CXCR4 x PDL1

近日，Cell期刊上公布了一篇名为“Strategies to boost antibody selectivity in oncology”的文章。文章题目该文章主要探讨了提高治疗性抗体的选择性，以减少对健康组织的损害并提高疗效的策略。    01  研究背景用于肿瘤治疗的抗体被配备了有毒的载荷和效应功能，能够在极低浓度下杀死细胞。但是，大多数癌细胞上的靶点也存在于一些健康细胞上。共享的靶点可能导致非肿瘤部位的结合，从而降低药物的安全性和治疗潜力。为了解决这一问题，研究人员最初引入了单特异性的治疗性抗体，但往往疗效不足且容易产生耐药性。而目前使用的新一代抗体则具有更高的细胞毒性潜力，包括抗体-药物偶联物（ADCs）和多特异性抗体。在ADCs中，抗体被用作载体，将细胞毒性化学载荷递送至肿瘤。这些载荷通常对患者来说毒性过大，若不与抗体结合则无法使用，甚至还有更具毒性的载荷正在研究中。多特异性抗体能够同时结合不同的表位，包括T细胞衔接器，它们能够将免疫细胞招募至肿瘤细胞。在这种情况下，一个T细胞衔接器分子就足以杀死整个细胞。鉴于其具有高细胞毒性潜力，许多ADCs和多特异性抗体存在剂量限制性毒性，这可能会限制到达肿瘤的生物制剂的量及其治疗效果。此外，即使是非肿瘤部位的轻微结合，也可能导致严重的副作用伤害。例如，针对B细胞恶性肿瘤中CD19的双特异性抗体还可能影响健康的B细胞，引发B细胞再生障碍和感染风险增加。因此，提高治疗性抗体药物对肿瘤的选择性，对于其安全、有效地应用于癌症治疗至关重要，同时也有助于它们在联合疗法中的应用。  02  提高抗体选择性的策略鉴于此，该文章提出了多种策略来，主要分为三类：三类提高抗体选择性的策略一、利用肿瘤细胞的独特特征1. 肿瘤特异性抗原（TSAs）提供高选择性靶点癌细胞可能会表达在健康细胞中沉默的基因，或者表达基因突变产生的蛋白质变体（新抗原），这些新抗原构成了肿瘤特异性抗原（TSAs）。具有高突变负荷的肿瘤，如黑色素瘤和肺癌，往往拥有更多的新抗原，尽管其中很少有能在许多患者之间共享（所谓的“公共新抗原”）。为了利用这些TSAs，可能需要个性化疗法，如疫苗或基于细胞的疗法。不幸的是，TSAs往往在细胞内，而传统的生物制剂通常无法被动地穿过脂质双层，包括细胞膜，来与它们结合。那么，针对这一缺陷，作者总结了三种靶向细胞内TSAs的策略。图1.利用抗体（Abs）靶向细胞内癌症靶点的多种方法。利用主要组织相容性复合体（MHC）：抗原呈递是一种针对细胞内威胁的自然监视机制（图1A），蛋白质的片段被展示给T细胞，T细胞使用T细胞受体（TCR）来检查它们，并对其作出反应。类似地，治疗性抗体可以模仿TCR并与特定的肽-MHC复合物结合。以这种方式利用TSAs，需要识别一种能够与特定构象表位结合的生物制剂，即肽-MHC，它需要包含足够的内容以确保特异性和安全性。此外，靶肽-MHC的潜在低丰度以及患者人群中MHC等位基因的自然变异可能会给增加额外的治疗复杂性。利用细胞内表达生物制剂：生物制剂通常是单链抗体片段（scFv），其以核酸的形式被递送到细胞中，随后在其中表达并结合细胞内靶点（图1B）。利用跨膜生物制剂送入细胞：生物制剂跨越膜的能力可以通过多种方式实现，包括通过包囊、某些肽基序的整合、与细胞穿透肽（CPPs）或其他载体的结合，或膜不稳定剂的控制释放（图1C）。例如，一种能够通过组织蛋白酶B诱导释放1,2-乙二胺（一种膜不稳定剂）的生物制剂。一些癌细胞系具有高活性的组织蛋白酶B，这有利于膜不稳定剂在内质网释放和生物制剂的选择性递送。除了直接到达细胞质外，还可以利用自然循环于细胞中的受体的结合，以更好地接触细胞内靶点。例如，利用IGF-1受体在上皮细胞中的转胞吞作用，使用二聚体IgA靶向KRASG12D。2. 肿瘤相关抗原更为常见，但选择性较低癌症蛋白质组的变化倾向于定量而非定性变化，大多数在肿瘤细胞中富集的抗原也存在于一些健康细胞上，这些被称为肿瘤相关抗原（TAAs）。鉴于此，提高对肿瘤细胞的选择性需要利用其他特征，例如靶点密度的差异或多个靶点的共表达。图2. 生物制剂的多价性和几何形状可以被利用来提高其对特定抗原密度的选择性。利用靶点密度差异：通过多价性（multivalency）和多特异性抗体，可以提高对肿瘤细胞的选择性。多价性提供了一种利用靶点密度差异并提高对肿瘤细胞上富集的单一TAA的结合选择性的方法。拥有多个具有适当亲和力的结合位点可以使治疗药物优先集中在表面抗原密度高的细胞上（图2），这种现象被称为“超选择性”。整体的结合亲和力或结合力可以通过单个结合臂的亲和力以及生物制剂的价态和几何形状来调节。通过包括IgM在内的形式以及IgG六聚体化等策略，可以实现比IgG更高的价态和结合力。同样，catenation和AvidiMabs通过在结合时引入抗体恒定区之间的非共价相互作用，增加了它们在肿瘤细胞上的停留时间。另一种可能性是，多价融合蛋白纳米颗粒可以围绕二价阳离子自组装，并且可以在体内以显著的选择性靶向CXCR4+和PDGFR+细胞。