N1、H5N1和H7N9病毒的攻击。此外，重组乳酸乳球菌表达的M1-HA2融合蛋白在鸡身上对H9N2病毒具有粘膜保护作用。使用这一策略开发的候选疫苗也在许多临床试验中进行了测试。多聚体-001(M-001)由以色列BiondVax制药有限公司开发，是一种基于多肽的疫苗，包含HA、M1和NP蛋白的B和T细胞表位。事实上，M-001已经在七个临床试验中进行了评估，结果令人振奋(表1)。M-001(NCT03450915)的II期试验表明，独立的M-001是HA疫苗的引爆剂，并提高了老年人的HI效价。此外，M-001可用作增强对三价流感疫苗的HI反应的引发剂，也可用作H5N1 IAV的引发剂或单独的疫苗。值得注意的是，在第三阶段临床试验中，M-001作为一种独立的尿路感染药物在50岁的成年人≥中也进行了安全性和临床疗效的评估。FP-01.1由免疫靶向系统有限公司(英国)开发，是一种以合成肽为基础的疫苗，含有6个来自甲型流感病毒NP、M和聚合酶碱性1和2蛋白的多肽(表1)。该疫苗在4个I期临床试验中进行了测试，显示出良好的安全性和耐受性。然而，FP-01.1已经不再处于开发阶段。Flu-v是由PepTcell(SEEK，英国)开发的由NP、M1和M2蛋白组成的合成肽疫苗(表1)。流感病毒已经在四个I期和II期临床试验中得到了彻底的研究。第一阶段研究的结果表明，Flu-v可以刺激细胞免疫，并减少症状和病毒脱落。临床第二阶段研究的结果表明，Flu-v减少了病毒的脱落和临床流感症状，并诱导了长期的细胞免疫。不过，这种疫苗的效力还有待进一步探索。总体而言，基于多种蛋白质/多肽的疫苗方法是通过多种蛋白质或多肽组合来开发UIVs的有前景的策略之一，但仍然存在局限性，如靶蛋白在亚型之间的序列差异。因此，应在设计的候选疫苗中筛选靶蛋白序列，以提供对不同毒株的广泛保护。还应选择好免疫优势区域，以获得最适合疫苗构建的表位。7.流感疫苗佐剂提高流感疫苗效力的一种方法是加入佐剂。三种主要佐剂，铝盐(明矾)、MF59和AS03，被纳入获得许可的流感疫苗。自20世纪20年代以来，明矾在美国和欧洲被广泛用于疫苗。先前的研究表明，明矾通过仓库效应、NLRF3炎症激活、CD4+T细胞的刺激和分化、树突状细胞膜的扰动和补体激活等机制刺激Th2偏向反应。众所周知，明矾能激发强大的体液免疫反应；然而，它只能最低限度地诱导ADCC。此外，明矾只能微弱地引起细胞免疫反应。MF59于1997年在意大利获得许可，被开发为老年人流感疫苗接种的佐剂。获得许可的流感疫苗，包括Focetria、Celtura和Fluad以及季节性流感疫苗，都包括MF59。研究表明，MF59显著增强了抗原特异性抗体的产生，并增强了Th1和Th2偏向的反应。然而，MF59可引起注射部位的疼痛、反应性，并可诱发炎症性关节炎。AS03佐剂已用于获得许可的疫苗Pandemrix、Arepanrix、Prepanrix和Q-PanH5N1。以往的研究表明，AS03可诱导注射肌肉和引流淋巴结产生炎性细胞因子和趋化因子，并促进单核细胞和树突状细胞向引流淋巴结的迁移。此外，AS03的包含会导致持续产生中和抗体和高频率的记忆B细胞。然而，研究报告称，AS03佐剂疫苗在接种后可能会导致睡眠障碍和发作性睡病。此外，已经测试了几种策略，例如使用Toll样受体激动剂或不同的佐剂组合，以克服常见佐剂的局限性。综上所述，每种佐剂都有独特的优点和缺点。因此，流感疫苗佐剂的选择对于提高疫苗抗原的免疫原性和提高疫苗效力至关重要。然而，需要更安全和更有效的佐剂来有效地改善针对疫苗抗原的体液和细胞免疫反应。8.总结流感大流行的持续威胁显著表明，有必要开发具有比现行流感疫苗更广泛和更强的保护效力的新型UIV，以抵御季节性和潜在的大流行毒株。然而，尽管作出了不断的努力，目前仍没有商用UIV可用。虽然各种流感抗原正在为UIV的开发进行测试，但不同的疫苗抗原有独特的优点和缺点。以HA为基础的疫苗主要诱导抗体应答，无头和嵌合HA疫苗主要针对保守的HA干区，而嵌合疫苗则同时针对头部和保守的HA区域。此外，计算优化的广谱反应抗原(COBRA)策略产生了一致的序列，允许激发针对不同病毒株的广谱反应抗体。针对隐藏的HA区域的呼吸性HA方法也显示出希望。目前的季节性流感疫苗使用NA和HA作为抗原。尽管基于NA的疫苗已显示出诱导免疫反应的作用，但由于其局限性，如标准化问题，NA目前在流感疫苗开发中作为抗原靶标被忽视。应对基于NA的流感疫苗进行进一步研究，以证明NA作为流感疫苗抗原的重要作用。此外，应该开发先进的技术来量化NA的绝对量，准确地测量NA抗体的反应，并在储存期间保持NA疫苗的神经氨酸酶活性。虽然M2e是一种保守的流感病毒蛋白，很有希望成为UIV的靶标，但它的免疫原性很低。因此，为了诱导强大的免疫反应，它应该与其他病毒蛋白或佐剂一起使用。此外，基于内部蛋白的疫苗主要诱导T细胞反应，促进流感感染细胞的杀伤，是利用多种蛋白质或多肽组合开发UIV的有前景的策略之一，但这些疫苗诱导的抗体反应较弱，应适当选择其中的免疫优势区域，以获得最合适的疫苗构建表位。由于具有增强疫苗免疫原性的能力，佐剂已被广泛应用于各种流感疫苗的研究中。使用合适的佐剂，如铝基佐剂、水包油佐剂如MF59、佐剂系统03、(AS03)或以Toll样受体(TLR)为基础的佐剂(如针对TLR4的佐剂)，或不同佐剂的组合，也有助于提高抗原免疫原性和疫苗效力。最后，针对以抗体为基础的传统疫苗的UIV将需要进行大规模的临床前和临床比较研究，以及用于商业UIV生产的疫苗生产和递送方案的标准化。