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关注并星标CPHI制药在线       念珠菌感染是临床最常见的机会性真菌感染之一，好发于老年人群、癌症化疗、移植术后、HIV感染等免疫低下人群。由于唑类、多烯类、棘白菌素类等传统抗真菌剂的广泛使用，天然耐药性念珠菌株的出现以及非白念珠菌感染比例增加，临床念珠菌耐药现象日渐严重。天然产物以其独特的化学多样性和生物活性而闻名，几个世纪以来一直被广泛用于治疗各种疾病。据统计，临床的一线抗真菌药物通常是天然产品或其衍生品。近年来，抗真菌天然产物的开发取得了重大进展，已发现相当数量的天然分子对不同种类的念珠菌具有治疗作用。如从植物组织中提取出的化学结构明确的生物活性分子及其衍生物对多种念珠菌具有显著抑制作用，且具有来源广泛、不良反应小、适合长期或预防性使用等多方面优势，成为新型抗真菌剂的重要来源。       抗念珠菌天然产物中，真菌代谢物是主要来源，其次是植物。这些化合物大多属于生物碱、聚酮类、萜类、酚类、大环内酯类和多肽类。其中，萜类化合物含量最高，其次是生物碱和聚酮类化合物。①萜类化合物主要是高等植物和内生真菌的代谢产物，具有抗念珠菌活性的萜类化合物包括单萜、倍半萜、二萜和三萜。研究表明，从有柄灵芝中分离的14种三萜类化合物增加了耐氟康唑白念珠菌对氟康唑的敏感性，其中部分能明显抑制白念珠菌。从樟子松挥发油中分离出的倍半萜对白念珠菌、光滑念珠菌及克柔念珠菌均有抑菌作用。②生物碱是存在于生物体内的含氮碱性化合物，具有显著的生物活性。抗念珠菌的生物碱种类繁多，主要包括吲哚类、吡啶类、喹诺酮类等。吲哚类及喹诺酮类具有相对广泛的抗真菌谱，但它们的抑菌活性通常是中等。相比之下，已报道的吡啶生物碱显示出很强的抗真菌活性。③聚酮类抗念珠菌的聚酮类化合物大部分是从真菌代谢产物中分离得到的。如从红树植物内生真菌茎点霉属中分离得到部分聚酮化合物对白念珠菌显示较强的抗菌活性，MIC50值为2.62μg/mL。       天然产物抗念珠菌的作用机制天然产物抗念珠菌的作用机制主要包括抑制念珠菌毒力因子，如抑制念珠菌黏附与侵袭、酵母态-菌丝态形态转换、生物膜形成、水解酶合成与分泌等；影响念珠菌细胞壁、细胞膜和线粒体等细胞结构变化；诱导念珠菌细胞凋亡；抑制念珠菌药物靶酶与外排泵表达；此外也有部分天然产物通过调节免疫增强抗念珠菌作用。       01抑制黏附与侵袭作用白念珠菌的黏附是其发挥侵袭作用及形成生物膜的关键性第一步，植物活性成分抗念珠菌黏附作用可主要通过细胞实验进行证实。即通过将念珠菌与口腔黏膜上皮细胞共培养，观察在植物活性成分作用下，念珠菌在口腔黏膜上皮细胞表面的黏附情况。研究发现，400μg/mL 丹皮酚和1μg/mL氟康唑单独应用时，白念珠菌对人口腔黏膜上皮细胞的黏附率分别为(93.33±4.84)%与(91.67±3.45)%，而联合应用时其黏附率仅为(38.33±1.51)%，表明丹皮酚可与氟康唑协同抑制白念珠菌对人口腔黏膜上皮细胞的黏附。此外，研究表明，肉桂醛、小檗碱单独使用以及与氟康唑联用时，既可抑制白念珠菌芽管形成，还可显著抑制其对人口腔黏膜上皮细胞的黏附。其机制为肉桂醛、小檗碱与氟康唑协同干扰了白念珠菌芽管胞壁蛋白的合成及其相关基因的调控，从而抑制了白念珠菌芽管的形成，并降低了其对宿主细胞的黏附能力。另有学者通过选取人克隆结直肠腺癌细胞系(Caco-2)与白念珠菌共培养，并采用细胞膜探针(DiI) 染色法，评估了网脊衣酸 B对白念珠菌侵袭宿主细胞能力的影响。结果表明，网脊衣酸B与氟康唑单独应用时，细胞内菌丝侵袭率分别为(68±34)%及(57±16)%，而当两种药物联用后，细胞内菌丝侵袭率可显著减少至(25±16)%，证实植物活性成分网脊衣酸B具有抗念珠菌侵袭作用。       02抑制酵母态-菌丝态形态转换酵母态-菌丝态形态转换是白念珠菌发挥致病性的基础。白念珠菌可通过由酵母态转化为菌丝态，对宿主细胞产生黏附、穿刺和侵袭作用，进而发挥其致病性。涉及到的相关信号通路主要包括：cAMP/PKA信号通路、MAPK信号通路、Rim101介导的pH信号通路、及Tup1介导的负调通路等。研究显示，当血根碱浓度为0.8μg/m时，Spider培养基中的白念珠菌全部保持酵母态，未见菌丝生成；而当血根碱浓度达1.6μg/mL时，白念珠菌cAMP信号通路相关基因ALS3、HWP1、ECE1、HGC1、CYR1 的表达水平均显著下调。研究发现，4μg/mL 的厚朴酚与和厚朴酚可显著抑制白念珠菌菌丝形成，当其浓度达到16μg/mL时，Spider培养基中的白念珠菌未见菌丝生成，其可能机制为厚朴酚与和厚朴酚抑制了Ras1-cAMP-Efg1信号通路相关基因RAS1、EFG1、TEC1 和CDC35 的表达。群体感应分子法尼醇可通过抑制腺苷酸环化酶活性，作用于Ras1-Cyr1-cAMPEfg1信号通路，进而抑制念珠菌酵母态-菌丝态形态转换及生物膜形成；而酪醇则可以促进其菌丝及生物膜形成。另有研究发现，穿心莲内酯可影响白念珠菌群体感应分子法尼醇与酪醇的分泌量，并且对法尼醇呈负调作用，对酪醇呈正调作用，且该成分可使群体感应分子编码基因CHK1和PBS2明显下调，最终对白念珠菌酵母态-菌丝态形态转换及生物膜形成产生显著抑制作用。       