4-1BB x albumin x PDL1

关注并星标CPHI制药在线 2024年11月29日，南京维立志博生物科技股份有限公司 （以下简称“维立志博”）在港交所递交招股书，拟香港主板IPO上市。 维立志博成立于2012年，主要致力于肿瘤、自身免疫性疾病及其他重大疾病方面的研发需求。在持续了将近3年的资本寒冬下，IPO终止现象屡见不鲜，据公开数据显示，2023年IPO终止的企业数量达到39家，2024年现象持续恶化。如此背景下，维立志博无疑是一个可以参照的Biotech创新样本。我们从其管线出发，来看一看这家公司别样的生存之道。 01 聚焦高门槛靶点，持续输出FIC/BIC新药 维立志博从成立之初就将“解决中国乃至全球患者尚未满足的临床需求或临床空白”作为自身发展的使命，走在肿瘤免疫治疗的前沿，致力于开发使PD-1/PD-L1单抗或其他免疫疗法治疗无效的癌症患者重新获益的创新疗法，为患者带来全球领先的首创新药（First-In-Class，FIC）或同类最佳新药（Best-In-Class，BIC）。 目前，维立志博拥有12款创新候选药物的差异化管线，6款已进入临床阶段，其中4款临床进度全球领先：LBL-024、LBL-034、LBL-033、LBL-007。以LBL-024为例，我们来一窥维立志博精益求精的创新精神。 LBL-024是维立志博的核心产品，该创新药为一款PD-L1/4-1BB双抗。目前，LBL-024已进入肺外神经内分泌癌（EP-NEC）的单臂关键性临床试验，一旦获批成功，将成为全球首款靶向4-1BB的药物。 4-1BB（又称CD137），是一种在免疫系统多种细胞上表达的共刺激受体，包括活化的CD4+和CD8+T细胞、自然杀伤T细胞（NKT）和自然杀伤细胞（NKs）、树突状细胞（DC）以及Treg细胞等。 由于其表达广泛，而且4-1BB能够增加T细胞存活和细胞因子的产生，从而增强免疫效应，因此4-1BB已成为癌症免疫治疗的明星靶点。 在4-1BB的布局上，BMS等较早入场，但是并未如愿上市。BMS的urelumab（BMS-663513）是第一个进入临床试验的靶向4-1BB治疗药物，是一种IgG4单克隆抗体。然而，由于Ⅰ期和Ⅱ期临床数据均显示出较高的肝脏毒性而使研发进展缓慢。 肝毒性也是其他靶向4-1BB的单抗药物进展缓慢的原因。为了克服这一挑战，LBL-024采用了维立志博的独创X-body平台，进行了独特设计。维立志博将LBL-024的结构调整为2:2，这样既能与肿瘤相关抗原PD-L1特异性地结合，将对4-1BB的共刺激定位在肿瘤环境内；还能降低对4-1BB的亲和力，大大减少了LBL-024与体内其他部位4-1BB的相互作用，从而降低了器官系统毒性的风险。 在单药治疗晚期肿瘤的Ⅰ/Ⅱ临床研究中，LBL-024耐受性良好，安全性可控，与当前已批准免疫治疗方案比较，未见新的安全性信号。截至目前的临床数据与现有治疗相比，LBL-024单药治疗晚期肺外神经内分泌癌（EP-NEC）的客观缓解率（ORR）、总生存期（OS）均提高了2倍以上。LBL-024于2024年10月9日获CDE突破性治疗药物认定。 在针对4-1BB药物开发领域，目前布局企业研发的产品有单抗，双抗以及多抗。鉴于MNC在4-1BB单抗临床开发和研究过程中已经观察到，单抗的疗效和安全性数据表现难以令人满意，目前入局的国内药企已将火力转向双抗或多抗领域。如天境生物与韩国ABL Bio合作开发的Claudin 18.2 &/4-1BB 双抗TJ-CD4B、基石药业靶向PD-L1/4-1BB/HSA的三抗产品CS2006、百利药业的四抗——GNC-038（PD-L1/4-1BB/CD3/CD19，用于血液瘤）、GNC-039（PD-L1/4-1BB/CD3/EGFRvⅢ，实体瘤）、GNC-035（PD-L1/4-1BB/CD3/CD19/ROR）目前都已进入临床。  全球目前还有多款4-1BB药物进入临床研究阶段，尽管对4-1BB的探索由来已久，但受安全性制约，全球尚无一款4-1BB靶向药物获批上市。LBL-024是最早敲开监管大门的4-1BB双抗药物，如若获批上市，将在巨大的4-1BB市场占据重要地位。 维立志博的第二款核心产品LBL-034，是一款靶向GPRC5D/CD3的TCE，基于维立志博独有的LeadsBody平台开发而成，其采用2:1非对称结构，拥有2个靶向GPRC5D的高亲和力Fab以及1个靶向CD3的低亲和力scFc。临床前研究表明，LBL-034在多种细胞增殖抑制试验中和体内药效模型中表现出优于已获批GPRC5D/CD3双抗Talquetamab的疗效。2024年10月，LBL-034获FDA孤儿药资格认定，用于治疗多发性骨髓瘤（MM）成人患者。目前，LBL-034是全球临床进度第二的GPRC5D/CD3双抗。 维立志博的第三款核心产品LBL-033，是目前全球仅有的两款已进入临床阶段的MUC16/CD3 TCE之一。MUC16（粘蛋白16）是一种高度糖基化的跨膜蛋白，在卵巢癌等多种恶性肿瘤细胞表面高度表达，并与生长因子相互作用，诱导肿瘤的发生和发展。LBL-033双抗同时靶向表达MUC16的肿瘤细胞和表达CD3的T细胞，介导T细胞对MUC16阳性肿瘤细胞的特异性杀伤，从而起到抗肿瘤作用。在结构设计上，公司对靶向MUC16的结合表位以及靶向CD3的亲和力等多个方面做了大量的优化，以期达到安全性和有效性的平衡。在临床前模型中，LBL-033表现出较强的抗肿瘤作用。 维立志博的第四款核心产品LBL-007 ，是一款靶向LAG-3的全人源IgG4单克隆抗体。