GPCR x HSP90

IND2025主会场授课已被预定，大会第一天下午茶歇前授课时间段预定开始，咨询热线：177 0186 0390。点击图片，查看IND2024会后报告 疼痛药物拥有巨大的市场潜力，对于疼痛的治疗需要根据其病因选择合适的治疗方法。根据疼痛的发病机制可以将其分为四类：伤害性、炎症性、神经性和功能失调性疼痛。   伤害性疼痛是由外周伤害感受器检测到有害的组织损伤刺激后被激活而引起的，刺激的持续存在可导致骨关节炎等病理状态。伤害性疼痛的治疗包括阻断伤害感受器感受外界刺激，如TRPV1和TRPA1；阻断感受器的动作电位传输，如Nav1.7和Nav1.8；用N型钙通道阻滞剂或神经递质受体拮抗剂阻断伤害感受器向大脑和脊髓的刺激传递；用阿片类药物阻断皮层区域激活。 炎症性疼痛是一种由组织损伤引起的疼痛，它引起免疫细胞和受损细胞的伤害感受器的激活。因此，通过非甾体抗炎药(NSAIDs)和环氧化酶2 (COX-2)抑制剂可以减少前列腺素E2的产生，免疫反应的降低可以减轻炎症性疼痛。 神经性疼痛不是病理的症状，而是神经系统损伤引起的周围和中枢神经系统病理改变的结果，并且疼痛通常在病理治疗后仍然存在。神经性疼痛可由糖尿病、化疗、脊髓损伤、神经创伤和中风等引起。治疗策略包括通过加巴喷丁类药物减少兴奋，增加双胺摄取抑制剂的抑制，或拮抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体。 功能失调性疼痛是由除以上三种因素引起的疼痛，主要是由于机体的功能失调而引起的，如纤维肌痛、肠易激综合征和颞下颌关节紊乱等。 止痛药发现的努力是针对每种类型的疼痛量身定制的。除了关注促进有效镇痛外，疼痛药物发现工作还应关注提高治疗率和避免耐受性和强化效应。疼痛也可以分为急性和慢性。急性疼痛是由损伤或疾病引起的，与骨骼肌痉挛和交感神经系统激活有关。急性疼痛具有有用的生物学目的，一旦疾病或损伤得到治疗，疼痛就会消失。另一方面，慢性疼痛比疾病或损伤持续的时间更长，被认为是一种独立的疾病状态。慢性疼痛可能源于心理状态，没有生物学目的，没有可识别的终点，治疗需要多学科的方法。 尽管努力开发新的更安全的镇痛药，但是阿片类药物和阿司匹林等非甾体抗炎药(NSAIDs)仍然是治疗疼痛的主要药物，其他用于治疗疼痛的药物包括三环抗抑郁药(TCA)、抗惊厥药(加巴喷丁类)、NMDA受体拮抗剂和曲坦类药物。在过去的一个世纪里，对疼痛机制的理解增加了，导致了一些靶点的确定，包括受体，如α2-肾上腺素能，大麻素，γ-氨基丁酸(GABA)，5-羟色胺(5-HT)1B/D,NMDA，阿片，TRPV1和降钙素基因相关肽(CGRP)受体等；酶，如COX-2和sepiapterin还原酶和离子通道，如电压门控钠通道。目前，阿片类药物仍然是治疗急性疼痛的主要药物，因此，应继续努力开发更安全的阿片类药物。 一、 开发更安全的阿片类止疼药 阿片样受体属于7次跨膜G蛋白偶联受体(GPCR)的超家族，分为mu、kappa和delta阿片样受体(分别为MOR、KOR和DOR) 。阿片类药物是唯一被证明对治疗大多数人群疼痛有效的药物类别。然而，阿片类药物在治疗神经性疼痛方面效果较差，并且会产生诸如耐受性、成瘾性、呼吸抑制、便秘、恶心和嗜睡等不良反应。由于与阿片类药物相关的这些问题，药物的发现工作已被用于开发副作用较小的阿片类药物疗法。这些方法包括开发偏向性阿片受体激动剂，多功能阿片受体，阿片受体的变张调节剂，以及使内源性阿片肽药物化。 1.1 阿片受体变构调节剂 变构调节剂结合在受体的变构位点，可以调节正构配体与受体的亲和力以及生物学效应。变构调节剂根据其对正构位点活性的影响可以分为正变构调节剂，负变构调节剂和静默变构调节剂。正变构调节剂增强了正位位点配体的结合亲和力和/或功效，而负变构调节剂降低了正构位点配体的结合亲和力和/或功效。静默变构调节剂不对正构位点活性产生任何影响，但是它可以竞争性拮抗正负变构调节剂。 MOR的正变构调节剂可用于增强阿片激动剂如吗啡和内源性阿片的效力，并降低产生镇痛所需的剂量，因此MOR的正变构调节剂被开发用于提高疗效降低副作用。BMS-986121 ，BMS-986122和BMS-986187已报道的MOR正变构调节剂。  1.2 偏向激动剂       通常，GPCR与一个或多个异源三聚体G蛋白功能偶联，然而，现在已经证明GPCR可以介导多种信号通路，如β-抑制素信号通路。能够选择性地通过一个途径而不是另一个途径发出信号的化合物被称为“功能性选择性”或“偏倚性”激动剂。阿片样物质通过G蛋白级联和β-抑制素途径发出信号。偏向性激动剂可以优先通过G蛋白信号传导，增强镇痛，减少呼吸抑制、耐受和依赖等不良反应。MOR的偏向激动剂Oliceridine 已被批准上市，与吗啡相比，拥有更好的治疗指数。进一步增加G蛋白信号传导对β-arrestin2信号传导的偏好可能会导致新型阿片类药物治疗疼痛的发展并显著减少不良反应。 1.3 双位/二价阿片受体的配体 二价配体是含有两个药团的化合物，两个药团由大小/长度不同的连接体分开，连接体可以是刚性的或柔性的。这两种药效团可以是相同的(同二价)或不同的(异二价)。代表性分子有MDAN-21,CYM51010,NNTA和INTA等。 1.4 阿片肽类似物       阿片肽类似物主要是模拟内源性的阿片肽，其代表性结构有以下两个化合物： 二、NMDR受体拮抗剂 NMDA受体是一种配体和电压调节离子通道，位于突触后膜，几乎在所有脊椎动物突触中表达，调节Na+和Ca2+离子的通透性。NMDA受体属于嗜离子性谷氨酸受体家族(iGLuR)，在神经元发育、可塑性、和存活中起重要作用。NMDA受体的过度刺激引起高Ca2+内流，从而促进兴奋性毒性，发条现象和中枢致敏，这可能导致急性和慢性疼痛状况的发展。4因此，NMDA受体拮抗剂可用于减轻痛觉。       氯胺酮（Ketamine ）是已知的NMDA受体拮抗剂，用于治疗急性和慢性疼痛。美沙酮（Methadone），金刚烷胺（amantadine）和美金刚（memantine）也能拮抗NMDA受体，产生止痛作用。右美沙芬（Dextromethorphan）可拮抗NMDA受体并在几种慢性疼痛情况下产生镇痛作用。新型的NMDR受体拮抗剂NYX-2925 和RL-208 也被报道。 三、非甾体抗炎药       非甾体抗炎药是世界范围内使用最广泛的非处方药(OTC)和处方药。非甾体抗炎药是治疗许多炎症性疾病的首选药物，如关节炎、肌肉和关节损伤。这些药物也用于治疗一系列急性和慢性疼痛，包括轻微疼痛、月经痉挛、术后疼痛和偏头痛。非甾体抗炎药通过阻断参与前列腺素合成COX-1和COX-2的活性来产生抗疼痛作用。包括非选择性COX抑制剂，如阿司匹林，双氯芬酸，布洛芬和萘普生等。选择性COX-2抑制剂，如塞来昔布，罗非昔布和伐地昔布等。一些包含非甾体抗炎药和碳酸酐酶活性的化合物也被报道，如29和30。 四、去甲肾上腺素转运蛋白（NET）抑制剂      NET属于Na+/Cl -依赖转运蛋白家族，可以转运血清素、多巴胺、甘氨酸和GABA等。它是一种位于交感神经元上的突触前转运蛋白，参与去甲肾上腺素信号的失活，这对于防止去甲肾上腺素的不成比例的升高至关重要。因此，NET可以调节大脑中的肾上腺素能神经传递以及周围器官。NET抑制剂在多种精神疾病中发挥重要作用，包括焦虑、抑郁、精神分裂症、肥胖和慢性疼痛。    度洛西汀（Duloxetine）和米那普仑（milnacipran）是血清素（SET）转运体和NET转运体的双重抑制剂，被批准用于治疗重度抑郁症，有效缓解慢性疼痛，如纤维肌痛、骨关节炎和糖尿病性神经病变。最近，一种新的选择性NET抑制剂TAS-303和双重NET和SET抑制剂ZY-1408分别对疾病如抑郁症和压力性尿失禁有效。因此，应该继续努力筛选新型NET抑制剂治疗慢性疼痛。        除了上述四类经典的靶标外，还有一些较新的靶标处于开发状态，包括一些受体，离子通道和酶。 血管紧张素Ⅱ受体      血管紧张素II因其在肾素-血管紧张素系统(RAS)中的作用而闻名，RAS与脉管系统、心脏、肾脏和大脑有关。在多种细胞和组织类型中，血管紧张素Ⅱ以相似的亲和力结合GPCR亚型血管紧张素II 1型和2型受体(分别为AT1R和AT2R)。除了控制血压外，血管紧张素Ⅱ在神经性疼痛中起重要作用，AT1R拮抗剂和AT2R配体均产生镇痛作用，AT2R配体产生的不良效应比AT1R拮抗剂少。AT1R拮抗剂坎地沙坦(candesartan)和氯沙坦(losartan)减轻了神经性疼痛模型中的异位性疼痛和痛觉过敏。两项多中心、随机、双盲、2b期研究证实了AT2R拮抗剂EMA401对减轻疼痛性糖尿病神经病变患者疼痛强度的临床疗效。AT2R拮抗剂EMA 200和激动剂C21均可产生抗疼痛作用。目前正在研究血管紧张素 II受体的选择性激动剂和拮抗剂，以开发新型镇痛药。 降钙素基因相关肽(CGRP)受体     CGRP是一种中枢和外周作用的神经肽，具有强大的血管扩张作用的神经递质，涉及几种疼痛途径，特别是偏头痛。Erenumab(一种单克隆抗体)，由Amgen和Novartis开发，是FDA批准治疗偏头痛的首个CGRP拮抗剂(2018年)。虽然olcegepant是第一个开发的小分子高亲和CGRP受体拮抗剂，但的Ⅰ期临床试验已停止。其他小分子CGRP受体拮抗剂，如ubrogepant和rimegepant，分别于2019年和2020年获得FDA批准用于治疗偏头痛。另一种小分子CGRP受体拮抗剂BI 44370 TA。目前正在美国和欧洲进行临床试验。 溶血磷脂酸（LPA）受体       LPA是一种小溶血磷脂，含有一个磷酸甘油头基团和一个单一的脂肪酸片段，在中枢神经系统的发育和生理中起重要的作用。LPA具有高亲和力结合并激活被称为LPA受体的GPCR。LPA受体分为六个亚型(LPA1 - 6)。LPA的产生和信号传导通过作用于神经元和免疫细胞，在诱导神经性疼痛中起重要作用。因此，针对LPA受体或产生LPA的酶，可能用于神经性疼痛的治疗。事实上，据报道，LPA1和LPA3受体介导小鼠糖尿病神经性痛觉过敏和痛觉减退的发生。已确定的LPA受体拮抗剂包括Ki-16425(非选择性)和ONO-9780307 (LPA1受体选择性)。Ki-16425能阻断LPA诱导和部分坐骨神经结扎神经性疼痛模型的异动行为。使用强效LPA1受体拮抗剂BMS-986020进行的2期临床试验表明，LPA1受体拮抗剂有效治疗特发性肺纤维化;然而，研究因肝毒性而终止。化合物如49和UCM-05194是LPA1激动剂也已被在小鼠免于神经损伤(SNI)神经性疼痛模型中，显示出显著的减轻神经性疼痛的疗效。因此，阻断LPA1受体的LPA1拮抗剂和导致受体脱敏的LPA1激动剂都可以用于神经性疼痛的新型治疗。 Nav1.7 and Nav1.8 编码Nav1.7的SCN9A 基因发生沉默突变时，病人感觉不到疼痛，但具有触觉和压力敏感性，嗅觉丧失，并且对组胺引起的瘙痒没有反应，而该基因发生功能获得性突变时，患者会发生极度疼痛障碍如阵发性极度疼痛障碍和外周性红斑性肢痛症。非选择性Nav抑制剂，包括利多卡因、美西汀、和卡马西平，对慢性疼痛有临床疗效。然而，由于部分不参与疼痛信号传导Nav亚型介导的不良效应，这些药物的临床应用受到限制。例如，抑制中枢神经系统表达的Nav1.1会导致中枢神经系统相关的不良反应;抑制心肌细胞中Nav1.5可诱导不良的心血管效应。目前为止，已报到了9个亚型，即Nav1.1~1.9。选择性Nav1.7抑制剂DS1971a在小鼠中对神经结扎引起的热和机械超敏反应具有镇痛作用，其他报道的选择性Nav1.7抑制剂有PF-05089771，PF- 05150122 ，PF-05186462 和XEN402 。但是在疼痛性糖尿病周围神经病变患者的临床试验中，PF-05089771 不能减轻疼痛，但能减轻灼烧感觉。XEN402能减轻遗传性红斑性肢痛症患者的疼痛。此外，选择性Nav1.7拮抗剂GX-201的研究显示，其体内停留时间较长，对炎症性和神经性疼痛的疗效有所改善，这表明Nav1.7抑制剂在临床研究中的失败可能是由于高血浆蛋白结合或高血浆清除率等药物特性差，导致靶点占用不足。对Nav1.7抑制剂的开发应该追求部分抑制剂，因为完全消除病人对疼痛的正常反应。 由SCN10A基因编码的Nav1.8似乎在疼痛的病理生理中发挥作用，且可能会消除中枢神经系统的不良反应，因为它位于中枢神经系统外的背根神经节。