TLR7

摘要：在过去二十年中，病毒样颗粒（VLPs）引起了广泛关注。基于VLP的疫苗已获批准用于预防三种传染病——乙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒和戊型肝炎病毒；它们非常有效，并能提供持久的免疫反应。除此之外，其他病毒（包括感染人类、动物、植物和细菌的病毒）的VLPs也在开发中。这些VLPs，尤其是来自人类和动物病毒的VLPs，作为独立疫苗用于预防VLPs来源的病毒。此外，包括来自植物和细菌病毒的VLPs在内的VLPs，作为平台用于展示来自其他传染病或代谢疾病（如癌症）的外来肽抗原，即它们可用于开发嵌合VLPs。嵌合VLPs的目标是增强展示在VLPs上的外来肽的免疫原性，而不一定是平台本身。本综述总结了已获批准和正在开发的用于人类和兽医用途的VLP疫苗。此外，本综述总结了已开发并在临床前研究中测试的嵌合VLP疫苗。最后，综述以VLP疫苗相对于传统疫苗方法（如减毒活疫苗和灭活疫苗）的优势作为结论。 1.引言 病毒感染了广泛的生物，包括人类、植物、动物、鸟类、昆虫以及微生物（例如，真核生物和原核生物）。病毒的一个独特特点是它们的结构蛋白、包膜蛋白或衣壳蛋白以及其他结构蛋白，可以独立或集体自发自组装形成不含病毒基因组的病毒样颗粒（VLPs）。因此，任何病毒都可以用来开发VLPs；VLPs可以通过将编码感兴趣病毒蛋白的结构基因克隆到表达载体中来开发（图1）。表达载体取决于将在其中表达蛋白（s）的表达系统，有时，如果表达系统（包括哺乳动物、昆虫和细菌）与病毒通常感染的细胞不同，则对蛋白进行密码子优化。然后，携带结构蛋白（s）DNA的载体被转染/转化到感兴趣的细胞中，在那里DNA被转录和翻译。翻译的蛋白折叠并组装形成VLPs。VLPs在生物医学科学中有多种应用，例如：（i）治疗——将药物/货物运送到特定的癌细胞；（ii）体内成像——装载荧光团的VLPs；（iii）诊断测试——使用装甲RNA作为传染病的阳性对照；（iv）疫苗开发。本综述仅关注后者：VLPs在疫苗开发中的应用。 图1. 一个示意图，展示了VLPs和嵌合VLPs的生成。一种病毒的衣壳蛋白被克隆到一个表达载体中。带有衣壳蛋白的载体也可以用来将外来肽插入到衣壳蛋白中（底部）。然后，每个载体被转化或转染到一个表达系统中，在那里蛋白质被表达并组装成VLPs。 VLPs具有许多不同于传统疫苗的特点，这使它们成为非常有吸引力的疫苗设计平台。它们在尺寸（20-200纳米）、几何形状（即多价表位的二十面体结构）以及激活T辅助细胞的能力方面模仿它们来源的病毒。VLPs自然编码T辅助细胞表位，这些表位由抗原呈递细胞（APCs）与主要组织相容性复合体（MHC）II类一起呈递给T辅助细胞。除了APCs的共刺激分子外，表位的呈递还导致T辅助细胞的激活。这激活了T辅助细胞分泌细胞因子，激活了其他免疫细胞，如巨噬细胞、B细胞和T细胞（图2）。VLPs还可以被设计为包裹内源性佐剂，如单链（ss）RNA，以刺激先天免疫反应，如下所述：ssRNA与位于免疫细胞的细胞内隔室（例如，内质网）的Toll样受体TLR7和TLR8结合。ssRNA与TLR7和TLR8的结合导致受体的激活，这些受体向下发送信号，导致细胞因子（例如，干扰素α、干扰素γ、TNFα、IL-1β、IL-6和IL-12）的表达/分泌。分泌的细胞因子激活先天免疫细胞，以及控制病原体入侵的适应性免疫系统的细胞。这一特性还增强了VLPs的免疫原性，即使是在较低剂量下。此外，VLPs被认为是安全的，因为它们不包含病毒基因组，因此不能复制。值得一提的是，像任何疫苗一样，VLPs可能会引起副作用，如注射部位的疼痛和肿胀。因此，VLPs在过去二十年中作为疫苗设计的有吸引力的平台引起了相当大的关注。虽然来自人类和动物病毒的VLPs被开发用于保护人类和动物免受VLPs来源的病毒的侵害，但来自其他生物（包括植物和原核微生物）的VLPs被开发用于展示人类和动物病毒的异源抗原，即开发嵌合VLPs（图1，底部）。嵌合VLPs的目标是引发对平台上展示的异源抗原的免疫反应，而不一定是平台本身。值得一提的是，来自人类或动物病毒的VLPs也可以用来开发嵌合VLPs，其中在VLP上展示的异源抗原来自其他人类病毒（图1，底部）。 图2. VLPs激活免疫反应。抗原呈递细胞吞噬并处理VLPs成片段，这些片段在MHC类II的帮助下呈递给T辅助细胞（顶部图像）。这导致T辅助细胞的激活，它们分泌激活B细胞的细胞因子（下方）。B细胞也通过VLPs交联B细胞受体（BCRs）被激活。激活的B细胞分裂并分化成浆细胞和记忆细胞（这里未显示）。浆细胞向体内分泌抗体，这些抗体中和了VLPs来源的感兴趣病毒。 2.来自人类病毒的VLP疫苗  已经开发了（还有一些仍在开发中）使用感染人类的病毒的VLPs（表1）。事实上，基于VLP的疫苗已获批准用于预防三种人类病毒感染，即乙型肝炎病毒（HBV）、人类乳头瘤病毒（HPV）和戊型肝炎病毒（HEV）。其中，全球至少有九种基于HBV的VLP疫苗已获批准，包括Engerix-B、Recombivax HB、Euvax B、Hepavax-Gene、GenHevac B、GenVac B和Heberbiovac HB。这些疫苗基于HBV表面抗原；其中一些疫苗；例如，Engerix-B和Recombivax HB，自20世纪80年代中期以来一直在使用，它们对其他HBV基因型，如A型和C型，提供交叉保护。尽管这些疫苗对其他基因型提供交叉保护，但已报道了几种疫苗逃逸病毒突变株。尽管如此，HBV保护性抗体在某些个体中可持续长达30年。接种时的年龄似乎与HBV抗体反应有关。例如，平均年龄36岁接种的个体产生的抗HBV抗体比平均年龄32岁接种的个体少。然而，一次加强注射使94%抗体水平低的个体的抗体水平提高。 三种基于VLP的疫苗——Gardasil-9、Gardasil-4和Cervarix——已在全球范围内获得批准，用于预防人类乳头瘤病毒。这些VLPs源自主要衣壳蛋白L1；它们提供针对两种至七种HPV类型的保护——HPV16、18、31、33、45、52和58——这些类型与70-90%的宫颈癌病例相关。它们还提供针对两种HPV类型的保护——HPV6和11——与约90%的生殖器疣相关。对Cervarix和Gardasil-4的免疫反应至少持续13年，而Gardasil-9的免疫反应至少持续6年。Cervarix疫苗在接种11年后对HPV35、31、33、45和58提供21-64%的交叉保护。另一方面，接种Gardasil-4的90%个体在14年后对异源HPV类型（HPV6、11和16）有抗体，52%对HPV18有抗体。值得一提的是，这三种疫苗的长寿研究正在进行中。另外两种有潜力提供更广泛保护的HPV疫苗正在进行临床试验；一种11价候选疫苗，含有未公开的HPV类型，和一种14价候选疫苗，分别处于III期和I期临床试验。预计14价候选疫苗将提供针对HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59的保护。 在中国，一种用于预防HEV的基于VLP的疫苗（Hecolin）已获批准；评估其在其他国家——孟加拉国和美国——的效力的临床试验正在进行中。该疫苗基于来自HEV基因型1衣壳蛋白开放阅读框2的氨基酸368-606。在16至64岁个体中，接种三剂疫苗后的12个月有效率为100%。在老年人中，即大于65岁的个体，接种Hecolin的97.3%个体在第三个月（第7个月）后的1个月内血清转换。此外，87%的接种者体内可检测到至少持续4.5年的抗体。该疫苗针对基因型1、2和4提供保护，并预计在较小程度上对基因型3提供交叉保护。 除了上述批准的基于VLP的疫苗外，还有几种候选基于VLP的疫苗正在开发中。Pumpens和Pusko的一本新书提供了一份全面的总结，介绍了从各种病毒开发的候选基于VLP的疫苗[1]。已开发并测试的VLPs包括流感病毒、SARS-CoV-2、人类免疫缺陷病毒和寨卡病毒。表1总结了一些从人类病毒开发的VLPs在临床前和临床试验中的情况。这些VLPs源自包膜蛋白、衣壳蛋白或两者兼有，并使用各种表达系统表达，如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞，以及转基因植物。其中一些VLPs的效力可与传统方法开发的批准疫苗相媲美。例如，使用来自两种流感A亚型——H1N1和H3N2——的结构蛋白开发的杂交VLPs进行免疫接种，其免疫原性与批准的灭活流感病毒疫苗（Vaxigrip；H2N3）一样；IgG反应的标准化中位荧光强度>107。同样，用来自寨卡病毒或埃博拉病毒的VLPs免疫小鼠，提供高达100%的存活率，而对照小鼠则没有存活。 源自人类病毒的VLPs也被用来开发针对其他人类病毒的候选疫苗。例如，源自HBV的VLPs已被用来开发针对幽门螺杆菌（H. pylori）、丙型肝炎病毒（HCV）、与HPV相关的癌症和四种登革热病毒血清型的候选疫苗（表2）。在临床前研究中，用来自H. pylori的肽段展示的嵌合HBV VLPs免疫的小鼠细菌负担减少。在其他研究中，用来自HCV和登革热病毒的肽段展示的HBV VLPs免疫的小鼠的血清中和并保护小鼠免受HCV和登革热病毒感染。此外，展示来自HPV16 E7的肽段的HBV VLPs在HPV相关癌症的小鼠模型中抑制肿瘤。 3.源自兽医病毒的VLP候选疫苗 源自感染动物和鱼类的病毒的VLPs也被用来开发针对影响各种动物的病毒的疫苗，包括猪、兔、羊、马、鸡和鱼（表3）。例如，源自猪圆环病毒-2（PCV-2）的VLPs在小鼠中引发更好的抗体反应，优于商业亚单位疫苗。PCV-2与仔猪断奶后多系统消瘦综合征相关。在羊中，用源自蓝舌病病毒的VLPs免疫提供与活疫苗（单价BTV-8）相同的保护水平。在马驹中，用源自三种非洲马病病毒——AHSV-6、AHSV-3和AHSV-1——的嵌合VLPs免疫，引发了针对这些病毒的中和抗体，尽管水平较低。在鸡中，用来自不同亚型/株的流感A病毒的马赛克VLPs免疫，或用源自传染性法氏囊病病毒的VLPs免疫，比商业灭活疫苗（例如，H6N2用于流感病毒）提供更好的保护（表3）。与此同时，在鱼类中，用源自红点石斑鱼神经坏死病毒（RGNNV）的VLPs免疫，将死亡率降低到约3.3%，相比之下，用商业灭活疫苗OceanTect病毒性神经坏死和对照组（死亡率分别为10%和约79%）免疫。此外，用源自大西洋鳕鱼神经坏死病毒的VLPs免疫鱼类，将死亡率降低到14%，相比之下，对照组的死亡率降低到只有约80%。 源自动物病毒的VLPs也被用作平台，开发针对其他病毒感染的候选疫苗（表4）。例如，源自犬细小病毒的VLPs已被用来展示来自中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的肽抗原，VLPs在小鼠中引发平衡的免疫反应；免疫小鼠的血清中和了假MERS-CoV。此外，用展示布鲁氏菌抗原——BCSP31——的新城疫病毒VLPs免疫，提供了针对布鲁氏菌强毒株（16M）的保护；保护水平与商业活疫苗：布鲁氏菌melitensis株M5相似；布鲁氏菌melitensis是一种与布鲁氏菌病相关的人畜共患病。 4.