NF-κB x TLR9

摘要:疫苗几个世纪以来一直是预防多种传染病的有效方法。另一方面，癌症疫苗（CVs）可以被定义为一种免疫疗法，它指导我们的免疫系统区分我们体内的癌细胞和健康细胞，并消除癌细胞。CVs的主要目标是帮助治疗某些类型的癌症或减少治疗后癌症的复发。例如，Sipuleucel-T用于治疗和管理晚期前列腺癌（PC）。然而，也有一些疫苗可以预防某些类型的癌症。例如，为即将进入青春期的女孩和某些年轻人接种人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗有助于预防宫颈癌和由HPV引起的其他五种重要类型的癌症。然而，大多数癌症的病因并不表明有传染性因子的参与，因此疫苗在预防它们方面的作用值得怀疑。尽管如此，全球目前正在进行多项临床试验，以找到适合的答案。“Lynch疫苗试验”就是其中之一，旨在确定疫苗是否可以有效地用于预防非病原体形式的癌症。此外，研究人员还在研究其他几个重要的策略。本章将讨论各种类型的CVs，它们假定的作用机制，与使用它们相关的药物不良反应，CVs的重要靶点，以及不同临床试验阶段的CVs。 1.引言 癌症疫苗（CV）的概念自20世纪50年代以来从一个假设演变成了一个真实性，它以其在对抗和管理包括手术、化疗、放疗和单克隆抗体（Abs）在内的多种癌症形式的现有方法上的日益巨大的潜力，吸引了癌症研究者的极大兴趣。这是因为，从概念上讲，它只需一次性或短时间内给予就能促进免疫力，就像目前针对细菌和病毒感染的疫苗接种计划一样，具有最小的破坏能力和在个体一生中加强癌症预防的能力。肿瘤学中免疫学的两个关键应用是免疫预防和免疫治疗。免疫预防使用免疫技术，主要是疫苗，来引发免疫反应，以防止宿主发展成癌症状况和肿瘤生长。免疫治疗涉及给予癌症患者的免疫程序，以努力根除已经存在的肿瘤细胞。免疫预防和免疫治疗的控制原则、实际应用和免疫学过程之间的对比已在许多癌症免疫预防研究中得到强调。疫苗是癌症预防策略之一。显然，用于对抗致癌病毒如乙型肝炎病毒和人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗在预防初始感染方面非常成功，因此显著降低了由这些病毒引起的癌症发展的机会。然而，大多数恶性肿瘤缺乏传染性起源，因此需要考虑替代目标作为预防性疫苗的可行抗原。由于大多数肿瘤抗原由自身分子组成，对它们产生强烈的免疫反应，人们认为它们违反了耐受自身细胞的规则，并增加了发展自身免疫的可能性。因此，开发CVs的大多数尝试都集中在生产针对转移性癌症的疫苗上，因为对于这类癌症，与目标抗原选择相关的风险已经得到了充分管理。已经一致证明，Abs是传统癌症免疫治疗的基石，而不是细胞毒性T细胞。这是因为Abs在介导用于预防癌症发生的疫苗的持久效果方面更为重要。图1.1描绘了CVs可能针对的不同分子靶点，以对抗不同形式的癌症。在当今世界，通过使用疫苗可以预防和治疗肿瘤状况。现在有三类CVs，包括预防性、治疗性和个性化疫苗。虽然疫苗针对癌细胞，但预防性疫苗可以保护患者免受致癌病毒或与癌症密切相关的病毒的侵害。尽管治疗性疫苗用于治疗患有不同形式癌症的持续状况的人，但包括HPV疫苗在内的预防性疫苗主要设计用于避免癌症类型的发生，并已发现在预防它们的传播方面也有效。FDA目前已在美国批准了三种治疗性疫苗和四种预防性疫苗的使用。 图 1.1 癌症疫苗主要针对的不同途径。 本章将详细描述针对多种癌症的不同类别疫苗，并重点关注这些疫苗的目标机制。此外，还将讨论最近批准的疫苗以及针对这些疫苗的各种临床前和临床试验。本章还将探索简要的机制方法。此外，本章将讨论与这些疫苗及其实施相关的不良反应（ADRs）和挑战。图1.1展示了设计癌症疫苗（CV）时可以考虑的各种途径。抗原呈递细胞（APC）在识别和呈递肿瘤抗原方面发挥着关键作用。随后，它们迁移到淋巴结，在那里激活原始T细胞，启动不同的信号通路。Fas配体的激活导致穿孔素和颗粒酶的释放，促进记忆和效应T细胞从淋巴结移动到肿瘤部位。这些细胞针对肿瘤抗原并消除肿瘤细胞。淋巴结中的原始T细胞释放白细胞介素-2、肿瘤坏死因子（TNF）和干扰素-γ，它们对肿瘤细胞产生影响。这导致肿瘤细胞的凋亡或坏死，从而释放肿瘤抗原。APC在区分和呈递细胞表面的肿瘤抗原方面发挥着关键作用。CVs的机制主要围绕肿瘤抗原的识别。在淋巴结中，原始T细胞在遇到APC时被重新激活。然后这些APC通过淋巴管迁移到外周淋巴结。 2.癌症疫苗类型 预防性、治疗性和个性化疫苗是抗癌疫苗可以被分类的三个类别。个性化疫苗由“目标”疫苗抗原组成，旨在实现特定结果。这种方法旨在增强免疫细胞反应，同时减少疫苗不遵从和不良反应的可能性，特别是在存在预先存在的严重疾病或其他状况的高风险个体中。治疗性疫苗用于治疗癌症患者，而预防性疫苗，如HPV疫苗，用于预防癌症的发生。 2.1.预防性癌症疫苗 抗癌疫苗的主要类别是预防性的，旨在阻止癌症在体内进一步发展。所有目前在临床试验中使用的经许可的预防性抗癌疫苗都集中在已知会导致癌症的致癌病毒上。2006年，HPV免疫疫苗之一的Gardasil最初获得了FDA的批准。建议用于9至26岁的女性，以预防最常见的女性癌症形式之一——宫颈癌的发生。这种疫苗还被提议有效地预防几种其他HPV相关疾病，如阴道、外阴、肛门和口腔癌症。Gardasil针对特定的HPV亚型（6、11、16和18），这些亚型约占全球宫颈癌发生的70%。与针对许多HPV介导癌症有效的Sipuleucel-T疫苗不同，HPV疫苗主要依赖于诱导免疫反应以预防HPV的初次感染。根据第三阶段临床研究的数据，接种了3剂HPV疫苗的女性在超过90%的HPV 16或18型引起的感染中受到保护。尽管疫苗不能提供对所有情况的完全保护，但宫颈筛查仍然是识别和诊断宫颈癌的重要手段。此外，由于HPV疫苗最近才在临床环境中提供，关于其长期效果和安全性的问题，以及男性是否也应该接种的争议尚未完全解决。美国疾病控制和预防中心（CDC）最近推荐将Gardasil加入免疫接种计划。另一种预防性疫苗是乙型肝炎病毒（HBV）注射，它提供针对乙型肝炎病毒引起的慢性感染的保护。这种病毒显著增加了肝细胞癌（HCC），一种常见的肝癌形式的风险。与HPV疫苗类似，HBV疫苗通过触发抗体反应来预防初始HBV感染。目前世界上许多国家都将HBV疫苗纳入其儿童或青少年疫苗接种计划。研究表明，HBV疫苗的3剂接种可以显著降低慢性HBV感染的发生率，特别是在风险较高的个体中。 2.2.治疗性癌症疫苗 我们对免疫反应及其在肿瘤学中的作用的理解迅速进步，为利用患者免疫系统的训练目标、攻击和消除癌细胞的治疗性疫苗创造了机会。这种创新的疫苗方法涉及激活和适当功能的T淋巴细胞和抗原呈递细胞（APCs），包括树突状细胞（DCs）。在细胞介导防御的背景下，CD4+ T淋巴细胞分泌细胞因子，刺激CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），也称为CTLs，攻击癌细胞。免疫反应可以针对两种不同类型的肿瘤抗原：肿瘤特异性抗原（TSAs）和肿瘤相关抗原（TAAs）。TSAs是仅在肿瘤细胞上发现的抗原，而TAAs是在宿主的肿瘤细胞和正常细胞上广泛表达的抗原。与TAAs相比，TSAs的优势在于它们是针对特定肿瘤定制的，并且通常能引发更强的免疫反应。然而，TSAs极其罕见，它们在特定肿瘤中的识别通常是开发专门针对TSAs的抗癌疫苗的主要障碍。另一方面，TAAs出现的频率更高，尽管通常比TSAs引起的免疫反应要小。针对TAAs的抗癌疫苗可能会引起自身免疫反应。当GM-CSF作为辅助共刺激剂给药时，DCs通过PBMC的帮助吸收PAP，并将其转化为细胞表面的MHC主要组织相容性复合体。这使得DCs能被特定的CTLs识别。这些特定的CTLs可以繁殖，创建一个对PAP有抵抗力的CTLs库，在自我激活后。患者随后接受由这些CTLs制成的sipuleucel-T疫苗。每种疫苗都是针对患者的自体疫苗，提供了防止HLA形成不匹配的关键好处，从而避免了与组织移植相关的重大问题。