SARS-CoV-2 S protein x TLR2

摘要:近年来，RNA疫苗在预防各种传染性疾病和肿瘤免疫治疗方面的研究受到越来越多的关注。在临床前和临床研究中观察到的强烈免疫反应，以及其快速和低成本的生产方法使mRNA疫苗技术有望替代传统疫苗技术。然而，要有效递送mRNA疫苗，就需要防止mRNA在细胞外降解。作为将mRNA递送至靶细胞的非病毒载体，脂质纳米颗粒(LNPs) 由于相对容易和可规模化的生产过程已被广泛研究。本综述重点介绍了LNPs开发的主要进展，并综述了基于LNPs的mRNA疫苗在预防传染性疾病和防治肿瘤方面的应用。1.引言接种疫苗被认为是控制传染性疾病的一种有效方法。众所周知，基于减毒活病原体的传统疫苗可激活体液免疫和细胞免疫。然而，这类疫苗存在安全问题，因为减毒病原体有可能恢复成为可引起感染的致病形式。另一方面，亚单位疫苗被认为是减毒活疫苗的安全替代品，但其诱导清除细胞内病原体所需的细胞免疫的效率较低。基于病毒载体和核酸(如质粒DNA和mRNA)的新疫苗技术都能通过疫苗抗原的原位表达，诱导体液和细胞毒性T细胞免疫反应。这种特性使新疫苗在达到保护效果的同时，也可能有助于消除细胞内感染。虽然质粒DNA疫苗在人类临床试验中已被证明是安全有效的，但将质粒DNA递送到细胞核内的方法仍然不够理想。因此，人们开始了对mRNA疫苗的研究，因为可以在不需要跨越任何细胞核的膜屏障情况系，递送这种疫苗并进行抗原表达。如果mRNA通过了细胞核膜，它既不会与宿主细胞基因组进行整合，也不会对其进行编辑。此外，mRNA的如结构、结合和翻译特性等理化性质，不受多种具有各种理化性质的蛋白质编码的影响。与其他类型疫苗相比，mRNA疫苗在获得传染性病原体的基因序列信息之后，就可以简易、快速、低成本的进行生产。一般来说，mRNA疫苗可分为两种类型:非复制或传统型和自扩增型。非复制型结构简单，只有一个小RNA分子。然而，其在体内的稳定性和活性受到细胞内抗原表达有限的持续时间的限制，但可以通过优化递送配方来提高这种mRNA疫苗典型的低抗原表达。对传统mRNA的核苷碱基进行化学修饰和序列优化，可以提高其蛋白质表达和免疫原性。将序列优化mRNA与核苷修饰mRNA的效力进行比较，目前没有明确结论，这是由于序列优化算法、修饰核苷类型、给药途径和其它试验条件等各种参数的差异造成的。然而，据报道，对恒河猴和小鼠接种脂质纳米颗粒(LNPs)递送的序列优化或核苷修饰的mRNA后，除了都会增加接种部位和引流淋巴结的中性粒细胞和树突细胞浸润外，也都能引起强烈的固有免疫反应。Magini等使用流感病毒的核蛋白和M1蛋白、Brito等使用人巨细胞病毒(HCMV)的Hg/gL蛋白复合物，评估了自扩增mRNA编码多种抗原的能力。对动物接种自扩增mRNA后，观察到了对病毒感染的保护作用以及强烈的T细胞免疫反应。自扩增mRNA产生的高水平抗原表达是由于其具有在细胞内自我扩增的能力。非复制mRNA疫苗和自扩增mRNA疫苗均可用于预防传染性疾病。mRNA在生理条件下的稳定性是其在细胞内有效递送的一个重大挑战。在设计这类疫苗时，应考虑到mRNA对普遍存在的核糖核酸酶水解作用的高敏感性。人们采用了各种各样的策略进行mRNA递送。例如，RNA偶联物的形成可能会防止核酸降解，但同时，它也可能会增强其与血清蛋白的结合，从而导致此结合物的聚集和血管阻塞。另一方面，利用病毒载体递送核酸除了会遇到当需要快速和大规模生产时的生产难题外，还存在一些安全隐患。比如，可能会在免疫抑制患者体内过度病毒复制以及产生病毒抗原对疫苗抗原的免疫显性。因此，非病毒载体是mRNA递送的首选载体，特别是可以用于设计这些载体的材料以及可用于生产这些载体的各种配方技术种类繁多。与病毒载体相比，非病毒载体的免疫原性较差，转染效率更低。此外，这些载体更容易生产，能够携带的遗传物质有效载荷更大。如多肽、聚合物、纳米颗粒和脂质等不同的材料均可用于非病毒载体的递送。mRNA与非病毒载体的有效结合可能可以防止核酸在细胞外降解，并有助于确保其在靶细胞膜上的定位。核酸的递送需要细胞摄取递送系统，然后核酸通过内涵体逃逸进入靶细胞的细胞质中。为了实现这个过程，合适的递送系统是至关重要的，它需要克服如图1所示的多种屏障。脂质纳米颗粒是体内递送核酸疫苗方面被研究最广泛的非病毒载体之一。随着美国食品药品管理局(FDA)于2018年批准Onpattro®(patisiran) 用于由蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病变的治疗，使LNPs在小干扰RNA (siRNA)系统递送中的应用得到了支持。LNPs也越来越多地应用于基因治疗、蛋白质替代治疗领域以及针对肿瘤和传染性疾病的mRNA疫苗的开发。图1 体外转录(IVT) mRNA递送的细胞内屏障:(1)递送系统与细胞膜的相互作用，(2)内吞作用，(3)内涵体逃逸和mRNA的释放以启动翻译过程。在一项研究中，采用裸mRNA(溶解于林格乳酸中)和商业化脂质转染试剂制备的mRNA纳米颗粒进行体外和体内给药，对基因载体介导的mRNA转染效率进行了评估和比较。这项研究表明，mRNA脂质可以有效地转染人类和小鼠树突状细胞(DCs)。作者还证明，mRNA脂质的体内转染效率与给药途径有关。表1总结了以LNPs或其他脂质制剂制备的针对传染性疾病和肿瘤mRNA疫苗的临床前疗效的一些研究。LNPs（特别是当用于RNA疫苗设计时）除了需要特殊生产流程外，还需要特定类型和比例的脂质成分。本研究综述了用于设计递送mRNA疫苗的LNPs成分，概述了生产LNPs的不同方法以及有助于提高这类疫苗效力和摄入的因素。此外，将重点介绍已经开展的临床前和临床试验，以研究基于LNPs开发的mRNA疫苗在传染性疾病和肿瘤方面的潜在应用。2.用于核酸递送的各种脂质配方概述不同的脂质已被广泛用于构建不同的脂质配方，用于核酸递送。