OTUB1

来源：药渡 撰文：balabala     编辑：哦呼 靶向嵌合体蛋白水解（PROTAC）技术代表了药物发现领域的突破性发展，利用泛素蛋白酶体系统特异性降解与疾病相关的蛋白质，多项目已进入临床开发。但针对CF和某些癌症，需开发靶向蛋白稳定剂TPS以对抗异常蛋白降解。 拓展阅读： 瞄准靶蛋白降解：中国在PROTAC药物战略布局中的新动向 PROTAC设计中Linker特性的探索与创新 靶向“不可成药”靶点，浅析PROTAC、分子胶靶向蛋白降解与靶向蛋白稳定技术 推动PROTAC药物开发新纪元：扩展PROTAC的E3连接酶 靶向蛋白质稳定技术（targeted protein stabilization，TPS）是近年来生物医学领域一种新兴的技术，旨在通过特定的方法来稳定细胞内的蛋白质，从而影响其功能和行为。这种技术潜在应用广泛，从基础研究到新药开发都有重要价值。 去泛素化酶靶向嵌合体（deubiquitinase-targeting chimeras，DUBTACs）是近年来逐渐发展的一种靶向蛋白质稳定技术，DUBTACs一般由靶蛋白配体、去泛素化酶配体和Linker三部分组成，这样的结构设计使得DUBTAC分子可以同时结合靶蛋白和去泛素化酶，诱导靶蛋白和去泛素化酶靠近，去除靶蛋白上的泛素链，从而达到稳定以泛素化依赖方式降解的特定蛋白质的水平（图1）。 图1. DUBTAC平台 在这里，我们总结了近年来DUBTAC技术的研发进展，详细探讨了其在生物医药领域的应用前景和潜在挑战。 01 基于OUTB1的DUBTACs 在2022年初，加州大学伯克利分校的Daniel K. Nomura教授团队运用基于活性的蛋白质图谱分析（activity-based protein profiling, ABPP）对65种去泛素化酶的反应性半胱氨酸进行全局性分析。 研究结果发现，泛素化酶OTUB1的C23位点不参与酶活性的调控且具有较高的亲核性，是一个理想的配体结合位点。由于细胞中主要介导蛋白质降解的最丰富的泛素链是K48链，而OTUB1则是靶向移除K48链的去泛素化酶。 理论上，利用OTUB1去针对性地去除特定蛋白上的泛素链，防止以泛素化依赖方式被降解的特定蛋白质被蛋白酶体降解，是非常有效的。 图2. EN523结构 （1）ΔF508-CFTR-DUBTACs Daniel K. Nomura教授团队基于上述发现筛选出了一个与OUTB1高亲和力结合的共价配体EN523（图2）。其中，EN523与OTUB1结合是通过EN523的丙烯酰胺部分与OTUB1变构半胱氨酸残基Cys23共价作用来实现的。他们通过体外实验证明EN523对OTUB1的酶活性没有显著影响。 随后，研究人员将筛选到的EN523与ΔF508-CFTR调节剂Lumacaftor连接起来所获得的异源双功能小分子NJH-2-057用于靶向CFTR突变体ΔF508-CFTR的稳定从而改善囊性纤维化。 实验结果表明，NJH-2-057可以有效稳定ΔF508-CFTR，而单独使用Lumacaftor的结果则与对照组差异不明显（图3）。这一结果为DUBTAC技术的发展提供了概念验证。 图3. NJH-2-057稳定CFTR （2）WEE1-DUBTACs Daniel K. Nomura教授团队随后将DUBTAC技术应用于提高抑癌基因WEE1的稳定性，WEE1是一种非恶性真核体细胞中的肿瘤抑制激酶，可磷酸化细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK1）-细胞周期蛋白B1复合物，以抑制有丝分裂S期和G2期的细胞周期进展，并且必须下调其活性才能发生有丝分裂进展。WEE1在许多肿瘤中被降解以促进癌细胞增殖。稳定癌细胞中WEE1激酶的水平有望阻止肿瘤生长。 研究人员将EN523与一种临床WEE1抑制剂AZD1775通过烷基链linker或基于聚乙二醇的linker连接合成了靶向肿瘤抑制性激酶WEE1的DUBTAC。