参考资料：Nguyen QT, Choi YK. Targeting Antigens for Universal Influenza Vaccine Development. Viruses. 2021 May 24;13(6):973. doi: 10.3390/v13060973. PMID: 34073996; PMCID: PMC8225176.为推动我国生物制品全生命周期质量管理体系的建立，进一步提升生物制品的安全性和有效性，“2023生物制品全生命周期质量管理峰会”将于2023年9月22-23日在上海举办，主题为“质量为先、精益求精”。组委会将力邀知名制药企业质量专家、行业协会和监管部门领导、学术专家做精彩报告。将重点围绕抗体、ADC药物、疫苗、细胞和基因治疗药物、重组蛋白药物等领域的质量管理策略及要点进行探讨。会议内容时间：2023年9月22-23日（周五-周六）地点：上海（酒店定向通知）指导单位：上海市医药质量协会主办单位：四叶草会展、生物制品圈协办单位：奥星集团会议费用：为药企质量专家提供参会福利，报名FREE!（仅收取50元定金，含茶歇、会议资料等，定金概不退还）（如需用餐，2天午餐加收150元），先到先得，报完即止！请提前锁定！报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：大多数疫苗都是通过肌肉接种。皮肤含有大量的抗原提呈细胞，被认为是疫苗接种更具免疫原性的部位。皮内接种已被批准用于提高流感疫苗的效力和节省流感疫苗剂量。为了应对最近暴发的猴痘疫情，皮内接种也被批准通过延长有限的猴痘疫苗剂量，以免疫更多有风险的人。疫苗佐剂的加入有望进一步提高皮内接种效力，节省更多疫苗剂量。然而，与肌肉接种相比，皮内接种与更显著的局部反应有关。因此，适合于皮内接种的佐剂应具有良好的局部安全性，而不会引起明显的局部反应。本文介绍了目前已批准用于人类疫苗中的佐剂及其皮内给药的相对反应原性、具有良好局部安全性可用于皮内接种的新型化学和物理佐剂，同时对开发物理佐剂的合理性、物理佐剂的类型以及物理佐剂用于皮内接种的独特优势也进行了介绍。1.皮肤结构皮肤覆盖全身，具有重要的生理功能，如防止热量和水分流失，防止环境病原体感染。皮肤可分为3层：角质层(SC)、表皮层和真皮层。SC层位于皮肤的最外层，由角质细胞组成，是终末分化的角质细胞，并且具有高度的亲脂性。SC层承担皮肤的主要屏障作用。表皮位于SC层之下，主要由角质细胞（90%）组成，中间散布着朗格汉斯细胞（LC，3-5%），作为免疫哨兵）。表皮层还含有黑色素细胞，可根据其密度和黑色素含量赋予皮肤特殊的颜色。表皮层下面是真皮层，它比SC层和表皮层包含更多的解剖结构。真皮层中含有汗腺和毛囊，以及血液和淋巴管网和神经纤维。真皮层还包含多种类型的细胞，包括成纤维细胞和先天性免疫细胞，如树突状细胞（DC）、巨噬细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞。有趣的是，皮肤还含有大量的T淋巴细胞，其中大部分是表皮和真皮层中皮肤驻留记忆T细胞。皮肤先天性免疫细胞是抵御病原体感染的第一道防线，也有助于诱导病原体或疫苗特异的适应性免疫应答。图1显示了带有常驻天然免疫细胞的简化皮肤模型。图1.皮肤结构和固有免疫细胞的图解：皮肤包含3个主要层：角质层、表皮和真皮。表皮含有朗格汉斯细胞，真皮含有树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞为主的天然免疫细胞。2.皮内疫苗接种及其好处由于肌肉注射的便利性，仅需要简单培训即能操作，因此大多数疫苗都是通过肌肉接种进行免疫。过去20-30年的大量研究发现，将疫苗接种途径从肌肉途径改为皮内途径可以诱导更有效的免疫反应。免疫原性更强的皮内接种在很大程度上可以归因于皮肤而不是肌肉中存在丰富的抗原提呈细胞，如表皮LC和真皮DC。抗原提呈细胞(主要是真皮DC)负责真皮内疫苗抗原在主要组织相容性复合体(MHC)I或II分子上的摄取和递呈，然后迁移到引流淋巴结，引发抗原特异性T和B细胞应答。皮内接种疫苗还可以激活局部先天性免疫细胞来分泌细胞因子和趋化因子，并招募循环中的先天免疫细胞，从而促进疫苗引起的局部反应。皮内接种有望能提高疫苗功效并节省疫苗剂量。最近的一项综述研究发现，在老年人中，皮内递送流感疫苗通常比肌内或皮下注射更具免疫原性。另外，在年轻人中，皮内接种低剂量流感疫苗（6或9µg）与肌肉注射全剂量疫苗（15µg）引起的免疫反应相当。除了流感疫苗外，皮内接种也能有效增强其他疫苗诱导的免疫反应，例如狂犬病疫苗和乙型肝炎疫苗。由于近期猴痘疫情暴发以及猴痘疫苗短缺，美国食品和药物管理局(FDA)授权皮内接种猴痘疫苗，以扩大疫苗剂量，让更多高危人群获得免疫接种。3.皮内接种的局限性皮内接种虽然提高了疫苗的免疫原性，但提高的程度相对较弱。皮内接种只能节省40-60%的流感疫苗剂量。在老年人中，皮内接种仅能将H1N1株的血清转换率从40%提高到52.3%，将H3N2株的血清转换率从49.1%提高到61.3%，将B型株的血清转换率从56.4%提高到61.3%。另一项研究也发现了类似的结果，即通过皮内接种流感疫苗，老年人的血清转换率仅略有增加。疫苗佐剂的加入有望进一步提高疫苗效力并节省更多的疫苗剂量。然而，添加佐剂的皮内疫苗面临着诱发严重局部反应的风险。研究一致发现，与肌肉接种疫苗相比，不含佐剂的皮内接种疫苗会诱发更频繁、更严重的局部不良反应。皮肤中存在的各种类型的先天性免疫细胞（如LCs、DCs、巨噬细胞）可以解释这种情况。这些细胞有助于增加抗原摄取和更有效的适应性免疫，同时通过合成和释放细胞因子和趋化因子以及招募外周中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞而引起局部不良反应。