来自植物和细菌病毒的VLP候选疫苗  不仅人类和动物病毒，植物病毒和细菌病毒也已被用于开发VLPs。使用各种病毒开发了植物源VLPs，如苜蓿花叶病毒（AMV）、冬葵花叶病毒（PhMV）、马铃薯Y病毒（PVY）、黄瓜花叶病毒和锦葵花叶病毒（MaMV）（表5）。展示疟原虫（Pfs25蛋白）抗原的AMV VLPs在I期临床试验中被证明是安全且可耐受的。展示HER2肽的PhMV VLPs被发现可以减缓小鼠的肿瘤生长并延迟其死亡。此外，展示家猫过敏原肽——Feline domesticus——的PVY VLPs引发了针对抗原的高抗体滴度。而且，用展示犬流感病毒H3N8抗原的MaMV免疫的小鼠，与对照小鼠不同，能够保护小鼠免受同源和异源小鼠适应性流感病毒株的致命挑战。 在感染细菌的病毒（噬菌体或phages）的另一侧，已从噬菌体AP205、MS2、PP7、Qβ、P22等开发了VLPs（表6）。用展示HPV肽的MS2和PP7 VLPs免疫可以保护小鼠免受与癌症相关的11种HPV假病毒类型的感染。噬菌体VLPs也已被用于癌症研究。展示来自卵清蛋白的B细胞和T细胞表位的噬菌体P22 VLPs抑制了小鼠中EG.7-OVA淋巴瘤细胞。总的来说，来自感染人类、动物、植物和细菌的病毒的VLPs已被用来开发针对传染病代理以及代谢性疾病的疫苗/候选疫苗。表1-6提供了从各种病毒开发的不同VLPs及其潜在应用的概览。 5.专家评审评论和未来展望  VLP疫苗是蛋白质，因此它们不能像其他重组疫苗（如病毒载体疫苗和mRNA疫苗）那样在体内扩增（即转录和翻译以制作更多副本）。尽管如此，VLP疫苗是这两种重组疫苗的更好替代品。VLP疫苗不需要像mRNA疫苗那样在-20至-80°C的冷冻条件下运输和储存。此外，一旦VLPs被注入体内，它们就会立即被APCs处理，不像DNA和mRNA疫苗，细胞首先需要转录（对于DNA疫苗）并将其mRNA翻译成蛋白质，然后才能被APCs处理并呈递给免疫系统。 VLP疫苗也是传统疫苗（减毒活疫苗和灭活疫苗）的更好替代品，原因有几个：首先，VLP疫苗不复制，因此它们可以用于每个人，包括孕妇或免疫系统受损的人。此外，来自具有分段基因组的病毒（例如，流感病毒、AHSV和蓝舌病病毒）的衣壳蛋白——包括其他结构蛋白——也可以用来开发杂交/马赛克VLP疫苗，而不必担心基因重组，就像在减毒活疫苗中那样。具有分段基因组的病毒有能力进行基因重组；不幸的是，一种由AHSV衍生的减毒多价疫苗导致了AHSV 1型的毒力反转和与AHSV 1、3和4型的基因组重组，导致AHSV的零星爆发。第二，VLPs与真实病毒的结构非常相似，不像灭活疫苗，其结构蛋白可能在灭活过程中被修改，导致免疫原性受损。因此，VLP疫苗是灭活疫苗的更好替代品。它们在较低剂量下也具有免疫原性；事实上，研究表明，用0.3微克的候选狂犬病病毒VLP疫苗免疫引发的抗体滴度与用3微克的VLPs或兽医和人类疫苗免疫相当。 尽管VLP疫苗在较小剂量下具有免疫原性，但目前尚不清楚较小剂量的VLPs是否能为具有不同基因型的病毒（如HBV（至少有九种基因型）、HPV（与癌症相关的20多种类型）或HEV（至少有七种基因型））提供长期保护。如上所述，基于VLP的疫苗提供的免疫反应对不同HBV、HPV和HEV基因型提供交叉保护，但对其他基因型或逃逸突变株（例如，HBV）的保护较少。这些疫苗的剂量至少为每次免疫10微克（例如，用于HBV的Engerix-B）；因此，减少每次免疫的剂量可能不会增强交叉保护。我们认为，增加VLPs（一般抗原）的浓度或增加加强剂量的数量可能会增强交叉保护。例如，研究表明，与10微克相比，较高剂量的抗原（例如，90微克）可以增强对流感病毒亚型和小鼠存活率的交叉保护。同样，用高剂量（106空斑形成单位）的ASFV疫苗免疫可以完全交叉保护ASFV株，而用一半剂量免疫则只能提供部分交叉保护。 因此，针对感兴趣病毒的基于VLP的疫苗应该引发针对感兴趣病毒的所有基因型的交叉保护性免疫，以确保全球效力，考虑到基因型的分布在不同地理区域之间有所不同。例如，HBV基因型在不同大陆之间有所不同，A型在北美、南美、非洲和欧洲更为普遍，而B型和C型在东南亚和东亚更为普遍。D型在西亚、中亚和南亚以及欧洲更为普遍。用于全球使用的基于VLP的HBV疫苗应该提供针对所有HBV基因型的保护，无论个人居住在哪里。HPV和HEV疫苗也是如此。尽管已经通过开发Gadarsil-9来扩大对在世界其他地区普遍的致癌HPV类型（HPV16、18、31、33、45、52和58）的保护范围（如上所述），但仍有一些与10%的宫颈癌相关的HPV类型（例如HPV35、39、51、59等），疫苗不提供保护。例如，虽然Gadarsil-9为非洲、欧洲、北美和拉丁美洲及加勒比地区的大多数与约90%的宫颈癌病例相关的HPV类型提供了保护，但它在澳大利亚和亚洲分别只提供了86.5%和87.5%的保护。该疫苗不保护与非洲3.4%的宫颈癌病例、亚洲1.6%、拉丁美洲和加勒比地区2.3%、澳大利亚1.8%和欧洲1.4%相关的HPV35。HPV56是另一种普遍的HPV类型，疫苗不提供保护，它与欧洲和非洲1.4%的宫颈癌病例以及北美1.0%的病例相关。开发一种14价候选疫苗（包括Gadarsail-9未涵盖的HPV35、39、51、56和59），将在全球范围内保护上述HPV类型。 要在全球范围内有效，基于HEV的VLP疫苗，如Hecolin，必须提供针对在世界各地不同地理区域普遍的四种HEV基因型（HEV1-4）的保护。如上所述，Hecolin疫苗源自HEV基因型1，它对基因型2和4提供交叉保护。疫苗还预计将对基因型3提供一定程度的交叉保护。然而，由于基因型3在全球范围内普遍存在，而基因型1和2主要在亚洲和非洲的发展中国家普遍存在，而疫苗目前正在这些地区进行测试（即在孟加拉国，而不是非洲），至关重要的是要进行包括基因型3在内的其他地区保护研究，以确保疫苗在全球范围内的有效性；基因型4也在中国普遍存在。值得一提的是，Hecolin疫苗是使用细菌表达系统开发的。使用细菌表达系统比使用真核表达系统更便宜。然而，与真核表达系统不同，细菌表达系统缺乏翻译后修饰，如糖基化。尽管缺乏糖基化与一些疫苗的效力较差有关，但这似乎并不适用于Hecolin疫苗；事实上，用该疫苗免疫的猴子完全免受HEV基因型1感染。 如前所述，VLPs（尤其是来自HBV和HPV的VLPs）也被用作展示平台，以增强来自其他传染病（例如细菌和其他病毒）和非传染病（例如癌症）的肽段的免疫原性，最终目标是保护这些代理。然而，使用人类病毒的VLPs作为外来肽段的展示平台存在挑战，因为人类人群中存在针对平台的预先存在的抗体，这些抗体可能来自自然感染或疫苗接种。事实上，一些研究表明，对某些平台的高预先存在的抗体水平可能会降低平台的免疫原性以及平台展示的异源抗原的有效性。例如，儿童体内对脊髓灰质炎病毒的预先存在的母体抗体已被证明在儿童接种相同抗原后，疫苗效力降低高达28%。为了克服这一限制，可以使用不寄生在人类身上的动物病毒、植物病毒和细菌病毒的VLPs来展示外来肽段。 总体而言，VLPs是用于疫苗开发的多功能和高效平台。它们可以用来开发不仅针对它们来源的病毒，而且针对其他传染病和非传染病代理的疫苗。此外，它们是开发针对具有分段基因组的病毒（尤其是那些通过昆虫传播的病毒，例如AHSV）的杂交/马赛克疫苗的极好平台。它们在昆虫体内无法复制，降低了减毒活疫苗可能发生的重组事件的风险。此外，针对AHSV等病毒的基于VLP的疫苗还可能有助于区分已接种疫苗的马匹和感染的马匹，这在使用减毒活疫苗时可能是一个挑战。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 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摘要：疫苗是改善健康影响最大的药物。尽管对病原体非常有效，但癌症疫苗仍然是一个未兑现的承诺。然而，RNA技术的最新进展，加上科学和临床上的突破，加速了肿瘤抗原的发现和有效递送，使癌症疫苗成为一个诱人的前景。尽管我们正处于一个关键的转折点，未来几年将有多项随机临床试验成熟，但仍有几个关键问题：哪些抗原、肿瘤、平台和宿主能触发具有临床影响的强大免疫反应？在这里，我们用一个从抗原检测到递送的癌症疫苗原则框架来解决这些问题。通过这个框架，我们概述了使RNA技术能够快速、强大、实时地进行体细胞突变衍生的新抗原疫苗接种的特点——这是一种新兴的“理想”抗原类别——并强调了激发了人们对RNA能够实现对抗癌症疫苗持久愿景的信念的潜在特点。 1.引言 癌症免疫疗法的成功证明了免疫系统的力量可以被释放来对抗癌症。这些包括免疫检查点抑制剂（ICIs）和经过改造的T细胞在内的巨大进步，都建立在数十年关于T细胞如何识别同源抗原的发现之上，并将免疫疗法确立为肿瘤学的支柱。然而，该领域仍面临重大挑战——只有约20%的癌症对现有方法有反应，迫切需要为对当前药物不敏感的80%的癌症识别新的、有效的免疫疗法。尽管基础免疫学稳步揭示了启动、增强和维持T细胞识别癌症抗原的新策略，但值得注意的是，最成功的癌症免疫疗法都围绕着T细胞受体（TCR）与其同源抗原之间的基本相互作用。这照亮了一条道路，将最具影响力的药物应用于利用T细胞-抗原识别——疫苗——对抗癌症。 2.疫苗原则：从病原体到癌症 针对病原体的疫苗可以说是预防疾病最成功的药物。疫苗——递送抗原以诱导特定抗原免疫的药物——的成功根植于治疗性地利用免疫记忆的内在电路。也就是说，外来抗原激活免疫细胞清除威胁，并赋予一部分激活的细胞长期存在并在抗原再次暴露时重新扩张的能力。因此，预防性抗原保护未来遭遇，这是一个优雅且高效的解决方案，以保护宿主免受病原体侵害。 然而，尽管数十年来一直尝试，利用这一免疫框架对抗癌症却取得了令人失望的临床结果。然而，最近的证据表明人类T细胞能够识别转化细胞，并可以治疗性地利用，这激发了将以往癌症疫苗失败与成功病原体疫苗原则进行更密切比较的动力。作为一种有效的疫苗——无论是针对病原体还是癌症——必须从根本上向理想的宿主递送最佳抗原以激活免疫记忆，癌症疫苗的关键要素将进一步讨论（图1）。 图1. 有效的癌症疫苗需要四个关键要素 有效的癌症疫苗必须利用抗原（特异性、免疫原性、最小性、价性）、传递系统（模块化、佐剂性、速度、规模、安全性）和宿主（健康状况）的最佳特征，以持久激活目标免疫细胞（CD8+和/或CD4+ T细胞）。缩写如下：APC，抗原呈递细胞。© 2024 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Memorial Hospital for Cancer and Allied Diseases, and Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, each in New York, NY. 版权所有，经许可转载。 2.1.目标抗原 疫苗最关键的组成部分是抗原（框1）。对于病原体，疫苗可以被广泛分类为抗原不可知和抗原特异性。 2.1.1.抗原不可知疫苗 抗原不可知的减毒活疫苗递送抗原和佐剂（框1），使用失去致病性但保留抗原性和佐剂性的灭活微生物。这些疫苗，如针对天花、黄热病、麻疹、腮腺炎、风疹和水痘等不变病原体的疫苗，不需要事先选择抗原，并能引发强烈的细胞和体液反应，模仿自然感染的保护性免疫。