多价性也可以引入到抗体的恒定区，这可能允许调节其效应功能和药代动力学。利用多个靶点共表达：通过靶向同一肿瘤细胞上的多个TAAs，也可以提高生物制剂对肿瘤细胞的选择性。在顺式方向上同时靶向多个抗原可以缩小生物制剂积累的位置。相关的方法涉及蛋白酶靶向抗体（PROTABs），这些是多特异性抗体，它们利用肿瘤细胞上富集的E3泛素连接酶来加速附近生物分子的降解。靶向多个细胞途径也可以实现更强大的抗肿瘤反应。最大化生物制剂对其靶点的结合亲和力并不总是最佳策略。如果抗体强烈结合健康细胞上少量的TAAs，或者增加毒性，那么在体内可能会表现不佳。过高的结合亲和力还可能增加抗体的内化速率，减少其从晚期内体的回收，并加速其降解，从而限制其半衰期和肿瘤穿透。高亲和力的另一个潜在问题是与细胞内信号传导有关：紧密的结合可能会减少受体聚集和信号传导。实际上，对T细胞衔接器的研究发现，在中等结合亲和力时，其效力和选择性达到最佳。二、利用肿瘤微环境特征的策略肿瘤微环境（TME）是一个动态的生态系统，它与肿瘤相互塑造，随着时间的推移形成双向关系。TME通常表现出一些表型特征，包括持续的炎症、细胞外基质（ECM）的重塑、异常的血管生成、坏死等。这些独特的特征可能会促进恶性表型的发展，但也可以被利用来设计选择性的生物制剂。图3. 抗体被设计为可以在肿瘤微环境（TME）中选择性结合，而不是在健康微环境中结合。1. 肿瘤微环境的特征可作为选择性抗体的合适靶点肿瘤微环境（TME）的一个特征是存在免疫细胞。抗体可用于减少TME中的免疫抑制或增强免疫激活。例如，针对CTLA-4和PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂能够重新激活一些效应细胞，并已被证明对某些患者非常有效。Tocilizumab和Siltuximab分别靶向IL-6R和IL-6，旨在增强树突状细胞的抗原呈递能力。此外，一些针对TME的免疫抑制剂也正在研究中。2. 肿瘤微环境的其他特征可作为选择性抗体的合适靶点肿瘤微环境（TME）的另一个特征是存在癌症相关成纤维细胞（CAFs）。CAFs是TME的主要组成部分，在肿瘤的免疫调节和侵袭性方面发挥着关键作用。通过使用fresolimumab等抗体靶向TGF-β信号通路，可以干扰CAFs的功能。研究人员也在探索针对CAFs分泌的基质金属蛋白酶以及在CAFs中经常过表达的CAF标志物——成纤维细胞激活蛋白-α（fibrilastin-α）的抗体。异常血管生成也是实体瘤的一个常见特征。肿瘤部位代谢需求高，可以通过新生血管生成（neoangiogenesis）和血管生成（vasculogenesis）招募新的血管。因此，干扰患者的血管生成可以优先影响肿瘤的生长。一些抗体已被批准用于规范化肿瘤血管并抑制新生血管生成，包括靶向VEGF-A的bevacizumab和靶向其受体VEGFR-2的ramucirumab。坏死区域是晚期实体瘤的另一个特征性标志。晚期实体瘤的核心区域可能营养物质、氧气和代谢废物交换不良，导致细胞坏死。可以设计抗体靶向坏死时暴露的分子，这种方法被称为肿瘤坏死疗法（TNT）。研究人员发现了几种与坏死靶点高度特异性结合的抗体，包括来自细胞核的DNA/组蛋白H1复合物、单链DNA和RNA以及核糖体蛋白。由于TNT不与活细胞结合，因此需要能够扩散或远距离杀伤的药物，如放射性核素、免疫调节剂和释放的化疗药物。3. 生物制剂可被设计为在TME中选择性激活构建在TME中选择性激活的抗体前药：这些分子也被称为前体抗体或条件性活性生物制剂。通过使生物制剂与TME中丰富的分子发生反应，触发药物的局部释放或选择性地暴露抗体的互补决定区（CDRs）（见图3），可以实现选择性激活。例如，Amunix制药公司的双特异性抗体，能够结合HER2或EGFR以及T细胞上的CD3共受体的分子。为了提高肿瘤选择性，将具有特定切割位点的XTEN多肽融合到双特异性scFv的两端。在非肿瘤部位，XTEN掩蔽物可防止抗原结合。然而，在TME中，丰富的蛋白酶会特异性识别这些切割位点，切割掩蔽物，从而使双特异性抗体能够结合其抗原。值得注意的是，这种策略使该分子在食蟹猴中的最大耐受浓度比未掩蔽的双特异性抗体提高了400倍以上。此外，还可以利用酶促切割通过可切割连接子从抗体药物偶联物（ADCs）中选择性释放载荷。对于能够影响邻近细胞的膜可渗透载荷（旁观者效应），可切割ADCs可能特别适用。这种效应可能提高在抗原丢失或减少的异质性肿瘤中ADCs的有效性。优化抗体以在特定pH下发挥作用，提高其选择性：通过赋予Fc区pH敏感性结合，有利于将效应细胞招募到通常呈酸性的TME（图3D），或者通过FcRn介导的抗体回收来延长抗体的半衰期。具有pH敏感性结合的CDRs（图3C）也可以增加治疗肿瘤的价值。通过精心设计蛋白序列来实现pH敏感性结合，其中组氨酸的离子化（pKa约为6）通常起着重要作用。