其设计为LAG-3的独特表位，能以高亲和力与LAG-3结合，并阻断LAG-3与所有已识别免疫抑制配体结合，增强免疫应答。 在临床研究中，LBL-007结合PD-1抑制剂的联合疗法在各种肿瘤类型中均表现出良好的协同抗肿瘤效果及良好的安全性。2021年，百济神州以7.72亿美元引进LBL-007，目前该药在全球处于临床阶段的LAG3 靶向单克隆抗体中临床进度位居前三。 可以看出，维立志博一直在致力于具有极大潜力的高门槛靶点的研发。另外在11月7日，维立志博宣布，与Aditum Bio成立研发公司Oblenio Bio，并将CD3/CD19/BCMA三抗授权给Olenio Bio。通过此次运作，维立志博将收获3500万美元预付款和近期里程碑金额，以及5.79亿美元的开发、监管、销售里程碑金额。维立志博在专注于研发的同时，也在通过BD合作更好地反哺研发。 02 真创新，是维立志博的底气 除了TCE管线和多抗管线之外，维立志博还搭建了ADC技术平台。在招股书中，公司公开了两款处于IND准备阶段的ADC，分别为靶向PSMA的LBL-013和靶向FGFR2b的LBL-052。这两款药物系2023年4月，维立志博与百凯医药签订合作开发协议，共同开发而来，LBL-013主要针对前列腺癌，LBL-052的开发方向为乳腺癌及胃癌。 致力于开发FIC、BIC的真创新，是维立志博在寒冬下前行的底气。公司始终坚持创新研发和产品差异化，这也是国内生物医药企业深化发展的策略和方向。 当下，经济下行周期中投资者由于对风险的厌恶，造成了对创新药的避而不投。然而潮起潮落终有时，当投资者信心恢复，只有少数具有“真创新”能力的创新药企能够穿越市场周期，迎来新的发展阶段。 参考文献： 1.https://www1.hkexnews.hk/app/sehk/2024/106941/documents/sehk24112901736_c.pdf. 2.www.leadsbiolabs.com. 3.Sharma P, Siddiqui B A, Anandhan S, et al.The Next Decade of Immune Checkpoint Therapy[J].Cancer Discov,2021, 11 (4): 838-85. END 【智药研习社近期直播预告】 来源：CPHI制药在线 声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。 投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~

摘要：双特异性抗体（bsAbs）能够实现传统基于IgG的抗体无法达到的新型作用机制和/或治疗应用。因此，这些分子在过去十年中引起了极大的兴趣，并且截至2023年底，已有14种bsAbs获得批准：11种用于治疗癌症，3种用于非肿瘤学指征。bsAbs有不同格式，针对不同的目标，并通过不同的分子机制介导抗癌功能。在这里，我们提供了bsAbs在癌症治疗领域最新进展的概述。我们专注于已批准或处于临床开发中的bsAbs，包括bsAb介导的信号通路双重调节剂、肿瘤靶向受体激动剂、bsAb-药物偶联物、双特异性T细胞、自然杀伤细胞和先天免疫细胞的招募者，以及双特异性检查点抑制剂和共刺激因子。最后，我们对处于更早开发阶段的下一代bsAbs进行了展望，包括三特异性抗体、bsAb前药、诱导肿瘤目标降解的bsAbs以及作为细胞因子模拟物的bsAbs。 引言  bsAbs用于双重受体抑制 bsAbs用于配体-受体抑制 bsAbs用于受体激活 bsAbs用于靶向载荷递送 bsAbs用于癌症免疫治疗、 新兴概念 、展望，双特异性抗体通过新生儿Fc受体（FcRn）循环利用。Fc部分的突变可以改变与FcRn的结合，从而改变抗体的半衰期。在不包含Fc部分的bsAbs中，可以通过其他方式实现类似IgG的药代动力学，例如结合到人血清白蛋白（HSA）或其他可以延长半衰期的分子。目前有超过几百种不同类型的bsAb格式，其中多种格式在已批准和处于临床开发中的分子中使用。目前，大多数已批准的bsAbs和处于药物开发高级阶段的分子主要用于癌症免疫治疗。其他针对新型药物递送的实体也在开发中，例如基于bsAb的抗体-药物偶联物（bsADCs）或双重靶向与癌症相关的信号通路（图1）。我们最近在ClinicalTrials.gov、Cortellis和The Antibody Society的数据搜索显示，有超过200种不同的双特异性分子的300多项临床试验正在进行中，其中约75%用于治疗实体瘤，25%用于治疗血液恶性肿瘤（图1）。目前有十种bsAb药物已获批准用于癌症治疗，其中九种在美国和/或欧洲获批准，卡多尼利单抗在中国获批准。在这十种bsAbs中，有九种可以归类为TCEs。卡塔莫单抗是首个获批准的bsAb，于2013年退出市场（表1和图2）。值得注意的是，今天在临床开发中的相当一部分bsAbs已经处于后期阶段（第二阶段和第三阶段）。我们发现，用于治疗实体瘤的bsAbs主要由免疫调节剂主导，包括双重CPIs（约45%）和TCEs（约33%），其次是针对双重通路的bsAbs、ICEs和双重ADCs。相比之下，TCEs是用于治疗血液恶性肿瘤的主要bsAbs类别（约75%），其次是ICEs、双重CPIs和NKCEs（图3）。我们数据集中的bsAbs针对60多个不同的目标，使用超过50种不同的bsAb格式，涉及100多种目标组合。