研究显示，DUBTAC能显著稳定肝癌细胞系中的WEE1，而EN523或AZD1775单独治疗对WEE1水平没有影响（图4）。 图4. WEE1 DUBTAC稳定WEE1 这进一步证明了DUBTAC技术用于TPS的普适性，此外，Daniel K. Nomura教授团队的研究也强调了使用化学蛋白质组学支持的共价配体发现平台的实用性。 （3）TF-DUBTACs 2022年6月份，来自美国哈佛医学院的Wenyi Wei教授团队在此前研究的基础上，使用EN523招募去泛化素酶OTUB1进一步开发了能够稳定抑癌转录因子（Transcription Factor，TF）的首个TF-DUBTAC药物平台，旨在通过稳定TF实现对肿瘤的治疗（图5）。 图5. TF-DUBTAC平台示意图 研究人员分别将FOXO3A、p53、IRF3三种转录因子的结合配体叠氮基修饰DNA寡核苷酸与BCN（bicyclononyne）修饰的去泛素化酶OUTB1的共价配体（DUBL-X-BCN 1-10）通过SPAAC反应连接起来，设计合成出了一系列靶向FOXO3A、p53、IRF3三种转录因子的DUBTAC分子（图6），紧接着，研究人员通过体外实验测定了细胞水平上化合物对靶蛋白的稳定作用，并筛选出有效的TF-TUBTAC分子，细胞水平活性测试研究表明，相应的TF-DUBTAC 以OUTB1依赖的方式分别稳定了细胞内的FOXO3A、p53、IRF3。 图6. TF-DUBTAC作用机理图示 这进一步说明了TF-DUBTAC是一个可推广的平台，可实现抑癌转录因子的选择稳定性，可作为抑制肿瘤生成的治疗手段。同时也表明DUBTAC技术在癌症治疗方面的普适性和有效性。 02 基于USP7的DUBTACs 由于基于去泛素化酶OTUB1共价配体开发出的DUBTACs可能与其他共价抑制剂类似存在毒性或超敏反应等劣势，因此，开发基于其他去泛素酶的可逆招募配体是TPS领域的重要发展方向。 2024年4月份，美国哈佛医学院的Wenyi Wei教授团队开发了第一个基于去泛素化酶USP7的DUBTAC，其利用USP7的非共价配体实现了选择性稳定CFTR和AMPK蛋白的目的（图7）。 图7.USP7-DUBTAC平台示意图 （1）ΔF508-CFTR-DUBTACs 首先，研究人员选择先前报道过的USP7 ligand #1作为去泛素化酶USP7的配体，通过分析配体与USP7复合物的共晶结构，选择配体分子USP7i-#4a结构中位于结合口袋外的氨基作为linker连接位点进行分子设计。 研究人员将USP7 ligand#1与ΔF508-CFTR调节剂Lumacaftor通过linker连接合成了一系列的靶向CFTR的DUBTAC的分子，并在细胞水平上测定化合物对CFTR蛋白的稳定作用（图8）。 图8.基于usp7的dubtac来稳定靶蛋白 研究结果表明，化合物MS6869以相对特定的方式促进了CFTR的稳定，其有效性与先前报道的基于OTUB1的CFTR-DUBTAC相当。 （2）AMPK-DUBTACs 随后，研究人员基于两种不同的USP7配体设计并合成了一系列的靶向AMPK的DUBTAC分子（图8），并对这些化合物进行AMPK蛋白稳定作用测试，研究表明，不同的USP7配体衍生的AMPK-DUBTAC可以选择性地稳定AMPK β的不同亚型，导致AMPK信号转导升高。 这些结果无一不说明了基于USP7的DUBTAC技术开发的可行性。 03 展望 DUBTAC技术的出现，使得许多领域有望从主动泛素化和降解蛋白的靶向去泛素化中获益。例如稳定线粒体中的BAX水平以诱导细胞凋亡，稳定STING用于免疫肿瘤学应用或在胰腺细胞中稳定葡萄糖激酶用于成年发病型糖尿病2型。其他受益于DUBTAC的靶标包括各种为了维持癌细胞增殖而被主动泛素化和降解的肿瘤抑制因子。 除了囊性纤维化之外，还有许多其他遗传疾病也可以通过dubtac稳定获益。包括高雪氏病或帕金森病中的葡萄糖脑苷脂酶突变和苯丙酮尿症中的苯丙氨酸羟化酶和富马酰乙酰乙酸羟化酶突变等。 