相互作用的pH敏感性可能涉及抗体、靶点或两者质子化状态的变化，也可能涉及介质中存在的第三种物质，如碳酸氢盐。将抗体设计为依赖于TME中特征性的其他分子：TME中某些肿瘤的细胞外ATP浓度显著增加。这种增加被研究人员巧妙地利用来识别需要ATP才能与CTLA-4和CD137结合的CDRs。在这些情况下，ATP实际上起到了分子胶的作用，补充了抗原和CDR之间的界面（图3B）。也可以设计生物制剂，使其结合在第三种分子存在时被阻止。这些方法可以扩展到其他靶点和代谢物。三、利用外部干预的策略除了设计生物制剂以利用肿瘤或TME的特征外，还可以通过外部干预来选择性地增加肿瘤中活性药物的浓度，或减少肿瘤外的药物浓度。构建用于生成特异性结合分子的替代性非抗体蛋白支架的结构。其中β-折叠以绿色显示，α-螺旋结构以黄色显示，二硫键以红色显示。增加肿瘤中活性药物的浓度改变给药途径：给药策略会影响生物制剂的运输和积累。生物制剂的给药途径，如静脉注射、动脉内注射、脑脊液内注射、胸膜内注射或腹膜内注射，会影响其在肿瘤部位的浓度。此外，正在研究新的给药途径，例如皮肤癌的局部抗体给药、呼吸道或中枢神经系统的鼻内抗体给药、淋巴系统的皮内给药以及直接的瘤内给药。一项研究显示，与静脉注射相比，腹膜内注射抗PD-L1分子在腹膜播散性癌模型中使生物制剂在肿瘤中的积累量增加了8倍。利用外部刺激：可在空间或时间上控制活性治疗药物的浓度，从而提高其选择性。可以使用辐射仅在照射区域触发抗体功能。还有报道称，通过微束辐射暂时提高治疗药物的局部血管通透性，以及将免疫检查点阻断与光热疗法相结合。外部刺激还可能涉及额外分子的给药。通过诱导表型变化的预处理也可以提高生物制剂对肿瘤的选择性。减少肿瘤外活性药物的浓度：减少治疗药物的非肿瘤结合有许多可行的方法。一种是使用治疗药物的非毒性类似物来阻断非肿瘤结合。这种方法非常适合抗体药物偶联物（ADCs），在实际给药ADC之前，可以先给药不含载荷的抗体，从而使更高比例的ADC定位到肿瘤。第二种是利用非肿瘤部位靶点密度通常较低的事实。在间接主动靶向（INTACT）中，研究人员预先给药以结合脂质体表面的靶点来控制抗体的浓度。脂质体上的靶点丰度减少了抗体向非肿瘤区域的损失，这些区域的靶点浓度较低，与脂质体相比，它们的释放更集中在肿瘤部位，靶点浓度较高。第三种是利用治疗药物在非肿瘤部位更高的可及性和更快的清除。例如，可以在非肿瘤结合清除后延迟给药某种分子。OncoOne的PreTarg-it平台涉及一种放射性核素，该放射性核素仅在ADC在肿瘤中浓集并从血液中清除后才与ADC结合。反向靶向是另一种与ADC兼容的方法，涉及（延迟）给药针对ADC化学载荷的抗体，以加速其在非肿瘤部位的清除。同样，最近的研究还展示了通过给药小分子药物使双特异性T细胞衔接器脱离的能力，从而减轻非肿瘤毒性。   03   未来展望文章最后提出了未来研究的方向，包括：整合实验、动物模型和人工智能：以更快地开发选择性治疗药物。评估分子靶点的质量：确定哪些靶点最适合用于癌症治疗。预测非肿瘤结合的次级效应：了解药物对不同细胞和组织的潜在影响。结合不同的分子设计策略：以最大化安全性和疗效。预测新型生物制剂的行为：在人体中的表现。生成分子设计的合理预期：基于当前的数据和知识，确定哪些目标是可行的。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

近日，Cell期刊上公布了一篇名为“Strategies to boost antibody selectivity in oncology”的文章。文章题目该文章主要探讨了提高治疗性抗体的选择性，以减少对健康组织的损害并提高疗效的策略。    01  研究背景用于肿瘤治疗的抗体被配备了有毒的载荷和效应功能，能够在极低浓度下杀死细胞。但是，大多数癌细胞上的靶点也存在于一些健康细胞上。共享的靶点可能导致非肿瘤部位的结合，从而降低药物的安全性和治疗潜力。为了解决这一问题，研究人员最初引入了单特异性的治疗性抗体，但往往疗效不足且容易产生耐药性。而目前使用的新一代抗体则具有更高的细胞毒性潜力，包括抗体-药物偶联物（ADCs）和多特异性抗体。在ADCs中，抗体被用作载体，将细胞毒性化学载荷递送至肿瘤。这些载荷通常对患者来说毒性过大，若不与抗体结合则无法使用，甚至还有更具毒性的载荷正在研究中。多特异性抗体能够同时结合不同的表位，包括T细胞衔接器，它们能够将免疫细胞招募至肿瘤细胞。在这种情况下，一个T细胞衔接器分子就足以杀死整个细胞。鉴于其具有高细胞毒性潜力，许多ADCs和多特异性抗体存在剂量限制性毒性，这可能会限制到达肿瘤的生物制剂的量及其治疗效果。此外，即使是非肿瘤部位的轻微结合，也可能导致严重的副作用伤害。例如，针对B细胞恶性肿瘤中CD19的双特异性抗体还可能影响健康的B细胞，引发B细胞再生障碍和感染风险增加。因此，提高治疗性抗体药物对肿瘤的选择性，对于其安全、有效地应用于癌症治疗至关重要，同时也有助于它们在联合疗法中的应用。  