因此，用于皮内接种的佐剂需要比用于肌肉注射的佐剂具有更好的局部安全性。本综述侧重于介绍用于预防传染病疫苗的皮内接种佐剂，尽管这种途径对其他疾病（例如过敏和恶性肿瘤）的疫苗接种也很有吸引力。本综述还重点介绍佐剂如何增强皮内蛋白和亚单位疫苗诱导的免疫反应。此外，具有佐剂效应的疫苗/佐剂制剂（如聚合物纳米颗粒、脂质体）（至少有一部分是由二者联合引起的），不包括在本综述中。4.已获批准的佐剂及其皮内反应原性疫苗佐剂在开发新型疫苗和改良疫苗方面发挥着关键作用，因此在21世纪受到越来越多的关注。美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）于2008年启动了"佐剂开发计划"，以支持新型佐剂的筛选、鉴定和临床前/临床开发。随着对这一领域的兴趣和投资不断增加，在过去二十年中，有五种佐剂被批准用于人类，而在过去八十年中，只有两种佐剂被批准用于人类（表1）。有趣的是，所有这些佐剂都被批准用于肌肉接种。如果没有皮内反应原性数据，则根据其肌肉注射后的局部不良反应来预测其皮内给药后诱发局部不良反应的可能。局部不良反应可能是皮肤红斑、肿胀、变色或组织学变化，如组织坏死或细胞死亡，或局部炎症反应，或细胞因子和趋化因子释放及免疫细胞浸润等。表1.目前批准的佐剂及其皮内反应原性l明矾佐剂明矾佐剂是一种铝盐类佐剂。临床上明矾佐剂主要以氢氧化铝为基础，由于纤维状纳米颗粒（图2A）或磷酸铝形成板状纳米颗粒的聚集而形成广泛的微米结构（0.5-10微米）。明矾佐剂是全球使用最广泛的佐剂，它已被用于多种儿童疫苗，如百白破（破伤风、白喉和百日咳）、乙型肝炎、乙型流感嗜血杆菌疫苗，明矾佐剂主要增强Th2细胞的抗体反应，但诱导细胞介导免疫反应的能力较弱。将明矾佐剂注射到肌肉组织中会引起明显的组织应激和细胞死亡。腹膜内注射明矾佐剂后也能观察到类似的现象。肌内注射明矾佐剂会诱导细胞因子/趋化因子的大量释放并快速募集中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。研究发现，在小鼠皮肤中皮内注射Imject（一种实验性明矾佐剂）可诱导高密度炎症细胞浸润，并持续至少四天。由于明矾佐剂会诱发严重的组织应激和炎症，因此在皮内注射后很有可能诱发严重的局部反应。lAS04佐剂AS04佐剂是通过将MPL（3-O-去酰基-4'-单磷酰脂质A）吸附在氢氧化铝佐剂上制备的组合佐剂（图2B）。MPL是一种Toll样受体(TLR)4激动剂。MPL/TLR4结合激活骨髓分化初级反应88(MyD88)和下游信号通路，导致核因子-κB(NFκB)和激活蛋白(AP)-1激活以及促炎细胞因子基因表达。AS04被批准用于增强人乳头瘤病毒疫苗的效力。研究发现，与明矾佐剂疫苗相比，AS04佐剂疫苗可在局部注射部位诱导更高水平的细胞因子和趋化因子，并在引流淋巴结中募集更多数量的单核细胞和DC。研究发现，与不含佐剂的疫苗相比，含有AS04佐剂的疫苗会引起更频繁的局部反应，例如疼痛、发红和肿胀。局部不良反应可在几天内消失。研究发现AS04佐剂可诱导更平衡的辅助性T细胞1(Th1)/Th2免疫反应。我们之前的研究发现。皮内注射MPL/明矾佐剂会引起皮肤真皮组织红斑和肿胀，并伴有大量炎症细胞浸润。这些数据表明AS04佐剂在皮内递送后诱发严重局部反应的风险很高。lAS01佐剂AS01是一种含有MPL和QS21的脂质体制剂，QS21是从肥皂树（Quillajasaponaria）中纯化的皂苷成分（图2C）。AS01佐剂已被批准用于提高疟疾RTS,S疫苗的功效。研究发现AS01佐剂可诱导Th1为主的免疫反应，而对Th2反应的诱导较弱。研究发现肌肉注射AS01佐剂被快速清除，3h时AS01水平显著降低，24h后几乎检测不到AS01水平。AS01诱导细胞因子的短暂表达，该表达在24h内达到峰值，然后迅速消退。AS01还诱导中性粒细胞和单核细胞迅速聚集到注射佐剂的肌肉中。考虑到AS01含有MPL，预计局部细胞因子和趋化因子的刺激至少部分是由TLR4和下游MyD88信号通路的刺激引起的。研究发现MPL和QS21能协同激活驻留淋巴结的自然杀伤细胞(NK)和CD8+T细胞并促进早期干扰素(IFN)γ产生，该细胞通过白细胞介素(IL)-18分泌通过荚膜下的巨噬细胞控制白细胞介素(IL)-18分泌，并得到IL-12支持。MPL和QS21的协同作用以及对局部炎症的强烈诱导表明，AS01佐剂在皮内给药后诱发显著局部反应的风险很高。这种作用由巨噬细胞通过白细胞介素（IL）-18的分泌来控制，并得到IL-12的支持。MPL和QS21的协同作用以及对局部炎症的强烈诱导表明，AS01佐剂在皮内给药后诱发显著局部反应的风险很高。lMF59和AS03佐剂MF59和AS03是基于角鲨烯水包油型纳米乳液佐剂。角鲨烯是一种天然三萜油，作为动物和人类胆固醇合成过程中的一种生化中间体。角鲨烯的可生物降解性使其成为佐剂配方中的安全成分。MF59和AS03分别由Novartis和GlaxoSmithKline（GSK）开发，化学成分略有不同（图2D）。MF59的主要油相成分是角鲨烯，而AS03的油相中含有角鲨烯和α-生育酚（维生素E）。α-生育酚还具有可生物降解性和免疫调节功能。关于表面活性剂，MF59含有两种表面活性剂（Tween80和Span85），而AS03仅含有聚山梨醇酯80（Tween80）。MF59最初被批准用于提高欧洲老年人接种季节性流感疫苗功效。MF59最近在美国被批准用于增强老年人季节性流感疫苗（FluadQuadrivalent）的效力以及大流行前H5N1疫苗（Audenz）的效力。