03天然产物对念珠菌生物膜的影响念珠菌生物膜的形成过程可大致分为4个阶段：宿主表面黏附；念珠菌细胞的增殖；菌丝形成及细胞外基质的产生；生物膜成熟后菌体的扩散及其他部位的定植。研究显示，植物活性成分的抗念珠菌作用机制包括抑制念珠菌生物膜形成过程、破坏念珠菌生物膜空间结构、影响念珠菌生物膜细胞扩散等。研究发现，小檗碱对白念珠菌、克柔念珠菌、都柏林念珠菌、光滑念珠菌生物膜的初始形成期至成熟期(6h、12h、24h、48h)均有抑制作用，其中对48h生物膜抑制作用最强。激光共聚焦显微镜及3D 重建后观察发现，小檗碱可显著破坏生物膜的空间结构，使细胞排列松散，密度降低，生物膜厚度变薄。       黄芩素是黄芩的主要活性成分，研究表明它可通过减少CSH1的表达而降低生物膜的表面疏水性，从而减少黏附，抑制白念珠菌生物膜的形成。从苔藓类植物中提取的具有大环双联苄结构的化合物Riccardin D可通过下调菌丝特异基因ALS1、ALS3、ECE1、EFG1、HWP1和CDC35的表达并抑制了Ras-cAMP-EFG途径，从而延缓了菌丝的形成，导致生物膜成熟缺陷。莲碱是从天仙藤茎中分离得到的一种异喹啉类生物碱，通过相似途径发挥抗念珠菌生物膜作用。酸模属植物根部提取的nepodin通过抑制菌丝和生物膜相关基因(ECE1、HGT10、HWP1和UME6)的表达以及增加运输基因(CDR4、CDR11和TPO2)的表达可抑制白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌等念珠菌生物膜的形成。大叶藤黄中分离得到的二苯甲酮类化合物xanthochymol和garcinol，能有效地抑制芽管萌发，诱导早期和成熟的生物膜细胞凋亡，从而直接杀死菌丝和生物膜。       04抑制水解酶合成与分泌白念珠菌毒力相关水解酶主要包括分泌性天冬氨酸蛋白酶(secretedaspartylproteinase，Sap)、磷脂酶 (phospholipase，PL) 和脂肪酶 (lipase，Lip)等。水解酶可介导白念珠菌黏附、侵袭宿主细胞，同时还可裂解宿主免疫应答相关分子，协助白念珠菌逃避宿主的免疫防御机制。多种植物活性成分可通过下调水解酶相关编码基因，抑制水解酶合成，进而减少其分泌。研究发现紫草素可呈浓度依赖性抑制白念珠菌磷脂酶分泌，8μg/m的紫草素可使PLB1和PLB2 基因的相对表达量降低56.4%和 61.4%，且16μg/mL 的紫草素可使白念珠菌磷脂酶分泌量下降56.3%。另有研究发现，当鱼腥草素钠浓度达240 mg/L时，可显著抑制磷脂酶编码基因PLB1和PLB2的表达。与此相反，一些植物活性成分还可通过上调水解酶相关基因表达而发挥作用。       参考资料       [1]余宇,佘晓东,刘维达.抗念珠菌天然产物的研究进展[J].中国真菌学杂志,2023,18(02):183-187.       [2]解雨飞,周培茹,华红等.植物活性成分抗念珠菌作用机制研究进展[J].中国真菌学杂志,2022,17(04):315-318+329.       作者简介：小米虫，药品质量研究工作者，长期致力于药品质量研究及药品分析方法验证工作，现就职于国内某大型药物研发公司，从事药品检验分析及分析方法验证。       【智药研习社近期直播预告】来源：CPHI制药在线声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文，进入智药研习社~

由于阿尔茨海默病（AD）的发病率不断增加，目前已经进行了大量的研究，以寻找能够改变疾病进程、产生药理治疗效果的药物。然而，目前还没有治愈AD的根本方法。目前在AD治疗中获得批准的药物只能用于缓解AD症状，主要限于乙酰胆碱酯酶抑制剂、Aβ单克隆抗体和NMDA受体拮抗剂（表1）。表1. 获得批准的AD代表药物传统的小分子药物和抗体药物在一定程度上能够缓解症状，但由于AD的病因不清、病理过程复杂以及血脑屏障(BBB)的存在，传统药物的研发面临巨大挑战，这促使科学家们寻求新的治疗方法和策略。基因治疗是一种新兴且功能强大的疾病治疗方法，目前在单基因罕见病治疗方面已取得了很大成功。鉴于基因治疗在近年来取得的显著成绩，人们期待AD也可以通过基因调节而得到有效治疗。目前已知25种基因可显著增加AD的患病风险。可见，基因治疗在AD治疗领域有望发挥重要角色。近年来，对AD发病机制和通路的进一步了解为基因治疗的靶点识别提供了各种技术手段。目前已经确定了多个潜在的AD基因治疗靶点，针对这些基因治疗靶点近年来已初步开始探索和开启了多项临床试验（表2）。本文就这些潜在靶点和其开发情况做一个简要介绍。表2. 基因治疗AD的临床试验神经营养因子（NGF）神经营养因子（NGF）是一种内源性神经营养因子，对基底前脑胆碱能神经元的存活、连接性和突触可塑性至关重要，并与AD中神经元的退化有关。NGF对周围神经系统（交感神经和感觉神经）和中枢神经系统（胆碱能神经元）的生长、存活和功能具有重要作用。它通过激活TrkA受体参与调节基底前脑胆碱能神经元，并调节神经系统的发育。最近的研究发现，NGF的缺乏会促进Aβ蛋白的产生，并与阿尔茨海默病中的Aβ蛋白连接有关。使用转基因小鼠模型的研究表明，NGF抗体的过表达会导致基底前脑胆碱能神经元的tau蛋白过度磷酸化，从而导致认知能力下降和神经退行性变。因此，NGF可能被用于治疗阿尔茨海默病，以加强胆碱能神经元并增加它们的活动，以弥补基底前脑乙酰胆碱水平的降低。