传统的脂质体、脂质复合物、阳离子纳米乳 (CNEs)和纳米结构脂质载体(NLCs)都已被开发为核酸载体系统。此外，与传统的脂质配方相比，已经出现了使核酸递送更加有效(图2)的更高级LNPs递送系统。这些高级LNPs可能没有包围水核的脂质双分子层，相反，它们可能呈现出一种胶束状结构，将药物分子封装在非水结构的核心内。此外，LNPs不会与其包裹的核酸成分产生静电络合作用。2.1 脂质体脂质体是由单层或多层磷脂双分子层组成的球形囊泡，封闭在其中的水核可将所选药物包裹在其中。脂质体也是由具有极性头部(亲水)基团和非极性尾部(疏水)基团的材料制备而成(图2)，这些基团在相互诱导作用下形成囊泡。脂质体由于其可生物降解性、有效性、最小毒性和易用于制剂而被广泛用作药物载体。在mRNA疫苗递送领域，脂质体在传染性疾病以及肿瘤免疫治疗方面有很好应用前景。例如，一项研究表明，与注射DNA-脂质复合物相比，瘤内注射mRNA-脂质复合物在实现原位肿瘤转染效率方面同样是高效的。随后，Zhou等开发了编码人黑色素瘤抗原糖蛋白100 (gp100)的mRNA疫苗中性脂质体。与对照组相比，在小鼠脾脏内直接注射该脂质体可抑制肿瘤生长，显著延长小鼠的生存时间。图2.主要mRNA脂质纳米载体:(A)脂质体、脂质复合物和脂质纳米颗粒;(B)纳米结构脂质载体;(C)阳离子纳米乳液。用于制备核酸递送脂质体的阳离子脂质具有两亲性，由带正电(阳离子)的氨基头部基团通过甘油与碳氢链或胆固醇衍生物连接。这些脂质一个重要特性是其带正电荷的头部基团能够与带负电荷的核酸产生静电作用，从而将核酸封装在脂质纳米颗粒的核心中。早期报道显示，利用阳离子脂质如N-[1-(2,3-二二氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)制备脂质体将mRNA转染小鼠细胞，可以形成一种高效的核酸转染系统。用于生产mRNA疫苗的阳离子脂质既可以封装mRNA，也可以作为一种免疫原性剂。例如，在小鼠皮下注射编码人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 Gag抗原的mRNA-阳离子脂质（1,2-二油乙基-3-三甲基丙烷（DOTAP）和1,2-二油乙基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)）复合物后，观察到了强烈的免疫反应。这种强烈的免疫反应造成了对Gag肽脉冲细胞的特异性杀伤，并产生了体液免疫反应。另一方面，采用mRNA-脂质体（基于Genzyme脂质67(GL67)）复合物对小鼠肺内给药后，没有在小鼠的肺部产生显著的荧光素酶表达。相比而言，采用pDNA-GL67脂质体给药却能在小鼠肺部产生可检测到的荧光素酶表达。产生上述差异的原因是mRNA-GL67脂质体在生物体液中的稳定性有限。此外，一系列阳离子脂质体，特别是基于DOTAP的脂质体，都可以作为疫苗佐剂。这些类型的阳离子脂质体作为免疫调节剂，以抗原(或病原体)非依赖性的方式刺激固有免疫反应。阳离子脂质体的免疫刺激作用与胺基头部基团的性质、脂质的流动性或酰基链的饱和程度有关。有人提出，含有季胺头部基团的脂质比含有叔胺头部基团的质具有更强的免疫刺激作用；而且，具有不饱和酰基链或短饱和链的脂质比具有长饱和酰基链的脂质更能刺激促炎介质和细胞因子的释放。因此，必须对作为核酸递送系统的阳离子脂质体的潜在免疫毒性进行仔细评估。2.2. 脂质复合物脂质复合物是基于脂质体的制剂，由阳离子脂质体与RNA的静电相互作用形成，由于脂质体结构转化为紧凑的RNA-脂质复合物，从而形成该脂质复合物独特的分子内部排列(图2)。这些制剂的其核酸封装效率低和耐受性差，已被排除在临床研究之外。此外，由于脂质体带有正电荷、易聚集、不能完全包裹核酸，导致脂质体静脉给药后可能会被迅速地从血液循环中清除和产生增强免疫反应。2.3. 阳离子纳米乳阳离子脂质也可用于制备阳离子纳米乳（CNEs）(图2)。Brito等人开发了一种阳离子水包油纳米乳，其中油相包括DOTAP(作为阳离子脂质)和角鲨烯(作为一种安全有效的佐剂)。将油相加入水相中，用亲水(吐温80)和疏水(三油酸山梨醇)表面活性剂稳定，形成纳米液滴。CNEs用于结合编码呼吸道合胞病毒(RSV)、艾滋病病毒(HIV)和人巨细胞病毒抗原的自扩增mRNA疫苗。对小鼠进行两次肌肉注射相对低剂量的CNEs制备的自扩增RNA疫苗后，可以观察到强烈的免疫反应。此外，对动物进行肌肉注射表达人巨细胞病毒包膜糖蛋白B的自扩增RNA疫苗后，在兔体内产生了大量的HIV中和抗体，而在恒河猴体内观察到了诱导T细胞反应。2.4. 纳米结构脂质载体纳米结构脂质载体(NLCs)是可用于递送mRNA疫苗的脂质之一(图2)。NLCs被认为是固体脂质纳米颗粒和水包油乳剂的混合制剂。NLCs的核心是固体和液体脂质的混合物。这种半结晶基质使该制剂具有更好的胶体稳定性，这种稳定性取决于其中固体脂质含量。与其他固体脂质纳米颗粒相比，NLCs易于制备和灭菌，毒性较低。在一项研究中，研究人员开发了一种An NLC制剂，并与编码寨卡病毒抗原的自扩增mRNA结合，在小鼠试验中，低至10 ng的单次剂量肌肉注射可以获得100%的寨卡病毒保护率。3.LNPs的组成用于RNA疫苗的LNPs应按照特定的生产程序，由特定脂质成分按精确的比例制备。如图3所示，LNPs通常由阳离子/可电离脂质和辅助型脂质(如磷脂、胆固醇和/或聚乙二醇化脂质)组成。图3. mRNA脂质纳米颗粒示意图3.1 可电离阳离子脂质由于带正电的脂质和带负电的核酸之间存在静电相互作用，使用阳离子脂质可以提高开发传统脂质制剂时核酸的包封效率。然而，这些高电荷脂质制剂通过静脉注射可能会刺激免疫系统，同时也可能会导致其在血液中被快速清除，阳离子脂质耐受性差，使新兴的可电离阳离子脂质得到了应用。可电离阳离子脂质是开发更多增强型LNPs的关键成分。Semple等人首次将可电离阳离子脂质引入核酸递送领域。