我们总结了近年来DUBTAC技术的研究进展，展现了DUBTAC技术在提高蛋白质稳定效率方面的显著优势，我们也对DUBTAC技术的发展前景做出了展望，期待更多研究者能够加入这一创新领域，共同推动生物医药技术的发展。 编者按： DUBTAC通过稳定关键蛋白质来对抗疾病，如CFTR和WEE1，已在实验室研究中取得初步成功。随着技术的不断进步，基于USP7等其他去泛素酶的DUBTAC也在开发中，有望克服现有技术的局限性。展望未来，DUBTAC技术有望在更多领域发挥作用，为治疗各种疾病提供新的策略。 参考文献 [1]Deubiquitinase-targeting chimeras for targeted protein stabilization [2]TF-DUBTACs Stabilize Tumor Suppressor Transcription Factors [3]USP7-Based Deubiquitinase-Targeting Chimeras Stabilize AMPK 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

来源：药渡 撰文：balabala     编辑：哦呼 靶向嵌合体蛋白水解（PROTAC）技术代表了药物发现领域的突破性发展，利用泛素蛋白酶体系统特异性降解与疾病相关的蛋白质，多项目已进入临床开发。但针对CF和某些癌症，需开发靶向蛋白稳定剂TPS以对抗异常蛋白降解。 拓展阅读： 瞄准靶蛋白降解：中国在PROTAC药物战略布局中的新动向 PROTAC设计中Linker特性的探索与创新 靶向“不可成药”靶点，浅析PROTAC、分子胶靶向蛋白降解与靶向蛋白稳定技术 推动PROTAC药物开发新纪元：扩展PROTAC的E3连接酶 靶向蛋白质稳定技术（targeted protein stabilization，TPS）是近年来生物医学领域一种新兴的技术，旨在通过特定的方法来稳定细胞内的蛋白质，从而影响其功能和行为。这种技术潜在应用广泛，从基础研究到新药开发都有重要价值。 去泛素化酶靶向嵌合体（deubiquitinase-targeting chimeras，DUBTACs）是近年来逐渐发展的一种靶向蛋白质稳定技术，DUBTACs一般由靶蛋白配体、去泛素化酶配体和Linker三部分组成，这样的结构设计使得DUBTAC分子可以同时结合靶蛋白和去泛素化酶，诱导靶蛋白和去泛素化酶靠近，去除靶蛋白上的泛素链，从而达到稳定以泛素化依赖方式降解的特定蛋白质的水平（图1）。 图1. DUBTAC平台 在这里，我们总结了近年来DUBTAC技术的研发进展，详细探讨了其在生物医药领域的应用前景和潜在挑战。 01 基于OUTB1的DUBTACs 在2022年初，加州大学伯克利分校的Daniel K. Nomura教授团队运用基于活性的蛋白质图谱分析（activity-based protein profiling, ABPP）对65种去泛素化酶的反应性半胱氨酸进行全局性分析。 研究结果发现，泛素化酶OTUB1的C23位点不参与酶活性的调控且具有较高的亲核性，是一个理想的配体结合位点。由于细胞中主要介导蛋白质降解的最丰富的泛素链是K48链，而OTUB1则是靶向移除K48链的去泛素化酶。 理论上，利用OTUB1去针对性地去除特定蛋白上的泛素链，防止以泛素化依赖方式被降解的特定蛋白质被蛋白酶体降解，是非常有效的。 图2. EN523结构 （1）ΔF508-CFTR-DUBTACs Daniel K. Nomura教授团队基于上述发现筛选出了一个与OUTB1高亲和力结合的共价配体EN523（图2）。其中，EN523与OTUB1结合是通过EN523的丙烯酰胺部分与OTUB1变构半胱氨酸残基Cys23共价作用来实现的。他们通过体外实验证明EN523对OTUB1的酶活性没有显著影响。 