尽管两组之间肿瘤生长的时间没有明显变化，但第三阶段随机对照试验（IMPACT）已成功证明，接受sipuleucel-T治疗的m-CRPC参与者的生存率高于安慰剂对照组。 2.3.个性化癌症疫苗 在疫苗方面，个性化指的是针对疫苗抗原的目标，以实现在增加免疫细胞反应和减少高风险患者不良事件（AEs）的可能性方面的最佳结果。在免疫目标的背景下，个性化旨在实现改善的结果。疫苗的个性化可以与个体水平相关，其中理解基因分型-x的存在以及单倍群-y可能会阻碍保护性免疫的发展或表明对严重不良反应的更高风险。研究免疫遗传多态性如何影响先天免疫系统、细胞介导反应和由先天系统介导的抗体反应对疫苗接种的多样性的科学被称为疫苗组学（图1.2）。如图1.2所示，对T细胞及其在HLA系统内识别致病性抗原（肽）的能力进行全面研究，激发了个性化疫苗的概念。这些个性化疫苗是通过利用患者自己的免疫细胞制成的，然后在实验室环境中暴露于癌细胞的内容。一旦准备就绪，疫苗通过注射给药以刺激更强大的免疫反应。一旦实现T细胞启动，个性化抗癌疫苗的生产就变得可行。在淋巴结中，癌细胞、死亡细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、IFN-gamma和IL-2在T细胞迁移过程中存在并释放。这种IFN-gamma和IL-2与癌细胞的结合导致它们的破坏。T细胞启动和迁移的过程在淋巴结中观察到。个性化疫苗通过捕获抗原靶向INF-gamma和TNF-alpha途径。 图 1.2 个性化抗癌疫苗的重要分子靶标。 人类基因组计划和全球Hap-Map的初始阶段已经成功完成，这促进了疫苗组学和个性化疫苗研究的进步。对生物制剂（如疫苗）的免疫反应可能因关键免疫反应基因的多态性而异的理解最近已经出现。因此，我们预计免疫和不良反应疫苗可以预测、测量并用于指导临床实践，导致更有效和针对性的疫苗开发过程。为了实现这一点，需要一个充满表型-基因型数据的验证数据库、负担得起且准确的测序技术，以及用于数据评估和解释的生物信息学和统计工具。个性化疫苗领域主要由对改善患者层面结果（如免疫原性、降低副作用风险和节省成本）的渴望驱动，尽管它依赖于实验室方法。对T细胞如何在人类白细胞抗原（HLA）系统中检测有害肽的理解对个性化治疗的概念产生了重大影响。图1.2提供了个性化CVs工作机制的简要概述。人类基因组由大约1000个人类白细胞抗原-A或B等位基因组成，导致等位基因变异，为人类白细胞抗原复合体的复杂性做出贡献，这是最多态性的基因组。HLA区域被认为对疫苗接种的免疫反应范围和对病原体的遗传易感性有重大影响。例如，当前的（非个性化的）MMR疫苗受到多种因素的限制，包括母体Abs的干扰、疫苗失败以及无法向免疫受损个体接种疫苗。正在进行广泛的研究以支持开发新疫苗以克服这些限制。一个潜在的解决方案是使用由蛋白质或肽组成的定制疫苗。事实上，来自世界各地的研究人员已经鉴定出13个免疫原性麻疹肽，这些肽可以用于开发第二代疫苗。这些肽被选为克服HLA多态性带来的挑战。此外，研究表明，麻疹肽在体外对个体进行给药时是免疫原性的。 3.癌症疫苗的作用机制 用于癌症的疫苗展示了激活免疫反应信号传导途径的抗肿瘤生成效应，包括针对干扰素相关信号传导途径、TLRs、NF-κB和NLRP3。 3.1.针对IFN相关信号传导途径 文献支持任何具有显著IFN介导免疫调节的细胞因子都具有抗肿瘤特性。干扰素（IFN）途径在人类免疫反应中扮演着关键角色。在疾病爆发后，身体启动了一系列复杂的自然和适应性免疫反应的调节机制，旨在对抗感染。产生干扰素（IFN），这种多效性细胞因子，是对病毒入侵的多种反应之一。IFN基因诱导增加了细胞对病毒感染的抵抗力，并可能影响细胞分裂。IFN被用于治疗多发性硬化症、多种癌症、乙型和丙型肝炎以及单纯疱疹感染等。在IFN研究中，我们提供了一系列产品，包括酪氨酸激酶-2（Tyk-2）和IFNR-1亚基、JAK1和IFNR2。JAK1和JAK2分别与IFN-R1和IFN-R2亚基相关。配体结合后，1型和2型受体激活导致受体亚基重组和二聚化，通过自磷酸化激活相关的JAKs，并进一步激活STAT蛋白。在被磷酸化后，激活的STAT组装成同二聚体并转移到细胞核，启动IFN刺激的基因转录。由STAT1、STAT2和IRF9组成的ISGF3复合体也可以由1型IFN形成。ISGF-3（ISG因子-3）复合体是另一个被1型IFN显著激活的转录复合体。ISGF3复合体结合ISREs，进一步刺激其启动子中包含ISREs的IFN刺激基因的转录。IFN-γ与IFN-γ受体结合，导致STAT1在Tyr-701位置发生酪氨酸磷酸化。这种Tyr701的磷酸化导致STAT1同二聚体的形成，然后转移到细胞核并结合GAS元件。还表明IFN信号控制MAPK途径。激活的JAKs磷酸化鸟嘌呤核苷酸交换因子Vav，导致下游的Rac1激活。Rac1进一步被MEKK1（MAP3K1）激活，该因子磷酸化MAP2K3和MAP2K6，最终导致p38MAPK（MAPK14）的磷酸化。此外，PI3K通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，即m-TOR，刺激翻译过程。 3.2.针对TLR相关信号传导途径 这种模式识别受体（PRR）也与疫苗用于抗癌治疗的典型策略有关：TLR靶向。根据Mesa等人的研究，VSSP激活DCs上的4型Toll样受体（TLR），有效地引发T1细胞介导的免疫反应。在这项研究中，VSSP还在脂多糖（LPS）反应低下的小鼠中激活DCs，表明其他VSSP成分也可能促进免疫。此外，VSSP执行与LPS类似的功能，同时比MPL-A更安全，对人类的影响更好。因此，使用VSSP作为DC激活剂可能是实用的。VSSP增强免疫反应的能力表明，它可以作为疫苗中的添加剂。根据Torréns等人的研究，HPV 16型的E-7癌蛋白和VSSP疫苗已被证明可以保护小鼠免受肿瘤形成，诱导现有肿瘤的缩小，并激活CD8+ T淋巴细胞。ERK途径被认为是阳离子脂质DOTAP（1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷）作为增强剂并刺激DCs的机制。当用作疫苗佐剂时，与HPV-16 E7衍生肽结合的最高剂量的DOTAP阻止了TC-1肿瘤的发展。与S-DOTAP相比，R-DOTAP被认为是更有效的辅料，用于刺激CD8+ T细胞产生干扰素-γ（IFN-γ）以对抗癌症。肿瘤回归是（R）-DOTAP佐剂机制的最终结果，该机制针对TLR7和TLR9产生Myd88依赖的1型IFN。张等人还鉴定了一组类似于阳离子脂质的物质。他们发现，具有12碳尾的C-1脂质纳米颗粒（LNP）有效地将编码抗原的信使核糖核酸（mRNA）传递给DCs。C-1 LNP在传递信使RNA时被DCs上的TLR-4刺激，诱导免疫反应。 3.3.针对NF-κB（核因子κB）相关信号传导途径 上游IκB激酶IKK、抑制剂IκB和二聚体转录因子NF-κB/Rel构成了NF-κB信号传导途径。IκB被激活的IKK磷酸化，被IκB降解，随后NF-κB转移到细胞核以调节基因表达。这个信号系统与恶性肿瘤和炎症密切相关。此外，特定纳米形式的添加剂在癌症疫苗中的作用与这个信号传导途径有关。这个途径与激活CCR7、促进DC成熟和DC摄取LDH有关。LDH纳米材料，如纳米颗粒（NPs）或纳米片，用作CVs中的佐剂，显著阻碍肿瘤生长。Chattopadhyay等人设计的NPs用于将肿瘤溶解物传递给巨噬细胞。随后，TNF被释放，激活NF-κB信号传导途径，并在体外和体内产生抗肿瘤效应。这种佐剂在其他肿瘤模型中的应用可能在未来的研究中被探索。苏等人开发了一种使用超分子抗原表位共轭肽（称为ECPs）的共组装水凝胶疫苗，这些肽靶向CD8或CD4 T细胞受体（TCRs）。共组装肽水凝胶疫苗在E.G7-OVA肿瘤模型中显示出更强的抗癌影响，因为它有效地激活了DCs中的MyD88依赖的NF-κB信号传导途径。 3.4.治疗性疫苗的作用机制 由于与过继T细胞转移相比效率不高，癌症疫苗（CVs）的功效一直被忽视。