02  提高抗体选择性的策略鉴于此，该文章提出了多种策略来，主要分为三类：三类提高抗体选择性的策略一、利用肿瘤细胞的独特特征1. 肿瘤特异性抗原（TSAs）提供高选择性靶点癌细胞可能会表达在健康细胞中沉默的基因，或者表达基因突变产生的蛋白质变体（新抗原），这些新抗原构成了肿瘤特异性抗原（TSAs）。具有高突变负荷的肿瘤，如黑色素瘤和肺癌，往往拥有更多的新抗原，尽管其中很少有能在许多患者之间共享（所谓的“公共新抗原”）。为了利用这些TSAs，可能需要个性化疗法，如疫苗或基于细胞的疗法。不幸的是，TSAs往往在细胞内，而传统的生物制剂通常无法被动地穿过脂质双层，包括细胞膜，来与它们结合。那么，针对这一缺陷，作者总结了三种靶向细胞内TSAs的策略。图1.利用抗体（Abs）靶向细胞内癌症靶点的多种方法。利用主要组织相容性复合体（MHC）：抗原呈递是一种针对细胞内威胁的自然监视机制（图1A），蛋白质的片段被展示给T细胞，T细胞使用T细胞受体（TCR）来检查它们，并对其作出反应。类似地，治疗性抗体可以模仿TCR并与特定的肽-MHC复合物结合。以这种方式利用TSAs，需要识别一种能够与特定构象表位结合的生物制剂，即肽-MHC，它需要包含足够的内容以确保特异性和安全性。此外，靶肽-MHC的潜在低丰度以及患者人群中MHC等位基因的自然变异可能会给增加额外的治疗复杂性。利用细胞内表达生物制剂：生物制剂通常是单链抗体片段（scFv），其以核酸的形式被递送到细胞中，随后在其中表达并结合细胞内靶点（图1B）。利用跨膜生物制剂送入细胞：生物制剂跨越膜的能力可以通过多种方式实现，包括通过包囊、某些肽基序的整合、与细胞穿透肽（CPPs）或其他载体的结合，或膜不稳定剂的控制释放（图1C）。例如，一种能够通过组织蛋白酶B诱导释放1,2-乙二胺（一种膜不稳定剂）的生物制剂。一些癌细胞系具有高活性的组织蛋白酶B，这有利于膜不稳定剂在内质网释放和生物制剂的选择性递送。除了直接到达细胞质外，还可以利用自然循环于细胞中的受体的结合，以更好地接触细胞内靶点。例如，利用IGF-1受体在上皮细胞中的转胞吞作用，使用二聚体IgA靶向KRASG12D。2. 肿瘤相关抗原更为常见，但选择性较低癌症蛋白质组的变化倾向于定量而非定性变化，大多数在肿瘤细胞中富集的抗原也存在于一些健康细胞上，这些被称为肿瘤相关抗原（TAAs）。鉴于此，提高对肿瘤细胞的选择性需要利用其他特征，例如靶点密度的差异或多个靶点的共表达。图2. 生物制剂的多价性和几何形状可以被利用来提高其对特定抗原密度的选择性。利用靶点密度差异：通过多价性（multivalency）和多特异性抗体，可以提高对肿瘤细胞的选择性。多价性提供了一种利用靶点密度差异并提高对肿瘤细胞上富集的单一TAA的结合选择性的方法。拥有多个具有适当亲和力的结合位点可以使治疗药物优先集中在表面抗原密度高的细胞上（图2），这种现象被称为“超选择性”。整体的结合亲和力或结合力可以通过单个结合臂的亲和力以及生物制剂的价态和几何形状来调节。通过包括IgM在内的形式以及IgG六聚体化等策略，可以实现比IgG更高的价态和结合力。同样，catenation和AvidiMabs通过在结合时引入抗体恒定区之间的非共价相互作用，增加了它们在肿瘤细胞上的停留时间。另一种可能性是，多价融合蛋白纳米颗粒可以围绕二价阳离子自组装，并且可以在体内以显著的选择性靶向CXCR4+和PDGFR+细胞。多价性也可以引入到抗体的恒定区，这可能允许调节其效应功能和药代动力学。利用多个靶点共表达：通过靶向同一肿瘤细胞上的多个TAAs，也可以提高生物制剂对肿瘤细胞的选择性。在顺式方向上同时靶向多个抗原可以缩小生物制剂积累的位置。相关的方法涉及蛋白酶靶向抗体（PROTABs），这些是多特异性抗体，它们利用肿瘤细胞上富集的E3泛素连接酶来加速附近生物分子的降解。靶向多个细胞途径也可以实现更强大的抗肿瘤反应。最大化生物制剂对其靶点的结合亲和力并不总是最佳策略。如果抗体强烈结合健康细胞上少量的TAAs，或者增加毒性，那么在体内可能会表现不佳。过高的结合亲和力还可能增加抗体的内化速率，减少其从晚期内体的回收，并加速其降解，从而限制其半衰期和肿瘤穿透。高亲和力的另一个潜在问题是与细胞内信号传导有关：紧密的结合可能会减少受体聚集和信号传导。实际上，对T细胞衔接器的研究发现，在中等结合亲和力时，其效力和选择性达到最佳。二、利用肿瘤微环境特征的策略肿瘤微环境（TME）是一个动态的生态系统，它与肿瘤相互塑造，随着时间的推移形成双向关系。TME通常表现出一些表型特征，包括持续的炎症、细胞外基质（ECM）的重塑、异常的血管生成、坏死等。这些独特的特征可能会促进恶性表型的发展，但也可以被利用来设计选择性的生物制剂。图3. 抗体被设计为可以在肿瘤微环境（TME）中选择性结合，而不是在健康微环境中结合。1. 肿瘤微环境的特征可作为选择性抗体的合适靶点肿瘤微环境（TME）的一个特征是存在免疫细胞。抗体可用于减少TME中的免疫抑制或增强免疫激活。