然而，我们承认，该领域的增长速度很快，新的bsAbs，可能具有新的目标和格式，已经进入临床试验，自我们分析以来。尽管如此，本综述旨在提供一份基于MoA的全面概述，介绍作为癌症治疗开发的bsAbs的最新进展，重点关注截至2023年底在同行评审出版物中描述的bsAbs。 双受体抑制的bsAbs  许多参与细胞信号传导的细胞表面蛋白，如RTKs及其相关受体，是抗体基疗法的验证目标。几十年前，对这些蛋白的研究，包括历史上的先行者表皮生长因子受体（EGFR；也称为HER1）、HER2、血管内皮生长因子（VEGF）和针对它们的抗体，为几乎所有后续的抗体基治疗发展奠定了基础。尽管结合一个定义的信号实体的抗体基疗法相当有效，但与疾病相关的表现型通常由多个通路触发。这种冗余允许细胞通过使用其他补偿性信号通路来克服单一目标或通路的药理学生长抑制或诱导细胞毒性。同时调节不同的与疾病相关的信号受体和/或通路的bsAbs可以减少或克服这种限制。Amivantamab（JNJ-61186372）靶向EGFR和肝细胞生长因子受体（MET）。两种受体都会触发非小细胞肺癌（NSCLC）的增殖，因此，阻断两者可以比仅阻断一个通路更有效地抑制NSCLC的生长。Amivantamab已获批准用于治疗携带EGFR外显子20插入突变的NSCLC亚型。 图1 | 用于癌症治疗的双特异性抗体在临床开发中。目前有200多种双特异性抗体（bsAbs）正在进行临床开发，根据癌症类型、临床阶段和作用模式进行分组。正在进行临床开发的bsAbs中有50%处于II期和III期或已经获批。大约四分之三的bsAbs被开发用于治疗实体瘤，实体瘤治疗主要由T细胞招募剂（TCEs；32.9%）和具有检查点抑制和/或免疫调节作用机制（MoAs）的bsAbs（45.1%）所主导。相比之下，血液系统恶性肿瘤的治疗主要由TCEs（75%）和其他MoAs（21.9%）所主导，这些MoAs涉及免疫学活动，如通过检查点抑制和/或免疫调节激活自然杀伤细胞和其他免疫细胞，这归功于高度肿瘤选择性或谱系特异性抗原的可用性。值得注意的是，约有10%用于实体瘤治疗的bsAbs采用双重信号抑制。迄今为止，正在开发的bsAb抗体-药物偶联物（ADCs）用于治疗实体瘤。CPI，检查点抑制剂；ICE，先天细胞招募剂；NKCE，自然杀伤细胞招募剂。 双特异性抗体用于配体-受体抑制  受体激活可以通过干扰受体二聚体化或复合物形成，或通过阻断受体的配体结合位点来抑制。在癌症中，通常来自几个互补或补偿通路的配体和受体有助于肿瘤进展和治疗抗性。bsAbs可以同时阻断两种不同的配体，无论是可溶的还是细胞膜结合的，或者是配体和受体的组合。这种方法不仅用bsAbs来解决，也用双特异性或双位点基于支架的结合剂来解决，这里我们不包括。双重靶向VEGF和血管素2（ANG2）以阻断分别参与血管生成的VEGFR和血管素-1受体（TIE2）的激活，已成为包括微转移的血管生成转换在内的实体瘤中几项临床试验的主题。BI836880是一种三特异性纳米抗体（Nb）融合蛋白，由三个靶向VEGFA、ANG2和HSA的纳米抗体组成，后者用于延长其血清半衰期。这种化合物目前正在对头颈鳞状细胞癌、NSCLC和其他实体瘤患者进行I期研究。值得注意的是，vanucizumab，一种靶向VEGFA和ANG2的bsAb，在与化疗联合使用的临床前模型中显示出抗肿瘤、抗血管生成和抗转移效应，但在与化疗联合使用时，并未在结直肠癌患者中提高无进展生存期，超过VEGF抑制。将VEGF抑制与另一种拮抗活性相结合的概念进一步应用于靶向VEGF和Delta样规范Notch配体4（DLL4）的bsAbs。DLL4是一种细胞表面配体，激活Notch-1受体通路，该通路在肿瘤血管生成中起着核心作用。几种靶向VEGF和DLL4的双特异性抗体已经进入临床试验，包括navicixizumab、dilpacimab和CTX009/ABL001。Navicixizumab是一种四价双特异性抗体，具有四个结合位点，其中两个基于单链可变片段（scFv）融合，它在与紫杉醇联合使用时在铂类耐药卵巢癌患者中展示了有希望的临床活性，并具有可管理的毒性，表明这种方法可能在某些适应症中提供临床益处。相比之下，另一项针对四价双特异性抗体dilpacimab的II期研究，与亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康（FOLFIRI）联合使用，揭示了安全问题。 表1 | 批准用于癌症治疗的双特异性抗体 ADCC，抗体依赖性细胞毒性；ALL，急性淋巴细胞性白血病；BCMA，B细胞成熟抗原；BiTE，双特异性T细胞招募剂；bsAb，双特异性抗体；DLBCL，弥漫性大B细胞淋巴瘤；EGFR，表皮生长因子受体；EpCAM，上皮细胞粘附分子；GPRC5D，G蛋白偶联受体C类5成员D；MoA，作用机制；NSCLC，非小细胞肺癌；NHL，非霍奇金淋巴瘤；scFv，单链可变片段；TCR，T细胞受体；TDCC，T细胞依赖性细胞毒性。批准区域限于美国、欧洲联盟（EU）、日本和中国；产品也可能在其他国家获得批准。状态截至2023年底。 靶向VEGF和PDL1或PD1的双特异性抗体  基于VEGF抗体和免疫检查点抑制剂（CPI）联合治疗的积极结果，上述概念进一步适应于设计靶向VEGF和肿瘤细胞上的PDL1或T细胞上的PD1的双特异性抗体，从而将抗血管生成与免疫肿瘤学方法相结合。使用这种方法最先进的分子是ivonescimab（AK112），它针对PD1和VEGF。目前，ivonescimab的上市申请正在中国接受监管审查。