LXR

作者｜小麦 代谢性疾病即是指由代谢问题引起的疾病，由代谢障碍和代谢旺盛等原因导致，主要包括高血压（HTN）、2型糖尿病（T2DM）、高脂血症（HLD）、肥胖，以及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）等。 它们中的多种疾病可能会同时发生，具有共同的危险因素，并与残疾、癌症和过早死亡风险增加有关。 据研究，从2000-2019年这20年里的所有代谢性疾病的发病率都有所增加，在平均收入、教育程度和生育率较高的国家，代谢性疾病负担的增加最为显著。 目前这些疾病的治疗以小分子化药和生物制剂靶向药物为主，它们虽然展现出显著的治疗效果，但在耐药性、毒副作用、价格以及适用范围等方面存在一定的局限性，所以仍需新的治疗方法。 蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）是近几年新兴的一门技术，有靶向不可成药靶点、效率高和克服耐药性等优点，在与代谢疾病相关的一些靶点如HMGCR、PNPLA3、LXR、PI3K和PDEδ中有应用进展。   01   靶向HMGCR的PROTACs 胆固醇是哺乳动物体内含量最丰富的甾醇类分子，是细胞膜的基本组分之一，胆固醇稳态对机体正常的生命活动至关重要，胆固醇的代谢异常与心脑血管疾病、神经退行性疾病及肿瘤等的发生密切相关。 胆固醇合成主要发生在肝脏，通过近30步酶促反应将乙酰辅酶A转化为胆固醇分子；其中3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase, HMGCR)介导的甲羟戊酸途径是机体胆固醇从头合成的关键步骤，因此，HMGCR的表达及调控对机体胆固醇稳态的维持十分重要（图1）[1]。 图1. HMGCR作用机制以及靶向HMGCR策略 HMGCR是他汀类药物防治心血管疾病的经典作用靶点, 然而他汀类药物可引起HMGCR蛋白的代偿性上调，并引起包括骨骼肌损伤在内的不利影响, 从而敦促开发额外的治疗策略。 2020年, Li等首次通过连接阿托伐他汀与CRBN设计并合成了一组可以降解内质网定位的多面跨膜蛋白HMGCR的PROTAC分子（图2）, 他们经过一系列优化得到化合物P22A，其能有效促进内源性HMGCR蛋白的降解。在Huh7细胞中，由P22A诱导的HMGCR蛋白的增加远小于阿托伐他汀引起的增加。P22A还能够激活胆固醇调节元件结合蛋白（SREBP）途径并阻断胆固醇的生物合成，该技术可为降低胆固醇水平和治疗相关疾病提供新策略。  图2. 基于CRBN设计的靶向HMGCR的PROTAC Luo等人通过连接链连接洛伐他汀与VHL配体得到一类新颖结构的靶向HMGCR 的PROTAC（图3）[2]，如PROTAC 21c，可有效降解 HepG2 细胞中的 HMGCR 并形成稳定的三元复合物，且其口服相应的内酯 21b 显示出有利的血浆暴露。 21b 的进一步体内研究表明，饮食诱导的高胆固醇血症小鼠具有强烈的 HMGCR 降解和有效的胆固醇降低作用，突出了治疗高脂血症和相关疾病的有前途的策略。  图3. 基于VHL设计的靶向HMGCR的PROTAC   02   靶向PNPLA3的PROTACs Patatin磷脂酶结构域 3（PNPLA3）是一种主要在肝脏和脂肪组织中表达的脂筏蛋白，对由单不饱和脂肪酸和二不饱和脂肪酸组成的甘油三酯（TG）具有水解酶活性，并且对磷脂中的多不饱和脂肪酸（PUFA）具有潜在的转酰酶活性，负责将甘油三酯中的不饱和脂肪酸转移到磷脂中（图4）[3]。 研究表明，PNPLA3变异会增加代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）发生风险，主要因为PNPLA3基因变异可导致148位氨基酸由异亮氨酸变为蛋氨酸，这将降低脂肪酶活性，阻碍脂肪从肝脏中排出，从而导致脂肪堆积引起疾病。 图4. PNPLA3 在肝细胞中的作用 另一项研究表明PNPLA3基因与肾脏疾病发生有关，研究发现在校正传统肾脏危险因素和NAFLD组织学后，PNPLA3 GG基因型不仅能显著增加慢性肾脏病（CKD）和蛋白尿的风险，而且还增加尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（u-NGAL）水平。因此对PNPLA3的降解消耗是一种潜在的治疗干预策略。 为了确定 PNPLA3 在肝脂滴（LDs）上的聚集是脂肪变性的原因还是结果，BasuRay 等设计并合成了 PNPLA3 降解物（PROTAC 3），其中含有对 E3 连接酶 VHL 具有高亲和力的羟脯氨酸衍生物，与氯烷烃偶联，并与修饰的细菌脱卤酶（Halo）共价结合（图5）[4]。 他们在表达 halo 标记的 PNPLA3 构建体处理的QBI-293A 细胞中加入浓度增加的PROTAC 3，研究发现PNPLA3 水平显著降低。此外，他们还测试了PROTAC3处理在表达 PNPLA3（WT）和 PNPLA3（148 M）的小鼠中的作用，验证 PROTAC 介导的降解降低了 PNPLA3（148 M）水平并改善了与突变蛋白表达相关的脂肪肝病（FLD）。 图5. PROTAC 介导的 Halo-PNPLA3（148M） 降解可降低肝脏甘油三酯（TGs）   03   靶向LXR的PROTACs 肝脏 X 受体α和β（LXRα 和 LXRβ）是在脂质代谢的转录控制中起关键作用的核受体。LXR 的转录活性是在细胞胆固醇水平升高时诱导的。 LXR 结合并参与调控胆固醇吸收、运输、外排、排泄和转化为胆汁酸的蛋白质的基因表达，它的异常也会导致相关疾病的发生（图6）[5]。  图6. LXR作用机制 LXR已越来越被认为是治疗血管和代谢疾病、神经系统疾病以及由脂质代谢驱动的癌症等疾病的潜在治疗靶点。 2021年，Xu等人发现了一类靶向LXR的PROTACs，如 GW3965-PEG5-VH032（3），依赖VHL E3 连接酶能够有效降解 LXRβ 蛋白（图7）[6]。  图7. 靶向LXR的PROTACs的设计策略   04   靶向PI3K的PROTACs PI3K是一种磷脂酰肌醇激酶且具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，主要是在磷脂酰肌醇（phosphatidylinositide，Ptdlns）3’端的羟基上加上磷酸。 PI3K 激酶在调节细胞生长、代谢、增殖和细胞凋亡等关键过程中发挥重要作用，PI3K基因在许多肿瘤中突变频率都很高，其异常激活与恶性肿瘤的发生发展十分密切。 2022年，Camaya等人探讨通过调节PI3K/Akt信号通路作为一种新的治疗策略增强β细胞功能和存活能力，表明PI3K/Akt信号通路是1型糖尿病（T1D）有希望的治疗靶点或将发展成为治疗1型糖尿病的一种新兴的疗法（图8）[7]。  图8. PI3K/Akt信号通路在1型糖尿病（T1D）中作用 2022年，Ma等人通过连接链将PI3K抑制剂与 VHL 配体连接获得一系列靶向 PI3K 激酶的降解剂，并研究了它们的生物活性。大多数化合物对 Hela 细胞表现出显著的抗增殖活性，其中化合物HL-8在10 μM显示出抗癌潜力。此外，HL-8 还可以在 10 μM 时明显降解 PI3K 激酶[8]。 2024年，Rao等人首次利用PROTAC技术实现了 I 类磷酸肌醇 3-激酶（PI3K）的亚型选择性降解，如ZM-PI05可以择性降解多种乳腺癌细胞中PI3K p110α 亚型且可以下调 p85 调节亚基，同时抑制 PI3K 独立于 p110 催化亚基的非酶功能（图9）[9]。 因此，与 PI3K 抑制剂 copanlisib 相比，ZM-PI05在乳腺癌细胞中表现出更强抗增殖活性。 图9. 靶向PI3K的PROTACs的设计策略   05   靶向PDEδ的PROTACs 异戊二烯基蛋白伴侣（PDEδ）是一种脂质结合蛋白，可与异戊二烯化 OS 蛋白形成可扩散复合物，并发挥异戊二烯化 Ras 的质膜定位功能。 靶向 PDEδ异戊二烯基结合位点的小分子抑制剂已被证明在PDEδ介导的生物过程分析（如 KRas 细胞运输）中具有不可估量的价值。然而，Arl2/3 GTP 酶从PDEδ释放的变构抑制剂限制了它们的应用。 