PSMA x CD3

摘要:免疫细胞治疗作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症护理。这是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的疗法。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）细胞疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法旨在利用身体的自然防御机制来定位和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，需要更高水平的操作，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制和细胞疗法产品设计的基本和临床研究以及技术创新方面取得了显著进展。随着技术的迅速整合和高创新格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足细胞疗法技术进步治疗癌症的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术创新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.引言 癌症是一种利用多种逃逸机制来躲避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变整个免疫系统的功能和组成。抗癌治疗的演变跨越了一百多年，其效果和特异性不断提高，旨在消除癌细胞的同时尽量减少对健康组织的损害。为了实现这一目标，免疫细胞治疗在现有方法中脱颖而出，成为了一种改变游戏规则的解决方案。2017年，食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharm的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和Novartis的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着抗癌治疗加速发展的一个重大里程碑。免疫细胞治疗的基本概念是通过外部供应具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以帮助患者对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应加入到抗肿瘤努力中。免疫细胞治疗的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）和自然杀伤（NK）细胞。肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞治疗的效果不佳。 根据癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润性免疫细胞），外部分化有效的细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞]，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）]。在本综述中，我们将讨论最新的免疫细胞治疗，总结应用于实现和优化这些治疗类别的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞治疗癌症 低风险免疫细胞治疗旨在使用患者自己的免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调的是细胞治疗领域内某些治疗相对更安全、副作用较少，属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞治疗包括四种关键技术：肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、DC疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，必须深入研究促进这些细胞治疗的基本机制和临床进展。 2.1.TIL细胞治疗 TILs是存在于实体肿瘤微环境（TME）中的天然单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润性淋巴细胞（sTILs）。与iTILs相比，sTILs主要是效应记忆T细胞，更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TILs“预训练”攻击癌细胞，同时留下健康的细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质细胞已经显示出治疗晚期癌症的潜力，第一个人类TIL治疗导致转移性黑色素瘤显著消退。实体瘤缺乏理想的肿瘤标志物，使得靶向肿瘤相关抗原（TAAs）具有挑战性。TILs作为具有多样化受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TILs在克服实体瘤的异质性方面表现出优越性，特别是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的趋化因子受体，并且与CAR-T细胞相比，它们的非靶向毒性较低，这归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TILs可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可供扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg，肿瘤相关巨噬细胞，髓系抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL治疗成功的至关重要步骤。TIL在体外的扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前阶段，TILs在高剂量白细胞介素（IL）-2下进行初级扩增。一些方法涉及选择肿瘤特异性TILs进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TILs以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备用于患者给药后进行淋巴细胞减少。 自1988年Rosenberg等人成功将TIL治疗应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL治疗首次被引入用于治疗非小细胞肺癌（NSCLCs），在涉及113名患者的临床研究中。结果显示，TIL与IL-2联合使用对NSCLCs是一种有效的治疗方法，与II期或IIIa期相比，对IIIb期NSCLCs有选择性益处。在初步成功后，TIL治疗的后续发展一直朝着提高治疗其他肿瘤类型的疗效方向发展，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成的肿瘤浸润性B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的临床结果改善。另一项关于胃癌TIL治疗的研究表明，TIL的组织学亚群与不同的存活时间相关。目前，TIL治疗的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发具有更有效分离和扩增方法的有希望的治疗性TILs，并可能与其他抗肿瘤疗法结合使用。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T和NK细胞样表型的异质免疫效应细胞。它们是通过将人的PBMC或脐带血单核细胞与干扰素γ（IFN-γ）、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外培养产生的。CIK细胞独特地表现出对肿瘤的主要组织相容性复合体（MHC）不受限制的靶向性，减少异体反应性，并能够攻击各种肿瘤类型。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子以激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效果。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活动并促进肿瘤细胞凋亡。它们主要通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/认知配体细胞间粘附分子-1（LFA-1/cam-1）与肿瘤细胞上的抗原结合的机制来实现肿瘤杀伤效果。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀伤肿瘤细胞。 激活的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效果和抑制肿瘤细胞，还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。主要由CIK细胞产生的IFN-γ增强了NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究指出，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞性白血病（CLL）细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris指出，某些肿瘤细胞（如黑色素瘤和卵巢癌）通过诱导表达FasL的淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或激活的T细胞被IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制选择性地消除。结合CIK细胞中高水平的抗凋亡基因表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应性的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有超过5,000名患有多种肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌等，参与了CIK细胞疗法。全球CIK细胞（或CIK细胞与DC联合）的临床试验已超过80项。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效果，正在发展中，是治疗癌症的一条令人鼓舞的途径。虽然临床前景看好，但一些公开讨论是必要的。与其他免疫细胞相比，CIK细胞输注后的毒性效应、最小化额外的支持性护理、确定与其他免疫疗法的优势、了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，以及在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs进行“疫苗接种”以对抗肿瘤组织是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs（如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒）处理体外培养的DCs。DCs将摄取抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，对影响免疫系统起着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 DC疫苗，通常采用体外成熟的自体单核细胞并用抗原冲击，已在多种肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间普遍较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每一步上。策略包括扩大DC来源、提高免疫原性、优化抗原选择、开发新的免疫佐剂以及探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效的成人恶性肿瘤治疗提供了希望，特别是对于去势抵抗性前列腺腺癌。通过培养患者的PBMCs与一种由TAA（前列腺酸性磷酸酶（PAP））和GM-CSF组成的重组蛋白（PAP-GM-CSF）来生产。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的一个重要进展，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DC主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂（ICI）以及化疗和放疗结合的免疫疗法中以改善结果。研究表明DC能够激活自然杀伤T（NKT）细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险的免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的综合协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中尤为明显，它们是可适应和协同的。这种协同作用旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效果而闻名，但由于缺乏特定的识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最近的研究表明CIK和DC之间的相互作用会在两个群体内部引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，与CIK细胞共同培养DCs发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展现出有希望的协同效应，即使在之前对CIKs有抵抗力且之前未与DCs共同培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DCs显著增加的IL-12分泌显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种合作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，并增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效果。同时，CIK细胞增强了DCs的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共同培养抑制了人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，并阻碍了肿瘤细胞的增殖。 基于上述机制，DC-CIK疗法以相互适应和协同为特点，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病（GvHD）的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的多个方面，从而形成了更全面的对抗疾病的方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤为有益，其中多种免疫功能障碍发挥作用。总的来说，低风险的免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的确切组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞治疗技术的进步 高风险免疫细胞治疗使用自体干细胞、异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些细胞都需要进一步的操作和评估。这些治疗的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重新激活已有的反应。