甚至单次免疫接种也能提供长达数十年的免疫。在癌症中，类似的概念是使用辐照肿瘤细胞、用自体肿瘤细胞裂解物脉冲的树突状细胞（DCs）或异质肿瘤细胞系产生的全细胞疫苗。由于这种方法同样是抗原不可知的，理论上它广泛捕获了多种癌症克隆的癌症抗原，并规避了对个别癌症或患者进行抗原选择。为了诱导抗原摄取和启动，全肿瘤细胞和DC疫苗通常与“功能性佐剂”（如刺激DCs、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞的细胞因子、趋化因子或共刺激分子，例如GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、TNF-a或IFN-g）结合使用。尽管全肿瘤细胞疫苗在临床前模型中可能有效，但临床效果大多有限，这表明抗原不可知疫苗与全细胞的概念——尽管在缺乏致病性微生物的情况下是可行的——不能线性应用于癌症。与递送基因组简单、克隆群体的减毒病原体疫苗不同，全肿瘤细胞具有更复杂的基因组，这可能会用非免疫原性的自身抗原稀释相关的免疫原性抗原。尽管尚不清楚临床效果不佳是否是由于不精确的抗原选择和递送，但鉴于最近技术进步使能够快速实时识别和递送肿瘤特异性抗原，当前疫苗大多是抗原特异性的。 2.1.2.抗原特异性疫苗 与抗原不可知的减毒活疫苗不同，抗原特异性疫苗（也称为亚单位疫苗）选择并递送免疫原性抗原（例如乙型肝炎病毒中的重组蛋白、白喉和破伤风中的灭活毒素、肺炎球菌中的细菌多糖，以及与更免疫原性载体结合的流感B型和脑膜炎球菌中的弱抗原），与佐剂复合。 目前，大多数癌症疫苗类似于病原体亚单位疫苗。这种方法需要事先为特定癌症或个体肿瘤选择抗原，这带来了根本性的挑战。与病原体不同，癌细胞是宿主衍生的，具有大量的“自我”抗原，受到中枢和外周耐受的限制（框1），因此缺乏宿主外周T细胞库中的同源抗原特异性T细胞。单个癌细胞也可能包含一系列具有不同免疫原性的“非自我”抗原。因此，最佳癌症疫苗抗原必须足够（1）癌症特异性，以限制对健康组织的非目标免疫，（2）“非自我”以在外周库中有功能性抗原特异性T细胞，这些细胞可以在抗原递送后扩展，以及（3）免疫优势以最大化对个体癌细胞的免疫反应。快速且大规模地识别最佳癌症抗原的能力一直是限制癌症疫苗发展的一个关键瓶颈。 为疫苗选择最佳癌症抗原可能具有挑战性，不仅在单个癌细胞内，而且在癌细胞集合中也是如此。由于肿瘤是遗传异质性的转化细胞集合，不同的克隆群体可能具有不同的抗原库，类似于病原体血清型。此外，这些抗原可能在内源性或治疗诱导的免疫选择压力下随时间演变，从而改变抗原层次。因此，癌症疫苗接种类似于针对快速演变的群体进行疫苗接种，类似于季节性病毒疫苗。这种假设强调了需要平衡疫苗的“最小性”、“价性”和“持久性”（框1）——即用最少的主要和次要抗原对单个克隆进行疫苗接种，广泛疫苗接种以覆盖所有癌症克隆和亚克隆，以及频繁重新采样抗原和重新疫苗接种以维持随着克隆组成演变的保护。 总之，我们认为必须选择癌症抗原以优化五个疫苗特征（图1）——特异性、免疫原性、最小性、价性和持久性。 2.2.目标递送 最佳疫苗平台必须安全地以速度、规模和强度递送抗原，同时保留上述五个关键特征。疫苗平台包括基于细胞的、基于蛋白质/肽的和基于核酸的。在这里，我们专注于RNA，它已成为创建满足前述要求的癌症疫苗的有吸引力的平台（图2）。 典型的RNA疫苗是通过体外转录（IVT）在无细胞系统中将线性化的质粒DNA模板转录成RNA，以产生模仿内源RNA结构的RNA，包括50帽、50和30非翻译区（UTRs）、开放阅读框（ORF）和聚（A）尾。通过IVT生成的RNA与传递载体复合，通常为脂质，它封装并保护RNA免于降解，并通过巨胞饮、内溶体合并和内体逃逸将RNA有效载荷传递到目标细胞的细胞质中。在细胞质中，RNA作为翻译模板产生蛋白质。翻译的蛋白质被蛋白酶降解成短肽，并用于在主要组织相容性复合体（MHC；框1）分子上呈现。RNA对癌症疫苗的关键优势包括以下几点。 图2. RNA实现快速、强效、模块化和安全的疫苗接种 RNA能够实现可行的抗原传递、内在的佐剂性以及多功能的模块化，通过多种平台和途径安全地传递任何抗原。缩写如下：UTR，非翻译区；ORF，开放阅读框。© 2024 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Memorial Hospital for Cancer and Allied Diseases, and Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, each in New York, NY. 版权所有，经许可转载。 2.2.1.抗原递送和模块性 RNA可以同时编码多种蛋白质，无需体外细胞培养或蛋白质工程。由于RNA制造是序列独立的，它可以生成细胞或基于蛋白质技术无法制造的蛋白质，这是基于肽疫苗的优势。序列修改可以进一步优化RNA半衰期、反应原性、免疫原性、稳定性和翻译。这种模块性使得可以快速更新几乎任何目标抗原的制造，具有高度特异性和价性，以确保持久免疫。 2.2.2.佐剂性 RNA分子结合内体（Toll样受体[TLRs] 3、7、8）和细胞质（RIG-I、MDA5、OAS、PKR）RNA传感器，在靶细胞中产生I型干扰素（IFNs），提供强大的内在佐剂性。这一特性省去了外源性佐剂，并理论上将抗原和佐剂递送到同一抗原呈递细胞（APC）以最大化免疫原性。 2.2.3.速度、可扩展性和递送 由于RNA疫苗是直接从DNA模板通过重组酶和核苷酸三磷酸体外转录而成，它们可以快速生成（数小时）并产量高。所有反应组分理论上都可以从商业供应商处获得，作为良好生产规范等级的无细胞产品，使RNA疫苗平台高度可扩展。RNA平台还可以通过简单地更换编码序列来适应生产各种疫苗，提供了巨大的灵活性。RNA可以使用各种传递载体传递到目标细胞，包括体外和体内。RNA支持快速、高度可扩展疫苗制造的能力在COVID-19 RNA疫苗开发的速度和规模上得到了壮观的展示。 2.2.4.安全性 RNA是一种非传染性、非整合性分子（即没有插入突变或永久改变宿主基因组的风险），它通过正常的细胞过程降解，这限制了分子半衰期并防止了免疫过度刺激。此外，由于癌症疫苗可能需要针对不断演变的肿瘤进行重复剂量，RNA是合适的，因为它是一个最小的基因载体，没有抗载体免疫的风险。最近针对COVID-19的RNA疫苗的广泛应用进一步证实了RNA疫苗的高度有利的安全剖面。一致地，对于癌症疫苗，到目前为止只观察到轻微到中度的不良事件，包括全身反应如头痛、疲劳和发热。 2.3.目标宿主 从概念上讲，理想的宿主是那些在最小抗原暴露下触发最大长期免疫记忆的宿主。为了实现对传染病的这种记忆，病原体疫苗用于初级预防（即预防性疫苗）。 癌症疫苗，像病原体疫苗一样，旨在传递抗原以激活保护性免疫记忆，类似的宿主健康特征可能增强免疫力。因此，就像对抗传染病一样，这需要接种“免疫最健康”的宿主——在癌症中，这可能等同于“疾病最轻微”的宿主，以在疾病发作或复发前产生免疫力。在癌症中，宿主特征可以为预防性疫苗（即，预防癌症发作）优化的概念现在已经在病毒驱动的癌症中被证明是可行的，早期研究表明，这在二级预防（即，预防癌症复发）中也可能是可行的。然而，大多数先前的临床癌症疫苗都是在晚期癌症宿主中部署的，因此可能存在广泛的免疫学损害，例如抗原呈递的缺陷、T细胞激活的抑制以及肿瘤内交通的损害等。这些多因素宿主免疫失调可能损害疫苗诱导的抗原特异性免疫，并可能解释了早期癌症疫苗临床效果信号较弱的原因。 在晚期癌症患者中测试疫苗和其他免疫疗法药物的范式也反映了一种历史药物开发方法，这种方法针对直接针对癌细胞的细胞毒素，如化疗和靶向疗法。然而，疫苗作为前药，必须激活宿主免疫细胞，而这些细胞又必须保持长期功能。因此，我们认为疫苗单药疗法应该在能够产生和维持长期记忆和功能的宿主中部署——这在最小疾病宿主中可能是最大的，疫苗旨在用于癌症的一级或二级预防。支持这一点的是，几项针对晚期疾病患者的癌症疫苗临床试验显示了有限的临床效果，而最近在最小残留疾病患者中进行的疫苗试验显示了更强大的疫苗诱导免疫。 2.4.目标细胞 大多数病原体疫苗刺激B细胞产生中和抗体，这些抗体主要识别细胞外蛋白。这些抗体通过结合同源表位来中和病原体毒素、抑制病原体进入或通过吞噬作用、补体固定、抗体依赖性细胞毒性或其他机制杀死病原体，以保护宿主。 尽管体液反应可能在免疫肿瘤学中发挥作用，但大多数癌症免疫疗法针对的是细胞免疫，因为T细胞具有内在的细胞毒性能力，并且能够识别由MHC分子在转化细胞中呈递的细胞内抗原。因此，当前的疫苗优先考虑CD8+ T细胞，它们能够识别人类癌症抗原并通过多种机制溶解目标细胞。此外，由于持久的免疫力是疫苗的一个关键特征，因此最大化长寿命记忆CD8+ T细胞的策略也是可取的。然而，越来越多的证据表明，除了CD8+ T细胞外，CD4+ T细胞在自发性和治疗性免疫中，包括疫苗中，也起着关键作用。因此，癌症疫苗的最佳目标细胞和细胞亚群仍在不断发展。 3.新抗原作为最佳靶标抗原 作为疫苗最关键的组成部分，抗原有三个特征定义了一个能够激发特定、强大、持久且最小自身反应的强效癌症疫苗抗原：肿瘤特异性、免疫原性和克隆性。尽管癌症抗原可以来自几个类别，例如在癌细胞中选择性或过度表达的蛋白质，包括来自病毒的蛋白质，但最近从癌症特异性遗传变异中产生的新抗原（Box 1）已经成为一个理想的疫苗抗原类别。 3.1.特异性 随着癌细胞的分裂，它们累积了各种遗传变异，最常见的是非同义突变，以及插入/缺失（indels）、新融合基因产物和选择性剪接RNA转录本。 这些遗传变异的一部分产生了正常组织中不存在的新蛋白质，称为“新抗原”。最近的研究表明，新抗原在人类癌症中刺激内源性T细胞，并且它们的存在与多种癌症中的T细胞活性相关。此外，癌症新抗原是生存的预后因素，受到自发编辑的影响，并且诱导临床免疫疗法的成功。因此，新抗原是肿瘤特异性的、由肿瘤发生产生的基本副产品，使免疫系统能够识别癌细胞，因此是理想的癌症疫苗抗原类别。 目前，由于新抗原必须在实时中快速识别以产生临床疫苗，计算技术仍然是识别新抗原的主要方式。在这里，下一代测序（NGS；全外显子或全基因组与RNA测序和患者特异性人类白细胞抗原[HLA]分型）识别在正常组织中不存在的肿瘤中表达的突变作为新抗原。新抗原是否可以通过较少侵入性的肿瘤细胞采样方法（例如，循环肿瘤DNA或其他检测液体活检中的肿瘤DNA的策略）被检测到，仍然是一个正在进行的研究领域。 3.2.免疫原性 尽管NGS识别了癌症特异性新抗原，但新抗原的免疫原性各不相同。因此，使用专门的下游计算策略进一步选择和排名免疫原性部分。尽管目前可用的计算工具准确性有限，但它们仍然是当今临床预测策略的主流。 目前，一个免疫原性新抗原必须满足两个要求：新抗原必须产生一个结合MHC-I或MHC-II分子的新表位（Box 1），并且呈现的新表位必须逃避宿主耐受性，以在库中繁殖并激活同源TCR（识别）。计算工具分别估计每个要求。 3.2.1.估计呈递 翻译。在通过NGS识别突变后，通常通过RNA测序获得的RNA表达可以估计一个突变是否被翻译成蛋白质以及翻译蛋白质的丰度。