其他双特异性抗体靶向PDL1和VEGF，包括PM8002，目前正在进行II/III期研究（NCT05756972），针对NSCLC患者。 受体激活的双特异性抗体  许多抗肿瘤反应是通过激活细胞表面受体介导的，包括免疫反应或通过诱导凋亡的细胞死亡。癌症治疗的一种方法是通过将受体激活配体（如生长因子、细胞因子和（共）免疫刺激配体）融合到抗体或抗体片段上，实现受体激活配体的靶向递送，以诱导局部或组织特异性的激动活性，从而引发细胞反应。越来越多的这些抗体-配体融合蛋白正在进入临床试验。受体激活也可以通过激动性抗体来实现。肿瘤坏死因子（TNF）超家族的成员，包括死亡配体（如TNF配体超家族成员10（TNFSF10）；也称为TRAIL）及其各自的死亡受体（如TRAIL受体1和2；也称为DR4和DR5），或具有免疫细胞共刺激活性的配体（如TNFSF9；也称为4-1BBL）及其受体（如TNFRSF9；也称为4-1BB或CD137）在癌症治疗中引起了特别关注。然而，单克隆抗体在临床试验中取得了相当令人失望的结果。原因是许多TNFRSFs需要超过两个受体的交联以激活，这只能通过Fc-FcγR介导的抗体在细胞表面的超聚集来实现，因此依赖于TME中表达足够数量FcγR的先天免疫细胞。作为替代方案，针对目标抗原和TNFRSF成员的双特异性抗体已被证明可以作为强大且肿瘤选择性的激动分子，模仿表面展示配体的活性。这尤其适用于DR4和DR5，DR5需要多个受体的聚集才能激活。值得注意的是，针对DR5和表面抗原的双特异性抗体，如成纤维细胞激活蛋白-α（FAPα；也称为脯氨酸内肽酶FAP）、钙粘蛋白17（CDH17）或叶酸受体-α（FRα），不仅有效地诱导受体激活，还避免了通过诱饵受体的隔离50。RG7386（RO6874813），一种针对癌症相关成纤维细胞上的FAPα和DR5的四价双特异性抗体，在体外和体内在表达FAPα的基质的小鼠中触发了强效且选择性的肿瘤细胞杀伤，并已进入临床测试，但由于战略投资组合优先级而随后中止。此外，BI905711，一种针对DR5和CDH17的四价双特异性IgG-scFv融合蛋白，目前正在进行I期临床研究，显示出在CDH17阳性目标细胞上的效力比单克隆抗体提高了1000倍以上，转化为在结直肠癌模型中的强效且选择性的抗肿瘤活性。相同的格式用于针对DR5和FOLR1的双特异性抗体，FOLR1是一种富集于卵巢癌的受体，已被证明介导顺式（在同一细胞上）和反式（在两个不同细胞上）的细胞毒性，其中FOLR1作为有效DR5激活的聚集点。从概念上讲，这种MoA也可以转移到依赖于受体聚集的TNFRSF家族的共刺激成员，包括4-1BB、OX40和CD40（见图3），使用针对肿瘤相关抗原（TAAs）的双特异性抗体，但也针对其他目标，如PDL1，从而将共刺激与检查点抑制相结合（见下文）。 用于靶向载荷递送的双特异性抗体  存在两种概念上不同的方法，用于使用双特异性抗体进行有效载荷（如细胞毒素或放射性）的靶向递送。第一种方法，预靶向治疗，使用双特异性抗体的一个结合特异性来靶向肿瘤细胞，另一个结合特异性随后捕获肿瘤上的载荷。这类双特异性抗体结合到肿瘤上的癌症靶标，如癌胚抗原（CEACAM5）或HER2，然后捕获由双特异性抗体的第二个结合特异性识别的放射性标记载荷/复合物。 图2 | 已批准用于癌症治疗的双特异性抗体概览。a, 双特异性T细胞招募剂（TCEs）。b, 其他双特异性抗体（bsAbs）（非T细胞招募剂（非TCEs））。11种已批准的bsAbs中有6种具有IgG样结构，由2条重链（恒定区域以深灰色显示，Vh结构域以深蓝色或深红色显示）和2条轻链（恒定结构域以浅灰色显示，Vl结构域以浅蓝色或浅红色显示）组成。它们大多数具有1+1的化学计量比 —— 每个抗原一个结合位点 —— 还有一个TCE通过将一个额外的Fab片段融合到一条重链上，利用2+1的化学计量比。其他的bsAbs要么是不含Fc的融合蛋白，由两个单链可变片段（scFv）片段组成（blinatumomab），要么是将scFv片段与T细胞受体（TCR）片段融合，或者是具有2+2化学计量比的IgG-scFv融合蛋白。除了由小鼠和大鼠杂交瘤细胞技术生产的catumaxomab外，所有其他的bsAbs都是通过重组技术生产的。对于IgG样异二聚体分子，通过在CH3域使用突变来强制异二聚体化 —— 如旋钮-入洞技术 —— 或控制的Fab臂交换（cFAE），解决了两种不同重链的正确组装问题，cFAE还允许从两种不同的单特异性IgG组装IgG样分子。cFAE还解决了轻链问题，即轻链和重链的配对。或者，如CrossMab方法所示，对Fab臂进行进一步的修改，以强制正确的轻链和重链配对。值得注意的是，所有重组IgG样bsAbs都包含一个具有沉默或减少效应功能的Fc区域，这是通过在铰链/CH2域引入突变来避免或减少Fcγ受体和补体结合来实现的。BCMA，B细胞成熟抗原；EGFR，表皮生长因子受体；EpCAM，上皮细胞粘附分子；GPRC5D，G蛋白偶联受体C类5成员D。 最近，被称为SADA的双特异性抗体利用改良的p53四聚体化域来延长GD2×DOTA在肿瘤中的滞留时间。GD2×DOTA是一种双特异性抗体，能够识别在癌症中高表达的二唾液酸神经节苷脂GD2，以及放射性载荷177Lu-DOTA，在肿瘤微环境中组装并滞留在那里，但没有四聚体化，它会迅速从周围清除，因为它缺乏半衰期延长。到目前为止，很少有临床试验中的双特异性抗体使用这种MoA，可能是由于与预靶向放射性相关的复杂物流限制了其普遍适用性。 