在这里，我们描述了高风险免疫细胞治疗中的特征设计、转染方法、细胞来源，以及克服抑制性肿瘤微环境（TME）的方法，包括CAR-T、T细胞受体-T（TCR-T）、CAR-NK和CAR-巨噬细胞（CAR-M）。此外，我们提供了对未来趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程受体蛋白，为免疫细胞提供了识别癌细胞表面特定抗原的新能力，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的潜力。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也可能会显著影响治疗效果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。 细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括一个用于目标结合的单链可变片段（ScFv）和一个铰链区域，通常在CAR工程细胞中的免疫球蛋白（Ig）样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞能够识别癌症特异性靶标表位，不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。 CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或抗原丢失的复发，并且结合任一抗原都将触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将编码两个独立CAR分子的单个双顺反子向量转导到单个细胞中，或将编码双价CAR分子的向量转导到细胞中，或共同给药两种不同的CAR工程免疫细胞产品，或共同转导两个向量到单个免疫细胞中编码不同的CAR。这些方法对于B细胞淋巴性白血病特别有前景，尤其是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病（B-ALL），因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞具有显著的疗效，以及CD19/CD22双特异性CAR-T细胞。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，治疗28天后的总体反应率为82%，显示出治疗目的的安全性和有效性。此外，Wang等人表明，CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内表现出相当或更好的功能。 除了ScFv的优化，细胞外区域也得到了改进。与传统CAR直接作用于靶细胞不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR（modCAR）。这种CAR-T（图1D、E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），只要能针对至少一个所需的抗原并介导目标与效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图1. CAR的设计策略。针对肿瘤的CAR设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以生成双顺反子CAR工程细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，生成双价CAR。(C) 通过共同给予两种不同的CAR工程免疫细胞产品（上图）或共同转导两种编码不同CAR的载体到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计装甲CAR以共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以增加效果和持久性。(G) SynNotch CAR通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特设计对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。这也可以通过特设计的转录因子和转录机制（H）实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR细胞（图1F）旨在分泌细胞因子或其他分子，以帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，潜在地提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR细胞或TRUCKs（T细胞重定向用于抗原无限制的细胞因子启动的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合进行探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在早期阶段试验中。值得注意的是，IL-7和IL-15已被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19或CCL-21，能够趋化其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，从而提高了CAR-T细胞的有效性。 CAR设计中的最新发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G，H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过引入可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型的案例使用了布尔逻辑和逻辑门的原理，当所有条件满足时，通过构象变化激活的共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。在体外已经证明了针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还含有一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。 在T细胞中，第一代CAR已构建包含编码针对2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体的可变区域的重组基因片段，这些片段被拼接到α或β T细胞受体（α或β TCR）的C区之一。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并能够识别MHC非限制性的肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T利用T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子包括可诱导的共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中最广泛使用。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给予淋巴瘤患者CD19导向的第二代CAR-T细胞（带有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（带有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和优越的扩张。然而，目前评估仅第三代CAR-T的临床数据有限。在一个研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T治疗，在成人复发/难治性ALL患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解。此外，最近的研究表明，配备有4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与仅有一种共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建。已经开发了包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告称，含有细胞内域的CAR-NK，包含4-1BB和CD3ζ，克服了抑制信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞特别创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞对肿瘤细胞有显著增强的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明，与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同的信号域，如CD3ζ、DAP10和DAP12的CAR构建，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，与包含DAP10域的CAR相比，具有CD3ζ信号域的CAR表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但其细胞内信号域的功能不同，主要是为了增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和多个表皮生长因子样域蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的研究结果表明，添加一个串联的PI3K招募域可以增加对癌细胞的吞噬。CAR-M的第一个临床试验产品是第一代产品，包含CD3ζ作为其细胞内域，并且第一阶段的临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得了FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，非病毒转染技术因其在克服与病毒载体生产相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP合规性方面的经济利益而越来越受欢迎。例如，转座子或移动遗传元素被用来实现高效和持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔能够使免疫细胞如T细胞短暂表达基因组编辑核酸酶，例如CRISPR-Cas9的表达，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简单性、容量和吞吐量以及有利的安全概况方面提供了优势。 与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是主流模式，并被广泛认为是转染困难细胞类型（如免疫细胞）的一种高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组中。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus和Yescarta都是由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。一般来说，γ逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常可以获得30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。 与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具挑战性又效率低下，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，单轮转染效率范围为27%-52%，经过两轮转染后为47%-75.4%。虽然逆转录病毒已被广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏有效的基因转移方法仍是NK细胞在免疫疗法中使用的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入性突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染具有较低的遗传毒性和插入性突变风险。然而，原代NK细胞在LV转导中的效率很低，需要多轮转染。最近，Bari等人表明，用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体的转导效率比用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的高20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在约70%的不同供体的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。用BaEV-gp伪型的慢病毒带有肿瘤特异性CAR在NK92细胞中的转导率几乎达到100%，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的转染方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因表达在转染后约3-5天内下降。但当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，与其他系统相比，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒和转座酶DNA转染到iPSC中，成功地稳定创建了表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。 与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，例如较低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本，以及能够转移基因片段，其载荷能力接近9-10 kb。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的一个有力选择。然而，要充分利用转座子系统对原代NK细胞进行转染，需要进行优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞比其他造血系统中的细胞更难转染和抵抗遗传操作，因为它们有能力识别并响应外来核酸。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒系统，该系统通过感染时Vpx诱导的SAMHD1降解，已被证明可以有效传递转基因到骨髓细胞。Klichinsky团队使用复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35有效地传递CAR到巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了肿瘤杀伤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座子系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即使用的材料是患者自己的细胞。尽管这种方法已证明有效，但存在一些重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时制造的不良等待时间，由于患者T细胞功能障碍可能导致的生产失败，与健康淋巴细胞一起提取的恶性白血病细胞污染产品的风险，高生产成本，标准化的复杂性，以及再剂量机会的限制。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。特别是，CAR-NK是一种有前景的同种异体细胞治疗，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤均无重大毒性副作用。它是一种更简单、可再注射、更实惠的通用治疗。 