将RNA转录本丰度纳入新抗原识别的理由是观察到较高的RNA转录本丰度可以抵消较低的肽-MHC结合亲和力。一致地，转录本表达幅度与肽-MHC复合物密度相关，具有较高转录本的新抗原是T细胞的靶标，并且转录本下调被认为是一种补偿性免疫逃逸机制。对于疫苗来说，转录本表达已被用于优先选择疫苗的新抗原。MHC结合。一个翻译后的新抗原被呈递给T细胞，如果它产生一个结合MHC I或MHC II分子的新表位（Box 1）。 为了识别结合在宿主MHC分子上的表位，理想情况下，需要分离肿瘤细胞，并通过液相色谱与串联质谱法鉴定结合到患者特异性HLA等位基因上的肽段。这种方法理论上可以捕获最广泛的MHC呈递肽段，并且可以包括翻译后修饰和非典型抗原（即来自编码区序列之外的抗原，以及非典型抗原处理机制）。 尽管这种方法可以鉴定肿瘤抗原，但它需要实时的体外抗原纯化，这限制了快速和大规模检测抗原的能力。这一挑战，加上获取足够新鲜实体瘤样本的技术障碍，以及低灵敏度和样本重现性，限制了免疫肽组学在临床新抗原检测中的当前应用。 为了匹配临床检测新抗原所需的速度和规模，各种计算工具被用来估计新抗原是否能产生结合患者特异性HLA分子的新表位。这些计算工具是基于神经网络构建的，它们在体外实验测量的MHC-新表位结合亲和力和人类及小鼠的质谱免疫肽组上进行训练。这些工具倾向于更常见的HLA等位基因，尽管已有努力利用MHC序列同源性来估计与罕见HLA等位基因的表位结合亲和力，这些罕见等位基因的实验数据很少。其他工具模拟了MHC结合之前的分子途径，例如蛋白酶体切割和内质网转运，以及其他结合特征，例如MHC-新表位稳定性，但这些额外参数是否提供额外的准确性仍然不清楚，因为当前的结合工具是在包括这些早期步骤的MHC洗脱配体上训练的。绝对结合亲和力的不准确性可以通过测量相对或与野生型（WT）表位的差异结合亲和力来抵消。然而，预测体内免疫原性的最优结合阈值仍然不清楚，因为具有低预测结合亲和力的新抗原在体内可能是免疫原性的。 3.2.2.估计T细胞识别 并非所有MHC结合的新表位都会被T细胞识别。相反，由于中心和外周耐受性会删除和失活与高亲和力的生殖系编码MHC结合自身肽段的TCR，因此，幼稚的外周库缺乏识别自身表位并与抗原性相似的新表位交叉反应的TCR。因此，只有与WT表位足够“抗原性距离”的新表位才可能逃避中心和外周耐受性，并在库中具有同源TCR。与呈递不同，呈递在当前新抗原选择流程中研究得更好并被纳入，而识别则较少，目前通过以下策略进行估计。 自身相似性和不相似性。与WT肽段的差异性可以识别足够抗原性距离以使其具有免疫原性的新抗原。差异性通过与人类蛋白质组、WT表位的差异性，或者与病原体表位的相似性来估计。确切的生物学原理，即为什么新表位序列与病原体序列的相似性能够改善免疫原性新抗原的预测，尚不清楚——即，是否存在“理想”的表位特征，可被人类TCR库识别，或者它是否代表通过预先存在的T细胞对新抗原交叉反应的异源免疫。由于特定TCR的产生是通过生殖系编码序列的重组而发生的，这被认为是随机的，可能重组倾向于产生更频繁和强烈识别某些抗原的TCR。虽然缺乏直接证据，但这种可能的库对偏好识别具有“外来性”特征的肽段的固有倾斜可能解释了为什么自身不相似性的代理增强了免疫原性新抗原预测。 类似于不相似性，自身相似性可以识别与WT表位过于抗原性相似的新抗原，因此受到宿主耐受性的影响。最近的努力已经确定，对于由单个氨基酸替换产生的表位，替换大小、疏水性、生化家族和位置（即，TCR-肽-MHC接触区之外的替换）可以广泛估计表位之间的抗原相似性。总体而言，估计自身相似性和不相似性的稳健框架依赖于实验验证，这是完善和测试的活跃领域。 TCR结合。与自身相似性/不相似性不同，它通过比较新肽段与其他肽序列来预测免疫原性新抗原，新肽段-MHC复合物是否直接结合TCR也已被研究，但这是预测免疫原性新抗原最不发达的特征。一些当前策略包括估计氨基酸组成是否有利于与TCRs的相互作用，纳入对配对α和β TCR链的训练数据，以及基于迁移学习的模型来预测TCR-新抗原结合特异性。 黑箱方法。尽管当前的工具，如神经网络，可以熟练地提供现成的模型结构来分类新抗原识别的各个方面，但机器学习的最新进展可能允许自然改进现有方法来预测免疫原性新抗原。由于这些方法需要更大的实验数据集，它们可能随着这些数据的可用性而变得更加可行。 3.3.克隆性 由于癌症是由具有不同突变集合的不同肿瘤克隆组成的异质混合物，因此疫苗需要完全针对这种异质群体，以避免未靶向克隆的无限制生长。因此，新抗原靶标选择应最大化肿瘤克隆覆盖。为此，采用两种策略：针对（1）来自（如驱动突变）的截断突变的新抗原，以及（2）完全涵盖所有肿瘤克隆的乘客突变集合。特定策略是否诱导更持久的T细胞反应仍然未知。 3.3.1.截断新抗原 针对截断突变有几个吸引人的优势——由于它们在定义上存在于绝大多数肿瘤克隆中，它们满足了最大化肿瘤克隆覆盖的要求。此外，如果截断突变是驱动因素，诱导的免疫可能针对癌细胞的致癌功能。尽管在治疗上理想，但大多数驱动内源性免疫的免疫原性新抗原似乎不是截断的，因为免疫原性新抗原将受到T细胞选择压力，使免疫原性新抗原在癌细胞进化过程中变为亚克隆。此外，有证据表明，由于MHC-I呈递不佳和可能选择具有较弱免疫原性的驱动突变的进化压力，驱动突变可能是较弱的抗原。一致地，尽管已有报道称肿瘤突变的体外免疫原性，但免疫原性驱动新抗原很少见，并且似乎不是主要的内源性免疫靶标。尽管克隆新抗原的存在与增强对ICIs的免疫反应相关，这些ICIs放大了新抗原特异性T细胞，并且早期工作表明克隆肿瘤的存在可能与增强的疫苗免疫相关，但如果这种相关性意味着肿瘤、新抗原或两者的致敏特征仍然不清楚。尽管如此，针对在各种癌症类型和患者中常见的驱动新抗原，如在突变的KRAS或TP53中产生的新抗原，仍然是许多正在进行的努力开发高度可扩展的现成疫苗的重点，最近的KRAS肽疫苗试验显示在一部分患者中可测量的免疫反应。 3.3.2.乘客新抗原 针对乘客突变的策略有一个缺点，它们发生在肿瘤发生的后期，并且通常是亚克隆的。它们也可以驱动内源性免疫，受到编辑，因此会不断进化。然而，由于它们构成了一个更大的多样化的癌细胞特异性抗原库，它们允许选择最有力而不是最普遍的抗原。此外，由于乘客突变在功能上可能与致癌性相比更脱钩，它们可能会在长期内最小化疫苗抗性。事实上，目前大多数团队选择具有保守免疫原性特征的乘客新抗原，而不是最普遍的新抗原，用于疫苗（表1）。 为了选择覆盖所有肿瘤克隆的疫苗乘客新抗原，必须确定肿瘤克隆结构，将新抗原映射到克隆上。目前，这是通过从大量DNA测序（全外显子或全基因组）中计算每个突变的变异等位基因频率（VAFs），将VAFs聚类到克隆中，然后构建系统发育树来实现的。此外，选择不同克隆中不同的新抗原疫苗靶标，以最大化疫苗价力，既可以提高免疫反应的概率，最大化诱导疫苗免疫的克隆覆盖，理论上也可以最小化克隆生长。直接使用单细胞技术（如单细胞DNA测序）实验测量肿瘤克隆结构和异质性，目前尚未在临床上适用。 3.4.疫苗新抗原选择的其他考虑因素 3.4.1.热肿瘤和冷肿瘤 新抗原选择原则可能在具有更强（热）和较弱/缺失（冷）内源性免疫针对新抗原的肿瘤中有所不同。 免疫学上的“热”肿瘤显示出针对新抗原的更强内源性T细胞免疫。这些肿瘤通常突变程度较高（例如，黑色素瘤、非小细胞肺癌、错配修复缺陷癌症），具有足够的内源性新抗原特异性T细胞免疫，使肿瘤对ICIs的免疫增强敏感。因此，疫苗新抗原必须从抑制宿主抑制途径的主导内源性靶标中选择，从不驱动内源性免疫的亚主导新抗原中选择，或两者的组合。针对主导内源性靶标可以使与ICIs的合理组合进一步放大新抗原特异性T细胞；然而，疫苗单药疗法可以重新放大ICI增强的新抗原特异性T细胞以驱动临床效益的程度仍然不清楚。一种可能性是，对于热肿瘤，ICIs增强的主导新抗原特异性免疫，针对亚主导新抗原的疫苗将扩大和堆叠免疫反应，以赋予持久性。 免疫学上的冷肿瘤表现出针对新抗原的较弱内源性T细胞免疫。这些肿瘤通常突变程度低/中等，只有少数患者表现出针对肿瘤新抗原的自发性T细胞免疫，这间接支持了缺乏预先存在的、被抑制的新抗原特异性T细胞，这些T细胞会使肿瘤对ICIs敏感。历史上，这些肿瘤被认为是不适合疫苗的，因为它们的突变数量少，因此产生适合疫苗的新抗原的可能性低。几个团队挑战了这一概念，证明突变程度低的癌症，如结肠癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤，确实含有新抗原，这些新抗原可以预测临床结果，驱动选择患者的内源性T细胞，并且可以通过疫苗增强治疗效果。在这里，大多数患者将通过疫苗对新抗原进行新的T细胞启动。此外，由于激活的T细胞在初次启动后上调免疫检查点，疫苗可以与ICIs协同作用。观察到疫苗可以在冷肿瘤中诱导强大的免疫反应，这包括目前对ICIs不敏感的80%的癌症，可能特别重要，鉴于它们巨大的未满足需求，总体预后差，重大的全球医疗负担，以及继续依赖上一代细胞毒素药物，如化疗，作为当前的临床标准。 3.4.2.新抗原的数量、类型、位置和演变 疫苗的最佳新抗原数量仍然不清楚。当前的个性化疫苗接种策略包括多个新抗原，最近的试验中从20到34不等（表1），主要是为了最大化价力。虽然理论上可以将整个突变组纳入疫苗，但疫苗中的更多新抗原可能导致免疫优势，减弱对亚主导和可能更具临床相关性靶标的免疫。理论上，理想的疫苗新抗原数量不应是一个预定的数量，而是最大化最小性和价力所需的最小新抗原数量。此外，尽管MHC-I限制的新抗原驱动CD8+ T细胞被认为是有效癌症疫苗的主要靶标，但MHC-II新抗原在小鼠模型中实现了最佳的抗肿瘤免疫，并且也应该纳入疫苗中。 如果新抗原是内源性T细胞靶标，它们可能会受到免疫选择压力，并随着肿瘤的进展而演变。因此，新抗原的组成和层次可能在原发和复发/转移部位之间有所不同，需要对多个肿瘤的患者进行多点采样。类似地，由于这也可能影响疫苗接种后演变的肿瘤，可能需要重新采样新出现的肿瘤，并用新的新抗原靶标重新接种疫苗，以实现持久的反应。 4.RNA作为最佳疫苗平台 RNA最初被认为是一种不稳定的分子，容易被细胞外的RNA酶降解，因此不适合作为治疗剂。然而，通过坚持不懈的科学努力，对RNA细胞摄取、分子稳定性和蛋白质翻译进行工程化和修饰，导致了1990年首个基于RNA的疫苗的出现。这些进步，以及Kariko和Weissmann获得诺贝尔奖的发现，即mRNA基础修饰可以避免被先天免疫受体不必要的免疫识别，共同改变了我们对如何在体内工程化和传递mRNA给细胞的理解，为有效的mRNA疗法奠定了基础。 4.1.优化稳定性和翻译 为了增强RNA稳定性、优化翻译并增加抗原传递，通常使用一系列药理学RNA修饰。治疗性RNA编码序列可以被50和30 UTR元素所包围，通常来自自然表达的α和β球蛋白RNA，具有可以增加RNA半衰期和蛋白质翻译的50帽状结构。新型合成50序列也可以增强RNA的可用性并增强抗原呈递。合成帽状类似物和加帽酶进一步增加蛋白质翻译。最佳的聚(A)尾巴（带有自由30端的120个核苷酸）可以防止RNA被外切酶降解并增强RNA翻译和稳定性。密码子优化和G-C含量富集可以进一步改善蛋白质翻译，并通过算法获得。在ORF中的序列修饰，如MHC-I转运域和与溶酶体相关的膜蛋白，可以将有效载荷定向到溶酶体隔室，并在MHC-I和MHC-II上提高抗原呈递效率。