TMPRSS2

研究背景： 临床雄激素受体拮抗剂转化为AR突变驱动的激动剂对前列腺癌（PCa）的治理提出了重大挑战，需要新的抗AR疗法来对抗突变诱导的耐药性。浙大侯廷军教授团队采用基于结构的虚拟筛选和生物学结合的方法，发现了新颖的纯的对AR野生型和AR突变体的拮抗作用的AR拮抗剂。本文选择AR LBD的激动构象进行虚拟筛选，重点研究配体-靶标结合。 研究内容： 与ARLBP高亲和力的Hit化合物E10的发现 首先，对于不同配体的AR LBD晶体结构，对不同精度的Glide评分系统的区分能力进行了评估。对不同预处理的AR配体和诱饵，然后将小分子配体对接到AR晶体结构中，并与晶体结构叠加进行比较。结果表明，对接过程可以准确再现晶体配合物中小分子配体的结合构象。为优化SBVS的效率，通过SP对接、XP对接、药物相似性过滤和结构聚类的级联，从specs化学文库中筛选89种不同结构的化合物。通过竞争配体结合试验初步评估这89个化合物与AR LBD的结合亲和力，在10μM浓度下，E10表现出约为100%的结合亲和力。随后，通过梯度浓度进一步评估E10的结合力，E10与LBD呈剂量依赖性结合，IC50比Enz高0.63μM。E10是一种AR激动剂，使用LNcap-eGFP实验进一步评估了E10对AR转录活性的拮抗活性，E10在一定浓度范围内对AR具有拮抗作用，但随着浓度的进一步增加而下降，而且在缺乏DHT的情况下，E10也促进了AR的转录活性。为了确认E10对携带ART878A突变体的LNCap细胞系的激动作用是否与T878A突变有关，在AR阴性的PC3细胞系中进行双荧光素酶报告基因测定来评估野生型AR的转录活性，在E10浓度较高时，抑制作用逆转为激动作用。在缺乏DHT的情况下，E10也会在微摩尔浓度下刺激ARwt的转录活性，在图1HLNCap细胞中的行为一致。在拮抗模式下，E10作为部分激动剂，在协同模式下，E10作为纯激动剂。     图 1：识别靶向AR LBP的命中化合物E10（PDB ID:3V49）。（A） 已知AR配体和诱饵的Glide SP和XP对接分数分布。（B） 还原AR晶体结构中的原配体。（C） SBVS协议的工作流程。（D） 评估通过SBVS鉴定的89种化合物（10μM）对AR的相对结合亲和力（n=3）。（E） E10的化学结构。（F） 在梯度浓度下测定E10与AR LBP的竞争性结合亲和力（n=3）。（G） 在DHT（5 nM）存在的情况下，E10和Enz对LNCaP eGFP细胞（n=3）AR转录活性的影响。（H） E10和Enz在没有DHT的情况下激活LNCaP-eGFP细胞中的AR（n=3）。1的值定义为10nM DHT诱导的eGFP信号。（I） E10和Enz对DHT（2nM）存在下外源转染ARwt（n=3）的PC3细胞中AR转录活性的影响。（J） E10和Enz在用野生型AR外源转染的PC3细胞中激活AR，不含DHT（n=3）。1的值定义为2nM DHT诱导的荧光信号。 自由能源景观中状态的代表性构象为结构优化提供了重要信息     为了预测E10与AR LBD的动态结合相互作用，进行MD模拟，累计时间600ns，0~100ns的均方根偏差(RMSD)逐渐增加到2.5Å范围，100~600ns稳定在2.2~2.5Å范围。通过对100~600ns的迹线平均1000帧来计算MM-GBSA结合自由能，并进行残差能量分解以标记能量贡献较高的关键残基Leu705、Asn706、Met746和Phe765等13种氨基酸。通过主成分分析(PCA)生成一个自由能图来描述具有代表性的自由能相对较低的构象。S1的能量阱聚集了大量的构象，代表了最低的能量态，化合物E10主要与Leu705和Asn706形成氢键，并与Phe765发生π-π堆积相互作用，同时与AR LBP发生疏水相互作用。S2和S3表现了相对较高的自由能，E10的整体取向保持不变，但两种构象都发生了明显的位移。 图 2：与LBD结合的命中化合物E10的MD模拟（PDB ID:3V49）。（A） E10的RMSD值。（B） AR LBP中的关键残基预计会与E10相互作用。（C） PCA构建的E10自由能景观和代表性构造图。 有人提出由一个仲胺键连接两个芳香环的核心支架。其中胺保存与Asn705形成氢键的能力，同时，在吡啶环上取代或添加向外延伸的LBP口袋的基团。为了从化合物E10的支架中获得有效的拮抗剂，在MD模拟的指导下，在specs和chemDiv库中鉴定出24个E10类似物，然后对化合物进行LNCap-eGFP测定来评估其AR的拮抗活性，其中E15活性最佳，IC50值为0.95μM。随后根据方案1的合成路线，合成了6个以EL15为基础的衍生物。      方案1：化合物EF1-EF6的合成 表1：E10类似物的结构和AR拮抗活性（NA:无活性） E10类似物EL15和EF2是纯AR拮抗剂 EF2和EF5均表现出良好的AR拮抗活性。IC50值为0.6和0.67μM，而Enz的IC50值为0.14μM。为了排除EL15、EF2和EF5可能的激动作用，在没有雄激素的情况下，使用LNPcap-eGFP测定方法评估这些化合物的反活化作用，在相对浓度大于10μM时，EF5表现出较弱的激动作用，而EL15和EF2均未表现出激动作用。用经过处理的LNCap-eGFP细胞的上清液来测定EL15、EF2，EF5对PSA的抑制活性。EF5对PSA的抑制作用不理想，EF2和EL15表现出明显的剂量依赖性。进一步评估EF2和EL15的靶向能量，这两种化合物与AR均表现出竞争性结合，IC50值为8.53μM和4.79μM，与Enz相当，表明EL15和EF2直接靶向AR的LBP，抑制AR的转录活性，进一步评估EL15和EF2对内源性AR应答基因的调节作用，使用定量PCR评估一组特征明确的雄激素调节基因的转录水平，DHT诱导了三个具有代表性的AR调节基因的mRNA水平，EL15和EF2可以不同程度地显著抑制这种诱导，并呈剂量依赖性。与Enz相比，EF2对KLK3和FKBP5的抑制作用相似，EL15略逊于EF2和Enz。进一步的western blot检测显示，EL15和EF2均能显著抑制内源性PSA，但不抑制AR表达。这些结果支持EL15和EF2对AR信号通路的干预 。 图3 EF2和EL15通过靶向AR LBP干预AR信号通路。（A）在没有DHT的情况下，EL15、EF2和EF5激活LNCaP eGFP细胞中的AR。1的值定义为10nM DHT诱导的eGFP信号（n=3）。