AS03最初被批准用于增强欧洲2009年甲型H1N1流感大流行期间的2009年甲型H1N1大流行流感疫苗(Pandemrix)效力，后来被批准用于增强美国大流行前H5N1疫苗的效力。研究发现MF59和AS03佐剂可诱导偏向Th2的免疫反应，而对Th1反应的诱导较弱。肌内注射MF59佐剂会诱导组织应激和细胞死亡。此外，MF59的清除不依赖于抗原，在肌肉中的清除半衰期为42h。研究发现，尽管时间招募模式相同，但发现肌内注射MF59比肌内注射明矾更能有力地募集中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。与肌内注射后的明矾佐剂相比，肌肉注射MF59佐剂可诱导多种细胞因子和趋化因子释放模式。皮内注射MF59样AddaVax佐剂可强烈诱导中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞，注射后4d，中性粒细胞和单核细胞水平显著升高。皮内注射AddaVax佐剂还可诱导各种细胞因子和趋化因子的延长表达至少4d。这些数据表明MF59佐剂在皮内递送后诱发严重局部反应的风险很高。研究发现，肌内注射AS03佐剂可持续诱导至少7d的细胞因子表达（例如C-C基序趋化因子配体2(CCL2)、IL-1β）。AS03比明矾佐剂诱导更强的细胞因子表达。AS03佐剂中的α-生育酚可通过激活巨噬细胞和单核细胞显著增加细胞因子的表达,AS03佐剂可诱导脂质代谢快速且短暂的下调，导致细胞内脂质水平升高，诱导内质网(ER)应激并激活未折叠蛋白反应途径。此外，消耗髓系细胞中ER应激激酶传感器肌醇需要的跨膜激酶内切核糖核酸酶-1α(IRE1α)会减少AS03佐剂诱导的细胞因子表达和高亲和力抗体的诱导。局部炎性细胞因子和趋化因子以及ER应激的强烈诱导表明AS03佐剂也可能在皮内递送后诱导显著的局部反应。lMatrix-M佐剂Matrix-M佐剂由两种独特的40nm颗粒配方制成，来自皂苷提取物的两种组分（组分A和C）（图2E），并已被纳入最近批准的基于蛋白质的Novavax新冠疫苗（NVX-CoV2373），用于新型冠状病毒肺炎大流行期间的紧急使用。每种纳米颗粒制剂均由皂苷A或C部分以及胆固醇和磷脂制成。Matrix-M佐剂被发现可诱导偏向Th1的免疫反应。研究发现，含有Matrix-M佐剂的新冠疫苗与无效对照剂相比更容易引起局部反应（第一剂：57.6% vs 17.9%；第二剂：79.6% vs 16.4%）。大多数局部不良反应为轻度或中度，并在3天内消失。Matrix-M佐剂可刺激猪单核细胞和淋巴细胞表达IL-1β和C-X-C基序趋化因子配体8(CXCL8)，但不表达肿瘤坏死因子α(TNFα)或IL-6。猪体内肌肉注射Matrix-M佐剂可诱发以中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞浸润为特征的急性炎症。局部不良反应还包括大多数猪的出血和部分猪的坏死。Matrix-M佐剂组比生理盐水对照组出现发红的频率更高。与对照相比，Matrix-M佐剂显着增加了384个基因表达并降低了162个基因表达。al,2012).在上调最多的基因中，23个中有10个与干扰素调节基因(IRGs)有关。尽管迄今为止还没有研究探索Matrix-M在促进皮内疫苗接种方面的有效性和安全性，但一项研究发现在猪模型中皮内给药脂质体中的QS-2（另一种基于皂素的佐剂）会剂量依赖性地诱发局部不良反应，如红斑、肿块和结痂。人类受试者肌肉注射免疫后出现较频繁的局部不良反应，至少一些猪出现强烈的局部炎症反应、出血和坏死，以及与之密切相关的QS-21佐剂皮内递送后诱发局部不良反应的剂量依赖性，都表明Matrix-M佐剂皮内递送后诱发严重局部反应的风险很高。lCpG 1018CpG 1018是一个未甲基化的含CpG基序的寡核苷酸。CpG 1018可激活TLR9和MyD88信号通路，从而激活各种转录因子，如NFκB、AP-1和干扰素调节因子（IRF），并控制细胞因子的表达，如TNFα、IL-1β、I型干扰素和IL-12。CpG1018刺激偏向Th1的抗体反应和细胞介导的免疫反应。CpG 1018已被纳入最近批准的乙肝疫苗。添加CpG 1018佐剂的乙肝疫苗被发现比添加明胶佐剂的乙肝疫苗诱导更有效的免疫反应。与物种特异性CpG寡核苷酸不同，CpG 1018在啮齿动物、非人类灵长类动物和人类中具有广泛的响应，从而在临床前和临床研究中不需要改变CpG序列。研究发现皮内注射小鼠特异性CpG只会诱发轻微的局部反应和低水平的免疫细胞招募。CpG 1018预计具有较低的皮内反应原性，有望安全地促进皮内疫苗接种。 图2.目前批准的颗粒状佐剂:A.氢氧化铝佐剂。B.AS04佐剂是由MPL吸附在氢氧化铝助剂上制备的。C.用脂质体包裹MPL和QS21制备AS01佐剂。D.角鲨烯纳米乳剂MF59和AS03佐剂。E.由两种皂素提取物(组分A和C)制成的两种纳米颗粒制剂组成的Matrix-M佐剂总之，大多数已批准的佐剂在皮内给药后诱发严重局部反应的风险很高。有趣的是，预测皮内反应原性较高的化学佐剂本质上都是自然界中微粒（表1），它们会强烈激活局部先天性免疫系统并诱发明显的局部反应。CpG1018可能是个例外，因为它能诱导轻微炎症，而不会引起明显的局部反应（图3A）。图3.皮内接种安全佐剂的化学结构A.CpG 1018。DNA骨架进行硫代修饰以提高佐剂的稳定性。B.具有六个14碳侧链的合成GLA。C.咪喹莫特。D.Poly(I：C)。E.cGAMP。F.PCPP聚合物。5.