ORF可以通过连接序列连接，最近的一项研究表明，基于丙氨酸的连接序列可能比基于甘氨酸的连接序列更增加抗原处理和呈递。最后，修饰的核苷类似物可以增加翻译。尽管最近的一项研究表明某些核苷修饰可能导致移码，但这一点的重要性仍然不清楚。 RNA的固有佐剂性可以触发强大的I型IFN产生，但也可能抑制蛋白质翻译。因此，限制RNA佐剂性的策略已经被纳入RNA药物产品设计和制造中。一个不希望的先天刺激是IVT反应中产生的双链(ds) RNA污染物。由于dsRNA触发病原体关联分子模式，包括TLR3、RIG-I、MDA-5和NLRP3，以产生I型IFNs，因此，通过反向相快速蛋白液相色谱和高性能液相色谱从酶制备的RNA中消除dsRNA的策略已经被Kariko、Weissman和同事开创。这种纯化进一步在原代人类DCs中将蛋白质翻译提高多达1000倍。为了限制来自单链RNA的先天刺激，用天然发生的化学修饰核苷类似物修饰的RNA，如假尿苷或N1-甲基假尿苷，进一步限制了TLR3、TLR7和其他先天感应器产生的I型IFN，同时抑制了dsRNA识别，从而也在体外和小鼠体内提高了蛋白质产量。这种修饰的RNA疫苗在预防COVID-19方面引起了高度有效的保护性免疫，并且已经获得食品和药物管理局的批准，有几种其他核苷修饰的RNA病原体疫苗正在进行临床开发。 由于抗癌免疫的主要免疫臂是直接和间接使用I型IFNs的CD8+ T细胞，I型IFNs在癌症疫苗佐剂性中可能发挥更关键的作用。事实上，I型IFN受体缺陷（Ifnar1或Ifnar2）增加了小鼠化学致癌诱导的肉瘤发病率，Ifnar1-/- DCs显示出向CD8+ T细胞交叉呈递肿瘤抗原的受损，并未能拒绝免疫原性肿瘤。I型IFNs还诱导DC成熟和淋巴结迁移，增加细胞毒性T细胞中的穿孔素I和颗粒酶B表达，并促进记忆T细胞的存活，突出了I型IFNs在宿主对转化细胞反应中的重要性。一致地，在使用未修饰RNA疫苗的临床癌症模型中，Sahin和同事报告说，IFNAR缺陷（Ifnar1-/-小鼠）和抗IFNAR1阻断损害了DC激活，CD8+ T细胞获得颗粒酶B、IFN-g、TNF-α和脱颗粒功能，并减弱了体内抗肿瘤疫苗效力。此外，Seder和同事使用一种激活TLR7/8的自组装纳米颗粒疫苗的小鼠结肠癌模型，显示I型IFN消除了抑制性肿瘤内单核细胞，以增强系统性疫苗抗肿瘤效力。未修饰的RNA确实在人类单核细胞中诱导了更高水平的I型IFN反应，迄今为止，大多数RNA癌症疫苗使用未修饰的核苷类似物。 4.2.RNA传递策略 裸露（未配方）RNA可以局部给药，但会被细胞外的RNA酶迅速降解。RNA还具有负电荷的磷酸二酯骨架，体积大（104-106 Da），亲水性，这阻止了它进入阴离子脂质双层和细胞质，在那里它可以被翻译成蛋白质。尽管有几种技术允许RNA在体外培养皿中和在小鼠体内使用物理方法传递，如电穿孔和基因枪穿透细胞膜，但在体内疫苗接种需要将RNA传递给免疫细胞。已经使用了两种方法：体外RNA DC加载与细胞重新输注，以及RNA复合或不复合载体的全身注射。 4.2.1.DC RNA加载 DCs是主要的专业APC，能够激发细胞介导的抗肿瘤免疫，并且对RNA转染非常敏感。这些特性，以及能够直接和特异性地将免疫原传递给APC，使得体外RNA加载具有吸引力。通常通过电穿孔将RNA加载到从患者体内收集的DC上，电穿孔使用高压脉冲创建膜孔，允许RNA进入细胞质。缺点包括需要实时操作自体细胞产品以生成疫苗。这种缺点，以及直接将免疫原传递给体内目标APC的更大简单性，激发了直接RNA传递系统的发展。 4.2.2.RNA的系统给药 最常见的RNA传递系统使用脂质/基于脂质的材料。脂质通过静电相互作用包裹RNA，保持RNA稳定性，防止细胞外RNA酶降解，并使细胞内体摄取，随后通过膜破坏逃脱，允许RNA胞质释放。其他传递系统包括聚合物和基于肽的车辆，如精氨酸。 第一代RNA疫苗使用了阳离子脂质，如1,2-二-O-十八烯-3-三甲基铵丙烷及其合成类似物二油酰-3-三甲基铵丙烷。然而，由于它们的正电荷触发炎症反应，并且为了将这些RNA-脂质复合物(RNA-LPX)从肝脏/肺部重定向到二级淋巴器官和骨髓中的DCs，引入了电荷修饰。使用这种封装策略的RNA疫苗的静脉给药在临床肿瘤模型中产生了强大的抗原特异性CD8+ T细胞，具有效力。 目前，基于脂质的纳米颗粒(LNPs)是疫苗中最常用的RNA传递平台(RNA-LNP)，包括所有SARS-CoV-2 RNA疫苗。LNPs包括四个组成部分——一种阳离子脂质、胆固醇、一种辅助磷脂和一种聚乙二醇化脂质——共同包裹和保护RNA有效载荷。阳离子脂质是LNPs最重要的组成部分——它们促进自组装成病毒大小的颗粒，并且在血清中的生理pH下保持中性电荷，这两者都延长了半衰期并促进了内体摄取（酸性内体环境调节正电荷并介导膜融合和胞质RNA释放）。LNPs的其他组成部分包括胆固醇，它填补脂质间隙以增强纳米颗粒稳定性；辅助脂质，它有助于纳米颗粒流动性并促进脂质相变以协助内体膜融合；以及聚乙二醇化脂质（聚乙二醇与脂质锚结合），它稳定LNP大小，减少RNA聚集和吞噬作用，限制肾脏清除，并增加半衰期。脂质传递车辆不仅可以传递RNA（从而传递抗原），还可以提供内在的佐剂信号。最近的工作表明，脂质可以增强NLRP3炎症体激活，以增强RNA诱导的IL-1b产生，并且激活STING途径以诱导APCs的成熟。 由于传递途径可以影响传递的免疫原的大小和持续时间，从而影响随后免疫的效力，因此正在测试各种传递封装RNA的途径，包括局部（肌肉内、皮内、淋巴结内、鼻内、皮下和肿瘤内）和全身（静脉内、腹腔内、鞘内和气管内）。鉴于直接将有效载荷传递给APCs的明显优势，Sahin和同事的早期研究直接将裸露的RNA注射到二级淋巴器官（腹股沟淋巴结）中，通过巨噬细胞吞噬作用将模型抗原传递给DCs，刺激抗肿瘤免疫，并延长了淋巴瘤和黑色素瘤模型中小鼠的存活时间。类似的结果随后在临床前模型中发现，使用裸露的RNA将肿瘤相关和病毒抗原传递到黑色素瘤、淋巴瘤、肥大细胞瘤、白血病和HPV驱动的癌症的淋巴器官。直接注射到另一个淋巴结（脾脏）也刺激了抗肿瘤免疫并在黑色素瘤小鼠模型中有效。此外，还测试了皮内和皮下疫苗传递，以优化有效载荷转移到皮肤中的APCs，许多APCs位于皮肤中。皮内RNA注射在早期研究中被证明可以延迟免疫原性致癌物质诱导的纤维肉瘤。类似地，皮内疫苗接种被证明可以在自发性前列腺癌模型中触发细胞毒性T细胞。还测试了其他传递途径，包括鼻内、肌肉内和肿瘤内注射RNA，传递固有的RNA佐剂信号或编码的共刺激。 4.3.其他疫苗平台 上述特点突出了RNA作为癌症疫苗有吸引力的传递平台。除了RNA，临床上用于传递新抗原和其他肿瘤抗原的其他传递平台包括合成肽和DNA质粒。肽疫苗已用于预防HPV和乙型肝炎的疫苗，以及作为黑色素瘤和胶质母细胞瘤的新抗原疫苗。尽管肽疫苗具有有利的安全性概况，但基于肽的个性化新抗原疫苗的一个主要缺点是无法制造针对相当一部分序列的临床级新肽，这阻止了对任何已识别的新抗原的无偏疫苗接种。此外，肽疫苗主要产生了CD4+ T细胞，与最近RNA-LPX疫苗可以强烈诱导细胞毒性效应CD8+ T细胞的证据形成对比，尽管这是否是疫苗平台、新抗原选择或肿瘤类型的结果尚不清楚。尽管基于DNA的新抗原疫苗也在临床上使用，并且显示出与RNA类似的理想特征，具有TLR9依赖的内在佐剂性，并且能够编码任何新抗原，但插入突变的可能性仍然是一个潜在的安全缺点。 5.RNA癌症疫苗在临床上 随着检测突变衍生新抗原的工具在临床兼容的时间框架内发展，早期针对实体癌症的RNA癌症疫苗的临床试验集中在共享的肿瘤相关抗原(TAAs)作为“现成”目标。对于有多个可靶向TAAs的前列腺癌，针对晚期患者的四个TAAs的皮内精氨酸配方RNA疫苗的1期和1/2a期临床试验发现，58%的接种患者对多个抗原有反应，但免疫反应在时间上不一致。同样，在Lipo-MERIT试验中，静脉注射RNA-LPX编码TAAs诱导了部分反应，在抗PD-1治疗的晚期/转移性黑色素瘤患者中，50%的目标病变退缩，具有显著强烈的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞反应，包括在选定患者中大约1.2年后可检测到的抗原特异性CD8+ T细胞。 与此同时，NGS和计算生物学的技术进步使得实时、个性化的新抗原预测与临床疫苗接种相兼容。在这种方法中，通过活检或手术切除对肿瘤进行采样、测序、识别新抗原、优先排序、实时制造疫苗，并在大约14周内交付给患者，最近在仅9周内。 6.个性化RNA癌症疫苗的人体首项研究 在13名患有III/IV期黑色素瘤且复发风险高的患者的腹股沟淋巴结中，通过直接注射未修饰的RNA，编码多达10种个性化新抗原。疫苗在所有患者中诱导了针对多种（平均三种）新抗原的特异性免疫反应，其中三分之一的新抗原扩大了预先存在的T细胞，三分之二的新抗原扩大了新的T细胞（57% CD4+，17% CD8+，26%两者都有），这些T细胞展示了多功能细胞因子的产生和溶解能力。总体而言，60%的预测新表位具有免疫原性。新表位特异性T细胞表达了PD-1，PD-1阻断进一步增强了疫苗反应，并且接种疫苗与减少转移相关。这项研究为免疫学上的“热”肿瘤中的个性化新抗原疫苗提供了第一个原理证明，并为随后在热、晚期癌症中的研究奠定了基础。 与上述原则一致，即疫苗可能在疾病最轻微的宿主中诱导最大的免疫活性，我们的团队完成了首个针对胰腺癌的个性化RNA新抗原疫苗的试验——这是一种免疫学上的“冷”癌症，被认为含有很少的新抗原，因此被认为不适合疫苗接种。在这项试验中，手术可切除的胰腺癌患者的肿瘤被切除，然后接受顺序的PD-L1阻断、静脉注射未修饰的RNA-LPXs（编码多达20种个性化新抗原）和化疗。在16名可评估的患者中，疫苗在50%的患者中诱导了高幅度的多功能CD8+ T细胞，包括针对单一（50%）和多种（50%）新抗原的T细胞。与接种疫苗的黑色素瘤患者的发现相反，我们发现PD-L1阻断和疫苗接种扩大了不重叠的T细胞克隆，这可能是因为在胰腺癌中，大多数患者的内源性新抗原特异性免疫反应低/低于阈值，无法用PD-L1阻断来增强，但可以用疫苗来诱导新的反应。一致地，疫苗诱导的T细胞在接种疫苗后长达1.9年的时间内在血液中持续存在。此外，尽管只有24%的预测新抗原具有免疫原性，但有疫苗诱导T细胞的患者表现出延迟复发，这一结果促使全球多中心2期随机试验测试疫苗在胰腺癌中的效力。 7.测量疫苗免疫反应 为了确定新抗原疫苗是否刺激了免疫反应，需要适当的生物标志物。在病原体疫苗中，通过针对病毒组分的血浆抗体滴度来测量B细胞反应，或针对共享病原体表位的肽-MHC四聚体来测量T细胞反应，相对来说比较简单。然而，由于新抗原疫苗诱导对患者特异性抗原的免疫反应，这需要一种策略来追踪可以广泛扩展的个性化抗原特异性反应。新的测序技术显示出解决这一挑战的希望。 在疫苗研究中，最常用的测量抗原特异性T细胞的方法是使用抗原特异性体外T细胞敏感性试验（例如，酶联免疫吸附试验[ELISpot]）或荧光标记的肽-MHC多聚体。这两种试验在速度和规模上都有使用上的挑战——两者都是劳动密集型的，需要体外湿实验室实验/校准，难以标准化，并且依赖于定制试剂的可制造性。