然而，当前的治疗尚未显示出强大的疗效和/或长期持久性，并且NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要在临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍显示出巨大潜力。 目前，CAR-M主要是自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现并正在进行进一步研究。 在开发同种异体方法时，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和GvHD（移植物抗宿主病）的发展。免疫排斥可能限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性的αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体引起，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，还进行额外的遗传修改。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调控，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定的和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在ALL小鼠模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。 此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，但其长期持久性较短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA类I分子的表达。这种方法防止了异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来物，但仍然容易受到宿主NK细胞的溶解。因此，一项研究使用突变的B2M融合蛋白来解决这个问题。为了在激活的异体CAR-T细胞生产过程中提高HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建众多同质HLA组合库的理想资源。通过从库中选择一个HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间CAR-T细胞的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人生成了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。 研究通过体内发挥效应功能证明了它们抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产满足临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过在培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来分化CAR转染的iPSCs为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了一个骨髓/巨噬细胞分化协议，诱导CAR-iPS向骨髓细胞系分化，成功产生了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中测试时，CAR-iMacs的有效性有限。总的来说，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ并以HLA独立的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞显示出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效应，并且在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续性较差。此外，针对CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行第一阶段的临床试验。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。UCB衍生的CAR-T细胞在体内显示出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明了改善的治疗潜力。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），并且不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展为GvHD，也不太可能迁移到表现GvHD的器官。研究表明，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）与它们的分化对应物相比，具有优越的增殖和干细胞潜力，并且在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩张和持久性。 VSTs拥有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中显示出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，输注CAR-VST细胞取得了良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的第一阶段临床试验中显示出既安全又临床有效。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并促进CAR-T或TCR-T重定向到肿瘤的临床使用。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。PBMC衍生的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们显示出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向针对前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致大部分治疗小鼠的肿瘤被完全根除。一种短暂表达针对间皮素的mRNA CAR，MCY-M11的CAR-PBMC细胞产品已进入临床试验，它是一种混合产品，包含不同的CAR工程T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一类同时具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞群。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质以及糖脂的抗原呈递分子。I型NKT细胞或称为iNKT细胞不具有HLA限制性，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚未知晓。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并且具有增强的消除脑淋巴瘤的能力。另一种异体NKT细胞，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行临床试验，针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者（NCT03774654）。 4.2.改善肿瘤微环境以增强治疗性免疫细胞的效果 免疫细胞治疗实体瘤的效果受限于低持久性和注入后的不充分增殖，这在很大程度上归因于免疫抑制微环境，它不是被动的旁观者，而是癌症进展的积极推动者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和驻留宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子-β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造支持性环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性细胞毒性T细胞。为了根除肿瘤，科学家们开发了几种策略来促进CAR工程或TCR工程治疗性免疫细胞向癌症焦点的迁移和渗透，包括利用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤退缩和增强的抗肿瘤效果。然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗癌的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制肿瘤微环境。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至会导致危及生命的毒性。在肿瘤微环境中阻断TGF-β信号是另一种提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的方法，因为它在肿瘤信号、重塑和代谢中起着至关重要的作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在肿瘤微环境中隔离TGF-β，耗尽调节性T细胞，并促进CTL共刺激。此外，通过转导优势负性TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了对TGFβ有抵抗力的肿瘤特异性T细胞，并已在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。另一种新策略是利用肿瘤微环境中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起被转导，与CAR或TC共表达，以产生工程化CTL。这些工程化CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。最近，这一策略已经进行了临床测试。这些工程化细胞被发现能有效克服免疫抑制肿瘤微环境，例如分泌更多的IFN-γ，积聚在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。细胞外基质为各种抗癌疗法创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和展示肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程巨噬细胞被证明能主动迁移到肿瘤部位，可以作为药物递送系统在抗原特异性环境中局部递送细胞因子和/或细胞毒性物质，显著改变免疫抑制肿瘤微环境，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。张等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现出抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准首个CAR-T细胞疗法产品以来，全球已有10个CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞疗法的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家角度看，高风险细胞疗法的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T疗法的主要临床治疗靶点是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的靶抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在病症方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T在头颈、肝脏和结肠癌症的临床研究正在迅速进展（图2C）。就CAR-NK病症而言，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤病症的进展速度更快（图2C）。 图2. CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法的临床试验。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞疗法临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组。(B) 按国家分组的细胞疗法临床研究数量，同样分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组，Y轴在50到450之间中断。(C) 针对不同适应症的细胞疗法药物的临床进展，细胞疗法药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和固体肿瘤两组。原始数据下载自https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 CAR-NK的临床治疗靶点主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。图2的数据可从补充表2获得。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中变得越来越重要。与替代免疫治疗方法（如免疫检查点抑制剂和细胞因子）相比，免疫细胞治疗表现出了优越的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液系统恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤异质性、靶标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略（如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗）结合起来被认为是有益的，可以通过不同的机制增强整体治疗效果。目前，全球已有10个CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一个获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TIL和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出了希望。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同的抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特征的异质细胞组成，在治疗相对高异质性的恶性肿瘤方面具有优势。另一方面，高风险免疫治疗如CAR-T和TCR-T通常是定向的和高度特异性的，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到了临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原和新抗原，使它们在外来抗原如病毒相关恶性肿瘤方面受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和降低GvHD风险和其他风险的方法为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略使得实现长期效果成为可能。同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低到中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或降低的产品活性。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，使用基因修饰细胞、自体干细胞或同种异体或异种细胞，这需要额外的评估。