Winzker等人基于PDEδ抑制剂设计了一类PROTAC化合物，可以有效且选择性地降低细胞中的 PDEδ水平（图10）[10]。 PDEδ PROTACs 的应用增加了甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）介导的脂质代谢相关酶的基因表达，这伴随着胆固醇前体水平的升高。这一发现首次表明 PDEδ功能在甲羟戊酸途径酶的调节中发挥作用。 图10. 靶向PDEδ的PROTAC的设计策略   小结   代谢综合征特指一类复杂的代谢紊乱疾病，全球代谢疾病患者逐年增加，迫切需要新的药物和技术。 目前全球有数几十种PROTACs临床在研，涉及的疾病类型越来越多，如癌症、自免疾病和代谢类疾病，且PROTAC作为一门技术在代谢疾病相关靶点也有很大的进展，为越来越多患者提供新的选择。  主要参考文献  1.Lebwohl D, Kay A, Berg W,Baladi JF and Zheng J. Progression-free survival: gaining on overall survivalas a gold standard and accelerating drug development. Cancer J 2009; 15: 386-394 2.Choi JH, Ahn MJ, Rhim HC, KimJW, Lee GH, Lee YY and Kim IS. Comparison of WHO and RECIST criteria forresponse in metastatic colorectal carcinoma. Cancer Res Treat 2005; 37: 290-293 3.McLeod C, Norman R, Litton E, Saville BR, Webb S and Snelling TL. Choosing primary endpoints for clinical trials of health care interventions. Contemp Clin Trials Commun 2019; 16: 100486 4.Anagnostou V, Yarchoan M, Hansen AR, Wang H, Verde F, Sharon E, Collyar D, Chow LQM and Forde PM. Immuno-oncology trial endpoints: capturing clinically meaningful activity. Clin Cancer Res 2017; 23: 4959-4969 5.Gyawali B, Hey SP and Kesselheim AS. Evaluating the evidence behind the surrogate measures included in the FDA’s table of surrogate endpoints as supporting approval of cancer drugs. EClinicalMedicine 2020; 21: 100332. 6.Barile JP, Reeve BB, Smith AW,Zack MM, Mitchell SA, Kobau R, Cella DF, Luncheon C and Thompson WW. Monitoringpopulation health for healthy people 2020: evaluation of the NIH PROMIS(R)global health, CDC healthy days, and satisfaction with life instruments. QualLife Res 2013; 22: 1201-1211. BiG近期会议 10月31日，BiG联合Citeline，将于10月底，举办自免小规模私董研讨会，聚焦：TCE vs. CAR-T，自身免疫开发策略，线上同步直播，敬请期待！ ▼ 共建Biomedical创新生态圈！ 如何加入BiG会员？

MENLO PARK, Calif.--( BUSINESS WIRE )--OrsoBio, Inc. ("OrsoBio” or “the Company”), a clinical-stage biopharmaceutical company developing treatments for obesity and obesity-associated disorders, today announced the close of an oversubscribed $67 million Series B financing. The financing was co-led by new investors Ascenta Capital and Woodline Partners LP, with significant participation from existing investors Samsara Biocapital, Longitude Capital, Enavate Sciences, NuevaBio, and Eli Lilly and Company. In conjunction with the financing, Evan Rachlin, MD, Co-Founder and Managing Partner of Ascenta Capital, has joined the OrsoBio Board of Directors. Proceeds from the financing will be used to accelerate development of the Company’s mitochondrial protonophore portfolio for the treatment of obesity and associated metabolic disorders. Obesity affects more than 40% of U.S. adults and leads to a range of adverse health outcomes including type 2 diabetes, cardiovascular disease, and metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Obesity is caused by an imbalance between energy intake and energy expenditure that leads to excess adiposity. Although glucagon-like peptide-1 receptor agonists (GLP-1 RAs) have revolutionized weight management by reducing caloric intake, they may cause loss of lean mass and metabolic adaptations that reduce energy expenditure. Mitochondrial protonophores directly increase energy expenditure and may represent the ideal means to complement the metabolic benefits of GLP-1 RAs. In preclinical studies, mitochondrial protonophores developed by OrsoBio led to weight loss, preserved lean mass, and improved insulin sensitivity. Further, when these potential therapies were used in combination with a GLP-1 RA, additional weight and fat mass loss were observed, without significant effects on lean mass. These benefits were sustained with continued protonophore therapy following GLP-1 RA discontinuation. 