（B）通过测量LNCaP-eGFP细胞培养物中分泌的PSA来评估EL15、EF2、EF5和Enz对PSA的抑制作用（n=3）。（C） EL15、EF2和Enz与AR LBP的结合亲和力（n=3）。（D）在10nM DHT存在的情况下，KLK3、TMPRSS2和FKBP5的相对mRNA表达（n=3）。（E） AR和PSA在LNCaP细胞中的表达（n=3）。ns，不显著**与DHT组相比，P<0.01。 EL15和EF2抑制了变异AR突变体的转录活性并且抑制AR阳性细胞系的增殖 本文评估了EL15和EF2对AR拮抗剂耐药性AR突变体。Enz对ARF877L和ARF877L/T878A突变体都表现出明显的转录激动作用，并且单独存在F877L突变相比，T878A和F877L突变同时存在时的效力更强。Bic显著提高了AR的转录活性，而化合物EL15和EF2对ARF877L的转录抑制作用呈现剂量依赖性，充分拮抗ARF877L/T878A突变体的转录活性，对ARW742CEL15，EF2和Enz的效果相似。EL15和EF2对野生型和突变型AR都是有效的AR拮抗剂。为了进一步验证EL15和EF2对AR阳性细胞株增殖的抑制。研究它们对不同特征PCa细胞增殖的影响。EF2在AR阳性PCa细胞系中表现出不同程度的增殖抑制，与雄激素依赖无关，在功效上超过Enz。在雄激素依赖型LNCap细胞和C4-2B细胞中，EF2对细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性，EF15的抑制作用弱于EF2和Enz。在雄激素独立的22Rvl和Vcap细胞中，EL15没有明显活性，而EF2在较高的浓度下仍有一定的抑制作用。对于AR阴性的DU145和PC3细胞，EF2和EL15均表现出与Enz相似的不显著的疗效，表明其选择性抑制AR信号通路。     图 4:EF2在不同阶段阻断AR激活，并且比其他NR更特异于AR。（A） EF2和Enz对DHT诱导的N/C相互作用的抑制作用。用GAL4-LBD、VP16-NTD和GAL4荧光素酶报告基因转染的PC3细胞与1μM测试化合物和10 nM DHT一起孵育24小时。**与DHT组相比，P<0.01。（B） EF2和Enz对DHT诱导的内源性AR核转位的影响（n=3）。将两种提取物中DHT处理组的密度归一化为1**与DHT组相比，P<0.01。EL15和EF2对PR（C）、MR（D）和GR（E）的拮抗活性（n=3）。EL15和EF2对PR（F）、MR（G）和GR（H）的激动活性（n=3）。 EF2阻断DHT诱导的AR N/C相互作用和核转位并且EF2特异性拮抗AR。 本文用暴露于EL15和EF2的人胃上皮细胞的存活率，证明EF2和EL15对AR阳性PCa细胞有特异性活性。EF2阻断DHT诱导的AR N/C相互作用，当缺乏C端组分，N端组分和雄激素任一种时。荧光信号都不能增强，当DHT加入到含有C端和N端组分的样品时，荧光素酶信号增强，分离细胞核和细胞质部分采用western blot分析来确定DHT诱导的AR核易位的影响，EF2和Enz均能显著抑制DHT诱导的AR核易位。相对于GR、MR和PR特异性拮抗AR。 图5:EF2在不同阶段阻断AR激活，并且比其他NR更特异于AR。（A） EF2和Enz对DHT诱导的N/C相互作用的抑制作用。用GAL4-LBD、VP16-NTD和GAL4荧光素酶报告基因转染的PC3细胞与1μM测试化合物和10 nM DHT一起孵育24小时。**与DHT组相比，P<0.01。（B） EF2和Enz对DHT诱导的内源性AR核转位的影响（n=3）。将两种提取物中DHT处理组的密度归一化为1**与DHT组相比，P<0.01。EL15和EF2对PR（C）、MR（D）和GR（E）的拮抗活性（n=3）。EL15和EF2对PR（F）、MR（G）和GR（H）的激动活性（n=3）。 EF2通过氢键和π-π堆积相互作用与AR LBP结合    利用长时间MD模拟，来阐明EF2在AR LBP中的结合构象，EF2非氢原子的均方根偏差在前100ns逐渐增大到2.0~2.5Å范围，在100~600ns保持平衡，从100到600ns之间的MD轨迹中结构和能量分析，突出了13个氨基酸残基，对EF2的结合贡献显著，为了阐明EF2的构象分布在100~600ns的轨迹上进行主成分分析，然后构建了自由能景观，在整个景观的构象空间有两个均匀匹配的能量阱，对比分析结合模式差异很小S2的典型构象缺乏Phe765的π-π叠加效应，S1的代表构象与E10类似。对ARL705A、ARN706A和ARM746A突变体进一步分析，L705A突变将EF2从AR拮抗剂转化为部分激动剂，N706A突变消除了EF2的影响，M746A突变显著降低了EF2的拮抗活性，而Enz保存一致的拮抗活性。 图6:EF2通过氢键和π-π堆叠相互作用的网络与AR LBP结合（PDB ID:3V49）。（A） EF2的RMSD值。（B） AR LBP中的关键残基预计会与EF2相互作用。（C） PCA构建的EF2自由能景观和代表性构象图。（D） EF2和AR LBP之间潜在相互作用的示意图。（E） DHT激活ARwt、ARL705A、ARN706A和ARM746A（n=3）**与其他组相比，P<0.01。（F） 通过萤光素酶报告基因测定法确定Enz和EF2对DHT诱导的ARL705A、ARN706A和ARM746A转录活性的拮抗作用（n=3）。 EF2在C4-2B异种移植小鼠模型中有效抑制肿瘤生长 EF2有效抑制C4-2B异种移植小鼠模型的肿瘤生长，用静脉注射1mg/kg和5mg/kg的剂量灌胃给药分析EF2的药代动力学。结果表明，EF2具有较高的口服生物利益度，但其半衰期相对较短。因此通过灌胃给予EF2每天两次，评估EF2对C4-2B异种移植小鼠CRP肿瘤生长的影响。 表2:EF2的药代动力学参数 在17天的治疗期间，EF2表现出强大的抗肿瘤功效。而且在该剂量的EF2下，没有观察到任何小鼠的明显宿主毒性，在治疗期间体重稳定，用苏术精和伊红染色和免疫组织化学分析，来评估细胞增殖标志物Ki67和细胞凋亡相关蛋白切割-caspase3在对照组和治疗组肿瘤标本中的表达水平，免疫结果表示，EF2降低了Ki67蛋白的表达，同时增加了切割-caspase3的表达。     图7:化合物EF2在C4-2B异种移植物CRPC小鼠模型中的抗肿瘤疗效。（A） C4-2B异种移植物的肿瘤体积变化。