图3 | 目前正在临床试验中的双特异性抗体的作用机制。a, 通过受体阻断两种不同的信号受体（以不同颜色表示）来抑制信号传导。b, 通过抑制可溶性配体（蓝色）和受体来抑制信号。c, 通过双重阻断两种不同的配体来抑制信号。d, 通过双特异性抗体（bsAb）药物偶联物（偶联物以浅蓝色表示）进行药物传递。e, 针对性阻断“别吃我信号”（CD47–SIRPα相互作用），导致巨噬细胞的吞噬作用。f, 结合检查点抑制，阻断“别吃我信号”。g, 通过T细胞受体（TCR）上的CD3或自然杀伤细胞上的CD16（FcγRIIIa）激活效应细胞。h, 肿瘤细胞结合介导的免疫细胞（共）刺激。i, PDL1结合介导的免疫细胞（共）刺激。j, 双重免疫细胞共刺激。k, 肿瘤靶向PDL1途径抑制。l, 肿瘤靶向PD1途径抑制。m, 检查点结合介导的免疫细胞（共）刺激。n, 双重检查点抑制。o, 通过配体阻断实现双重检查点和可溶性转化生长因子-β（TGFβ）信号的抑制。展示了用于实体瘤和血液系统恶性肿瘤的目标分子和肿瘤相关抗原（TAAs）的例子。注意：bsAbs可以同时发挥多种作用机制（MoAs）。Ang2，血管生成素2；APC，抗原呈递细胞；BCMA，B细胞成熟抗原；CDH17，钙粘蛋白17；DLL4，典型Notch配体4；EGFR，表皮生长因子受体；EpCAM，上皮细胞粘附分子；FRα，叶酸受体α；GPRC5D，G蛋白偶联受体C类5成员D；HLA，人类白细胞抗原；ICOS，诱导性T细胞共刺激因子；LAG3，淋巴细胞相关基因3；TIGIT，具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体；VEGF，血管内皮生长因子。 双特异性抗体药物偶联物  第二种方法通过同时靶向肿瘤细胞表面的两个表位或两个目标，实现了通过双特异性抗体药物偶联物（bsADCs）传递细胞毒素载荷的特异性靶向。处于临床开发中的bsADCs的例子包括zanidatamab zovodotin（ZW49），这是一种双特异性HER2结合抗体zanidatamab与auristatin衍生的细胞毒素载荷偶联，双特异性MET×MET bsADC REGN5093或izalontaxab brengitecan（BL-B01D1），一种EGFR×HER3 bsAb与一种新型TOPO-I抑制剂偶联（NCT05194982）（表2）。 双特异性抗体用于癌症免疫治疗  大多数用于癌症免疫治疗的双特异性抗体通过T细胞驱动的自然或内源性免疫发挥作用，例如通过增强现有的抗肿瘤反应和/或克服检查点抑制，或通过提供合成免疫，例如通过bsAb驱动的免疫细胞的参与、激活和招募（图3）。在这一部分中，我们提供了包括CPIs、效应细胞招募剂（包括TCEs和ICEs）和共刺激双特异性抗体在内的最突出的MoAs的概述。 双重CPIs  许多干扰免疫检查点（如CTLA4或PD1/PDL1）的单特异性抗体已获批准用于癌症免疫治疗，包括ipilimumab、tremelimumab、nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab、avelumab、durvalumab或cemiplimab。将免疫检查点抑制抗体治疗扩展到包括双特异性抗体可能会减少不良副作用并提高观察到的单特异性抗体治疗的疗效。第一个方面，检查点抑制的安全性，包括预防自身免疫相关事件和/或不希望的免疫细胞激活。为了实现这一目标，正在开发针对检查点抑制功能和TAAs（如RTKs）的双特异性抗体，目的是将其活动更优先地集中在肿瘤上，正在开发中。第二个方面，检查点免疫治疗的疗效，通过双特异性抗体同时靶向两种不同的检查点蛋白来提高疗效并降低抗性的可能性，或提供互补的免疫刺激信号。值得注意的是，这些双特异性抗体的共同设计原则是提高对表达两种检查点蛋白的T细胞的选择性，如CTLA4/PD1或PD1/淋巴细胞相关基因3（LAG3），这些蛋白可能更具肿瘤反应性，目标是提供比单独检查点阻断更优越的治疗指数。 表2 | 晚期临床开发中选择的双特异性抗体概览 BiTE，双特异性T细胞招募剂；BCMA，B细胞成熟抗原；bsAb，双特异性抗体；BTC，胆管癌；cL，普通轻链；DART，双亲和重定向；DLL4，类似Delta的典型Notch配体4；EGFR，表皮生长因子受体；EpCAM，上皮细胞粘附分子；Fchet，异二聚体化Fc；LAG3，淋巴细胞相关基因3；Nb，纳米抗体；NHL，非霍奇金淋巴瘤；NSCLC，非小细胞肺癌；PDC，胰腺导管腺癌；scFv，单链可变片段；TIGIT，具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体；TGFβ，转化生长因子β；VEGF，血管内皮生长因子。a晚期包括关键性II期、II/III期和III期临床研究。 例如，通过降低自身免疫不良事件的发生率 —— 而不是与联合检查点阻断相比。探索肿瘤靶向检查点抑制的工作包括开发双特异性抗体，这些抗体靶向肿瘤细胞表面的HER家族RTKs，并结合PD1/PDL1信号通路的阻断作为第二功能，从而将PDL1结合剂定向到肿瘤细胞。这些分子的特定肿瘤靶向导致了对表达EGFR的肿瘤细胞更具特异性和增强的活性。类似地，一种特别结合HER2和PDL1的双特异性抗体被证明可以在HER2表达的肿瘤细胞中特异性阻断PDL1活性，从而比单独使用每个实体或在不作为双特异性抗体结合时联合应用产生更大的治疗效果。 