在临床上，这些疗法有时可能引发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征（CRS），这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风险管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不需要的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GVHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期遗传修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入性突变或遗传毒性以及恶性转化的可能性。然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。重要的是要理解风险在临床研究中无处不在，它被定义为在特定时间框架内发生不利结果的可能性。评估可接受的免疫细胞治疗风险水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，而是可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻微肿瘤或癌症适应症且存在适当治疗方法的患者相比，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。总的来说，免疫细胞治疗的技术障碍相对较高，创新动力强，技术发展多。近年来进展呈爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法如TIL面临由于无法完全消除Tregs而有限的效力。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以高效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉回输无法有效激活DC分化和成熟的影响。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为有希望的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将肿瘤靶向CAR-M转化为肿瘤支持表型方面的高适应性。然而，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来开发中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术创新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

ADC热潮之后，很多制药巨头在布局前沿技术赛道时瞄准了一个共同的方向——双抗。 根据医药魔方数据库，2024年前9个月，全球药企围绕双抗药物达成了31笔交易，数量上比之前三年的每一年都要多。 这其中也不乏制药巨头的重量级押注。8月，默沙东以7亿美元的首付款将同润生物一款处于I期阶段的CD3/CD19双抗CN201收入囊中。7月，诺华与Dren Bio就髓系细胞募集双抗的开发达成合作，交易总额达30亿美元。 与此同时，一些药企也在加快双抗药物的临床开发布局。比如阿斯利康在今年接连启动了TIGIT/PD-1双抗rilvegostomig的4项注册性临床试验，包括联合化疗对比K药的III期头对头研究。 更早下注的玩家已经步入收获。比如，罗氏的眼科双抗法瑞西单抗已成为其业绩增长的核心驱动，上市第2年的销售额便轻松突破25亿美元。强生的埃万妥单抗则在研发端实现了重要突破，联合兰泽替尼头对头击败奥希替尼，并借此拓展了新适应症。 本文对制药巨头的双抗产品管线进行梳理，并对管线较丰富的几家企业进行分析，揭示它们不同的布局重点与扩张策略。 制药巨头双抗产品及临床管线 罗氏：打造畅销产品，站上赛道制高点 在双抗赛道，罗氏已展现王者风采，强大的已上市产品阵容就是其实力的最好印照。根据医药魔方数据库，全球共有15款双抗获批上市，罗氏独占4款，与Genmab并列为全球拥有最多上市双抗产品的药企。不仅仅是数量上的领先，这些产品的商业化成绩亦斐然。立足于已有产品，罗氏徐徐铺开布局版图。 艾美赛珠单抗是首个非凝血因子类血友病药物，可每4周皮下给药一次。它巧妙地利用双抗的作用模式，同时结合凝血因子IXa（FIXa）和FX来模拟FVIII的凝血功能。凭借创新性与变革性治疗价值，艾美赛珠单抗逐步“征服”广大患者，销售额一路攀升，2024上半年创收21.43亿瑞士法郎（约合24.21亿美元），是全球销售额最高的双抗药物。 新一代FX/FIXa双抗RG6512也已推进至I/II期临床阶段，其与FIX和FX形成三元复合物的能力显著优于艾美赛珠单抗，有望以更低的剂量和更长的给药间隔实现突破。继罗氏之后，诺和诺德也看好血友病双抗的开发前景。Mim8的III期研究已传来捷报，预计年内申报上市。 在血液疾病领域，罗氏还先后推出了两款CD3/CD20双抗莫妥珠单抗和格菲妥单抗，形成差异化布局。莫妥珠单抗被设计成典型的1:1结构，疗效相对温和，更适用于惰性淋巴瘤，而格菲妥单抗具有2:1比例的CD20与CD3结合位点，对表达CD20的恶性B细胞产生更强的靶向作用，可以攻克侵袭性和难治淋巴瘤。 除淋巴瘤外，罗氏还希望借力双抗打破多发性骨髓瘤（MM）的现有格局。针对发病率第二高的血液肿瘤，与多数企业押注CD3/BCMA双抗不同，罗氏主要将希望寄托于FCRH5/CD3双抗cevostamab和GPRC5D/CD3双抗forimtamig。I/II期CAMMA 2研究显示，cevostamab针对三重难治性MM患者的总缓解率（ORR）为67%。 法瑞西单抗是当下罗氏增长势头最强劲的双抗产品。今年上半年，法瑞西单抗销售收入几近翻倍，达17.94亿瑞士法郎（+93%，约20.27亿美元），未来销售峰值或将超越巅峰时期的阿柏西普。 法瑞西单抗的成功不是偶然，这依赖于罗氏在眼科赛道的深厚底蕴，此前罗氏已打造出全球首个应用于眼科的抗血管内皮生长因子（VEGF）药物雷珠单抗。法瑞西单抗同时靶向VEGF-A和血管生成素2（Ang-2）两条不同的信号通路，获批了湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD）、糖尿病黄斑水肿（DME）和视网膜静脉阻塞（RVO）继发黄斑水肿三大适应症。与单纯抗VEGF疗法相比，法瑞西单抗显著减少了眼部注射给药频率，只需每4个月给药1次。 眼科赛道，罗氏继续向着“进一步提高护理标准”的战略目标前进。两款靶向VEGF的双抗应运而生。下一代Ang2/VEGF-A双抗zifibancimig采用港式给药系统（PDS）尝试进一步延长nAMD治疗间隔；VEGF/IL-1β双抗经玻璃体内给药，用于治疗RVO继发黄斑水肿。 罗氏在实体瘤领域推进最快的双抗是靶向PD-1/LAG-3的tobemstomig，处于II期临床阶段。PD-1与LAG-3的协同作用已经得到充分验证，BMS的双免疗法Opdualag于2022年3月获批上市。围绕tobemstomig，罗氏重点开启了一项单药或联合TIGIT单抗tiragolumab一线治疗尿路上皮癌的注册性临床（NCT05645692）。 另有三款CD3双抗夯实罗氏在实体瘤领域的布局。CD3/HER2靶向的runimotamab主攻乳腺癌和胃癌；CD3/GPC3靶向的ERY974在探索治疗肝细胞癌的可行性；CD3/CLDN6靶向的SAIL66具备FIC潜质，CLDN6靶点尚未成药，其开发过程必定充满挑战，今年7月安进已终止开发同靶点双抗AMG 794。 双抗的身影也出现在罗氏的神经科学布局中。Aβ/TfR靶向的trontinemab是罗氏在阿尔茨海默病领域的一次大胆创新。 从作用机制上，trontinemab就体现出了与众不同之处，它运用罗氏大脑穿梭技术（brainshuttle），将靶向Aβ的单抗（gantenerumab）与可以和转铁蛋白受体1（TfR1）相结合的蛋白域融合，通过TfR1介导的胞吞转运有效协助抗体穿越血脑屏障。早期临床数据显示，与标准Aβ单抗相比，trontinemab能以相对较低的剂量（1.8和3.6mg/kg）快速且稳健地减少淀粉样蛋白斑块。 手握如此丰富的产品管线，罗氏已率先占据双抗赛道的竞争高地。在不断地开疆拓土中，罗氏还将继续扩大优势。 强生：血液肿瘤、实体瘤、自免全面出击 近几年，强生以每年推出1款产品的速度在双抗赛道强势崛起。2021年5月，全球首款c-Met/EGFR双抗埃万妥单抗在美获批EGFR外显子20插入突变非小细胞肺癌（NSCLC）适应症，其只需5分钟给药的皮下剂型也已申报上市。 埃万妥单抗正在抢占奥希替尼的市场份额，后者2024上半年销售额达32亿美元。MARIPOSA研究中，埃万妥单抗联合兰泽替尼头对头击败奥希替尼，显示出一线治疗EGFR外显子19缺失或外显子21 L858R置换突变NSCLC的PFS获益。MARIPOSA-2研究则聚焦奥希替尼耐药后的未满足需求。凭借这两项研究，埃万妥单抗接连拓展了2项新适应症。 2022年8月，全球首款CD3/BCMA双抗特立妥单抗首次在欧盟获批上市；一年后，全球首款CD3/GPRC5D双抗塔奎妥单抗也问世了。这两款双抗是强生统治MM业务的重要接力产品。 在MM领域，强生早已建立了霸主地位，从FIC蛋白酶体抑制剂硼替佐米到全球首款CD38单抗达雷妥尤单抗，再到BCMA CAR-T西达基奥仑赛和双抗，产品护城河深厚，持续引领着MM治疗手段的演变。MM这块大蛋糕也有很多玩家竞争，仅双抗这一类型药物的相关管线就达到65项，辉瑞的CD3/BCMA双抗elranatamab已经获批上市。 对于后续的双抗药物储备，强生着重开辟实体瘤，前列腺癌是强生下一个进攻方向。靶向CD3/PSMA的JNJ-8114、靶向CD3/KLK2的JNJ-8343、靶向PSMA/CD28的JNJ-9401都已进入临床阶段。 不过JNJ-8114的一项I期研究（NCT05441501）在今年3月刚刚完成，但却已消失在强生2024Q1的管线图中。此前，强生还放弃了另一款治疗前列腺癌的CD3/TMEFF2双抗管线JNJ-8902。 JNJ-8343建立在强生和Zymeworks 2017年的合作基础上。交易背后，强生看中了Zymeworks的Azymetric和EFECT平台，其中Azymetric平台通过对IgG样抗体的重链和轻链进行专有的氨基酸修饰，从而实现单抗到多抗的转换。 JNJ-9401同样诞生于合作模式。2021年10月，强生与Xencor就CD3/CD20双抗plamotamab和CD28双抗达成一笔超13亿美元的交易。不过并不是所有交易都能走到最后。今年6月，强生已经退回了plamotamab的全球权益。至于CD28双抗的开发，除JNJ-9401外，还延伸出了CD28/CD20双抗JNJ-1493这一产品，剑指非霍奇金淋巴瘤（NHL）领域。 靶向CD3/CD22的JNJ-8780也主要用于NHL，强生于2020年9月启动了该药物的首次临床试验（NCT04540796）。2022年9月，JNJ-8780的临床足迹扩张至中国，然而在2023年10月强生主动终止了这一研究（CTR20222211）。 事实上，之后强生仍开展了有关JNJ-8780的临床试验，不过主要作为联合的选项出现。2023年11月，强生启动了JNJ-1493联合JNJ-8780或CD3/CD20/CD79b三抗JNJ-8543的试验（NCT06139406）。双抗+双抗甚至三抗的组合，还是一个待验证的新方向，也期待强生的突破。 血液疾病领域，强生还布局了一款潜在FIC双抗JNJ-9968，用于治疗骨髓纤维化。该药物靶向CD3/CALR，而CALR（钙网蛋白）是一个极其新颖的未成药靶标，全球在研药物也仅有4款。有研究[1]证实，暴露在表面的CALR可以作为NK细胞的内源性激活剂，向骨髓细胞传递强大的促吞噬信号，协调先天免疫监视的各个方面。 在自免领域，强生也扎下了较深的根基，乌司奴单抗、英夫利昔单抗、古赛奇尤单抗、戈利木单抗等生物制剂每年为其带来了可观的业绩增量。从药物类型来看，这些产品都属于单抗，自免领域双抗药物的迭代也在推进中。 靶向IL-4Rα/IL-31的NM26治疗特应性皮炎（AD）的I期研究于2023年5月启动。一年后，强生又以8.5亿美元现金收购了聚焦于免疫学的Proteologix，目的就是丰富自免双抗管线。收购而来的IL-13/TSLP双抗PX128和IL-13/IL-22双抗PX130均处于临床前阶段，两者主要适应症都覆盖了AD。 针对AD，强生全球免疫疗法负责人David Lee认为双抗有“实现最佳疾病疗效的机会”[2]。AD是一种异质性疾病，不同的患者亚群有不同的致病通路，“目前的AD疗法要么仅能抑制单一致病通路且疗效有限，要么具有广泛的免疫抑制作用，但又会导致严重的安全性问题”，而双抗可以同时针对两种不同的致病通路，可能提供高标准疗效和缓解。 强生在双抗赛道的布局，策略性覆盖了实体瘤、血液学和自免领域这几个优势业务板块。目标明确，火力集中，如此步步为营之下，强生的收获是必然的。 阿斯利康：倾力打造肿瘤免疫双抗“双子星” 阿斯利康在双抗赛道上的布局渐近收获期。靶向PD-1/CTLA-4的volrustomig和靶向TIGIT/PD-1的rilvegostomig这两款肿瘤免疫（IO）双抗均已进入III期临床阶段，共同瞄准NSCLC大适应症，也是阿斯利康着重打造的“双子星”。 在肺癌领域，阿斯利康凭借一个个重磅产品持续引领着临床治疗变革，从一代EGFR-TKI吉非替尼到三代的奥希替尼，PD-L1单抗度伐利尤单抗和HER2 ADC德曲妥珠单抗肺癌适应症的快速拓展，又不断稳固阿斯利康肺癌领导者的地位。阿斯利康与第一三共合力打造的TROP2 ADC药物Dato-DXd也已申报上市，尝试覆盖非鳞状NSCLC人群。 有了小分子、单抗、ADC不同类型的产品之后，阿斯利康并没有停止对新技术的追逐，而且它希望立足现有产品基础打出一套更强的组合拳。双抗就是阿斯利康实现上述目标的重要资产。 透视现有的临床布局，可以发现阿斯利康为IO双抗开辟的版图主要围绕联合治疗展开。一方面是IO双抗与化疗的联合，可能实现比PD-1单抗更强的疗效。2023年10月，阿斯利康启动了volrustomig联合化疗一线治疗PD-L1表达＜50%的NSCLC的III期研究（NCT05984277），头对头K药。今年10月，阿斯利康又登记了rilvegostomig联合化疗一线治疗PD-L1阳性的非鳞状NSCLC的III期头对头研究（NCT06627647），同样对标K药。 在挑战K药的道路上，已经有先行者取得胜利。在一线治疗PD-L1阳性NSCLC的III期HARMONi-2研究中，康方生物的PD-1/VEGF双抗依沃西单抗相较于K药实现了更显著的PFS获益。 另一方面，阿斯利康倾力挖掘更具竞争力的“IO+ADC”组合。比如，rilvegostomig与Dato-DXd的联用。围绕该组合，阿斯利康已先后启动TROPION-Lung10和TROPION-Lung12两项III期研究，分别针对一线治疗PD-L1高表达的非鳞状NSCLC和辅助治疗IB-IIIB期NSCLC场景。 此外，靶向PD-1/TIM-3的sabestomig和靶向EGFR/c-Met的FPI-2053也可能有治疗NSCLC的潜力。Sabestomig已读出单药二线治疗IIIB-IV期NSCLC的I/IIa期研究数据（NCT04931654），19例患者中有2例实现未确认的部分缓解（PR）。 值得一提的是，上述双抗不仅在阿斯利康的肺癌布局中扮演重要角色，也是其进击消化道肿瘤领域的潜在利器。II期GEMINI-Gastric研究显示，接受rilvegostomig联合化疗治疗的40例HER2阴性胃或胃食管交界腺癌患者的确认ORR为52.5%。 靶向CD3/CLDN18.2的AZD5863（HBM7022）主攻胃癌、食管癌和胰腺癌等，由阿斯利康于2022年4月从和铂医药引进来的，交易时其还处于临床前开发阶段。“通过临床前资料，我们发现HBM7022在包括胃癌和胰腺癌在内的实体瘤中表现出强大的潜在功效。”阿斯利康肿瘤研发负责人Susan Galbraith当时表示。敢于在早期就出手押注，也充分说明阿斯利康对于这款中国创新资产的看好。 在实体瘤领域之外，阿斯利康也有两款双抗已推进至III期临床阶段，即gefurulimab和AZD0486。开发gefurulimab的主要目的是为涉及末端补体途径激活的慢性疾病患者提供皮下治疗选择。这是一种迷你双抗（25kD），由一个N端白蛋白结合型VHH和一个C端C5结合型VHH通过柔性linker连接而成。如此设计的巧妙之处在于，较小的分子量可以带来更好的渗透性，与白蛋白的结合能够延长其半衰期。 CD3/CD19靶向的AZD0486由阿斯利康以超12亿美元收购TeneoTwo获得。通过单药或联合BTK抑制剂、CD20靶向疗法治疗，AZD0486有望解锁滤泡性淋巴瘤（FL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）等血液肿瘤适应症。今年8月，阿斯利康已经启动AZD0486联合CD20单抗利妥昔单抗一线治疗FL的III期试验（NCT06549595），计划招募1005例患者。 随着4款不同作用机制的双抗管线相继进入III期临床阶段，阿斯利康已经成为双抗赛道上实力不容小觑的明星玩家。结合联合治疗的策略打法，这些双抗可能将与更多已上市产品形成紧密捆绑的关系，为未来的市场竞争做好铺垫。 参考资料： [1]Jitka Fucikova, Radek Spisek, et al. Calreticulin and cancer[J]. Cell Research volume 31, pages5–16 (2021) [2]https://www.jnj.com/media-center/press-releases/johnson-johnson-to-acquire-proteologix-inc-to-lead-in-atopic-dermatitis-treatment 推荐阅读 安进双抗业务布局的启示 制药巨头的核药版图 制药巨头ADC布局：辉瑞有钱任性，罗氏抢占先机，AZ异军突起，默沙东雄心勃勃...... Copyright © 2024 PHARMCUBE. All Rights Reserved. 欢迎转发分享及合理引用，引用时请在显要位置标明文章来源；如需转载，请给微信公众号后台留言或发送消息，并注明公众号名称及ID。 免责申明：本微信文章中的信息仅供一般参考之用，不可直接作为决策内容，医药魔方不对任何主体因使用本文内容而导致的任何损失承担责任。