小鼠接受50mg/kg剂量的EF2或赋形剂治疗，每天两次通过灌胃给药（n=5）。（B） 治疗期间小鼠的体重（n=5）。（C） 用载体或EF2治疗的肿瘤的H&E染色和免疫组织化学。（D）用赋形剂或EF2治疗的肿瘤中Ki67或Cl-Capase 3水平的定量（n=5）。所有数据均以平均值±SEM表示。**P<0.01。 结论与展望： 在这项研究中，利用AR LBD的激动性构象，进行了SBVS来鉴定对AR LBP的高亲和力化合物。在89个候选化合物中，E10对AR LBP的结合亲和力最高，是Enz的3.5倍。在E10结构和能量分析的指导下，购买并合成30个类似物，其中EF2和EL15是对抗ARwt和各种耐药AR突变体的有效拮抗剂。此外EF2有效阻断DHT诱导，抑制AR下游靶向基因，而且选择性强。通过MD模拟和诱变研究，确认了参与EF2作用的关键氨基酸。此外，体外抗肿瘤实验表明，EF2在C4-2B异种移植CRPC小鼠模型中具有良好的治疗潜力。通过MD模拟引导SBVS选择的高亲和命中化合物的结构优化，发现新的AR拮抗剂。化合物EF2可作为开发PCa新疗法的先导化合物。    作者：欧霞 校审：周金明 编辑：蔡江涛 时间：2025年3月4日 参考文献：Wang H, Wang X, Zhong H, Cai L, Fu W, Chai X, Liao J, Sheng R, Shan L, Xu X, Xu L, Pan P, Hou T, Li D. Discovery of 5‑Nitro‑N‑(3-(trifluoromethyl)phenyl) Pyridin-2-amine as a Novel Pure Androgen Receptor Antagonist against Antiandrogen Resistance. J. Med. Chem,2024, 67(22):20514-20530. 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

导读：由SARS-CoV-2病毒引起的COVID-19疫情对人类健康构成严重威胁。疫苗接种是控制其传播最有效、最经济的干预措施，SARS-CoV-2疫苗现主要有灭活疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、mRNA、DNA及VLP疫苗等。其中，mRNA疫苗因开发周期短、易于工业化、响应新变种的灵活性及诱导更好免疫反应的能力等优势而在控制疾病方面发挥重要作用。本期文章菌菌就mRNA疫苗的研究历程、作用机制、SARS-Cov-2病毒结构、新冠疫苗抗原设计及主要产品等总结如下，以期为各类mRNA疫苗的设计提供参考。 01 mRNA疫苗的发现和发展1.1 mRNA疫苗的发展历程 随着mRNA递送系统和核酸修饰技术的出现，用于癌症治疗和预防多种传染病的mRNA技术的研究进展迅速。1961年，Brenner及其同事首次描述mRNA分子，由于其高度不稳定性，1969年才使分离的mRNA在体外首次合成蛋白。1984年Krieg及其同事使用SP6 RNA聚合酶在体外成功转录合成mRNA。1987年Malone及其同事利用阳离子脂质封装mRNA以注射到真核细胞，获得体外表达mRNA的高效系统。1990年Wolff及其同事首次将体外转录（IVT）产生的mRNA注射到小鼠股四头肌肌肉中并成功表达。用脂质体包裹的编码流感病毒核蛋白（NP）的mRNA对小鼠进行免疫接种后，在宿主体内诱导产生抗流感CTL，标志着首个mRNA疫苗开发的里程碑。2005年Karikó及其同事发现，使用修饰尿苷合成的mRNA可逃避免疫系统的识别和降解，提高mRNA体内稳定性和免疫原性，开创了mRNA疫苗的新时代。随后，多款mRNA疫苗进入临床开发阶段。 在新冠疫情的管理预防中，mRNA疫苗是首批处于临床试验的SARS-CoV-2候选疫苗。截至2022年2月8日，世卫组织报告337种处于开发阶段的SARS-CoV-2候选疫苗，其中47种是mRNA疫苗（23种已进入临床试验）。 mRNA疫苗将编码目标抗原的核酸分子递送到宿主靶细胞中进行表达引发免疫反应。当携带抗原的病原体入侵时，宿主的免疫系统迅速触发体液和细胞免疫反应。1.2 mRNA疫苗的作用机制 Th1细胞反应 mRNA-1273、BNT162b2等mRNA疫苗及其他SARS-CoV-2疫苗可诱导Th1细胞反应。分布在外周淋巴器官的CD4+ T细胞在识别AP-MHC II类复合物和T细胞受体（TCR）后分化为Th1细胞，其可分泌白细胞介素2（IL-2）等多种细胞因子，同时上调相关受体（IL-2R）表达，IL-2与IL-2R结合后，促进T细胞增殖和CD8+ T细胞活化。活化的CD8+ T细胞分化成CTL，进一步诱导细胞免疫。当效应细胞（Th细胞和CTL）清除抗原时，T细胞反应减弱，免疫系统恢复稳态。此外，Th1细胞可分泌IFN-γ和TNF-α，前者诱导CD4+ T细胞分化并增强免疫反应强度。 图1 疫苗诱导的Th1细胞反应 生发中心反应和体液免疫调节 除T细胞反应外，mRNA疫苗诱导的滤泡辅助性T细胞（Tfh细胞）还可触发有效的SARS-CoV-2抗原特异性生发中心B细胞（GC B细胞）反应。一些活化的Th细胞可移动到淋巴滤泡分化为Tfh细胞。活化的B细胞在淋巴滤泡中增殖、分裂，形成生发中心，在Tfh细胞帮助下，GC B细胞的抗体基因可变区发生高频点突变，抗体类别实现转化，最终形成记忆B细胞和浆细胞，产生高亲和力抗体。研究表明BALB/c小鼠的GC B细胞反应在注射基于全长S蛋白的mRNA疫苗后7-14天达到峰值。 GC B细胞的持续存在是诱导长寿命浆细胞的前提，持续性GC B细胞反应可分泌强效、持久的中和抗体，并引发强大的体液免疫。  图2 疫苗诱导的生发中心反应 记忆细胞反应 疫苗诱导的记忆细胞反应可诱导Th1和持续的生发中心反应，从而触发强大的细胞和体液免疫。该过程形成的抗原特异性记忆T细胞和B细胞对长期保护具重要意义。与初始T细胞活化不同，记忆T细胞的激活不再依赖抗原呈递细胞，且可诱导更强的免疫反应。大多数记忆B细胞进入血液参与循环，遇到相同抗原时被迅速激活产生有效抗体。此外，在COVID-19康复患者和单剂接种mRNA疫苗的正常群体中都可检测到记忆细胞的存在。  图3 疫苗诱导的记忆细胞反应 02 SARS-CoV-2病毒结构 SARS-CoV-2是一种单链正义RNA包膜病毒，属冠状病毒科β冠状病毒属。