Nav1.8选择性阻断剂A-803467能够削弱大鼠的神经疼痛和炎症疼痛。因此，共同靶向参与伤害性传递的Nav通道，如Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9，或开发高选择性Nav抑制剂仍然是开发新型镇痛药的可行途径。 神经紧张素（Neurotensin ） 神经紧张素结合三种受体:神经紧张素1、2和3 (NTSR1、NTSR2和NTSR3)。神经紧张素通过NTSR1/2s介导伤害性反应，例如，非选择性NTSR1/NTSR2激动剂ABS212， JMV2007， JMV2009和NT69L在啮齿动物急性疼痛模型中产生抗伤害性反应，该作用NTSR1/2拮抗剂SR48692逆转。NTSR1激动剂PD149163和NTSR1 PAM PP-001均在大鼠急性和慢性疼痛模型中产生镇痛作用。如前所述，NTSR1和NTSR2激动剂均可产生镇痛作用，然而，神经紧张素的不良反应如低温和低血压是通过NTSR1激活介导的。最近有报道选择性NTSR2激动剂JMV431在大鼠的甩尾、福尔马林和CFA试验中产生抗痛感而不诱导低温。CGX-1160是一种神经紧张素a类似物，在脊髓损伤后中枢性神经性疼痛患者的Ⅰ期临床试验中产生抗痛觉作用。因此，高度选择性神经紧张素受体激动剂仍然是开发具有低滥用潜力的新型镇痛药的可行途径。 P2X3和P2X7嘌呤受体拮抗剂       除了作为细胞代谢的主要能量来源外，三磷酸腺苷(ATP)还通过激活P2X3和P2X7嘌呤能受体调节神经传递。ATP是一种伤害性调节剂，它作用于外周和中枢增强过程，导致超敏反应。选择性P2X3受体拮抗剂A-317491，其选择性比其他P2受体高100倍以上，在炎性疼痛的CFA模型和神经损伤的CCI模型中产生抗疼痛感觉。另一方面，A-317491在有害刺激的急性伤害感觉模型中不产生抗伤害感觉，这表明P2X3受体仅在组织受伤或致敏时有反应。P2X7受体拮抗剂A-438079在类似于P2X3受体拮抗剂的致敏条件下产生抗伤性。除了P2X3和P2X7拮抗剂外，P2Y14受体拮抗剂66和67在CCI诱导的神经损伤小鼠模型中逆转了慢性神经性疼痛。P2X3、P2X7和P2Y14受体可能是开发新型非阿片类镇痛药的理想靶点。 电压门控钾Kv7通道 电压抑制的K+通道在控制神经元兴奋性中起重要作用，打开神经元Kv7通道的化合物对动作电位启动有抑制作用，因此它们在神经性疼痛中具有应用潜力。氟吡汀(Flupirtine)是Kv7钾通道的开启剂，用于治疗对非甾体抗炎药或阿片类药物难治的患者的疼痛。Kv7.2负性突变的小鼠对疼痛的敏感性强于野生型。Kv7.2抑制剂XE991会增强小鼠痛感，这种增加作用可被Kv7离子通道开启剂retigabine所挽救。其他Kv7.2离子通道开启剂如71、ICA-27243和SCR2682在啮齿动物急性伤害性疼痛模型中产生抗痛觉性。此外，在使用福尔马林试验的等密度分析研究中，观察到Flupirtine和吗啡之间的协同作用。 GPR18,35,55      与GPR18相关的信号传导机制尚未完全建立，该受体介导的生理功能尚未完全了解。已经提出了许多GPR18的激动剂，包括Abn-CBD，Δ9-tetrahydrocannabinol，O-1918，N-arachidonoyl glycine , resolvin D1 和resolvinD2。这些化合物与大麻素相关，表明GPR18可能与CB1和CB2一起被归类为大麻素受体。。PSB-CB5是通过分子建模和计算研究发现的首个有效的GPR18拮抗剂。PSB-KK-1415被发现是一种有效的、选择性的GPR18激动剂，据报道在炎症性疼痛的动物模型中发挥抗炎和抗伤害性作用。选择性GPR18配体仍然是目前项目的重点，旨在发现安全有效的镇痛药。 GPR35参与了许多疾病，如疼痛、高血压和癌症。虽然GPR35的内源性配体尚不清楚，但色氨酸代谢物kynurenic acid、2-acyl lysophosphatidic acid和趋化因子CXCL17被认为是GPR35的内源性配体。GPR35激动剂，包括bufrolin、cromolyn、lodoxamide和zaprinast。在小鼠坐骨神经损伤实验中，化合物kynurenic acid和zaprinast降低热和触觉超敏反应，增强吗啡治疗神经性疼痛的疗效。已报道的GPR35拮抗剂包括ML-145和CID2745687。鉴定GPR35的激动剂和拮抗剂不仅有助于了解GPR35的生理学，而且有助于开发新型镇痛药。 GPR55与嘌呤受体和趋化因子受体家族有关，可能是一个非典型的大麻素受体，因为它的氨基酸与两种大麻素受体CB1和CB2序列同源性较低。GPR55的第一个假定的内源性配体是磷脂溶磷脂酰肌醇，激动剂包括Abn-CBD, Δ9-tetrahydrocannabinol，2-AG，N-arachidonoylethanolamine和O-1602，拮抗剂有CID16020046 和SR141716A 。GPR55刺激产生炎症性疼痛，因此暗示GPR55是疼痛的治疗靶点。 HMGB1 HMGB1是一种没有特异性配体的炎症生物标志物，其在抗疼痛感受中的作用仍有待阐明。然而，现有证据表明，HMGB1的抑制导致异位性疼痛的减少。HMGB1抑制剂glycyrrhizin在小鼠炎症性疼痛模型中产生减轻机械异常性痛和热痛觉过敏。另一种HMGB1释放抑制剂丙酮酸乙酯，减轻了小鼠急性胰腺炎伴随的胰腺痛感过敏。目前已经开发的针对HMBG1的化合物有限，因此，药物化学应继续努力追求高选择性HMBG1抑制剂，因为这些化合物可能导致新型镇痛药的开发。 神经营养生长因子(NGF)和原溶酶受体激酶A（TrkA） NGF通过诱导痛觉过敏在疼痛信号的传递中起作用，以高亲和力与TrkA的细胞外结构域结合，并以低亲和力与75 kDa的神经营养因子受体p75结合，导致一系列事件，这些事件负责NGF的生理效应，包括其促疼痛特性。人源化抗NGF抗体RN624的 3期临床试验目前正在进行中，用于治疗骨关节炎、慢性腰痛和癌症疼痛。NGF-TrkA途径的小分子药物发现工作主要集中在开发结合NGF、拮抗TrkA受体或抑制TrkA激酶活性的化合物。化合物ALE-0540、PD90780和Ro 08-2750与NGF结合，阻止NGF与TrkA和p75的结合。第一批开发的TrkA激酶抑制剂主要是泛Trk抑制剂，具有显著的脱靶激酶活性和不良反应。pan-Trk抑制剂的例子包括103和PF-06273340(104)。这些化合物在CFA诱导的疼痛模型中显示出剂量依赖性的抗痛觉性，其疗效高于非甾体抗炎药。三个Trk亚型的x射线晶体结构从2012年开始被解决，这导致使用基于结构的药物设计开发对TrkA选择性优于TrkB和C.的化合物。Array BioPharma使用诱导拟合方法和基于结构的药物发现开发了选择性TrkA抑制剂AR786。默克公司还报道了一种选择性TrkA激酶抑制剂106，其选择性分别比TrkB和TrkC高230倍和190倍。其他尚未披露结构的TrkA选择性抑制剂包括CT340、GZ389988、vm902a和Ono-4474。抗NGF疗法在临床试验中的成功，刺激了靶向NGF-TrkA通路的发展。虽然NGF/TrkA通路产生抗痛觉的机制尚未完全阐明，但已经提出TRPV1通道、AT2R和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)受体可能参与其中因此，靶向NGF/TrkA通路和上述受体仍然是开发新型镇痛药的可行途径。 Sepiapterin还原酶（SPR）抑制剂 SPR是参与合成(6R)-L-erythro-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (BH4)的末端酶，BH4是芳香族氨基酸羟化酶、烷基甘油单加氧酶和一氧化氮合酶等酶的重要辅因子。在啮齿动物模型中，BH4水平升高与更大的疼痛和过敏有关。因此，抑制SPR可能是开发新型镇痛药的可行途径。SPR的x射线晶体结构揭示了其抑制剂Nacetylserotonin（NAS）的结合袋，这有助于SPR抑制剂的药物设计。SPRi3在神经性疼痛SNI模型小鼠中产生剂量依赖性抗触觉异动效应，并在神经性疼痛慢性CCI模型小鼠中降低机械异动。化合物108显著减轻了由板内CFA引起的热痛感过敏，并降低了炎症足部的BH4水平。其他SPR抑制剂包括109、110、QM385和被批准用于支气管哮喘的曲尼拉斯特。磺胺吡啶(Sulfasalazine)，一种FDA批准的抗炎药物，被发现通过其代谢物磺胺吡啶(113)抑制SPR活性。通过抑制SPR活性降低BH4水平是缓解神经性和炎症性疼痛超敏反应的可行方法。有趣的是，完全抑制SPR不会导致BH的过度减少，因为BH4可以通过替代途径产生。缺乏BH4会导致严重的认知迟缓、肌张力障碍、震颤和高苯丙氨酸血症。因此，靶向SPR可能导致较少的不良反应，因为没有完全阻断BH4的合成。 可溶性环氧化物水解酶(sEH)抑制剂 sEH是一种主要存在于肝脏和其他组织(如肾、肠、脑和脉管系统)中的酶，其作用是代谢或水解环氧脂肪酸(EpFAs)。EpFA是由花生四烯酸通过COX、脂氧合酶(LOX)和细胞色素P450 (CYP450)酶生成的类二十烷类前列腺素和白三烯。CYP450酶作用于长链多不饱和脂肪酸，如二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸，通过双键的环氧化作用形成EpFA。EpFA包括环氧二十碳三烯酸、环氧二十碳四烯酸、和环氧二十碳五烯酸。与COX和LOX代谢物主要是促炎不同，EpFAs主要是抗炎和促溶解。 sEH将EpFA水解为二醇，而二醇缺乏环氧化前体的活性，二醇具有高极性，易于偶联，并且快速排出。因此，sEH抑制剂阻止EpFAs的降解，从而延长其抗炎作用。其他EpFA降解途径如β-氧化，链延伸和CYP450氧化已被报道。因此，抑制sEH不会导致EpFA的积累，这将导致脱靶效应的减少。早期的sEH抑制剂(AUDA, 和AEPU)被设计为模拟sEH的天然底物，这些化合物被设计为模拟开放环氧环的假设过渡态。这些化合物具有高度亲脂性，熔点高，生物利用度差，并迅速代谢成无活性的化合物。这些先导化合物导致了新一代化合物的发展，如GSK2256294， TPPU和t-TUCB，它们更稳定，具有类似药物的性质，具有高效力，并且改善了药代动力学谱。基于TPPU结构的一系列新化合物被设计，用来寻找更多的低熔点和高水溶性化合物。其中，EC5026的效价、水溶性、熔点和半衰期得到了改善，目前正在进行治疗神经性疼痛的临床试验。 克服阿片类药物不良反应同时保持其镇痛活性的一种策略，是将低剂量高效阿片类药物与通过非阿片类受体类型发挥镇痛作用的化合物结合。这种联合疗法假定所产生的镇痛将是相加的或协同的，而副作用是降低的。理想情况下，非阿片类药物的副作用与阿片类药物不同，因此这种组合不会增加单个化合物产生的任何给定的副作用。一种非阿片类药物与阿片类药物产生协同镇痛，同时伴有较小程度的不良反应，有时被称为“阿片类药物节约”效应。这样的组合将比单独使用化合物获得更大的治疗指数。以下是一些靶点/化合物与阿片类药物联合产生协同作用：α2-肾上腺素能受体激动剂，AMPA受体，CB2受体激动剂，GABAB，加巴戊二烯类，糖皮质激素，咪唑啉I2, MAGL/FAAH抑制剂，NMDA受体拮抗剂，非甾体抗炎药，孤儿受体GPR119，P2X3和P2X7嘌呤受体拮抗剂，过氧化物酶体增殖激活受体(ppar)，代谢性谷氨酸受体(mGluR)，血清素/去甲肾上腺素再摄取抑制剂，sigma受体，S1P受体1和TRPV1。 α 2肾上腺素能受体激动剂 α2肾上腺素能受体激动剂具有良好的镇痛作用，并广泛应用于围手术期，特别是作为麻醉药和镇痛药的辅助药物。α2肾上腺素能受体有三种类型，分别是在中枢神经系统中发现的α2A和α2C，它们负责镇静、镇痛、和交感神经溶解作用，而在血管平滑肌中发现的α2B负责血管加压作用。MOR和α2肾上腺素能受体激动剂之间的协同作用是由斯波尔丁首次报道的，他观察到吗啡和可卡因定皮下注射可以相互增强。右美托咪定像其他α2肾上腺素能受体激动剂一样，减少麻醉和阿片需求，产生镇静和镇痛，并减少阿片诱导的痛感过敏。开发更具选择性的α2A或α2C肾上腺素能受体激动剂，与阿片类药物产生强大的镇痛协同作用，可进一步提高治疗指标。 