摘要：双特异性抗体（bsAb）和多特异性抗体（msAb）包含多种格式，能够同时结合多个表位，解锁了治疗以前难以治疗或不治之症的机制。早期评估候选抗体的开发潜力可以降低潜力低的抗体的等级，并提升最有前途的候选抗体进行进一步开发。基于蛋白质的治疗需要一套严格的开发潜力要求才能具有竞争力（例如高浓度配方和长半衰期），而这些要求的评估需要一套强大的方法工具箱，其中很少有经过验证用于询问bsAbs/msAbs。在评估bsAbs/msAbs的开发潜力时，需要考虑的重要因素包括它们的分子格式、免疫原性的可能性、特异性、稳定性和高产量生产的潜力。在这里，我们总结了开发潜力评估的关键方面，并提供了如何为给定的bsAb/msAb制定全面计划的指导。 1.介绍 抗体工程的进步已经发展出了多样化的生产和纯化流程，以推进各种大小和复杂性不同的分子格式。双特异性抗体（bsAb；具有两种不同结合特异性的抗体）和多特异性抗体（msAb；具有三种或更多不同结合特异性的抗体）允许在多种疾病领域进行新颖的治疗应用。然而，与传统单克隆抗体（mAb）开发相比，实现双特异性或多特异性所需的典型抗体流程和格式的偏差带来了额外的挑战，并且与开发潜力评估的最佳实践相关的信息很少。本综述总结了bsAbs/msAbs开发潜力的关键考虑因素，这些因素在药物开发过程中集体评估时有助于最大化技术成功的可能性。 通过不变簇分化3（CD3）与靶向肿瘤相关抗原（TAA）的相互作用，招募T细胞来识别T细胞受体/主要组织相容性复合体（MHC），已有几种利用这种免疫细胞重定向策略的分子获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，包括blinatumomab（Blincyto®，抗CD19）、teclistamab（Tecvayli®，抗BCMA）、mosunetuzumab（Lunsumio®，抗CD20）、glofitamab（Columvi®，抗CD20）、talquetamab（Talvey®，抗GPRC5D）、elranatamab（Elrexfio®，抗BCMA）和epcoritamab（Epkinly®，抗CD20）。除了免疫细胞重定向，双特异性和多特异性还被用于增加对细胞亚型（例如，用于治疗转移性非小细胞肺癌的volrustomig）的特异性和克服常见的抗性途径（例如，用于治疗EGFR外显子20插入突变的非小细胞肺癌的amivantamab）。 单克隆抗体（mAbs）作为治疗多种疾病和条件的治疗选择的引入，为患者提供了许多以前未满足的医疗需求的解决方案，或者提供了比早期护理标准更有效和/或更安全的治疗。尽管mAbs的治疗成功是不可否认的，但仍有许多未满足的医疗需求。 bsAbs/msAbs是一类能够同时结合多个靶标的大分子，从而解锁了传统mAbs无法提供的新颖作用机制（MOA）和生理特性。bsAbs已被用于肿瘤学中，通过同时结合所需的免疫细胞和肿瘤细胞本身，有效地治疗多种癌症。bsAb T细胞接合器（TCEs）绕过了通过招募T细胞来识别肿瘤相关抗原的T细胞受体/主要组织相容性复合体（MHC）的需要。几种利用这种免疫细胞重定向策略的分子已经获得了FDA的批准，包括blinatumomab（Blincyto®，抗CD19）、teclistamab（Tecvayli®，抗BCMA）、mosunetuzumab（Lunsumio®，抗CD20）、glofitamab（Columvi®，抗CD20）、talquetamab（Talvey®，抗GPRC5D）、elranatamab（Elrexfio®，抗BCMA）和epcoritamab（Epkinly®，抗CD20）。除了在肿瘤学中的应用，bsAbs在2017年通过emicizumab（Hemlibra®）的批准中展示了成功，这是一种bsAb，能够识别酶因子IXa和底物因子X[凝血因子IXa（FIXa）×FX]，用于治疗血友病。 尽管FDA尚未批准任何msAbs，但在临床前和早期临床开发中已经披露了几个有前景的分子。随着我们对疾病病因学的理解的进步，bsAbs/msAbs有望通过多因素靶向潜在生物学或通过增强药代动力学（PK）和药效学（PD）属性来进一步改善结果。 虽然同时结合多个靶标的能力是bsAbs/msAbs的优势，但将多个异质结合基团整合到单个分子中也存在风险，需要在开发潜力计划中通过仔细的临床前评估、选择和修改来考虑和最小化。例如，虽然CD3 TCE bsAbs/msAbs可以有效地将T细胞与TAA结合起来，但微量杂质的存在或稳定性差可能导致异常的T细胞激活，这可能导致患者的不良反应。此外，开发潜力可能取决于上下文，如在静脉注射抗体不导致免疫原性的情况下，皮下注射相同疗法却导致免疫原性的情况，正如Janssen在voxalatamab（JNJ-63898081）中的经验，这是他们的前列腺特异性膜抗原（PSMA）×CD3 bsAb。 早期、有目的、主动的抗体开发潜力评估和修改对于最小化后期开发中昂贵且耗时的挫折以及高效地识别具有成为安全、有效和可制造治疗潜力最大的分子至关重要。 任何格式的基于抗体的治疗药物的开发路径都是漫长而复杂的，需要大量的财务和人力资源。因此，开发潜力应在药物开发过程的早期进行评估，并减轻风险，以最大化整体成功的可能性。可接受的开发潜力，此处定义为分子对药物开发和给药过程中的测试、制造、储存和给药要求的适应性，因此是任何药物开发计划成功的关键标准。与mAbs相比，bsAbs/msAbs的开发带来了额外的独特挑战，因为它们固有的结构复杂性。虽然每种bsAb/msAb格式都会呈现不同的挑战，但有广泛适用于它们开发的总体方法，可以作为起点，并在需要时在方法上进行偏差。 潜在抗体治疗的开发潜力评估是多因素的，有越来越多的工具和流程可用于协助预测低风险分子。需要考虑的重要开发潜力因素包括了解给定bsAb/msAb的分子格式，以及评估它们的免疫原性、特异性、稳定性和可制造性的策略和方法。 2.抗体格式 在人类中，天然抗体由四个多肽链组成，组织成两个相同的轻链和两个相同的重链。抗原识别是通过两个相同的可变抗原结合（Fab）区域进行的。蛋白质和抗体工程的进步带来了各种不同的bsAb/msAb格式，这些格式从免疫球蛋白（Ig）样格式变化到高度工程化的分子，这些分子与传统IgG的相似性最小，这些主题有无数的变化（图1）。这些不同的bsAb/msAb格式与传统mAbs相比具有独特的属性，并有可能实现精确的功能性属性以治疗一系列疾病。Wilkinson和Hale最近发表的一篇出版物中对抗体设计的多样性进行了深入调查。 图1. 常见的单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（bsAb）和多特异性抗体（msAb）配置。a. 标准免疫球蛋白G抗体；b. 对称IgG样双特异性抗体；c. 含有scFv和sdAb的双特异性抗体；d. 多价双特异性抗体；e. 多特异性抗体。 基于IgG的bsAb/msAb格式通常保留天然蛋白质的可结晶片段（Fc）区域，通常可以细分为对称或不对称格式。这些bsAbs/msAbs通常依赖于有目的的突变来增强链配对效率，以及修改Fc介导的功能或半衰期延长。 基于片段的分子，如单链可变片段（scFv）或驼类重链可变域（VHH），通常不包含Fc区域，保留抗原结合的最小要求，允许连接不同的结合片段。通常引入不同长度的连接子来连接具有独特功能属性的不同部分。虽然这些偏离传统IgG格式的变化是必要的，以便启用或改善功能性活动，但它们也影响了其开发潜力。 确保bsAbs/msAbs的适当开发潜力和可制造性需要特别考虑抗体格式。一般起点是确定正在评估的新型格式与“IgG样”的相似程度，与天然蛋白质的偏差越大，需要越来越严格的审查。例如，为了推动bsAb的轻链和重链的正确组装而应用的有目的的突变，可能会降低稳定性，增加免疫原性，和/或改变Fc功能。 同样，虽然缺乏Fc的格式，如scFvs，可能提供更好的生物分布和更高的效力，它们通常容易高度聚集，并可能导致分子没有所需的溶解度和稳定性水平的最终治疗。此外，通常需要双特异性格式或多特异性格式的连接子，这些格式附加了额外的scFv或Fab到IgG框架，这些连接子本身可能会引入免疫原性或显著改变药代动力学（PK）属性。 一旦传统的IgG骨架被修改以允许双特异性或多特异性，就需要定制的制造过程，以获得足够数量的高纯度bsAb/msAb。一个主要考虑因素是，每种独特的格式通常需要不同的纯化策略。例如，由于许多基于片段的抗体缺乏Fc，它们需要偏离用于典型IgG的基于蛋白A亲和色谱的纯化策略。由此产生的bsAbs/msAbs通常具有缩短的半衰期，需要在配方中进行额外考虑，如持续静脉内输注或修改，如与聚乙二醇或人血清白蛋白融合，以延长半衰期，实现更有利的PK特性。 此外，许多双特异性和多特异性格式可以引入多种格式特定的杂质，这些杂质对许多分析和纯化方法提出了独特的挑战。这些格式特定的杂质在生物物理属性（如分子量和等电点（pI））上可能与所需的双特异性产品几乎相同，需要开发定制的分析测定和/或纯化方法。 对双特异性和多特异性格式的修改也可能影响蛋白质表达水平，因此可能不适合高通量生产和开发潜力调查。因此，必须仔细考虑不同格式及其产生足够产量和产品质量以进行高通量开发潜力测定的能力。综合考虑，正在开发中的格式与所需的治疗候选属性应指导开发潜力评估策略。 2.1.格式考虑 虽然这里没有回顾bsAb/msAb工程策略的细节，但了解为什么做出某些工程选择以及分子格式的修改如何影响功能是重要的，这使得一个知情的过程能够从功能和开发潜力的角度权衡候选分子的相对风险。就与目标结合相关的功能而言，bsAb/msAb格式可以在两个一般类别中相互偏离：结合价（即，任何目标的结合基团数量）和结合几何学（即，组装分子中靶向基团的相对方向）。 这些两个维度的变化如何产生改善活性的例子包括zanidatamab，这是一种HER2靶向双特异性抗体，它采用了scFv和Fab，从而改善了受体聚集和补体依赖性细胞毒性，以及BiTE（双特异性T细胞接合器）格式，这是两个scFv分子的融合，是第一个商业批准的TCE。这种格式虽然容易聚集，但在目标肿瘤细胞和T细胞之间实现了短的细胞间距离，这可以导致与更IgG样的bsAbs相比显著增强的细胞毒性效力。 BiTE格式的演变是双亲和性重定向抗体格式，它包括一个经过工程改造的二硫键，连接了两个可变域（Fv）的重链可变域（VH）和轻链可变域（VL）的交叉融合。分子格式对活性和开发潜力的耦合影响是过去二十年的积极研究领域。 Loh等人比较了八种不同的HER2 × CD3“结-孔”Fc基础bsAb格式在稳定转染池中的表达、纯化容易性、热稳定性、抗原结合和功能表征。在这项研究中，几何学和价的变化没有影响表达水平或热稳定性，但增加scFv的数量导致了更高的异质性和聚集倾向。Madsen 等人进行的一项类似研究通过使用带有10个氨基酸连接子的单域抗体（sdAb）与IgG融合，生成了针对PD-L1 × HER2的不同几何结构的双特异性抗体（bsAbs），并评估了它们的生产、稳定性、抗原结合以及CD16a结合特性。将sdAbs融合到重链的N-或C-末端通常可以提高产量，但某些融合分子导致分子组装不良，高价分子显示出胶体稳定性低的迹象。 此外，与bsAbs/多特异性抗体（msAbs）格式相关，翻译后修饰、片段和格式相关杂质（如错配物种和半抗体）对功能性活动的影响应在定义关键质量属性（CQAs）时考虑。Lippold 等人报道了一种开发2 × 1TCE的优雅方法，该方法使用功能性CD3亲和色谱结合质谱（MS）来定义CQAs，这可能是一种广泛可定制的方法，用于分析化学稳定性风险及其对功能性活动的影响。总之，格式优化是调节bsAbs/msAbs活性的强大方式，但必须与适当选择的开发性检测一起进行。 2.2.生成bsAb/msAb分子的共同组成部分 尽管许多bsAb/msAb格式尝试主要使用来自典型人类IgG的分子组分，但这些分子的复杂性需要偏离。如下所述，多肽连接元件和VHH部分特别是非IgG元素，在bsAb/msAb分子的工程中常用。 多肽连接子可以分为刚性、柔性和体内可裂解连接子。它们不仅用于将不同的蛋白质结构域连接在一起，还可以有其他效果，例如增加活性、调节药代动力学(PK)特性、在体内释放蛋白质结构域，或将治疗剂定向到特定的组织或器官。多肽融合到Fc结构域、转铁蛋白或人血清白蛋白通常用于延长抗体的半衰期，通常需要使用连接子。此外，多肽连接子通常用于构建单链靶向结构域，如单链可变片段(scFvs)，以及将这些结构域与其他蛋白质组分融合，以修改结合价数，并实现不同的双特异性和多特异性几何结构，而不引入额外的链配对复杂性。通常，在这些应用中使用多甘氨酸-丝氨酸(G4S)n连接子的变体，其中整体长度被优化以最小化聚集倾向，同时保持位点可及性。连接子长度和组成的优化是格式设计的关键组成部分，正如在CD19 × CD3双特异性串联二价体的优化中所展示的，连接子的变化被证明影响折叠效率、稳定性和活性。已经展示了几种稳定多肽连接子的策略，例如通过点突变减少蛋白酶敏感性，从而改变裂解基序，应用稳定框架突变，修改融合几何结构和连接子锚点，引入二硫键，变化连接子长度，以及添加谷氨酸和赖氨酸残基以提高溶解性。VHHs，也称为Nanobodies®，是由骆驼科动物自然产生的只有重链的单变量域抗体。它们缺乏传统抗体中与VL结构域配对所需的疏水界面，因此具有高溶解性和小尺寸(15 kDa)等特征。它们的热稳定性可能有所不同，但许多VHHs具有独特的能力，在热暴露后重新折叠并恢复抗原结合， 因此，与传统的靶向单元如Fab或scFv相比，它们表现出额外的稳定性特征，后者在热暴露后通常显示出不可逆的聚集。VHHs通常具有更长的、高度可变的互补决定区(CDR)3环，这些环补偿了缺失的VL结构域。这些扩展的CDR3环实现了高亲和力和特异性结合，并有助于通过形成折叠覆盖结构来屏蔽否则暴露的疏水残基。与传统的scFv相比，scFv由最小的IgG结合域VH和VL通过多肽连接子连接而成，并且由于它们的“呼吸”界面容易聚集，VHHs是有趣的替代品，作为靶向单元，以实现额外的抗原结合能力和价数在双特异性抗体/多特异性抗体上，具有优越的开发性属性，并避免许多IgG样双特异性格式中常见的链配对复杂性。首个VHH衍生抗体caplacizumab(Cablivi®)在2019年的批准为VHH在双特异性抗体/多特异性抗体中的增加使用奠定了基础。在双特异性抗体/多特异性抗体中使用VHHs已被证明用于靶向FcγRIII，在TNF × F4/80双特异性抗体中，Vδ2-TCE，在双特异性和三特异性VH在CD1d × Vγ9H SEED结构体中，等等。