用于安全皮内接种的其他化学佐剂由于担心已获批准的佐剂具有较高的局部反应原性，人们还探索了其他化学佐剂的安全性和有效性，以促进皮内疫苗接种。其中几种佐剂已进入临床试验阶段。由于疫苗佐剂在皮内给药后有可能诱发明显的局部反应，因此本综述不包括未报告局部安全性数据的佐剂。lGLA-AF佐剂几种已获批准的佐剂，如AS01和AS04，都含有MPL作为提升疫苗接种效果的主要成分。虽然MPL还没有被批准作为一种独立的佐剂，但我们在小鼠模型中发现MPL皮内注射引起了轻微的炎症，没有明显的局部不良反应。Carter等人评价了一种合成的TLR4激动剂(GLA-AF)(图3B)以促进雪貂和人类皮内接种H5N1疫苗，并发现GLA-AF对于皮内接种H5N1疫苗在雪貂中诱导单针保护和在人类中诱导血清保护至关重要。此外，在人类临床研究中，加入GAL-AF的H5N1疫苗没有在豚鼠体内引起体温上升或体重下降，并没有引起一过性红斑和其他明显的不良反应。这项研究表明GLA-AF和其他可能的TLR4激动剂用于皮内接种的有效性和安全性。l外用咪喹莫特佐剂FDA批准外用咪喹莫特乳膏(5%阿尔达拉)用于治疗各种疾病，如光化性角化病、浅表性基底细胞癌和外生殖器疣。咪喹莫特是一种TLR7激动剂(图3C)并激活TLR7-MyD88信号通路，导致NFκB和IRF7的激活以及促炎细胞因子和I型干扰素基因的表达。有趣的是，外用咪喹莫特乳膏的载体也可能有助于观察到的疗效，因为在没有咪喹莫特的情况下，诱导激活炎症小体、角质细胞死亡和IL-1释放。在一项双盲、随机对照的临床试验中，在皮内接种流感疫苗前局部应用咪喹莫特乳膏可以获得更高的疫苗病毒株血清转换率和更好的非疫苗病毒株血清转换率。最常见的局部不良反应是1级红肿，尽管与其他组没有统计学差异，但局部应用咪喹莫特组红肿发生率更高。在炎症性肠病(IBD)患者中，外用咪喹莫特乳膏后皮下注射乙型肝炎疫苗的血清保护率明显高于外用水乳膏后肌肉注射疫苗的血清保护率。虽然局部咪喹莫特组引起更频繁的瘙痒和肿胀，但各组之间的局部不良反应无明显差异。这些结果表明，外用咪喹莫特乳膏可显著提高皮内疫苗的疗效，且总体上具有良好的局部安全性。lPoly(I:C)佐剂聚肌胞苷酸(Poly(I:C))是双链RNA(dsRNA，图3D)的合成类似物，可根据位置激活两种不同的信号通路。内质多聚体(I:C)激活TLR3并诱导IL-12和I型IFN产生，而胞质多聚体(I:C)可激活视黄酸诱导基因I(RIG-I)和黑色素瘤分化相关蛋白5(MDA-5）并增强I型干扰素的产生。Poly(I:C)还用于皮内或透皮疫苗接种，以诱导针对各种类型传染病的有效免疫反应。Weldon等人发现，当在小鼠模型中将Poly(I:C)佐剂亚单位流感疫苗涂覆在微针表面时，可引发与单独的亚单位疫苗类似的免疫反应和保护佐剂效果不明显，可能与该研究中使用的Poly(I:C)剂量相对较低有关（1µg）。在另一项研究中，Bardel等人发现25µg Poly(I:C)可以显著增强皮内HIV-1gp140或HSV-2gD糖蛋白诱导的全身和粘膜抗体反应以及在HSV-2攻击研究中对小鼠模型的保护作用，而不会明显增强小鼠模型中对皮肤反应原性的保护作用。这项研究表明，皮内接种添加Poly(I:C)佐剂的HIV-1gp140或HSV-2gD糖蛋白疫苗具有良好的安全性和效力，可诱导有效的粘膜免疫。Du等人发现，将白喉毒素（DT）和Poly(I:C)封装到脂质体中，然后以空心微针为基础进行皮内给药，与单独以空心微针为基础进行皮内单独接种DT相比，可显著增强DT特异性IgG2a抗体反应。有趣的是，该研究中使用了相对较低的poly(I:C)剂量（0.31µg），但并未观察到总IgG或IgG1抗体反应的显著增强。最近，在一项1期临床研究中测试了用聚-L-赖氨酸稳定的poly(I:C)与光化学内化（PCI）相结合增强人乳头瘤病毒多肽疫苗接种的效果，光化学内化是一种通过光诱导过程促进内吞抗原的胞体释放，从而促进诱导细胞介导的免疫反应的技术。尽管没有研究基于poly(I:C)佐剂在增强人乳头瘤病毒多肽疫苗接种方面的效力，但研究发现，当光敏剂剂量低于一定阈值时，整体对研究对象是安全的。上述研究表明，poly(I:C)佐剂用于加强皮内接种具有良好的安全性。lcGAMP佐剂2′3′-环GMP-AMP（cGAMP，图3E）是细胞内干扰素基因刺激物（STING）通路的刺激物，可导致NFκB和IRF3激活以及促炎细胞因子和I型IFN基因表达。cGAMP及其类似物，如cdAMP和cdGMP，已被探究为诱导Th1免疫应答对抗传染性疾病和癌症的有效佐剂。研究发现，在小鼠和猪模型中，皮内注射cGAMP与H5N1流感疫苗或2009年大流行H1N1疫苗可显著增强疫苗诱导的免疫反应，而不会引起明显的局部不良反应。此外，在小鼠模型中，cGAMP被发现是一种比CpG或MPL更有效的佐剂，可增强皮内对H5N1免疫。最近，Hernandez-Franco等人探索了cdAMP和一种以植物为基础的阳离子α-D-葡聚糖纳米粒(Nano-11)增强小鼠和猪皮内OVA免疫的安全性和有效性，发现cdAMP佐剂的皮内OVA免疫在注射后24小时诱发一过性变色，14天后消失，而Nano-11佐剂的皮内OVA免疫则不会诱发明显的不良反应。这些研究支持STING激动剂作为安全的佐剂来促进皮内疫苗接种。lPCPP佐剂微针是将疫苗递送至皮肤的一种极具吸引力的技术。疫苗可以涂布在金属或不可溶解聚合物微针的表面，或封装在可溶解聚合物微针结构中。考虑到微针通常会诱导与肌肉注射给药相当的免疫反应，人们探索了安全的佐剂来促进基于微针的皮内疫苗接种。