大麻素CB2受体激动剂和MAGL/FAAH抑制剂 2-AG和anandamide是内源性亲脂性配体，可激活大麻素CB1和CB2受体。CB1激动剂的临床使用受到限制，因为CB1介导的不良反应(精神活性、戒断、和运动障碍)，而CB2激动剂缺乏这些与大麻素相关的不良反应。CB2激动剂LY2828360与吗啡共给药，在抑制紫杉醇诱导的机械异痛感和阻断吗啡诱导的野生型小鼠奖励中产生协同抗异痛感作用，而不产生奖励或厌恶。2-AG和anandamide分别由脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)和单酰基甘油脂肪酶(MAGL)代谢。因此，抑制这些酶可能会增强大麻素活性。URB937是一种不透脑的FAAH抑制剂，通过激活CB1减少紫杉醇诱导的异位性疼痛，并与吗啡产生协同镇痛作用，但不增强吗啡的不良反应。BIA-10−2474是一种可透脑的FAAH抑制剂，在一项I期临床试验中，出乎意料地在5名健康志愿者中产生了严重的神经系统不良反应，导致1名受试者死亡。因此需要开发不透脑的FAAH 和MAGL抑制剂。GABA受体激动剂 GABA是中枢神经系统中一种抑制性神经递质，参与许多生理过程的调节。巴氯芬(Baclofen)是一种选择性GABAB受体激动剂，临床上用于治疗偏头痛、肌肉骨骼疼痛和三叉神经痛。巴氯芬与吗啡共给药产生协同抗疼痛作用，并拮抗吗啡的奖励效应。GABAB受体的阳性变构调节剂ASP8062 可产生镇痛作用，但不良反应少于巴氯芬。因此，应进一步研究GABAB阳性变构调节剂与阿片类药物的联合使用。此外，α1 GABAA受体已被证明与苯二氮卓类药物相关的不良反应有关，而α2、α3和α5 GABAA亚型介导脊髓镇痛。PF-06372865是一种不含α1 GABAA活性的GABAA受体激动剂，可逆转啮齿动物神经性、炎症性和术后疼痛模型的病理性痛觉过敏，目前正在进行临床Ⅱ期试验。 Gabapentinoids Gabapentinoids是电压依赖性钙(Ca2+)通道辅助α2δ (α2δ−1和α2δ−2)亚基的配体，并作为该通道的阻滞剂。尽管加巴喷丁类药物在临床上用于治疗癫痫、神经性疼痛和一些超说明书用途，但关于加巴喷丁类药物急性抗痛觉的研究相对较少。关于加巴喷丁类药物与MOR的相互作用，加巴喷丁的急性抗痛觉性作用似乎是通过阿片受体介导的，因为在小鼠中使用弹尾、夹尾和热板试验，加巴喷丁的抗痛觉性作用被纳洛酮拮抗。此外，通过甩尾实验，加巴喷丁和普瑞巴林增强了吗啡和羟考酮在大鼠中的抗伤害感受作用。在一项随机对照临床试验中证实了普瑞巴林在小鼠中可减少了阿片类药物的消耗。非竞争性NMDA受体拮抗剂 阿片类药物治疗后NMDA受体的激活，可能会降低阿片类药物的镇痛作用，而NMDA拮抗剂治疗可能会增强阿片类药物诱导的抗镇痛作用。也有研究表明，阿片类药物与NMDA受体拮抗剂的联合使用增加了在神经性疼痛状态下对阿片类药物的敏感性。高选择性NMDA拮抗剂(+)-MK-801当与吗啡共给药时，可减少神经性疼痛，可减少耐受性的发展，并逆转阿片类药物耐受性。然而，使用NMDA拮抗剂与阿片类药物的治疗指标非常狭窄，不良效应如严重的拟精神效应是常见的。EU1622-1，偏向的NMDA 正变构调节剂，降低Ca2+的通透性，同时增加激动剂的效力。Sigma-1 受体拮抗剂    sigma-1受体是一种配体调节的伴侣蛋白，它调节与其相互作用的蛋白质(受体、酶)的信号传导。Sigma-1受体拮抗剂单独产生抗痛觉作用，特别是在致敏条件下，如炎症、缺血性和由神经创伤或化学损伤引的神经性疼痛。然而，与阿片类药物不同，sigma-1受体拮抗剂在没有致敏刺激的情况下不会产生抗痛觉，而只在超敏条件下产生，并将伤害性阈值恢复到正常。S1RA，一种选择性sigma-1受体拮抗剂在尾弹试验中没有作用，但增强了抗疼痛感受作用，但没有增强丁丙诺啡、可待因、芬太尼、吗啡、羟考酮和曲马多的不良反应。与S1RA联合给药阻止了吗啡耐受性和奖励效应的发展。CM304是一种sigma-1受体拮抗剂，对sigma-1受体的选择性高于sigma-2受体，比S1RA剂量依赖性地减少了CCI和顺铂神经性疼痛模型中的异位性疼痛。因此，选择性sigma-1受体拮抗剂联合阿片类药物有可能作为神经性疼痛、炎性疼痛和术后疼痛的联合疗法。 5-羟色胺(5-HT) 去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)和5-HT1A激动剂 神经递质去甲肾上腺素和5-羟色胺在抑制脊髓伤害性刺激中起重要作用。milnacipran是一种SNRI，剂量依赖性地减少了大鼠术后疼痛模型中的超敏反应，并与吗啡具有协同相互作用。此外，阈下浓度的DAMGO(阿片激动剂)和5-HT显著降低GABA能微型抑制性突触后电流频率，提示联合治疗的镇痛效果.最近，compound 133，一种强效和选择性5-HT1A激动剂，在福尔马林和热平板试验中产生镇痛作用。因此，应该进一步研究MOR和选择性5-HT1A激动剂的联合治疗，因为这些联合治疗可能会降低MOR激动剂产生的奖励效应，耐受性和呼吸抑制。 靶向参与阿片信号传导的细胞内蛋白 G蛋白信号(RGS)调控因子蛋白与G蛋白的活化G-α亚基结合，增强其GTPase活性，加速其返回至无活性G-α- GDP状态，导致信号终止。有超过30种RGS蛋白，包括RGS9-2和RGS4，已被证明以激动剂依赖的方式调节阿片样物质的作用。此外，下调RGS蛋白RGSz1导致镇痛效果增强，并降低阿片类药物的奖励作用。噻二唑烷酮(TDZDs)通过共价修饰RGS蛋白中半胱氨酸残基来抑制RGS- g -α相互作用，其中CCG-203769和CCG-50014是对RGS4最有效的抑制剂。RGS同工异构体的瞬时半胱氨酸暴露机制不同，这可能对下一代RGS抑制剂的合理设计有潜在的帮助。因此，开发RGS蛋白的小分子抑制剂可能是发现减少阿片类药物不良作用的新疗法的可行途径。热休克蛋白90(Hsp90)是多种蛋白质的激活和稳定所必需的伴侣蛋白，抑制热休克蛋白90已被证明可以减少阿片类药物依赖和戒断的躯体体征。应进一步研究Hsp90调节剂用于阿片类药物协同治疗，以减少阿片类药物的不良反应。此外，信号激酶如ERK1/2、JNK MAPKs和p38 MAPK的激活可能在阿片类药物诱导的耐受、依赖、痛觉过敏/异常性疼痛和便秘以及KOR相关的厌恶和烦躁不安的不良反应中发挥作用。MOR或KOR激动剂与RK、JNK或p38抑制剂联合治疗可提高阿片类药物的治疗指数。然而，由于这些信号激酶广泛表达并参与许多生物过程，它们的抑制可能会增加非阿片类药物不良反应的风险。专注于阿片样物质细胞内信号蛋白调节剂的药物发现工作应该考虑筛选化合物的毒性。 双作用或多功能阿片配体 利用联合治疗的一种有效方法是设计对MOR和其他非阿片类疼痛靶点具有双重或多功能活性的化合物。Tapentadol是美国FDA批准的第一种同时具有MOR激动剂和SNRI活性的中枢作用镇痛药,由于具有双重作用模式，它被用于治疗中度至重度急性和慢性非癌性疼痛和神经性疼痛。Cebranopadol和compound 138是痛感肽/孤儿蛋白FQ肽(NOP)和MOR受体激动剂，在啮齿动物急性和神经性疼痛模型中显示出治疗急性和慢性疼痛的疗效。另一种化合物EST73502是一种MOR激动剂和sigma-1受体拮抗剂，在急性和慢性疼痛动物模型中具有与羟可酮同等的镇痛活性。与羟考酮相比，化合物139产生更少的阿片类戒断症状和肠道转运抑制化合物140，一种TRPV1拮抗剂和MOR激动剂双配体在小鼠福尔马林实验中产生抗伤害感受作用。Mitragynine，已被证明与阿片肾上腺素能和血清素能受体结合,通过甩尾试验在小鼠中产生抗疼痛感觉。因此，除了已知介导疼痛信号的受体靶点外，靶向MOR的双重或多功能配体仍然是开发新型镇痛药的可行途径。 阿片类药物是用于治疗疼痛的主要药物类别，过度使用阿片类药物治疗疼痛已导致阿片类药物过量危机。因此，需要新的镇痛药或治疗策略来遏制持续的阿片类药物流行。疼痛药物发现的一个主要挑战是缺乏适当的人类疾病的临床前替代模型。例如，像甩尾试验这样的急性抗触感试验测量的是啮齿类动物的反射行为，而不一定是抗疼痛感。此外，神经性疼痛模型的损伤后时间(约14天)不能恰当地反映人类的神经性疼痛。如果没有合适的疼痛模型，药物研发工作将受到阻碍，因为大多数候选药物通常在临床前阶段表现出良好的镇痛效果，副作用较少，但在临床试验中产生的效果与安慰剂相似。因此，非常需要适当的临床前疼痛模型。 目前正在进行临床疼痛试验的非阿片类候选药物包括：χ-conopeptide，一种选择性变抗NET抑制剂;CGX-1160，一种神经紧张素a类似物;BI44370 TA, CGRP受体拮抗剂;EC5026，一种sEH抑制剂。许多化合物和联合疗法仍处于临床前阶段。以非阿片类药物为目标将有助于克服与阿片类药物相关的滥用倾向、耐受性和呼吸抑制。与MOR激动剂相比，作用于非阿片类靶点的化合物的主要挑战是获得的镇痛效果较差。因此，针对导致特定疼痛的多种机制类型可能有助于提高镇痛效果。 综上所述，镇痛药物开发的重点是开发具有低滥用潜力的化合物。为了克服这一挑战，必须努力开发更安全的阿片类药物，减少滥用风险，或采用联合疗法等治疗策略，允许使用较低剂量阿片类药物，从而减少阿片类药物的相关不良反应。最后，努力已经并将继续关注开发具有与阿片类药物相似或更有效的非阿片类药物作用机制的新型镇痛药，这将在急性和慢性疼痛的治疗中是无价的。参考文献：Novel Approaches, Drug Candidates, and Targets in Pain Drug Discovery END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 OTC2024类器官前沿应用与3D细胞培养论坛圆满落幕，点击图片可查看会后报告，咨询OTC2025类器官论坛请联系：王晨 180 1628 8769

摘要：多发性骨髓瘤（MM）是一种以骨髓中浆细胞积累为特征的血液系统癌症。尽管治疗取得了进展，但大多数患者中的MM仍然无法治愈。与MM相关的免疫失调促进了疾病的进展，这促使研究者探索免疫疗法来对抗这种疾病。免疫疗法研究的一个领域是设计骨髓瘤疫苗疗法，以逆转与肿瘤相关的免疫抑制，并引发针对肿瘤的特异性免疫反应，有效地针对MM细胞。本文回顾了MM的疫苗免疫疗法，按抗原类型和递送方法对研究结果进行分类。抗原包括特异性抗原（Id）、肿瘤相关抗原（TAA）、肿瘤特异性抗原（TSA）和整个肿瘤裂解物。到目前为止，骨髓瘤疫苗在临床上显示出有限的疗效。然而，进一步的研究至关重要，以优化各个方面，包括抗原和患者选择、疫苗的时机和顺序，以及与新兴MM治疗的合理组合。 1.引言 多发性骨髓瘤（MM）是一种血液系统恶性肿瘤，其特征是克隆性浆细胞在骨髓（BM）中积累，并分泌单克隆免疫球蛋白，导致被称为CRAB（高钙血症、肾功能不全、贫血和骨病变）的特征性症状。尽管出现了许多新的治疗方法显著改善了治疗效果，但MM在很大程度上仍然无法治愈，对于大多数晚期患者来说，这种疾病仍然是致命的。越来越多的研究关注于利用宿主免疫系统针对MM细胞的免疫疗法。由于抗原呈递无效和效应细胞功能障碍，MM与免疫失调相关，创造了一个促进疾病进展的免疫抑制环境。研究的一个领域是设计骨髓瘤疫苗疗法。癌症疫苗接种是一种旨在激活免疫系统以识别和对抗癌细胞的治疗性方法。这些疫苗可以作为预防措施，称为预防性疫苗，或者作为已经诊断出癌症的个体的治疗选择，称为治疗性疫苗。任何癌症疫苗所针对的抗原的选择对其临床效果至关重要。肿瘤抗原被分为两大类：肿瘤相关抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSAs）。TAAs是自身抗原，它们在肿瘤细胞中要么优先表达，要么异常表达，但也可能在正常细胞中以某种水平存在。TSAs，也称为新抗原，包括仅由癌细胞编码的抗原，并且是肿瘤特异性的，能引发高亲和力T细胞反应。疫苗被分为共享和个性化疫苗。共享抗原是公共抗原，可以由相对常见的人类白细胞抗原（HLA）等位基因在患者中呈递。这些疫苗是现成的免疫疗法的有希望的候选者。另一方面，个性化癌症疫苗由于高通量基因测序、质谱（MS）和生物信息学的进步而最近获得了更多的关注，这些技术使得能够识别HLA结合肽和预测独特的个性化新抗原。此外，癌症疫苗可以通过各种平台递送，如肽疫苗、RNA疫苗、DNA疫苗、病毒疫苗和抗原呈递细胞（APC）/树突细胞（DC）疫苗。