然而，观察到肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）的治疗有效性受到移植T淋巴细胞的表位敏感性的影响，有时发现TILs数量增加。近期研究表明，TILs通常针对新抗原而非大多数针对非病毒恶性肿瘤的治疗性疫苗所针对的常见抗原。实际上，针对黑素细胞分化抗原的持续CTL克隆在诱导患者黑色素瘤显著消退方面是不足够的。针对免疫原性CD-4+ Th和CD-8+ CTL同源体反映新抗原的个性化免疫接种可能有很强的潜力改善症状，如SLP疫苗在实验动物中所证明的。通过创新方法快速评估癌症外显子序列，可以解决定制疫苗生产带来的新的物流和监管挑战。不显著重组癌症微环境就要求癌症疫苗的有效性是不合理的。有必要建立一个工作机制，使疫苗能够有效激活血液中的效应T细胞和记忆T细胞群体，并且这些细胞迁移到癌症区域并参与肿瘤抑制活动。因此，需要额外的干预措施。例如，针对具有类似沙利度胺和其他已知能减少免疫抑制性Treg和/或MDSC群体的常见化疗药物，而不影响效应和记忆T细胞数量。值得注意的是，这种消耗为免疫疗法创造了一个理想的环境，如同时进行的治疗性疫苗接种，以取得更好的结果。化疗免疫疗法增强肿瘤根除的另一种方式是通过顺铂减少癌性或肿瘤细胞的凋亡能力，这是由疫苗诱导的肿瘤内T细胞释放的。在治疗性免疫接种中加入检查点阻断药物是另一种可行的联合疗法选择，并在临床前模型中显示出有希望的结果。图1.3简要概述了治疗性CVs通过影响肿瘤微环境（TME）增强免疫力的机制。图1.3显示了疫苗给药的途径和免疫细胞的迁移，这可以通过皮下（S.C.）给药或分发到富含DC的淋巴结来实现。这些方法已被证明非常有效。除了电穿孔，肌肉内注射也已成功用于传递DNA疫苗。治疗性疫苗采用复杂的疫苗配方，将目标抗原传递给DCs并刺激它们的活性。这导致CD4+和CD8+ T细胞的激活。为了产生和维持CD8+记忆细胞，以及实现最强大和最持久的免疫反应，需要效应CD8+ T细胞的活性。载有抗原的DCs通过传入淋巴被运送到淋巴结，在那里它们激活淋巴细胞。经过启动和激活的T淋巴细胞通过血液、胸导管和传出淋巴等途径到达肿瘤组织。在黑色素瘤的背景下，像Tregs和MDSCs这样的免疫抑制细胞，以及肿瘤细胞产生的IDO、巨噬细胞和免疫抑制性趋化因子，阻碍了T细胞的运动和增长。克服这些敌对因素对于T细胞免疫接种的有效性至关重要。 图 1.3 通常展示的治疗性癌症疫苗的主要作用机制。 3.5.个性化新抗原肽疫苗 CD8+细胞毒性T细胞（Tc细胞）在抗肿瘤免疫中的功能已经得到了广泛的研究。然而，近期研究强调了CD4+ Th细胞的不足，这阻碍了CTL的反应，并强调了它们的重要作用。通过CD40-CD40L相互作用，CD4+ Th细胞可以激活DCs并增强对CTLs的抗原呈递，使其更有效。与它们通常通过细胞因子产生在免疫反应中的作用不同，CD4+ T细胞表现出细胞毒性特征，即使在没有MHC-I限制的CD8+ T细胞反应的情况下，也能直接消除肿瘤。有趣的是，已经有人提出CD4+ T细胞在小鼠中检测到大量免疫刺激性突变组，强调了在抗肿瘤免疫中纳入CD4+ T细胞反应的重要性，特别是在个性化新抗原疫苗的背景下。值得注意的是，近期关于新抗原疫苗的临床研究也观察到了显著的CD4+ T细胞反应，使用MHC-1结合预测方法。与合成长肽（SLPs）相比，短肽被发现能更快速地激活CD8+ T淋巴细胞，因为它们可以在疫苗接种后直接呈现在MHC-I分子上，绕过细胞摄取和内部处理阶段。然而，短肽与SLPs相比更高的信号转导效率只有在免疫接种后的早期阶段观察到，因为SLPs的穿透能力（在图1.4中解释）导致随着时间的推移这种趋势的逆转。这表明，在单个APC（抗原呈递细胞）上传递双重标记而不是两个独立的APC提供了一个更优的方法来发展抗肿瘤免疫。 如图1.4所示，经典的抗原呈递途径包括MHC类I分子，它们向CD8+淋巴细胞呈递内源性抗原，以及MHC类II分子，它们向CD4+ T细胞呈递外源性抗原。在这个过程中，从患者那里获得健康组织基因组、参考基因组和肿瘤基因组等基因组变体。从这些基因组衍生的短肽被用来刺激特异性识别抗原的CD8+ T细胞。这些肽在注射后直接与附近DCs表达的MHC类I分子结合，形成MHC类I-肽复合物。MHC分子装载来自癌细胞RNA转录的新抗原肽。新抗原肽与MHC类I分子结合，T细胞可以通过交叉呈递被激活，导致各种细胞和体液反应。这种个性化新抗原肽疫苗在抗癌免疫反应中发挥着关键作用。 图 1.4 个性化新抗原肽疫苗最常见的工作流程。 交叉呈递使CD8+ T细胞能够通过DCs激活，通过将外来抗原与MHC类I分子结合。T细胞可以通过交叉呈递以多种方式被刺激，这协调了不同的细胞和体液反应，促进了抗肿瘤免疫反应的发展。注射后，短肽产生直接与局部DCs表达的MHC-I分子结合的MHC类I肽复合物，从而刺激特异性识别抗原的CD8+ T淋巴细胞。虽然在成熟DCs表面观察到MHC类I-肽复合物，但它们表现出持续的波动。24小时后，大多数MHC类I-肽复合物在成熟DCs的细胞表面很少被检测到，而形成了MHC类II-肽复合物。为了及时清除异常组织细胞和病原体，MHC-I分子不断呈递来自细胞质的配体，包括新合成的错误折叠蛋白或病毒蛋白。因此，短肽疫苗有有限的抗原呈递窗口，这被认为是其显著功效的贡献因素。然而，SLP MHC-I分子已被证明可以持续至少3天的抗原呈递，并引发更强的抗肿瘤反应。进一步的研究表明，需要细胞内内吞和处理以释放MHC-I配体的抗原（如SLPs）可以在DCs内储存数天。这确保了抗原的持续供应，并允许大量的细胞外MHC类I-肽相互作用，从而延长了DCs的抗原桥接。这些储存器官被描述为类似溶酶体的细胞器。 4.癌症疫苗使用中报告的常见不良反应 开发任何形式的癌症治疗疫苗的障碍既有财务性质的，也有科学性质的。与CVs使用相关的一个主要缺点是不良反应的普遍性。肿瘤细胞适应变化微环境的能力是肿瘤细胞的一个关键特征。免疫系统必须克服这些肿瘤细胞才能在体内生存和扩散，这些通常是公认的抗癌免疫疗法方法。TME富含免疫系统抑制剂，如Tregs，可能阻碍对抗癌疫苗的免疫反应。 疫苗接种后观察到的不良反应，特别是与表1.1中概述的疫苗缺点有关。一个主要关注点是因肿瘤相关抗原（TAAs）而潜在发展自身免疫。例如，接受黑色素瘤疫苗的个体报告经历了白癜风，这是一种以皮肤色素丧失斑块为特征的疾病。这被认为是由于疫苗在靶向TAAs时缺乏特异性的副作用。另一个重要问题是包含用于增强疫苗免疫作用的辅料。佐剂对疫苗效果至关重要，但在它们期望的影响和潜在有害影响之间必须保持微妙的平衡。目前，某些抗癌疫苗佐剂已获批准用于医疗用途，包括称为铝盐的明矾，以及称为MPL的单磷酸脂A型，它是以油包水乳液形式准备的，称为MF-59。当MPL和明矾结合时，被称为AS04。明矾和油包水乳液都向宿主免疫系统传递疫苗抗原，同时控制其释放。然而，它们也可能激活先天免疫系统，导致慢性炎症，可能加剧细胞介导的或全身性免疫反应。MPL由Toll样受体4（TLR-4）产生，这是一种PRR，能够识别病原体相关分子模式（PAMPs）和LPSs。AS04已被授权用作Cervarix和Fendrix的添加剂，这两种HBV疫苗（一种HPV疫苗）。 5.癌症疫苗的重要抗原靶标 预防策略有几个层面。通常，一级预防专注于预防疾病的发生，可能涉及筛查健康个体。它还专注于预防继发性癌症的复发，如对侧乳腺癌，或早期发现和治疗非恶性的初始癌症。最后，三级预防涉及管理治疗后的患者，以防止疾病复发。根据疫苗接种的阶段，目标抗原会有所变化。因此，可以看到针对所有预防水平的癌症预防疫苗（CPV）的众多临床试验。表1.2列出了针对不同类型癌症疫苗的不同目标抗原在不同临床测试中的情况。 5.1.肿瘤相关抗原（TAAs） TAAs是一类在癌细胞中或多或少频繁产生或在组织分化中发挥作用的抗原形式，如Muc-1。通常在生殖细胞中表达的癌症-睾丸抗原（CTAs），包括胎儿细胞、卵巢、睾丸和合体滋养层细胞，也属于这一类。