随后，研究人员将筛选到的EN523与ΔF508-CFTR调节剂Lumacaftor连接起来所获得的异源双功能小分子NJH-2-057用于靶向CFTR突变体ΔF508-CFTR的稳定从而改善囊性纤维化。 实验结果表明，NJH-2-057可以有效稳定ΔF508-CFTR，而单独使用Lumacaftor的结果则与对照组差异不明显（图3）。这一结果为DUBTAC技术的发展提供了概念验证。 图3. NJH-2-057稳定CFTR （2）WEE1-DUBTACs Daniel K. Nomura教授团队随后将DUBTAC技术应用于提高抑癌基因WEE1的稳定性，WEE1是一种非恶性真核体细胞中的肿瘤抑制激酶，可磷酸化细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK1）-细胞周期蛋白B1复合物，以抑制有丝分裂S期和G2期的细胞周期进展，并且必须下调其活性才能发生有丝分裂进展。WEE1在许多肿瘤中被降解以促进癌细胞增殖。稳定癌细胞中WEE1激酶的水平有望阻止肿瘤生长。 研究人员将EN523与一种临床WEE1抑制剂AZD1775通过烷基链linker或基于聚乙二醇的linker连接合成了靶向肿瘤抑制性激酶WEE1的DUBTAC。研究显示，DUBTAC能显著稳定肝癌细胞系中的WEE1，而EN523或AZD1775单独治疗对WEE1水平没有影响（图4）。 图4. WEE1 DUBTAC稳定WEE1 这进一步证明了DUBTAC技术用于TPS的普适性，此外，Daniel K. Nomura教授团队的研究也强调了使用化学蛋白质组学支持的共价配体发现平台的实用性。 （3）TF-DUBTACs 2022年6月份，来自美国哈佛医学院的Wenyi Wei教授团队在此前研究的基础上，使用EN523招募去泛化素酶OTUB1进一步开发了能够稳定抑癌转录因子（Transcription Factor，TF）的首个TF-DUBTAC药物平台，旨在通过稳定TF实现对肿瘤的治疗（图5）。 图5. TF-DUBTAC平台示意图 研究人员分别将FOXO3A、p53、IRF3三种转录因子的结合配体叠氮基修饰DNA寡核苷酸与BCN（bicyclononyne）修饰的去泛素化酶OUTB1的共价配体（DUBL-X-BCN 1-10）通过SPAAC反应连接起来，设计合成出了一系列靶向FOXO3A、p53、IRF3三种转录因子的DUBTAC分子（图6），紧接着，研究人员通过体外实验测定了细胞水平上化合物对靶蛋白的稳定作用，并筛选出有效的TF-TUBTAC分子，细胞水平活性测试研究表明，相应的TF-DUBTAC 以OUTB1依赖的方式分别稳定了细胞内的FOXO3A、p53、IRF3。 图6. TF-DUBTAC作用机理图示 这进一步说明了TF-DUBTAC是一个可推广的平台，可实现抑癌转录因子的选择稳定性，可作为抑制肿瘤生成的治疗手段。同时也表明DUBTAC技术在癌症治疗方面的普适性和有效性。 02 基于USP7的DUBTACs 由于基于去泛素化酶OTUB1共价配体开发出的DUBTACs可能与其他共价抑制剂类似存在毒性或超敏反应等劣势，因此，开发基于其他去泛素酶的可逆招募配体是TPS领域的重要发展方向。 2024年4月份，美国哈佛医学院的Wenyi Wei教授团队开发了第一个基于去泛素化酶USP7的DUBTAC，其利用USP7的非共价配体实现了选择性稳定CFTR和AMPK蛋白的目的（图7）。 图7.USP7-DUBTAC平台示意图 （1）ΔF508-CFTR-DUBTACs 首先，研究人员选择先前报道过的USP7 ligand #1作为去泛素化酶USP7的配体，通过分析配体与USP7复合物的共晶结构，选择配体分子USP7i-#4a结构中位于结合口袋外的氨基作为linker连接位点进行分子设计。 研究人员将USP7 ligand#1与ΔF508-CFTR调节剂Lumacaftor通过linker连接合成了一系列的靶向CFTR的DUBTAC的分子，并在细胞水平上测定化合物对CFTR蛋白的稳定作用（图8）。 