Andrianov等人发现，PCPP（图3F）是一种合成的、水溶性、可生物降解的聚磷嗪聚合物，在药物输送和组织工程中有着广泛的应用，是一种安全的佐剂，可促进猪的基于微针的皮内乙型肝炎疫苗接种。此外，PCPP可作为一种关键的微针疫苗制造材料，以减少对表面活性剂的依赖。在这项研究中，只观察到轻微的皮肤红痕，没有发现严重的不良反应。除PCPP外，研究还发现一种新型聚磷腈聚合物PCEP可安全促进仔猪皮内接种H1N1流感疫苗，尽管对H3N2病毒缺乏异种亚型保护。总之，皮内反应原性低的化学佐剂通常是水溶性的或制成水性制剂，以便于从局部给药部位快速清除。这些佐剂大多基于病原体相关分子模式（PAMPs）或其合成类似物，可激活模式识别受体（PRRs），如TLR3、TLR4、TLR7、TLR9和STING，从而在不过度激活先天性免疫系统的情况下发挥佐剂作用。虽然PCPP不是PAMP，但研究发现PCPP可通过TLR3、TLR4和TLR9直接激活免疫细胞。这些研究表明，某些PRR激动剂作为皮内接种佐剂是安全的。6.安全用于皮内疫苗接种的物理佐剂除了注射化学佐剂，人们还探索了在皮内注射疫苗前在皮肤表面短暂施加物理能量，以促进皮内疫苗接种。l开发物理佐剂的合理性由于缺乏对佐剂作用原理的了解，过去的佐剂开发主要依赖于经验或试错方法，尤其是那些非PAMP型佐剂，如明矾、MF59和QS21。这些佐剂没有特定的细胞受体来介导其佐剂效应，因此不会直接激活先天性免疫细胞，如直流电和巨噬细胞。相反，这些佐剂更有可能刺激组织应激和细胞死亡，从而释放内源性危险信号或损伤相关分子模式（DAMPs）来介导其佐剂效应。20世纪90年代，Matzinger和她的同事提出了"危险理论"，证明免疫系统是由受压或受损细胞释放的危险信号激活的。"危险理论"解释了在没有外来病原体入侵的情况下诱导适应性免疫，如移植排斥、某些化疗诱导的全身性抗肿瘤免疫激活。在过去的二三十年中，人们发现了各种类型的DAMPs，其中包括尿酸和ATP等小分子化学物质以及dsDNA等大分子物质，它们能够根据"危险理论"调节免疫系统的功能。这些物质在生理条件下被封闭起来，无法被免疫系统识别，但在组织应激或细胞死亡时会释放出来，激活免疫系统。研究发现，明矾佐剂可刺激尿酸释放，从而激活NOD-、LRR-和含吡啶结构域蛋白3（NLRP3）炎性小体和Caspase-1激活，部分介导其促炎症反应。明矾佐剂还能刺激宿主DNA的释放，从而诱导IgG1抗体的产生和IgE类的转换，并延长DC和CD4+T细胞的相互作用。MF59佐剂可刺激ATP释放，从而增强疫苗接种的免疫反应。这些进展表明，刺激组织应激或细胞死亡的物理模式可能会诱导内源性危险信号的释放，从而促进疫苗接种。l物理佐剂类型研究最多的两种疫苗佐剂物理能量是激光和射频。图4总结了各种类型的激光佐剂和射频佐剂。图4.不同类型的物理佐剂。简要说明不同类型的激光佐剂(全表面、非消融部分、消融部分)和射频佐剂l激光佐剂激光发出窄波长的光，可被特定的组织发色团吸收。可见光主要被黑色素和血红蛋白吸收，而近红外光主要被组织水吸收。激光在美学和医学方面有着独特的应用。由于其超细的光束，高能激光已被用于无刀片激光辅助原位角膜磨镶术(LASIK)，术后并发症最少。激光还被用于低强度激光治疗，以刺激伤口愈合和缓解疼痛。激光还被用于皮肤表面处理、胎记和皱纹去除。已经探索了几种激光来促进皮内疫苗接种。Onikienko等人探索了一种发射两种波长(510nm和578nm)的铜蒸气激光，通过诱导持续的局部炎症来增强疫苗诱导的免疫反应，类似于化学佐剂。我们探索了非侵入性Q开关Nd：YAG532nm激光治疗来增强皮内疫苗诱导的免疫反应，并发现非侵入性激光治疗可以显著增强模型抗原OVA和流感疫苗诱导的小鼠模型的免疫反应，而不会导致可见或组织学皮肤损伤。激光治疗几乎没有诱导细胞因子的表达或免疫细胞的招募。进一步的研究发现，非炎症性激光治疗显著促进了MHCII+细胞(如巨噬细胞和DC)在皮肤内的迁移。MHCII+巨噬细胞和DC的局部运动增强可能有助于增强抗原摄取和增强获得性免疫。我们进一步发现，激光佐剂可以通过促进DC进入淋巴管和迁移到引流淋巴结来增强基于DC的抗肿瘤免疫治疗。激光佐剂被发现还能增强皮内尼古丁疫苗诱导的抗尼古丁抗体的产生。研究人员还开展了1064纳米近红外激光(NIR)增强疫苗皮内接种效果的研究。结果发现，无组织损伤的近红外治疗可以瞬时诱导一组明确的趋化因子，如CCL2和CCL20的表达，并增加表皮和真皮中DC的浓度。近红外激光治疗被发现显著提高皮内卵白蛋白和流感疫苗诱导的小鼠模型的免疫反应。进一步研究发现，近红外激光增加并激活皮肤中的Lang+和CD11b-DC亚群，并促进DC迁移到引流淋巴结，以增强疫苗诱导的免疫反应。与这项研究一致的是，皮肤中的CD103+DC亚群被发现在近红外佐剂效应中发挥关键作用。初步临床研究探索了近红外治疗在人类中的最大耐受量，并发现近红外激光促进CD1a+LC和CD11c+DC在真皮中的迁移。与非侵入性全表面激光治疗不同的是，非消融性部分激光(NAFL)也被用于增强皮内接种效果。NAFL发射高能微激光，并在皮肤表面形成微温区。在低温区域的死亡细胞招募浆细胞样树突状细胞(PDC)，它可以被局部咪喹莫特激活以增强皮内流感疫苗接种效果。NAFL治疗后皮内接种流感疫苗，然后局部注射咪喹莫特，在NAFL或局部咪喹莫特存在的情况下，比皮内接种流感疫苗产生更好的免疫反应，而在AddaVax佐剂存在的情况下，肌肉接种流感疫苗产生类似的免疫反应。有趣的是，NAFL/咪喹莫特佐剂的组合流感疫苗在小鼠和猪模型中显示出良好的局部和系统安全性。