如今，大多数正在临床研究中的疫苗涉及递送肿瘤抗原与佐剂或其他共刺激因子的组合。佐剂是癌症疫苗的重要组成部分，因为它们通过激活先天免疫途径来增强免疫反应。各种佐剂，如Toll样受体（TLR）激动剂和细胞因子被用来提高癌症疫苗的效果。有关癌症疫苗的更详细信息，请参考文献3-7。本文旨在回顾针对MM的疫苗免疫疗法的主要发现，根据抗原类型及其递送方式（无论是肽、蛋白质、DNA或DC基础疫苗）进行分类。讨论的肿瘤抗原包括特异性抗原（Id）、TAA、TSA和整个肿瘤裂解物。在MM中，恶性浆细胞分泌含有称为Id的肿瘤特异性抗原决定簇的单克隆免疫球蛋白（副蛋白）。Id是通过B细胞成熟和体细胞超突变期间的基因重排形成的。尽管Id抗原是TSA的一个子集，但由于研究针对骨髓瘤Id抗原的疫苗的历史意义，本综述中包括了对这些抗原的专门部分。 2.特异性疫苗 2.1.基于Id蛋白/肽或DNA的疫苗 Id疫苗的最初研究之一可以追溯到1995年Kwak等人的一项研究，他们用接受者血浆中的骨髓瘤免疫球蛋白免疫了一个健康的兄弟姐妹BM供体。检测到淋巴增殖反应，恢复了对骨髓瘤Id具有独特特异性的接受者CD4+ T细胞系，这证明了用Id免疫可能代表一种增强特异性抗肿瘤效应的新策略。后来，更多的研究调查了Id疫苗作为治疗策略的潜力。一组I-III期MM患者接受了用明矾作为佐剂的自体血清M组分的重复免疫。虽然在三名患者中成功，但引起的免疫反应幅度适中且短暂。随后的研究引入了免疫原性载体蛋白，如钥孔帽螺血蓝蛋白（KLH）或丝状噬菌体，单独或与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素（IL）-2、IL-12等佐剂一起使用，以增强Id蛋白的抗肿瘤免疫。尽管这些策略能够引起肿瘤特异性免疫反应，但临床反应适中。例如，在Osterborg等人的研究中，Id疫苗与GM-CSF一起用于五名II期MM患者。所有患者都发展了Id特异性T细胞免疫，但只有一名个体的M组分浓度显著降低。Massaia等人用KLH和低剂量的佐剂细胞因子GM-CSF或IL-2对接受高剂量化疗（HDT）后最小残留病（MRD）的患者进行了疫苗接种。在75%的患者中记录了特异性T细胞反应，但没有减少肿瘤负担。另一项研究探讨了在HDT和外周血祖细胞输注后的第一个缓解期使用与KLH结合的特异性蛋白和低剂量GM-CSF作为维持治疗。回顾性病例匹配分析显示，疫苗组和用干扰素（IFN）-α和/或地塞米松作为维持治疗的对照组之间的生存和无进展生存（PFS）持续时间相似。 在非随机的I期临床试验中，更多的努力被投入到研究基于Id DNA的疫苗，该疫苗编码患者特异性的单链可变片段，或将Id与破伤风毒素的片段C（FrC）链接。14名患者接受了至少在自体干细胞移植（ASCT）/高剂量治疗（HDT）后6个月开始的疫苗接种。在为期52周的研究期间，10名患者（71%）的血清副蛋白无法检测到、减少或保持稳定，而11名患者（79%）维持了持续的完全反应（CR）/部分反应（PR）。此外，对于13名患者，中位无进展生存期（TTP）为38.0个月。然而，由于之前的ASCT/HDT，很难区分疫苗效果和延迟治疗反应，因为在疫苗接种开始后，7名、6名和1名患者已经分别达到了CR、PR和稳定病状（SD）。在Qazilbash等人最近发表的一项研究中，采用了另一种Id疫苗接种策略。在这项随机的2期试验中，采用了初免和增强策略，通过收集已经用患者特异性Id-KLH在体内初免的T淋巴细胞，然后使用CD3/CD28磁珠在体外激活这些T细胞，并在HDT和自体造血干细胞移植（AHCT）后重新注入这些细胞，并随后增强剂量的指定疫苗。尽管疫苗引发了持续至+180天的强烈免疫反应，但与仅接种KLH的对照组相比，接种Id-KLH的组别在临床上没有益处。表1显示了使用Id蛋白/肽或基于DNA的Id疫苗的试验总结。 2.2.基于DC的Id疫苗 专业的APCs，DCs，在启动和调节先天和适应性免疫反应中发挥着关键作用。通过利用它们增强宿主效应器和记忆CD8 T细胞反应的能力，这些反应对于抗肿瘤免疫至关重要，DC疫苗已成为癌症免疫疗法的主要策略之一。DC疫苗首次在MM的Id抗原背景下进行了测试。历史上，基于Id的DC疫苗在MM试验中已经测试了十多年，但没有明确的临床益处。已经提出了几种优化方法，用于生成、给药途径和疫苗接种的时间。原始方法涉及从通过白细胞分离术收集的外周血液中分离DCs，随后进行密度梯度离心。随后，添加细胞因子，即GM-CSF和IL-4，成为培养要么粘附的单核外周血细胞，CD34+或CD14+细胞的标准实践。在Id脉冲后提出了各种成熟方案以增强有效性，包括单独暴露于肿瘤坏死因子α（TNF-α），TNF-α和IL1-B，CD40配体或TNF-α、IL-6、IL-1和前列腺素E2的组合。研究了不同的疫苗接种途径，包括皮下、皮内、静脉内和淋巴结内。在I/II期试验中，Curti等人比较了通过顺序皮下和静脉内途径的Id脉冲DCs。每位患者都作为自己的对照，接受顺序皮下和静脉内给药。结果表明，皮下给药诱导了更强的T细胞反应，表明其在引发免疫反应方面比静脉输注重建。此外，疫苗在不同的患者群体中进行了测试，包括晚期骨髓瘤患者，化疗后的患者，未经预处理的个体，在ASCT后肿瘤负担较低的患者和冒烟型骨髓瘤（SMM）。如上所述，尽管付出了巨大努力，基于Id的DC疫苗并未产生令人满意的临床结果。Wen等人在1998年进行的一项研究是对DC基础Id疫苗针对MM的首批试验之一，涉及一名43岁的晚期难治性骨髓瘤患者。通过一系列密度梯度离心从单核细胞中分离出DCs。尽管临床反应有限，但这项研究通过产生Id特异性免疫反应，证实了体外生成的骨髓瘤DCs的功能能力。后来，通过对DC生成的一些优化，通过培养粘附的单核细胞与GM-CSF和IL-4等细胞因子。在1999年，两名晚期难治性MM患者接受了用Id抗原和KLH装载的自体DC疫苗，并以GM-CSF作为佐剂。结果表明，两名患者都发展了Id特异性T细胞增殖反应，其特征是产生干扰素γ（IFN-g）。然而，在这两名病例中没有临床益处。尽管如此，考虑到这些患者患有晚期疾病，预计疫苗可能不会对这一特定群体产生最佳效果。因此，对免疫系统受损较小或肿瘤负担较低的患者群体进行了额外的试验，预期这可能会增强疫苗的效果。六名早期/早期复发的骨髓瘤患者接种了自体DCs（静脉内）准备如前述研究并装载Id抗原和KLH。然而，只有3名患者的Id血清水平稳定期，2名患者在疫苗接种后疾病进展。在另一项研究中，在26名预期肿瘤负担较低的患者中，在HDT和外周血祖细胞移植（PBPCT）后测试了基于DC的Id疫苗。值得注意的是，只有四名患者发展了Id特异性增殖性T细胞反应。这些免疫反应者中有三名在疫苗接种时处于CR状态。在移植后平均随访30个月，共有17名患者存活。这些发现表明，较低的肿瘤负担可能导致更好的免疫反应。然而，由于缺乏对照组进行比较，将这些结果完全归因于疫苗是具有挑战性的。还在未经治疗的I期患者中进行了基于DC的Id疫苗接种的调查。在这项试验中，九名患者接受了用Id和KLH脉冲的自体单核细胞衍生的DCs。疫苗在56%的患者中导致了T细胞增殖。与其他研究一样，临床反应适中，三名患者的M蛋白略有减少。 为了增强基于DC的Id疫苗的效力，对DC生成进行了优化。在早期的基于DC的疫苗接种研究中，未成熟的DCs被脉冲抗原。然而，未成熟的DCs激活T细胞的能力次优。因此，引入了在成熟诱导细胞因子存在下暴露于抗原的DCs。这首先在5名在HDT后稳定部分缓解的患者中进行了测试。此外，有人建议将给药途径从静脉内改为皮下，以克服与静脉内疫苗接种相关的潜在限制，例如DCs可能在肺、肝和脾等器官中的积累。即使对DC生成进行了修改，并将给药途径转移到皮下，临床效益仍然不明显。此外，将临床反应仅归因于DC疫苗仍然具有挑战性，特别是考虑到化疗/自体HCT后四个月开始的时机。 尽管探索了DC生成、给药途径、疫苗接种时机以及添加免疫原性载体蛋白/佐剂的优化，但未观察到显著结果。Bendandi等人假设缺乏临床意义可能是由于从MM患者获得的DC在数量和质量上的缺陷。因此，他们进行了一项试点研究，其中4名MM患者接受了异体树突细胞（alloDC）随后是Id-KLH。疫苗仅诱导了可检测的抗KLH效应T细胞和B细胞反应，而没有诱导针对肿瘤特异性Id的T细胞增殖。从临床角度来看，结果并不令人印象深刻，一名患者在停止疫苗接种后出现SD，而其中3名患者在研究随访期间进展。表2显示了在MM中使用基于DC的Id疫苗的试验总结。 3.肿瘤相关抗原 3.1.基于肽的TAA疫苗 尽管Id疫苗能诱导可检测的免疫反应，但未能显示出临床效力。这可能归因于高水平循环Id蛋白对T细胞的抑制作用，导致耐受性，以及Id蛋白本身是一个弱抗原的事实。作为Id疫苗的替代品，开发了具有TAA的疫苗。在临床、临床前和体外环境中研究了多种TAA在MM中的作用，如Mucin-1（MUC1）、透明质酸介导的运动受体（RHAMM）、B细胞淋巴瘤2（BCL-2）家族、Wilms肿瘤1（WT1）、X盒结合蛋白1（XBP1）、syndecan-1（CD138）、CS1（SLAM7）、癌症睾丸抗原（CTA）、Dickkopf-1（DKK1）、甲基丙二酸半醛脱氢酶（MMSA-1）、热休克蛋白（HSP）、端粒酶逆转录酶（hTERT）和Survivin。表3显示了在MM中使用TAA作为抗原的试验总结。 糖蛋白MUC1存在于包括MM在内的各种癌症中。ImMucin，一种21肽合成长肽疫苗，在15名骨髓瘤患者的I/II期研究中进行了测试。ImMucin诱导了显著的T细胞反应，并增加了针对MUC1的抗体滴度。然而，临床效力次优，中位PFS为17.5 ± 3.9个月。 RHAMM衍生的肽R3在I/II期研究中作为另一种潜在的血液学恶性肿瘤的免疫原性抗原进行了调查，包括MM。在10名HLA-A2阳性患者中进行的300 mg疫苗的初步研究，包括4名MM患者，显示出积极的临床和免疫学反应。在接受300 mg疫苗的MM患者中，3/4显示出特异性CD8+ T细胞增加，2/4显示出克隆标记减少。然而，有限的样本量需要谨慎得出明确结论。 BCL-2家族蛋白在1期试验中作为MM的另一个靶标抗原进行了研究。复发的MM患者接受了与montanide ISA-51作为佐剂混合的Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1肽的疫苗接种，以及bortezomib。由于肽HLA限制，患者根据他们的HLA-A阳性性接受肽，即HLA-A1、HLA-A2和/或HLA-A3。在7名患者中，3名显示出与基线（疫苗接种前）相比的疫苗诱导的肽抗原特异性T细胞反应。然而，小样本量阻碍了对临床效力的结论性评估。与儿童肾肿瘤Wilms肿瘤相关的WT1基因，作为癌基因和某些正常细胞过程的关键组成部分，发挥着双重作用。它在造血恶性肿瘤和实体癌中高度表达，包括骨髓瘤，其表达随着疾病进展而增加。研究已经鉴定了WT1中的各种表位，可以以人类HLA限制的方式引发WT1特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。因此，基于WT1肽的免疫疗法可能是恶性疾病患者的一个选项。在Tsuboi等人的案例研究中，一名57岁的耐化疗MM患者每周接受HLA-A*2402限制的9肽WT1肽和montanide ISA51作为佐剂的皮内疫苗接种。疫苗接种后，骨髓癌细胞减少了60%，尿液M蛋白水平从3.6降至0.6 g/天。此外，C-X-C趋化因子受体类型（CXCR）4阳性细胞有显著变化，表明WT1特异性CTLs有效地迁移到肿瘤部位。 为了应对单一抗原肽疫苗的局限性，包括潜在的抗原逃逸和目标抗原的下调，还研究了多肽疫苗。PVX-410是一种基于肽的疫苗，由来自XBP1、CD138和CS1三个不同抗原的4个9肽组成。在一项研究中，22名中度至高风险HLA-A2阳性的SMM患者接受了PVX-410皮下注射和佐剂poly-ICLC，有或没有lenalidomide。PVX-410一致地产生了特定、持久的免疫反应，特别是与lenalidomide一起使用时。然而，总体临床反应仍然适中。单独使用时，所有患者的最佳反应为SD，其中5/12在12个月内进展。在联合治疗组中，一名患者实现了PR，四名患者有最小反应或SD。 DKK1、MMSA-1和HSP作为TAA被研究，它们有潜力作为针对MM的疫苗疗法。