这些脂质的特点是可以根据环境pH值改变电荷，也就是他们在酸性pH值下带正电荷，而在生理pH值下则变为中性。携带的正电荷可以使脂质封装一个RNA分子并且在融合过程与内涵体膜相互作用，然后将核酸释放到细胞质中。另一方面，这些脂质在生理pH值下呈中性避免了脂质在血液中被快速清除，因而其耐受性和药代动力学特性得到了改善。因此，在进行静脉给药后，脂质制剂除了在病变组织(如肝脏和实体瘤)中聚集增加外，其在血液循环中的半衰期也延长了(约30分钟或更长)。与更容易产生细胞毒性的阳离子脂质相比，可电离脂质具有更好的耐受性。此外，含有阳离子脂质的颗粒更容易聚集和沉积在较细的毛细管床中，导致不良后果。对可电离脂质进行不同的结构修饰，可增强其递送核酸的能力。例如，增加可电离脂质疏水结构域的不饱和程度，其核酸递送能力得到了显著提高。因为增加双键数量可能可以促进纳米颗粒融合基团的形成，从而可能会增强融合过程和内涵体的递送。此外，据报道，酸解离常数(pKa)会显著影响该制剂的递送能力（pKa对应可电离脂质或LNPs变成带正电时的pH值）。因此，纳米颗粒在生理pH值下表面呈中性，而在被细胞吸收到内涵体的酸性环境后带正电是很重要的。通过监控LNP的组成，可以进一步增强LNP递送核酸的能力。例如，当显著提高可电离脂质含量(高达57%)以及降低聚乙二醇(PEG)含量 (从10%降低到1.4%)，可明显提高脂质制剂的核酸递送能力。在开发不同的mRNA配方时，仍使用与50%可电离脂质和1.5% PEG相似的组成。为避免产生脂质相关毒性，在制备LNPs时（特别是需要经常给药的脂质），可使用具有高生物降解特性的可电离脂质，可以通过在疏水脂质尾部嵌入羧酸酯基团实现这种可生物降解特性。在体内，酯酶对这些基团的裂解可能有助于将化合物代谢成更易溶于水的产物，这些产物可在几小时内从血浆和组织中被清除。利用可电离脂质制备用于RNA疫苗的LNPs已在多项研究中得到证实。例如，除了磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-脂质外，还使用可电离的阳离子脂质(Acuitas专有)制备LNPs封装编码寨卡病毒菌株前膜和包膜糖蛋白的mRNA。对小鼠和非人灵长类动物进行皮下注射单剂量mRNA的LNP均能诱导产生保护作用。另一组研究人员开发了一种递送mRNA疫苗的LNP，在携带黑色素瘤的B16F10小鼠中可诱导细胞毒性T细胞反应。使用由可电离阳离子脂、磷脂、胆固醇和PEG-脂质制备的LNPs封装编码肿瘤相关抗原gp100和TRP2的修饰mRNA，用上述LNPs对小鼠进行皮下接种，可诱导强烈的T细胞活化，从而缩小肿瘤大小，延长小鼠的生存时间。研究还表明, 与未添加佐剂的LNP的对照组相比，增加脂多糖(LPS)作为佐剂的优化LNP制剂可增强mRNA疫苗的效力并改善小鼠的存活率。为增强LNPs在体内递送RNA的能力，新开发了被称为“类脂质”的可电离脂质。在Chahal等人的一项研究中，利用树状聚合物类脂和PEG-脂质开发的修饰树状聚合物纳米颗粒封装自扩增mRNA（编码H1N1流感病毒的血凝素(HA)蛋白，埃博拉病毒的糖蛋白(gp)或6种弓形虫特异性抗原(根尖膜抗原1 (AMA1)、致密颗粒蛋白6 (GRA6)、表面抗原1 (SAG1)、表面抗原2A (SAG2A)、弓形虫学蛋白2A (ROP2A)和肾上腺皮质蛋白18 (ROP18))）。用编码埃博拉病毒糖蛋白的mRNA疫苗对小鼠进行两次肌肉注射，在所有已获得埃博拉病毒完全保护的小鼠中都产生了高滴度的gp抗体。同样，在对小鼠进行单次肌肉注射编码H1N1流感病毒血凝素或弓形虫抗原的疫苗后，可以预防所有小鼠感染这些病原体。他们在另一项研究中使用同样的树状聚合物类脂纳米颗粒开发针对寨卡病毒的mRNA疫苗。3.2 辅助型脂质辅助型脂质，如PEG-脂质、胆固醇和磷脂酰胆碱，都具有独特的功能特性，他们通常包含在mRNA-LNP中，以增强纳米颗粒的稳定性；辅助型脂质也可促进细胞对脂质双分子层的摄取和破坏，从而提高核酸递送的效率。3.2.1 PEG-脂质聚乙二醇化脂质(PEG-脂质) 是通常位于LNP表面的重要成分。PEG-脂质由PEG的亲水分子与疏水烷基(或脂)链偶联而成，其中PEG结构域位于LNP表面，而烷基链附在LNP双分子层上。聚乙二醇化脂质附着在LNPs双分子层上，由于其空间位阻效应，可以延长LNPs的循环时间。这一特性降低了LNPs与血浆蛋白（调理素）的结合，减少了网状内皮系统对LNPs的快速清除，从而有助于纳米颗粒在病变部位聚集。此外，聚乙二醇化脂质的空间位阻特性可能会阻止纳米颗粒在制备过程中发生融合或聚集，从而获得粒径较小(50-100 nm)、低分散系数的均匀制剂。LNPs中聚乙二醇化脂质的含量应谨慎控制并保持在最低限度。PEG含量较高通常会增加LNPs在血液循环中的停留时间，但也可能会阻止它们与内涵体膜融合，妨碍核酸在细胞内递送。因此，正如Semple等人报道的，将PEG含量从10%降低到约1.5%(同时可电离脂质增加到57%)可以显著提高结合mRNA的LNPs的效力。此外，通过监控附着在LNPs上的PEG-脂质的大小可以控制PEG-脂质从纳米颗粒扩散的速度，并影响其在血液循环中的停留时间。较大的脂质锚点通常用于形成脂质体，这种脂质体在血液中循环的时间更长，以递送化疗药物。另一方面，较小的脂质锚点用于制备在血液循环中停留时间更短的LNPs，它们可以将siRNA递送到肝细胞。控制LNPs的血液循环时间对防止其产生毒性非常重要。附着PEG-脂质的LNPs更长的循环时间可能会提高封装核酸的LNPs的免疫原性和抗体反应(针对表面聚乙二醇)。强烈的抗体反应可能加快该制剂在血液循环中的清除速度，反复给药可能引发急性超敏反应。我们知道，在使用过聚乙二醇化或含聚乙二醇药物的患者体内会产生抗聚乙二醇抗体。这些抗体在反复静脉给药LNPs后产生，并特异性与LNP上的PEG部分结合，引起对LNP的加速清除和急性超敏反应，从而降低药物疗效。