1 TLC-6740 is a novel, oral, liver-targeted mitochondrial protonophore under evaluation in a 12-week, Phase 1b clinical trial in patients living with obesity ( NCT05822544 ). In a prior Phase 1 study in healthy subjects, TLC-6740 was safe, well tolerated, and caused dose-dependent increases in energy expenditure and improvements in lipids and markers of insulin resistance. Additional Phase 1b and Phase 2a studies of TLC-6740 in patients with obesity and type 2 diabetes, including those on a GLP-1 RA, will initiate in the coming months. IND-enabling studies for two additional novel protonophores (TLC-1180 and TLC-1235) with unique attributes compared to TLC-6740, including greater systemic distribution, are expected to be completed in 2025. TLC-1180 is a potent, long-acting mitochondrial protonophore that is suitable for weekly oral or subcutaneous administration. TLC-1235 is a controlled-release mitochondrial protonophore (CRMP) that has shown metabolic benefits across a range of models and species. 2 "We welcome Ascenta Capital and Woodline Partners to OrsoBio and appreciate their support and that of our existing investors. These resources enable us to continue advancing our portfolio of mitochondrial protonophores and other potential therapies to address the burden of obesity and obesity-associated diseases,” said Mani Subramanian, MD, PhD, CEO and Founder of OrsoBio. “We believe that the future of obesity treatment will include GLP-1 RA-based combinations; this financing will enable us to build the scientific and clinical foundations to support our protonophores as components of these regimens.” "OrsoBio’s novel mechanisms hold promise to enhance weight loss, improve metabolic function, and preserve lean muscle mass,” said Evan Rachlin, MD, Co-Founder and Managing Partner of Ascenta Capital. “These medicines could one day complement GLP-1 RA-based approaches and expand the long-term health benefits of these treatments. We look forward to partnering with the world-class team at OrsoBio to help bring these extraordinary medicines to patients.” OrsoBio’s portfolio of compounds in clinical development also includes TLC-3595, an ACC2 inhibitor, currently in a Phase 2a study for the treatment of type 2 diabetes, and TLC-2716, a liver X receptor (LXR) inverse agonist currently in a Phase 2a study for severe hypertriglyceridemia and MASH. About OrsoBio, Inc. OrsoBio, Inc. is a privately held, clinical-stage biopharmaceutical company dedicated to developing therapies to treat obesity and obesity-associated disorders, including type 2 diabetes, MASH, and severe dyslipidemias. OrsoBio currently has four programs in clinical and preclinical development with first-in-class compounds that address central pathways in energy metabolism. For more information, please visit www.orsobio.com . ____________________________ 1 Data accepted for presentation at ObesityWeek® 2024. 2 Perry RJ, et al. Science 2015 ( PMID: 25721504 ); Goedeke L, et al. Mol Metab 2021 ( PMID: 33545391 ).