它们在其他健康组织中的表达极少。由于生殖细胞缺乏HLA-I分子，并在各种肿瘤形式中异位产生，免疫系统将这些抗原识别为外来物质。 5.2.癌症-睾丸抗原 疫苗最常针对的黑色素瘤蛋白家族之一是CTA。一种名为NY-ESO-one的肽段作为黑色素瘤的抗原。PRAME与其他恶性肿瘤一样，在卵巢、恶性黑色素瘤、骨髓增生异常综合征和各种骨肉瘤中高度表达。在非小细胞肺癌和转移性黑色素瘤患者中，重组PRAME蛋白与免疫刺激剂AS15联合使用，产生相关的抗体和CD-4+免疫反应。由于其在自发体液免疫反应中表现出的显著性，NY-ESO-one，一种在精子细胞和胎盘细胞中表达有限且在多种恶性肿瘤中重新表达的组分，被广泛用于各种癌症免疫治疗策略。几项对照试验已证明这种疫苗能产生特定的CD-4+和CD-8+反应。 5.3.肿瘤特异性抗原（TSAs）及相关新抗原 由于下一代测序技术，即NGS技术的发展，以及分子生物学的整体进步，个性化医疗的兴趣正在迅速上升。个性化新抗原疫苗方法的标准方法包括获得基因分型。下一步是通过为每个患者特别设计的计算机模型评估或预测新抗原，同时考虑他们的HLA单倍型。可以开发针对高度特异性于恶性肿瘤的新抗原或新表位的个性化疫苗。新抗原在早期癌前病变中出现的可能性支持了预防性疫苗的可能性，这些癌前病变可能发展成肿瘤，尽管它们在癌前病变中的出现数量比在恶性肿瘤中少。 6.临床试验不同阶段的癌症疫苗 与任何形式的癌症疫苗相关的主要挑战是其高昂的成本，使其对国家卫生服务来说无法负担。此外，临床试验仅显示了在生存率上的微小改善，与安慰剂相比平均延长了大约四个月。这种有限的好处可能归因于在人类试验中未被识别的预测因素。Provenge的制造商Dendreon被迫申请第11章破产，疫苗此后被valeant制药公司收购。STAND随机第2阶段试验在24个月内评估了各种反应，包括体液和细胞反应，证明了Provenge在刺激前列腺癌（PC）患者的强烈免疫反应方面的有效性。然而，目前关于治疗的整体有效性的数据不足，使得sipuleucel-T奥德赛成为一个正在进行的工作。表1.3提供了不同阶段临床试验中针对不同类型癌症的CVs的概述，其中大多数仍处于最初的招募阶段。 7.结论 建立预防性癌症疫苗（CVs）的道路充满了障碍。主要障碍包括癌细胞对免疫系统的抑制作用。然而，研究人员正试图利用几种佐剂来解决这一问题。此外，由于癌细胞是从个体自身的体细胞发展而来，它们常常被免疫细胞忽视。此外，某些形式的癌症治疗可能会削弱个体的免疫系统，限制疫苗的有效性。尽管存在这些挑战，一些研究者认为，用疫苗治疗和管理不同类型的癌症可能对小肿瘤或早期癌症更有效。尽管与CVs的概念和策略相关的众多缺点，当前研究表明，接种这种方法可能对癌症预防是可行的。在动物模型中的成功为这一领域的临床发展提供了一个有希望的模型。FDA最近批准了三种治疗性疫苗和四种预防性疫苗在美国使用。临床试验对于进一步理解癌症免疫疗法至关重要，无论是在治疗还是预防背景下。研究人员目前正在测试多种癌症的免疫接种，特别是基于NY-ESO-1的结肠癌（CC）免疫接种，以及MUC1、CEA和鸟苷酸环化酶C。医生可以为转移性前列腺癌（PC）患者接种sipuleucel-T疫苗。最近的进步促进了各种类型CVs的发展。本章讨论的许多策略似乎对未来的进展是可行的，并且可能从最近和改进的工程解决方案中获得额外的洞见，这些解决方案结合了不同的方法。例如，针对并增强宿主对预防性抗癌疫苗的适应性免疫系统反应对于成功实施有效的预防性癌症疫苗至关重要。因此，有显著的潜力和乐观态度认为，将开发出更多类型的此类疫苗，并在不久的将来广泛实施以预防各种形式的癌症。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 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近期Signal Transduction and Targeted Therapy杂志（IF=40.5）上发表了一篇重量级AAV基因治疗综述文章（通讯作者为美国马萨诸塞大学Chan医学院的高光坪教授），深入探讨了AAV基因治疗的最新突破与未来趋势。这篇文章不仅汇聚了行业内的权威观点，更揭示了关键技术的最新动态，为学术界和产业界的创新提供了全新启发。前几章我们分别学习了AAV的基础知识、AAV的载体开发、AAV的生产工艺以及AAV的临床应用，相信大家都有不少收获，下面我们继续深入学习AAV临床应用中存在的免疫原性和应对策略。 rAAV基因治疗临床应用的挑战和局限性 rAAV衣壳的性能与给药方式密切相关，因此需要探索不同的递送方式，以便将其递送至合适的位置。每种递送方式和衣壳的选择都应根据具体的疾病、靶向区域、器官系统，以及患者年龄等因素来确定（表2）。 表2 rAAV不同给药方式的优点和缺点 一个经典的例子是血脑屏障（BBB）的存在，它有效地保护了中枢神经系统，也成为基因治疗需要克服的一个重要障碍。一些rAAV衣壳能够有效穿过血脑屏障。如果治疗的目标仅限于大脑的某个小区域，那么通过静脉注射给药以靶向中枢神经系统就不是最优选择，因为它需要的载体剂量较大，且可能导致较大的副作用，同时无法实现对目标区域的最佳转导。在这种情况下，直接且局部的递送方式至关重要，AADC的治疗案例便是一个典型的例子。然而，即使是在有限的区域内递送，衣壳的选择也必须非常谨慎。比如，rAAV9即便在局部递送时也表现出明显的组织扩散和较广泛的亲和性，而像rAAV2这样的血清型则转导能力较为有限。 另一个挑战是从临床前研究到临床试验的转化。为了降低静脉注射所需的高剂量带来的载体成本和风险，通常采用脑脊液空间给药来实现中枢神经系统的广泛转导。然而，将小鼠、大鼠甚至更大动物的研究结果外推到人类身上面临巨大的挑战。例如，rAAV9在小鼠中能够实现全脑转导，因为小鼠的侧脑室和皮层之间的距离仅为几毫米，而在人类中，这个距离则是几厘米。因此，采用脑脊液递送方式进行广泛的中枢神经系统转导的临床试验，必须证明这种递送方式在人类中的可转化性。 rAAV的免疫原性 除了物理屏障之外，rAAV还面临着免疫系统设立的多重生物屏障，这些包括预存免疫、补体激活、天然免疫模式和危险信号受体，以及适应性免疫中的B细胞和T细胞反应（图6）。在这里，我们将讨论每种免疫屏障如何对载体转导产生负面影响，以及现有的潜在解决方案。 图6 rAAV基因治疗中的免疫反应。a. 预先存在的AAV特异性抗体可能与rAAV相互作用，阻止其进入目标细胞。来自细菌的内肽酶IdeS及其同源物能够将抗体切割成Fab和Fc片段，从而缩短抗体在血液中的半衰期，并消除Fc介导的功能。另外，也可以通过修饰rAAV衣壳或将其包装在外泌体（EVs）中，以防止被抗体的识别。b. 在给予高剂量rAAV时，观察到补体激活现象，其具体机制尚不清楚。主要假设是rAAV与细胞表面结合，通过与补体C1q的相互作用激活经典途径，导致C4和C2裂解形成C3转化酶C4b2b。随后，C3被裂解并形成C5转化酶，裂解C5成C5b，C5b与C6-9结合形成膜攻击复合物（MAC），直接导致细胞裂解，从而引发肝脏或肾脏损伤。补体激活还可能引发内皮损伤、血栓性微血管病（TMA）和非典型溶血性尿毒症综合征（aHUS）。环肽APL-9是C1抑制剂，依库珠单抗则可抑制C1、C3和C5，可能有助于抑制补体激活级联反应。c. 包括TLR2（识别病毒衣壳）、TLR9（识别未甲基化CpG）和RIG-I/MDA5（识别双链RNA）在内的天然免疫受体已被证实能够促进炎症反应。通过一系列信号转导事件，IRF3、IRF7和NF-κB会被磷酸化并转移到细胞核，激活I型干扰素（IFN I）、干扰素刺激基因（ISGs）和促炎细胞因子，进而介导抗病毒免疫和炎症反应。许多信号通路的组成成分可以被药物抑制剂靶向。此外，来自端粒的io2序列（一种哺乳动物端粒来源的ODN TTAGGG重复序列）能够抑制TLR9的激活。d. GOI的表达产物和衣壳可以通过蛋白酶体加工为肽段，随后由MHC-I或MHC-II分子进行呈递。