有趣的是，在使用NGF基因敲除小鼠进行的实验中，并未观察到基底前脑胆碱能神经元的问题，但对感觉神经和交感神经节的影响明显。然而，NGF能够阻止在唐氏综合征小鼠模型中基底前脑胆碱能神经元的远程运输障碍和退行性变，这表明NGF具有神经营养作用。在小鼠上进行的研究还发现，NGF的注入可以防止核基底内胆碱能神经元的退化，从而预防老龄小鼠记忆功能的衰退，改善了阿尔茨海默病中的胆碱能缺陷。在进行了临床前试验后，一些患者接受了神经生长因子（NGF）的临床试验。由于NGF无法穿过血脑屏障，因此它通过脑室内注射给予患者。然而，这种方法出现了意外的不良反应，包括疼痛综合征、施万细胞的迁移和增殖，以及摄食减少。这是因为NGF在大脑中广泛且无法受控地分布，导致体重减轻。然而，研究人员发现，当NGF以定位靶向的方式递送时，疼痛相关的副作用可以被消除。将NGF通过体外基因递送的方式传递到认知障碍灵长类动物的基底前脑，研究人员成功消除了疼痛相关的副作用。后来对猴子的研究发现，当NGF通过基因递送给细胞时，内侧隔脑胆碱能神经元并没有丧失。基于这些发现，第一项临床试验使用成纤维细胞进行NGF基因递送，并且结果显示没有NGF相关的不良反应，并且明显减缓了认知退化。这种方法还可以更好地控制NGF在大脑中的分布和水平。因此，通过基因转移的方式递送NGF可能是一种更有效且副作用较少的治疗方法。卡罗林斯卡研究所开始进行临床试验1b阶段，使用经过工程改造的视网膜上皮细胞表达NGF。在试验中，六名患者接受了半透性生物传递装置，释放NGF并防止细胞迁移，没有出现任何术后并发症。脑源性神经营养因子（BDNF）BDNF基因在大脑中广泛存在，特别是在大脑皮层和海马体的神经元中，对于记忆和学习至关重要。它通过激活受体TrkB和p75NTR来控制分化，并确保多巴胺能和乙酰胆碱能神经元的存活。研究表明，BDNF与AD之间存在着遗传联系。在动物模型中，BDNF治疗改善了学习和记忆功能的损害。此外，AD小鼠模型中发现BDNF水平较低与神经毒性A寡聚体的含量较高相关。脑组织的尸检分析也显示，AD患者的颞叶皮层和海马体中BDNF水平较低。BDNF的减少会导致BDNF-TrkB信号传导减弱，影响记忆。它还刺激了Aβ的合成，并增加了促炎细胞因子的产生，从而加剧AD的病理过程。此外，BDNF的中和或删除还会促进APP和Tau的裂解，并产生Aβ和神经毒性Tau N368。为了发挥BDNF对AD的保护作用，需要将其递送到大脑中。由于BDNF的亲脂性有限且无法穿过血脑屏障，基因递送被认为是一种有益的治疗替代品。研究表明，将BDNF基因转移到大脑的颞叶皮层可以修复空间记忆缺陷，并改善认知功能。在动物模型和灵长类动物中的实验中，BDNF基因治疗已显示出减少神经元损失、改善记忆和逆转突触退化的积极效果。总之，这些发现支持了BDNF基因递送将是一种可行的AD治疗方法的策略。NeprilysinAD的两个主要原因是细胞内过度磷酸化tau蛋白的积累和Aβ肽的堆积。Aβ肽是通过酶分解淀粉样前体蛋白（APP）产生的，最常见的是由40个和42个氨基酸组成的肽。Aβ肽在大脑中的水平由APP产生速率、通过血脑屏障的转运速率和在脑实质中的降解速率三个因素决定。Neprilysin是一种内源性蛋白酶，能有效降解Aβ肽。随着年龄增长，Neprilysin的水平会减少，而AD患者的脑组织中检测到的Neprilysin水平更低。研究表明，增加大脑中的Neprilysin活性可能有助于防止Aβ肽在大脑中的积累，从而保护神经元免受Aβ的毒性影响，并预防与Aβ相关的认知障碍和突触退化。因此，Neprilysin基因递送可能是降低AD患者体内Aβ水平的有益治疗方法。目前已经开发了用于递送Neprilysin的病毒载体，这些载体具有高转导率。先前的研究使用辛德比斯病毒载体成功降低了小鼠原代皮层神经元中的Aβ水平。另外，使用慢病毒载体递送Neprilysin基因给予APP转基因小鼠后，大脑的同侧斑块明显减少。此外，使用rAAV载体进行Neprilysin基因递送也能有效降解Aβ。然而，使用病毒载体可能存在毒性、免疫原性问题，以及选择靶细胞的能力有限和成本增加等限制。一项腺病毒介导的基因治疗实验中出现了严重的免疫系统刺激，导致患者死亡。因此，在将这种策略用于AD临床试验之前，需要解决与Neprilysin水平上升相关的技术障碍和安全考虑。Apolipoprotein E (APOE)APOE基因编码的蛋白质在脂质代谢中起着重要作用，与AD的发展有关。人类有三种常见的APOE等位基因，分别是ε2、ε3和ε4，其中ε4等位基因在AD患者中的频率较高。APOE4等位基因与AD的风险增加有关，与Aβ的清除能力较弱相关。研究表明，通过基因治疗引入APOE2等位基因可以改变淀粉样蛋白的发病机制，降低Aβ的浓度和沉积。APOE2与APOE3相比，与Aβ结合后更有效地促进Aβ通过BBB的清除。因此，基因递送APOE2可能是一种治疗AD的有效方法。2022年2月，LEXEO Therapeutics公布LX1001在治疗APOE4纯合子AD患者的1/2期临床试验中获得积极数据。LX1001是一种基于AAV的在研基因疗法，旨在将表达保护性APOE2的转基因递送到携带两个APOE4等位基因的阿尔茨海默病患者的中枢神经系统（CNS），以阻止或减缓疾病进展。初步结果显示，在所有随访时间超过3个月的患者中都观察到脑脊液中的APOE2蛋白表达。