图8.基于usp7的dubtac来稳定靶蛋白 研究结果表明，化合物MS6869以相对特定的方式促进了CFTR的稳定，其有效性与先前报道的基于OTUB1的CFTR-DUBTAC相当。 （2）AMPK-DUBTACs 随后，研究人员基于两种不同的USP7配体设计并合成了一系列的靶向AMPK的DUBTAC分子（图8），并对这些化合物进行AMPK蛋白稳定作用测试，研究表明，不同的USP7配体衍生的AMPK-DUBTAC可以选择性地稳定AMPK β的不同亚型，导致AMPK信号转导升高。 这些结果无一不说明了基于USP7的DUBTAC技术开发的可行性。 03 展望 DUBTAC技术的出现，使得许多领域有望从主动泛素化和降解蛋白的靶向去泛素化中获益。例如稳定线粒体中的BAX水平以诱导细胞凋亡，稳定STING用于免疫肿瘤学应用或在胰腺细胞中稳定葡萄糖激酶用于成年发病型糖尿病2型。其他受益于DUBTAC的靶标包括各种为了维持癌细胞增殖而被主动泛素化和降解的肿瘤抑制因子。 除了囊性纤维化之外，还有许多其他遗传疾病也可以通过dubtac稳定获益。包括高雪氏病或帕金森病中的葡萄糖脑苷脂酶突变和苯丙酮尿症中的苯丙氨酸羟化酶和富马酰乙酰乙酸羟化酶突变等。 我们总结了近年来DUBTAC技术的研究进展，展现了DUBTAC技术在提高蛋白质稳定效率方面的显著优势，我们也对DUBTAC技术的发展前景做出了展望，期待更多研究者能够加入这一创新领域，共同推动生物医药技术的发展。 编者按： DUBTAC通过稳定关键蛋白质来对抗疾病，如CFTR和WEE1，已在实验室研究中取得初步成功。随着技术的不断进步，基于USP7等其他去泛素酶的DUBTAC也在开发中，有望克服现有技术的局限性。展望未来，DUBTAC技术有望在更多领域发挥作用，为治疗各种疾病提供新的策略。 参考文献 [1]Deubiquitinase-targeting chimeras for targeted protein stabilization [2]TF-DUBTACs Stabilize Tumor Suppressor Transcription Factors [3]USP7-Based Deubiquitinase-Targeting Chimeras Stabilize AMPK *声明：本文仅是介绍医药疾病领域研究进展或简述研究概况或分享医药相关讯息，并非也不会进行治疗或诊断方案推荐，也不对相关投资构成任何建议。内容如有疏漏，欢迎沟通指出！ 点击下方“药渡“，关注更多精彩内容 2025年上市新药谁最具“帝王之象”？ 诺华通过战略合作和收购扩大放射治疗产品布局 2024中国药企研发管线和销售额排名 点击下方关注，聚焦医药创新一手资讯

2024年4月10日，哈佛医学院Wenyi Wei课题组在JACS上发表了一篇题为USP7-Based Deubiquitinase-Targeting Chimeras Stabilize AMPK的文章。文章首次证实了去泛素化酶 USP7可用于DUBTAC的开发。作者使用两种不同的USP7非共价配体（图1A）开发了第一个AMPK DUBTAC，其选择性地稳定AMPKβ的不同亚型，导致AMPK信号转导升高。首先，作者选择使用先前报道的可以结合并抑制细胞中的USP7的配体#1（图1B），以募集USP7去泛素化酶。复合物共晶结构分析表明，USP7 抑制剂的氨基不在结合口袋中（图1B-C），可用于连接子连接。将USP7配体#1与CFTR配体Lumacaftor通过连接子连接产生化合物 1-13（图2A）。在这13种化合物中，7（MS6869）和13两种化合物可以稳定表达CFBE41o-4.7ΔF508-CFTR的人囊性纤维化支气管上皮细胞中的ΔF508-CFTR突变蛋白（图2B），其有效性与先前报道的基于OTUB1的CFTR DUBTAC NJH-2-057相当。