更常见的免疫学技术，如通过流式细胞仪进行的表型分析，不足以从背景噪声中区分出新抗原特异性T细胞。 通过测序TCR CDR3域（TCR Vb测序）来识别T细胞克隆的最新进展，提供了更大的灵敏度，以高通量方式准确追踪个体T细胞克隆。TCR Vb测序可以逐个克隆解析，并已用于在针对病原体和癌症的RNA疫苗试验中追踪疫苗诱导的T细胞克隆。这种方法还可以与额外的依赖TCR序列的工具配对，如单细胞RNA/TCR a/b测序，以测量疫苗扩大的T细胞克隆的表型和功能。 动态追踪疫苗诱导的T细胞最重要的理由是实时监测疫苗反应，并根据需要重新干预，类似于当前用病原体疫苗的抗体滴度下降来增强免疫的做法。如果疫苗诱导的T细胞克隆下降到保护阈值以下，或者变得耗竭，可以根据需要重新接种疫苗（或重新激活）。识别适合响应或注定会丧失功能的T细胞的表达标志物，可以进一步发现推动T细胞长期持久或耗竭的疫苗特征。鉴于这些测序工具比目前的方法更适合扩展，因为它们在患者间的校准更简单，且不依赖于定制试剂。 一个并行的考虑，特别是考虑到当前计算新抗原预测工具的不准确性，是检查疫苗诱导的T细胞是否正确识别了在自体肿瘤细胞上处理和呈现的抗原。这种验证需要将疫苗诱导的T细胞与自体患者衍生的肿瘤材料进行体外共培养。然而，这些研究目前在后勤上存在挑战，因为对于某些肿瘤小和/或基质含量高的癌症，大部分肿瘤材料将需要分配给疫苗制造。此外，患者肿瘤衍生的细胞系可能无法捕捉所有异质的肿瘤克隆进行体外筛选，因此，缺乏反应性可能错误地意味着缺乏肿瘤特异性T细胞活性。是否可以用肿瘤衍生的类器官克服这一限制，仍然是一个未解决的问题。 8.疫苗抗性的成因 尽管由于大规模辅助癌症疫苗临床试验的数量有限，目前对癌症疫苗抗性机制的全面理解还不是很深入，但从治疗性疫苗和其他T细胞疗法的临床试验中了解到的抗性机制可以提供合理的见解。 疫苗失败主要有两种情况：（1）疫苗未能产生免疫反应；（2）随着时间的推移，疫苗诱导的免疫反应逐渐失效。 8.1.疫苗因素 未能优化疫苗的基本要素（特异性、免疫原性、最小性、价性和持久性）、疫苗传递或疫苗时机可能导致失败。抗原特异性和免疫原性不足可能导致初次失败，因为缺乏肿瘤特异性的自身抗原和与佐剂不足（因此免疫原性弱）的抗原可能诱导耐受性。价性不足的疫苗，因此无法充分覆盖克隆，可能导致逃逸克隆的出现。未能优化抗原层次结构的疫苗可能导致优势反应，饱和且可能偏斜的反应。同样，传递效果不佳的疫苗可能无法将T细胞激活到足够高的水平或长期持久，从而导致初次或二次疫苗失败。最后，由于在疾病最轻微的宿主中癌症复发是随时间不对称的，大多数复发发生在早期，随后逐渐减少，因此在癌症易感窗口期间最大化疫苗免疫可能对预防二次失败至关重要。 8.2.肿瘤因素 从T细胞选择压力下出现的耐药克隆可能适应限制新抗原呈递或T细胞杀伤的观察中，可以了解到导致疫苗失败的肿瘤内在因素。限制新抗原呈递的适应包括肿瘤抗原的下调，以及MHC表达的下调或失活，导致失去肿瘤特异性疫苗诱导的反应。肿瘤细胞还可以通过获得性遗传改变来抵抗T细胞的细胞毒性，这些改变限制了肿瘤细胞对细胞因子的敏感性，包括IFN-g和TNF-a，或通过表达抑制CD8+ T细胞的配体。肿瘤细胞也可能利用策略将T细胞排除在肿瘤微环境之外，例如通过激活β-catenin信号或PTEN的丢失。这些策略在治疗性疫苗的抗性中可能起主要作用，而不是针对初级或二级癌症预防的疫苗接种。 8.3.宿主因素 由于有效的疫苗需要能够产生并持久维持疫苗诱导细胞的宿主，癌症发展和治疗过程中获得的宿主损害可能会改变疫苗诱导细胞的动态和功能，并导致疫苗失败。考虑到最佳疫苗接种应该在最适合的宿主中进行——例如在疾病最轻微的宿主中进行辅助疫苗接种——任何和所有接种前的治疗，包括化疗（新辅助或辅助）、手术和其他治疗，可能会影响宿主的健康状况、疫苗接种潜力以及疫苗诱导的免疫细胞的动态和功能。事实上，接种前的治疗可能会影响B细胞和对SARS-CoV-2 RNA疫苗的抗体反应，类似的接种前治疗可能会影响T细胞。一致地，接种前使用类固醇可能会影响疫苗诱导的T细胞，但某些化疗似乎不会，这表明特定治疗可能会不同地影响疫苗诱导的免疫。由于淋巴区域对于产生强烈的疫苗诱导免疫至关重要，完整、功能性的淋巴结区域的存在可能会影响宿主产生高强度免疫的能力，因为有观察表明，如果脾切除术先于静脉注射RNA-LPX新抗原疫苗，反应会减弱。疫苗诱导的T细胞也可能随着时间的推移通过频率或功能的丧失而失去功能。 9.展望 尽管在对抗传染病方面取得了巨大成功，但针对癌症的疫苗尚未成为现实。然而，RNA技术的进步，加上在抗原发现和临床传递方面的科学突破，极大地增强了人们对癌症疫苗的兴趣，临床试验现在涵盖了各种癌症。随着这些试验似乎准备实现教会宿主免疫系统识别改变的自我这一持久的追求，新型RNA传递平台（如环状RNA和自扩增RNA）的技术加速将开辟新的疫苗接种途径。然而，由于任何成功疫苗的基本组成部分是最佳抗原，迭代改进新抗原选择策略对于成功推进临床疫苗接种至关重要。尽管目前源自体细胞突变的新抗原疫苗仍然是“个性化”的——因为大多数新抗原出现在有限的基因组范围内——迭代映射癌症突变组可能会开辟新的可能性，例如用于预防性疫苗的新抗原库和多价疫苗以防止克隆逃逸。

摘要：先天免疫系统是抵御流感病毒的第一道防线，流感病毒会导致严重的呼吸道炎症，每年在全球造成超过65万人死亡。信使RNA（mRNA）疫苗是传统疫苗方法的有希望的替代品，因为它们具有安全剂量、低成本制造、快速开发能力和高效率。在这篇综述中，我们提供了我们对使用模式识别受体检测和响应mRNA疫苗的先天免疫反应的当前理解。我们还提供了mRNA疫苗的概述，并讨论了推进这一有前途的治疗方法的未来方向和挑战。 关键词：mRNA、疫苗、流感病毒、先天免疫、炎症体、细胞因子、炎症 1.引言 先天免疫系统是宿主对病原体的第一反应线，也是针对病毒疫苗（包括减毒或灭活病毒）的第一道防线，用于预防传染病。接种疫苗后，先天免疫系统识别并清除接种细胞，同时协调适应性免疫反应，以抗原特异性反应的形式，从而维持对病毒感染的长期保护。为了快速检测和防御各种病毒，免疫细胞已经进化出获得多种模式识别受体（PRRs），如Toll样受体（TLRs）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）和核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体家族蛋白（NLRs）。通过这些受体，先天免疫系统以严格调节的方式激活，同时保留适应性免疫反应，但不会引发过度的先天免疫反应，这些反应可能导致组织损伤和全身性炎症，对宿主有害。在本篇综述中，我们讨论了先天免疫识别、炎症体的激活以及对流感病毒感染及其mRNA疫苗的细胞因子分泌反应。我们还强调了mRNA疫苗作为预防和控制流感病毒疾病的有前途的工具。 2.迄今为止流感疫苗的简要历史 流感病毒是人类最严重的呼吸道传染病原之一。季节性流感病毒流行估计每年在全球导致29万至65万人死亡。流感病毒是包膜的、负义单链RNA（ssRNA）病毒，具有分节段的基因组。例如，流感A病毒（IAV）包含八个RNA片段，编码RNA聚合酶亚基[聚合酶酸性蛋白（PA）、聚合酶基础蛋白1（PB1）、聚合酶基础蛋白2（PB2）]、病毒糖蛋白[血凝素（HA），促进病毒进入；神经氨酸酶（NA），促进病毒释放]、病毒核蛋白（NP）、基质蛋白（M1）、膜蛋白（M2）和非结构蛋白1（NS1）（图1A）。IAV通过内质网摄取和释放感染细胞，病毒核糖核蛋白（vRNPs）进入细胞核进行mRNA转录和复制，通过正义互补核糖核蛋白（cRNP）中间体。病毒mRNA然后在细胞质中转化为病毒蛋白，这些蛋白被组装成新的病毒颗粒并从细胞中释放出来（图1B）。 图1 | 流感A病毒结构和复制。(A) 流感A病毒（IAV）基因组由八个分节段的单链负义RNA（vRNA）组成。每个节段都被核蛋白（NP）包裹，并通过RNA聚合酶介导，形成病毒核糖核蛋白（vRNP）复合体（PB1、PB2、PA和NP），这是转录和复制的基本单位。(B) 感染的vRNP被运输到细胞核中，在那里发生病毒转录和复制，随后产生后代vRNP。后代vRNP被运输到细胞质后，病毒开始组装。HA，血凝素；M1，基质蛋白；M2，膜蛋白；NA，神经氨酸酶；NS1，非结构蛋白1；PA，聚合酶酸性蛋白；PB1，聚合酶基础蛋白1；PB2，聚合酶基础蛋白2。 季节性流感病毒有四种不同类型：A型、B型、C型和D型。A型和B型流感病毒目前在人群中共同循环，并引起季节性流行：IAV的H1N1和H3N2亚型，以及流感B病毒（IBV）的两个不同谱系（山形谱系和维多利亚谱系）。通过世界卫生组织全球流感监测网络的协调，每年设计季节性流感病毒疫苗，配方包含两种IAV株和两种IBV株；然而，季节性流感病毒疫苗的有效性在每个流感季节都有很大差异。在季节性流感疫苗注射后，先天免疫细胞，包括存在于肌肉中的巨噬细胞和树突状细胞（DCs），会引起趋化因子释放的增加，这导致更多免疫细胞从血液中招募到疫苗接种部位。分化的DCs作为抗原呈递细胞，迁移到淋巴结，导致T细胞和B细胞的激活，以产生抗体（图2）。然而，疫苗诱导的免疫反应狭窄且特定于株，需要不断更新（几乎每年），由于点突变的高频率，这最终是一个复杂、昂贵且耗时的过程。此外，包括禽类和猪类在内的各种流感病毒株已经获得了在人类中高效生长的能力，跨越物种障碍从动物宿主传播，并在人群中传播，对人类构成严重威胁。除了季节性流行，流感大流行每隔几十年发生一次，由猪源H1N1 IAVs引起，这些病毒以前从未循环过，并且可以迅速在人类中传播。1918年的H1N1流感大流行在全球造成约4000万人死亡。自那时以来，流感大流行由1957年的H2N2、1968年的H3N2和2009年的H1N1pdm09引起。考虑到季节性流感病毒疫苗诱导的株特异性免疫可能无法对大流行性流感病毒提供强大的保护，因此需要开发新型流感疫苗，以诱导不专注于相应疫苗株的广泛免疫。 图2 | 宿主对mRNA疫苗的免疫反应。自复制RNA（saRNA）疫苗可以以类病毒RNA颗粒、体外转录RNA和质粒DNA的形式传递。树突状细胞（DCs）在肌肉中识别saRNA并分化。分化的DCs作为抗原呈递细胞，迁移到淋巴结，导致T细胞和B细胞激活以产生抗体。 在1980年代之前，已经建立了灭活疫苗和减毒活疫苗来保护人类免受致病微生物的侵害。灭活疫苗是通过化学或热处理制造的，而减毒活疫苗通常在动物或细胞系中开发。使用杀死的整个生物体疫苗或减毒活疫苗在减少包括麻疹、腮腺炎、风疹和脊髓灰质炎在内的病毒感染以及根除天花感染方面取得了巨大成功。尽管取得了成功，但传统疫苗策略仍然存在主要问题。流感病毒等传染性病原体能够逃避适应性免疫反应，而且通常很难开发减毒或杀死的整个生物体疫苗。在目前的流感病毒疫苗的情况下，主要挑战是其在老年人（65岁及以上）中的低效性，他们比儿童和成年人更容易感染流感病毒。灭活流感病毒疫苗的其他缺点通常归因于流感病毒表面抗原的突变。关于流感病毒减毒活疫苗的其他担忧包括可能引起全身性炎症和死亡，可能是由于回突变、获得补偿性突变或与循环传播的野生型株重组。 通常，流感病毒通过鼻腔或口腔腔感染宿主，首先与呼吸道上皮细胞接触，类似于通过鼻腔内给药的减毒活流感疫苗。