DKK1，一个Wingless相关整合位点（Wnt）/β-连环蛋白信号抑制剂，能诱导肽特异性CTLs，这些CTLs能识别并溶解表达HLA-A0201的骨髓瘤细胞。MMSA-1是一种在MM细胞中特异表达的膜蛋白。当与DKK1结合在疫苗中时，它以HLA-A0201限制性方式增强CTL反应，改善存活，并在临床前模型中减轻骨破坏。肿瘤细胞衍生的HSPs，如gp96，已被作为小鼠骨髓瘤的TAA进行研究。来自已建立的小鼠骨髓瘤细胞系的混合HSPs，显示出作为现成疫苗的潜力，有效治疗具有大骨髓瘤肿瘤负担的小鼠，HSP与抗B7H1或抗-IL-10单克隆抗体结合使用。然而，需要进一步的研究来确认它们在临床环境中的效力。 此外，最初在黑色素瘤患者中发现的CTA抗原，由于在正常组织上的有限表达，成为免疫疗法的靶点。Andrade等人的研究表明，骨髓瘤细胞上表达超过六个CTA抗原具有预后价值，与MM患者的较短总生存期（OS）相关。像NY-ESO-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3和MAGE-C1（CT-7）这样的突出CTA抗原已显示出刺激T细胞反应的潜力，使它们成为癌症免疫疗法的候选者。在CTA抗原中，MAGE-A3已在临床环境中进行了测试。在一个案例研究中，一个健康的捐赠者，即患者的同卵双胞胎，用MAGE-A3蛋白和AS02B作为佐剂进行免疫。在同种异体外周血干细胞移植后，将 primed捐赠细胞转移到患者体内。随后，患者接受了额外的MAGE-A3免疫接种，以及第二次外周骨髓单个核细胞输血。MAGE-A3免疫接种耐受性良好，并在两个双胞胎中产生了强大的MAGE-A3特异性抗体、CTLs和T辅助细胞反应。有趣的是，CTL反应针对一个以前未知的HLA-A*6801结合MAGE-A3肽，该肽在最后一次免疫接种后在患者体内保持可检测超过一年。检测到多个T辅助细胞反应，主要反应针对HLA-DR11限制的MAGE-A3表位。令人鼓舞的是，患者在第二次移植后2.5年仍处于缓解状态。这个案例研究表明，这种个性化的免疫治疗方法对MAGE-A3阳性MM患者具有潜在的疗效。在另一项II期研究中，评估了使用MAGE-A3多肽疫苗结合Poly-ICLC和GM-CSF在体内初次免疫，然后体外扩增的自体T细胞的安全性和效力，在27名骨髓瘤患者中。疫苗包括两个HLA-A2限制的类I表位和一个多类II表位。结果显示，在8名可评估的HLA-A2+患者中有7名检测到MAGE-A3特异性CD8 T细胞。此外，在25名患者中有19名产生了能产生细胞因子的疫苗特异性T细胞。2年OS为74%，2年无事件生存期（EFS）为56%。Cohen等人进行了类似的研究，其中13名MM受试者在接受ASCT前后以及早期SCT后疫苗初次自体淋巴细胞输注，接受了重组MAGE-A3和AS15免疫刺激剂。组合免疫疗法在所有受试者中产生了高滴度的体液免疫和持久且强大的抗原特异性CD4+ T细胞反应。然而，中位PFS为27个月，中位OS未达到，表明与标准护理没有差异。 在临床前环境中测试的其他CTA已被建议作为MM的可能免疫疗法靶点。自发的NY-ESO-1抗体和特异性CD8+ T细胞已在NY-ESO-1阳性MM病例中体内检测到。在临床前模型中，研究了一种名为NACH的复杂疫苗，该疫苗基于NY-ESO-1-alum-CpG ODN-HH2。NACH疫苗中使用的Alum-CpG ODN-HH2组合佐剂是一种新型免疫佐剂。疫苗在小鼠MM的预防和治疗模型中显示出有希望的抗肿瘤效果和免疫原性。NACH疫苗抑制了肿瘤生长，在小鼠中显著延长了存活时间。在治疗模型中，接受NACH疫苗的10只肿瘤小鼠中有7只存活至第90天，而对照组的所有小鼠在40天内死亡。LAG-1a是另一个在MM患者中经常表达的CTA抗原，与NY-ESO-1共享高mRNA序列相似性。In silico分析确定了在LAG-1a和NY-ESO-1中存在的七个肽段，这些肽段被不同肿瘤的T淋巴细胞识别。因此，假设针对NY-ESO-1的疫苗可能对表达LAG-1a但不表达NY-ESO-1的肿瘤的MM患者有益。MAGE-C1、SPAN-Xb和SP-17是其他能够引发CTL反应的CTA抗原，使它们成为基于疫苗的免疫疗法MM的靶点。 与Id疫苗类似，基于肽的肿瘤-TAA疫苗的实际应用到临床实践中尚未发生。Rapoport A.P等人的研究比较了54名MM患者中称为hTERT的端粒酶复合体的限速催化亚单位和抗凋亡蛋白Survivin作为目标抗原疫苗与肺炎球菌结合疫苗的免疫原性。HLA-A2阳性的患者（包括任何A2等位基因）被分配到A组，他们接受了hTERT/Survivin疫苗。研究表明，尽管这种多肽肿瘤抗原疫苗的免疫反应频率高于报道的Id疫苗，但TAA仍未达到微生物疫苗所诱导的水平。这表明，为了获得显著的长期临床益处，可能需要对癌症疫苗产生更大规模的免疫反应。 3.2.基于DC的TAA疫苗 使用与肿瘤相关抗原(TAA)相关的基于树突状细胞(DC)的疫苗也被视为替代Id抗原的选择。对12名至少接受了诱导化疗和造血细胞移植/自体造血干细胞移植(HCT/ASCT)后获得最小部分缓解(PR)的II期或III期骨髓瘤患者进行了疫苗接种。通过电穿孔法用MAGE3、Survivin和BCMA装载粘附的CD14+细胞生成DCs，并与或不与KLH一起脉冲。值得注意的是，所有患者都产生了强烈的抗KLH T细胞反应，这表明在高剂量美法仑治疗后免疫恢复，并且在两名患者的迟发型超敏反应活检中检测到了疫苗特异性T细胞。在最后一次随访时，12名患者中有10名在第一次接种后平均25个月（范围9-53个月）仍然存活。在这些患者中，5名病情稳定(SD)，5名病情进展。在另一项研究中，进行了DC的mRNA电穿孔，使用装载有CT7、MAGE-A3和WT1的朗格汉斯DC。这些从CD34+造血前体细胞衍生的朗格汉斯型DC被认为是体外对肿瘤抗原的CTLs更具潜力的刺激因子，与单核细胞衍生的DC相比。患者被随机分配在ASCT后100天内接受疫苗或被放置在没有疫苗的对照组。虽然该研究没有足够的能力来评估临床疗效，但治疗反应倾向于接受疫苗的组。在最近发表的一项研究中，Locke及其同事设计了一种针对抗凋亡蛋白Survivin的基于DC的疫苗，在1期临床试验中。通过腺病毒载体工程化DCs以表达包含两个突变的全长Survivin版本(Ad-S)，这些突变中和了野生型Survivin的抗凋亡功能。13名新诊断的MM患者，他们没有通过诱导治疗获得CR，接种疫苗的时间是在干细胞收集前7到30天，以及在ASCT后20到34天。疫苗与ASCT联合使用耐受性良好，仅观察到轻微的不良反应。值得注意的是，85%的患者表现出针对Survivin的T细胞反应或抗体反应。7名患者在第+90天表现出增强的临床反应，所有这些都与Survivin特异性免疫反应相关。令人印象深刻的是，在平均4.2年的随访后，这7名患者中有6名保持无病状态。估计的四年无病生存(PFS)为71%，超过了IFM 2009试验的历史数据，该数据大约为4.1年时PFS为50%，针对这类患者群体。Survivin已成为MM中一个显著的TAA。在8项正在进行的MM试验中，有两项专注于开发针对Survivin的疫苗。其中一种疫苗名为TXSVN，它使用了一种减毒的活沙门氏菌株，经过遗传改良以产生Survivin。第二种疫苗是一种基于肽的配方，称为SVN53-67/M57-KLH，源自Survivin蛋白(表4)。 4.肿瘤特异性抗原 4.1.基于肽的TSA疫苗 尽管某些关于TAA的研究显示出希望，但由于每个临床试验中患者数量有限，总体评估具有挑战性。需要对更大的队列进行进一步研究，以得出关于基于TAA的免疫疗法疗效的确定性结论。此外，由于它们作为非突变的自身抗原的地位，一般来说TAA可能表现出低免疫原性，这归因于中枢T细胞耐受的影响。因此，TSA，也称为新抗原，似乎是疫苗免疫疗法的另一种靶标抗原。癌细胞中的体细胞突变可以产生新的蛋白质序列，这些序列可以被APCs作为新抗原呈现给宿主免疫系统。肿瘤新抗原是免疫疗法的极好靶标，因为它们在癌症组织中特异性表达。通过下一代测序，在184名MM患者中识别出的新抗原景观，揭示了在复发患者中的NRAS、KRAS和干扰素调节因子4(IRF4)基因中共享的新抗原，以及在新诊断患者中的KRAS，支持在具有此类突变的MM患者中使用基于新抗原的疫苗的可能性。在MAPK途径中的扰动，特别是KRAS、NRAS和BRAF中的突变，在相当一部分MM病例中观察到，RAS突变在多达70%的复发/难治性病例中被检测到。这些与MAPK激活相关的突变，可能会影响预后，有助于从前期状况向骨髓瘤的转变，以及从髓内到髓外疾病的转变，随着疾病的进展，其患病率越来越高。针对共享的新抗原，如与RAS突变相关的新抗原，正在临床试验中探索，例如我们小组正在进行的研究，使用TG01癌症疫苗在高风险SMM或MM患者中(表4)，在≥1线治疗后有可测量疾病。TG01由7种合成肽组成，模仿RAS蛋白的突变形式，在胰腺癌患者中显示出有希望的结果。TG01研究的主要终点是安全性，关键的次要终点包括对疫苗的免疫反应、总体反应率、OS和PFS。 另一种基于新抗原的疫苗是PGV-001。PGV-001是一种个性化的基因疫苗，针对基于患者HLA分型的多达10个预测的个人肿瘤新抗原。在辅助治疗环境中测试了PGV-001，包括3名接受了ASCT的MM患者在内的13名多种癌症类型的患者。疫苗肽在27周的过程中与聚肌胞（poly-ICLC）和破伤风辅助肽一起给药。一名患者失去了随访，但在剩下的12名患者中，平均随访了925天，其中四名没有疾病证据，四名接受了后续的治疗线，四名已经去世。值得注意的是，只有两名去世的患者有记录的恶性肿瘤复发。这篇摘要中没有描述患者的详细信息以及他们中哪些是MM患者。免疫监测免疫原性正在进行中。然而，初步分析表明诱导了针对新抗原的CD4和CD8 T细胞扩增。 如前所述，TSA由于缺乏胸腺选择和中枢耐受，可以激活高亲和力T细胞。尽管对Id有显著的关注，但由于其在骨髓瘤中的丰富性，显示出有限的临床疗效，对骨髓瘤中除了Id之外的其他新抗原的研究仍然有限。进一步的研究对于评估它们作为骨髓瘤疫苗治疗中的靶标抗原的潜力至关重要。 5.整个肿瘤抗原 5.1.基于DC的疫苗 单一抗原特异性疫苗容易受到因抗原表达下调而导致的免疫逃逸的影响。或者，也探索了整个细胞靶标作为一种策略，该策略寻求建立多克隆免疫反应。这样的疫苗可能包括广泛的抗原，包括新抗原。这在骨髓瘤中特别相关，因为存在大量的肿瘤突变负担。对664名新诊断的骨髓瘤患者的研究发现，每个患者的平均体细胞和错义突变负荷分别为405.84和63.90个突变。突变和新抗原负担之间存在正相关。此外，高剂量美法仑治疗，这是ASCT前的标准治疗，与高突变负担相关，并且可能在骨髓瘤患者的复发时有更多的新抗原。 Rosenblatt等人通过化学融合患者衍生的骨髓瘤细胞与自体DCs开发了一种肿瘤疫苗。这种疫苗的优势在于可能在DC介导的共刺激的背景下呈现多样化的骨髓瘤相关抗原。融合细胞是通过将DCs和骨髓瘤细胞与聚乙二醇共培养而创建的。在17名患者中测试了DC融合疫苗，其中大多数患有晚期疾病。疫苗接种耐受性良好，并在大多数评估的患者中导致与患者自己的骨髓瘤细胞反应的淋巴细胞扩增，以及记录的体液反应。晚期疾病的患者经历了疾病稳定，三名患者在12、25和41个月时分别显示持续的SD。在当前研究中，调节性T细胞水平在疫苗接种期间保持稳定。同一疫苗在ASCT后的患者中进一步测试，假设自体移植为融合疫苗提供了一个最佳环境，因为肿瘤细胞减少和调节性T细胞耗竭导致的免疫环境增强。该研究取得了有希望的结果，47%的患者实现了CR/近CR（nCR）作为最佳反应，78%的患者至少实现了VGPR。值得注意的是，近35%的CR发生在移植后超过100天，在接种疫苗后。尽管可能会观察到化疗的延迟效应，但在没有维持治疗的情况下，大量的晚期反应可能暗示了疫苗介导的效应。基于这些结果，该团队被鼓励检查融合疫苗与来那度胺作为自体HCT后维持治疗的联合疗效。然而，与来那度胺一起的DC/MM融合疫苗接种并没有在移植后1年显著增加CR率，但与循环MM反应性淋巴细胞的显著增加相关，这表明了肿瘤特异性免疫。该团队进行了另一项临床试验，涉及接受自体移植的MM患者，他们在接受DC/骨髓瘤融合细胞疫苗后接受了抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）抗体（Pidilizumab）的联合治疗，目的是克服肿瘤细胞逃避宿主免疫的免疫抑制环境。