摘要：通常，抗体-药物偶联物（ADCs）由人源化抗体和小分子药物通过化学连接物连接而成。ADCs将细胞毒性药物递送到特定部位并减少副作用的能力，在肿瘤学领域显示出了有希望的结果。迄今为止，已有十四种ADCs获得美国食品药品监督管理局的批准，大约297种ADCs处于肿瘤学领域的临床前/临床阶段。受到这些成果的启发，一些科学家探索了抗体-药物偶联物在非肿瘤学疾病中的潜力，例如关节炎、重症肌无力、免疫性疾病和肾衰竭。然而，关于抗体-药物偶联物在非肿瘤学应用方面的数据有限。本综述着重于抗体-药物偶联物在非肿瘤学应用，包括它们的发展研究、测试程序、体外评估和临床前测试。此外，还提供了ADCs在非肿瘤学应用中的限制、困难和前景的总结。 1.引言 抗体-药物偶联物（ADCs）通常用于治疗癌症，由单克隆抗体（mAb）通过合适的连接物与细胞毒性剂相连。它们结合了单克隆抗体和小分子的最佳特性，为靶标部位创造了一个高度选择性和有效性的部分。被称为“制导导弹”的ADCs有三个基本组成部分：一种优先结合目标组织抗原表面的mAb，一个活性治疗分子，以及一个连接物（可裂解或不可裂解）。ADCs最常见的载体是单克隆抗体，它们具有强烈的结合力和目标选择性。活性部分可能是癌症情况下的细胞毒性剂，或者是非肿瘤学应用中的其他小分子，如图1所示。ADCs的显著优势是减少了非靶标毒性效应，这使它们在肿瘤学中用于将细胞毒性有效载荷递送到特定部位变得方便。 图1.ADC的结构和作用机制 ADCs在肿瘤学的应用始于Mylotarg®（Gemtuzumab ozogamicin）获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于CD33+急性髓系白血病。辉瑞公司在2010年应美国FDA的请求，基于一项揭示安全问题且对患者没有临床优势的临床试验，将Mylotarg®从美国市场撤回。然而，日本药品和医疗器械管理局（PMDA）决定安全概况没有重大变化，并且该产品可以在日本销售。后来，在2017年，FDA重新批准了Mylotarg®用于不同的人群，并修改了剂量方案（之前一次剂量9 mg/m2改为三次剂量3 mg/m2），降低了最大血浆浓度并提高了安全性。Adcetris®（brentuximab vedotin），由CD30特异性mAb与单甲基奥瑞司他丁E（MMAE）偶联而成，是继2011年获得美国FDA批准后进入肿瘤学市场的第二种ADC。在美国、欧洲和日本，它被授权用于霍奇金淋巴瘤（HL）和系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）。Adcetris®通过MMAE与微管蛋白结合，破坏细胞的微管网络，导致细胞周期停滞和凋亡细胞死亡。Kadcyla®（ado-trastuzumab emtansine），是首个获准用于治疗实体瘤的ADC，由Genentech/Roche在2013年开发。它由抗HER2 IgG1抗体曲妥珠单抗，通过不可裂解的硫醚连接物连接到抗有丝分裂剂DM1（美登素衍生物）。它通过破坏微管网络导致细胞周期停滞和凋亡细胞死亡。它被批准作为辅助疗法（手术后）用于先前接受过曲妥珠单抗（赫赛汀®）和紫杉醇治疗的HER2+早期乳腺癌患者，无论是单独使用还是联合使用。这一批准标志着ADC研究的转折点，因为用这种疗法治疗实体瘤一直是一项艰巨的任务。这些ADCs因其成功故事在肿瘤学领域获得了更多关注。目前，已有十四种ADCs在全球范围内获得批准用于实体瘤和血液恶性肿瘤，还有更多的ADCs已经通过了不同的临床发展阶段。当在clinicaltrials.gov上搜索“antibody-drug conjugate”一词时（截至2023年6月19日），发现了235项临床试验研究。当时大约有122项研究正在进行并招募中，65项已完成，7项因各种原因撤回，28项已终止。它们绝大多数与癌症有关，有效载荷为损伤DNA或微管的化学物质。尽管ADCs在肿瘤学中显示出了卓越的潜力，但其在癌症以外的应用一直很少，但近年来一直在增长。Everts等人使用E-selectin导向的免疫偶联物将地塞米松递送到活化的内皮细胞，标志着ADCs在非肿瘤学应用的开始。从那时起，有一些尝试探索ADCs在各种非肿瘤学疾病中的效用，包括炎症性疾病（关节炎、动脉粥样硬化、肌肉疾病、重症肌无力、系统性硬化症和溃疡性结肠炎）、细菌感染、心血管疾病和肾衰竭。这些研究的大多数在体外细胞系或动物中检验了ADCs的潜力。表1提供了不同ADCs在临床前和临床阶段的概述，重点关注非肿瘤学领域。 抗体-药物偶联物的作用机制：下面讨论了ADCs进入体内后的基本作用机制。 循环：通过静脉注射途径给药的抗体-药物溶液进入血液。 结合：ADC的mAb部分与目标抗原结合。 内化：通过受体介导的内吞作用ADC发生内化。 循环：ADC的早期内体部分与FcRn受体结合。 释放：溶酶体与晚期内体融合并释放活性部分。 作用：细胞毒性药物与DNA/细胞微组装相互作用并诱导 细胞凋亡在癌症或其他情况下显示其报告的活性，如图1所示。 2.超越癌症治疗的ADCs 在非肿瘤学应用中，ADCs的显著增加，其中有效载荷可以改变特定的生物过程而不是直接杀死细胞。例如，作为有效载荷的抗生素可用于治疗细菌感染，而糖皮质激素可用于抑制免疫系统。 2.1.抗炎 炎症是身体的保护机制，其特征是触发免疫和非免疫细胞，保护宿主免受各种感染并促进组织修复和愈合。然而，由于身体条件的改变，慢性炎症会导致许多疾病，如高血压、心血管疾病、代谢疾病、关节炎、牛皮癣和癌症。糖皮质激素是市场上可用的许多抗炎剂之一，用于治疗哮喘、自身免疫性疾病、关节炎和炎症性肠病等炎症性疾病。 然而，由于它们的非靶标暴露，激素的长期使用会导致严重的副作用。一些研究人员评估了ADCs将这些皮质类固醇以最小的副作用传递的潜力。尽管当前讨论的主要焦点是糖皮质激素的位点特异性传递，但也讨论了像姜黄素这样的天然生物活性物质的传递。 2.1.1.抗E选择素地塞米松偶联物 Everts等人评估了ADCs利用E选择素导向的免疫偶联物将地塞米松（Dex）细胞内传递到活化的内皮细胞的能力。E选择素（CD62E）在内皮细胞中表达，并且通过转录调控被各种促炎化学物质上调，如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1（IL-1）和LPS（脂多糖）。因此，选择了一种可以特异性结合过度表达的E选择素的抗E选择素抗体（Eab）（H18/7）。Dex通过琥珀酸连接物共价连接到抗体（H18/7）。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PGE）和高效液相色谱（HPLC）分别进行偶联的定性和定量分析。通过西方印迹分析的SDS-PGE分析确认了Dex与Eab的偶联，偶联效率为56%，DAR为2.3（每个抗体2.3个Dex分子）。此外，他们还发现增加Dex浓度会降低偶联物的溶解度和靶向E选择素的能力。使用表面等离子共振结合技术获得的感光图表明Dex-Eab偶联物与E选择素的结合。通过免疫组织化学和流式细胞术在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中评估了Dex ADCs的内皮细胞结合分析。mAb和偶联Dex的免疫组织化学分析显示了偶联物对rhTNF刺激的HUVEC的准确结合。偶联Dex结合到活化的内皮细胞而不是静止的内皮细胞，这一点通过流式细胞术得到确认。偶联和未偶联的抗体同样选择性地结合到活化的HUVEC。结合后，Dex应该从ADCs中释放出来以产生所需的药理作用。使用HUVEC刺激rhTNF-alpha的共焦激光扫描（CLMS）用于确定Dex抗体偶联物的内化和结合。基于染色模式，内皮细胞对偶联和未偶联抗体的内化被识别出来。在最初的10-20分钟内在表面上可见染色，随后在一小时内细胞内强度增加，表明最初在表面上的结合和偶联物的后期内化。在孵育18-24小时后细胞内强度的下降表明偶联物的分解，并通过对免疫透射电子显微镜分析得到确认。通过将Dex浓度与荧光素酶报告基因的增加相关联来研究偶联物中Dex的释放。结果证实，与未偶联的Dex相比，Dex-Eab偶联物以较慢的速率向细胞释放药物。最后，通过西方印迹分析评估释放的Dex对促炎IL-8 mRNA水平的影响。IL-8表达水平的降低证实了从偶联物中释放的Dex是活性的，并显示了预期的药理活性。基于所获得的结果，作者得出结论，合成的偶联物有潜力将Dex特异性地传递到活化的内皮细胞中。然而，必须进行进一步的体内研究以确认这一点。 2.1.2.抗CD163地塞米松偶联物 糖皮质激素通过抑制巨噬细胞释放促炎和组织坏死因子来发挥抗炎作用。然而，这些药物的使用受到严重的副作用的限制，如肌肉质量减少、骨动员、免疫抑制和代谢改变，这是由于糖皮质激素的非特异性定位。许多炎症性疾病，如动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和炎症性肠病，其特征是活化的巨噬细胞上血红蛋白清道夫受体CD163的升高。