以及在一种增强对HIV株特异性中和能力的双特异性抗体中。 3.免疫原性 生物治疗剂可能具有免疫原性，即在患者体内引起对治疗剂本身的不需要的免疫反应，通常通过产生结合治疗剂的抗体，可能影响安全性和/或有效性。免疫原性可能导致治疗抗体在临床开发过程中的药物失败，导致资本、时间和资源的大量损失。抗药物抗体(ADA)是免疫原反应的标志。ADAs可以降低治疗效果，引起不良反应，甚至导致严重的副作用。T细胞通过反应治疗抗体中的特定序列在决定免疫反应中发挥关键作用，这些序列由抗原呈递细胞(APCs)在人类白细胞抗原(HLAs)中呈递。由于缺乏完整的临床研究来审查双特异性抗体/多特异性抗体，这些替代格式的免疫原性风险的数据很少。最近批准的双特异性抗体/多特异性抗体的报告，或目前在临床开发中的那些，表明不同抗体模式的ADA发病率和这些ADAs的临床结果各不相同，包括TCEs、双免疫检查点抑制剂和各种肿瘤相关抗原(TAAs)的双结合物。这些不同的结果突出了需要从早期临床前阶段到临床阶段开发全面的免疫原性风险评估策略，以促进选择、设计和开发具有降低患者免疫原潜力的最优双特异性抗体/多特异性抗体。下面提供了一个概述，说明可以有助于塑造对双特异性抗体/多特异性抗体治疗剂的免疫反应的多种因素，包括与产品相关的因素、与患者相关的因素和与疾病相关的因素。此外，我们简要讨论了目前可用于预测、监测和减轻双特异性抗体/多特异性抗体在临床前开发阶段的免疫原性的工具和进展。 3.1.基于序列的风险 与所有蛋白质治疗剂一样，对双特异性抗体/多特异性抗体产生免疫反应的主要风险决定因素之一是原始氨基酸序列。双特异性抗体/多特异性抗体通常包含大量工程化序列元素，这些元素使得不同的功能域能够非自然地连接到一个分子中。此外，这种双特异性抗体/多特异性抗体特有的工程通常与额外的抗体工程方法结合，如人源化突变(将小鼠CDRs移植到人抗体框架中)和Fc效应子修饰(要么调节Fc受体介导的效应子功能，要么通过修改与新生儿Fc受体(FcRn)的结合来延长半衰期)。这些新颖的工程序列可能通过引入新抗原或暴露可以被APCs处理和呈递的隐蔽表位来增加免疫原性，从而激活T细胞反应。因此，免疫原性风险评估和减轻策略最好从双特异性抗体/多特异性抗体的工程阶段开始，并在整个表征和筛选过程中使用越来越彻底的方法。通过设计低风险抗体结构使用脱免疫和耐受化(introduction of T regulatory cell epitopes)方法，由计算预测工具和可用的体外/离体确认试验的组合指导，可以实现降低免疫原性。 3.2.计算机模拟免疫原性风险评估 在抗体发现阶段早期，通常会首先应用计算机模拟(in silico)的T细胞表位筛选和预测工具。有多种商业、公共和学术平台可用于筛选抗体序列中的T细胞表位（通常是9到15个氨基酸的序列），以预测可能与HLA分子结合的序列。这些预测工具仅基于抗体的主要序列来识别潜在的T细胞表位。更复杂的计算方法能够使用同源建模和分子动力学模拟等技术生成抗体结构的三维模型。这些方法允许评估可能影响免疫原性的结构特征，如溶剂暴露的环、翻译后修饰和构象灵活性。 计算机模拟预测工具有助于在bsAb/msAb的早期开发过程中识别潜在的免疫原性区域，并允许选择潜在的免疫原性较低的分子或应用进一步的蛋白质工程技术来降低候选分子的风险。这些计算机模拟方法具有高通量和相对较低成本的优势。然而，这些计算工具通常存在一些局限性，例如倾向于过度预测，同时未能充分反映人类群体中发现的重要HLA II类多态性。 因此，建议使用各种体外和离体方法，包括免疫测定和基于细胞的测定，对这些假定的T细胞表位进行进一步的检测。 3.3.体外HLA I类和II类结合测定 HLA结合测定评估肽段在体外与不同HLA等位基因结合的能力，并补充计算机模拟预测工具。纯化的HLA-II肽段（通常是重叠的15个氨基酸的肽段）在一系列浓度下与单体HLA-II分子共同孵化。使用多种方法，包括荧光光谱、生化测定（例如，酶联免疫吸附测定）或表面等离子共振（SPR）来量化结合亲和力和动力学。通常，这些测定以高通量规模进行，能够快速筛选大量的肽库。这些结合测定的一个固有困难是全球人群中各种HLA-II等位基因的正常分布的代表性有限。为了克服这一局限性，HLA-II结合测定通常使用共享表位结合基序的HLA-DR等位基因组，也称为超类型等位基因，能够代表全球超过95%的人类HLA分布。 由于HLA-I分子的高度多态性和结构/构象对结合亲和力的影响，HLA-I结合测定的使用较少，尽管已经描述了几种测定和方法，包括基于荧光激活细胞排序（FACS）的MHC稳定化测定、竞争测定、分型B细胞系或使用HLA的基于细胞的测定。 虽然HLA结合测定可以提供有关特定HLA等位基因结合的有意义的信息，但由于它们依赖于感兴趣的肽段的最佳设计和纯度，因此存在一些局限性。这种依赖性可以直接影响肽-HLA相互作用的结合和稳定，并导致假阴性结果。此外，虽然从HLA结合测定获得的数据可能表明特定肽基序可能与HLA等位基因结合，但这些数据并没有考虑到这种肽基序是否能够在APC表面的HLA分子上被处理和呈递。 3.4.MHC相关肽蛋白质组学 MHC相关肽蛋白质组学（MAPPs）方法在识别存在于APC表面相关HLA分子上的已处理肽段方面被证明是有价值的，特别是鉴于液相色谱/质谱（LC/MS）灵敏度和蛋白质组分析工具的最新进展。在这种方法中，完整的bsAb/msAb分子被装载到体外生成和成熟的单核细胞衍生的树突状细胞（DCs）上，以使DCs摄取和处理抗体，然后细胞裂解和分离肽-MHC复合物，这些复合物稍后被解离并通过MS测序进行测序。 MAPP测定的通量相对较低，主要是由于DC生成的限制。因此，MAPPs通常在临床前开发过程的后期阶段使用，并用于有限数量的开发候选物。从MAPPs获得的数据可以帮助识别可能被工程化以降低免疫原性的主导抗原肽序列。当这些个体的DCs被包括在分析中时，这种方法还可以揭示健康和疾病个体之间在抗原处理和呈递方面的差异。 尽管从MAPP测定中收集到的有价值的信息，但仔细解释至关重要。当评估bsAbs/msAbs与APCs（如DCs）的潜在直接或间接相互作用时，bsAbs/msAbs增加了一层复杂性。在使用MAPPs测定针对DCs表达的靶标或对DC功能重要的途径（如CD40×CD11c或LAG-3×PD-L1 bsAbs）的bsAbs/msAbs时，应考虑这种相互作用。 这些靶标的结合可能会干扰这些细胞中的抗原呈递机制，这反过来可能会影响该测定识别真实主导抗原序列的能力。在使用MAPPs测定之前，可以使用DC结合测定和评估DC成熟、激活和细胞因子测量的测定来了解bsAb/msAb对DCs的影响。 此外，评估bsAbs/msAbs对内源性蛋白的已知表位呈递的影响也可以提供对抗体与MAPP测定潜在干扰的洞察。 通过MAPPs识别的主导抗原序列表明这些序列可能通过抗原呈递机制被处理和呈递；但这并不一定意味着这些序列会转化为T细胞反应。因此，建议进行进一步的确证性体外T细胞激活和增殖实验，特别是当对感兴趣的序列进行进一步重设计可能会对抗体的效力或特异性产生重大影响时。 3.5.T细胞激活和增殖实验 各种体外T细胞激活和增殖实验已经开发出来，并越来越多地被用来评估治疗性抗体候选物的免疫原性。这些实验大多数使用新鲜分离或冷冻保存的健康或疾病个体的外周血单个核细胞（PBMCs）、去除CD8 T细胞的PBMCs，或与单核细胞衍生的树突状细胞（DCs）共培养的分离CD4 T细胞。PBMCs可以被整个抗体刺激，允许抗原呈递细胞（APCs）摄取、处理和呈递肽序列给原始T细胞，导致T细胞激活、增殖和细胞因子分泌。流式细胞术通常用于评估通过标记PBMCs与细胞示踪染料来评估抗原特异性T细胞增殖。此外，使用特定的T细胞激活标志物如CD25、CD69、HLA-DR、CD134和/或CD137通常与增殖评估结合使用，以了解T细胞的激活状态和对刺激的反应程度。 激活的T细胞产生的细胞因子也可以通过流式细胞术进行细胞内细胞因子染色或通过酶联免疫吸附点（ELISpot）或多重荧光斑点（FluoroSpot）实验进行评估。 尽管基于PBMC的实验被认为是最简单且接近体外模拟复杂抗原呈递和T细胞激活过程的设置，但它们受到能够响应特定抗原刺激的前体原始T细胞数量相对较低的限制，导致实验灵敏度降低。DC-T细胞实验提供了一个替代方案，克服了这一限制，作为一个较不复杂的体外系统，允许免疫反应的基本组成部分之间的抗原特异性相互作用，即DCs和T辅助细胞。 虽然这些实验越来越被接受，但它们与bsAbs/msAbs的兼容性需要确认。bsAbs/msAbs通常针对T细胞或其他免疫细胞表达的受体或配体。在这些例子中，使用完整的抗体进行刺激可能不合适，因为免疫反应可能主要由抗体的MOA和与免疫细胞的直接结合驱动，而不是由抗原刺激驱动。这可以通过使用来自抗体序列的重叠肽段库而不是完整的抗体来克服。然而，使用肽段库有自己的局限性，包括更高的成本和可能识别出不一定在体内由APCs处理或呈递的肽段的风险。因此，使用MAPPs实验数据来指导设计和生产感兴趣的序列以在这些体外实验中进行测试可能是有益的。此外，bsAbs/msAbs由于抗体在所需格式中的错配组装，携带更高的杂质风险，导致产生其他不想要的错配格式，这可能会影响体外实验的性能，并导致对免疫原性风险的潜在误解。 因此，使用高纯度的测试文章准备这些实验至关重要。 3.6.B细胞表位和体外B细胞实验 虽然CD4 T细胞在导致ADA产生的免疫反应中起着关键作用，但B细胞也直接识别、结合、内化、处理和呈递治疗性抗体的表位给T辅助细胞，导致原始B细胞分化为记忆和产生高亲和力（IgG）ADAs的浆细胞。然而，体外B细胞实验受到在体外诱导B细胞反应的生物学复杂性的限制。已经描述并商业化了几种评估B细胞在体外刺激后分泌IgG/IgM的比色和荧光B细胞ELISpot实验，这些ELISpot实验主要关注评估记忆B细胞反应。目前尚无强大的实验可用于测量原始B细胞对体外刺激的IgG产生，主要是由于从IgM到IgG产生过程中涉及的免疫过程的复杂性。 在缺乏强大的体外B细胞实验的情况下，已经开发了几种用于预测B细胞表位的计算工具，如免疫表位数据库和分析资源SEPIA。 许多这些预测方法使用序列衍生特征，包括氨基酸组成、亲水性、表面可及性、β-转角和主链柔韧性来提高B细胞表位预测性能，这通常相对于现有的T细胞表位预测工具是有限的。 3.7.与产品关键质量属性相关的风险因素 CQAs是在适当的限制、范围或分布内存在的物理、化学、生物学或微生物学属性或特征，以确保所需的产品质量。 CQA相关的免疫原性风险因素是在治疗性抗体开发过程中的重要考虑因素。 由于分子设计的相对复杂性，bsAbs/msAbs通常与许多制造挑战相关，如增加的聚集、降低的稳定性和由于存在不想要的错配抗体格式而导致的产品相关杂质，这些都影响bsAb/msAb的免疫风险、与先天免疫细胞上的模式识别受体的相互作用以及意外佐剂效应导致打破耐受。 PBMC和全血实验是经常用来评估CQA相关免疫原性风险的工具。 这些实验能够广泛代表特定人群，通常被认为比其他基于细胞系的实验格式更具临床相关性。这些实验中通过与抗体孵化后分泌的细胞因子和趋化因子水平的量化来测量免疫原性反应。这些类型的实验面临的挑战包括从大量供体（通常>25）中获取足够数量的PBMC和新鲜全血样本，以及高供体间变异性。 重要的是，必须考虑特定bsAb/msAb的作用机制（MOA）来解释这些实验获得的数据。通常首先进行全血或PBMC实验以获得更广泛的风险评估，然后进行其他体外实验以进一步进行机制性特征描述。 3.8.与患者相关的风险因素 预先存在的反应性是随着基于抗体治疗领域，特别是bsAbs/msAbs的快速增长而日益受到关注的问题，尽管其对药物安全性和有效性的影响尚不清楚。最近有关bsAb/msAb免疫原性的报告表明，在临床药物开发阶段考虑实施对药物未接触受试者预先存在反应性的筛选和特征化策略是必要的。 许多正在开发的bsAb/msAb模式针对的目标已经使用其他生物治疗药物进行了探索，包括mAbs和抗体药物偶联物。在某些情况下，bsAbs/msAbs可能使用以前开发或批准的抗体的抗体臂，如上文提到的JNJ-61178104（以前称为COVA322）bsAb，它建立在阿达木单抗的骨架上。 在这些情况下，针对先前生物治疗的ADA反应可能导致由于快速记忆回忆反应而对bsAb/msAb的免疫原性反应增强。因此，应考虑对患者进行预先存在的反应性筛选，特别是在有生物治疗药物治疗史的患者中。此外，这种预先筛选可能有助于在预期出现显著免疫原性反应和相关不良事件时定义潜在的患者排除标准。 虽然目前主要在临床环境中使用筛查或治疗前时间点的患者样本来评估预先存在的ADA，但预先存在的ADA的高流行率表明，在临床前开发阶段早期使用健康或药物未接触的捐赠者的人类血清进行更严格的评估是有必要的。用bsAb给药的受试者中出现的治疗性ADA与在健康捐赠者中检测到的预先存在的ADA相关，并且预先存在的ADA的表位特异性能够预测临床ADA的表位偏好。 在评估LY3415244的安全性和免疫原性的1期试验中也有类似的观察结果，其中所有12名入组的患者都对至少一个bsAb臂产生了治疗性ADA。针对anti-TIM-3臂的ADA被发现更早出现，并对大多数患者的可溶性TIM-3目标参与产生负面影响。在最近的一项调查中，评估了60个正常人类血清样本中针对LY3415244的预先存在的ADA反应性，分析同样发现，正常人类血清样本中针对LY3415244的预先存在的ADA免疫原性主要针对TIM-3 CDRs。 3.9.治疗相关风险因素 包括给药途径、药物剂量和给药方案以及使用免疫调节共治疗药物，都是影响生物制剂免疫原性风险的因素，包括bsAbs/msAbs。大多数治疗性抗体通过静脉注射或皮下注射给药。尽管普遍接受的观点是皮下注射治疗性抗体与更高的免疫原性风险相关，但目前临床批准的抗体的数据并不支持这一假设。然而，与皮下注射相关的独特的免疫原性挑战可能对bsAbs/msAbs特别重要。皮下注射通常需要相对于静脉注射的高浓度给药。因此，与增加的bsAb/msAb聚集体以及其他产品属性相关的挑战可能在通过皮下途径产生更高的免疫反应中发挥重要作用。这一假设得到了pasotuxizumab这一例子的支持，这是一种PSMA × CD3 bsAb TCE，在1期研究中评估了静脉和皮下给药。 虽然静脉组的患者中没有检测到任何ADA，但所有接受皮下治疗的患者都发展出非短暂的ADA。此外，在这些患者中超过93%的人发现中和性ADA，并且没有人对局部糖皮质激素治疗有反应。当JNJ-63898081，另一种PSMA × CD3 bsAb TCE，通过静脉和皮下给药给试验参与者时，也报告了类似的结果。 药物剂量和给药方案也可能强调bsAbs/msAbs的免疫反应风险，因为由于细胞因子释放综合征等毒性，给药通常限于相对于mAbs的较低剂量。与msAb/msAb的较低剂量可能潜在地导致ADA介导的药物清除增加和次优的PK和PD性能。此外，治疗持续时间也是一个需要考虑的重要因素，尽管其与免疫刺激性bsAbs/msAbs在肿瘤学中的相关性可能不清楚，因为这些方案不需要长期治疗。此外，可能需要长期治疗的bsAbs/msAbs，如那些用于自身免疫性疾病的，可能从其自身的免疫抑制MOA中受益，导致免疫原性降低。最后，与抗炎药物或化疗的联合治疗也可能影响bsAbs/msAbs的免疫潜力。 3.10.作用机制风险因素 最近批准的bsAbs/msAbs的数据，以及其他在临床开发中的bsAbs/msAbs，表明这些bsAbs/msAbs的作用机制在它们在患者中的免疫潜力中起着关键作用。根据分子的不同，可以增加或减少免疫原性。例如，批准用于B细胞恶性肿瘤的bsAb TCEs，如CD19 × CD3 blinatumomab和BCMA × CD3 teclistamab，显示出最小的ADA发病率（<2%），可能由于它们的B细胞耗竭MOA。另一方面，针对B细胞上共刺激分子的bsAbs/msAbs，ABBV-428，一种间皮素-CD40 bsAb，在1期临床试验中显示出高ADA发病率（63%），可能由于其对B细胞的CD40激动效应和对药物PK的影响。非B细胞耗竭TCEs也可能由于其MOA涉及广泛的T细胞激活而带来更高的免疫原性风险，如AMG 211，一种CEA × CD3双特异性T细胞-引导剂，它在所有接受>3.2 mg高剂量治疗的患者中诱导了ADA，并在高滴度下暴露量下降，导致停药。 免疫调节性bsAbs/msAbs通过激活共刺激通路或拮抗抑制通路（如CTLA-4 × PD-1和CTLA-4 × OX-40双特异性抗体）可能会对患者造成更高的免疫原性风险，导致ADA发生率增加，因为它们相对于针对相同靶点的单抗单药治疗能够释放更强的免疫细胞激活。这一概念得到了抗PD-1和抗CTLA-4单抗的单药治疗和联合治疗报告的支持。