例如，针对CTLA-4和PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂能够重新激活一些效应细胞，并已被证明对某些患者非常有效。Tocilizumab和Siltuximab分别靶向IL-6R和IL-6，旨在增强树突状细胞的抗原呈递能力。此外，一些针对TME的免疫抑制剂也正在研究中。2. 肿瘤微环境的其他特征可作为选择性抗体的合适靶点肿瘤微环境（TME）的另一个特征是存在癌症相关成纤维细胞（CAFs）。CAFs是TME的主要组成部分，在肿瘤的免疫调节和侵袭性方面发挥着关键作用。通过使用fresolimumab等抗体靶向TGF-β信号通路，可以干扰CAFs的功能。研究人员也在探索针对CAFs分泌的基质金属蛋白酶以及在CAFs中经常过表达的CAF标志物——成纤维细胞激活蛋白-α（fibrilastin-α）的抗体。异常血管生成也是实体瘤的一个常见特征。肿瘤部位代谢需求高，可以通过新生血管生成（neoangiogenesis）和血管生成（vasculogenesis）招募新的血管。因此，干扰患者的血管生成可以优先影响肿瘤的生长。一些抗体已被批准用于规范化肿瘤血管并抑制新生血管生成，包括靶向VEGF-A的bevacizumab和靶向其受体VEGFR-2的ramucirumab。坏死区域是晚期实体瘤的另一个特征性标志。晚期实体瘤的核心区域可能营养物质、氧气和代谢废物交换不良，导致细胞坏死。可以设计抗体靶向坏死时暴露的分子，这种方法被称为肿瘤坏死疗法（TNT）。研究人员发现了几种与坏死靶点高度特异性结合的抗体，包括来自细胞核的DNA/组蛋白H1复合物、单链DNA和RNA以及核糖体蛋白。由于TNT不与活细胞结合，因此需要能够扩散或远距离杀伤的药物，如放射性核素、免疫调节剂和释放的化疗药物。3. 生物制剂可被设计为在TME中选择性激活构建在TME中选择性激活的抗体前药：这些分子也被称为前体抗体或条件性活性生物制剂。通过使生物制剂与TME中丰富的分子发生反应，触发药物的局部释放或选择性地暴露抗体的互补决定区（CDRs）（见图3），可以实现选择性激活。例如，Amunix制药公司的双特异性抗体，能够结合HER2或EGFR以及T细胞上的CD3共受体的分子。为了提高肿瘤选择性，将具有特定切割位点的XTEN多肽融合到双特异性scFv的两端。在非肿瘤部位，XTEN掩蔽物可防止抗原结合。然而，在TME中，丰富的蛋白酶会特异性识别这些切割位点，切割掩蔽物，从而使双特异性抗体能够结合其抗原。值得注意的是，这种策略使该分子在食蟹猴中的最大耐受浓度比未掩蔽的双特异性抗体提高了400倍以上。此外，还可以利用酶促切割通过可切割连接子从抗体药物偶联物（ADCs）中选择性释放载荷。对于能够影响邻近细胞的膜可渗透载荷（旁观者效应），可切割ADCs可能特别适用。这种效应可能提高在抗原丢失或减少的异质性肿瘤中ADCs的有效性。优化抗体以在特定pH下发挥作用，提高其选择性：通过赋予Fc区pH敏感性结合，有利于将效应细胞招募到通常呈酸性的TME（图3D），或者通过FcRn介导的抗体回收来延长抗体的半衰期。具有pH敏感性结合的CDRs（图3C）也可以增加治疗肿瘤的价值。通过精心设计蛋白序列来实现pH敏感性结合，其中组氨酸的离子化（pKa约为6）通常起着重要作用。相互作用的pH敏感性可能涉及抗体、靶点或两者质子化状态的变化，也可能涉及介质中存在的第三种物质，如碳酸氢盐。将抗体设计为依赖于TME中特征性的其他分子：TME中某些肿瘤的细胞外ATP浓度显著增加。这种增加被研究人员巧妙地利用来识别需要ATP才能与CTLA-4和CD137结合的CDRs。在这些情况下，ATP实际上起到了分子胶的作用，补充了抗原和CDR之间的界面（图3B）。也可以设计生物制剂，使其结合在第三种分子存在时被阻止。这些方法可以扩展到其他靶点和代谢物。三、利用外部干预的策略除了设计生物制剂以利用肿瘤或TME的特征外，还可以通过外部干预来选择性地增加肿瘤中活性药物的浓度，或减少肿瘤外的药物浓度。构建用于生成特异性结合分子的替代性非抗体蛋白支架的结构。其中β-折叠以绿色显示，α-螺旋结构以黄色显示，二硫键以红色显示。增加肿瘤中活性药物的浓度改变给药途径：给药策略会影响生物制剂的运输和积累。生物制剂的给药途径，如静脉注射、动脉内注射、脑脊液内注射、胸膜内注射或腹膜内注射，会影响其在肿瘤部位的浓度。此外，正在研究新的给药途径，例如皮肤癌的局部抗体给药、呼吸道或中枢神经系统的鼻内抗体给药、淋巴系统的皮内给药以及直接的瘤内给药。一项研究显示，与静脉注射相比，腹膜内注射抗PD-L1分子在腹膜播散性癌模型中使生物制剂在肿瘤中的积累量增加了8倍。利用外部刺激：可在空间或时间上控制活性治疗药物的浓度，从而提高其选择性。可以使用辐射仅在照射区域触发抗体功能。还有报道称，通过微束辐射暂时提高治疗药物的局部血管通透性，以及将免疫检查点阻断与光热疗法相结合。外部刺激还可能涉及额外分子的给药。通过诱导表型变化的预处理也可以提高生物制剂对肿瘤的选择性。