Graversen等人展示了针对炎症的糖皮质激素靶向传递的ADC的生产和表征。通过将地塞米松（Dex）与小鼠抗大鼠CD163 mAb偶联，合成了ADC。使用脂多糖诱导的炎症在体外和体内测试了抗炎潜力。抗CD163 mAb-Dex偶联物是第一个用于炎症性疾病的非肿瘤学抗体-药物偶联物。 抗CD163和Dex-半琥珀酸-NHS酯之间的反应导致形成抗CD163-Dex偶联物。最终配方由每个抗体四个Dex分子组成，自由Dex不到百分之一。结构完整性、反应性和特异性是抗体在偶联后应保留的主要特征，以保持其潜力。凝胶电泳和尺寸排除色谱通过注意没有任何聚集来确认完整性。使用表达大鼠重组CD163的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞通过西方印迹和流式细胞术分析，确认了偶联后抗体的反应性和特异性。使用125I标记的抗CD163显示，只有转染的细胞可以摄取ADCs，与未转染的细胞相比，这是一个特异性的指示。在CHO中2小时后自由125I的增加表明药物从偶联物中释放出来。这通过在共焦显微镜下观察CHO细胞中抗体和地塞米松在两小时后的局部共定位进一步得到证实。通过测量大鼠巨噬细胞在孵育抗CD163地塞米松、自由Dex、IgG-Dex（对照偶联物）、抗CD163和缓冲液15分钟后的LPS介导的TNF-alpha形成，评估了抗炎效果。除了抗CD163和载体对照外，所有其他三种偶联物通过抑制LPS介导的大鼠巨噬细胞刺激减少了TNF-α的产生。发现抗CD163 Dex在最初的15分钟内比自由Dex更有效，而在1小时后没有观察到差异。这可以通过自由Dex的缓慢被动扩散与偶联物的内吞作用来解释。在LPS注射的大鼠中评估了开发的ADC的体内抗炎活性。在诱导炎症后，将抗CD163 Dex（ADC）和自由Dex注射到大鼠体内，并测量血清TNF-α水平以评估抗炎活性。与Dex相比，抗CD163-Dex显示出优越的疗效。未偶联的抗CD163与抗CD163-Dex在确切剂量下显示出相同的消除半衰期。与接受自由Dex的大鼠相比，接受ADC的大鼠的胸腺、脾脏和总体重没有显著减少，这证实了ADCs中偶联药物的位点特异性传递。 2.1.3.抗-DR5抗体-姜黄素偶联物 肝脏纤维化的特征是严重的肝损伤和细胞外基质蛋白的积累。受损肝组织的再生与炎症相关的细胞损伤有关。肝纤维化主要由活化的肝星状细胞（HSCs）引起，它们提高了死亡受体5（DR5）的表达。促炎介质激活HSCs，促使巨噬细胞向促纤维化表型转变。这触发活化的HSCs转分化，从而增加胶原蛋白沉积。姜黄素是一种天然的酚类抗氧化化合物，具有抗炎和抗纤维化的潜力，因为它能够使HSCs失活。You等人开发了含有姜黄素的抗-DR5抗体偶联物，用于治疗肝纤维化并增强HSCs的清除。姜黄素ADC是通过四步反应合成的，其中在前三步中对姜黄素进行了修改，以包含丙烯酸己酯。在最后一步中，姜黄素的丙烯酰亚胺基团与抗-DR5抗体的硫醇基团偶联。制备后，每种化合物都通过1H-NMR质谱进行了表征。通过Nano-drop分光光度计测量，ADC中姜黄素与抗体的比例为3:1。Coomassie蓝蛋白分析证实了合成偶联物的稳定性，因为在磷酸盐缓冲液中孵育48小时后偶联物的重量没有显著变化。在共聚焦显微镜下，Flamma® 675标记的裸抗体和抗体-姜黄素偶联物摄取的比较分析显示，偶联物和裸抗体的摄取没有显著差异，表明偶联没有改变抗体的结合特性。在存在自由抗-DR5抗体的情况下，与没有抗体的活化LX-2细胞相比，活化的LX-2细胞中偶联物摄取减少。此外，与HepG2和RAW264.7细胞相比，LX-2活化细胞中的偶联物摄取显著更高。这表明摄取是由于活化HSCs中DR5的过度表达。MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5二苯基四氮唑溴化物）测定结果表明，裸抗体及其姜黄素偶联物对活化的LX-2细胞有毒，但对HepG2和未活化的LX-2细胞没有毒性。这证实了抗体-姜黄素偶联物仅在活化的HSCs中诱导凋亡。通过测定活化LX-2细胞中的活性氧（ROS）水平和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达，分别确定了抗体-姜黄素偶联物的抗氧化和抗炎活性。ROS和iNOS由活化的HSCs产生。特别是转化生长因子β（TGF-β1），刺激LX-2细胞，增加其细胞内的ROS水平。与纯姜黄素相比，抗体-姜黄素偶联物显著降低了LX-2细胞中的ROS水平，这在共聚焦显微镜下观察到，表明其具有更高的抗氧化效果。iNOS水平的类似结果也证实了合成的抗体-姜黄素偶联物在活化的HSCs中的有效性，与新生的HSCs相比。通过免疫细胞化学分析和流式细胞术测量活化LX-2细胞中的α-SMA水平，评估了抗体-姜黄素偶联物的抗纤维化潜力。结果得出结论，与纯姜黄素和裸抗体相比，抗体-姜黄素偶联物显著增强了抗纤维化效果，证实了合成偶联物中抗体和姜黄素组合的协同活性。在小鼠中评估了来自抗体偶联物的姜黄素的生物分布和药理活性。在向正常和肝纤维化诱导的动物注射Flamma® 675标记的抗体-姜黄素偶联物后，发现偶联物在纤维化肝脏中的分布高于正常肝脏，证实了体外观察到的靶向性。 2.2.抗体介导的siRNA偶联物 基于小干扰RNA（siRNA）的治疗因其效力而受到研究者的极大兴趣。然而，由于非靶标暴露导致的不良反应等问题限制了它们的应用。非共价杂交或将siRNA直接与抗体或其片段（Fab，scFv）的寡核苷酸偶联产生了抗体-siRNA偶联物（ARCs）。抗体-siRNA偶联物（ARCs）在体外和体内均显示出特异性地进入组织、病毒感染的细胞或癌细胞。细胞表面受体结合携带Fab和siRNA的ARCs，然后通过内吞体被细胞摄取（图2），siRNA被释放并逃逸到细胞质中。siRNA被加载到RISC（RNA诱导的沉默复合体）后，特定的mRNA被降解。当核酸被用作有效载荷时，就利用了这个概念。 图2. 与小干扰RNA（siRNA）偶联的抗体的作用机制。 由于ADCs具有位点特异性递送的特性，研究人员被吸引将抗体与siRNA结合，以实现有效的治疗潜力。在他们最近的文章中，Cao W等人讨论了将siRNA与抗体偶联的不同方法。他们解释了不同的偶联机制和用于将siRNA与抗体偶联的各种连接物。作者还提到了一些ADCs及其在多种疾病中的应用。其中一些在下面进行了讨论。 2.2.1.重症肌无力（MG） 重症肌无力（MG）是一种罕见的自身免疫性疾病，由于自身抗体破坏神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体（AChR），导致肌肉无力。在所有MG患者中，约有90%的人血液中会有抗AChR自身抗体。治疗MG的最常见方法是使用类固醇免疫抑制疗法和血浆置换。这些治疗有许多副作用，如降低免疫系统功能、引起感染和提高血压。因此，迫切需要新的更好的MG治疗方法。自身免疫病MG依赖于T细胞，并由B细胞介导。研究发现，介导MG自身免疫表现的受体位于B细胞中。 成熟B细胞的存活由核因子κB（NF-kB）介导的细胞信号维持，该信号由B细胞激活因子（BAFF）受体引起，主要表达在成熟B细胞中。除了B细胞的维持外，通过沉默仅在活化的B细胞中存在的特定基因表达，可以中断MG的发病机制。双特异性的，即针对特定受体和基因沉默，可能是MG的极好的治疗选择。Ibtehaj等人尝试使用抗原-抗体复合物来解决MG的主要问题。他们在重症肌无力（EAMG）小鼠模型中研究了BAFF受体特异性mAb与短干扰RNA偶联的治疗效应。首先，他们使用二甲基甲酰胺在偶联缓冲液中将鱼精蛋白连接物与抗体结合进行偶联。然后，通过静电反应将带有连接物的抗体与双链siRNA（约19个核苷酸）(1:1)偶联。使用电泳来确认偶联物的产生效果和偶联物的稳定性。 在BAFF受体特异性偶联后，作者通过转染Cy-3标记的非特异性siRNA至大鼠骨髓瘤Y3细胞系中，测试了偶联物进入细胞的内化能力。根据研究结果，大约80%的Y3细胞和70%的B细胞呈现红色荧光。在大鼠骨髓瘤Y3 B细胞和C57BL/6 EAMG小鼠模型中评估了偶联物降低成熟B细胞中BAFF受体表达的效果。带有BAFF受体特异性偶联物或siRNA-、IgG-、或IgG–siRNA对照的Y3细胞孵育了48小时。