这种现象在需要多次给药以获得长期保护的免疫治疗中很常见。通过对PEG分子的修饰以降低其免疫原性或使用不同的给药途径可能是克服这种抗体反应的解决方案。3.2.2 胆固醇胆固醇与封装mRNA或siRNA的LNPs结合可能有助于提高LNPs的稳定性、结构完整性和膜融合性。一些研究表明，在LNPs中加入胆固醇可以高效递送被包裹的DNA，这可能是由于膜融合性得到增强。这些改善产生的原因是胆固醇在纳米颗粒的核心表现出低溶解度，因此可能以结晶形式聚集在LNPs表面，这可能会破坏脂质双分子层的稳定性并增强内涵体逃逸。此外，最近有研究表明，将胆固醇类似物(如C-24烷基植物甾醇)整合到LNPs上，可显著提高体外mRNA基因转染率。3.2.3 磷脂酰胆碱磷脂酰胆碱的作用是形成和破坏脂质双分子层(因为脂质双分子层是圆柱形的)，因此可能促进内涵体逃逸。使用饱和、高熔点的磷脂酰胆碱，如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，可以产生高度稳定的LNPs。然而，由此产生的LNPs不会促进内涵体逃逸，因此会降低被包裹核酸的递送效率。另一方面，利用不饱和的低熔点磷脂酰胆碱，如二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，可能产生流体化的LNPs，这些LNPs对血清蛋白的调节作用非常敏感。因此，磷脂酰胆碱通常与胆固醇结合形成高度稳定的LNPs，这些LNPs在生理温度下保持结构完整性，并可以促进内涵体释放。4.用于RNA疫苗的LNPs的生产方法以前，制备负载RNA的LNPs最常见的方法是利用含有核酸缓冲液的脂质成分的水合作用，然后，通过聚碳酸酯过滤器挤压使上述方法产生的LNPs均质化，以生产更小尺寸的LNPs。这种方法的核酸包封率较低，而且由于需要高度专业化的设备，难以规模化生产。另外，乙醇稀释法是一种耐用、易于规模化生产和重复性好的方法，该方法具有较高的核酸包封率(>80%)。这种方法是在特定浓度下，将脂质成分溶解在乙醇(一种可溶于水的溶剂)中。然后，在酸性pH条件下，用T型混合器将含有脂质的乙醇溶液与mRNA的水溶液混合。这两种溶液的混合相当于稀释了乙醇，从而降低了脂质的溶解度，然后脂质浓缩成带正电的颗粒，转而与带负电的核酸结合产生纳米颗粒。用中性缓冲液稀释上述纳米颗粒，以去除乙醇并中和pH，从而获得更稳定、更均匀的LNPs。微流控混合装置也被用于高效而快速的单个分散LNPs小规模生产。通过向装置内注入脂质的乙醇溶液，然后使用内置的人字形微混合器结构将其与水溶液混合。微混合器和微流控装置可以使两种溶液快速混合，并促进小尺寸LNPs的形成。此外，使用不同微混合器循环数可能证实溶液的混合可以产生LNPs。有报道称，与T型管混合法相比，使用微流体混合技术(采用人字形微混合器)制备siRNA-LNPs可以获得更高的核酸包封率(约70%)。采用低温透射电镜对这两种混合技术所产生的siRNA-LNPs的形态结构进行观察，结果表明，这两种混合方式所产生的LNPs具有相似的结构，它们都具有高电子密度核心，而不是类似于脂质体中观察到的较低电子密度的水核。作者发现，核心的电子密度取决于制剂中使用的可电离阳离子脂质的电荷数和饱和度。5.影响RNA/LNP疫苗在体内递送和摄取的因素5.1 给药途径不同的给药途径，如肌肉注射(IM)、皮内注射(ID)、皮下注射(SC)、静脉注射(IV)、结内注射(IN)和瘤内注射，均可用于递送mRNA疫苗。是否选择了最适合的给药途径是决定疫苗安全性和有效性的重要因素。此外，给药途径可能决定了在设计最优化LNPs时必须考虑的特定的细胞外屏障。研究发现，在肿瘤免疫治疗方面，为刺激全身免疫反应，从而产生对肿瘤的免疫，采用静脉注射mRNA肿瘤疫苗更合适。此外，有报道称，对小鼠静脉和腹腔注射含有编码萤火虫荧光素酶的修饰mRNA的LNPs，荧光素酶在肝脏中表达最高，但持续时间最短(1-4天)，而采用同样的疫苗进行小鼠皮内和肌肉注射，可使接种部位的蛋白表达时间维持10天。另一方面，梁等的研究表明, 与肌肉注射相比，对恒河猴皮内注射编码流感H10N8全长血凝素(HA)蛋白的核苷修饰mRNA(以LNPs为载体) ，可以产生明显更高的血凝素抑制(HAI)滴度和更强的CD4+ T细胞激活作用。这种更强的免疫原性是由于皮内注射疫苗后，皮肤的树突状细胞更快速地激活并迁移到引流淋巴结和抗原在接种部位保留时间更长。因此，对于mRNA疫苗，皮肤似乎是一种有效的给药途径，因为它提供了直接的局部转染并可刺激树突状细胞产生并迁移到淋巴系统。此外，mRNA-LNPs通过淋巴系统被动引流，可将mRNA直接递送到淋巴结和固有抗原提呈细胞和T细胞内。为了获得对纳米颗粒有效的淋巴递送，另一个重要因素是颗粒的大小。有报道称，200nm以下的纳米颗粒可以进入淋巴管，而较大的颗粒可滞留在接种部位。研究还表明，LNPs的聚乙二醇化可能促进其流入淋巴系统，同时有利于其在注射部位的分布和细胞摄取。此外，将靶向配体附着到LNPs上，可增加其在引流淋巴结内的诱捕作用。因此，对于淋巴系统摄取最终的LNPs来说，制备出未带电、体积相对较小、具有充分聚乙二醇化外表面的最优mRNA-LNPs是至关重要的。Wang等人制备的mRNA纳米颗粒系统具备了这些特性。聚乙二醇化的脂质纳米颗粒系统包括脂质包被的磷酸钙纳米颗粒，内含编码黑色素瘤相关抗原的mRNA。LNPs的功能化是通过附着甘露糖作为靶向配体，使淋巴结中的树突状细胞优先摄取最终的LNPs来完成的。最终的mRNA-LNPs小于50 nm，对小鼠皮下注射4小时后，就能有效地转运到淋巴系统。作者推测，磷酸钙核心促进了内吞溶酶体中LNPs的溶解，允许几乎全部剂量的编码黑色素瘤抗原的mRNA快速释放到淋巴结中固有的巨噬细胞和树突状细胞。该研究团队还发现编码酪氨酸相关蛋白2 (TRP2)的mRNA疫苗在B16F10黑素瘤小鼠模型中产生强烈的细胞毒性T细胞反应，并能显著抑制肿瘤生长。