另一项研究发现，在小鼠模型中，与在NAFL或单独使用咪喹莫特的情况下皮内接种疱疹病毒多肽相比，局部应用咪喹莫特和NAFL治疗，然后皮内接种疱疹病毒多肽疫苗，可以诱导最有效的疫苗特异性CD4+和CD8+T细胞反应，并对生殖器疱疹病毒感染提供最显著的保护。上述研究表明，NAFL的使用顺序、局部应用咪喹莫特和皮内接种并不是该组高免疫原性的关键，只是在皮内接种疫苗之前使用NAFL以避免疫苗抗原的潜在热灭活。进一步研究发现，NAFL刺激死亡细胞释放dsDNA，并激活STING和IRF途径来介导其佐剂作用。NAFL还被发现在小鼠和猪模型中安全地加强基于微针的流感疫苗接种。关于激光疫苗佐剂更详细分类可参考其他综述。除了仅将激光用作佐剂外，最近开发了基于激光的粉末递送系统(LPD)，用于无需外部佐剂的无针经皮疫苗递送和辅助植入。LPD是基于消融部分激光(AFL)治疗产生皮肤微通道，然后局部应用粉末疫苗涂层阵列贴片，通过AFL产生的皮肤微通道将疫苗输送到皮肤。研究发现，能量为10mJ、覆盖率为10%的超脉冲CO2 AFL在促进OVA皮内免疫方面具有强大的佐剂作用。此外，基于AFL的粉末注射流感疫苗比皮内注射相同剂量的流感疫苗产生更强的抗体反应。在致命的病毒攻击后，流感疫苗的LPD也比皮内注射提供更显著的保护。AFL治疗诱导了显著的细胞因子和趋化因子的释放，并将中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞招募到微通道周围的组织中。由于消融了一小部分皮肤和靠近皮肤微通道的局部炎症反应，AFL治疗的皮肤没有明显的不良反应，并在几天内完全恢复。AFL的佐剂作用被认为是由于旁观者的光热效应。由于激光的脉冲宽度较长，在激光消融过程中产生的热量会扩散到周围组织，并导致周围一层薄薄的微通道组织的热损伤。dsDNA被发现从低温区域释放并诱导细胞因子表达。研究发现AFL还能激活NLRP3炎症体和Caspase1，导致IL-1β的活性释放。有趣的是，dsDNA、NLRP3炎症体和IL-1β对于激光佐剂效应是非必需的，而MyD88对激光佐剂有重要作用。与光热应激不同的是，在微针疫苗接种过程中施加的机械压力也被发现可以增强疫苗诱导的免疫反应。Ng等人发现，增加微投影阵列应用能量来诱导机械压力和细胞死亡增强疫苗(包被在微针表面)诱导的免疫反应，而不加入化学佐剂。这种方法被发现可以诱导与肿瘤坏死因子α和核因子-κB信号通路相关的基因表达。这些开创性的研究支持开发自佐剂疫苗递送技术，以便在不注射针头或化学佐剂的情况下进行更具免疫原性的疫苗接种。l射频佐剂射频(RFs)是交变电磁波。中高频(0.3-10MHz)的射频可产生组织加热，在美学和医学上有着广泛的应用。由于其热效应，RFs已被用于肿瘤治疗中的肿瘤组织消融或在皮肤表面修复中诱导新的胶原合成。为了寻求替代的物理能量来促进皮内疫苗接种，我们探索了在皮内疫苗注射之前对一小块皮肤进行双极射频治疗的潜在佐剂效果。射频治疗受到控制，以诱导显著的加热效应，但不会对皮肤造成损害。我们发现，非侵入性RF治疗诱导了一过性、低水平的局部炎症，而化学佐剂，如明矾、AddaVax和MPL，则诱导了持久且更强烈的局部炎症。RF治疗被发现显著增加真皮CD103+和CD11b-DC亚群的抗原摄取，并促进真皮DC向引流淋巴结的迁移。此外，射频治疗显著增加了引流淋巴结中传统DC和PDC的成熟。RF治疗显著增加了OVA诱导的抗体反应，佐剂效果与AddaVax相当，也增强了OVA特异性细胞免疫反应，佐剂效果与CpG佐剂相当。此外，研究发现，与0.06μg疫苗剂量的AddaVax佐剂疫苗相比，0.3μg疫苗剂量的RFA同样增强了2009年H1N1流感大流行疫苗诱导的抗体应答和保护作用。低剂量下的RFA效果较好，提示其具有优良的剂量节约效应。为了验证这一点，我们研究发现RFA可以帮助毫微克H3N2疫苗在小鼠模型中诱导有效的免疫反应和保护。考虑到先前的激光佐剂效果主要是与相对较弱的明矾佐剂进行比较，RFA是第一个与广泛使用的化学佐剂(类似MF59的AddaVax)相比的物理佐剂，可以增强流感疫苗接种。由于RFA能够帮助蛋白质或亚单位疫苗诱导细胞免疫反应，我们进一步探索了RFA在基于重组核蛋白(NP)和基质蛋白1(M1)的通用流感T细胞疫苗开发中的作用。通用流感T细胞疫苗主要针对保守的病毒细胞内抗原，如NP和M1。佐剂提供了一种方便的策略来帮助NP和M1诱导CD8+T细胞反应。我们发现RFA可以增强真皮内NP和M1诱导的CD8+T细胞反应。在小鼠模型中，在RFA存在的情况下，皮内NP/M1免疫对致死性病毒攻击具有显著的保护作用。在加强NP/M1免疫方面，RFA显示出与AddaVax相似的佐剂作用。最近发现，RFA还可以扩大流感疫苗诱导的针对异源病毒的免疫反应。这种交叉保护免疫可能是由于它诱导了交叉保护的细胞毒性T淋巴细胞。RFA还有效促进了雄性和雌性小鼠的H5N1流感疫苗皮内免疫。含有RFA的H5N1流感疫苗皮内接种(RFA/ID)诱导的血清血凝抑制(HI)效价和免疫球蛋白抗体效价显著高于单独皮内疫苗(ID)。在致死性病毒攻击后，RFA/ID组而不是ID组显示出显著的肺病毒滴度降低。有趣的是，与ID组相比，RFA/ID组攻击后肺组织中分泌肿瘤坏死因子α和干扰素γ的CD4+和CD8+T细胞显著增加。RFA/ID组对体重减轻也有显著的保护作用。RFA/ID组小鼠不分性别全部存活，ID组部分小鼠存活(雌鼠占25%，雄鼠占75%)。有趣的是，在这项研究中，与AddaVax佐剂相比，RFA对促进H5N1流感疫苗接种的作用较弱。比较组织蛋白质组学最近被用来鉴定RFA治疗后独特表达的蛋白质。我们发现，与化学佐剂处理(MPL、AddaVax、Alum、MPL/Alum)相比，RFA诱导了14种唯一表达的蛋白质。