流式细胞术数据显示，与其他对照组相比，偶联物降低了大约50%的BAFF受体表达。在体外确认后，他们进一步评估了偶联物的体内抑制效果。对于体内效果，偶联物以三种剂量经腹腔注射（i.p.）给EAMG小鼠一次。使用的剂量如下：高剂量，每个mAb和siRNA 350微克；低剂量A，每个mAb和siRNA 125微克；低剂量B，每个偶联物组分50微克。与未经处理或牛IgG对照的外周血单核细胞（PBMCs）相比，偶联物在较高剂量或低剂量A下减少了更多的成熟B细胞（CD268+CD19+）。为了更好地了解BAFF受体偶联物如何影响脾脏和淋巴结中B细胞表型和存活，作者检查了这些细胞中Fas（CD95）的表达量。这种蛋白仅在细胞死亡被触发后才在生发中心B细胞中表达。令人惊讶的是，他们发现在仅给予高剂量偶联物的EAMG小鼠的淋巴结中有很多表达Fas的CD19+和B220+细胞，而不是脾脏中。 经BAFF受体偶联物处理的小鼠握力通过数字方式（使用测力计）在三、四、七和九周时测量。值得注意的是，与其他治疗/对照组的小鼠相比，这些小鼠的肌肉更为强壮。研究结果表明，BAFF受体偶联物是增强EAMG小鼠肌肉力量的极好方法。此外，他们还检查了小鼠淋巴细胞和PBMC细胞中I型干扰素γ（IFN）和血清细胞因子水平的表达。他们注意到高剂量偶联物组显示出高水平的IFN。 研究表明，BAFF受体特异性mAb–siRNA偶联物可以通过Fas依赖性和非依赖性机制在MG中诱导凋亡信号。剂量和配方方法的进一步改进可能有助于实现更好的结果。 2.2.2.肌肉疾病中的抗体–siRNA偶联物 针对骨骼和心肌的抗体–siRNA偶联物是治疗肌肉疾病的新方法。Sugo等人证明了通过次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT）抗CD71 Fab偶联siRNA在肌肉器官中沉默效应的潜力。抗体和siRNA通过迈克尔反应通过马来酰亚胺连接物共价连接，HPLC和UV吸收光谱分析证实了偶联。进行了免疫吸附剂结合实验，以评估使用重组小鼠CD71蛋白的抗CD71 siHPRT的特异性和结合活性。研究表明，在纳摩尔浓度下，浓度依赖性结合CD71蛋白。与IgG–Fab偶联siHPRT相比，抗CD71 siHPRT与马来酰亚胺连接物连接在体外实验中显示出三倍的沉默效率，使用的是原代肝细胞。给予小鼠抗CD71 siHRPT（10 mg/kg）静脉剂量，观察到在24小时后给药显著沉默心脏和小腿肌肉中的HPRT。这种沉默随时间逐渐增加，注射后三天观察到最大活性。IgG siHPRT后缺乏沉默表明这种效应特定于CD71。 此外，为了研究给药途径对偶联物沉默能力的影响，通过皮下和腹腔途径给予抗CD71 siHPRT，并将沉默效率与静脉给药进行比较。根据结果，作者建议偶联物可以从任何给药部位到达目标。在这些实验成功之后，作者进一步探索了抗CD71–Fab偶联到肌肉抑素（抗CD71-siMSTN）在周围动脉疾病小鼠模型中的效率。结果还表明肌肉抑素mRNA的沉默。基于结果，作者得出结论，使用ADCs可能作为siRNA的传递平台，以获得更好的效果和活性。 2.3.抗生素-抗体偶联物 抗生素通常被视为现代医学的标志。几十年来，它们帮助防止了传染病的流行，并允许安全地进行侵入性手术。多重耐药的出现，加上新抗生素的发现和开发减少，导致了全球性危机，可能会产生灾难性的后果。ADCs在治疗癌症和自身免疫性疾病等具有挑战性的疾病方面的应用非常成功。一些研究人员尝试了类似的概念，并开发了抗生素-抗体偶联物（AACs），将抗体和抗生素的好处结合成一种混合结构，以解决与抗生素耐药性相关的限制。对所有β-内酰胺抗生素都具有耐药性的MRSA（甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌）在过去几十年中出现并迅速扩散，使S. aureus感染更具挑战性。Lehar等人证明，细胞内MRSA很难用标准抗生素（包括万古霉素、利奈唑胺和达普霉素）清除，这些抗生素用于对抗侵袭性MRSA感染。S. aureus可以侵入吞噬细胞，也可以侵入非吞噬细胞，这种细胞内S. aureus是许多疾病的罪魁祸首。清除细胞内MRSA对于提高临床成功率是必要的。 Lehar等人开发了一种在哺乳动物细胞中精确触发的抗生素-抗体偶联物（AAC），这些细胞被S. aureus保留。这种AAC由一种抗S. aureus抗体（THIOMAB）组成，该抗体通过一个可被组织蛋白酶裂解的连接物与一种最有效的抗生素共价连接，该连接物具有新的季铵盐。制备的AAC在与S. aureus浮游菌结合时没有任何抗菌效果，并且由于更大的抗体大小，不会进入哺乳动物细胞。然而，在宿主细胞消耗AAC-包被的细菌后，可裂解的连接物分离并释放抗生素。根据抗体的选择性，尽可能多的AAC将附着在细菌上，以在所需的作用部位提供足够的抗生素浓度。作者报告说，在筛选了来自S. aureus感染康复患者B细胞的约40种S. aureus抗体后，与壁-四肽聚糖（WTAs）的结合更高。由S. aureus产生的WTA由磷酸核糖醇的重复单元组成，可以通过糖转化由TarM或TarS糖基转移酶介导转化为α或β-O-连接的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）。利福霉素衍生物被用作抗生素，通过叔胺与抗体偶联。使用相同的抗体（抗β-WTA单克隆抗体）偶联染料的荧光共振能量转移（FRET）基础探针用于识别连接物的裂解。进一步的质谱分析也证实了与通过替换P1位置的氨基酸获得的不可裂解连接物相比，连接物与可裂解连接物的分离。 AAC有效地包被了MRSA，而用非可裂解β-WTA抗体-抗生素偶联物或单独mAb包被的相同细菌存活了下来。此外，与未偶联的利福平相比，AAC阻止细胞内靶向后细菌细胞间转移的效果提高了10倍。结果表明，与未偶联的抗生素相比，AAC显著降低了细菌的活性。 用细胞内MRSA感染的小鼠评估了AAC体内的效果。感染的小鼠被给予磷酸盐缓冲液、单独的万古霉素或一剂AAC。对万古霉素治疗有耐药性的细菌可以成功地用单一剂量的AAC根除，表明AAC可以消除从万古霉素逃逸的细菌。作者还发现，与未偶联的抗生素相比，AAC治疗更有效，抗生素从AAC中的释放对效果至关重要。这一结果表明了抗体-药物偶联物在肿瘤学之外使用的可能性。 Peck等人在I期单剂量递增研究中评估了AAC的安全性、耐受性、药代动力学和免疫原性。研究中使用的AAC（DSTA4637S）由一种新型抗生素4-二甲氨基哌啶基-羟基苯并噁嗪利福平（dmDNA31）和一个人免疫球蛋白G1（IgG1）抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体通过蛋白酶可裂解的缬氨酸-瓜氨酸（VC）连接物链接而成。平均药物-抗体比（DAR）为2。所选单克隆抗体对细菌壁有选择性结合，且在人体组织中没有靶向抗原，使AAC使用安全。在筛选了104名健康志愿者后，共招募了30名受试者。受试者的平均年龄为41.9岁，男女比例为（63.3%：33.3%）。受试者分别接受四个剂量（5、15、50、100和150 mg/kg，每组n=4）的AAC治疗和安慰剂（n=10）。除了治疗中出现的不良事件（TEAEs），研究期间没有发生死亡、不良事件或严重副作用。安慰剂组和AAC治疗组均出现了TEAEs，在AAC组中高百分位数（85%）。在AAC治疗组中，还有较高剂量组如100 mg/kg（16次TEAEs）和150 mg/kg（8次TEAEs）。所有TEAEs均可逆且可耐受。没有因TEAEs而报告的退出。AACs、纯抗体和未偶联抗生素之间的药代动力学特性比较显示，AACs具有更高的Cmax、更低的蛋白结合率和更好的药代动力学特性。作者得出结论，AAC有望成为针对金黄色葡萄球菌感染的新型递送系统，具有更好的耐受性、安全性和药代动力学特性。 Kajihara等人证明了抗体-抗生素偶联物能够递送具有不良药代动力学或毒性特性的抗生素。治疗传染病的一个困难是细菌的多重耐药性（MDR），这增加了死亡率。铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性菌，可导致一些肺部和血液相关的感染。