识别这些肽段的CD8和CD4 T细胞将被激活。CD8 T细胞可能会直接杀死rAAV转导的细胞，而CD4 T细胞则可以协助CD8 T细胞和B细胞增强其效应功能。可以特异性识别衣壳的B细胞会释放抗体，可能导致未来重复给药时抗体介导的免疫排斥。通过在GOI质粒中表达盒的3’UTR设计miRNA结合位点，可以与细胞内的miRNA相互作用，导致转录本降解。在抗原呈递细胞中，这种设计可能会阻止转基因来源的肽段被呈递给T细胞。此外，抗CD20抗体利妥昔单抗和mTOR抑制剂雷帕霉素也可用于减少适应性免疫反应。 1 预存免疫 针对rAAV衣壳的预先存在的体液免疫反应，通常通过rAAV特异性中和抗体（NAbs）来衡量，这些抗体可能源自与野生型AAV的过往接触，形成了免疫记忆。新生儿在出生后的前6个月会携带母体来源的AAV中和抗体。之后，中和抗体的滴度会逐渐下降，但在婴儿7至9个月大时，抗体滴度会再次升高。不同血清型和不同地理区域的血清阳性率差异较大，从低于10%到超过90%不等。对于rAAV基因治疗来说，这种免疫反应是最大的挑战之一，因为即使是低水平的血清阳性反应，也可能显著降低通过静脉给药的载体转基因表达效果。 在与外来抗原积极交战时，一些表达IgG的B细胞会分化为长期存在的浆细胞，这些浆细胞主要驻留在骨髓中，并在感染得到控制后继续产生抗原特异性的IgG。尽管IgM水平在感染结束后会迅速下降，IgG水平却可以保持相当长的时间，成为抵抗感染的主要体液免疫屏障。 NAbs（中和抗体）在再次给药时也是一个巨大的挑战。由于rAAV基因组通常以环状游离基因组的形式存在，它们在宿主细胞每次分裂时会平均减少一半，且在宿主细胞死亡时会丢失。因此，在患者的一生中，特别是对于细胞周期活跃的器官（如肝脏）的基因治疗，可能需要多次给药。然而，重新给药时会受到由第一次给药引发的NAbs的抑制。 基因治疗中rAAV衣壳-抗体的相互作用：在基因治疗中rAAV衣壳与抗体的相互作用尤为关键。通过冷冻电镜（cryo-EM）或肽扫描技术，可以捕捉到抗体与AAV衣壳表面相互作用的互补决定区（即抗体接触抗原的位置）。研究人员已经识别出一些抗原“热点”区域，比如二十面体结构的3重对称轴、5重对称轴以及2/5重对称区域等。在一项针对接受Zolgensma治疗的患者的最新研究中，约75%的抗体与2重表面结合。尽管这些发现有助于指导衣壳改造，以避开由抗体引发的预存免疫反应，但需要注意的是，rAAV相对较小，因此即使少量抗体结合到病毒衣壳上，也足以覆盖其表面并阻止病毒进入细胞。 对局部与系统给药方式的影响：静脉输注最容易受到循环中rAAV特异性抗体的影响。相比之下，局部注射到免疫豁免器官（如眼睛和中枢神经系统）的方式对rAAV特异性抗体的限制较小，并且有可能进行重新给药。尽管玻璃体中的预存中和抗体（NAbs）水平远低于血清中的水平，但玻璃体中的NAb水平与血脑屏障（BBB）的完整性呈负相关关系，这一点在评估眼科基因治疗潜在影响时尤为重要。在接受ADVM-022通过玻璃体内注射的非人类灵长类动物（NHPs）中，注射了一只眼睛后，血清和注射眼睛中均出现了NAbs，但未注射的眼睛中并未出现。两个月后对另一只眼睛进行玻璃体内注射，未导致炎症加重。与第一只眼睛相比，第二只眼睛中的转基因表达趋势较低，但仍在预测范围之内。 有趣的是，针对循环中NAbs的不同敏感性，可能可以作为一种策略，以限制载体在非靶组织中的感染。具体来说，在进行脑内或脑室内注射时，NAbs的存在能够阻止转基因递送到肝脏，但不会阻止其递送到中枢神经系统。 筛选预存免疫：可以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）来检测针对rAAV衣壳的总抗体（TAb）水平。为了确定患者是否符合临床试验的入组标准，许多试验采用基于细胞转导抑制（TI）的方法来评估患者血清需要稀释到什么程度才能允许最佳的rAAV感染。有时，血清中可能出现TAb阳性但TI阴性的情况，这表明并非所有AAV特异性抗体都会抑制转导。更有趣的是，有些血清TAb阴性但TI阳性，这意味着血清中存在非抗体的抑制性成分。 逃避预存免疫的策略：CD20是一种在B细胞上高度表达的特异性分子，能够被利妥昔单抗（rituximab）靶向。利妥昔单抗在多个基因治疗试验中与其他免疫抑制剂（如类固醇和雷帕霉素）联合使用，旨在减少全身炎症反应以及B细胞和T细胞介导的免疫反应。然而，利妥昔单抗无法有效预防已有的体液免疫反应，因为长期存活的浆细胞不表达CD20。 在rAAV外面包裹囊泡（EVs）可能有助于部分逃避中和抗体（NAbs）的作用。还可以在EVs表面加载免疫抑制分子，如CTLA-4，从而进一步抑制免疫反应。将rAAV包裹在EVs内部可能改变其对不同组织的趋向性，这可能需要对EV进行额外的修饰，类似于对rAAV衣壳的改造。这也是逃避预存免疫反应的另一种常见方法。 最近，研究者探索了能够切割人类抗体的细菌内肽酶。来自化脓性链球菌的IgG降解酶Imilifadase（IdeS）已被证明能够有效消耗总IgG，并在rAAV血清阳性的非人灵长类动物（NHPs）中显著改善载体转导。来自马链球菌的IdeZ也显示出了类似的效果。此外，IdeXork，一种专有的IgG降解酶，目前正在基于rAAV的迟发性庞贝病临床试验中进行研究。多项研究表明，IdeS型酶能够提供一个5-7天的无IgG窗口期。一个潜在的问题是，IdeS在中和滴度较低时（例如，NHP中AAV3B的中和滴度约为1:108）效果最佳。在一个初始中和滴度为1:696的NHP中，IdeS将滴度降至1:88，这仍然足以抑制转基因表达。此外，针对IdeS的适应性免疫反应可能会降低其效果。借鉴移植研究的经验，二次使用IdeS可能只能提供一个24小时的治疗窗口，因为会产生抗IdeS抗体。 此外，还有来自猪链球菌的IgM切割酶（IceM）和经过工程改造的IceMG，后者能够同时切割IgM和IgG。除了切割血清中游离的IgM/G外，这些酶还能从B细胞表面切割IgM，并阻断rAAV9介导的补体激活。不过，这些酶是否能转化为临床应用仍需要进一步研究。 2 补体激活 补体系统由一系列高浓度的血清蛋白和相关细胞表面受体组成。在接受高剂量（约1.0 × 10^14 vg/kg）rAAV基因治疗的患者中，许多人出现了与补体激活相关的治疗相关不良事件（TEAEs），包括血小板减少、溶血性贫血、血栓微血管病（TMA）、转氨酶升高、急性肝损伤以及类似溶血性尿毒症综合征（aHUS）的肾损伤。已有因补体激活引发的死亡案例。值得注意的是，截至2022年1月13日，在超过1400名接受Zolgensma治疗的患者中，记录了9例TMA病例（约占0.6%）（https://www.fda.gov/media/126109/ download）。 补体激活可以通过三种途径之一发生：经典途径（由IgM/IgG、C1q和C4介导）、替代途径（通过C3的自发水解）和凝集素途径（由甘露糖结合凝集素介导）。这三条途径最终都汇聚到C3转化酶和C5转化酶的形成，进而产生膜攻击复合体，导致细胞死亡。 rAAV输注期间补体激活的具体机制尚未完全明了。AAV2衣壳能够直接免疫沉淀C3及其裂解产物C3b和iC3b，但在体外，当rAAV颗粒的剂量达到1 × 10^14 vg/kg时，在无IgG的混合人类血清中并不会激活C3。体外实验表明，只有当存在抗AAV抗体时，AAV才能在全血中激活补体。多个临床试验观察到接受rAAV治疗的患者体内C4水平下降。此外，最近一项针对接受Zolgensma治疗患者的研究发现，单独接受类固醇治疗的患者表现出更高的TMA发生率，并且AAV9特异性IgM和IgG滴度较高，而同时接受类固醇、利妥昔单抗和雷帕霉素治疗的患者则表现出较低的抗体滴度和最小的补体激活。这些证据似乎表明，rAAV输注中的补体激活是通过经典途径发生的。然而，两个观察结果与这一假设存在一定的冲突，尚未得到充分解释。首先，在AAV初次接触的患者中，即便在rAAV特异性IgM和IgG尚未产生之前，C4水平就已较低。其次，患者在预先筛选时已被被确定为特定AAV血清型阴性。 