感染呼吸道上皮细胞后，病毒或鼻腔内流感疫苗可以诱导全身和粘膜免疫反应。先天免疫细胞的防御机制，特别是DCs，是流感病毒的强大屏障。在不同的粘膜表面存在特定的免疫系统来抵抗流感病毒的入侵。存在于感染细胞内的病毒RNA被各种模式识别受体（PRRs）识别为非自身，导致促炎细胞因子、趋化因子和I型干扰素（IFNs）的释放。巨噬细胞、肺泡细胞、DCs和浆细胞样DCs产生I型IFNs，进而刺激邻近细胞中IFN刺激基因（ISGs）的表达，诱导抗病毒状态。 与流感病毒感染或鼻内流感疫苗不同，基于mRNA的疫苗包含编码病毒蛋白和免疫调节蛋白作为佐剂的mRNA，这些佐剂增强了免疫刺激性特性。当mRNA进入宿主细胞时，内质网（例如，TLR3、TLR7和TLR8）和细胞质先天免疫传感器（例如，RIG-I、PKR、NOD2、OAS和MDA5）识别mRNA，包括单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA）。随后，免疫细胞被激活并产生I型IFN和多种炎症细胞因子。然而，疫苗中的单链mRNA通过体外转录过程适当纯化，以消除与先天免疫传感器的相互作用，这些相互作用会诱导过度分泌I型IFN及其细胞功能障碍。此外，佐剂刺激先天免疫反应，并在不引起可能引发严重副作用的全身性炎症的情况下，推动抗原特异性T细胞反应。此外，注射部位（例如，皮下、肌肉内、皮内和静脉内）和mRNA疫苗递送配方（例如脂质纳米颗粒）影响免疫反应的效力。例如，脂质纳米颗粒载体系统进一步保护mRNA免受核酸酶的侵害，并通过肌肉内注射靶向淋巴管并促进淋巴结中的蛋白质翻译。与鼻内mRNA介导的先天免疫反应相比，肌肉内mRNA主要被非免疫细胞摄取，包括局部肌细胞。一旦进入淋巴结，脂质纳米颗粒最终被DCs吞噬，从而产生并呈递抗原给T细胞以促进适应性免疫反应。mRNA疫苗诱导细胞内产生抗原蛋白以及先天免疫反应的能力必须促使CD8+和CD4+ T细胞分化为效应和记忆亚群，以保护免受感染。 体外转录的mRNA在哺乳动物中的有效使用首次报告于1990年，将报告基因mRNA注射到小鼠体内诱导了目标蛋白的产生。随后的研究表明，在下丘脑中施用编码血管加压素的mRNA可以在大鼠中诱导生理反应。然而，这些早期的有希望的结果并没有导致对mRNA疫苗开发的显著投资，因为人们担心mRNA的不稳定性、严重的先天免疫反应和体内递送无效。然而，在过去的十年中，重大的技术革新和研究投资使mRNA成为一种有前途的疫苗工具。与亚单位、灭活和减毒活病毒相比，mRNA疫苗的使用具有多种优势。由于mRNA是一种非传染性和非整合性平台，因此没有感染或插入突变的潜在风险。此外，mRNA通过正常的细胞过程降解，各种修饰和递送方法可以调节其在体内的半衰期。将mRNA配方成载体分子有助于在细胞质中快速摄取和表达，在那里它是稳定的并且高度可翻译的。此外，由于体外转录反应的高产量，mRNA疫苗具有快速、廉价且可堆叠的制造潜力。此外，已经使用非人灵长类动物模型进行了几项优雅的流感mRNA疫苗研究。在猴子中免疫修饰的非复制型mRNA编码流感H10包裹在脂质纳米颗粒中后，针对血凝素的抗体保护水平显著增加，与人类季节性流感疫苗接种后的观察结果类似。使用一种新的成像技术（正电子发射断层扫描-计算机断层扫描，PET-CT），标记有探针的mRNA疫苗被运送以评估猴子中的生物分布，提供了疫苗接种后先天和适应性免疫反应机制的见解，这些反应在接种部位和引流淋巴结转化为保护性免疫。 3.先天免疫对流感病毒的反应 IAV被包括TLRs、RLRs和NLRs在内的PRRs识别为外来物质，导致程序性细胞死亡、I型IFN的分泌和促炎细胞因子的分泌，从而引发过度炎症。 3.1.与流感病毒识别相关的TLR和RLR TLR和RLR介导的流感病毒信号诱导I型IFN的释放，并刺激感染细胞和附近细胞表达ISGs以诱导抗病毒状态。此外，TLR和RLR信号还诱导促炎细胞因子的释放，如白细胞介素（IL）-6和IL-8。TLR3在内质网中感应dsRNA。尽管感染流感病毒的细胞不产生dsRNA，但Tlr3−/−小鼠在致命流感病毒感染后比野生型小鼠寿命更长，这表明TLR3在病毒感染后识别了未知的RNA结构。此外，Tlr3−/−小鼠在流感病毒感染后产生正常的抗体，以及CD4+和CD8+ T细胞反应，表明TLR3对于产生T细胞免疫是可有可无的。在浆细胞样DCs中，TLR7识别流感病毒的ssRNA基因组。TLR7通过适配器髓系分化初级反应88（MYD88）信号传导，导致激活包括核因子-κB（NF-κB）和干扰素调节因子7（IRF7）在内的转录因子，从而诱导产生I型IFN和促炎细胞因子。RIG-I是一种细胞质PRR，通常识别5'ppp双链RNA（dsRNA）。RIG-I还感应流感病毒复制后产生的5'ppp病毒ssRNA。在检测到流感病毒RNA后，RIG-I的解旋酶结构域与ATP相互作用，这有助于卡斯帕酶募集结构域（CARD）发生构象变化，与信号适配器线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）相互作用，以产生I型IFN。 3.2.炎症体介导的对流感病毒的反应 NLRs在抗病毒免疫反应、炎症反应和细胞因子诱导中发挥重要作用。促炎信号诱导免疫细胞（如巨噬细胞和中性粒细胞）的招募，以消除病原体和病原体衍生分子。IL-1β和IL-18是关键的促炎细胞因子，对抵御IAV感染很重要。IL-1β和IL-18的分泌需要分别通过炎症体介导的pro-IL-1β和pro-IL-18的蛋白水解成熟。炎症体是由caspase-1、ASC和PRRs（如NOD样受体家族蛋白3（NLRP3））组成的多蛋白复合体。在病毒配体感应后，PRRs诱导自聚合并结合到炎症体适配蛋白ASC，ASC由N末端pyrin结构域（PYD）和C末端CARD组成。ASC通过PYD结构域的同型相互作用寡聚化，然后通过CARD与caspase-1结合以形成炎症体，最终诱导炎症性细胞死亡。 在巨噬细胞中，流感病毒诱导的NLRP3炎症体激活需要Z-DNA结合蛋白1（ZBP1）形成ZBP1-NLRP3炎症体。当复制时，IAV产生Z-RNAs，这是RNA双螺旋的转化版本，被ZBP1感应并与受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶3（RIPK3）和caspase-8结合以激活ZBP1-NLRP3炎症体。最近，研究表明caspase-6促进RHIM依赖性RIPK3与ZBP1的结合，促进ZBP1介导的NLRP3炎症体激活。在呼吸道上皮细胞中，MxA充当炎症体传感器，识别流感病毒蛋白NP并以NLRP3独立的方式诱导IL-1β和IL-18的释放。 NLRP3和MxA炎症体激活已被证明是对抗流感病毒的重要先天免疫防御。在流感病毒株A/Puerto Rico/8/34（PR8）感染后，发现NLRP3对白细胞迁移到肺部和保护宿主免受感染很重要。在人类MxA转基因小鼠的流感病毒感染期间，呼吸道上皮中MxA炎症体的快速激活显示出抑制病毒从细支气管传播到远端肺泡区域。这些研究表明，最佳的炎症体激活对宿主有益；然而，异常激活可能导致有害结果。 4.适应性免疫对流感病毒 先天和适应性免疫反应显著保护宿主免受流感病毒侵害，并对产生强烈的抗体反应很重要。流感病毒感染后，先天免疫系统对于识别和清除接种细胞至关重要，同时也通过抗原特异性抗体反应协调适应性免疫，并提供长期保护。 在识别病毒抗原和与认知CD4+ T细胞相互作用后，幼稚B细胞被激活。一些激活的B细胞迅速分化为短寿命的浆细胞。尽管其他激活的B细胞迁移到二级淋巴组织的滤泡并经历生发中心反应，但浆细胞在人类中产生第一波病毒特异性抗体。如果浆细胞来自记忆B细胞，那么在感染后约7天，浆细胞的数量在外围达到峰值。然而，少数激活的B细胞只会分化为长寿命的浆细胞，它们迁移并居住在骨髓中产生抗体，提供长期血清抗体水平，并与抵御病原体感染和疾病的防御相关。另一部分主要激活的B细胞分化为记忆B细胞，它们不释放抗体并留在外围进行免疫监视，但它们是长寿命的，可以在感染期间重新激活成为浆细胞，以产生新的抗体和进一步的记忆B细胞。总体而言，适应性免疫衍生的抗体反应对流感病毒感染相对广泛且持久；然而，由于高突变率和抗原灵活性，流感病毒有时会偏离适应性免疫反应。需要进一步研究自然病毒感染如何诱导长期免疫反应，以开发下一代流感病毒疫苗。 5.传统的季节性流感病毒疫苗 季节性流感病毒疫苗是使用基于鸡蛋、细胞和蛋白质的技术生产的，整个过程通常需要6~8个月。针对IAVs和IBVs的流感疫苗在1940年代发明，这些全病毒灭活疫苗是在胚蛋中产生的，由甲醛和苯汞硝酸盐灭活的粗提纯全病毒组成。2012年，含有基于细胞的病毒的疫苗作为生产灭活和减毒活疫苗的替代方法出现。三价灭活和减毒活流感疫苗的有效性分别约为成人和儿童的65%和83%。通常使用的减毒活流感病毒疫苗通常是冷适应和温度敏感的，在上呼吸道而不是下呼吸道有效复制。总体而言，这些研究表明季节性流感病毒疫苗对流感病毒感染提供了良好的保护。 然而，也有关于这些疫苗的负面报告。成人75%的疫苗效力在老年人中突然下降，老年人更容易感染流感病毒。此外，疫苗和循环株之间的不匹配有时也会发生，通常与较低的疫苗效率有关。根据美国病毒学监测和美国流感疫苗效力（Flu VE）网络数据，2019-2020年流感季节所有年龄组对IAV或IBV的估计疫苗效力（VE）降至29%（2010-2018年平均VE为44.1%），由于抗原漂移的IAV（H3N2）的传播，这引发了对疫苗株选择的担忧（https://www.cdc.gov/flu/vaccines-work/past-seasons-estimates.html）。此外，保护的持续时间有时很短。为了在老年人中诱导更强、更持久的免疫反应，已经测试了高剂量疫苗或包括MF59和AS03在内的先进佐剂疫苗。高剂量疫苗的剂量是三价灭活疫苗的4倍，可以比标准剂量疫苗诱导更多的抗体。MF59佐剂季节性疫苗已在25多个国家获得许可并针对老年人群市场。AS03佐剂流感病毒疫苗也在考虑用于老年人群。 6.传统大流行流感病毒疫苗 IAV通常在一种动物种群内传播，但有时它们可以跨越并导致另一种物种生病。在后一种情况下，与在人类中循环的季节性IAV相比，表现出更显著的遗传变化。如果新型IAV具有传染性并在人类中容易传播，则被认为是流感病毒大流行。由于大多数人口对新型流感病毒株没有或只有有限的自然免疫力，因此已经使用多种生产平台开发了大流行IAV疫苗候选物。带有佐剂的灭活分裂流感病毒疫苗平台进展最远，其他平台，包括核酸（DNA和mRNA）、载体、重组蛋白（VLP；类病毒颗粒）、活病毒仍在开发中。H5N1禽流感病毒疫苗是第一个获得美国FDA批准用于人类人口的疫苗，因为对高致病性H5N1病毒可能引起流感大流行的潜力提出了关注。 流感大流行管理面临的挑战之一是在全球疫苗生产能力在爆发后的几个月内。在针对H5N1株的疫苗的情况下，使用反向遗传学生成了种子株，以去除HA的多基本裂解位点，并将背景更改为高生长PR8 H1N1株，后者表现出相对较少的致病性。这些修改有助于生产更安全的疫苗株，并大量生产，因为高致病性IAV经常杀死胚蛋，导致产量低。已经对H5N1和H7N9疫苗在人类中进行了测试，需要高抗原剂量或使用佐剂以诱导可靠的血凝抑制滴度。