在随访时间超过12个月的两名患者中，脑脊液中的tau蛋白水平和磷酸化tau蛋白水平与基线相比降低。此外，APOE基因治疗还可以通过调节胆固醇代谢来影响AD的发展。研究发现，APOE基因治疗可以增加脑内胆固醇的水平，从而影响神经可塑性和Aβ的代谢。基因递送APOE2还可以通过调节胆固醇-羟化酶的表达来改变脑内胆固醇的代谢，进一步降低Aβ的水平。虽然APOE基因治疗在AD治疗中显示出潜力，但仍需要进一步的研究和临床试验来验证其安全性和疗效。此外，精确控制APOE2的表达是一个重要的挑战，以避免潜在的副作用。内皮素转化酶（ECE）ECE是一种锌金属蛋白酶，与Neprilysin类似，参与降解Aβ肽。ECE具有细胞外锌结合活性，主要底物是内皮素-1和内皮素-2，它们是强效血管收缩剂，定位在血管内皮细胞中。ECE-1和ECE-2是两种类型的ECE。ECE-1在N末端侧切割Aβ肽的特定残基，对Aβ40和Aβ42的降解都有显著倾向。研究表明，在AD脑中，ECE-1和ECE-2的水平严重受损。在下颞叶顶叶中，ECE-2的水平会显著降低。因此，ECE也被认为是潜在的AD治疗靶点。Cathepsin B像其他Aβ降解酶一样，Cathepsin B是另一种Aβ降解酶。当给小鼠注射 Cathepsin B抑制剂时，可以减少Aβ40、Aβ42和CTF-β水平。在过表达野生型APP的转基因小鼠中，它还改善了记忆缺陷。由于Cathepsin B存在于淀粉样斑块中，认为它与Aβ的代谢有关，但目前尚不清楚Cathepsin B如何影响Aβ的代谢。已有研究表明，在APP转基因小鼠（J20）中，Cathepsin B缺乏会增加海马和大脑皮层中的斑块负荷和Aβ42/40比率。此外，通过慢病毒进行Cathepsin B基因递送可以降低Aβ水平和硫代黄素S阳性淀粉样斑块，这表明Cathepsin B在Aβ降解中发挥了作用。小结自发现AD以来，科学家们在这个领域进行了广泛的研究，深入探究了AD的病理生理学以开发有效的治疗靶点。最初开发的传统药物并不能作为疾病修复性的解决方案而仅起到缓解症状的效果。基因治疗有望是治疗AD的一种高效选择。近年来，发现了许多基因治疗AD的靶点，临床前和临床试验中已显示出了积极的结果。然而，基因治疗AD仍尚处于早期阶段，其强大疗效依然有待探索和开发，发展历程也将充满挑战，但相信其终将为AD的治疗带来新希望和新突破。参考文献1.Gene therapy: an alternative to treat Alzheimer’s disease.2.Recent advances on drug development and emerging therapeutic agents for Alzheimer’s disease.3.下一款阿尔茨海默病重磅疗法是...4.一年融资13.5亿的基因治疗公司递交IPO，致力开发AD和心血管基因疗法.

引入Introduction目前，中国糖尿病患病率高达11.6%，约1.3亿患者，其中，糖尿病肾病发病率30%以上，男性多见，治疗药物不尽人意。项目发明人丛晓东与中国药科大学团队历经30年研发，从大黄中发现的天然产物大精酸，用于糖尿病并发症。2005-2006年进行临床前研究，药学方面取得了积极进展；2007年与中国药科大学戴德哉教授合作对药理药效、作用机制进行了系统的研究，发现了其三个药理作用机制：①消除糖尿病记忆；②抗血管炎症；③修复血管内皮细胞损伤，证明其完全可以控制和治疗糖尿病多种并发症。自2006年起陆续申请了全程覆盖化合物、晶型、制备方法及用途等多个专利，具有品种的稀缺性和市场的独占性，同时也具有较高的经济与社会价值。目前获得重大突破，取得：（1）中国、欧、美、日、俄发明专利证书；（2）糖尿病并发症的新作用机制及药效获国际医药专家的认可，在国际著名核心期刊SCI公开10多篇研究报告；（3）项目列为国家重大新药创制科技重大专项立项，2017ZX09301066。关于糖尿病肾病的治疗，除控制血糖，控制血压外，控制糖肾低劣度炎症更重要，如何控制肾病的低劣度炎症？今天推荐我们前期的研究数据：一篇2011年在德国药理学杂志发表的一篇文章，“大精酸通过减少肾NADPH氧化酶，CX43和PERK靶点的表达—治疗糖尿病肾病”，见下。大精酸治疗糖尿病肾病的获益（通过减少肾的NADPH氧化酶，CX43和PERK的表达路径）摘要Abstract  糖尿病肾病是糖尿病微血管病变，会不断恶化、发展至出现终末性肾病（ESRD ）。糖尿病肾病的发病机制复杂及其新药开发理论颇具研究价值。糖尿病肾病是一种炎症反应，表现为肾脏内炎症因子及促炎因子的增多，例如肾脏中过氧化物酶增殖体激活受体α（PPARα）、NADPH氧化酶、内质网应激（ER stress）和内皮素受体A（ETA）的上调及缝隙连接蛋白43（Cx43）的下调。氨基胍是晚期糖化终产物的特异性阻断剂，大精酸是由大黄酸和L-精氨酸结合的一种新型化合物。大黄酸具有抗炎活性，经化学修饰后形成的化合物二乙酰大黄酸可用于治疗骨关节炎，并已在欧洲上市。大精酸由于具有两个活性基团——大黄酸和L-精氨酸，可能会有效地抑制炎症因子引起的糖尿病肾病病理改变。以链脲佐菌素对大鼠进行腹腔注射（65mg/kg）造模，结果显示早期糖尿病肾病的微量蛋白尿、血浆中肌酐和尿素升高，这些与肾脏中NADPH氧化酶 p22phox，p47phox和p67phox以及ETA的mRNA和蛋白质的表达上调、(PKR)-like 真核起始因子2α激酶（PERK）的上调以及Cx43下调有关。