在rAAV给药后，小鼠和非人类灵长类动物（NHPs）似乎没有表现出在人类中观察到的补体激活特征。在NHPs中，即使AAV特异性IgM尚未出现，也在给药后第3天短暂出现了补体激活，表现为Bb和sC5b-9的增加，而非C4b。在小鼠中，未发表的结果显示，当AAV的剂量达到2.5 × 10^14 vg/kg时，补体激活非常轻微。最近一项在小鼠中的研究表明，当剂量达到3.0 × 10^14 vg/kg时，可检测到血清中的C3b和肝脏中的C5b-9；而在7.0 × 10^14 vg/kg的超临床剂量下，出现了轻度的血小板减少，并且补体激活的峰值出现在给药后的第3天。 补体抑制策略：目前正在测试几种补体抑制剂用于rAAV基因治疗，包括阻断C5的人单克隆抗体依库珠单抗、阻断C3的肽类抑制剂APL-9421以及天然存在的血清蛋白C1酯酶抑制剂（C1-inh）。 依库珠单抗已用于治疗溶血性尿毒症综合征（aHUS），并且也已用于TMA后的基因治疗患者。尽管大多数患者从TMA中恢复，但有一名患者最终因新发的金黄色葡萄球菌表皮炎感染导致急性肾损伤而死亡。依库珠单抗能够降低血清中的sC5b-9并略微增加血小板计数，但未能挽救该患者，因为补体在抗细菌防御中是必不可少的。 由于C3与rAAV衣壳的相互作用促进了小鼠巨噬细胞对病毒的摄取，因此补体抑制可能会影响rAAV的转导效率。体外实验结果证实，APL-9421在NAb高的血清中能够减少人类血液白细胞对rAAV的摄取，但在NAb低的血清中没有此效应。然而， C1-inh在未免疫小鼠和免疫小鼠中分别提高了约33%和28%的肝脏转导效率。 3 天然免疫 细胞的表面、内质体和细胞质中存在一些被称为天然免疫受体的模式识别受体（Pattern Recognition Receptors，PRRs），它们能够识别病原体相关分子模式（Pathogen-Associated Molecular Patterns，PAMPs），触发免疫应答。这些受体包括Toll样受体（TLRs）、RIG-I（维甲酸诱导基因-I）样受体（RLRs）、NOD样受体（NLRs）等，它们有助于宿主防御微生物感染，特别是对病毒等病原体的识别和响应至关重要。天然免疫受体通常在病原体感染后的几分钟或几小时内被激活。由于rAAV是病毒，它的一些固有特征可能会被这些天然免疫受体识别。天然免疫受体激活后会导致炎症细胞因子的产生，这些因子已被证明显著降低转基因表达，并进一步诱导适应性免疫应答。 已证明与rAAV相互作用的天然免疫受体：已证实与rAAV相互作用的先天受体包括TLR-2、TLR-9、MDA5和RIG-I。TLR-2是一种细胞表面受体，能够识别多种微生物相关的配体，如脂蛋白、肽聚糖和糖脂。TLR-2还可以通过与TLR-1和TLR-6形成异二聚体，进一步扩大其配体识别范围。研究发现，rAAV2和rAAV8通过TLR-2依赖的途径在人体肝细胞中激活了NF-κB介导的细胞因子表达。TLR-9是一种内质体膜附着的受体，负责识别微生物DNA中的未甲基化CpG序列。rAAV激活TLR-9不仅导致下游TLR信号转导介导的细胞因子（如IL-6和TNF-α）的急性表达，还会促使细胞毒性CD8+ T细胞浸润，导致转导细胞的死亡。此外，通过从基于rAAV8的血友病B治疗载体中去除CpG序列，可减少中和抗体的产生。MDA5和RIG-I是细胞质中的dsRNA传感器。rAAV的3′ ITR区域可能具有合成负链RNA的启动子活性，其与正链转录本退火形成双链RNA。人体肝细胞和灵长类视网膜均高表达MDA5和RIG-I，且在体外rAAV感染后能介导IFN-β的产生。 最近的一项研究表明，IL-1受体（IL-1R）-MyD88信号转导是rAAV检测的关键因素。研究发现，IL-1R−/−和MyD88−/−小鼠在注射rAAV8.OVA后并未显示出转基因特异性T细胞反应。IL-1R的配体为IL-1α和IL-1β，这些配体在炎症小体激活后被激活，而MyD88在TLRs和IL-1R的下游发挥作用。有趣的是，缺乏TLR2/3/4/9、NLRP1/3、AIM2或Caspase-1的小鼠表现出正常或仅轻微降低的转基因特异性T细胞反应，表明rAAV可能由未知的天然免疫受体识别到。 减轻天然受体信号传导的策略：为减少TLR-9信号传导，可通过密码子优化去除rAAV载体中的CpG序列。然而，这种方法的一个担忧在于不同tRNA分子的丰度可能存在差异，改变其使用可能会影响蛋白折叠的动态，并增加误折叠的风险。因此，在rAAV生产过程中加入甲基转移酶或许是一个更好的替代方案。另一种选择是添加TLR-9抑制序列。哺乳动物端粒来源的ODN TTAGGG重复序列能够形成G-四联体，可通过与TLR-9结合以抑制其二聚体的形成和信号传导。携带该序列的rAAV在多种动物模型中表现出较低的免疫刺激性，减少了肝脏、肌肉和视网膜的T细胞浸润。 药理学抑制天然免疫信号通路也是一种可行策略。阻断IL-1（炎症小体相关细胞因子）可以降低rAAV衣壳和GOI表达产物特异性CD8+ T细胞的比例，而抑制IL-6（TLR相关细胞因子）则减少了对rAAV衣壳的抗体反应。此外，在体外实验中抑制IRAK4（TLR信号通路中的激酶）降低了TLR-9介导的细胞因子表达，目前该策略正在进行体内测试。 4 适应性免疫 适应性免疫是指抗原特异性的B细胞和T细胞反应。B细胞能够产生针对rAAV衣壳的抗体，从而使再次给药变得不可能。细胞毒性CD8+ T细胞可以识别来自GOI表达产物和rAAV衣壳的外源性肽片段，并启动对转导细胞的杀伤。CD4+ T细胞通过分泌Th1、Th2或Th17型细胞因子来辅助B细胞和细胞毒性T细胞的反应。适应性B细胞反应的形成过程与预先存在的体液免疫机制相似，因此本节将主要关注T细胞反应。 T细胞介导的不良反应：背根神经节（DRG）是沿脊髓分布的感觉神经元群，发挥传递感觉信息的关键作用。研究发现，在NHP、啮齿动物和小猪模型中，DRG损伤的发生率与剂量呈正相关。在一位人类患者中，观察到DRG毒性症状，包括感觉变化、疼痛和核磁共振成像（MRI）上DRG的增强。部分损伤可能由GOI引起，通常持续时间和影响范围有限，但严重的DRG毒性则与CD8+ T细胞的大量浸润有关，且不受类固醇的影响（https://www.fda.gov/media/152000/download）。类似地，在NHP中，系统性rAAV感染后出现的心肌炎被认为是由于心肌损伤引发的CD8+ T细胞介导的细胞毒性反应所致，表现为严重心肌炎中CD8+ T细胞的高浸润，以及酶联免疫吸附点试验中检测到的强烈的GOI特异性反应。 当前的免疫抑制药物：目前，许多试验已采用包括类固醇、利妥昔单抗和雷帕霉素在内的三重免疫抑制方案。而当前用于抑制rAAV基因治疗临床试验中免疫反应的药物几乎都最初用于治疗其他疾病（如自身免疫疾病、器官移植和肿瘤），并非专为rAAV开发（表3）。这些疾病的生理机制与基于rAAV的基因治疗可能存在显著差异，因此有必要进一步研发专门针对rAAV的药物疗法。 表3 目前在基因疗法试验中使用或在动物模型中正在研究的免疫抑制药物。 在推进对rAAV免疫学的理解过程中，有三个关键领域值得关注：首先，关于野生型AAV的基础免疫学研究存在显著空白；其次，现有免疫学研究主要集中在原代免疫细胞、源自免疫细胞的细胞系或肿瘤细胞，而忽略了rAAV基因治疗在体内靶向的多种体细胞（如中枢神经系统细胞、视网膜细胞、肝细胞和肌肉细胞），这些细胞具有各自独特的免疫特征；第三，从动物模型获得的见解并不总能反映人类临床试验中的免疫反应。为应对这些挑战，可以考虑改进体外建模系统，如混合细胞培养、3D类器官和诱导多能干细胞。此外，CRISPR筛选技术的进步可能有助于识别参与rAAV基因递送的细胞因子。创新的体内系统也在研发中，如植入人类骨髓、肝脏和胸腺（BLT）系统的小鼠模型，有望用于监测人类天然免疫受体的激活及人类适应性免疫的形成。 参考资料： 1.  https://doi.org/10.1038/s41392-024-01780-w 关于派真生物