5.2 制剂的胶体稳定性为确保所接种制剂的有效性，mRNA-LNPs的胶体稳定性是需要仔细监控的另一个关键因素。众所周知，mRNA纳米颗粒可以与不同的体液相互作用。这种相互作用可能导致生物分子或内源性蛋白吸附到纳米颗粒表面，从而形成一种双分子或蛋白冠的复合体。纳米粒子-蛋白冠复合物的形成可能会降低mRNA-LNPs的胶体稳定性，导致颗粒聚集和mRNA的提前释放。因此，应在未稀释的生物液中对LNPs进行表征，以确定其稳定性、大小和mRNA包封率。关于这点，荧光相关光谱可以用来确定mRNA的络合程度，而荧光单颗粒跟踪技术可以用来测量LNPs的大小和聚集程度。改变LNPs辅助型脂质的组成也可能有助于提高其在血清中的稳定性。例如，据报道，胆固醇的加入可以降低脂膜的渗透性，增加脂膜的硬度，因此，有助于保持血清中LNPs的完整性。此外，在LNP成分中加入聚乙二醇化脂质可能会起到隐身作用以及通过降低对血浆蛋白的吸附能力提高胶体稳定性，从而避免在血液中聚集。然而，有报道称含有聚乙二醇化脂质的LNPs细胞摄取和转染效率较低。因此，仔细选择聚乙二醇化脂质很重要。我们知道，传统的聚乙二醇脂质（如二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)-PEG2000）可以与LNPs紧密相连，并阻止核酸的释放。利用具有短酰基链的特定PEG脂质(如神经酰胺-PEG脂质)可能有利于获得高转染效率，因为它们能够逐渐扩散出LNPs，形成不稳定的LNPs，从而释放其核酸成分。双分子冠状复合物的形成可能会改变LNPs的表面特性，这些改变可用于增强对载荷药物的靶向递送。已有文献证明，用于形成双分子冠状复合物的单个蛋白质的类型和数量取决于纳米颗粒的固有特性和生物活性。LNPs能与血液蛋白(调理蛋白如免疫球蛋白(IgG和IgM)、纤维连接蛋白和一些补体蛋白)相互作用，这种相互作用将促进吞噬细胞对纳米颗粒的识别、摄取，从而将纳米颗粒清除。LNPs的聚乙二醇化可能会降低吞噬细胞对纳米颗粒的识别及快速清除作用。有报道称，加入聚乙二醇化脂质降低了纳米颗粒吸附补体蛋白和免疫球蛋白的倾向，从而使纳米颗粒逃离巨噬细胞系统。然而，在有抗PEG抗体的患者中，注入这些聚乙二醇化纳米颗粒会加速对聚乙二醇化纳米颗粒的清除，并且会引起更强的补体相互作用。5.3 目标组分的合并在mRNA-LNP系统中加入抗体或靶向配体可促进mRNA在靶器官的分布和表达于特定免疫细胞(如树突状细胞)的特异表面受体对mRNA的摄取。通过靶向特定受体，纳米颗粒可能被导向细胞内运输通路，防止mRNA被降解。将mRNA纳米疫苗靶向不同C型凝集素受体(如12-205、CLEC9A和甘露糖受体)的理念可用于诱导这些特异性受体摄取mRNA-LNPs。此外，通过加入靶向组分，可实现对核酸的内吞保护，使其免受降解，并调控死细胞相关抗原的交叉提呈作用。Parhiz等人研究了核苷修饰的mRNA-LNPs与抗血管细胞粘附分子(PECAM-1或血小板内皮细胞粘附分子-1)抗体的结合。结果显示，小鼠全身给药后，与非靶向LNPs相比，靶向LNPs对肺内皮细胞的mRNA递送提高了200倍，蛋白表达提高了25倍。此外，对小鼠静脉注射后，加入了甘露糖基序的纳米颗粒可以增加甘露糖基化组织苷基化脂多糖mRNA对脾脏树突状细胞的转染效率。此外，Kedmi等人提出了一种将脂蛋白嵌入siRNA-LNPs中的模块化靶向平台。设计的纳米颗粒用于多种白细胞，并与选定的靶向抗体的可结晶片段结构域产生非共价相互作用。在只存在于炎症组织的炎症白细胞中观察到了白细胞介素10的靶向表达，从而证实了这些LNPs在治疗炎症性肠病方面的疗效。虽然已经证明加入靶向配体可以提高mRNA-LNP的递送效率和治疗效果，但应指出的是，附着靶向成分也可能会增加LNP系统生产过程的复杂性、成本和调控难度。此外，当脂质纳米颗粒暴露于生物体液中，与介质中的蛋白质相互作用，从而形成蛋白冠状复合物时，一些靶向配体的靶向特异性可能会失效。因此，应考虑一些折中方案，以实现可能的临床效益与靶向mRNA-LNP生产过程的复杂性及生产成本之间的平衡。一些研究提出了纳米颗粒与调理素血液蛋白(即:调理作用)的相互作用可作为被动靶向抗原提呈细胞的方法，或通过疫苗平台中的补体相互作用产生树突状细胞的有效激活。Reddy等人的一项研究表明，皮内注射超小的卵白蛋白纳米颗粒作为疫苗平台，可通过补体相互作用靶向和激活淋巴结中的固有树突状细胞。作者的结论是，对小鼠皮下接种卵白蛋白纳米颗粒，通过靶向淋巴结可能仅仅诱导产生体液免疫和补体激活。全身接种mRNA-LNP后，位点特异性靶向和器官分布的差异与LNPs的生物分子冠状物和表面电荷有关。例如，吸收载脂蛋白E作为靶向配体可使肝脏从可电离(或近中性)LNPs中特异性摄取(si)RNA，而不能从阳离子型LNPs中摄取(si)RNA。另一方面，研究发现，采用阳离子脂质和胆固醇制备的阳离子mRNA脂质复合物主要聚集在肺中转染肺树突细胞，用于递送核苷修饰的mRNA和单磷酸基脂质A (TLR4激动剂)。出乎意料的是，Kranz等人发现，降低mRNA脂质复合物的脂质含量会使纳米颗粒携带负电荷，并使其聚集器官从肺转移至脾脏。靶向阴离子mRNA脂质复合物的临床研究(I期)表明，黑色素瘤患者脾脏中存在核酸聚集。5.4 佐剂的整合通过在疫苗配方中加入某些被称为佐剂的化合物，可以增强对抗原的免疫应答。在疫苗配方中使用佐剂可以更有选择性地刺激免疫通路以获得抗原特异性免疫反应(细胞免疫反应或体液免疫反应)。LNPs由于其含有脂质成分，自身可作为佐剂。有些脂质可诱发炎症，刺激免疫系统。例如，据报道，与使用阴离子或中性脂质制备的LNPs相比，用阳离子脂质（如DOTAP）制备的LNPs递送RNAi，在小鼠治疗中可诱导更强的伴随Th1细胞因子的促炎症反应和toll样受体4 (TLR4)的激活。