减少肿瘤外活性药物的浓度：减少治疗药物的非肿瘤结合有许多可行的方法。一种是使用治疗药物的非毒性类似物来阻断非肿瘤结合。这种方法非常适合抗体药物偶联物（ADCs），在实际给药ADC之前，可以先给药不含载荷的抗体，从而使更高比例的ADC定位到肿瘤。第二种是利用非肿瘤部位靶点密度通常较低的事实。在间接主动靶向（INTACT）中，研究人员预先给药以结合脂质体表面的靶点来控制抗体的浓度。脂质体上的靶点丰度减少了抗体向非肿瘤区域的损失，这些区域的靶点浓度较低，与脂质体相比，它们的释放更集中在肿瘤部位，靶点浓度较高。第三种是利用治疗药物在非肿瘤部位更高的可及性和更快的清除。例如，可以在非肿瘤结合清除后延迟给药某种分子。OncoOne的PreTarg-it平台涉及一种放射性核素，该放射性核素仅在ADC在肿瘤中浓集并从血液中清除后才与ADC结合。反向靶向是另一种与ADC兼容的方法，涉及（延迟）给药针对ADC化学载荷的抗体，以加速其在非肿瘤部位的清除。同样，最近的研究还展示了通过给药小分子药物使双特异性T细胞衔接器脱离的能力，从而减轻非肿瘤毒性。   03   未来展望文章最后提出了未来研究的方向，包括：整合实验、动物模型和人工智能：以更快地开发选择性治疗药物。评估分子靶点的质量：确定哪些靶点最适合用于癌症治疗。预测非肿瘤结合的次级效应：了解药物对不同细胞和组织的潜在影响。结合不同的分子设计策略：以最大化安全性和疗效。预测新型生物制剂的行为：在人体中的表现。生成分子设计的合理预期：基于当前的数据和知识，确定哪些目标是可行的。点击下方阅读原文获取文章来源欢迎感兴趣的朋友进群讨论，群二维码如下：推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。©2021 医药速览 保留所有权利往期链接“小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点 人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版）综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学温馨提示医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群请扫描上方二维码，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送①点击标题下方“医药速览”  ②至右上角“...”  ③点击“设为星标

前 言研究表明，Epcam(epithelial cell adhesion molecule,上皮细胞黏附分子)参与了肿瘤干细胞、细胞增殖、代谢、血管生成、上皮向间充质转化(EMT)、转移、化疗/放射抵抗和免疫调节等过程。在肿瘤发展过程中，EPCAM会与许多关键信号通路如Wnt/β-catenin、转化生长因子-β/SMAD、Epex/EGFR、PI3K/Akt/mTor和P53等发生串扰，诱导肿瘤细胞产生生物学变化。例如增强Epcam表达能通过阻止细胞间黏附、促进免疫逃逸或激活白血病和结肠癌的下游致癌基因来促进癌症侵袭。在早期食道癌中，发现EpCAM表达减少会诱导EMT（上皮-间叶细胞转化过程），加速新陈代谢。所以Epcam在癌症发展过程扮演的角色“敌友难辨”鉴于其在癌症过程的复杂作用，EpCAM已成为癌症治疗中充满前景的靶点。并可作为监测CTCs（循环肿瘤细胞）和CSCs（肿瘤干细胞）的生物标志物。因此本文集中讨论了Epcam的结构特征和生物学功能。01EpCAM的结构特征Epcam(epithelial cell adhesionmolecule)亦称CD326,隶属GA733蛋白家族，是一种I型跨膜糖蛋白和同型Ca2+非依赖性细胞粘附分子，在多种正常上皮细胞的基底膜中低水平表达(结肠表达水平最高)，而在癌细胞膜上广泛表达，尤其是鳞癌和腺癌。同时Epcam也是当前全球首个进入靶向CAR-T细胞疗法相关临床研究的靶点相关研究发现Epcam会参与细胞黏附过程，但其粘附性与钙粘附素相比更弱。值得注意的是，借助EpCAM的细胞黏附会受到CD44结合的claudin-7影响。EPCAM与两个claudin-7 和cLaudin-1分子相互作用，通过阻止其降解，来调节紧密连接的功能。当敲除EPCAM基因后，claudin-7和 claudin-1都会减少，紧密连接增加，细胞更不容易裂解，证明EpCAM在肿瘤侵袭和扩散中起着重要作用。图1：Epcam结构示意图02肿瘤生物学中扮演角色图2 EpCAM在肿瘤发生发展中的作用一癌症干细胞先前研究表明，EpCAM会在人类胚胎干细胞上广泛表达，并在分化过程中发挥关键作用。Kuan 等人研究发现，Epex和EpCAM可以提高OCT4、SOX2、KLF4和c-myc的重编程效率，并通过STAT和HIF-2α诱导成纤维细胞向多能干细胞分化。