SARS-CoV-2分离株Wuhan-Hu-1全长基因组含29881个核苷酸，编码16种非结构蛋白（nsp）、9种辅助蛋白和4种结构蛋白，4种结构蛋白包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。 N蛋白位于衣壳内，通过将病毒RNA包裹成核糖核蛋白复合物来保护病毒RNA基因组，并执行包括病毒RNA复制和转录在内的多种功能。M蛋白在病毒表面大量存在，因其膜的弯曲特性负责病毒融合、组装和出芽功能。E蛋白负责病毒粒子组装、形态发生与致病。S蛋白是存在于病毒粒子外膜上的跨膜结构蛋白，通过与宿主细胞表面的特异性受体接触，促进病毒进入宿主细胞。  图4 SARS-CoV-2病毒结构 03 SARS-CoV-2 mRNA疫苗的抗原设计 SARS-CoV-2表面的三聚体S蛋白在介导宿主细胞侵袭中起关键作用，被认为是疫苗设计的主要抗原。在病毒感染过程中，S蛋白被Furin酶和TMPRSS2裂解为S1和S2亚基。S1亚基含信号肽（SP）、RBD、N端结构域（NTD）、CTD1和CTD2，主要通过RBD与血管紧张素转化酶2（ACE2）受体相互作用。S2亚基包括融合肽（FP）、双七肽重复序列（HR）、中心螺旋区（CH）、连接结构域（CD）、跨膜结构域（TMD）和细胞质尾部（CT），负责介导病毒与宿主细胞膜间的融合。RBD和ACE2受体在宿主细胞膜上结合后，S蛋白发生结构重排，形成融合后构象。研究发现，S蛋白预融合构象具良好免疫原性，被认为是理想的目标抗原，大多数中和抗体是基于S蛋白在融合前构象的表位塑造的，一旦S蛋白获得融合后构象，该表位被覆盖并减少中和抗体的产生。  图5 SARS-CoV-2 mRNA疫苗设计策略的基本原理 设计SARS-CoV-2 S蛋白常采用两种策略： （1）2P突变策略：S2亚基中心螺旋位置顶部的两个氨基酸被脯氨酸（K986P和V987P）取代，可有效提高S蛋白在预融合构象中的稳定性。该策略适用于SARS-CoV-2和其他β冠状病毒，BioNTech、Moderna、CureVac等均采用该策略。 （2）S1/S2切割位点策略：直接将野生型SARS-CoV-2蛋白S中的Q677TNSPRRARYSV687序列删除至Q677TILRYSV683或氨基酸突变（RRAR到GGSG），阻止S蛋白在宿主细胞中切割，保持其结构稳定性并诱导更强的免疫应答。 某些研究机构已开发出优化S蛋白的独特策略，如删除S2亚基上的TMD、CT、FP并突变S2′切割位点（K814A、R815N），提高预融合S蛋白的构象稳定性。在某些情况下，可在ORF区域的前段插入额外的序列，增加抗原蛋白的表达。此外，由于S蛋白是三聚体，在S蛋白或RBD蛋白编码区3'端引入T4噬菌体纤维蛋白的三聚体基序可模拟S蛋白的天然结构并增强抗原免疫原性。研究表明当选择不同的信号肽时，目标抗原的蛋白质表达水平存在显着差异，其中S蛋白信号肽MFVFLVLLPLVSSQCV已被包括BioNTech和Moderna在内的多家开发商用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗；RiboBio在SARS-CoV-2 mRNA疫苗中采用免疫球蛋白重链可变区（IGVH）信号肽序列（MDWIWRILFLVGAATGAHS）来增加目标蛋白表达。综上，由于mRNA疫苗涉及序列编辑，可对S蛋白的 结构、稳定性和表达进行修饰改善空间构象，从而提高疫苗诱导的免疫应答。  表1 SARS-CoV-2 mRNA疫苗抗原设计策略 04 上市/在研的新冠mRNA疫苗4.1 主要上市产品 BNT162b2：BioNTech和Pfizer合作开发的5种SARS-CoV-2 mRNA候选疫苗分别为基于核苷修饰的mRNA（BNT162b2、BNT162b1、BNT162b3）、未修饰的mRNA（BNT162a1）和自扩增mRNA（BNT162c2）。其中BNT162b2编码全长刺突糖蛋白，S2亚基中具两个脯氨酸突变以维持蛋白质的融合前构象；BNT162b1编码分泌形式的三聚体刺突蛋白RBD。BNT162b2于2020年12月11日获得美国政府的紧急使用授权（EUA），并于2021年8月获得FDA的生物制品许可证申请批准（BLA），成为全球首个上市的用于治疗COVID-19的mRNA疫苗。 mRNA-1273：Moderna开发的mRNA-1273编码SARS-CoV-2的全长预融合刺突蛋白，具良好耐受性，是美国政府于2020年12月18日获得EUA的第二种mRNA疫苗，2022年2月1日正式获FDA的生物制品许可证申请批准上市‌。Moderna成功推出的另外2款新冠疫苗为针对原始株及Omicron BA.1的二价疫苗（mRNA-1273.214）和针对Omicron BA.4/BA.5的二价疫苗（mRNA-1273.222）。 ARCT-154：由CSL与Arcturus therapeutics联合开发的首款上市的saRNA疫苗，已获日本厚生劳动省（PMDA）批准上市。ARCT-154抗原编码基因为SARS-Cov-2 S蛋白D614G突变序列，复制酶来自VEEV非结构蛋白编码序列nsp1-4。 SYS6006：石药集团于2023年3月22日宣告其研发的mRNA新冠疫苗（SYS6006）在中国纳入紧急使用，用于预防COVID-19，SYS6006是涵盖Omicron BA.5突变株核心突变位点的mRNA疫苗，于2022年4月获得国家药监局的应急批准进行临床试验，已在中国完成Ⅰ、Ⅱ期和序贯加强免疫临床研究，结果证明了其安全性、免疫原性和保护效力。4.2 其他上市/在研产品 PF-07252220：由Pfizer和BioNTech合作研发的主要用于预防流感和流感/COVID-19组合疫苗，已发布的III期试验结果表明在18-64岁患者中疗效优于已上市的流感疫苗。而针对流感/COVID-19的联合mRNA疫苗仅达到一项免疫原性治疗终点的结果。 mRNA-1083：由Moderna研发的COVID-19/流感疫苗（mRNA-1083）由流感疫苗mRNA-1010和下一代新冠疫苗mRNA-1283组成。mRNA-1083的III期研究在2个独立的年龄队列中评估免疫原性、安全性和反应原性：65岁及以上组，mRNA-1083与赛诺菲的高剂量流感疫苗Fluzone及Moderna的Spikevax进行比较；50-65岁组，与GSK的Fluarix及Moderna的Spikevax进行比较。