PERK上调表明糖尿病肾病出现内质网应激，并伴随着炎症因子及致炎因子的增加，这说明糖尿病肾病其实是一种慢性炎症。氨基胍或大精酸能显著缓解这些异常的生理指标。新化合物大精酸能够缓解和抑制糖尿病并发症（如糖尿病肾病等导致的微血管病变），具有一定的临床应用前景。1.前言糖尿病人的血管并发症是致残和死亡的重要原因，糖尿病10年后常引发慢性肾病，比如微血管并发症，糖尿病肾病。在发达国家，糖尿病成为引起终末性肾脏疾病（ESRD）的重要原因(B rown2008)。糖尿病（包括高血糖症）的病理过程是逐步发展的，其促进因子是可调控的。高血糖症引发细胞损伤，包括血管内皮，肾小球和肾小管 ，这些物质都促进糖尿病的最终发生，增加了糖基化的末期产物（AGEs）。体内的糖基化的末期产物（AGEs）可以通过测定HbA1c来反映，然而HbA1c和血糖的降低水平并不能阻止肾脏发展成为终末期肾脏疾病（ESRD）（Okada et al. 2 007）。严格控制血糖并不能减少心血管并发症的死亡率（Mannucci et al.2009）。并且6.9% HbA1c严格治疗组和8 .4 % Hb A1c 标准治疗组的致死率之间没有显著差别（Duckworth et al .2009）。由于活性氧簇（ROS）的增多导致氧化应激，氧化应激参与糖尿病的病理过程（Haidara et al. 2010），因此，抗氧化剂的应用可以在一定程度上减轻糖尿病。活性氧簇（ROS）有许多来源，其中，NADPH氧化酶可能是肾脏组织中最主要的来源。乙酰香草素（APO）是NADPH氧化酶特异性抑制剂，可以有效地改善糖尿病的病理病变（Asaba et al. 2005; Xu et al. 2009）。因此NADPH氧化酶可以作为治疗糖尿病药物干预的重要靶标。STZ注射大鼠导致内皮素系统激活（Liu et al. 2008;Xu et al. 2009），糖尿病病人血浆中ET-1增多（Zanatta et al. 2008）。血管收缩功能受许多因素调控，两种因素比较重要：NO和ET-1。内源性血管舒张物质NO由血管内皮释放，通过cGMP 可以使血管平滑肌舒张，而ET-1则是重要的血管收缩物质。高血糖症引起AGEs，从而产生ET-1，导致组织损伤。ET受体A（ETA）的激活可以降低血管中NO的生物活性，引起血管收缩活性增加，导致肾脏组织血流供应减少。ETA的阻断导致血管舒张反应增强，改善血管痉挛状态。除了对血管平滑肌的直接作用，ET可以导致ROS产生增加（Lund et al. 2005），其中ET的增加可以通过ETA和ETB激活NADPH氧化酶的活性（Peng et al. 2010）。因此，ETA的激活可以认为是一种促炎症因子。细胞内缝隙连接通路由一类连接蛋白调控，其中Cx43在肾小球和肾小管细胞中参与小分子的转运，这参与正常的肾功能。Cx43表达下调表明肾脏细胞中间隙连接通路受损，这影响肾小管和肾小球的功能，从而导致糖尿病的病理过程。由于炎症因子和促炎症因子参与慢性低劣度炎性病变，糖尿病的实质是炎症（Li et al. 2009）。非折叠蛋白响应（UPR）的增加与细胞核转运因子比如PERK的增加有关，PERK反映了ER 应激（Hotamisligil 20 10）。ET-1和ROS的增加，参与糖尿病肾病并发症的炎症反应。大精酸作为大黄酸的衍生物，其大黄酸部分具有抗炎活性。大黄酸对糖尿病的治疗作用有临床应用（Zheng et al. 2008; Gao et al.2010）。NO活性的降低损伤血管内皮，引起糖尿病并发症（Brown. 2008）。L-精氨酸作为NO的供体可以影响NO的外源性生物合成，L-精氨酸的补充可以提高糖尿病血管活性（Coronel et al. 2010）。大精酸是由大黄酸和L-精氨酸结合的新分子。给予大精酸治疗后，可以在体内发挥这两种功能基的作用。我们提出由糖尿病引发的慢性肾病的本质是炎症反应，这包括促炎症因子的升高，例如NADPH氧化酶，ETA和PPARα和生物活性分子PERK的升高。这会引起内质网应激（ER stress）和Cx43的减少，从而参与糖尿病的病理过程。抗炎药物大精酸和氨基胍可以改善肾脏组织中生物指标的改变。氨基胍特异性阻断AGEs 和 iNOS，对改善糖尿病症状具有很好的疗效（Sugim oto et a l. 200 7; Xu et al. 2009; Liu et al. 2008）。3种不同剂量的大精酸，可以改善炎症因子和促炎症因子的作用，从而改善糖尿病肾脏功能。2.材料与方法略。【请见原文】（链接地址）大精酸治疗糖尿病肾病的获益.pdf3.结 果蛋白尿（Proteinuria），血清肌酐（Serum creatinine）及尿素（Urea nitrogen）大鼠链脲佐菌素注射给药8周后，血清葡萄糖含量（28.58±6.71mmol/L）相比正常值（7.98±2.41mmol/L）明显升高，P<0.01。同时，与正常组大鼠相比，链脲佐菌素注射组大鼠的24h尿微量蛋白、血清肌酐和尿素含量也随之增加（Fig.2）。大精酸治疗4周能够减轻这些变化，治疗作用与剂量具有相关性，100mg/kg剂量给药比氨基胍更有效地降低血清肌酐和尿素水平。