当nivolumab与ipilimumab联合使用时，ADA发生率较单药治疗（11%）显著提高，报告为26-38%。 类似地，当抗PD-L1抗体durvalumab与化疗联合使用时，ADA发生率极低（<1%），而与抗CTLA-4抗体tremelimumab和化疗联合使用时，ADA发生率则较高。 与这些观察结果一致，LY3415244，一种针对TIM-3和PD-L1的bsAb，也被报告在所有给药的患者中诱导ADA。最近，在针对HER2和4-1BB的bsAb PRS-343的1期研究中也报告了类似的观察，PRS-343的给药导致ADA发生率为28%。 尽管存在这些趋势，免疫原性仍然难以预测，因为并非所有这些机制总是导致免疫原性增加。 另一个与作用机制相关的风险因素是抗体与其可溶性或膜寡聚靶标形成免疫复合物的能力。由于bsAbs/msAbs能够结合多个靶点，免疫复合物形成的风险可能更高。大型免疫复合物被广泛认为通过增加APCs的摄取以及通过交联和激活B细胞受体的T细胞非依赖性激活B细胞来增强免疫反应。针对炎症细胞因子TNF和IL-17A的bsAb JNJ-61178104支持这一概念，因为其给药已被证明在所有患者中诱导ADA。 尽管目前对免疫调节性bsAbs/msAbs的临床免疫原性数据有限，但现有证据表明它们与增加的免疫原性风险和更高的ADA发生率相关。因此，作用机制的考虑应成为bsAb/msAb开发过程中全面免疫原性风险评估策略的重要组成部分。重要的是，这些考虑也应适用于上述讨论的各种体外和体外工具的兼容性，考虑到正在开发的抗体的作用机制，以及这对这些实验数据解释的影响。 总之，随着bsAbs/msAbs领域的快速发展，以及关于与这一类抗体相关的免疫原性和安全风险的知识逐渐可用，开发全面的免疫原性风险评估策略对于实现最佳抗体开发至关重要。这些免疫原性风险评估策略可以在临床前阶段涉及各种计算工具以及体外和体外实验，同时关注与bsAb/msAb开发相关的重要药物、患者和治疗相关风险考虑。 4.特异性 在双特异性抗体（bsAbs）和多特异性抗体（msAbs）的开发中，多特异性（在蛋白质组中对靶点外的结合）和多反应性（对带电或疏水蛋白、膜或其他生理表面的非特异性结合）都是不希望出现的属性，它们可以改变疗效、清除率和组织分布。这些不需要的效果可能导致靶点外毒性、免疫原性和生产上的挑战。 多特异性可以由几种机制引起，例如与不相关靶标的分子模拟或CDRs中的可塑性，这些特征可能因在同一抗体上具有多个互补决定区而加剧。多反应性归因于不希望的抗体表面属性，例如电正性、电负性和疏水性表面斑块或Fv和Fc的电荷不平衡。在bsAbs/msAbs中，与从亲本分子行为预期的相比，多特异性和多反应性都可以被调节。这些差异可以归因于结合价的改变和/或复杂的互补决定区间相互作用。然而，尽早识别可能产生靶点外效应的抗体至关重要，建议在将亲本分子重新格式化为bsAbs/msAbs之前对其进行评估。 4.1.计算机预测 众多的计算机模拟工具已被开发出来，用于评估抗体特征以预测多反应性。抗体的特性，如序列组成、互补决定区（CDR）的长度和表面特性（即电荷和疏水性），通常从同源模型中得出，已被用来创建多反应性的预测模型。 具有大量电荷在其CDR上的抗体或高疏水性可能具有加速的清除率，对他们的治疗有效性产生负面影响。这种加速清除被认为是由于抗体表面的正电荷可能与负电荷的细胞膜或细胞外基质相互作用，导致 增加的组织吸收和血液清除。几个小组已经评估了使用许多可用的在硅片上的工具来探索抗体开发能力，但这些工具的广泛适用性对bsAbs/msAbs的探索较少。Jain等人。系统地评估了在硅片上派生的特征和体外指标之间的关系， 评估了许多开发能力方面。 虽然预测体外测定结果的能力大于那些仅从计算派生指标派生出来的，总体正电荷被发现对多特异性有害，更大的负电荷区域似乎有益，其他基于序列的趋势对氨基酸组成和位置在CDRs中证实了其他研究，这些研究正在调查多反应性。此外，许多在硅片上的指标的数量下降超出了确定的可接受分布（通常称为标志或违规行为）随着临床路径的进展（即，批准的抗体具有最少的在硅片上的标志）。同样，Zhang等人。生成了用于识别潜在多特异性的物理化学 规则，通过评估序列和结构特征与测定之间的相关性来探测自关联和结合到各种多特异性试剂在137个临床阶段抗体上。最近对1000个mAbs的生物信息学分析系统地 确定了多反应性和非多反应性抗体之间的关键差异，目标是扩展对属性的理解推动多反应性超出疏水性，电荷和CDR环灵活性。多反应性抗体往往有CDRs，平均产生轻微的亲水性，中性电荷的结合表面，可能潜在地允许与广泛的配体进行弱相互作用。这些数据被用来构建一个计算框架，可以识别多反应性抗体，准确率为75%。最近开发的机器学习方法已被用来预测纳米抗体和scFv中的多反应性。这些可变域格式是bsAbs/msAbs中越来越常见的组成部分，因为它们不需要非轻链的共价配对，因此产生较少的格式特异性错配物种。哈维等人。使用一个合成库，旨在模仿一个天真的骆驼库并将其排序到结合池到多特异性试剂（PSR）使用FACS。结果被用来训练逻辑回归和神经网络模型来分类纳米体多反应性。有几个预测特征为多反应性例如，存在精氨酸和色氨酸；然而，它们被位置强烈混淆。值得注意的是，他们的模型能够建议突变以减少估计的多反应性。Lim等人，通过训练四种监督式机器学习方法，利用这些数据计算了19,426个已知多反应性档案的scFv的基于序列和基于结构模型的特征，并得出结论，表现最好的模型具有与多个不同的CDR和全局抗体特征相关的特征，包括CDRH3中的色氨酸数量、等电点（pI）和径向旋转半径。然后，这些模型与基于自然语言的模型描述符相结合，以从scFv特征中提取额外的信息。表现最佳的集成模型在识别多反应性scFv方面的精确度和准确率超过75%。可用于特异性预测的在硅片上工具的数量和可变性可能会令人生畏，而且很少有模型专门针对bsAbs/msAbs的独特属性进行了设计。因此，建议主要使用这些方法作为在开发过程的早期对几个候选分子进行初步评估，以识别抗体和相关的在硅片上指标，这些指标落在任何一个预测的极端。这些数据可以作为进一步实验探究策略的有用指南。 4.2.体外特异性测定 评估PK属性是与特异性相关的主要开发能力属性。事实上，mAbs的长消除半衰期是这类治疗药物的主要优势。调节清除率的最重要元素是Fc中含有的分子在内质网隔室中依赖pH的特定FcRn结合。BsAbs/msAbs通常通过扰动或移除Fc-常驻FcRn相互作用来大幅度改变这一档案。分析FcRn亲和液相色谱使用从pH 5.5到8.8的线性pH梯度来分离IgG异构体、降解产物和工程抗体，如bsAbs/msAbs，基于它们在不同pH下对FcRn的亲和力。与野生型IgG相比，突变体的洗脱峰档案和保留时间的变化与FcRn转基因小鼠中的PK档案相关。尽管普遍认为Fc在FcRn介导的循环中起主导作用，但还表明，可变域的净电荷也影响与FcRn的结合，正如brakinumab所示，其Fv净电荷较高，但与ustekinumab相比具有类似的pI。FcRn有一个扩展的负电荷表面补丁和增加的brakinumab结合，阻止了在生理pH下与FcRn的有效解离，并减少了其终端半衰期。在中性pH下从FcRn的缓慢释放已被证明对两个具有类似pI和生物物理属性的bsAbs的PK产生不同的影响。 除了FcRn独立特性如单克隆抗体（mAbs）的Fv电荷、目标结合和定位、多特异性和多反应性或糖基化变化可能导致不期望的增加清除率，影响mAbs的药代动力学（PK），这些特性对于双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）的开发同样重要。特别值得注意的是，针对CD3的bsAb TCEs通常具有与不良PK相关的多反应性标志，部分原因是许多针对CD3的抗体结合到CD3 epsilon极端N-末端的电负性线性表位，并且具有较高的等电点（pI）值。基于结构的方法和使用基于酵母的检测平台的抗体工程已被证明可以纠正这种多反应性行为，同时增加对CD3的亲和力。 测试更广泛的多反应性和多特异性，这与药代动力学不佳、制造困难和耐受性问题有关，由于人类蛋白质组和其他生理表面呈现的巨大潜在非目标空间，这是一项挑战。人类细胞微阵列技术可以在体外分析人类蛋白质组，以减少体内非目标毒性和加速清除的风险。 筛选多特异性性还可以包括结合由CHO、HEK或Sf9细胞提取物制成的PSRs，其中包含溶解的膜蛋白。这种方法可以作为基于展示的方法的反筛选，如针对SARS-CoV-2的基于纳米抗体的四价bsAb所示。 如上所述，局部正电荷可以导致通过增强FcRn结合、防止FcRn-抗体解离和有效回收来加速清除率。虽然可以从序列或通过毛细管等电聚焦等直接方法估算抗体的pI，但它是多反应性的一个差指标，因为它不显示电荷斑块或局部不平衡，通常更倾向于使用结构衍生方法，如Fv电荷对称性和空间电荷图（SCM）。 除了静电相互作用外，抗体的疏水性是多特异性以及潜在胶体稳定性问题的可靠指标。可以通过分析疏水相互作用色谱上的保留时间和洗脱曲线来评估抗体的疏水性。某些抗体germlines，如VH1–69，由于它们的重链CDR2更疏水，更可能产生疏水性较高的抗体，但这种倾向可以通过工程方法和生物物理评估来最小化。 在bsAbs/msAbs的临床前阶段进行特异性测试，应考虑作为降低开发和制造风险的两阶段方法。应评估每个亲本抗体，并仅选择低风险的亲本抗体或结合域进行重组成bsAbs/msAbs。重组成后，应在衍生的bsAb/msAb上重复相应的特异性测定，以确认所应用的设计和格式没有显著改变每个亲本抗体或结合域的特性。选择具有良好特异性特性的低风险亲本序列是有效生成可开发bsAbs/msAbs的先决条件。 5.稳定性 抗体的稳定性包括许多分子内在和药物相关的外在组成部分，包括热稳定性、胶体稳定性、耐蛋白水解性和血液中的化学稳定性。这些领域的缺陷可能导致制造过程中的困难、影响货架期以及改变抗体的免疫原性和活性。 5.1.热稳定性 热稳定性是承受热应用时蛋白质展开和降解的能力。成功开发的抗体的一个关键特性是它们良好的热稳定性，这主要由mAbs中的Fab区域决定，但对于bsAbs/msAbs可能不那么明显。就稳定性而言，Fv区域具有最高程度的变异性，因为其主要序列因每种抗体而异。 低热稳定性可能使抗体更容易聚集，限制了它们作为治疗性抗体的潜力。抗体热稳定性的一个有用估计值是其熔化温度（Tm），定义为抗体在其展开状态的浓度等于其在折叠状态的浓度的温度。抗体包含几个区域，包括可变Fv区域和恒定CL、CH1、CH2和CH3区域。这些区域中的每一个都是伪独立的，因此在不同区域之间通常观察到不协同的展开。众所周知，IgG1 CH2区域的Tm约为70°C，CH3区域的Tm约为82°C。 一项研究发现，当通过异二聚体CH3界面构建bsAbs时，所得抗体的CH3热稳定性显著降低，与K409突变相关的Tm降低约为12°C。 Fv、CH1和CL区域倾向于协同展开，其Tm可以根据可变区域序列跨越大范围。差示扫描量热法（DSC）用于建立不同区域的热稳定性和热力学特性。 差示扫描量热法（DSC）特别适合于双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs），因为它可以通过额外的信息，如展开焓变，来识别不同区域的展开事件，但由于仪器限制和样品需求，通常相对低通量。相比之下，差示扫描荧光法（DSF），也称为热移测定，基于色氨酸和酪氨酸在展开时的内在荧光或添加荧光染料，通常高通量。这种技术在高通量环境中的一个典型用例是识别低稳定性抗体进行优先级降低，这些抗体的Tm接近或低于CH2热展开温度。 除了热展开外，许多DSF仪器还能够检测由热展开引起的聚集体形成，这导致光散射增加。这种聚集的起始温度通常用于筛选各种配方对聚集倾向的影响。 bsAbs/msAbs的形式对热稳定性有若干重要影响。一般来说，bsAb/mAb设计策略很少相对于亲本mAbs增加热稳定性。因此，建议在开发过程早期评估亲本抗体的热稳定性，并且理想情况下应降低热稳定性低的mAbs的优先级。在bsAb/msAb工程之后，通常一个或多个重组成的可变区域会失去热稳定性。设计可能如何影响亲本抗体不同区域的热稳定性，理想情况下应通过DSC进行评估，DSC非常适合解耦大多数mAb和bsAb格式中存在的众多展开事件。使用不需要突变Fv区域的bsAb/msAb格式，如VHH域，可能完全避免基于重组成的热稳定性下降的不可预测性。 已经开发和优化了几个bsAb平台和结合域的工程解决方案，以避免热稳定性的损失。对于目标域，包括在Fabs的VH-VL和CH1-CL界面、scFvs的可变域之间、scFvs的连接和可变域之间引入二硫键，或在scFvs的连接和可变域之间引入二硫键。后一种方法被证明可以将二硫键固定的scFvs的热稳定性提高约10°C。用于保持热稳定性的其他方法包括合理工程或随机突变方法的组合、人源化到更稳定的框架、或将稳定框架残基转移到不太稳定的框架上。 5.2.化学稳定性 化学稳定性指的是抗体一级序列中共价键的完整性以及重链-重链或重链-轻链之间。基于抗体的治疗药物的化学稳定性可能受到多种不同的降解途径的影响，包括脱酰胺作用、异构化、氧化、二硫键交换、N-末端焦谷氨酸形成、C-末端赖氨酸剪切、片段化和糖基化。 根据这些降解事件的位置与亲和位点和恒定域的关系，抗体的活性或半衰期可能会受到影响。一个众所周知的例子是曲妥珠单抗，其中LC-Asn30的脱酰胺对效力有轻微影响，而HC-Asp102的异构化显著降低了其效力。由于氧化应激，蛋氨酸氧化为蛋氨酸亚砜可能会对抗体产生几种影响，如报告的单克隆小鼠抗体OKT3。在Fc区域的M428/M252处蛋氨酸氧化可能会影响与FcRn的结合，从而影响抗体的回收，这会减少抗体的半衰期。任何影响亲和位点活性或Fc效应功能的化学降解都是有害的。因此，选择化学稳定的靶向单元以限制项目失败的风险非常重要。bsAb/msAb格式及相关的连接子或突变应用于生成bsAbs/msAbs也可能影响化学稳定性。化学稳定的靶向单元在重组成bsAbs/msAbs时可能会遇到不可预见的化学稳定性问题；因此，仔细评估亲本和衍生的bsAbs/msAbs都很重要。如果检测到降解事件，它们有时可以通过适当的配方条件来减轻。但重要的是要注意，强大的化学稳定性对于体内给药后的稳定性很重要，因此工程方法通常比配方筛选更可取。导致抗体降解的常见事件包括脱酰胺作用、异构化和片段化。脱酰胺作用是抗体中普遍存在的修饰，它发生在生产、储存或体内，并且更容易影响天冬酰胺残基，以及在较小程度上影响谷氨酰胺残基。脱酰胺作用是通过主链酰胺氮对侧链酰胺的羰基碳的亲核攻击和随后氨的丢失，导致通过天冬酰-琥珀酰亚胺（Asu）中间体形成天冬氨酸，通常在中性或碱性pH下加速。 相反，天冬氨酸通过Asu中间体的水解异构化通常在酸性pH下加速，并导致异天冬氨酸或天冬氨酸的形成（在中性条件下的比例为3:1）。异构化不依赖于水的存在，因此也可能发生在冻干的抗体配方中。 识别化学降解风险最直接的方法是通过对一级氨基酸的简单基序分析。然而，任何给定基序的降解倾向高度可变，并且取决于额外的结构因素，如溶剂可及性和二级结构构象，以及诸如pH、温度、辅料等外在因素。因此，基序方法仅作为化学责任风险的初步评估，任何情况都应通过额外的分析来确认。最近，基于结构和同源模型的方法已被开发出来，以更好地评估这些降解事件的可能性，某些位置和溶剂暴露的CDR环中的序列基序被识别为脱酰胺、异构化和氧化的热点。 虽然从开发的角度来看，Fv区域的降解通常是最具问题的，但这些修饰也常位于IgG的恒定区域。 化学稳定性问题可以通过强制降解研究来识别，这些研究通过故意将治疗性抗体暴露于应力条件下，在其整个生命周期中进行调查。这些研究可以包括长时间暴露于高温、低/高pH值、冻融循环、搅拌、糖基化、光照和生理或氧化应激。这些研究通常结合实验方法来检测和定量任何化学修饰，如离子交换和疏水相互作用色谱、标记和HPLC-UV-Vis、通过质谱的肽图、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或毛细管电泳和等电聚焦。 这些研究劳动密集、耗时且耗费材料，通常在发现过程的后期阶段对较少数量的抗体进行，通常在细胞系开发前。根据检测到的任何化学责任的位置，这些研究的样本通常也通过结合和活性测定来表征，以评估任何化学降解事件是否影响对目标的结合亲和力或抗体的活性和回收。抗体治疗中化学稳定性受损的另一种表现是片段化，可以分为非酶促和酶促片段化。非酶促片段化在抗体中经常观察到，主要在恒定区域，最有可能在上铰链区域，由于其动态环结构，可能性最高。 在上铰链区域的非酶促片段化发生在蛋白质主链中，通过诸如β-消除、直接水解、介导的裂解或自由基催化等化学反应，这取决于溶剂条件，如碱性或酸性pH值、温度以及自由基或金属的存在。