另一种双特异性抗体介导的靶向免疫治疗方法包括将PDL1阻断与识别黑色素瘤上的软骨素硫酸蛋白聚糖4（CSPG4）的结合物相结合。特定的肿瘤靶向增强了抗肿瘤T细胞的特异性、激活状态和疗效。概念上相关的方法包括将PDL1结合物与黑色素细胞刺激激素化学偶联。通过这种方式，PDL1抑制活性被定向到黑色素瘤细胞上的黑色素皮质素-1受体。同时靶向两个检查点蛋白而不额外包括常见的肿瘤细胞表面靶标的双特异性抗体的例子包括同时结合肿瘤细胞上的PD1和PDL1的双特异性抗体。Wan等人分析了这种双特异性抗体在高级别浆液性卵巢癌类器官与免疫细胞共培养中引发的联合活性。与单特异性结合物相比，双特异性抗体介导了优越的疗效，并在T细胞和自然杀伤细胞中诱导了表型变化，包括激活状态和细胞毒性的改变。双特异性抗体LY3434172也采用了这种方法。通过完全抑制PD1/PDL1途径，LY3434172显示出比每个亲本抗体或两者组合更大的抗肿瘤活性，再次证明以双特异性抗体形式的结合很重要，并且可以增加疗效。超越PD1/PDL1方法的界限，包括CTLA4在内的其他免疫受体的双特异性抗体正在开发或已获批准。同时靶向PD1和CTLA4是双特异性抗体cadonilimab的作用机制。Cadonilimab由于四价性，介导了对高密度PD1和CTLA4的增加亲和力驱动的目标结合，这与Fc突变以废除FcγR结合相结合，可能是其有利的治疗指数的基础。值得注意的是，cadonilimab还在PD1+和CTLA4+ T细胞之间介导了跨结合。在晚期实体瘤患者的I/Ib期研究中，cadonilimab显示出抗肿瘤活性和有利的安全性概况，免疫相关不良事件的发生率低。Cadonilimab已在中国获批准用于治疗在铂类化疗后或化疗期间进展的复发或转移性宫颈癌。其他在高级临床试验中结合相同特异性的双特异性抗体是MGD019和MEDI5752。MGD019结合了PD1和CTLA4结合物，在进行中的临床研究中观察到可接受的安全性和组合阻断以及在多种实体瘤中的客观反应。MEDI5752目前正在进行临床评估，它结合了PD1和CTLA4，并显示了PD1介导的靶向，因为它优先饱和了PD1+ T细胞上的CTLA4，并引起了PD1的快速内化和降解。与cadonilimab相比，MGD019和MEDI5752似乎对双阳性T细胞显示出更强的亲和力驱动的选择性增益。双重失活也在探索中，通过结合PD1/PDL1阻断与LAG3或TIM3抑制。例子是IBI323和FS118，它们都结合了PDL1和LAG3，并在临床前模型中显示出增强的双重功效。LY3415244结合了PDL1和TIM3的阻断，作为一种不同的免疫调节剂，但由于在I期研究中观察到的免疫原性，该分子的开发被终止。最近，I期剂量递增和扩展数据的临床试验显示，PD1×LAG3双特异性抗体tebotelimab在实体瘤或血液系统恶性肿瘤患者中作为单药治疗以及与HER2抗体margetuximab联合治疗时显示出有希望的活性。双配体抑制是另一种基于双特异性抗体的检查点抑制方法。PDL1和转化生长因子-β（TGFβ）是具有互补且非冗余免疫抑制活性的受体结合配体。TGFβ不仅具有免疫抑制作用，还可以进一步诱导促血管生成因子的上调和癌症相关成纤维细胞的激活。目前正在开发几种靶向PDL1和TGFβ的双特异性抗体，如类似双特异性抗体融合蛋白的bintrafusp alfa（M7824）。在这种情况下，PDL1的结合是通过一个“标准”的抗体结合模块实现的，而TGFβ则被人类TGFβ受体II的细胞外域捕获。Bintrafusp alfa在临床前研究中显示了激活先天和适应性免疫系统，从而比单独使用抗PDL1抗体或TGFβ陷阱模块更好地抑制肿瘤生长和转移，目前正在进行临床试验。Retlirafusp alfa（SHR-1701），另一种以类似方式靶向PDL1和TGFβ的双功能融合分子，正在对宫颈癌和胃癌或胃食管结合部癌症患者进行III期研究（表2）。YM101是一种TGFβ×PDL1双特异性抗体，目前处于临床前开发阶段。YM101的一个替代品，Y101D，正在对晚期实体瘤患者进行评估（NCT05028556）。所有同时对抗抑制性TGFβ和PD1/PDL1途径的方法在体内模型中显示出比单独使用各自结合物更高的抗肿瘤活性，但迄今为止尚未在临床上证明概念。针对性的TGFβ信号阻断也已经在临床前研究中通过阻断CD4+ T细胞中的TGFβ信号的双特异性抗体实现。为此，将非免疫抑制性的CD4靶向抗体ibalizumab与TGFβ陷阱以类似于上述的双特异性抗体方式结合。这导致在辅助T细胞中针对性阻断TGFβ信号，可以释放抗肿瘤反应。通过双特异性抗体招募磷酸酶抑制PD1是一种最近报道的新型MoA88。这是通过一个单域（Vhh）融合到一个scFv实现的，将PD1连接到细胞表面磷酸酶CD45，这反过来触发细胞内去磷酸化。这种方法与单独使用PD1抗体介导的配体阻断相比，增强了检查点阻断的抑制。按照同一原则，双特异性抗体可以将细胞表面磷酸酶CD45与抑制性自然杀伤细胞表面受体NKG2A或Ly49连接，以进行后续去磷酸化。这样的双特异性抗体可以阻断并同时去磷酸化它们的目标，可能比相应的单特异性抗体及其抑制信号的组合更有效的拮抗剂，以增强自然杀伤细胞和T细胞的抗肿瘤活性。使用双特异性抗体对CD73的不同表位进行双位点靶向是另一种双特异性抗体相关方法，以抵消免疫抑制活性或增强针对肿瘤的免疫能力。CD73产生免疫抑制性腺苷，其通过内化的双特异性抗体介导的抑制和耗尽比单一位点CD73抗体更有效。 