在癌症治疗领域，EpCAM是一个非常经典的CSCs（肿瘤干细胞）标志物。表达EpCAM的肿瘤细胞展现出更强的癌变能力，和更强的干细胞特性(化疗/放射抵抗、增强的成瘤性、血管生成、耐缺氧和转移集落形成能力)。二细胞代谢与血管生成比较四种表达EpCAM和AFP的肝癌，发现EpCAM+/AFP+人群的微血管密度和EGF表达水平较高。此外，Sankpal 等人发现EPCAM可调节IL-8和NF-κB转录因子在BC侵袭和血管生成中的活性。针对VEGFR2/EpCAM的双抗的增强效应及通过降低IL-8和IL-6对血管生成的调节表明EpCAM可能是预防肿瘤进展中血管生成的理想靶点。三免疫逃避和调节EpCAM会参与肿瘤免疫调节，Park等人推断EpCAM含量较高的肝癌会通过上调癌胚抗原相关细胞黏附分子1来抵抗NK细胞介导的细胞毒作用。与之类似，EpCAM+CD45+卵巢癌细胞通过过度表达主要组织相容性复合体I类抗原(MHC-I)来逃避NK细胞介导的免疫监控。四EMT过程中的动态表达和背景依赖性EpCAM在EMT（上皮细胞-间充质转化）过程中处于动态并具有背景依赖性(图2D)。鉴于EpCAM是一种黏附分子，推测EpCAM的表达下调是为了提高癌细胞迁移率，但细胞黏附分子通过干扰α-连环蛋白和F-肌动蛋白之间的联系而减弱E-钙粘附素介导的细胞间黏附作用。此外，EPCAM与EMT相关基因的表达呈正相关。在不同的研究中得到的结果并不一致。在TGF-β1诱导的食管癌细胞内皮细胞转化过程中，Epcam在细胞膜表面的表达显著减少，细胞的迁移、侵袭和扩散能力得到了提高。而低表达的EpCAM增强了癌细胞的EMT，并与子宫内膜癌的晚期肿瘤分期和淋巴转移发生相关。03EpCAM在临床肿瘤学中的应用图3 EpCAM的功能和应用EpCAM仅在上皮性肿瘤中表达，在外胚层或中胚层肿瘤中不表达。但EPCAM在乳腺癌、肝癌和胰腺癌中的表达水平与预后不良相关，而在甲状腺和肾癌中过度表达则预后较好。但在食道癌和结直肠癌中，EpCAM过度表达与患者生存之间的相关性仍然存在争议，这表明EpCAM对癌症或抑制或促进作用其实更取决于肿瘤微环境和癌症类型。但Epcam在肾癌中的表达有很高的预后价值。  表1 ：EpCAM与其他生物分子联合检测对肿瘤预后和诊断的作用一肿瘤中表达及预后价值EpCAM参与了癌症多个进程。除了其在预测转移和检测CTCs方面的诊断和预后价值外，它在癌症中的独特表达模式使其成为诊断和预后的生物标记物，详见表2    表2：EpCAM在肿瘤治疗中的免疫治疗应用二基于EpCAM的CTC检测与诊断方法CTCs（肿瘤循环细胞）是检测癌症转移的重要标志。CTC在肿瘤转移过程中起主要作用，是多种癌症的预后指标。CTCs是非常罕见的细胞(每毫升患者血液中有1-10个CTCs)，其中只有少数具有转移能力。测量外周血中的这些细胞，除了更准确地确定疾病的阶段外，对病人的伤害也较小。但值得注意的是epcam不会在CTCS表面表达。但epcam会在大多数上皮源性癌症高度表达，因此是检测CTCs的一个标志物。然而，通过EpCAM检测CTCs的方法存在不足之处。传统的基于EpCAM的CTC检测策略仅限于EpCAM阳性的CTC，并且由于EMT，还可能忽视最具侵袭性的肝癌CTC亚群的风险，导致循环中CTC的总数偏小。三化学修饰和靶向治疗先前研究表明，EpCAM在人类胚胎干细胞上广泛表达，并在分化过程中发挥关键作用。Kuan 等与传统的抗体介导的肿瘤治疗相比，可以用核酸适配体来提高药物递送的特异性和亲和力。由于EpCAM在肿瘤细胞上高度表达，尤其是CSCs，靶向EpCAM的适配体被广泛应用于癌症治疗。与双特异性抗体类似，用双特异性适配子同时靶向CD44和EpCAM比单适配子效果更好。此外，该适配子对寄主无毒性，对天然免疫无激活作用。04EpCAM在免疫治疗中的应用一单抗临床上已报道了许多有希望用于癌症治疗的EpCAM抗体（表3）。表3 EpCAM在肿瘤治疗中的免疫治疗应用第一个单克隆EpCAM抗体edrecolomab(17-1A)是从小鼠腹水中提取的IgG2a，但在多种腺癌中的治疗效果有限，这可能是因为它和肿瘤的亲和力较低。随后开发了抗体工程和人源化抗体ING-1和3622W94，并在腺癌中进行了测试。这两种抗体与EpCAM具有较高的亲和力，但耐受性较低，并会诱发胰腺炎。激素难治性前列腺癌患者的I期研究和EpCAM阳性复发或难治性晚期乳腺癌的IB期研究证实了adecatumab的有效性。EpAb2-6则是一种新的EpCAM中和抗体，它通过抑制EpicD/β-连环蛋白复合体的核转位和诱导结肠癌细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。此外，EpAb2-6通过提高A2表达所需温度和降低PD-L1蛋白水平来增强CD8+T细胞的细胞毒活性来阻止肿瘤进展。二EpCAM双特异性抗体及其变体已开发双特异性或嵌合抗体来增强抗肿瘤疗效(上表3)。