此外，在小鼠皮肤注射含有用可电离阳离子脂质制备的编码绿色荧光蛋白(GFP) mRNA 的LNPs 24小时后，观察到了促炎症反应。因此，激活表达于抗原提呈细胞(APCs)上toll样受体，已经成为刺激细胞因子的产生从而引发炎症反应的佐剂整合靶点。研究人员已经对作为toll样受体激动剂的不同类型的佐剂进行了评估。例如，与非脂质A配方相比，将细菌单磷酸基脂质A整合到LNPs可制备出更有效的疫苗。据报道，佐剂(如未甲基化的CpG-寡核苷酸)与蛋白疫苗共封装时可增强免疫应答。此外，Wu等开发的小分子免疫增强剂作为TLR激动剂诱导免疫激活作用，可以作为制备LNPs的佐剂。非mRNA佐剂的整合可能并不是必要的。哺乳动物细胞可以通过不同的模式识别受体识别外源mRNA，如先天免疫受体TLR3、TLR7和TLR8。刺激这些受体将导致编码促炎细胞因子、趋化因子和1型干扰素的基因转录上调。这些受体介导的反应有助于启动免疫反应。6.作为RNA疫苗递送系统LNPs的临床前和临床应用LNPs在RNA疫苗递送系统的应用有助于充分发挥疫苗的潜力，因为这种递送系统可以防止封装的核酸大分子被核酸酶降解。作为递送系统，LNPs通过细胞膜被细胞摄取(通过内吞作用)，只有在内涵体逃逸后才将其包裹的mRNA递送到细胞质中。LNPs也可能影响固有免疫反应，也可以为mRNA疫苗提供协同佐剂作用。RNA在预防和治疗方面的各种应用角色促进了RNA疫苗对传染性病原体和癌症的不同应用。许多将LNPs作为自扩增mRNA和传统mRNA的递送系统预防各种传染性疾病的研究表明，LNPs在不同的动物中具有强烈和快速的免疫刺激作用。表1总结了以各种脂质配方中mRNA疫苗防治传染性疾病和癌症的临床前研究。此外，为预防传染性疾病开发的不同mRNA疫苗已进入临床研究，以评估其有效性。表2总结了这些临床试验的现状。由Bahl等人主持，由Moderna Therapeutics赞助的临床研究被认为是第一个使用LNP-mRNA疫苗(编码H10N8流感HA抗原)的人体试验(NCT03076385)。本研究结果显示，对31名受试者间隔3周进行两次肌肉接种 100µg疫苗后，所有受试者均产生了不小于40的流感H10N8 HA抗原特异性抗体滴度，表明该疫苗具有良好的免疫原性。此外，研究表明，接种43天后，87%的接种者血清中产生了≥20的病毒中和抗体滴度。尽管与动物模型试验相比，人体试验产生的抗体滴度较低，但这结果也是令人满意的。Feldman等人也报道了类似的发现。这些研究表明，以LNP为载体，编码H10N8和H7N9病毒的全长血凝素的mRNA疫苗是安全的，对健康成人肌肉接种100µg和25µg剂量的疫苗，能在3周内产生强烈的体液免疫反应。作者还报道，两种疫苗在100µg剂量下与使用或不使用佐剂制备的已获批疫苗具有相似的安全性和反应原性。表2 针对传染病和癌症的临床研究的mRNA疫苗HCMV, human cytomegalovirus; hMPV, human metapneumovirus; HPIV3, human parainfluenza virus type 3; LNP, lipid nanoparticle; PCD, estimated primary completion date; TAAs, tumor-associated antigens.6.1．预防严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)感染的RNA/LNP疫苗目前，RNA疫苗已成为预防2019年12月因严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)感染而出现的冠状病毒(COVID-19)大流行最有效的疫苗技术之一。对编码SARS-CoV-2刺突蛋白或刺突受体结合结构域的LNP-mRNA疫苗已开展了多项临床前研究，以评估疫苗的有效性和免疫原性。例如，与电穿孔pDNA疫苗相比，用LNP封装编码病毒刺突蛋白的的自扩增RNA免疫小鼠可产生明显更高的SARS-CoV-2特异性抗体，并诱导了强烈的细胞免疫反应。这些结果与所使用LNP的性质有关。 另一项临床前研究评估了编码SARS-CoV-2全长刺突蛋白或刺突受体结合域的核苷修饰mRNA在小鼠体内的免疫原性。据观察，这两种疫苗在单次接种后除了可产生强烈的抗体反应外，还能诱导强烈的T和B细胞反应。此外，美国马萨诸塞州剑桥市Moderna Therapeutics公司开发了一种编码SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA-LNP疫苗(mRNA-1273)，用该疫苗免疫非人灵长类动物可产生高中和活性和显著升高的刺突蛋白特异性抗体。由LNPs制备的mRNA疫苗的临床前研究结果有望为COVID-19提供疫苗解决方案，并使RNA疫苗推进到临床研究阶段。Moderna mRNA-1273可以认为是在确定SARS-CoV- 2基因序列42天后第一种进入I期临床研究的疫苗(识别号NCT04283461)。该疫苗生产公司最近宣布，根据对第一次III期临床研究的中期分析，该疫苗的有效性为94%。不同的机构和制药企业正在利用不同的LNPs作为平台技术，开发针对COVID-19的RNA疫苗。例如，BioNTech (Mainz, Germany)与辉瑞(New York, NY)合作开发的mRNA疫苗(BNT162)由四种不同的mRNA格式组成，以S蛋白和受体结合域的抗原为靶点，并以LNP作为载体。截至2020年11月9日，BioNTech(德国美因茨)和辉瑞(美国纽约)报告称，根据对III期临床研究的首次中期疗效分析(鉴别号: NCT04368728)， BNT162疫苗对COVID-19的有效性超过90%。总之，使用LNPs制备mRNA疫苗可以被认为是一种很有前景的预防SARS-CoV-2的方法。