结果mRNA-1283显示出对照组的非劣效性，并引发对3种流感病毒株（H1N1、H3N2和B/Victoria）及SARS-CoV-2更显著的免疫反应。且Moderna成为首家及唯一公布COVID-19/流感联合疫苗III期阳性结果的公司。 GSK4382276和GSK4388067：GSK购买了CureVac公司针对COVID-19（GSK4388067）和流感 （GSK4382276）mRNA疫苗的全球开发权，并可选择开发针对禽流感的组合疫苗和附加疫苗。GSK4388067和GSK4382276目前都处于II期试验中。 ABO1020：继艾博生物与沃森生物、中国军科院共同研发的新冠mRNA疫苗ARCoVax（编码SARS-CoV-2的RBD）于2020年6月成为国内首个获批开展临床试验的新冠mRNA疫苗后。2024年7月，Cell出版社医学旗舰刊Med发表艾博生物新冠变异株（BA.4/5）mRNA疫苗（ABO1020）的III期保护力临床数据，采用随机、双盲、安慰剂对照设计，评价在既往接种2剂或3剂新冠灭活疫苗人群中接种2剂ABO1020的疫苗效力、免疫原性和安全性，并达到预期评价目的和标准。同时基于体液免疫评价结果和免疫机制，阐明针对国内主流的2剂新冠灭活疫苗建立的免疫保护相对弱的实际情况，通过首次接种2剂mRNA疫苗，可突破免疫印迹，面对新的突变株提供有效的交叉保护。 SW-BIC-213：由“国产mRNA疫苗三剑客”之一的斯微生物自主研发的新冠mRNA疫苗，在老挝完成Ⅲ期临床并达到主要研究终点，该疫苗在研发设计中包含了Delta、Omicron等多种新冠病毒变异株均有的D614G突变，对新冠病毒流行株具保护效力，有一定广谱性。‌‌ 05 结语 与传统疫苗不同，mRNA疫苗可调整抗原设计，甚至允许组合来自多个变体的序列以响应病毒基因组中的新突变。目前mRNA疫苗所赋予的安全性和保护性是令人满意的，但长期保护作用需进一步临床研究确定。 参考文献  [1] Fang E, Liu X, Li M, et al. Advances in COVID-19 mRNA vaccine development[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2022, 7(1): 94. [2] Li M, Wang H, Tian L, et al. COVID-19 vaccine development: milestones, lessons and prospects[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2022, 7(1): 146. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

研究背景在该工作中，中国海洋大学秦钟课题组报告了靶向雄激素受体N末端结构域（AR-NTD）的小分子PROTAC化合物，通过连接子将AR-NTD拮抗剂和不同类别的E3连接酶配体栓系而获得。代表性化合物BWA-522有效地诱导AR-FL和AR-V7的降解，并且在体外比相应的拮抗剂更有效地对抗前列腺癌（PC）细胞。其研究结果证明BWA-522降解AR-FL和AR-V7蛋白可以抑制AR下游蛋白的表达并诱导PC细胞凋亡。BWA-522在小鼠中达到40.5%的口服生物利用度，在比格犬中达到69.3%。在LNCaP异种移植模型研究中，BWA-522也被证明是有效的PROTAC降解剂，在口服给药60 mg/kg剂量后，导致76%的肿瘤生长抑制。这项研究表明，BWA-522是一种有前途的AR-NTD PROTAC，用于治疗AR-FL和AR-V7依赖性肿瘤。    图1    前列腺癌（PC）是最常见的恶性肿瘤之一，在男性中发病率和死亡率都很高，全球有超过1000万男性患病，每年全球有超过40万人死亡。在早期阶段，PC可通过放射治疗或手术缓解，而接受雄激素剥夺疗法（ADT）治疗晚期PC的患者最终获得致死性去势抵抗性前列腺癌（CRPC），这通常与雄激素受体（AR）转录增加有关。AR及其持续的下游信号传导对于PC细胞的生长、存活和增殖至关重要。野生型全长AR基因由8个外显子和内含子组成，其形成C末端配体结合结构域（LBD）、铰链、DNA结合结构域（DBD）和N末端转录结构域（NTD）的编码序列，（图2A）。此外，AR基因突变主要由AR-LBD和剪接变体（ARV）上的特定点突变组成。AR-V7，缺乏LBD和铰链区，是最广泛表征的AR剪接变体，并被鉴定为能够显著促进CRPC中AR调节基因表达的主要雄激素非依赖性驱动因子。大多数FDA批准的AR拮抗剂（图1B），如氟替卡松（1）、比卡鲁胺（2）、恩杂鲁胺（3）和阿帕鲁胺（4），通过竞争性抑制雄激素靶向AR-LBD。然而，LBD中的点突变和AR变体中完整LBD的缺失导致对这些拮抗剂的原发性或获得性耐药性。近年来，也报道了一些针对其他AR结构域的拮抗剂。据报道，化合物5是一种有效的AR-DBD拮抗剂，在AR转录活性中的IC50= 0.1μM。Sadar等人报道，EPI化合物是从海绵中分离的双酚A衍生物，并发现通过抑制NTD的AF-1结构域来阻止AR转录活性。EPI-002（6）是一种有效的AR-NTD拮抗剂，及其乙酸酯前药EPI-506（7）于2015年进入I期临床试验，但其效力不足且代谢特性较差，限制了其进一步的临床试验。EPI-7386是EPI家族化合物中的另一种AR-NTD拮抗剂，化学结构未公开，于2020年进入I期临床试验。   图2：(A)AR的结构和AR基因突变。(B)靶向LBD、DBD和NTD的AR拮抗剂的结构蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）是一种有前景的治疗策略，其通过劫持细胞泛素-蛋白酶体系统来诱导靶蛋白的泛素化，随后通过蛋白酶体降解。（图3）与传统的小分子抑制剂相比，PROTAC具有显著的优势，包括它们治疗“无法控制的目标”的能力并通过以较低剂量和毒性消除病原蛋白质来避免耐药性。Crews等人报道了第一个AR-PROTAC降解剂（8），其设计基于MDM 2作为E3连接酶。为了改善AR降解活性和药代动力学（PK）特征，Arvinas的科学家采用有效的AR拮抗剂作为配体，沙利度胺衍生物作为（CRBN）配体，并将它们与有利的刚性接头连接以获得ARV-110（9），其是在所有测试的细胞系中具有低纳摩尔水平的DC50值的口服生物可利用的AR- PROTAC。