效应细胞招募剂 T细胞招募剂 在过去二十年中，专门结合肿瘤表面抗原和TCR的CD3ε链的T细胞招募剂（TCEs）在这一类双特异性抗体中占据主导地位，描述了数百种TCEs，并且有100多种进入临床开发。事实上，第一个获准上市的双特异性抗体是鼠/大鼠嵌合的上皮细胞粘附分子（EpCAM）×CD3ε双特异性抗体catumaxomab，它在2009年被欧洲联盟（EU）批准用于恶性卵巢腹水的腹腔内治疗，但后来因商业原因退出市场。目前正在中国再次进行临床试验，用于腹腔内给药。系统应用的catumaxomab显示出严重的输注反应和高免疫原性发生率，可能由于其鼠/大鼠嵌合的恒定区域和保留的FcγR结合，导致在没有抗原结合的情况下非特异性FcγR和TCR激活。随后，下一代TCEs被设计为缺乏Fc部分，如基于串联scFv的CD19×CD3ε双特异性T细胞招募剂（BiTE）blinatumomab，它在2014年首次被批准用于治疗B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）。然而，由于缺乏通过FcRn的循环，这种疗法需要持续输注，FcRn通过从分拣内体循环到细胞表面，从内溶酶体降解中挽救IgG。基于blinatumomab的成功，针对血液和实体瘤的各种目标的BiTEs被开发出来，但最终没有进入晚期临床试验，由于BiTEs和相关短半衰期的药代动力学特性不佳。人们尝试通过纳入FcγR结合惰性Fc结构域（沉默Fc）或HSA结合部分来实现bsAbs的IgG样半衰期，目前大多数处于开发中的TCEs是基于IgG和/或具有IgG样药代动力学的。值得注意的是，大多数TCEs使用单个单价结合位点用于CD3作为T细胞上的触发分子，以避免在没有同时目标结合的情况下TCR交联引起的系统性T细胞激活。然后它们使用一个（1+1）或两个（2+1）肿瘤目标的结合位点，因为双价结合可以在肿瘤选择性和效力方面提供优势。CD20×CD3ε双特异性抗体mosunetuzumab106和B细胞成熟抗原（BCMA）×CD3ε双特异性抗体teclistamab是第一批异二聚体1+1 IgG基TCEs，分别在2022年被批准用于治疗复发/难治性滤泡性非霍奇金淋巴瘤（NHL）或多发性骨髓瘤。在2023年，异二聚体2+1 CD20-TCE glofitamab104,108和1+1 CD20-TCE epcoritamab109被批准用于治疗复发/难治性弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL），以及1+1 G蛋白偶联受体C类5成员D（GPRC5D）-TCE talquetamab110和BCMA-TCE elranatamab111用于复发/难治性多发性骨髓瘤（表1）。CD20-TCE odronextamab112和BCMA-TCE linvoseltamab的上市申请正在等待监管决定。鉴于它们在复发/难治性B细胞和浆细胞恶性肿瘤患者中显示出的有希望的临床疗效和完全缓解率 —— 包括在CAR-T细胞治疗后复发的患者中的活性 —— 以及它们作为现成疗法的简单可用性以及皮下给药的可能性，可以预期TCEs将成为CAR-T细胞疗法的主要替代品，特别是随着它们开始被开发用于更早期的治疗线并且可以让患者轻松获得。免疫动员单克隆T细胞受体针对癌症（ImmTACs）是结合了工程化TCR以识别人类白细胞抗原（HLA）呈递的肽抗原与抗CD3 scFv的TCEs，实现对细胞内TAAs的靶向。值得注意的是，短暂存在的ImmTAC tebentafusp，它包含一个针对由HLA-A*02:01呈递的黑色素细胞谱系特异性抗原糖蛋白（gp100）表位的可溶性TCR融合到CD3靶向scFv，已在2022年被批准用于治疗葡萄膜黑色素瘤，为TCEs在实体瘤中的细胞内靶标空间开辟了新的领域。值得注意的是，tebentafusp介导了总体生存益处，尽管它只诱导了少数临床反应，因此直接杀死肿瘤细胞可能不是其唯一的MoA。与此同时，各种基于重组TCR或使用类似TCR的抗体（TCR模拟物）的TCEs已进入临床开发，包括针对WT1和突变新抗原如KRAS122或p53的TCEs。重要的是，高通量动力学筛选和通用TCR类似库可以促进高度选择性的TCR和TCR模拟物的开发，用于TCEs。有趣的是，使用共价KRASG12C抑制剂sotorasib，可以产生一种类似TCR的TCE，可以特异性识别HLA呈递的sotorasib-肽共轭物，并随后诱导KRASG12C突变细胞的T细胞杀伤。细胞因子释放综合征的发生，主要是由于靶向T细胞激活，一直是TCEs临床开发的一个主要挑战。尽管在许多情况下，这可以通过使用类固醇预处理和逐步剂量增加来管理，但最近的努力已经研究了使用具有降低CD3ε亲和力的CD3ε抗体，目标是将T细胞杀伤与细胞因子分泌解耦。与CAR-T细胞一样，由于TCEs的杀伤效力非常高，因此需要严格肿瘤特异性和/或谱系特异性表达目标抗原，以避免靶向非肿瘤毒性。对于血液癌症中的B细胞和浆细胞抗原，如CD19、CD20、CD79b、BCMA140141和FcRH5，通常认为它们只存在于B细胞和浆细胞恶性肿瘤以及非必需的B细胞和浆细胞谱系中。然而，即使对于CD19等抗原，其在正常组织中的表达可能并非绝对不存在，有报道称CD19在围绕内皮细胞的壁细胞/血管周细胞上表达，这些细胞对血脑屏障完整性至关重要，作为一种靶向非肿瘤机制与神经毒性有关。相比之下，在急性髓系白血病中，典型的抗原如CD33或CD123也存在于髓系造血谱系上，使得它们的临床开发更具挑战性。