这些脂质制剂可迅速生产，从而加快疫苗的开发。用LNPs制备的针对COVID-19不同的mRNA疫苗在各种临床试验中均显示出良好安全性和免疫原性。动物研究数据显示，LNP-mRNA疫苗能诱导强烈的中和抗体反应并产生对 SARS-CoV-2的高保护率。6.2 预防流感病毒感染的RNA/LNP疫苗mRNA流感疫苗是研究最广泛的mRNA疫苗之一，因为它们易于评估在小动物中的疗效，而且可以测试诱导的T和B细胞反应。有报道称，一旦确定流感病毒血凝素(HA)抗原的基因序列，就可以在短时间内生产出自扩增mRNA疫苗。在此基础上，在确定HA抗原基因序列的8天内，就研制出了中国H7N9流感病毒自扩增mRNA疫苗(基于LNPs)，并证明了其在小鼠体内具有免疫原性。Lindgren等人也开发了一种经修饰的编码大流行H10N8流感毒株的血凝素的非复制mRNA-LNP疫苗。用该疫苗对恒河猴进行肌肉和皮内接种，接种后都可使B细胞反应增强，并在引流淋巴结中形成生发中心(GCs)。此外，还观察到H10特异性T滤泡辅助细胞水平的增加，并与人类季节性流感疫苗接种后产生的高亲和力抗体反应相关，上述结果表明产生了血清转化。有研究人员使用mRNA-LNP诱导对不同病毒毒株保守表位(嵌合及无头血凝素结构)的强烈地免疫反应开发了一种通用流感疫苗。这种通用流感疫苗产生了对血凝素柄区结构域的抗体，对动物抵抗各种不同的流感病毒均表现出了很好的保护作用。Pardi等人使用表达全长流感病毒血凝素的核苷修饰mRNA-LNPs制备了另一种具有广泛保护作用流感疫苗并对其进行了疗效评价。在不同的动物模型(小鼠、家兔和雪貂)中，用上述疫苗进行单次接种，可产生血凝素柄区特异性抗体反应，从而对小鼠的同源、异源和异亚型流感病毒感染提供保护。此外，LNPs被用于递送编码H10N8或H7N9流感毒株血凝素的修饰mRNA疫苗。该疫苗在小鼠、雪貂和食蟹猴身上产生了强劲、快速和持久的免疫反应。6.3 预防狂犬病病毒感染 的RNA/LNP疫苗有人利用LNPs制备了预防狂犬病毒感染的mRNA疫苗。Lutz等人开发了一种编码狂犬病毒糖蛋白(RABV-G)的经序列优化、未修饰的mRNA疫苗。用该疫苗对食蟹猴进行单次接种，产生的病毒中和滴度水平超过了世界卫生组织设定的对应人类保护水平的参考值(0.5 IU/mL)。这些抗体滴度是剂量依赖性的，在第28天对动物进行第二次接种后其水平进一步提高了20倍。作者注意到，在1年的观察期内，接种了疫苗的食蟹猴对狂犬病均有稳定的抵抗作用。6.4．预防寨卡病毒感染的RNA/LNP疫苗不同研究团队报道了mRNA/LNPs疫苗对寨卡病毒的保护作用。Pardi等人研究表明,对小鼠(30µg剂量)或恒河猴(50µg剂量)进行单次皮下接种编码寨卡病毒的前膜和包膜(prM-E)糖蛋白的核苷修饰mRNA/LNPs疫苗，在两种试验动物中均可诱导产生抗寨卡病毒中和抗体，从而引起强烈和持久的保护性免疫反应。Richner等也报道了对小鼠肌肉注射编码寨卡病毒prM-E糖蛋白的修饰mRNA/LNPs疫苗（2个10µg剂量），其结论与Pardi等人研究一致。此外，Richner等人设计了一种mRNA/LNP疫苗，对E蛋白的保守的融合环表位进行了基因突变。研究发现，在细胞培养和小鼠试验中，该突变mRNA疫苗对寨卡病毒感染具有保护作用，减少了登革热病毒感染(与寨卡病毒感染密切相关)的增强抗体的产生。研究人员对上述基因突变疫苗预防由寨卡病毒感染引起的可能在怀孕期间发生的胎儿先天性畸形的效果进行了评估。作者报告说，接种两次该疫苗预防了怀孕小鼠由寨卡病毒引起的母体、胎盘和胎儿感染。此外，可以设计出递送编码不同抗原的多种mRNA的mRNA疫苗，从而在一次免疫后产生对多种病原体或同一传染病病原体的不同抗原的免疫作用。这些编码不同抗原的多价mRNA对于刺激不同的免疫反应或靶向染病病原体多个生命周期中表达的抗原特别有用。例如，John等人的研究描述了封装核苷修饰mRNA的LNPs的制备，该mRNA编码人类巨细胞病毒(CMV)五聚体蛋白复合物的五个不同亚基和糖蛋白B (gB)。对小鼠和非人灵长类动物肌肉接种后，该疫苗能在体内有效递送，并产生了强烈的免疫反应和广谱中和抗体。作者还制备了另一种编码免疫显性巨细胞病毒T细胞抗原pp65的LNP/mRNA疫苗。将这种传统疫苗与五聚体蛋白复合物和糖蛋白B疫苗混合接种，可产生多种抗原或广谱T细胞应答，且不会干扰用多价五聚体蛋白复合物接种小鼠产生的抗体水平。表达人巨细胞病毒五聚体蛋白的mRNA疫苗已进入临床评估阶段，目前正在进行I期临床试验。6.5.肿瘤RNA/LNP疫苗肿瘤疫苗既可作为预防(防止引起癌症的病毒感染)性疫苗，也可作为治疗(治疗现有癌症)性疫苗。2010年，首个治疗性肿瘤疫苗Sipuleucel-T (provenge)被批准用于治疗前列腺癌。不同的研究已经证实了肿瘤疫苗在降低癌症复发率以及提高患者总体生存期方面的临床效果。肿瘤疫苗可以编码如肿瘤相关抗原(TAAs)和肿瘤特异性抗原(TSAs)的多种抗原。TAAs包括在癌细胞中过度表达但也存在于正常细胞中的蛋白质。TSAs仅在肿瘤细胞中表达，它们来源于病毒的原癌蛋白或基因突变或重排产生的蛋白。此外，肿瘤细胞在肿瘤发展和癌变过程中的突变可能导致被称为新抗原的变异蛋白的产生。这些类型的蛋白质可以通过分析单个癌细胞的基因突变进行识别。新抗原的使用可能使个性化的新表位肿瘤疫苗的生产成为可能，这可能有利于增强耐受性和限制正常组织毒性，与传统肿瘤疫苗相比，个性化肿瘤疫苗还能提高抗肿瘤免疫反应。个体化RNA突变体疫苗和个体化多肽疫苗是个体化疫苗在一期临床试验中显示出良好效果的例证。第一款个性化疫苗IVAC MUTANOME (BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH)是一个编码多个新表位的RNA疫苗, 在I期临床试验中，研究人员对其靶向突变新抗原治疗黑色素瘤患者的免疫原性,安全性和耐受性效果进行了评估(鉴别号:NCT02035956)，结果观察到了对疫苗抗原强烈的免疫反应。