这表明大精酸能够治疗糖尿病肾病所发生的血清肌酐和尿素异常，但并不能缓解血糖的增高。PPARα（过氧化物酶体增殖物激活受体α）在糖尿病肾脏中，PPARα的mRNA和蛋白表达与正常组相比显著下调，P<0.01（Fig.3）。PPARα的下调与肾功能异常有关，而氨基胍能够缓解这种病变，促使肾功能复原。3种剂量的大精酸都可显著改善PPARα的受限表达，使其趋于正常；大精酸的最大治疗效应要比氨基胍更好（P<0.01）。NAPDH氧化酶我们测定了NAPDH氧化酶的三个亚单位p22phox、p47phox和p67phox在肾组织的mRNA表达和蛋白含量，其中，与正常组大鼠相比，链脲佐菌素注射组的含量明显增高。口服给予大精酸100mg/kg，减轻NAPDH氧化酶异常表达，与氨基胍相比同样有效，而且大精酸的最大治疗作用要强于氨基胍（Fig.4）。内皮素系统我们检测了大鼠糖尿病肾组织中ppET-1，ECE和ETA的mRNA表达，发现ET系统的基因表达相对于正常组别明显上调，P<0.01（Fig.5a-c）。ETA的蛋白浓度也明显上升，与其mRNA变化一致。这些数据说明ET系统的激活是糖尿病肾脏中的致病因子之一。大精酸直接抑制了ppET-1，ECE的mRNA及ETA的mRNA和蛋白表达，使他们趋于正常。氨基胍治疗组也显著抑制了ET系统的激活；但是大精酸比其更为有效。Cx43（链接蛋白43）在糖尿病肾组织中，我们发现Cx43的mRNA和蛋白表达，相比于正常组显著下调（Fig.6）。对于维系正常肾功能来说，细胞间隙中的小分子交换必不可少；而链脲佐菌素诱导的肾功能异常，会损害这种肾组织细胞间的交换机制。与未施用链脲佐菌素的组相比，氨基胍显著缓解了这种异常变化。3种剂量的大精酸都改善了Cx43的表达，也促进了肾功能恢复。Fig. 4 Upregulation of mRNA and protein abundance of NADPH oxidase subunitsp22phox (a, b), p47phox (c, d),and p67phox (e, f) were found in the diabetic kidney. These changes were blunted by aminoguanidine (AMG;100 mg/kg, po) and argirein(AR; 50,100, and 200 mg/kg, po). x ± s, n=8. **P<0.01 vs. normal; ##P<0.01 vs. STZPERK（pkr样真核起始因子2α激酶）糖尿病肾脏中ET系统和NADPH氧化酶的变化显著，这说明糖尿病肾病可能具有炎症机制。PERK是一种能调节核内转录过程的生物活性分子，基于此，检测了PERK的表达。肾脏中PERK的基因和蛋白表达都显著上调（Fig.7），显示出UPR的增加，这导致了肾功能恶化及ETA、NADPH氧化酶的上调。肾组织中PERK的异常表达是内质网应激的信号，而氨基胍和大精酸可以显著减缓这种异常。200mg/kg灌胃剂量的大精酸可完全抑制PERK的上调，这比氨基胍更为有效。这说明在抑制糖尿病的内质网应激方面，大精酸至少与氨基胍有同等或超过的药效。Fig. 5 Upregulation of mRNA of the ppET-1 (a), ECE (b), ETA(c), and protein abundance of ETA (d) was found in the kidney in STZ-injected rats. These changes were suppressed by aminoguanidine (AMG;100 mg/kg, po)  and argirein(AR) at three doses (50, 100,and 200 mg/kg, po). x±s. n=8,**P<0.01 vs. normal; ##P<0.01vs. STZ; $P<0.05 vs. AMGFig. 7 Upregulation of mRNA (a) and protein (b) of PERK in thekidney was found in STZ-injected rats and alleviated by aminoguanidine(AMG) and argirein (AR). x±s. n=8. **P<0.01 vs. normal; ##P<0.01 vs. STZ; $P<0.05 vs. AMG4.讨论大鼠注射STZ 8周后大鼠出现高血糖症，导致肾功能的显著改变，同时肾脏PPARα的mRNA和蛋白表达下降。PPARα的表达降低与NADPH氧化酶的上调有关。AMG和大精酸能通过调节NADPH氧化酶逆转PPARα的异常。PPARα是一种配体激活的核转录因子，能够调节周围脂肪代谢。在醋酸去氧皮甾酮盐性高血压中，PPARα的激动剂氯贝丁酯能够使肾小管细胞色素P450的表达上调，20-羟二十碳四烯酸产生增多（Zhou et al.2008）。PPARα的激活能抑制脂毒性，炎症，和ROS的产生，使细胞内信号通路保持正常，减少血管损伤，降低糖尿病微血管并发症的发生率(Hiukka et al. 2010)。尽管很多研究表明，由于其对脂相关或者不相关因素的都有作用，PPARα可能成为预防微血管病的新靶点，但是临床证据还很少。