ARV-110是2019年第一个进入I期临床试验的AR- PROTAC降解剂，目前正在II期临床试验中进行评估。Wang等人随后报告两个系列的基于CRBN、ARD-2128（10）和ARD-2585（11）的有效口服AR- PROTAC在小鼠中的口服生物利用度分别为67%和51%。虽然已经开发了许多AR-LBD PROTAC，成功实现了AR的降解，但这些PROTAC靶向AR变体（如缺乏LBD的AR-V7）仍具有挑战性。MTX-23（12）是第一种AR-DBD靶向PROTAC化合物，据报道可有效降解全长AR（AR-FL）和AR-V7，DC 50值分别为2和0.37 μM。该课题组的研究组最近报道了含有AR拮抗剂、连接子以及能够诱导AR-FL和AR-V7降解的Hsp 90结合基序。假设靶向AR-NTD的PROTAC应能够同时降解AR-FL和AR-V7，并将在PC和CRPC治疗中显示出临床价值。在此，该课题组报告了第一例AR-NTD靶向PROTAC的设计、合成和生物学评价研究，发现了一种新型的口服活性AR-FL和AR-V7 PROTAC降解剂BWA-522。  图3：代表性AR PROTAC的化学结构研究内容  AR-NTD PROTAC是异双功能分子，通常由三种组分组成：结合AR-NTD蛋白的配体、募集E3连接酶复合物的第二配体和将这些配体连接在一起的接头（图4A）.由于E3连接酶，VHL和CRBN已成功用于PROTAC的设计，该课题组选择了它们相应的配体来募集AR-NTD PROTAC中的E3连接酶（图4B）。   图4.(A)含有AR-NTD配体和E3连接酶配体的AR-NTD PROTAC的一般方案(B)VHL配体和CRBN配体的结构作为一种有前景的小分子AR-NTD拮抗剂，EPI-002被认为与NTD AF-1区域共价结合（图5）。首先，EPI-002氯代醇子结构的仲醇通过快速可逆的相互作用位于NTD AF-1碱性位点附近。随后，碱位点从仲醇中除去质子，导致形成亲电子环氧化物。反应性环氧化物最终与NTD AF-1中的亲核位点反应形成共价键。因此，该课题组认为EPI-002的溶剂暴露的丙二醇亚结构可以是通过适当的接头掺入E3连接酶配体而不显著降低对NTD的结合亲和力的合适位点。    图5：EPI-002与NTD AF-1区共价结合反应的提出机制   使用含叠氮化物的VHL配体和含炔的EPI-002衍生物之间的点击反应，该课题组设计并合成了三种具有不同长度接头的潜在AR-NTD PROTAC（13−15）。在AR依赖性细胞系LNCaP和VCaP中通过蛋白质印迹法评价PROTAC的AR-FL降解。同时，还测试了它们在高水平表达AR-V7的VCaP细胞中降解AR-V7的能力。通过灰度分析定量AR-FL和AR-V7蛋白水平，提供表1中总结的数据。数据显示，基于E3连接酶VHL的化合物13 - 15在两种PC细胞系中的浓度为1和5μM时，仅具有将AR-FL降低17.6 - 53.5%的适度能力。然而，这些化合物都成功地将VCaP细胞中的AR-V7降低了38.1 - 63.3%。总之，这些结果表明，AR-NTD PROTAC具有开发为AR-FL和AR-V7双降解剂的潜力。   表1：VHL配体与柔性连接体的连接体亲和性研究该课题组质疑CRBN配体是否可以用于设计AR-NTD PROTAC。首先是确定柔性接头中的接头长度是否对AR降解活性有显著影响，该课题组继续使用点击反应合成具有脂肪烃接头和聚（乙二醇）（PEG）接头的化合物16 - 21（表2）。Western印迹显示，这些化合物在LNCaP细胞中仅轻微降解AR-FL蛋白，但有效地降低VCaP细胞中的AR-V7蛋白。在5μM下，具有最短连接体长度（10个原子）的化合物16使AR-V7中度降低64.1%。在连接体长度为11−14个原子的化合物17−20中，AR-V7的降解水平没有显著改善。具有12个原子连接基的化合物18在1和5μM下分别使AR-V7减少62.2%和71.1%。随着连接体长度延伸至13（19）和14个原子（20），降解活性略微降低，并且与18 - 20相比，含有PEG连接体的化合物21在VCaP细胞中显示出降低的降解活性。接下来，该课题组合成了化合物22 - 24（表2），引入带有哌啶基团的半刚性连接体来限制构象并提高溶解度。在以5μM浓度给药的这些化合物中，随着连接体长度的延长，观察到AR-V7降解水平呈增加趋势。含有10个原子的连接体的化合物24显示出最有效的降解活性，在LNCaP细胞中，1和5μM的浓度分别使AR-FL降低21.2%和39.1%。此外，在VCaP细胞中，在1和5μM下，它使AR-FL显著降低22.6%和49.3%，使AR-V7显著降低54.4%和75.7%。  表2：柔性和半刚性连接基CRBN配体的连接基稳定性研究连接体的构象限制有助于形成稳定且高产的三元复合物，从而显著提高化合物的降解活性。因此，该课题组合成了化合物25 - 34（表3），其中使用了刚性越来越大的连接体，如四元或六元杂环，以限制化合物的构象。虽然这些化合物中的大多数未能降解LNCaP细胞中的AR-FL，但化合物28（BWA-522）在1和5μM下使AR-FL降低了48.7%和72.0%。在VCaP细胞中，化合物25 - 27（在连接体中有两个杂环）使AR-FL轻微降低<40%，使AR-V7中度降低43.6 - 69.9%。类似地，通过将化合物27中的连接体延长一个亚甲基获得的BWA-522显示出最强的AR-FL和AR-V7降解活性，在1和5μM下分别将AR-FL有效降低52.4%和73.1%，将AR-V7有效降低77.3%和84.6%。化合物29−32在其连接基中含有三个杂环，在1和5μ M下保持有效的降解活性，使AR-FL水平降低62.5%，AR-V7水平降低29.2− 80.3%。然而，观察到化合物31和32在5μM时诱导细胞死亡。在22 Rv 1和PC-3细胞中评价了不同浓度的化合物31和32对AR-FL和AR-V7的降解作用。结果表明，31和32在低浓度（0.03−1μM）下不能诱导AR-FL和AR-V7降解，但在高浓度下导致细胞死亡。此外，化合物31和32显著抑制AR非依赖性PC-3细胞生长，IC50值分别为1.03和1.37μM。这些结果表明，化合物31和32显示出脱靶细胞毒性。化合物33和34（在接头中含有三个环和一个酰胺基团）使VCaP细胞中的AR-FL和AR-V7水平降低<50%，其效力低于化合物BWA-522。    