这项试验涉及22名患者，并表明这种组合可以诱导抗肿瘤免疫反应，并且在一部分患者中，在移植后完全根除可测量的疾病。移植后，调节性T细胞水平显著下降，并在整个免疫治疗期间保持低水平。六名患者达到了VGPR的最佳反应，六名患者达到了nCR/CR。从移植起的中位PFS为19个月，随访正在进行中（表4）。其他整个细胞裂解物，如GVAX和DCOne疫苗，作为现货疫苗进行了测试，具有多样化的抗原库。MM-GVAX是一种疫苗，其中两个已建立的异质性骨髓瘤细胞系，H929和U266，与K562细胞系（GVAX®）一起给药，该细胞系被改造为过表达GM-CSF。H929表现出t(4;14)，并且NRAS突变，U266涉及BRAF和TP53途径的几个突变。注册的患者血清/尿液免疫固定阳性，并维持了至少4个月的nCR。在2021年的出版物中，15名患者中有8名（53.3%）加深了治疗反应并实现了真正的CR。中位OS为7.8年。MM-GVAX触发了克隆T细胞扩增和细胞因子反应，在所有患者中持续了长达7年。这项试验正在进行中（表4）。 DCOne是另一种现成的肿瘤疫苗，它源自人类急性髓系白血病（AML）细胞系，可以分化为完全功能的DCs的表型，并内源性地表达肿瘤相关抗原（TAA）。这些抗原与HLA分子以及对T细胞激活至关重要的各种共刺激分子一起呈现。尽管最初作为AML的癌症疫苗进行工程化，DCOne表达的肿瘤抗原也存在于包括MM在内的多种血液系统恶性肿瘤中。使用DCOne疫苗治疗MM导致激活的CD8+ T细胞扩增，这些细胞表达干扰素-γ和穿孔素。此外，将患者的肿瘤细胞与外周血单个核细胞和DCOne共培养，诱导了针对自体MM细胞的细胞毒性T淋巴细胞介导的杀伤，突出了DCOne在骨髓瘤治疗中的潜力。表5显示了使用整个肿瘤抗原治疗MM的试验总结。 6.结论和未来展望 尽管进行了广泛的研究，肿瘤疫苗尚未纳入骨髓瘤治疗。多年来，主要的研究重点是Id疫苗，这些疫苗偶尔产生免疫反应，但临床效果有限。随后的调查在临床试验中探索了不同的抗原靶标。然而，在早期试验中对各种抗原进行广泛测试，并限制了患者群体，这在建立明确结论方面带来了挑战。此外，即使在同一类型的抗原研究之间进行直接比较，也会因患者特征（如年龄、细胞遗传学/风险因素）的差异以及疫苗接种时的疾病阶段而受到阻碍。此外，许多疫苗研究是在化疗构成标准治疗的时期进行的，更多关注使用疫苗单独来根除肿瘤。然而，将疫苗接种与新建立的治疗方法（如IMiDs、蛋白酶体抑制剂和新一代免疫疗法，如嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞和双特异性抗体）结合起来，尚未得到解决。 总的来说，疫苗的复杂性以及骨髓瘤作为疾病的复杂性，为将疫苗整合到骨髓瘤治疗策略中带来了挑战。疫苗治疗是复杂的，需要彻底的实验。这包括选择肿瘤抗原、制定疫苗、确定传递工具，决定给药途径和频率、确定疫苗接种的时间，以及考虑骨髓瘤肿瘤微环境的复杂性（图1）。优化所有这些因素可能是提高临床效果的必要条件。 图1：疫苗设计考虑因素。MM（多发性骨髓瘤）骨髓微环境由包括MDSCs（髓系来源的抑制细胞）、TAM（肿瘤相关巨噬细胞）和Tregs（调节性T细胞）在内的免疫抑制元素组成。MDSCs通过IL-10刺激TAM和Tregs。MDSCs还通过IL-10抑制CTLs（细胞毒性T淋巴细胞）。Tregs通过直接的细胞间相互作用以及通过分泌抑制性细胞因子，如TGF-b和IL-10，来抑制CTL和DC（树突状细胞）的功能。此外，MM细胞分泌包括IL-6、TGF-b和IL-10在内的多种细胞因子，这些因子抑制DCs、CTLs并刺激Tregs。多发性骨髓瘤患者表达多种免疫检查点受体，包括PD-1、CTLA-4、TIM-4、LAG-3、TIGIT。末端T细胞耗竭与CD4+和CD8+ T细胞亚群失去细胞毒性相关，这些细胞亚群产生IFN-g，这是肿瘤免疫的关键细胞因子。MM，多发性骨髓瘤；MGUS，未定意义的单克隆丙种球蛋白病；SMM，隐匿性MM；BM，骨髓；DC，树突状细胞；BMSC，骨髓基质细胞；CTL，细胞毒性T淋巴细胞；MDSCs，髓系来源的抑制细胞；TAM，肿瘤相关巨噬细胞；Treg，调节性T细胞；PD-1，程序性细胞死亡蛋白1；CTLA-4，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4；TIM-3，T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3；LAG-3，淋巴细胞激活基因3；TIGIT，T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域；白细胞介素（IL）-10；TGF-b1，转化生长因子-b1；TAA，肿瘤相关抗原；TSA，肿瘤特异性抗原。部分图表使用了/改编自Servier Medical Art（Servier；https://smart.servier.com/）提供的图片，该图片在Creative Commons Attribution 4.0 Unported License（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）下授权使用。 6.1.抗原选择 理想情况下，靶标抗原必须具有免疫原性，在肿瘤中高度表达，在正常组织中低表达或不存在，并且具有肿瘤特异性，以避免脱靶效应。包括Id、TAA和TSA在内的几种抗原已在骨髓瘤研究中进行了探索。尽管努力增强它们的免疫原性，特别是通过将疫苗接种与免疫原和佐剂结合，但临床效果并不显著。对Id以外的TSA的研究仍然有限。预测TSA作为靶标既耗时又昂贵，需要先进的方法来预测能够引发新抗原特异性T细胞反应的新抗原。此外，准确的HLA分型对于可靠地预测免疫原性抗原和提高治疗效果至关重要，这为疫苗开发增加了另一层复杂性。这是由于人类HLA等位基因的多态性，涵盖了超过24,000个独特的基因复合体。尽管使用表达多种抗原的特定于患者的疫苗（如整个肿瘤裂解物）有很强的理论基础，但可能存在随着时间推移重新建立肿瘤耐受性，促进疾病进展的潜在担忧。这可能部分解释了整个肿瘤裂解物疫苗在骨髓瘤临床环境中采用的延迟。肠道微生物群抗原具有固有的强烈免疫原性属性，但在骨髓瘤研究中仍然是一个未被探索的领域。TAA和微生物抗原之间存在高度相似的抗原表位，表明可能存在强大的交叉反应性CD8+ T细胞反应。具体来说，由特定微生物抗原诱导的T细胞记忆可能转化为抗癌症T细胞记忆，对癌症生长进行长期控制。例如，在MAGE-A10和巨细胞病毒之间观察到的分子模拟。这一发现为探索骨髓瘤相关TAA和微生物抗原之间的交叉反应性开辟了途径，为提高骨髓瘤疫苗治疗的效果提供了新的见解。 6.2.疫苗传递平台 基于肽的疫苗接种已成为引发抗肿瘤T细胞反应的有希望的方法。然而，其有效性仍然有限，即使肽与强大的佐剂共传递时也是如此。这可能归因于DC的功能失调，DC在影响抗肿瘤免疫的质量和数量中起着重要作用。因此，通过基于DC的肽方法传递肿瘤抗原正被认识到作为一种潜在的癌症免疫治疗策略。 自从DC在骨髓瘤治疗中的使用开始以来，许多研究都集中在优化DC生成上，特别是使用 idiotype 作为抗原来源。一些研究表明，来源于CD34+造血前体细胞（HPC）的朗格汉斯型DCs在刺激CTL方面比单核细胞来源的DCs更为有效。然而，它们在骨髓瘤研究中的临床应用仍然有限。此外，对来源于骨髓瘤患者的DCs的体外生成也进行了巨大关注。Shinde等人从MM和健康供体样本中生成了DCs。尽管MM-DCs和健康供体衍生的DCs都显示出成熟的表型，但MM-DCs表现出较低的迁移能力和细胞因子分泌，使它们在诱导抗MM反应方面效果较差。此外，正在探索通过各种方法增强向DCs传递抗原的努力。这些包括用抗原肽库脉冲DCs，并采用基因编辑技术，如电穿孔、脂质纳米颗粒或病毒载体来改善抗原呈递。COVID-19大流行导致mRNA疫苗的显著进展，为它们在抗肿瘤治疗中的应用提供了机会。这些疫苗提供了强大的细胞和体液免疫，超越了传统的病原体或基于蛋白的疫苗。此外，mRNA疫苗提供了诸如快速开发、安全性、较少的副作用和灵活性等优势，从而促进了个性化疫苗策略的实施，特别是在TSA的背景下。mRNA疫苗用于抗原传递代表了一种新颖的方法，值得研究其在骨髓瘤治疗中的潜力。 6.3.给药途径和接种的最佳时间 给药途径和接种的最佳持续时间仍然是正在进行的辩论主题，临床试验中的比较不足。在骨髓瘤中被忽视的另一个因素是肿瘤疫苗接种的时机。在大量已发表的临床研究中，疫苗在系统性抗癌治疗后不久被给予。这个时机带来了挑战，因为自然免疫可能在疫苗接种时被化疗抑制。一个在许多试验中探索的建议方法是在ASCT后接种疫苗的潜在益处，特别是在达到深度反应状态时。在这个阶段的细胞免疫部分的植入提供了形成抗肿瘤免疫的机会。然而，这种方法的挑战包括延迟的免疫重建，T细胞数量至少需要3个月才能恢复正常，导致对疫苗治疗的反应次优。为了解决这个问题，一些研究已经研究了ASCT前疫苗接种，然后在淋巴耗尽环境中早期进行疫苗启动的T细胞转移。然后进行移植后增强疫苗接种以扩大疫苗特异性T细胞。尽管做出了这些努力，但这种策略并没有产生有利的临床结果。然而，这些研究是有限的，需要更多的调查才能得出任何结论性结果。另一种潜在的方法是针对疾病早期阶段的患者，特别是那些具有未定意义的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）或SMM的患者。然而，实施这一策略将需要治疗大量患者并进行长期随访以建立临床效益。到目前为止，缺乏支持这一假设的结论性研究。目前有三项正在进行的试验正在研究SMM患者的疫苗，包括我们的针对RAS突变的TG-01研究、PVX-410（来自XBP1、CD138和CS1的多肽癌症疫苗）和由个人的血液和骨髓制成的个性化癌症疫苗（表4）。 6.4.疫苗外源性因素 疫苗外源性因素，包括肿瘤微环境和骨髓瘤中宿主免疫反应的功能障碍，强调了引发有效免疫反应的复杂性。骨髓瘤肿瘤微环境由免疫抑制细胞群组成，包括髓系来源的抑制细胞、调节性T细胞和肿瘤相关巨噬细胞。此外，不充分的抗原呈递、对自然杀伤（NK）细胞溶解的抵抗力、T细胞耗竭和/或衰老，与ASCT后较差的结果相关，并特征化为多次复发疾病。骨髓瘤衍生的细胞因子，如转化生长因子（TGF）-b、IL-6和IL-10，有助于免疫功能障碍。此外，由于与年龄相关的免疫系统变化导致的T细胞无反应性，疫苗的有效性随着年龄的增长而降低。这对于平均诊断年龄为70岁的骨髓瘤来说尤其重要。另一个在骨髓瘤患者中很少研究的外源性因素是肠道微生物群对肿瘤疫苗效力的潜在影响。Radojevic等人通过分析14名健康供体的粪便微生物群组成以及单核细胞衍生的DCs的表型和产生的细胞因子，报告了肠道微生物群组成与DCs的免疫原性之间的相关性。Calcinotto等人的另一项研究表明，Prevotella heparinolytica促进了定居在肠道并迁移到转基因Vk*MYC小鼠骨髓的Th17细胞的分化，在那里它们有利于MM的进展。这个主题是复杂的，因为许多因素可能影响肠道微生物群，包括通常给予骨髓瘤患者的抗生素治疗。 6.5.疫苗与新一代疗法的结合 需要注意的是，大多数肿瘤疫苗单独使用并不能直接消除肿瘤病灶，但肿瘤疫苗在消除微小残留病（MRD）方面具有潜在的前景。因此，需要进一步的试验来定义疫苗在新的药理疗法时代的角色，如免疫检查点抑制剂（ICI）、抗体药物偶联物、双特异性抗体和CAR-T细胞。这些治疗的持久反应不频繁，但与疫苗结合的策略可以增强反应或消除MRD。例如，疫苗与ICI的结合似乎是一种合理的途径，但在缺乏明确改善疗效信号的情况下，安全性问题已成为ICI在MM临床应用的主要障碍。在双特异性抗体构建之前进行疫苗接种，可以通过创建抗原经验丰富的T细胞池来增强治疗效力。疫苗还可以促进嵌合抗原受体T细胞的扩增和效力。此外，值得注意的是，尽管双特异性抗体和CAR-T目前在MM免疫疗法领域占据主导地位，但癌症疫苗提供了独特的优势。与主要针对细胞表面肿瘤特异性抗原的CAR-T细胞或双特异性抗体不同，癌症疫苗有潜力针对细胞内抗原。这种能力提供了解决更广泛肿瘤抗原的机会。 6.6.结论 总之，尽管迄今为止针对MM的疫苗接种尚未取得令人印象深刻的临床结果，但有必要进一步研究，重点关注选择合适的抗原、患者群体、优化疫苗的时机和序列，以及确定合理的组合。这些元素与其他针对肿瘤微环境免疫抑制活性的免疫干预措施相结合，可能会带来更大的益处，并实现改善和持久的临床反应。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