虽然研究表明PPARα的抗炎活性对心脏具有保护作用(Chen et al. 2010)，但是，非诺贝特激活的PPARα在肾脏的作用却具有争议：上调的PPARα是有益的，但是因为同型半胱氨酸导致肌酐浓度增加而对肾脏有害(Foucher et al. 2010)。PPARα的表达对氧化和炎症反应敏感，我们以往的研究发现，非PPARα激动剂如抗氧化和抗炎药物对其都有调控作用。如在糖尿病心脏中，维生素C能够使异常表达的PPARα趋于正常，同时下调NADPH氧化酶的异常增高(Lee et al. 2010)。小檗碱能够通过上调PPARα的表达，缓解糖尿病肾病(Liu et al. 2010; Noh et al. 2010)。抗氧化和抗炎药物上调PPARα却不会增加对肾功能有影响的同型半胱氨酸，因此比PPARα的直接激动剂更有利。糖尿病肾病处在进行性发展状态之中，通过监测HbA1c，血糖能够在很长时间内保持正常，但是肾功能却在不断下降，最终发展为ESRD。糖尿病肾病的病理过程机制尚不明确，我们认为这可能是肾小球组织和肾小管上皮细胞长期的炎症反应，因此与炎症反应相关的生物指标可能与肾脏的进行性损害有关。NADPH氧化酶是高血糖症导致肾功能异常最重要的原因之一，是糖尿病肾病（DN）中ROS的主要来源。吞噬细胞上的NADPH氧化酶所有组成部分，以及Nox-1和Nox-4在肾脏都有表达特别是肾血管，肾小球，足细胞，小管细胞和皮质中的成纤维细胞。血管紧张素II的刺激能够导致调节亚基p22phox表达上调 (Gill and Wilcox 2006)。在肾系膜细胞中，NADPH氧化酶的表达受ETA调控(Xu et al. 2009)。研究发现，NADPH氧化酶的特异性抑制剂夹竹桃麻素（Apocynin）能够缓解糖尿病肾病，肾脏中NADPH氧化的激活可能由PKCα的磷酸化介导(Thallas-Bonke et al. 2008)。NADPH氧化酶的过度表达是氧化变化（包括MMP-9，ETA和ETB）的基础，导致了糖尿病血管并发症中血管活性的异常(Xu et al. 2008a, b)。本实验中，糖尿病大鼠肾脏皮质中NADPH氧化酶的膜亚单位（p22phox）和胞浆中的调节亚单位（p47phox和p67phox）都表达上调，与之前的发现一致(Etoh et al. 2003; Xu et al. 2009)。本文中，我们还发现大精酸不能抑制高血糖症，但是却能缓解糖尿病肾病，这主要与显著降低NADPH氧化酶有关。NADPH氧化酶的表达上调提示了体内氧化应激状态，这会导致肾小球和远端小管的损伤，后者也是糖尿病肾病的主要损伤。NADPH氧化酶的过度激活，会出现肾小球和肾小管间质功能异常，而血管紧张素转化酶抑制剂或醛固酮对NADPH氧化酶都有抑制作用(Tojo et al. 2007; Strippoli et al. 2005; Ribeiro and Gavras 2006)。糖尿病肾病的实质是上一种炎症，大精酸能有效缓解DN可能是通过其抗炎活性对NADPH氧化酶直接抑制而产生的。糖尿病肾病病理过程中，除肾素—血管紧张素—醛固酮系统有关外，ET-1也是NADPH氧化酶的激活因素，ET-1介导了长期的微量蛋白尿，而在与糖尿病肾病和高血压肾病中，长期微蛋白尿与肾小球和肾小管的纤维化有关(Neuhofer and Pittrow 2006)。在糖尿病肾病和高脂血症诱导的肾功能不全中，ET受体双重阻断剂CPU0213能抑制NADPH氧化酶的激活并缓解微量蛋白尿症状(Xu et al. 2009) (Luo et al. 2009)。内皮素受体拮抗剂CPU0213的抗氧化作用可能是因为其对NADPH氧化酶的抑制。在异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化病变中，ETA和ETB介导了NADPH氧化酶的激活，并与MMP-2，MMP-9的上调以及Cx43的下调有关(Peng et al. 2010)。在糖尿病血管病变和视网膜病变中，NADPH氧化酶，MMP-9和ETA的上调造成的损害可能是一种炎症反应(Kern. 2007)。过氧化亚硝基是一种自由基，能促使eNOS的解偶联，降低NO生物利用度，进而对血管内皮造成损伤。NO的产生减少是STZ注射引起的大鼠糖尿病肾病中的肾脏损害的重要因素(Keynan et al. 2000)。补充L-精氨酸增加可利用的NO，使血管功能恢复正常(Coronel et al. 2010)。给予大精酸治疗后糖尿病大鼠的肾功能得到改善，可能与其增加了NO的生物利用度有关(Liu et al. 2008; Xu et al. 2009)。缝隙连接蛋白（Cx）在细胞间缝隙连接通讯中至关重要，对血管的功能的发挥也很必要。异常的缝隙连接蛋白参与了DN中肾功能的损害。Cx40在脉管系统中缝隙连接形成的中发挥主要作用，它也参与了肾血流量的自我调节(Just et al. 2009)。嘌呤霉素氨基核苷诱导的实验性足细胞损伤肾病模型中，肾小球缝隙连接蛋白Cx43表达降低 (Herrmann et al. 2010)。肾小球缝隙间正常沟通对正常肾功能是必要的，还依赖于正常的细胞外基质。细胞外基质MMP-2和MMP-9的异常表达会导致通过缝隙间传导信号减弱，损伤血管功能 (Xu et al. 2008a)，正常的MMPs，ETA和NADPH氧化酶表达对于糖尿病肾病中损伤的肾功能的恢复是必要的(Xu et al. 2009; Liu et al. 2008)。