一项H7N9疫苗的临床试验尽管使用了佐剂，但产生了大约60%的效力，这表明为了实现足够的疫苗效力，需要佐剂和多次接种。 7.针对流感病毒的信使RNA疫苗策略 mRNA疫苗通过实验方法进行了广泛表征，这些方法改善了mRNA的稳定性和传递以及蛋白质生产。这些方法涉及开发纳米颗粒运输技术，这些技术可以稳定mRNA，增强细胞摄取，并在mRNA进入细胞时提高生物可用性。mRNA疫苗的一个明显优势是它不需要进入细胞核来促进抗原表达。 7.1.针对流感病毒的自复制mRNA疫苗 自复制RNA（saRNA）疫苗可以以质粒DNA、类病毒RNA颗粒和体外转录RNA的形式携带（图3）。基于DNA质粒的saRNA疫苗结合了更稳定的DNA核酸产品和更高水平的抗原表达的优势。saRNA疫苗在临床前模型中引起了强烈的免疫反应。saRNA疫苗源自阿尔法病毒的基因组骨架，其中编码病毒RNA复制机制的基因是完整的。 图3 | 通过自复制RNA疫苗获得抗原表达。展示了自复制RNA（saRNA）传递的三条途径。这些包括：1） 类病毒RNA颗粒通过受体介导的内吞作用将saRNA传递到细胞质；2） 直接将体外转录的复制子saRNA以生理盐水或合成配方的形式传递给细胞；3） 携带复制酶基因和转基因的质粒DNA进入细胞核，在那里转录生成复制子saRNA，然后运输到细胞质。三条saRNA疫苗途径最终产生信使RNA（mRNA），通过核糖体翻译产生疫苗抗原。 有几份报告使用了针对流感病毒的saRNA疫苗。用编码PR8 H1N1 IAV HA的10 mg saRNA疫苗免疫，在小鼠中产生了抗体反应，并在致命的同源病毒挑战中提供了保护。另一项研究表明，开发了saRNA疫苗，其中A/California/07/2009（H1N1）或A/Shanghai/2/2013（H7N9）IAV HA编码的saRNA被配制在脂质纳米颗粒中，小剂量在小鼠中两次肌肉注射后诱导了保护水平的血凝抑制滴度。与这一发现一致，另一组表明，肌肉注射0.1或0.2 mg PR8 H1N1 IAV NP、M1或联合NP+M1自复制RNA-脂质纳米颗粒疫苗在小鼠中引起了强烈的抗原特异性T细胞反应和对同源病毒感染的保护。IAV HA和NP复制子RNA与含壳聚糖的脂质纳米颗粒或聚乙烯亚胺（PEI）复合后，在小鼠皮下给药后引起了T细胞和B细胞免疫反应。最近的一项研究揭示了一种由化学修饰的阳离子树状分子复合成的脂质纳米颗粒组成的递送平台。使用这个平台，肌肉注射编码A/WSN/33（H1N1）IAV HA的RNA复制子成功地保护了小鼠免受致命同源病毒挑战。最近的一项研究显示了自复制mRNA和非复制mRNA免疫后在小鼠中免疫反应和保护效力的直接比较。动物在首次疫苗接种后八周内两次肌肉注射不同剂量的PR8 H1N1 IAV HA编码未配方自复制mRNA或未修改非复制mRNA，并进行了挑战。两个平台都引起了对同源流感病毒感染的保护。 7.2.非复制型流感病毒mRNA疫苗 非复制型mRNA疫苗可以通过结合各种修饰的核苷酸来制造，并且在开发直接可注射的非复制型mRNA疫苗方面投入了大量的努力。有几项针对流感病毒的非复制型mRNA疫苗的研究。在脂质体中复合的IAV NP编码mRNA的给药在小鼠中诱导了细胞毒性T细胞反应。用各种IAV HA、NP和NA编码的RNActive疫苗在小鼠、雪貂和猪中进行皮内免疫，单次免疫后产生了保护性免疫反应。使用PR8 H1N1 IAV HA编码未修改mRNA-脂质复合物的小鼠静脉内免疫显示单剂量给药后T细胞激活增加。总之，确定这些发现是否以及如何转化为临床试验和疫苗接种将是重要的。 7.3.先天免疫对mRNA疫苗的反应 先天免疫系统作为宿主对mRNA疫苗接种的第一反应线。在mRNA疫苗接种期间，mRNA可被各种PRRs识别，包括TLRs、RLRs和NLRs，以产生IFNs和促炎细胞因子。典型地，IFNs和促炎细胞因子对宿主大有裨益，触发IFN诱导基因的诱导和免疫细胞的浸润，以清除接种细胞。然而，失调的IFNs和促炎细胞因子会抑制mRNA疫苗的效力，导致有害的全身性超炎症和组织损伤。因此，体外转录mRNA的适当纯化对于最大化免疫原产生和避免不必要的先天免疫激活至关重要。 TLR3感应超过45个碱基对的dsRNA和来自ssRNA形成二级结构或来自病毒复制中间体的dsRNA。TLR7可以识别dsRNA和ssRNA，而TLR8只感应ssRNA。TLR7的激活可以刺激抗原呈递、细胞因子释放并诱导B细胞反应。特别是，RIG-I感应带有5'-三磷酸的ssRNA和dsRNA并刺激IFN产生。 mRNA疫苗通过RNA传感器产生的IFN产生依赖于体外转录mRNA的质量、传递载体和给药途径。体外转录mRNA被dsRNA污染的识别会导致快速的I型IFN诱导，这上调了蛋白激酶R（PKR）和2'-5'-联腺苷酸合成酶（OAS）的表达和激活。这导致翻译抑制和细胞mRNA、核糖体RNA和体外转录mRNA的降解（图4）。通过包括反向相快速蛋白液相色谱或高性能液相色谱在内的色谱方法，可以有效地从体外转录mRNA中去除污染的dsRNA。这些方法的纯化已被证明可以增加人类DCs中体外转录mRNA的抗原蛋白产生高达约1000倍。除了dsRNA污染物外，单链mRNA分子被识别为PAMP并被TLR7和TLR8检测，导致I型IFN产生和体外转录mRNA的抗原蛋白产生减少。 图4 | 失调的先天免疫阻止mRNA疫苗的效力 在mRNA疫苗接种时，进入的自复制RNA（saRNA）被Toll样受体（TLR）3、TLR7和视黄酸诱导基因I（RIG-I）识别，这促进了它们的下游信号传导和随之而来的产生I型干扰素（IFN）。体外转录mRNA被dsRNA污染的识别会导致快速的I型IFN产生，这会诱导蛋白激酶R（PKR）和2'-5'-联腺苷酸合成酶（OAS）的表达和激活。这将抑制翻译并诱导细胞mRNA、核糖体RNA和体外转录mRNA的降解。EIF2a，真核生物启动因子2a；IFNAR，干扰素α受体。 鉴于减少I型IFN信号传导对mRNA疫苗策略至关重要，几项研究揭示了减少I型IFN信号传导的修饰mRNA的开发。包括天然存在的化学修饰核苷，包括假尿苷和1-甲基假尿苷，防止TLR7、TLR8和其他先天免疫传感器的激活，从而减少I型IFN信号传导。另一项研究还表明，与未修饰的mRNA相比，核苷修饰的mRNA在体外和体内（特别是在小鼠中）在原代DCs中的翻译更好。总之，mRNA疫苗与先天免疫反应之间的平衡对于潜在的疫苗方法至关重要；这种平衡必须精细控制，以减少过度的先天免疫反应，同时在DCs中保持最大的免疫原产生。 注意，虽然依赖炎症体的IL-1β和IL-18的释放触发了DCs中进一步的产生，以诱导流感病毒特异性CD8+ T细胞启动，体外转录mRNA是否可以被炎症体传感器识别在很大程度上仍然未知。未来的研究需要全面检查驱动炎症体适应性免疫反应所需的因素。 7.4.基于mRNA的流感病毒疫苗开发 mRNA疫苗最近吸引了大量关注，涉及大规模的学术和工业投资，生物技术公司已成功筹集资金用于开发创新的RNA疫苗。Moderna Therapeutics（美国）的科学家开发了第一种直接可注射的针对H10N8和H7N9的流感RNA疫苗，证明了用可接受的耐受性概况诱导保护性免疫原性的可能性。对于第一种人类季节性流感病毒RNA疫苗试验，CureVac AG公司（德国）开发了一种序列工程化的mRNA-脂质纳米颗粒策略，该策略在不使用修饰核苷酸的情况下实现了非凡的体内蛋白质翻译水平。使用这种策略，最近的一项研究表明，单次肌肉注射10 mg A/Netherlands/602/2009（H1N1）HA编码mRNA-脂质纳米颗粒在非人灵长类动物中诱导了保护范围内的血凝抑制滴度（≥1:40）。此外，第二次剂量接种有效地增强了免疫反应，并在所有接种动物中使血凝抑制滴度≥1:160超过1年。CureVac AG科学家提供的证据表明，两次免疫接种mRNA-脂质纳米颗粒编码的HA来自A/Hong Kong/4801/2014（H3N2）比许可的MF59佐剂三价灭活IAV疫苗诱导更强的T细胞和B细胞免疫反应。 7.5.mRNA疫苗的局限性 通常不常观察到与mRNA疫苗相关的超敏反应。同样，严重的急性发作，假定为免疫球蛋白E（IgE）或免疫球蛋白G（IgG）介导的，以及补体介导的过敏性或严重的迟发性T细胞介导的全身反应被认为是非常罕见的。疫苗的活性抗原也可以发展超敏性。疫苗接种后的急性超敏反应包括自限性的局部副作用，系统反应可以从荨麻疹/血管性水肿到全系统多系统涉及的全身性过敏性反应。过敏性反应是一种罕见的危及生命的过敏反应，通常在接种后几分钟到几小时内发生。疫苗诱导的过敏性反应通常很少见。2019年冠状病毒病（COVID-19）大流行突显了通过脂质纳米颗粒中的mRNA疫苗进行强大疫苗生产的需求。出乎意料的是，由于公共疫苗引起的严重过敏反应较少，因此，围绕特应性个体的相当大的公众关注。以前的疫苗相关过敏性反应的免疫机制研究集中在明胶、乳胶和鸡蛋蛋白的存在上，最近更多地关注聚山梨酯80，这是一种广泛存在于许多疫苗中的表面活性剂。然而，上述所有辅料都没有包含在辉瑞-BioNTech COVID-19 mRNA疫苗中，而且在大规模2/3期临床试验中没有观察到过敏性反应病例；因此，这些事件是出乎意料的。因此，初次接触COVID-19疫苗时发生的过敏性反应是指预先存在的抗体介导的免疫（过敏）或与以前暴露无关的假过敏反应。已知过敏原引起的过敏性反应最好通过与肥大细胞和嗜碱细胞的结晶片段（Fc）ϵ受体交联的IgE的经典范式来理解，但包括抗体依赖性补体激活或IgG相关肥大细胞/粒细胞/血小板/嗜碱细胞介导的肥大细胞/粒细胞/血小板/嗜碱细胞激活通过Fcg受体的非经典途径已在动物模型和人类对药物的过敏反应中描述。不幸的是，关于疫苗潜在用途的信息用于测试以确认病理病因或预测反应风险仍然很少。在公共卫生危机期间，需要对经历过敏性疫苗反应的患者进行快速彻底的基于研究的评估，并在处于风险中的个体中进行前瞻性临床试验，以解决这些问题。 8.结论和未来研究方向 我们已经强调了IAV mRNA疫苗接种期间先天免疫系统的反应。最佳的先天免疫感应和炎症细胞因子释放对于T细胞和B细胞免疫反应至关重要。然而，过度的宿主先天免疫反应可能导致细胞因子风暴和/或组织损伤，抑制流感病毒mRNA疫苗的效力。因此，必须控制mRNA诱导的先天免疫，以减少过度炎症，同时保持抗体产生。 在过去的十年中，流感病毒mRNA疫苗领域取得了明显的突破，证明了在临床前和临床环境中的概念验证。然而，减少mRNA的先天免疫感应和将有希望的动物数据最大化转化为人类仍然是一个挑战。需要进一步的临床试验来检查长期安全性和免疫原性，以评估RNA疫苗对流感病毒疫苗领域的影响。 目前，COVID-19大流行继续在全球蔓延，迫切需要有效的疫苗来对抗它。FDA批准的mRNA疫苗在工作年龄成人中预防SARS-CoV-2感染方面非常有效，疫苗减轻了突破性感染者的病毒RNA负荷、发热症状风险和病程，尽管接种了疫苗。mRNA疫苗领域的未来是潜力无限的，相关公司和其他学术机构提供的临床数据和资源可能会显著地建立和加强基于mRNA的疫苗的基础研究。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。