此外，该疫苗对选定的125个新表位中的60%都产生了T细胞应答，且没有药物不良反应，这表明入组患者对疫苗具有良好的耐受性。与其他类型疫苗相比，mRNA肿瘤疫苗的优势之一是可以从肿瘤样本中获得RNA，从而生产患者特异性抗原，然后制备个性化疫苗。此外，toll样受体TLR3、TLR7、TLR8提供的信号可能反映了mRNA作为佐剂增强的免疫应答作用。此外，mRNA疫苗不存在感染风险，而且其具有生产迅速、可规模化生产、廉价的优点。当编码的抗原在细胞质中被翻译成抗原提呈细胞或APCs(树突状细胞或巨噬细胞)的蛋白质时，mRNA疫苗会刺激特异性免疫反应。表达的蛋白质通过主要组织相容性复合体(MHC) I类分子呈递给CD8+ T细胞，刺激细胞反应。通过mRNA编码的抗原与来自溶酶体蛋白的MHC II类转运信号的融合，可能诱导在癌症免疫治疗中至关重要的支持性CD4+ T辅助细胞反应的产生。因此，可以开发出编码肿瘤特异性抗原的mRNA疫苗，产生针对肿瘤细胞的特异性T细胞免疫反应。使用安全且具有生物相容性的纳米颗粒系统，如脂质纳米颗粒和脂质体，制备和优化mRNA的递送，从而进行个性化mRNA肿瘤疫苗的临床试验和体内给药。纳米颗粒系统作为mRNA肿瘤疫苗载体的应用在防止mRNA降解方面具有很多优越性，而且可能通过疫苗与佐剂的共同递送以及配体靶向树突状细胞，增强抗肿瘤反应。此外，纳米颗粒系统为控制疫苗的释放和分布提供的可能。研究人员已经在脂质纳米系统中制备出了编码不同抗原的个性化mRNA肿瘤疫苗，并已进入临床研究(NCT03897881，NCT02316457, NCT03313778, NCT03480152, NCT03323398)。已有报道称LNPs封装个性化mRNA疫苗已成功应用于黑色素瘤患者的治疗。所有患者对疫苗的新表位均表现出T细胞应答。此外，接种疫苗后，两名受试者的黑色素转移酶显著降低，从而提高了患者的存活率。为了诱导强烈细胞毒性CD8+ T细胞应答，Oberli等人开发了LNPs，用于递送编码模型免疫蛋白 (卵白蛋白（OVA）)的mRNA疫苗。作者确定了一种包含可电离脂质(cKK-E12)和添加剂(十二烷基硫酸钠)的最佳配方疫苗。当cKK-E12的摩尔比从35%降低到10%时，该配方疫苗可以增强T细胞反应。使用编码相应抗原的mRNA疫苗对表达OVA的转基因肿瘤或侵袭性B16F10黑素瘤的模型小鼠进行免疫，可产生很强的CD8+ T细胞免疫激活，同时减缓肿瘤生长，缩小肿瘤体积，从而延长疫苗接种小鼠的生存期。通过将不同组分附着在靶向免疫细胞表面特异性受体的LNP表面，进而递送其封装的mRNA，增强LNP的效力。另外，LNPs与佐剂共同给药可能会增强对免疫反应的刺激。例如在荷瘤（B16F10黑色素瘤）小鼠中，将TLR4激动剂(脂多糖;LPS)整合到LNP中，可减缓肿瘤生长并延长小鼠存活时间。同样，Verbeke等人证实，对核苷修饰mRNA与含有TLR4激动剂(单磷酸基脂类A;MPLA)的DOTAP-胆固醇mRNA脂质复合物共同给药，可以诱导固有免疫反应，并能引起体内抗原高水平表达。此外，Lee等人将脂肽三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸(Pam3)（一种TLR1和TLR2激动剂）作为佐剂加入到封装卵白蛋白mRNA的LNPs中，用Pam3-LNP对小鼠进行肌肉接种，可引起肿瘤抗原的高水平表达，并增强细胞免疫反应。LNPs在递送mRNA肿瘤疫苗方面的另一个优点是，可以设计出递送编码细胞因子mRNA的LNPs，以激活免疫反应并杀伤肿瘤细胞，而不会对健康细胞产生毒性或副作用。Lai等人研究了编码白细胞介素-12 (IL-12，一种具有抗癌活性的细胞因子)的mRNA-LNPs对肝癌模型转基因小鼠肿瘤生长的抑制作用。对小鼠进行mRNA-LNPs疫苗全身给药，结果表明，该疫苗不仅不会产生对健康组织的毒性，而且能减缓肝脏肿瘤的生长，并提高治疗小鼠的存活率。Jain等人研究了另一种提高治疗性mRNA特异性的策略。作者研究了使用治疗性mRNA对患病或癌变细胞进行编程，使其合成一种有毒蛋白质的可能性，这种蛋白质将导致这些细胞的自我毁灭，而不会损害正常细胞。为此，将microRNA (miRNA)的靶点整合到修饰mRNA中，编码毒蛋白或凋亡蛋白，如caspase或PUMA (p53上调凋亡调节剂)。miRNA结合位点可以靶向只存在于健康细胞中的miRNA，然后使这些细胞能够识别并降解毒性mRNA。研究发现，小鼠瘤内给药携带这些miRNA-mRNA组合序列的LNPs可以阻止健康细胞中mRNA毒蛋白的表达，但可以选择性地触发肿瘤细胞的凋亡，而不会引起全身毒性。7.结论RNA疫苗被认为是一种有前景的、高效的、廉价的、可规模化生产的疫苗设计平台。与传统疫苗相比，RNA疫苗因其生产过程快速、生产成本低的优点，更适合于传染病大流行期间的免疫接种。LNPs作为mRNA疫苗的递送系统的潜力已在许多临床前研究中证实，而且LNPs除了能使核酸进入靶细胞外，还能有效地防止mRNA胞外降解。然而，将动物试验转化为人类临床研究可能出现的挑战限制了以LNP制备的RNA疫苗进入市场的数量。随着Onpattro®的初步批准和各种mRNA纳米载体的开发，在封装mRNA疫苗和将递送RNA疗法用于其他领域（如基因编辑和治疗性蛋白质的生产），LNPs技术都已被证明是有效的。为了得到最终更高疗效的非肠道接种的LNP，需要对其配方进行一些调整。这些调整应该适用于诱导固有用于免疫治疗特定的感染或疾病。总的来说，本文对LNP作为mRNA疫苗递送系统的研究，将为进一步提高LNP制剂中其它核酸产品的有效性和耐受性奠定基础。原文来源：Lipid Nanoparticles as Delivery Systems for RNA-Based Vaccines