在唯一表达的蛋白质中，热休克蛋白70(HSP70)在RFA效应中发挥了关键作用。验证研究发现，与野生型小鼠相比，HSP70基因敲除小鼠显著降低了促进OVA和pdm09疫苗接种的RFA效应。有趣的是，这项研究发现RFA引起的局部组织蛋白质组变化最小，而AddaVax佐剂引起的局部组织蛋白质组变化最大。RFA对局部组织蛋白质组的最小变化与其诱导的一过性和低水平的局部炎症是一致的。l物理佐剂的优点物理佐剂将物理能量短暂地应用于皮肤表面，然后皮内注射疫苗，以增强疫苗诱导的免疫反应(图5)。物理佐剂主要由医疗器械输送，可在室温下保存，无需冷链储存。这与化学佐剂不同，化学佐剂通常与疫苗一起保存，并需要冷链储存。物理佐剂设备可以重复使用，每次应用的成本可能类似于化学佐剂。物理佐剂不需要与疫苗混合，因此不需要改变或修改疫苗制造或给药过程。物理佐剂不太可能引起显著的全身性或长期副作用，这可能是化学佐剂的一个问题。这是因为物理佐剂的作用主要局限于治疗部位，而化学佐剂可以迁移到引流淋巴结，甚至到达体循环，从而广泛激活免疫系统。物理佐剂可诱导良好控制的组织应激(例如，热)，并允许皮肤快速恢复，而不会产生持久的影响。物理佐剂经常引起短暂的、低水平的局部炎症，而化学佐剂往往引起持续的、更强烈的局部炎症。物理佐剂主要是改变局部环境以增加DC的运动性，诱导内源性危险信号的释放以增强抗原摄取和DC成熟，或促进DC迁移到引流淋巴结以增强疫苗诱导的免疫反应(图5)。经过适当的开发，物理佐剂的效果可以与化学佐剂一样强大。图5.化学佐剂和物理佐剂在皮内接种中的不同作用机制。皮内给药后，化学佐剂通过与PRRs结合直接激活DC，诱导DC成熟，诱导DC释放细胞因子/趋化因子，招募天然免疫细胞，或促进DC向引流淋巴结迁移，以增强疫苗诱导的免疫应答。物理佐剂传递激光或射频能量，诱导组织应激释放危险信号，刺激DC成熟，诱导DC释放细胞因子/趋化因子，并招募先天免疫细胞。物理佐剂还可以增加DC在真皮组织中的运动性，并促进DC迁移到引流淋巴结，以增强疫苗诱导的免疫反应。7.专家评论皮肤已被公认为疫苗接种的高免疫原性部位。与肌肉接种相比，皮内接种疫苗通常能诱导更强的免疫反应，在提高疫苗效力或节省疫苗剂量方面有很大作用。事实上，已有几种疫苗获得了皮内接种的许可，其中包括流感疫苗、狂犬病疫苗和最近的猴痘疫苗。然而，皮内接种面临着诱发严重局部反应的风险。目前获批的大多数佐剂都不适合皮内接种，因为它们具有诱发严重局部反应的高风险。我们需要新型佐剂来安全地增强皮内接种效果，同时避免皮肤出现明显的反应。最近的研究发现了几种有可能安全增强疫苗皮内接种效果的化学佐剂，包括CpG1018、GLA-AF、局部咪喹莫特、poly(I:C)、cGAMP和PCPP。CpG1018已被授权用于促进肌肉接种乙型肝炎疫苗，而GLA-AF和局部咪喹莫特已在临床试验中用于增强皮内接种流感疫苗。由于这些佐剂在人体中的安全性已得到证实，因此可随时用于皮内疫苗接种。poly(I:C)已在临床试验中被用于增强肿瘤内、肌内或皮下注射后的抗肿瘤免疫力。poly(I:C)其总体良好的耐受性支持对其进行评估，以增强皮内疫苗接种。皮内接种佐剂疫苗的好处是可以进一步提高疫苗效力，节省更多疫苗剂量，并有可能诱导交叉保护性免疫。流感疫苗可作为测试皮内佐剂接种的良好目标，以解决疫苗失配问题，因为疫苗失配会大大降低疫苗效力，或通过节省疫苗剂量来解决每年流感疫苗生产的负担。在批准皮内佐剂疫苗供大众使用时，需要仔细评估其效益/风险比。除化学佐剂外，人们还探索了不同类型的物理佐剂（激光、射频），以安全地促进皮内疫苗接种。物理佐剂是一种相对较新的佐剂类型，它利用物理能量诱导组织应激以促进皮内接种。虽然物理佐剂提高人类疫苗效力的潜力仍有待探索，但最近发现内源性危险信号在化学佐剂效应中发挥关键作用（如明矾、MF59），这支持了物理佐剂的发展，以诱导组织应激和释放内源性危险信号来促进疫苗接种。最近在临床前动物模型中研究了物理佐剂的概念及其增强皮内疫苗接种的安全性和有效性。这些研究支持物理佐剂在促进皮内疫苗接种方面具有良好的安全性和有效性。尽管取得了这些令人鼓舞的成果，但物理佐剂在人类使用方面仍面临着一些挑战。首先，物理佐剂是依靠设备的。目前，还没有指导物理佐剂开发和审批的指导方针。其次，物理佐剂的开发需要设备制造商和疫苗公司的共同努力，还需要引入佐剂开发和医疗设备审批方面的监管机构。多方的参与可能会给物理佐剂的开发带来新的挑战。第三，使用目前的物理佐剂进行皮内接种需要两个步骤：物理佐剂处理和皮内接种。与化学佐剂结合疫苗接种相比，两步接种过程需要花费更多时间，而且公众对这种新型疫苗接种的接受程度还有待进一步探讨。佐剂的开发在21世纪受到极大关注。在批准新佐剂供人类使用和阐明疫苗佐剂的内在机制方面取得了重大进展。所有这些努力都有望促进安全的化学和物理佐剂的开发，从而增强皮内接种疫苗的效果。参考来源：Chen X. Emerging adjuvants for intradermal vaccination. Int J Pharm. 2023 Feb 5;632:122559. doi: 10.1016/j.ijpharm.2022.122559. Epub 2022 Dec 28. PMID: 36586639; PMCID: PMC9794530.推荐学习：疫苗佐剂概述：发展现状和未来展望基于TLR激动剂佐剂的设计疫苗佐剂：选择标准、与免疫应答相关的作用机制和未来方向识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。