非酶促片段化也可能伴随着二级、三级和四级结构以及构象灵活性发生，将序列空间中相距甚远的侧链带到局部环境中。非酶促片段化事件经常发生在天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺残基上，其中除了甘氨酸外，其他残基都可以通过它们的侧链介导片段化事件。CH1恒定区域的K(133)STSGGT环可能是一个常见的裂解位点，产生两个约35和15千道尔顿的片段，CH2区域（G236-G237，D270-P271）的其他位点也被发现可以迅速裂解。酶促片段化通常由蛋白酶裂解介导，这发生在mAbs和bsAbs/msAbs的生产和纯化过程中，铰链区域是酶促裂解最常见的位点。在所有情况下，片段化主要通过如天然尺寸排除色谱或SDS-PAGE等分离方法检测。与任何已识别的化学稳定性问题一样，需要根据裂解位点在Fv或恒定区域的位置评估其对抗体活性的影响。检测bsAbs/msAbs中片段化的工作与mAbs相同，但由于存在两个或更多的靶向区域，事件的复杂性和分配裂解基序的难度可能会增加。 此外，双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）可能会经历一个更为严格的纯化过程，包括额外的色谱步骤来去除与格式相关的杂质，因此任何化学稳定性的缺陷在制造过程中可能变得更加明显或累积。 焦谷氨酸的形成通常出现在抗体重链和轻链的N-末端，特别是当N-末端残基是谷氨酰胺时，对于谷氨酸来说则较少见。焦谷氨酸的形成可以通过非酶促的自发环化在体外通过亲核攻击N-末端主链酰胺氮对侧链酰胺形成稳定的五元环与H2O离去基团，或在体内由谷氨酰胺环化酶催化，这是一种在人类、动物和植物中发现的酶。如果控制不当，焦谷氨酸的形成可能导致抗体异质性，并可能影响制造过程中关键质量属性（CQAs）的维持。对于bsAbs来说也是如此，由于所有链的N-末端在某些双特异性格式中可能不同，检测和控制焦谷氨酸形成的复杂性增加了。 主要发生在赖氨酸侧链胺基和较小程度上的N-末端胺基和精氨酸的糖基化是一种非酶促的糖基化修饰，可以改变对抗原的亲和力，影响抗体的效力，并增加聚集。这种现象在治疗性抗体中很常见，并已在bsAbs中得到证实。这种糖基化事件通常由细胞培养中的发酵过程或储存期间引起，当含有蔗糖的配方水解导致非还原糖时，这会通过低pH和高温度加速。因此，制造过程需要严格控制，以通过适当的生产和配方条件满足CQAs。糖基化可以通过硼酸盐或离子交换色谱、毛细管等电聚焦、LC/MS方法和比色法检测。 5.3.胶体稳定性和粘度 胶体稳定性指的是折叠蛋白通过自相关沉淀在溶液中的倾向，由电荷不平衡、疏水斑块、融合蛋白界面解离和结合以及与离子的相互作用介导。 粘度是描述给定抗体配方流动阻力的相关属性，由不希望的分子间蛋白-蛋白相互作用引起，这些相互作用由胶体和构象浓度依赖行为介导。这些相互作用可能源于与部分原子电荷分布、等电点和偶极矩相关的变量域的静电属性，或导致自相关的疏水属性和形状互补性。对于高浓度的治疗性bsAbs/msAbs配方，胶体稳定性和粘度是重要的属性。通常通过盐或PEG诱导沉淀、静态光散射、多角度光散射和动态光散射（DLS）来评估蛋白质治疗剂的胶体稳定性。DLS可以在高通量设置中确定扩散相互作用参数（kD），特别适合评估配方条件及其在搅拌等应激条件下对胶体稳定性的影响。胶体稳定性通常在含有scFv域的bsAbs/msAbs中受损，由于VH-VL界面的柔韧性增加，这种柔韧性通过可逆解离和结合形成寡聚体，这一过程取决于蛋白质浓度，并可能受到pH值、离子强度和其他辅料的影响。Majumder等人证明，一个易于聚集的scFv-bsAb在组氨酸和谷氨酸的等摩尔缓冲液组合中具有改善的胶体稳定性，展示了配方对改善胶体稳定性的潜力。 自相互作用测定评估抗体在高浓度（>100 mg/mL）下配制用于治疗管理时的胶体稳定性风险。由于bsAbs中靶向臂的价数通常减少，mAbs中自相互作用测定观察到的趋势在bsAbs/msAbs中可能减弱，但不太可能完全消失。此外，任何bsAbs/msAbs平台的设计突变以强制正确的重-重和重-轻界面组装，如引入电荷对和疏水界面工程，如果突变部分或完全暴露或引起构象变化影响抗体表面属性，可能带来自相关风险。因此，重要的是只考虑低风险的靶向单元进行重组成bsAbs/msAbs，并通过自相互作用测定再次评估重组成分子对不希望的自相互作用的倾向。评估自相互作用的方法包括动态光散射（DLS）、亲和捕获自相互作用光谱（AC-SINS）、电荷稳定自相互作用光谱（CS-SINS）和生物层干涉测量（CSI-BLI）。DLS是一种广泛使用的评估抗体自相关性的技术，可以在微孔板格式中进行，使用少量抗体评估数百个样本。DLS测量增加的水动力半径作为蛋白质浓度的函数。从在相对较低的抗体浓度（1-20 mg/mL）下进行此分析得出的kD与高达175 mg/mL浓度的29种不同mAbs的粘度测量结果相关性良好。在AC-SINS中，抗体被吸附到金纳米颗粒上，产生高局部蛋白质浓度，模拟浓缩的抗体溶液。吸引的自相互作用减少固定抗体之间的粒子间距离，导致最大吸收波长（等离子体波长，λp）的红移。AC-SINS在高通量板格式中识别具有高自相关风险的抗体，同时在稀薄浓度（<50 μg/mL）下使用极少量的样本。这种方法通常用于筛选临床前阶段的抗体胶体稳定性风险。这种方法进一步发展为通过聚赖氨酸涂层通过电荷稳定（CS-SINS）筛选某些配方条件和弱酸性缓冲条件。虽然bsAb重组成可能导致衍生的bsAb与亲本mAb相比AC-SINS得分降低，但由于bsAbs AC-SINS得分与粘度风险之间关系不太明确，因此必须选择低风险的mAb进行重组成。 在生物层干涉测量（CSI-BLI）中，抗体通过其Fc区域装载到生物层干涉测量生物传感器上，以测量自结合反应。Fab可用于通过氢键配对、离子相互作用或疏水相互作用进行结合，该测定可以在低样品量（15μg）的高通量格式下进行。 抗体候选物和配方的粘度风险通常通过使用粘度计直接测量。由于高浓度配方需要大量样品，通常在开发过程的相对后期进行此实验。将单克隆抗体重组成bsAbs/msAbs可能会导致粘度增加，因为在存在两个靶向单元时会出现新的相互作用，特别是如果这些单元具有相反的静电属性。混合两种低粘度mAbs（pI分别为6.3和9.3）的粘度数据与相关bsAb的高粘度相关。新型几何结构导致的更大的bsAbs/msAbs也可能导致粘度问题，如一项研究中所示，一种双变量域免疫球蛋白bsAb比亲本mAb更粘稠，粘度的增加归因于bsAb的整体大小。有几种策略可以预防适用于mAbs和bsAbs/msAbs的粘度问题。首先选择对其预期给药途径具有有利的低粘度行为的bsAbs/msAbs非常重要。选择低粘度亲本抗体进行双特异性IgG重组可能无法预测具有有利粘度的bsAb/msAb，正如Tilegenova等人所证明的，用一个抗IL-13/IL-17双特异性IgG4抗体进行的研究发现，怀疑引起阳离子-π和/或π-π相互作用的芳香族点突变降低了双特异性的粘度，并且对一个在150 mg/mL时粘度高的单特异性抗GCGR IgG1抗体也成功。从蛋白质序列或结构计算的Fv净电荷可以表明潜在的粘度风险。Fv电荷<2的抗体被认为是高风险，因为它们可能有负电荷斑块，可能驱动与恒定域中的正电荷斑块自相关。此外，Fv电荷对称参数，即VH和VL的净电荷乘积，也可以表明由于自相关引起的粘度风险。 总之，稳定性评估是非常多维的，并且是全面开发性评估的关键要素。在目标给药途径和粗略配方的背景下最好评估稳定性。有大量的测定可用于这些测量，这些测定在实施的难易程度、通量和预测能力上有所不同，一个结构良好的评估策略应该在开发过程中利用多种测定。5.4.体内稳定性 治疗性抗体在给药后数天和数周内的体内物理化学稳定性可能对药物效力、清除和免疫原性有影响。与mAbs一样，IgG样的bsAbs/msAbs最好具有提供长半衰期的药代动力学（PK）特性。由于它们的半衰期较长，因此可以减少给药频率并改善患者依从性。与mAbs一样，bsAbs/msAbs的体内稳定性可以通过检测其在体内的浓度随时间的变化来评估，这通常通过ELISA或基于质谱的检测来完成。体内稳定性的测定对于预测药物效力和评估长期给药方案的可行性至关重要。 由于它们在循环中的半衰期大约为3周，内源性和重组抗体可以经历与治疗性抗体在制造和储存过程中类似的体内生物转化事件，包括异构化、氧化、糖基化、二硫键修饰、N-末端焦谷氨酸形成、C-末端赖氨酸剪切和蛋白水解裂解。在体内对抗体药物的生物转化事件的检测和定量是治疗性抗体开发中一个相对较新且日益增长的领域，这一领域面临着一些技术挑战。 血清是血液的一个亚室，含有富含白蛋白、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、同型半胱氨酸和其他小硫醇的异质环境，这可能导致抗体二硫键的重新排列，特别是对于IgG和IgG4。根据局部环境和溶剂暴露，这种混乱可能与使用工程二硫键以增强热和胶体稳定性的bsAb/msAb格式相关。 在啮齿动物和非人灵长类动物中进行的血清稳定性研究和药代动力学（PK）评估有助于评估bsAbs/msAbs的稳定性，并在开发性评估的早期识别潜在的责任。PK与抗原结合能力之间的关系可以用来识别体内不稳定的开发候选物。例如，体内脱酰胺作用可能导致抗原结合的丧失，影响效力，并可能引起潜在的关注。 IgG1、IgG2和IgG4亚类的的治疗性抗体可能容易受到木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和链球菌免疫球蛋白降解酶的重组蛋白酶裂解，不同的酶特异性和裂解效率主要基于它们各自的铰链序列。此外，IgG1可以被肿瘤微环境中的蛋白酶如基质金属蛋白酶裂解，或者在循环中，而IgG2则较不易受到裂解。IgG1两个重链的下铰链的裂解可能对Fc效应功能产生负面影响，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性，因为裂解位点靠近Fcy受体和C1q的结合位点，可能与自身炎症性疾病中mAbs的治疗抵抗性有关。蛋白酶裂解事件可能以类似的方式影响IgG型bsAbs/msAbs格式的铰链区域，具有潜在的意想不到的裂解敏感性、特异性和效率。因此，应在临床前开发阶段监测这些裂解事件。许多bsAb格式使用甘氨酸-丝氨酸的扩展连接序列来系上额外的模态并增加价数，这些可能容易受到体内蛋白水解裂解的影响。 相反，最近已经利用在实体瘤的肿瘤微环境中优先表达的某些蛋白酶的存在来激活被蛋白酶可裂解的域或肽段掩盖的bsAb TCEs，以限制它们在循环中的靶向毒性。在另一个例子中，蛋白酶敏感的连接子被用来将两个域抗体系成一个bsAb分子，用于治疗性口服治疗炎症性肠病。 6.可制造性 可制造性是分子开发性评估的一个组成部分。通过可制造性评估，可以更深入地了解分子行为，从而设计出既注重质量又注重数量的制造过程和控制策略。这种评估最好在代表性材料上进行，评估与产品质量、可扩展性和工艺产量相关的大规模生产过程的技术可行性。通常，可制造性评估分子适应平台流程和方法，以支持简化的开发工作。及早识别CQAs（关键质量属性）和工艺及分析开发的风险，可以减轻开发挑战，并允许优先分配工艺开发资源。开发候选物的可制造性是实现供应高质量、纯化和配方化的抗体以推进毒理学研究、临床研究和商业化的关键考虑因素。执行严格和全面的临床计划以及满足商业化视角下的供应链目标所需的抗体数量，突出了建立强大和可扩展制造工艺的基本需求。 6.1.双特异性抗体/多特异性抗体的制造考虑 从可制造性的角度来看，单克隆抗体（mAbs）已经通过发表的报告和行业指导文件得到了很好的表征。自1986年首个单克隆抗体商业化以来，已经开发了许多可制造性工具，并对潜在的责任进行了表征，降低了将单克隆抗体治疗推进到制造过程中的相关风险和挑战。 尽管双特异性抗体/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）作为一类治疗药物取得了进展和势头，但与单克隆抗体相比，支持其开发到制造的资源相对较少，这主要是因为它们在临床和商业制造方面的历史相对有限。此外，bsAbs/msAbs的结构异质性除了必须克服的单克隆抗体工艺障碍外，还提出了几个可制造性挑战。 6.2.工艺考虑 上游工艺考虑 在开发稳定表达bsAb/msAb的细胞系时，上游处理考虑不仅必须评估典型的开发标准，如蛋白质滴度、细胞系稳定性、群体倍增时间、翻译后修饰以及在预测设备、材料、培养基和饲料背景下的可制造性，而且还必须额外评估完整bsAb/msAb分子正确组装的可能性。 开发bsAb/msAb上游工艺可能非常具有挑战性，因为几个变量可能影响正确与错误组装分子的比例，以及错误组装物种的身份和相对丰度。载体和序列设计、选择克隆性和正确组装分子产量的过程，以及细胞培养和蛋白质表达的多因素性质（如上所述），都是需要考虑的关键因素。使用导向突变，如knob-into-hole突变，结合细胞系开发选择和上游工艺开发考虑，通常用于努力优化粗提物中正确配对目标分子的浓度。 尽管在细胞系开发和上游处理方面取得了进展，但在细胞培养上清液中存在错配的bsAb/msAb并不罕见，制造过程中还需要在下游成功纯化此类产品相关杂质的方法。 下游工艺考虑 在下游处理中，上游bsAb/msAb制造过程中产生的错配变体是不受欢迎的，它们作为工艺杂质，给纯化过程带来额外负担。在典型的单克隆抗体制造过程中，半抗体和抗体片段是常见的杂质，但具有显著结构和生化特性差异的变体更容易使用依赖分子电荷差异的色谱方法分离。这对bsAbs/msAbs的可制造性提出了特别的挑战，因为潜在的错误组装分子，如几个四链bsAb分子中的那些，可能表现出难以用制造中常用的分离方法区分的生物物理特性。不同质量的产品相关杂质也可能影响纯化和表征方法，包括由于bsAb/msAb变体的聚集倾向增加而产生的重大制造挑战。因此，在开发bsAb/msAb候选物时及早评估可制造性是非常有利的，以确定由于链错配而产生的结构变体之间的分子属性差异是否提供了足够的分辨率，以实现大规模成功纯化。变体之间的pI差异是主要关注点，因为在大规模制造中广泛使用了pH和/或电导依赖的色谱过程。 也可以利用其他纯化方法从其他属性中分离产品相关变体，包括利用疏水相互作用色谱针对变体之间的疏水性差异，或依靠独特的属性组合通过多模式色谱方法实现分离。虽然结合多种纯化方法可以增加成功分离配对的bsAbs/msAbs与错配变体的可能性，但涉及的额外时间和成本通常是不受欢迎的。在制造过程中，定制与建立可靠的平台流程相反，突出了开发需要有限工艺定制的bsAbs/msAbs的价值。 使用适当的分析方法对于生产中双特异性抗体/多特异性抗体（bsAb/msAb）的特性描述至关重要。除了典型的与产品相关的、宿主细胞相关的以及其他与工艺相关的杂质外，建立一个足够灵敏的分析方法以区分正确和错误组装的抗体产品非常重要。在开发过程中，区分这些变体的可制造性和工艺开发至关重要。此外，这种材料可能用于临床前研究，强调了其质量的重要性。当考虑制造规范时，批量放行标准推动目标分子的最终浓度以及任何指定杂质在可接受的范围内。液相色谱/质谱（LC/MS）方法，包括去糖基化完整质谱，通常能够区分错配变体，识别包含错配的重链（HC）和/或轻链（LC）组合的分子，以及正确配对的bsAbs/msAbs。随着bsAb/msAb药物开发向商业化发展，另一个关键的分析挑战是生物测定法的开发。bsAb/msAb的生物测定法必须准确且可重复地反映分子的双重作用机制和潜在的机制协同作用。将这些组合到单一测定中可能证明是一个重大挑战，评估是否需要开发两个单独的生物测定法是建立适当分析策略时的一个重要因素。7.结论 首个基于bsAb和msAb的药物开发涉及大量投资，用于制造和评估这些新兴分子，以满足现代治疗药物所期望的严格的安全性和有效性标准。治疗性双特异性抗体的开发有着悠久且研究深入的历史，始于20世纪60年代双特异性F(ab)2分子的形成，并于2018年首个双特异性药物blindumomab获得FDA批准。随后，用于生成这些复杂分子的蛋白工程方法以及高效评估其功能和开发性属性所需的技术和知识都有了显著改进。这些努力的结果是，过去几年有数百个bsAb/msAb分子进入临床研究，为临床上评估这些令人兴奋的分子提供了独特的治疗潜力。同时在体内对多个靶标采取行动的能力为药物开发提供了组合机会，并有望改变许多疾病的治疗格局。因此，用于工程化和评估这些独特分子的方法必须继续发展，以满足这一机会并为患者提供价值。 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