表3：不同刚性连接体对AR-NTD PROTAC影响的研究最后，由于使用刚性连接体后降解活性的提高，通过将化合物25 - 34中沙利度胺苯环的连接位置从间位改变为邻位，合成了化合物35 - 44（表4）。Western印迹显示，这些化合物中的大多数在降低LNCaP细胞中的AR-FL蛋白水平方面上级相应的间位取代化合物。此外，它们在VCaP细胞中对AR-FL和AR-V 7保持相同的降解活性。在LNCaP细胞中，化合物39在1和5μM时分别使AR-FL降低13.9%和62.4%，并且是化合物35 - 44中最有效的AR-FL和AR-V7降解剂。在VCaP细胞中，1μM和5μM的AR-FL进一步有效降低44.3%和51.2%，AR-V7降低37.1%和72.7%。与化合物31和32类似，化合物41和42在5μM时显示出细胞毒性。尽管化合物43相对于化合物33改善了LNCaP细胞中AR降解的能力，但未观察到其在VCaP细胞中具有任何降解效力。化合物44在降低两种细胞中的AR-FL和AR-V7水平方面比34有效得多。  表4：不同刚性连接体对AR-NTD PROTAC影响的研究基于AR-FL或AR-V7在LNCaP和VCaP细胞系中的明确降解活性，该课题组评估了三种代表性化合物（24、BWA-522和39）在小鼠中的PK（表5和图6）。以2 mg/kg静脉内给药后，化合物24、BWA-522和39具有不同的半衰期（t1/2 = 0.5、8.2和13.6 h）和最大浓度（Cmax = 518、782和662 ng/mL）。化合物BWA-522达到了最高的最大浓度（图6A），这反映了高血浆暴露（AUC值= 3018 h·ng/mL）。BWA-522具有594 mL/h/kg的低血浆清除率，而化合物24和39的血浆清除率为6636和2314 mL/h/kg。还比较了10 mg/kg剂量的三种化合物的口服给药，发现化合物24、BWA-522和39也具有不同的半衰期（t1/2 = 1.8、7.9和20.5 h），达到最大浓度的时间（tmax = 0.2、4.7和2.0 h）和最大浓度（Cmax = 130、376和47 ng/ mL）。化合物BWA-522具有优异的口服血浆暴露，AUC值为5947 h·ng/mL（图6B），这比24（图6A）或39（图6C）好得多。此外，化合物BWA-522的口服生物利用度为40.5%，而化合物24和39的口服生物利用度分别仅为7.8%和12.3%。鉴于BWA-522在小鼠中的良好口服利用度，进一步评估了其在比格犬中的PK（表6）。当以5 mg/kg的剂量口服给药时，BWA-522的t1/2较长，为31.2 h，口服生物利用度较高，为69%。这些结果共同表明，BWA-522是一种口服活性PROTAC降解剂。  表5：化合物24、BWA-522和39在小鼠体内的PK     图6：小鼠血浆浓度-时间曲线 表6：化合物BWA-522在比格犬中的PK基于在LNCaP和VCaP细胞中的初步筛选和PK谱，选择BWA-522用于用蛋白质印迹法进一步评估其降解能力。使用三种PC细胞系LNCaP、VCaP和22 Rv 1测定BWA-522的效力。在这些细胞中，22 Rv 1是一种CRPC细胞系，据报道其对AR拮抗剂恩杂鲁胺具有耐药性。BWA-522显著降低了三种细胞系中AR-FL或AR-V7的水平。它在最初的3小时间隔有效地降低了LNCaP细胞中的AR-FL水平，并产生了持续的降低直到24小时，但AR-FL在48小时内反弹（图7A）。值得注意的是，在VCaP和22 Rv 1细胞中，AR-V7的降解效果比AR-FL的降解效果更显著（图7 B、C）。数据表明，BWA-522还以剂量依赖性方式诱导AR-FL和AR-V7蛋白降解（图7A-C）。处理24小时后，BWA-522在三种细胞系中有效地将AR-FL和AR-V7从0.03μM降低到30μM。在高达30μM的浓度下，未观察到BWA 522的钩状效应。BWA-522在LNCaP、VCaP和22 Rv 1细胞中诱导AR-FL蛋白降解，DC 50值分别为3.45、0.73和2.41μM（图7D）。它还在VCaP和22 Rv 1细胞中实现了有效的AR-V7蛋白降解，DC50值分别为0.67和0.76μM（图7E）。与结构-降解关系研究一致。  图7：（A-C）LNCaP、VCaP和22 Rv 1细胞中AR-FL和AR-V7蛋白的蛋白质印迹分析。D，E）基于PC细胞系中归一化为α-微管蛋白水平的AR-FL和AR-V7水平的定量的BWA-522的DC50值  该课题组发现在同一细胞系中，相对于比AR-FL蛋白的降解，BWA-522更有效地诱导AR-V7蛋白降解，接下来研究BWA-522在PC细胞系中的降解机制。10μM BWA-522处理10 h后，VCaP和22 Rv 1细胞中的AR-FL和AR-V7被有效地降低。当在BWA-522处理前用蛋白酶体抑制剂MG132（3μM）、活化E1酶抑制剂MLN4924（1μM）和CRBN配体沙利度胺（100μM）预处理细胞时，降解效应显著阻断（图8）。这些机制数据充分证实了BWA-522对AR-FL和AR-V7的降解依赖于泛素蛋白酶体系统和CRBN泛素连接酶。  图8：BWA-522降解AR-FL和AR-V7的作用机制 AR及其变体在调节AR依赖性PC细胞的增殖中至关重要，因此接下来使用EPI-002（5）作为AR拮抗剂对照，在LNCaP、VCaP和22 Rv1细胞中测试了BWA-522的抗增殖能力，治疗6天。如图9A-C所示，BWA-522在抑制AR依赖性PC细胞生长方面具有很高的效力，在LNCaP和VCaP细胞中达到1.07和5.59μM的IC50值。BWA-522能有效抑制恩杂鲁胺耐药细胞22 Rv 1的生长，IC50值为4.08μM。AR拮抗剂EPI-002在这些癌细胞中显示出弱的抑制作用（IC50值>30μM）。  图9：BWA-522对PC细胞的抗增殖活性该课题组还在LNCaP和22 Rv1细胞系中进行了集落形成实验，以评估长期细胞生长抑制作用。培养细胞并用三种浓度的BWA-522和EPI-002处理。与细胞活力测定一致，BWA-522以剂量依赖性方式减少这两种细胞系的殖民地形成（图10）。EPI-002在这些癌细胞中显示出比BWA-522更弱的抑制活性。  图10：BWA-522对PC细胞的抗增殖活性   为了研究BWA-522对AR信号通路的作用，该课题组接下来测试了BWA-522抑制LNCaP（图11A）和VCaP（图11B）细胞中AR下游蛋白表达的能力，AR-NTD拮抗剂EPI- 002（6）作为对照。