侃言 此前多次分享过“小分子大环化”这种分子编辑策略在药物化学中改善候选分子效力、选择性、物化特性、和ADME特性等应用实例和总数观点。 近期，EJMC上也刊载了一篇相关综述，文末“阅读原文”可直达原英文文献地址。 此前分享的JMC上的一篇“小分子大环化”的综述，主要从大环化对分子各种性质的影响以及连接器的应用的角度来讲述。本篇EJMC的综述文章更注重从不同类型的蛋白质靶点出发，讲述近5年，“大环化”分子编辑策略在具体药化实例中的优势和应用。 1 “大环化”的优势 “大环”一般指的是在重原子的基础上，具有12个活更多成员的环状化合物。根据“环”形成的核心化学性质，大环类化合物可以分为环肽类、环内酰胺类、环内酯类、环醚类/胺类等。 从药物化学的角度，根据大环药物成环的化学特征，可将其细分为环肽、和大环。 近些年，化学药物发现领域不断涌现出具有多种创新机制的新药，包括：大环类药物（大环/环肽）、靶向蛋白水解嵌合体（PROTACs）、分子胶、抗体偶联药物（ADC）、共价抑制剂等。其中，“大环化”后的大环类药物，由于能够在部分刚性结构中提供功能多样性和立体化学复杂性，具有几个独特的优势： 为药物研究提供新颖的化学空间和知识产权（IP); 大环刚性结构提供相对开环结构表现出更高的亲和力、选择性。在结合具有挑战性药物靶点，解决小分子药物耐药性的问题上具有优势； 在药物发现过程中，优化药物性质； 因此，小分子大环化在近期的药物研发中，已经成为一种热门分子编辑手段，用来改善药物功效和药物类药性特性。 2 “大环化”在先导化合物优化中的应用 接下来，作者汇总了近5年来，在不同的靶点先导化合物优化的过程中，利用“大环化”改善“小分子”功效和特性的实例，大约近30个实例。 01 ATP柠檬酸裂解酶抑制剂 ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）是一种催化柠檬酸生成乙酰辅酶A的酶，在糖代谢和脂质生物合成中起重要作用。催化过程为一些重要分子（如胆固醇、脂肪酸等）的生物合成提供合成砌块，并在蛋白质乙酰化中起重要作用。 ACLY过表达会导致代谢疾病和恶性肿瘤，因此，这种酶是一种潜在的药物治疗靶标。然而，ACLY抑制剂的研发过程中，低活性、细胞渗透性、毒性、药代动力学特性等，一直是阻碍候选分子进一步进入临床研究的障碍。 如上图，在观察化合物1与ACLY的共晶结构时发现，其与靶标呈“U”型结构结合，并且处于活性构象时，苯环与酯基结构非常接近。这里出现了关环以稳定其活性构象的切机！ 通过优化，大环化后的分子在保持了相当的功效（IC50、KD)的同时，其代谢稳定性得到了极大的提高：半衰期提高了158倍，人肝微粒体清除率减少了258倍！ 02 CGRP受体拮抗剂 降钙素基因相关肽(CGRP)及其受体(CGRPR)是偏头痛治疗的潜在靶点，当前已有几种口服CGRP拮抗剂上市。 CGRPR由降钙素样受体（CLR)和受体活性修饰蛋白1（RMAP1)的复合物形成，具有宽、浅、溶剂暴漏的结合位点，最适合大环化配体结合。 如上图，在研究化合物3与CGRPR的共晶结构时发现，一个吲唑甲基片段填充了亲脂腔，取代了疏水性热点重叠的“高能水”区。因此，研究人员尝试设计大环化，以稳定化合物3的活性构象。 通过分子对接，发现大环化分子（4a、4b)与无环化化合物3的活性构象刚好吻合。验证也发现，环化后的分子的效力提高了4倍，亲脂效率（LEE)提高了1.3倍。更有趣的是，非对映体5也是针对靶标有效的，并且是完全不同的结合模式，有助于设计新的CGRP受体拮抗剂。 03 CTG重复序列结合物 DNA或RNA靶向也是一个比较快速发展的药物研究领域。例如，肌强直性营养不良是一种遗传性疾病，其蛋白激酶（DMPK）基因的3’-非翻译区含有扩增的d(CTG）重复序列和扩增的r(CUG）重复序列隔离肌盲样（MBNL）家族蛋白，在剪接中起重要作用。 化合物6可以选择性识别d(CTG）和r(CUG），结合常数在次微摩尔级别，然而，其在该浓度范围内也表现出了细胞毒性。 经过分析，化合物6存在如上图中的堆叠构象和非堆叠构象。非堆叠构象，一方面发挥与DNA、RNA的非特异性结合，另一方面因非特异性结合而增加的剂量会导致细胞毒性。因此，通过环化，锁定化合物在堆叠的活性构象，可以增加分子的特异性和效力，进而减少细胞毒性。 正如预期，化合物8a细胞毒性降低了10倍；化合物8b的效力、选择性等都得到了显著提高。 04 因子XIa抑制剂 凝血酶或凝血因子XIa(FXIa)是抗血栓治疗的新靶点。 BMS研发的化合物9是FXIa潜在的抑制剂，具有nM级抑制常数。然而，该化合物具有较大的极性表面积，以及较差的PK属性：仅3%的生物利用度，以及较多的氢键导致极低的渗透性。 通过配体与靶标的共晶结构，发现化合物9咪唑附近的两个苯环彼此邻近，具有大环化的潜力，进而有可能改善分子的效力和选择性。 在后续的优化中，研究人员通过去除四氮唑和酰胺氢，以降低PSA，改善不良的渗透性和口服吸收。环化后的化合物10，虽然与靶标的结合力常数略有升高，但仍保持在有效的范围内。同时，降低了PSA，其药效更强、生物利用度更好，并且增加了靶标特异性。 05 FKBP51抑制剂 FK506结合蛋白（FKBP51）是一种隶属于免疫亲和蛋白家族的肽基脯氨酸异构酶，在调节糖皮质激素受体活性中起重要作用，并作为共同伴侣，参与HSP90蛋白折叠。FKBP51是许多疾病的潜在靶点，包括与压力相关的精神障碍、肥胖引起的糖尿病、和慢性疼痛等。 如上图，化合物11a、11b是首次报道的FKB51选择性配体，具有个位数nM级别的抑制活性。在研究化合物11b与靶标的共晶结构时发现，两个芳环上的醚键彼此靠近，具有环化的潜力，以锁定生物活性构象。 如上图，通过从尝试一系列连接子，含有两个羟基的化合物12相比于非环化前体，药效最强。感觉整体选择性降低了，变泛配体了？ 06 谷氨酰胺酶1抑制剂 谷氨酰胺酶（GLS)是水解谷氨酰胺，获得谷氨酸盐的关键性酶。在一些癌症中，“谷氨酰胺成瘾”，维持癌细胞增殖所需要的能量。人类GLS酶包括两种类型：GLS1，广泛分布于肝外组织的肾型谷氨酰胺酶；GLS2，主要分布于成人肝脏的肝型谷氨酰胺酶。其中，GLS1的活性与肿瘤生长速率相关，是癌症潜在的治疗靶点。 如上图，化合物13是一个临床候选分子。早期研究期待通过环化获得新型的抑制剂，然而效力均不理想。直到在分析化合物13与GLS1的共晶结构时，在结合的生物活性状态观察到了“U”构象。分子处在生物活性构象时，两端的基序彼此靠近，提供了环化的切机。 环化后的化合物14，效力提高了3.6倍，并且稳定性也获得了显著的提高：半衰期提高了2倍、清除率降低了1/3。然而，生物利用度相比于前体13有所降低（9% vs 19%）。 07 异柠檬酸脱氢酶2（IDH2)抑制剂 异柠檬酸脱氢酶（IDH)是一种影响三羧酸循环中异柠檬酸和α-酮戊二酸相互转化代谢途径的酶。 化合物15是一种FDA批准的用于治疗复发性和难治性急性髓性白血病的药物。研究人员尝试通过大环化获得构象限制的新型IDH2抑制剂。通过观察化合物15与IDH2R140Q突变体的共晶结构，发现吡啶N的部分与脂肪侧链非常接近，因此合成了大环化合物16。 环化后的化合物对R140Q突变体抑制性最强，具有个位数nM级抑制活性，而对野生型IDH2无抑制作用。同时，环化后的化合物还具有良好的生物利用度和代谢稳定性。 08 激酶凋亡信号调节激酶1（ASK1）抑制剂 凋亡信号调节激酶1（ASK1)通过调节细胞应激反应，在炎症和凋亡中发挥重要作用。ASK1调节可有治疗神经系统疾病，包括肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、帕金森病、阿尔兹海默病等。 如上图，Selonsertib是表现最好属性的ASK1抑制剂，具有生化和细胞效力以及良好的药代动力学特征。然而，其是P-gp底物，不适合作为中枢神经系统药物。 通过研究其与靶标蛋白质在溶剂暴露区和催化赖氨酸结合位点附近的激酶结构域的共晶结构发现，具有大环化的潜力，或许可以解决CNS渗透性问题。 如上图，获得了两种类型的大环化产物：化合物17、18。然而，环化后的产物并没有比母体更具有效力。CNS渗透性可以通过引入适当的官能团来调节。如上图，含氟化合物17表现出低至中等的CNS穿透性，而咪唑类化合物18表现出更优异的脑暴露性。 09 激酶骨形态发生蛋白受体II型（BMPR2) 骨形态发生蛋白受体II型(BMPR2)是一种丝氨酸/苏氨酸受体激酶，属于酪氨酸激酶样(TKL)组，是肺动脉高压、癌症、阿尔兹海默病等疾病的靶点。 如上图，化合物19具有BMPR2靶标次纳摩尔级的结合力以及双位数nM级的抑制活性；然而，其同时抑制468个激酶中的262个，表现出极差的特异性的混杂行为。 通过分析化合物19与VRK1的共晶结构，发现氰基与环丙烷彼此靠近，设计连接子，或许可以提高其选择性。如上图中，环化后的化合物20，其效力虽不如前体，但仍保持在次微摩尔级的有效范围。而其选择性获得了提供。 10 周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）抑制剂 周期蛋白依赖性激酶2（CDK2)是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，与周期蛋白伙伴相互作用。CDK-周期蛋白复合物失调，会导致癌细胞失去周期和转录控制。 其中CDK2抑制剂对CDK4/6抑制剂治疗产生耐药性的患者有益。 研究人员发现化合物21对CDK2参与的PPI作用具有有效的抑制作用。以此为起点，结合AI技术和基于片段的变分自编码器生成模型来识别CDK2抑制剂。通过分析其对CDK2/cyclin E1的共晶结构，发现其呈“U”型结构，吡啶与溶剂暴露的异丙基靠近，具有大环化的潜力。 在一系列的大环化衍生物中，化合物22最具潜力。其针对CDK2/E1的抑制效力提高了21倍，然而，针对CDK1/A2的选择性略有下降。 11 周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）抑制剂 髓样细胞白血病-1(Mcl-1)是一种抗凋亡蛋白，在癌细胞存活中起重要作用。Mcl-1在多种癌症的细胞增殖过程中过表达，特别是在EGFR突变的细胞系中，而CDK9抑制可下调Mcl-1。 化合物23是一种有效抑制CDK9的苗头化合物，然而，其同时对其它CDK蛋白具有抑制活性，如CDK2/4/12，具有较差的选择性以及因此而导致的体内毒性。 研究人员试图通过大环化来固定二面角，以抑制柔性旋转。通过优化大环化连接子以及酰胺侧链，如上图，获得化合物24，保持了针对CDK9效力的同时，具有良好的选择性。 12 c-Met激酶抑制剂 c-Met是一种受体酪氨酸激酶（RTK)，是肝细胞生长因子（HGF)/分散因子（SF)的受体。靶向HGF/c-Met信号通路，是非小细胞肺癌的潜在治疗策略。一些小分子已被用于靶向c-Met，包括已上市的药物(克唑替尼、卡马替尼、替波替尼、萨沃替尼和卡博赞替尼等)。 如上图，在基于先导化合物设计新型c-Met抑制剂时，发现了与c-Met共晶结构中存在“U”型结合模式，使用不同的连接子使小分子大环化，能够产生在生化、细胞活性等方面的差异性。 通过大环化，可以使分子维持在折叠的低能构象，以避免结合自由能熵补偿。如上图，大环化后的化合物26，获得了改善的生物活性、选择性。 13 酶双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A/B 双特异性酪氨酸（Y)磷酸化调节激酶1A (DYRK1A) 在神经系统疾病和癌症中都起作用。 如上图，化合物27是一种有效的DYRK1A抑制剂，然而，其是一种泛激酶抑制剂，具有广谱抑制作用。在研究化合物27与DYRK1A的共晶结构时，发现了“U”型结合模式，其中苯环的3-位与吡啶环的5-位非常接近。 因此，研究人员以此合成大环化分子，实现了对靶标的高亲和力和选择性。 14 激酶表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂 表皮生长因子受体(EGFR)携带del19或L858R突变体时，它是一种致癌驱动因子，特别是在肺癌中。 如上图，化合物30是勃林格殷格翰发现的具有潜力的苗头化合物。