Catumaxomab(Removab)具有两个抗原结合位点(EpCAM和CD3)和一个Fc结构域，在体外可启动T细胞介导的杀伤、细胞因子相关的细胞毒作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)性和补体依赖的细胞毒性(CDC）。在II/III期研究的恶性腹水患者中，Catumaxomab治疗组的总生存期(OS)显著延长。MM-131是一种抗EpCAM/Met双特异性抗体，对Met信号通路既有依赖又有非依赖性抑制作用，对Met诱导的肝癌、BC、胃癌和肺癌的增殖均有抑制作用。双特异性T细胞结合抗体(BITE)通过将T细胞与癌细胞联系起来，刺激T细胞活化、肿瘤杀伤和细胞因子的产生，从而增强患者对肿瘤的免疫反应。Solitomab(MT110)是一种与EpCAM和CD3结合的双特异性T细胞结合抗体(BITE)，可有效治疗原发性子宫和卵巢癌肉瘤。MT110的作用机制主要依赖于T细胞活化后穿孔素和颗粒酶的释放。但由于其胃肠道毒性，solitomab最终被停用。EpCAM反义寡核苷酸1H8/CD3成功地抑制了肝癌移植瘤的生长，并降低了大多数CSC生物标志物的表达。为了降低T细胞活化引起的有害细胞因子毒性，开发了靶向NK细胞上的CD16和肿瘤细胞上的EPCAM的双特异性NK细胞活化子(Bike)，以此介导ADCC对EPCAM+HT-29结肠癌细胞的杀伤作用。经白介素15交联剂修饰的三特异性NK细胞激活剂(TRIKE)与BIKE相比，对NK细胞的激活、增殖和存活均有改善。三EpCAM ADCEpCAM抗体-药物结合物(ADC)也在应用于EpCAM+癌症治疗(表3)。Oportuzumab monatox由抗EpCAM单链可变区和假单胞菌外毒素A(ETA)片段组成，在ADC内化和ETA释放后发挥抗瘤作用。与之类似，Citatuzumab bogatox是由抗EpCAM Fab和非免疫原性九重葛毒素组成。针对各种癌症的I期和II期临床试验表明，它们对癌症治疗都具有良好的耐受性和有效性。Tucotuzumab celmoleukin(EMD 273,066，Huks-IL2)是通过将白细胞介素2(IL-2)基因融合到人源化的抗EpCAM单抗上而产生的一种免疫细胞因子，这种基于抗体的新疗法可能通过IL-2激活淋巴细胞。此外，Tucotuzumab celmoleukin与射频消融联合应用可增强小鼠结肠癌的抗肿瘤作用和免疫记忆。Tucotuzumab celmoleukin对癌症患者的安全性和有效性在I期和IB期研究中得到证实。体外细胞系分析和体内动物实验证明，更多ADC有望用于癌症治疗。ChiHEA125-AMA是α-Amanitin与嵌合的抗EPCAM单抗的偶联物，在胰腺癌、乳腺癌和其他癌症中展现出抑制肿瘤的潜力。相应地，吲哚苯二氮二聚体(IGN)与EpCAM(EpCAM-IGN)抗体的结合显示出剂量依赖性的抗肿瘤活性。四CAR-T除了抗体介导的治疗外，细胞免疫，特别是T细胞治疗，在癌症治疗中展示出一定前景。最近一项研究表明，异位表达miR-200C和EpCAM的CD8+T细胞会降低细胞凋亡，并增强抗瘤反应。靶向EpCAM的CAR - T疗法已取得了一定成功(表2)，与EpCAM−急性髓系白血病细胞相比，EpCAM+急性髓系白血病细胞具有更强的致瘤性和化疗耐药性，因为正常骨髓细胞和外周血单核细胞均不表达EpCAM。因此，靶向EpCAM的CAR -T是治疗AML的理想方法。此外，雷帕霉素可抑制mTORC1活性，上调CXCR4，从而促进EpCAM Car T细胞在骨髓中的迁移和穿透能力，治愈急性髓系白血病(AML)。结语随着基础研究的进步，EpCAM被发现在癌症进展中起着多方面的作用。除其在细胞黏附中的作用外，EpCAM还会通过调节胞外和胞内的细胞信号来实现多种功能，EpCAM通过调节细胞特性，如增殖、干细胞、移动性、化疗/放射治疗来调控癌症的进展。但其实无法断言Epcam扮演的是致癌角色或肿瘤抑制角色。但从临床角度来看，EpCAM对癌症患者的诊断和预后有很大的潜在价值。靶向EpCAM的抗体已应用于临床，随着研发人员对epcam了解的不断深入，未来在癌症治疗中将更具价值。推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。©2021 医药速览 保留所有权利往期链接“小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点 人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版）   综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学温馨提示医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送①点击标题下方“医药速览”  ②至右上角“...”  ③点击“设为星标