对这些细菌的耐药性增加导致死亡率上升，并构成了一个严重的问题。最近，世界卫生组织将MDR铜绿假单胞菌感染指定为“严重威胁”病原体。作者在初步分析后选择mAb 26F8作为对铜绿假单胞菌具有更高特异性和结合力的单克隆抗体。后来，通过将抗生素（G2637）与修饰有六个未配对半胱氨酸的单克隆抗体偶联，生成了AAC。在溶酶体组织蛋白酶存在下，连接物环丁烷-1,1-二羧酰胺瓜氨酸分解以释放附着的抗生素。LC-MS/MS分析显示生成的AAC的DAR为6。在存在和不存在组织蛋白酶B的情况下，将AAC与铜绿假单胞菌孵育后，分析连接物的裂解和抗生素的释放。存在组织蛋白酶B的样本比缺乏组织蛋白酶B的样本抑制水平更高，表明抗生素释放是AAC发挥作用的先决条件。这一点通过将与铜绿假单胞菌PA14 WT孵育的AAC添加到RAW264.7巨噬细胞中后，量化游离抗生素进一步得到证实。在这里，含有可裂解连接物的AAC在巨噬细胞中显示出比含有不可裂解连接物的AAC更高的细胞内抗生素浓度。使用AAC表明，所需的抗生素浓度将比游离抗生素少两倍，表明AAC的效率。作者得出结论，使用AAC可以允许更大的细胞内抗生素浓度，从而与使用游离药物相比，具有更大的抗生素效力。 2.4.肾小球肾炎 当前治疗必须提高特异性并减少系统毒性，以减缓肾脏疾病的进展。Kvirkvelia等人假设一种针对3(IV)胶原的肾小球定位非胶原1域（NC1）的人单克隆抗体（F1.1）可能扮演精确药物递送载体的角色。由于在肾小球疾病期间其暴露增加，而在其他器官中表达较低，3(IV)NC1是递送疾病修饰药物的完美靶标。通过EDC（1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]羰二亚胺盐酸盐）零长度交联剂在Dex或PGE2的羧基和mAb的胺基之间形成的酰胺键，将纯化的人单克隆抗体与PGE2或Dex连接。由于它们在肾毒性肾炎中的活性和各自的抗炎特性，选择了PGE2和Dex。使用PGE2 ELISA试剂盒，他们确定了与抗体结合的PGE2量。通过流式细胞术测量它们与足细胞结合的能力来评估偶联物的功能。低结合的观察结果证实了偶联物在其他细胞系（如小鼠系膜细胞和肝细胞AML-12细胞）中的抗原特异性。它抑制了重组3(IV)引起的足细胞结合。为了确定制备的ADCs在肾炎诱导动物中的特异性和有效性，进行了动物研究。通过腹腔途径注射13.5微升/克体重来诱导肾炎。在第2天之后，将PEG2–F1.1、Dex–F1.1和人IgG–Dex以10 µg/g的等效剂量给予患病动物。通过定期测量尿液中的蛋白质和血尿素氮来确定疗效。经过7天治疗后，切除肾脏并通过光学显微镜或直接免疫荧光检查。在接受偶联物的小鼠的肾小球内发现了强烈和精确的荧光染色，使偶联物能够在患病小鼠的肾小球内被轻松识别。确认F1.1偶联物主要定位在肾脏，因为人IgG反应带仅在肾脏裂解物中观察到，而不是在心脏和肺部等其他器官的裂解物中。与未接受偶联物的NTN小鼠相比，治疗后疾病进展显著减少，血尿素水平（BUN）和组织学正常化。这些结果表明，将PGE2（逆转现有肾炎）和类固醇（Dex）（减少局部和全身炎症）结合起来，可能在与人类3(IV) mAb结合时以相当低的剂量改善现有肾炎的恢复。抗肾小球基底膜抗体针对相关表位，因为其表达限于肾脏、其他几个器官和肾小球以外的区域。 2.5. 类风湿性关节炎（RA） 滑膜炎症和骨退化是类风湿性关节炎的特征，这是一种严重的慢性炎症性疾病。关节液和血液中过量的促炎细胞因子带来RA中的自身免疫和组织损伤。类风湿性关节炎的病理生理学非常复杂，其具体机制尚未完全了解。然而，IL-6信号是炎症和RA症状的主要原因。巨噬细胞、破骨细胞、B细胞和T细胞等细胞具有IL-6并对IL-6信号作出反应，有助于RA中的免疫反应。在RA治疗中使用的细胞毒性药物的有效性受到非特异性靶向相关副作用的限制。因此，需要一种配方策略在目标部位具体发挥作用。在众所周知的靶向药物递送策略中，ADCs因其能够将偶联药物输送到特定细胞且几乎没有不良药物反应而最近受到广泛关注。 Lee等人研究了tocilizumab-阿仑膦酸盐(TCZ-ALD)偶联物在体外和体内模型中对RA的疗效。TCZ是一种人源化单克隆抗体，而小分子阿仑膦酸盐(ALD)分别通过阻断IL-6受体和巨噬细胞显示出抗炎活性。ALD通过可裂解的二硫键连接到TCZ的Fc部分，在不影响其抗原潜力的情况下，通过化学连接物连接。通过Purpald分析和质谱法确认了偶联。使用单独的TCZ和偶联物中的TCZ进行的ELISA分析显示，TCZ的结合能力没有显著差异，证实了TCZ偶联后抗原结合位点没有变化。在巨噬细胞RAW 264.7细胞上的活性分析显示，与生理盐水、IgG-ALD和TCZ组相比，接受ALD处理的细胞活性降低。TCZ+ALD混合物和TCZ-ALD偶联处理组的细胞活性没有显著差异，证实了ALD偶联后活性没有改变。 体外研究后，使用胶原蛋白诱导的关节炎DBA/1j小鼠在体内评估了偶联物的活性。在用佐剂免疫4周后，将ALD(0.2 µg/kg)、单独的TCZ(0.8 mg/kg)和ALD-TCZ偶联物分别注入关节炎诱导的踝关节。然后，使用微型CT、组织学和西方印迹分析观察动物8周的RA严重程度和骨退化。微型CT显示，除了接受TCZ-ALD偶联物治疗的组外，所有动物组都有显著的骨退化，尽管它是在低剂量下给予的。这可能是由于TCZ和ALD对破骨细胞骨吸收的协同效应以及由于与TCZ偶联而使ALD在细胞内传递。 组织学检查表明，接受ALD单独治疗的动物存在炎症和软骨破坏。这在接受TCZ治疗的动物中显著减少，而接受TCZ-ALD偶联物治疗的动物显示出清洁的软骨-骨接触，没有炎症细胞浸润，几乎与标准对照组一样。通过与其他组相比，IL-6和CD68水平的显著降低进一步证实了TCZ-ALD偶联物的有效性。作者得出结论，将ALD与特异性结合IL-6受体的TCZ偶联，延长了ALD在关节中的停留时间，并显示出增强的疗效。这种偶联物的成功可能为开发更多自身免疫性疾病治疗中的偶联物铺平了道路。 2.6.免疫抑制 Dasatinib临床上用于治疗BCR-ABL依赖的慢性髓性白血病。由于抑制Src家族激酶如Lck和Fyn，它也可能具有潜在的免疫抑制活性。然而，由于缺乏选择性，dasatinib具有严重的副作用，限制了其作为免疫抑制剂的临床应用。Wang等人开发了一种抗体-药物偶联物，用于将dasatinib特异性递送到T淋巴细胞以实现有效的免疫抑制。作者首先合成了一种特异性针对T细胞的抗体，然后在下一步将抗体与dasatinib偶联。最后，在体外评估了抗体-dasatinib偶联物的免疫抑制活性。在几种能够结合T细胞的抗体上进行了初步筛选，基于其高表达、更好的内化和更少的副作用，选择了CD184(CXCR4)。将CXCR4拮抗剂与牛抗体(BLV1H12)骨架结合，并进一步嫁接到曲妥珠单抗的CDR3H中，以产生更少的免疫原性人源化抗体(HLCX)。使用HEK 293F细胞表达HLCX。进一步使用蛋白G色谱纯化抗体，并通过电喷雾电离质谱法确认其质量。 流式细胞术分析中的峰移证实了HLCX与CXCR4的结合。将抗体与高表达CXCR4的细胞系(JurkatT细胞)和缺乏CXCR4的细胞系(MDA-MB435细胞)孵育。与Jurkat细胞孵育的样品清楚地显示了峰移(96.2%)，由于结合，而与MDA-MB435细胞孵育的样品由于缺乏结合，没有显示出任何显著的峰移。通过分析与不同CXCR4表达水平的不同细胞系孵育的样品，进一步证实了这一点。通过共聚焦显微镜确认了HLCX进入T细胞的内化能力。将Alexa Fluor 488(AF488)染料与HLCX偶联，以及未偶联的抗体，并与人类T淋巴细胞孵育。在37°C混合后30分钟内，在T细胞的细胞质中观察到绿色斑点，表明HLCX-AF488内化。这在4°C和未偶联的HLCX中没有观察到，证实了HLCX的位点特异性递送。在修饰dasatinib和抗体后，通过两步偶联过程合成了两种ADCs，即不可裂解的(HLCX-dasatinib)和可裂解的连接物(HLCX-SS-dasatinib)，因为它们都没有直接相互作用的基团。合成的ADCs纯度超过90%，药物-抗体比为3，通过SDS相分析得到证实。分子量在预期范围内，表明合成ADCs的结构完整性。 