点击上方“蓝字”关注我们吧！ 呼吸道合胞病毒（RSV）是儿童急性呼吸道感染的主要病因之一，暴露于包括香烟烟雾、颗粒物、苯、臭氧（O3）、一氧化碳（CO）或二氧化氮（NO2）在内的空气污染则可能增加RSV发病率和严重程度。世界卫生组织（WHO）已公布六种最重要的空气污染物清单，包括颗粒物≤直径10μm的颗粒物（PM10）、直径在0.1至2.5μm之间的颗粒物（PM2.5）、NO2、O3、二氧化硫（SO2）和CO。 目前关于RSV和空气污染的确切病理机制数据较少，主要结论集中在宿主抗病毒能力下降、促进病毒进入和病毒载量增加、病毒从主要感染细胞释放增加、炎症反应延长和/或加重（可能导致组织病理改变，粘液分泌增强和气道高反应（AHR）），其中最重要的共同机制之一似乎由氧化应激所介导。 N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为一种具有抗氧化和抗炎特性的粘液溶解药物，已广泛应用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）、支气管扩张症、特发性肺纤维化等临床研究中。一篇发布在《International Journal of Molecular Sciences》（IF=4.9）的系统综述回顾现有文献以确定NAC在治疗RSV感染和空气污染中的分子作用机制[1]。 研究设计 研究者对Scopus、PubMed（Medline）和Cochrane数据库进行了系统的文献检索，检索数据库中1998年至2023年9月7日期间所有分析NAC在RSV感染或空气污染中的分子作用机制的原始研究。共检索出167项研究，去重后，根据摘要和标题排除了122项研究，阅读全文最后筛选出28项原始研究纳入系统综述。 研究结果 NAC可减少病毒进入 空气污染主要通过两种机制促进病毒进入： (1)损伤保护屏障（由于现有屏障受损或存在额外的运输通道）； (2)病毒吸附增加（由于细胞表面的变化促进病毒粘附，或RSV获得特殊毒力，从而促进其粘附到细胞表面或进入），但暂未发现关于RSV毒力增加的信息（图1）。 ①NAC可改善上皮屏障通透性 Smallcombe等人在人支气管上皮细胞和小鼠模型中证明，TiO2-NP通过破坏顶端连接复合物（AJC）和重塑细胞内细胞骨架肌动蛋白对AJC的锚定以增强RSV诱导的上皮屏障瓦解，使上皮变得“渗漏”，从而增强病毒感染。通过评估病毒降低滴度，NAC治疗减少了AJC分解，改善了上皮通透性，降低了RSV感染程度。 氧化应激在其中扮演着不容忽视的作用，研究发现共暴露于RSV和TiO2-NP后细胞内活性氧（ROS）水平迅速增加，并保持高水平长达36小时；Wen等人的研究证实暴露于TiO2-NP后过氧化氢酶（CAT）活性增加，ROS上调，许多细胞间隙和内皮层通透性增加，内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）表达降低，而NAC的使用逆转了氧化应激和间隙的形成，表明其在氧化应激中发挥关键作用。 ②NAC可抑制血清细胞间粘附分子1（ICAM-1）表达 ICAM-1是一种存在于多种细胞表面的糖蛋白，包括上皮细胞和内皮细胞、淋巴细胞和单核细胞，RSV感染诱导人内皮细胞上ICAM-1表达呈时间和剂量依赖性过度增加。 Mata等研究表明，在RSV培养的原代正常人支气管上皮细胞（NHBEC）中，使用NAC预处理可消除ICAM-1表达增加现象；Modestou等人发现香烟烟雾提取物抑制干扰素-γ（IFN-γ）诱导的人器官支气管上皮细胞（hTBE）中ICAM-1的表达，但NAC和谷胱甘肽单乙基酯（GSH-MEE）能够减轻这种抑制作用。 除ICAM-1外，空气污染还可能诱导其他表面分子表达：TiO2-NP诱导内皮细胞中ICAM-1、血管细胞间黏附分子1（VCAM-1）、血小板内皮细胞黏附分子（PECAM-1）和选择素（E和P）的表达，以及它们在单核细胞上的配体包括早期[E-选择素配体（sLex）和P-选择素配体（PSGL-1）]和晚期粘附分子[ICAM-1配体（LFA-1）、VCAM-1配体（VLA-4）和PECAM-1配体（αVβ3）]的受体表达，而NAC可抑制表面受体的表达。 ③NAC可阻断表皮生长因子受体（EGFR）磷酸化 RSV进入细胞的另一种机制涉及EGFR的磷酸化和激活以及与EGFR相关信号因子的级联反应（PI3K、PKC、Cdc42、PAK1和N-Wasp）。RSV与细胞表面结合即激活EGFR的磷酸化及其下游信号级联，通过微胞饮作用引起肌动蛋白重排和内吞。NAC可阻断人支气管上皮细胞（HBECS）中EGFR的磷酸化，从而阻止病毒的内吞作用并减少感染。 NAC可抑制病毒载量增加 病毒载量增加可能源于宿主抗病毒反应降低、感染开始后RSV释放加速（通过促进从主要感染细胞释放）或由于RSV获得异常毒力（图2）。 ①NAC可恢复抗病毒反应 人T细胞和自然杀伤（NK）细胞具有产生IFN-γ的能力，IFN-γ与其受体结合，并通过磷酸化Stat1导致Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）通路激活，二聚磷酸化的Stat1随后易位到细胞核并激活抗病毒基因。香烟烟雾提取物（CSE）抑制Stat1的磷酸化，并抑制IFN-γ介导的RSV mRNA和RSV蛋白表达降低，而使用NAC或GSH-MEE可恢复IFN-γ的抗病毒作用。 ②NAC可抑制病毒释放 在暴露于CSE和RSV的hTBE细胞中观察到较高的病毒载量似乎与香烟烟雾可能阻止RSV诱导的caspase激活有关。在受CSE和RSV侵袭的细胞中，坏死比凋亡更明显，这导致病毒从感染细胞中释放出来，而不是凋亡。 一系列实验表明，使用NAC和醛脱氢酶能够部分逆转上皮细胞从凋亡到坏死的转变，这表明ROS和丙烯醛在这一复杂系统中发挥了重要作用。细胞模型显示，无香烟烟雾暴露的RSV也会产生ROS，并激活蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶点（AMPK-MTOR）信号通路，从而诱导自噬，促进病毒感染。敲除自噬基因（如beclin1）或用AMPK抑制剂（化合物C）或NAC治疗能够抑制RSV复制，但化合物C仅能阻断自噬依赖性RSV复制，NAC则具有抑制自噬依赖性和自噬非依赖性途径的能力。 Zhou等人的研究将细胞凋亡标志物的评估与临床角度相结合，在126例老年慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者中采用口服NAC、吸入硫酸特布他林和两者联合三种治疗方法。所有治疗方案均可降低Fas受体/凋亡抗原1（Fas/APO-1）和可溶性Fas（sFas）水平，改善氧化还原状态，即ROS降低、氧化应激指标丙二醛（MDA）降低，并伴有超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）升高，且两药合用效果最佳。 NAC可减轻过度的宿主反应 ①NAC可减轻过度的促炎反应 A． NAC可减少促炎趋化因子和细胞因子的产生 许多促炎趋化因子和细胞因子被认为与RSV感染和空气污染共同暴露后的强烈的免疫反应有关，具有广泛数据支持的包括白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的作用，以及在激活后调节的正常T细胞表达和分泌（RANTES）（图3）。 Lei Chi等人的研究证实了NAC的抗炎作用：NAC处理后细胞上清液中mRNA表达和细胞因子浓度（TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18）均显著降低；Mata等人的研究也表明NAC抑制IL-6、IL-8和TNF-α的表达；在苯并[a]芘引起的急性肺损伤小鼠模型中，NAC预处理能够减轻炎症反应，降低TNF-α、IL-6、MCP-1、MIP-2（巨噬细胞炎症蛋白2，Cxcl2）基因的表达。 B．