有研究表明，肾功能损伤是由于缝隙连接蛋白异常影响了肾小球近端组织钙信号，肾小管嘌呤信号，肾小球反馈以及水盐的重吸收而造成的(Hanner et al. 2010)。Cx43的通信损伤与ETA(Tang et al. 2008)，NADPH氧化酶(Zheng et al. 2010)，MMPs(Li et al. 2008)的异常联系密切。过量的ET-1的合成与释放会导致肾小球毛细管静水压升高，系膜基质沉积，炎症因子增多，足细胞损害(Ortmann et al. 2004)，最终导致肾小球硬化症和肾小管间质纤维化的发生，同时肾功能退化。内皮素系统的上调是高血糖症导致炎症反应的重要部分，使用内皮素受体拮抗剂(Neuhofer and Pittrow 2006;Xu et al. 2009)或使用中药汤剂(Liu et al. 2008)均可抑制上调。大精酸能改善肾功能，可能也与其通过发挥抗炎活性，抑制ETA的上调有关。维持或增强内质网功能对预防慢性代谢改变引起的损害是必要的。尽管内质网应激和高血糖症对分子伴侣的作用机制尚不明确，一些发现还是能表明恢复内质网的正常功能能够减缓多种代谢性疾病的发展进程。肾功能的改变与氧化应激中的生物指标的改变主要受增强的细胞核转录介导，分子伴侣PERK的增多就是核转录的三个主要通路之一(Hotamisligil 2010)。内质网应激会导致非折叠蛋白响应（UPR）的激活，贯穿于胰岛素抵抗和2型糖尿病中多种不同炎症和应激信号通路。内质网应激导致了肾脏病理与功能的改变，大精酸和AMG减少上调的PERK转录和蛋白表达缓解糖尿病肾脏功能和生物指标的异常的新途径。代谢疾病引起的氧化应激的增强与伴随着的内质网应激相关，使用抗氧化剂维生素E和维生素C能减少内皮细胞中高糖造成的氧化应激，但是对内质网应激无作用，说明内质网应激对抗氧化的响应与经典的抗氧化药物不同(Sheikh-Ali et al. 2010)。上调的PERK调控内质网应激的启动是一系列炎症反应的结果，包括NADPH氧化酶的上调，PPARα的下调，ET系统的上调和细胞间缝隙连接信号减弱，抗炎药物大精酸能显著的抑制这些炎症反应。5.结论综上所述，NADPH氧化酶的激活，ET通路的上调，PPARα的下调以及的PERK上调都是炎症或者促炎症因子，他们促使了肾脏功能损害。这些异常变化实质上是糖尿病肾病中炎症反应的结果，并不取决于血糖的高低，这些炎症反应能被大精酸所抑制。通过抗炎能够减缓糖尿病肾病的病理进程，对减少糖尿病肾病（DN）病人ESRD的发生意义重大。6.致谢与参考文献本工作得到了国家自然科学基金项目81070145的资助。非常感谢纽约州立大学的David Triggle教授为编辑正文的英语写作风格提供的帮助。参考文献：略【见原文】附：作者简介Introduction丛晓东中国药科大学77级药学专业1982年-2002年，任中国药科大学/中药学院助教、讲师、副教授。1999年—2005年，山东绿叶制药集团/南京新药研究中心R&D 总监；期间，2000年—2003年兼烟台大学化学生物理工学院 教授。2005年-2007年8月江苏联创医药技术有限公司 总经理；2005年—2007年兼南京师范大学生命科学院 教授；2007年—2022年浙江中医药大学/中药炮制技术研究中心 副主任；2016年3月至今南京中敬医药科技研究所 所长；南京瑞因大健健康科技有限公司 董事长。1982-2000年：中国药科大学 （1）获国家中医局1991年度中医科技进步一等奖；（2）同上项目，1992年度国家科技进步一等奖。2000-2007年：（1）获新药证书2个（独家产品）；（2）二类中药临床批件（多个化合物专利证书+有效部位专利证书）；（3）主持国家863计划人工皮肤中试与产业化项目,获生产批件；（4）获国家发明专利证书6项。2008-2022年：（1）承担国家重大专项、国家发改委、卫生部、中国药典、浙江省自然科学基金等科研项目多项；（2）发表论文约100篇，其中，中文80多篇；国际SCI论文27篇；（3）成果：获中华人民共和国教育部-科学技术进步奖二等奖。获中国发明专利证书10项，国际化合物专利证书（欧盟、美国、日本、俄罗斯）4项。联系方式：13372006183信息来源：丛晓东往期推荐本平台不对转载文章的观点负责，文章所包含内容的准确性、可靠性或完整性提供任何明示暗示的保证。------------THE END------------点击查看：投稿获丰厚稿费关注药研 一路同行药研论坛：始终以为药品研发一线人员提供高质量、高性价比培训为第一宗旨。自成立以来，累计举办近60期药品研发、注册领域研讨班。据统计，中国医药工业百强企业和研发百强企业均超过90%参加过药研收费类培训。截至2022年底，包括上海强生、辉瑞、阿斯利康、山德士、日本大冢、大鹏、卫材、小林制药、扬子江、恒瑞、正大天晴、东阳光、科伦、中科院等在内的2600余家企事业单位参加过药研线下收费培训，得到业界普遍认可与好评！药研学院：已同众多企业合作近百期直播课，全网观看突破100万+，药研直播课聚焦药品研发相关主题，平均观看人数行业领先。药研自媒体矩阵20万+：目前药研公众号研发领域关注用户约10万人！双直播平台10万人，微信社5万人，其中制药企业和研发机构关注量4000+。商务合作：15911172616