在用两种化合物处理48 h后，结果显示BWA-522可以有效地并且剂量依赖性地下调两种细胞系中的TMPRSS 2、FKBP 51和PSA蛋白水平。在LNCaP细胞中，BWA-522在10μM时使TMPRSS 2蛋白水平降低1.45%，使FKBP 51蛋白水平降低1.25%，使PSA蛋白水平降低1.15%。同时，10μM的BWA-522还使VCaP细胞中的TMPRSS 2蛋白水平降低约40%，FKBP 51蛋白水平降低约25%，PSA蛋白水平降低>80%。这些结果表明，BWA-522诱导AR-FL和AR-V7的降解，导致其下游信号通路的抑制。  图11：BWA-522抑制AR调节蛋白的表达此外，该课题组还使用蛋白质印迹分析来研究BWA-522诱导LNCaP和VCaP细胞凋亡的能力。如图12 A、B所示，BWA-522在5和10μM浓度下导致PARP-1和Caspase-3的显著裂解。EPI-002仅对两种PC细胞中裂解的PARP-1和裂解的Caspase-3的表达有轻微影响。  图12：BWA-522抑制AR调节蛋白的表达   评估了在小鼠的LNCaP异种移植肿瘤模型中口服施用BWA-522的抗肿瘤功效。当肿瘤达到约100 mm 的平均体积时，小鼠每天接受媒介物、恩杂鲁胺（10 mg/kg，PO）和BWA-522（20或60 mg/kg，PO）治疗，持续4周。根据已报道结果，EPI-002在体内的抗肿瘤功效取决于施用的高剂量。因此，每天以180 mg/kg口服给予EPI-002。结果如图13所示。数据显示，两种测试剂量的BWA-522有效抑制肿瘤体积和肿瘤重量的生长（图13 A、B）。在28天处理结束时，与溶媒对照相比，经口给予180 mg/kg EPI-002和10 mg/kg恩杂鲁胺的肿瘤生长抑制分别为43%和72%。然而，用EPI-002组治疗的一半小鼠的死亡可能与药物毒性有关。与溶剂对照相比，口服给予20和60 mg/kg的BWA-522抑制肿瘤生长26%和76%。令人满意的是，60 mg/kg的BWA-522显示出比180 mg/kg的EPI-002更有效的抑制。在媒介物组中观察到16%的动物体重减轻（图13 C）。在对照组中观察到的体重减轻和其他组的早期报告一致。与溶剂对照相比，20和60 mg/kg的BWA-522在整个实验中没有导致明显的体重减轻，表明小鼠耐受性良好。  图13：BWA-522在小鼠中的LNCaP异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤活性为了探索BWA-522的药物样特征，本研究初步评估了BWA-522的体外稳定性。肝脏代谢是药物从体内清除的主要贡献者，肝微粒体通常用作测量代谢稳定性的酶源。因此，首先通过测量小鼠和人肝微粒体中BWA-522随时间的消耗来确定BWA-522的稳定性。如表7所示，BWA-522在小鼠和人微粒体中代谢稳定，两种物种中的清除率较低，为7.40μL/min/mg蛋白（t1/2 = 187.21和187.35 min）。  表7：BWA-522在小鼠和人肝微粒体中的稳定性 除了肝代谢外，化合物还将通过血浆中的酶，特别是水解酶和酯酶进行降解和修饰。因此，还通过在0、15、30、45、60和120分钟的六个不同时间点将BWA-522与小鼠和人血浆孵育来测定血浆稳定性。BWA-522在120分钟孵育后保持在90%以上，表明BWA-522在小鼠和人血浆中高度稳定。BWA-522的体外稳定性与体内半衰期长有关。        表8：BWA-522在小鼠和人血浆中的稳定性  人类（hERG）通道是一种钾离子通道，在调节心脏电活动中发挥重要作用。62 hERG抑制可导致心律异常，如QT间期延长，从而增加心脏副作用的风险。因此，评价hERG抑制的潜力很重要.在自动膜片钳hERG试验中，BWA-522显示出较低的hERG抑制作用，IC50> 10 μM（表9和S3），表明心脏毒性的风险较低。  表9：BWA-522对hERG通道的影响      结论与展望 从这项研究中，该课题组报告了一系列AR-NTD PROTAC，其将EPI-002衍生物作为AR-NTD配体和不同类型的E3连接酶配体通过接头连接。数据表明，某些具有构象约束接头的PROTAC在降低LNCaP和VCaP细胞系中的AR-FL和AR-V7蛋白水平方面是高度有效的。强效PROTAC的PK评价导致最有效的化合物BWA-522被鉴定为口服生物可利用的AR-NTD PROTAC降解剂。进一步的降解研究证实，BWA-522在LNCaP、VCaP和22 Rv 1细胞系中以剂量依赖性和时间依赖性方式诱导AR-FL或AR-V7蛋白降解，特别是在VCaP细胞中达到0.73μM（AR-FL）和0.67μM（AR-V7）的DC 50。机制研究证实，BWA-522对AR-FL和AR-V7的降解可通过MG 132、MLN 4924或沙利度胺预处理阻断，表明泛素蛋白酶体系统和CRBN泛素连接酶对该化合物的功能至关重要。在体外，BWA-522对LNCaP、VCaP和恩杂鲁胺耐药22Rv1细胞的细胞生长表现出强效抑制活性。它还有效地导致AR靶向蛋白的下调并触发细胞凋亡。此外，口服20和60 mg/kg的BWA-522可有效抑制LNCaP异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长。最后，初步药物样性质的体外评价表明，BWA-522在小鼠和人中具有良好的血浆和肝微粒体稳定性，对hERG抑制作用轻微。总之，BWA-522是一种有效的和口服生物可利用的AR-NTD的PROTAC降解剂，并且有可能成为AR-FL和AR-V7阳性肿瘤的药理学候选药物。  作者：向凤娇 校审：周金明 编辑：蔡江涛 时间：2024年11月17日 参考文献 Discovery of BWA-522, a First-in-Class and Orally Bioavailable PROTAC Degrader of the Androgen Receptor Targeting N-Terminal Domain for the Treatment of Prostate Cancer. J Med Chem. 2023, 66(16):11158-11186. 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