图1：基于USP7的DUBTAC用于稳定靶蛋白通过MS6869进一步研究基于USP7的CFTR DUBTAC的机制，他们发现MS6869引入了USP7和CFTR蛋白之间的新相互作用（图2C），随后降低了 CFTR的泛素化水平（图2D）。此外，MS6869以浓度和时间依赖性方式稳定CFTR（图2E-F）。更重要的是，CFTR蛋白水平的增加可能是功能性的，因为它主要位于质膜上（图2G）。此外，与USP7配体或CFTR配体的共同处理在很大程度上消除了MS6869对稳定ΔF508-CFTR突变蛋白的作用（图2H）。与此一致，CFBE41o-4.7 ΔF508-CFTR 细胞中USP7的耗竭阻断了MS6869稳定CFTR 的作用（图 2I），表明MS6869诱导的CFTR稳定可能取决于USP7的去泛素化酶活性。此外，他们进一步进行了TMT标记质谱（MS）测定，发现MS6869以相对特异性的方式促进CFTR的稳定（图2J-K）。这些结果共同表明，USP7 可用于使用非共价USP7配体稳定靶蛋白。 图2.基于USP7的CFTR DUBTAC可稳定细胞中的ΔF508-CFTR突变蛋白为了进一步证明基于USP7的DUBTAC可以稳定靶蛋白，作者设计并合成了一系列基于USP7的AMPK DUBTAC化合物14-25，通过将USP7配体#1与AMPK激动剂991连接起来 (图3A）。AMPK激动剂991与AMPK ADaM位点结合，该位点位于α亚基的激酶结构域和β亚基的碳水化合物结合模块之间的界面，991可以选择性激活AMPKβ1亚基而不是AMPKβ2亚基。他们测量了DUBTACs处理后AMPK激酶的α和β亚基水平发现三种化合物22、23和24可以稳定AMPKβ1，但不能稳定HeLa细胞中的AMPKβ2亚型和AMPKα亚基（图3B）。对这些先导化合物的进一步评估表明，MS8118（化合物24）在稳定AMPKβ1方面最有效，同时伴随AMPK下游底物乙酰辅酶A羧化酶（ACC）磷酸化升高（图3C），而AMPKβ1的mRNA水平不受影响，表明AMPK DUBTAC在翻译后水平起作用。选择 MS8118代表AMPKβ1进行进一步的功能测定发现MS8118 引入了USP7和AMPKβ1 之间的新相互作用（图3D），这导致细胞内泛素化测定指示的AMPKβ1泛素化水平降低（图 3E）。此外，MS8118对AMPKβ1稳定的作用可能被USP7配体和AMPK配体（图3F）或通过消耗内源性USP7（图3G）阻断，表明MS8118对AMPKβ1蛋白稳定性的影响可能是通过募集USP7去泛素化AMPKβ1。图3.USP7配体#2，GNE6776衍生的USP7-AMPK DUBTAC稳定细胞中的AMPKβ2作者还使用另一种USP7非共价抑制剂GNE6776（图1C），其与AMPK亚基具有不同的结合模式，作为USP7配体产生一系列新的基于USP7的AMPK DUBTAC化合物26-36（图4A）。与USP7配体#1衍生的AMPK DUBTAC相比，GNE6776衍生的AMPK DUBTAC 对AMPKβ1的稳定性影响最小（图4B）。相反，55（MS8655）、56（MS8656）和57（MS8657） 三种化合物优先增加了 HeLa 细胞中 AMPKβ2的蛋白质稳定性（图4B）。进一步的分析表明，MS8655、MS8656和MS8657以浓度依赖性方式主要稳定AMPKβ2，而AMPKβ1仅受到中度影响（图 4C）。接下来，使用AMPKβ2的一个代表性DUBTAC MS8657进行进一步的功能测定，结果与 MS8118 类似。 图4.USP7配体#2，GNE6776衍生的USP7-AMPK DUBTAC稳定细胞中的AMPKβ2总体而言，这篇文章提出了第一个可以稳定CFTR和AMPK蛋白的基于USP7的DUBTAC，这表明USP7可以用来稳定其他感兴趣的蛋白质，显著扩展了靶向蛋白稳定的有限工具箱。本文作者：HYN声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