在详细的构象分析中发现，化合物30具有活性和非活性构象，因此，研究人员决定通过大环化来稳定其活性构象。 如上图，大环化后的产物31，其抗增殖效力得到了极大的提高。 也有研究人员基于Gefitinib的结构尝试大环化，如上图，化合物32针对突变体的抑制效力虽略有不如前体，但也保持了次nM级抑制效力；而其针对野生型的选择性获得了极大的提高。 15 造血祖激酶1（HPK1）抑制剂 造血祖激酶1 (HPK1)是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，调节T细胞、B细胞和树突状细胞的功能，是免疫治疗潜在的治疗靶标，作为肿瘤转移患者潜在的治疗策略。 如上图，化合物33是BMS发现的一种有效的HPK1抑制剂，并且针对GLK具有39倍选择性。研究发现，HPK1与GLK的差别之处在于HPK1具有更宽的入口口袋，因此，这种差别赋予了两个靶标的空间冲突选择性。而研究发现，化合物33的苯基基序的柔韧性可以引起构象变化，符合GLK。若通过大环化来实现构象限制，则有可能进一步提高选择性。 如上图，环化后优化的产物34，其针对HPK1的效力提高了4.6倍；选择性提高了101倍；代谢稳定性提高了3倍；抗hERG活性低于化合物33等。此外，其还获得了中等的渗透性，无外排倾向，对CYP3A4无明显抑制作用。 16 Janus激酶2（JAK2）抑制剂 Janus激酶2（JAK2）是一种细胞内非受体酪氨酸激酶，属于Janus激酶家族（JAK1、JAK2、JAK3、Tyk2），可以作为骨髓增生性肿瘤、类风湿性关节炎、以及炎症性肠病的治疗靶点。 如上图，研究人员以Fedratinib为起点，探索基于深度学习的JAK2大环化抑制剂设计。Fedratinib已批准于治疗骨髓纤维化，但其激酶选择性较差。 研究人员在两个芳环之间设计连接子，并鉴于结构分析去除磺酰胺，通过分子对接，从产生的218个大环化分子中选择最具潜力的分子进行合成、验证，其中化合物35与Pacritinib非常相似。其效力略不如前体，然而其仅抑制17种野生型激酶，相比于前体的34种，选择性得到了很大的提高。同时，PK属性获得了提高。 17 激酶Pim-1抑制剂 Pim-1编码基因具有致癌潜力，Pim-1激酶是前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤的信号蛋白。 如上图，化合物36是一种μM级的Pim-1抑制剂，通过配体竞争饱和方法进一步优化，获得更高效的抑制剂37，以及选择性靶向Pim-2、Pim-3。然而，其细胞渗透性差。 分析化合物36、37与Pim-1的共晶结构，发现芳环上的氯原子与侧链N原子旁边的碳原子非常接近，具有大环化的潜力。通过设计不同的大环化连接子，最终确定了最有效的化合物38，保存了化合物37相当的效力，同时具有μM级细胞活性。 18 脾酪氨酸激酶（SYK）抑制剂 脾酪氨酸激酶（SYK）是一种主要在造血干细胞种表达的非受体酪氨酸激酶，也是B细胞受体（BCR)信号的调节因子，是治疗自身免疫性疾病和血液病的潜在治疗靶点。 如上图，化合物39是阿斯利康发现的一种有效的、选择性SYK抑制剂。然而，其具有不良的药代动力学（PK）特性。因此，研究者尝试用大环化的分子编辑手段进行进一步优化。 首先，基于溶液态NMR数据，观察到化合物39主要以“U”型构象存在，发现了大环化的切机。在众多大环化分子中，化合物40最具有潜力。尽管其效力和细胞活性略有降低，其在大鼠肝清除和人肝微粒体清除研究中更加稳定。同时，其没有hERG抑制活性，提高了激酶选择性。此外，其渗透性由于羟基极性的引入而降低，这或许需要用前药的方法来进一步解决。 19 原肌球蛋白受体激酶（TRK）抑制剂 原肌球蛋白受体激酶（TRK）是一种跨膜受体酪氨酸激酶，有三种亚型（TRKA、TRKB、TRKC）组成，分别由神经营养受体酪氨酸激酶1、2、3基因编辑。TRKs调控哺乳动物中枢和周围神经系统的生理功能，是NTRK融合阳性癌症的潜在治疗靶点。 如上图，Larotrectinib是一种FDA获批的TRK抑制剂，并且在临床上通过将二氟苯和吡咯烷基序连在一起，产生了两种新型药物Selitrectinib、Repotrectinib。 此外，也有研究通过Schrodinger软件，以Larotrectinib为起点生成TRKAG595R突变体的对接，实现大环化。在分析了结合模式后，通过环化3-羟基吡啶部分和二氟苯的溶剂暴露区域，合成了3种类型的大环化化合物，共23个。其中，化合物41是比前体更具有效力的。 丁克教授也在该项目上做了大量工作，如上图。他们首先确定了苗头化合物42，具有TRKA、TRKB、TRKC抑制活性。 以苗头化合物42为起点，新的设计首先采用了骨架跃迁的策略，获得先导化合物43，其在针对野生型TRKA、TRKC、以及突变体TRKAG667C等生化试验中显示有效活性。 通过对43的结合模式进行预测分析，发现了该化合物以II型结合模式与TRKC的APT结合口袋结合，因此，在此基础上计划将苯环和胺基序环化以获得刚性结构。 环化后的化合物44表现出比先导化合物更有效的生化活性、和细胞活性、以及更高的激酶选择性。对连接子和侧链进一步优化，获得化合物45，其效力、细胞活性、选择性进一步获得了提高。 20 TYK2激酶抑制剂 TYK2也隶属于前面提到了Janus激酶家族一员，是治疗自身免疫性疾病的潜在靶点。 如上图，化合物46是一种有效的Tyk2抑制剂，通过共晶结构分析，在氧杂吡咯烷酮与吡啶基序之间的溶剂暴露区发现了大环化的切机。环化后的化合物47尽管效力没有改善，其针对JAK1、JAK3的选择性得到了极大的提高。 21 髓过氧化合物酶(MPO)抑制剂 髓过氧化物酶(MPO)是一种人类含血红素过氧化物酶，是中性粒细胞初级颗粒的主要成分。其过表达和氧化产物的形成与炎症性疾病，特别是动脉粥样硬化有关。适当调节这种酶，对预防心血管疾病很重要。 如上图，化合物48是一种有效的MPO抑制剂，针对TPO的选择性约25倍，而化合物49具有相当的MPO抑制活性。通过将结合了MPO活性位点的48、49的晶体结构于同一位置的三唑并吡啶环重叠，发现化合物48的茚环与化合物49的苯环距离很近，几乎重叠。因此，研究人员设计融合两个化合物的构象特点，通过设计大环化来提高分子的效力和选择性。 优化后，获得的化合物50，其MPO抑制效力提高了约10倍，选择性提高了1580倍！ 22 NS3/4A蛋白酶激动剂 Asunaprevir是获批NS3/4A蛋白酶药物，然而却常常诱导R155K和D168N突变而产生耐药性。这种耐药性机制可能是配体结合诱导Arg155与P2*杂环接触，Arg155与Asp168结合而稳定。因此任何一个位点的突变，都会破坏配体与NS3/4A蛋白酶结合。 因此，BMS试图通过环化P1、P3来稳定结合的活性构象，以避免耐药性突变的发生。通过优化后，获得的大环化化合物51，其激动剂活性针对所有的基因型均获得了改善。同时，除了食蟹猴以外，大鼠和狗的生物利用度也获得了很大的提高。 23 PI3K δ抑制剂 磷酸肌醇3-激酶δ（PI3K δ）可催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2)磷酸化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3)，在细胞生长、增殖、存活和迁移相关信号通路中起重要作用，主要在白细胞中表达，是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的靶点。 如上图，化合物52是一个临床候选化合物发现的起点。通过其与PI3Kδ共晶结构分析发现，磺酰胺基团的甲基与酰胺键的羰基之间靠近，具有大环化的机会。 对比环化前体，环化后的产物其针对PI3Kδ抑制效力和结合力显著提高，配体效力（LE)略微改善、体内/体外的清除率明显降低。 24 PI3K/m-TOR抑制剂 PI3K/AKT/m-TOR信号通路的激活与乳腺、结肠、肺、血液等恶性肿瘤的发生发展有关。 如上图，Omipalisib是已知的PI3Kα、m-TOR抑制剂，以此为起点，通过对其共晶结构的分析、以及分子对接的了解，研究人员通过环化两个溶剂前沿区域的靠近基序，获得的产物55，其PI3Kα抑制活性得到了改善，m-TOR抑制效力降低，p-AKT激动活力提高了3倍以上等。 25 PI3K/m-TOR/PIM抑制剂 PIM激酶通过参与PI3K/m-TOR/PIM通路参与癌症的发展。 如上图，环化产物57比非环化前体56更具有效力和选择性，且具有泛PIM抑制活性。 26 纤溶酶抑制剂 纤溶蛋白是一种类似胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶，在生理条件下参与纤维蛋白凝块的降解，控制循环中纤溶和凝血的平衡。纤溶酶活性增强的情况，如心脏手术合并体外循环、和器官移植，会增加出血性疾病的风险。 如上图，化合物58是一种非特异性抑制剂，具有次nM级抑制力活性。在分子模拟研究中发现，P2、P3侧链与美表面或溶剂暴漏区的方向相同；而且，除了纤溶酶外，其它蛋白酶的“发卡”结构会与P2、和P3形成的大环产生空间冲突，因此，这为大环化后提供了潜在的选择性。 通过优化后，获得大环后产物59，其抑制效力保持，而且选择性获得了极大的提高。 27 RORC2反向激动剂 视黄酸受体相关孤儿受体C2(RORC2, RORγt)是一种与IL-17A和IL-17F表达相关的核激素受体。因此，一种合适的调节RORC2受体的小分子，特别是作为一种逆激动剂，可能抑制体外IL-17A的产生，并对牛皮癣、类风湿性关节炎(RA)、炎症性肠病和多发性硬化症的体内模型有效。 如上图，化合物60是辉瑞发现的一个低分子量的先导化合物，进一步的改善获得化合物61，其表现出合理的RORC2反向激动作用和IL-17A抑制性，但理化特性没有得到改善。 通过共晶结构分析发现，化合物61具有“U”型活性构象，因此，将两个靠近的基序进行连接、大环化，获得产物62，其活性略有降低，然而其物化特性获得了极大的改善。 28 突变呼吸道合胞病毒融合(RSV F)蛋白 呼吸道合胞病毒（RSV）是一种传染性病毒，可引起下呼吸道感染，特别是婴幼儿和患有其它疾病的老人。 如上图，Presatrovir是目前正在临床阶段的很有前景的RSV F蛋白抑制剂。然而，已经观察到耐药性突变，这是一个非常严重的问题。 研究Presatrovir和野生型A2 RSV F蛋白分子模型发现，磺胺的氢和吡唑环的氮相互作用。将分子模型数据与单晶结构进行比较，结果很吻合。为了稳定这种构象，尝试基于先导化合物63进行大环化，来靶向野生型和D486N突变型RSV F。 其中各项最平衡的产物是化合物64，其针对野生型的活性降低，但针对突变体活性获得了极大的提高。然而，NMR分析，其具有拓扑异构混合物的存在。进一步优化，扩展环获得化合物65，其针对野生型、突变体的活性都获得了极大的提高，没有拓扑异构混杂的现象。捅死，在10μM环境下，仍没有CYP3A抑制活性。 29 干扰素基因刺激剂（STING) 干扰素基因刺激剂（STING)是一种衔接蛋白，在免疫应答相关的信号通路中发挥重要作用。因此，STING激动剂用于感染性疾病和癌症免疫治疗；而STING抑制剂用于自身免疫性疾病和炎症的治疗。 如上图，环化后的产物比前体具有更高的亲和力以及活性。 3 总结   在药物发现中，越来越多的证据表明，大环提供了一种新颖的化学类别，它占据小分子和生物制剂之间独特的化学空间。基于独特的构象特征，大环的药物特性使它们能够靶向其它化学类别不易接近的细胞外和细胞内的位点。 基于大环的药物设计或小分子“大环化”的分子编辑策略，在药物法中具有潜在的优势。 大环可以为靶蛋白提供更大的相互作用表面，从而在结合强度和特异性方面增强了结合亲和力； 大环的复杂性和三维特性增加了可能有助于提高靶蛋白的选择性，从而减少脱靶效应，增加治疗的安全性和选择性； 线性化合物的“大环化”通常提供更好的细胞渗透性，从而提高生物利用度； 大环的约束构象和刚性结构还可以提高稳定性，增加抵抗酶降解的能力，进而延长药物在体内的半衰期； 大环提供独特的化学支架，扩大化学空间的多样性； 大环能够更好的平衡亲脂性、亲水性、和分子量等性质，获得最佳的类药性； 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