两种ADCs与活化的T细胞孵育，以产生更多的CD25和促炎细胞因子，包括IL-2、TNF-alpha和干扰素(IFN gamma)。两种ADCs和未偶联的HLCX与用抗CD3或抗CD28抗体激活的人类T细胞孵育，并通过流式细胞术和ELISA分析促炎细胞因子水平。流式细胞术和ELISA分析显示，两种ADCs在低浓度(8 nM)下阻断了CD69和CD25的表达，并阻止了细胞因子的释放。相比之下，未偶联的HLCX抗体观察到的最小效果。HLCX-SS-dasatinib在抑制细胞因子方面比HLCX-dasatinib有效两倍。这可能是由于药物释放、内化或停留时间的差异。两种dasatinib和ADCs在高达200 nM的剂量下，与未处理的细胞相比，通过CellTiter Glo测量，没有显著降低活化T细胞的活性。这排除了细胞毒性的可能性。使用西方印迹法检查TCR诱导的T细胞激活期间下游激酶的磷酸化。研究表明，与未偶联的抗体和曲妥珠单抗-SS-dasatinib相比，两种ADCs和dasatinib阻断了Lck信号。这清楚地表明，T细胞抑制取决于抗体和药物分子。基于结果，建议ADCs可能是提高激酶抑制剂在肿瘤学应用之外的活性的有价值的策略。 2.7.动脉粥样硬化 动脉粥样硬化是一种由胆固醇在动脉中沉积引起的疾病，约占美国死亡人数的35%。该过程涉及氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的发展，随后发生炎症反应和巨噬细胞的积累。巨噬细胞通过逆向胆固醇运输(RCT)将胆固醇转移到肝脏进行胆汁分泌，发挥其对动脉粥样硬化的保护作用。RCT由肝脏X受体(LXR-α和LXR-β)等触发。LXR激活通过抑制促炎细胞因子阻断巨噬细胞增殖和泡沫细胞形成。已经开发并测试了LXR激动剂(GW3965和T0901317)对动脉粥样硬化的活性。然而，这些衍生物也因LXR-α的过度表达而在肝脏中显示增加的甘油三酯。将LXR激动剂位点特异性递送到巨噬细胞可能减少这种风险并提高LXR激动剂的临床适用性。Lim等人描述了基于ADC的LXR激动剂递送到巨噬细胞。作者合成了一种类似于上述LXR激动剂的新化合物，该化合物在与带有氨基乙基磺胺替代的抗体偶联后可以保留其抗原特性。在筛选了带有二硫键、酸敏感的腙和蛋白酶可裂解的连接物的各种连接物后，发现蛋白酶可裂解的连接物是合适的。使用化学方法，他们合成了一种稳定的氨基氧-CatB-LXR激动剂，并使用液相色谱和质谱(LC-MS)确认了其在纯化的CatB酶存在下的可裂解潜力。作者选择CD11a作为在白细胞、单核细胞和巨噬细胞上表达但不在肝脏上表达的特定抗原。克隆人源化抗体Efalizumab并转染中国仓鼠卵巢(CHO)悬浮细胞后，获得了所需的抗体用于偶联，即抗-CD11a IgGX。这通过SDS-PAGE分析和电喷雾电离质谱法分别进行了纯化和质量分析。在进一步的实验中，还表达了两种抗体，即作为阴性对照的抗-Her2 IgGX和抗-Her2 FabX。 最后，连接到LXR激动剂的连接物通过共价键与抗CD11a IgGX偶联。在与人类THP-1单核细胞/巨噬细胞和人类HepG2肝细胞孵育后，将偶联物的结合与阴性对照进行了比较。进一步使用Fc阻断剂也用于确认结合是CD11a介导的。流式细胞术分析表明，抗CD11a IgGX-AF488与单核细胞和巨噬细胞结合，表现为流式细胞术分析中明显的峰移。它不与肝细胞结合，表现为峰移的缺失。同样，抗CD11a IgGX-AF488对单核细胞的结合在Fc阻断剂存在下存在，表明结合是CD11a介导的，而不是Fc控制的。阴性对照抗体偶联物在Fc阻断剂不存在时显示结合，阻断剂的存在并不确认它们与细胞的结合，因为它们是Fc依赖的。通过共聚焦显微镜观察，在孵育后，偶联物的内化通过在THP-1细胞的细胞质中识别偶联物(Alexa Fluor 488)-连接的染料来确定。 使用LXR转录激活分析来检查合成ADC的LXR激动活性，并与阳性对照和T0901317(LXR激动剂)和氨基氧-CatB-LXR激动剂进行比较。所有三种化合物都在10%人类AB血清的存在和不存在下与THP-1细胞和HEpG2细胞孵育，以阻断Fcγ受体。然后，用ONE-Glo处理细胞，并在Envision平板阅读器上记录发光。合成的偶联物(抗CD11a IgGX-AF488)在THP-1细胞中显示出强烈的激动作用，在HEPG2细胞中没有任何活性。阳性对照在两种细胞系中显示出等效的活性，氨基氧-CatB-LXR激动剂没有显示出激动活性。这表明抗CD11a IgGX-AF488对巨噬细胞具有特异性结合能力，效力高出三倍。 2.8.系统性硬化病 系统性硬化病(SSc)是一种自身免疫性疾病，其特征是免疫系统失调，导致皮肤和内脏纤维化。目前还没有治疗这种疾病的方法，但在早期阶段治疗患者以逆转炎症可能提供缓解。最近的研究揭示了炎症标志物的显著增加，如CD28-CD80/86、CD19、CCL24、CD20、CD30、肿瘤坏死因子、转化生长因子β、B细胞激活因子、溶血磷脂酸受体1、可溶性鸟苷酸环化酶、Janus激酶和白细胞介素6在SSc患者血清中。增强的CD30可以使用Brentuximab(αCD30抗体)进行靶向。基于这一概念，启动了三项临床试验(clinicaltrials.gov于2023年6月19日访问，identifierNCT03222492、NCT03198689、NCT05149768)。NCT05149768试验是一项brentuximab vedotin剂量递增安全性研究，该药物-抗体偶联物已获准用于淋巴瘤治疗，靶向表达在活化免疫细胞中的CD30分子。有证据表明CD30在SSc中发挥作用。这项研究是评估brentuximab vedotin在SSc患者中的安全性和耐受性的第一步。NCT03198689旨在评估Brentuximab vedotin(Adcetris)的可行性、安全性和初步疗效。NCT05149768试验旨在作为当前治疗的48周延长，使治疗适用于那些在Brentuximab vedotin(24周治疗)中显著改善但在治疗终止后复发的SSc患者。这三项试验都处于II期，目前正在进行中。根据临床试验数据，预计前两项研究将在2023年完成，第三项将在2024年完成。clinicaltrials.gov上提出了一项临床试验(于2023年6月19日访问，identifier NCT01616680)，用于在类固醇抵抗性急性移植物抗宿主病中使用Adcetris，但在招募受试者之前被撤回。 3.抗体-药物偶联物的临床药理学考虑 2022年2月20日，美国食品药品监督管理局(FDA)发布了一份关于开发抗体-药物偶联物(ADC)的临床药理学考虑的指南草案。该指南规定了建议，以帮助行业和其他参与ADC开发的相关方，这些ADC具有各种有效载荷。这些建议报告了FDA对临床药理学挑战以及ADC开发计划的建议，包括生物分析方法、剂量和暴露-反应、内在因素、药物基因组学和QTc评估。这些研究必须与临床研究同时或单独计划，以确保安全性和有效性。美国FDA的相关指南文件可以作为执行研究的参考。正如指南所述，需要进行生物分析定量和剂量暴露研究，以检查ADC及其成分以及任何活性代谢物的安全性和有效性。必须使用器官损伤和药物基因组学程序研究内在变量对ADC药代动力学的影响。同样，应进行心电图(ECG)监测以进行QTc评估，检查免疫原性以检查安全性，研究药物-药物相互作用，以更好地了解ADC在接受多种药物治疗的患者中的效果。 4.结论和展望 当前的综述总结了各种研究，这些研究探讨了将ADCs的效用扩展到非肿瘤疾病状况的前景，如炎症、传染病、系统性硬化病、动脉粥样硬化和免疫抑制。尽管ADCs由于其位点特异性递送和减少脱靶效应而在肿瘤治疗中受到广泛关注，但在非肿瘤状况中ADCs的使用仅限于需要位点特异性递送来减少副作用的特定有效载荷。在这种情况下，ADCs对这些有效载荷的益处应与治疗的益处、治疗成本和这些有效载荷的替代选择相权衡。研究还需要关注监管方面，并考虑为满足监管要求而需要进行的各种研究。另一个需要关注的问题是使用针对过度表达抗原的特异性抗体。许多研究调查了在非肿瘤疾病中产生抗体的问题。未来的研究应考虑为成功开发ADCs治疗非肿瘤疾病而提出的关注点。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。