NAC可降低NF-κB刺激作用 Carpenter证明了NAC抑制RSV诱导的趋化因子表达的方式与TNF-α不同，提示氧化还原敏感的NF-κB通路参与了IL-8、MCP-1和RANTES的诱导。 当HBEC（BEAS-2B）、正常人支气管上皮（NHBE）和COPD人支气管上皮（DHBE）细胞暴露于PM2.5后，NF-κB靶细胞因子的结合活性和分泌均表现出剂量依赖性增加。长时间暴露于PM2.5会导致核因子-红细胞2p45相关因子2（NRF2）信号通路部分失活，破坏线粒体氧化还原稳态。NRF2/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（KEAP-1）是抗氧化反应的关键调节因子，KEAP1释放NRF2导致其蛋白体降解，从而刺激包括血红素加氧酶1（HO1）基因在内的NRF2靶基因产生抗氧化作用。 Mata等人的研究描述了NAC作用诱导的抗氧化机制：感染RSV后第15天HO1表达下降，NAC预处理后HO1表达不仅恢复且升高。由于NRF2本身表现出复杂的时变反应，RSV感染后，总抗氧化状态（TAS）即细胞对氧化事件的反应能力下降，使用1mM NAC预处理恢复，使用10mM NAC预处理后增加。此外，NAC能够抑制NF-κB向细胞核的易位以及p38/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化以调节NRF2的表达。 IL-8和RANTES的产生均受柴油尾气颗粒诱导，p38/MAPK磷酸化在HBECs中起关键作用，NAC预处理不仅降低了p38 MAPK磷酸化酪氨酸和苏氨酸的数量，也因此降低了IL-8和RANTES的浓度。MAPK信号通路包括三个信号通路：细胞外信号相关激酶（ERK）、Jun氨基末端激酶（JNK）和p38，它们将信号从细胞膜传递到细胞核，Wang等人使用细胞（HBECs）和动物（小鼠）模型进行的一项研究表明，在暴露于颗粒物之前使用NAC预处理可阻断ERK、JNK和p38的磷酸化。 C．NAC可阻止或减少氧化应激 氧化应激在RSV和空气污染的相互作用中起着至关重要的作用，NAC可有效阻止或减少氧化应激的危害。RSV感染HBECs模型（BEAS-2B）显示，RSV诱导ROS和MDA的产生，SOD活性和细胞内还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比值。NAC处理可抑制ROS和MDA的产生，提高SOD活性和GSH/GSSG比值，从而减弱RSV感染的病理效应。柴油尾气暴露的体外模型表明，NAC具有恢复细胞内GSH/GSSG比值、抵消脂质和蛋白质氧化、抑制氧化应激诱导的HO-1表达的能力。 在人体和动物模型中，颗粒物均可诱导ROS以剂量和时间依赖的方式产生，而NAC预处理能够阻断ROS的产生；缺氧-再氧化应激通过增加ROS的产生对人上皮细胞造成损伤，NAC可有效缓解该现象；此外，RSV感染会增加热休克70kDa蛋白6（HSPA6），而NAC可有效阻断HSPA6 mRNA和蛋白表达。 D．NAC可减轻病原相关分子模式（PAMP）激活带来的影响 toll样受体（TLRs）是膜结合的模式识别受体（PRRs），TLR3、TLR7、TLR8和TLR9识别特定的病毒基因组成分，并在病毒诱导的信号转导中发挥关键作用。Wang等人的研究证实了人肺上皮A549细胞中TLR3的激活与氧化应激之间存在相关性。 RSV感染细胞羟基自由基（·OH）和一氧化氮（NO）浓度升高，SOD总活性降低，NAC预处理可降低这些影响，并且·OH和NO水平均与RSV感染持续时间呈时间依赖性；在mRNA表达方面，RSV感染后TLR3和NF-κB上调，干扰素调节因子-3（IRF3）和超氧化物歧化酶1（SOD1）基因下调，NAC预处理可逆转mRNA和蛋白的表达模式，提示氧化应激可能在TLR3激活和炎症反应增强中起调节作用。 ②NAC可抑制过度的粘液分泌 RSV感染和空气污染（如香烟烟雾）可能增加粘液分泌，MUC5AC作为一种形成凝胶的粘蛋白，是人类粘液的主要成分之一，Mata等人的研究表明，NAC能够抑制粘蛋白基因MUC5AC的释放。 ③NAC可改善肺部结构异常 在慢性鼻窦炎或COPD等病理条件下，杯状细胞化生和MUC5AC表达增加，而香烟烟雾增强了病理反应，这主要是由EGFR通路介导的。Mata等人研究发现，感染RSV的NHBECs的纤毛阳性和β管蛋白阳性细胞数量下降，并伴有轴突基底体超微结构异常，而NAC能够以剂量依赖的方式抑制上调，恢复上皮功能；Lei Chi等人的研究也表明，在人HBECs（BEAS-2B细胞）中，NAC处理抑制了EGFR的磷酸化和MUC5AC的激活。 大鼠肺支气管肺泡灌洗（BAL）表现为高浓度环境颗粒引起的多形核白细胞内流，并伴有细支气管血管增厚、细支气管炎症和肺水肿等组织病理改变，NAC预处理逆转了多形核白细胞内流，动物无组织学变化。此外，NAC预处理可逆转小鼠肺部颗粒物诱导的PM沉积周围炎症细胞浸润，减少支气管肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞和巨噬细胞数量，提高肺损伤评分。 ④NAC可减轻肺气肿 Cai等研究显示NAC可减轻吸烟致COPD大鼠晚期肺气肿，NAC处理大鼠的平均线性截距（MLI）和破坏指数（DI）均较低。重要的是，NAC降低了肺泡间隔细胞的凋亡指数（AI），逆转了血管内皮生长因子（VEGF）及其受体蛋白（VEGFR2）表达的下降，AI与VEGF水平呈负相关。苯并[a]芘引起的小鼠组织病理学改变包括气道壁增厚，MLI减少，DI增加，经NAC预处理后均有缓解，肺病理总评分均有改善。 另一种小鼠模型研究了臭氧诱导的COPD，并比较了NAC的预防和治疗作用，结果显示，暴露前给予NAC能够减少BAL和气道平滑肌（ASM）肿块中的巨噬细胞数量，而治疗性给药能够减少ASM肿块和凋亡细胞数量，但肺气肿不可逆。肺气肿的机制复杂，与基质金属蛋白酶（MMP）尤其是MMP-9和MMP-12相关，在颗粒物暴露模型中，NAC预处理后HBECs和BALF中MMP-9的表达和水平均降低。 ⑤NAC可减轻DNA损伤和衰老 氧化应激诱导DNA损伤，并可能引发细胞衰老（增殖停止），这已在RSV感染中得到证实。RSV感染后，ROS产生增加，DNA损伤和增殖阻滞标志物表达增加，而NAC可显著减少受损细胞核的数量，但其保护作用仅对新生DNA损伤灶有效，对先前存在的DNA损伤灶几乎无效。 各种空气污染物包括颗粒物（PM2.5、PM10）、NO或香烟烟雾对衰老和细胞衰老也有类似的影响，而氧化应激则是最合理的相互作用机制。Kang等人研究证实NAC预处理可逆转空气污染物对ROS生成和DNA断裂的影响，在防止DNA损伤和细胞衰老方面发挥保护作用。 NAC可降低气道高反应（AHR） 混合暴露于RSV和空气污染可导致RANTES、MCP-1和NGF水平升高，白血病抑制因子（LIF）水平降低，从而导致AHR，而上述研究证明了NAC在RSV暴露和空气污染暴露（分别为柴油排放和苯并芘）模型中降低RANTES和MCP-1水平的有效性，这可能进一步导致AHR降低或消失。 · 总结 · 本综述确定了NAC用于减轻RSV感染和空气污染影响的潜在分子机制，包括阻断病毒进入、降低病毒载量和过度的宿主反应（炎症反应增强、粘液分泌增加、AHR、DNA损伤和/或细胞衰老）等。未来应开展进一步研究以调查RSV感染期间NAC的作用，并重点关注NAC在最重要的六种空气污染物中发挥的分子机制。 参考文献 [1]Wrotek A, Badyda A, Jackowska T. Molecular Mechanisms of N-Acetylcysteine in RSV Infections and Air Pollution-Induced Alterations: A Scoping Review. Int J Mol Sci. 2024，25(11):6051.  提示：本材料仅供医疗卫生专业人士进行医学科学交流，不用于推广目的。