类似地，许多主要的（上皮）实体瘤抗原如EGFR、HER2、EpCAM、肿瘤相关钙信号转导蛋白2（也称为细胞表面糖蛋白Trop-2）、MUC1、CEACAM5和glypican 3也可以在（必需的）正常组织中找到。因此，由于更免疫抑制性的肿瘤微环境，TCEs（和CAR-T细胞）在实体瘤的开发在过去几年中进展较少。重要的是，必须认识到对于TCEs，与ADCs150相比，由于更高的效力，对肿瘤选择性的要求更严格，固体瘤ADC靶标如HER2和TROP-2可能无法用传统的TCEs靶向。与此同时，与TCEs相比，ADCs可能由于在肿瘤微环境中释放有毒载荷而受益于更强的旁观者杀伤效应，对抗原阴性肿瘤细胞进行杀伤。因此，很少有肿瘤选择性抗原似乎是TCEs的可行靶标，包括新抗原如p95-HER2和EGFRvIII，或者MUC16、claudin 18.2、DLL3和STEAP1等靶标。对于DLL3靶向的TCE tarlatamab，目前正在美国食品药品监督管理局（FDA）的优先审查中，已在小细胞肺癌中报告了有希望的I期临床数据，总反应率达到23%。随后的II期研究证实了活动性，持久的客观反应和有希望的生存结果，使用每2周10毫克剂量治疗的患者。基于这些数据，已启动了一项随机关键研究，比较tarlatamab与标准护理（NCT05740566）。同样，xaluritamig，一种2+1 STEAP1 TCE，具有亲和力驱动的活性，能够选择性地针对高表达STEAP1的肿瘤细胞与正常细胞相比，已在转移性去势抵抗性前列腺癌患者的I期剂量递增研究中展示了有希望的临床活性。综上所述，这些概念验证数据表明，TCEs仅限于血液癌症活跃的共同假设，特别是B细胞恶性肿瘤，并不适用，并且TCEs也有可能治疗某些实体瘤，只要能够管理靶向非肿瘤活性。正在使用多种方法来克服实体瘤选择性挑战。例如，在双特异性抗体中使用具有降低亲和力的肿瘤抗原结合物（2+1格式）可以实现亲和力介导的选择性增益（也称为亲和力调节），目标是利用肿瘤和正常组织之间的表达差异，如CEACAM5、HER2和FOLR1，以提高肿瘤选择性。或者，双重靶向和亲和力介导的选择性增益应用于三特异性TCEs，这些TCEs选择性地杀死共同表达这些靶标的肿瘤细胞，但不会影响只表达这些靶标中一个的正常细胞。此外，针对两种不同的肿瘤抗原如CD19和CD22的三特异性TCEs可以防止通过抗原丢失的免疫逃逸。尽管大多数传统的TCEs可以招募常规T细胞和非传统先天样γδ T细胞（表达TCRγ/δ而非TCRα/β的T细胞），但一类特定的γδ TCEs已被设计为通过TCRγδ特别招募γδ T细胞，目标是通过只针对可以在患者中进一步扩展的T细胞亚群来提高安全性和有效性。在临床前研究中，γδ TCEs作为单一药物显示出强大的抗肿瘤活性。或者，为了此目的，制造了针对肿瘤的双特异性异二聚体BTN2A1和BTN3A1抗体融合蛋白。由于γδ T细胞生物学在小鼠模型中没有完全反映，这种方法的最终概念验证将不得不依赖于正在进行的临床试验的临床数据，如针对PSMA的γδ TCE LAVA-1207（NCT05369000）。而不是针对CD3ε或TCRα/β的双特异性抗体，肽-MHC复合物可以被应用来特别招募特定pMHC复合物的T细胞，如由于自然发生和普遍的巨细胞病毒感染而存在的巨细胞病毒衍生肽。在另一种方法中，病毒表位可以被传递到肿瘤细胞中，以便加载相应的MHC分子，并招募病毒特异性T细胞攻击这些细胞。还描述了用于更有效介导双特异性抗体介导的聚集和补体依赖性细胞毒性的双特异性抗体。有趣的是，通过应用两对独立的抗体，可以建立一种逻辑门，通过补体依赖性细胞毒性选择性地消除共表达两种抗原的细胞。例如，使用这种方法，可以消除共表达CD20和CD52的B细胞，而单独表达这些抗原的细胞则不会被杀死。随着对采用CAR-T细胞疗法的极大兴趣，一类特定的TCEs，作为CAR-T细胞和肿瘤细胞之间的双特异性适配器，已被设计为特别招募采用转移的T细胞用于治疗各种癌症，同时不涉及自然T细胞。其中一个例子是合成激动性受体（SAR）-T细胞系统，其中一种双特异性抗体识别肿瘤抗原和一个引入到采用转移的T细胞中的合成抗原受体。这种在合成生物学背景下的方法提供了多种方式。 进一步工程化和控制采用T细胞疗法方法，超出了传统抗体疗法或经典CAR-T细胞疗法所能提供的范围。另一种结合细胞疗法和双特异性抗体的方法是体外武装T细胞与多种TCEs，目标是克服肿瘤异质性。为此，T细胞在体外与针对肿瘤抗原如GD2、HER2、PSMA和STEAP1的TCEs孵育，并给药于肿瘤携带动物，在这些动物中，由于抗原丢失，它们阻止了肿瘤进展。 固有细胞招募剂  尽管TCEs在效应细胞招募剂领域占据主导地位，但正在大力开发下一代ICEs，包括NKCEs和双特异性抗体，这些抗体招募髓系衍生细胞（MDCs）进行吞噬作用，包括中性粒细胞和巨噬细胞/单核细胞。介导ADCC的单克隆抗体，如利妥昔单抗、西妥昔单抗或曲妥珠单抗，因为ADCC/抗体依赖性细胞吞噬作用对其MoA至关重要，除了其他作用如信号抑制外，可以被视为第一代ICEs。基于这种经验，已经批准了几种与常规单克隆抗体相比具有增强ADCC功能的Fc工程化IgG1抗体，包括obinutuzumab、mogamulizumab、tafasitamab、margetuximab和amivantamab。基于这种经验和目标，进一步增强ADCC功能，超越Fc工程化IgG1抗体，已经开发了各种双特异性NKCEs，它们针对自然杀伤细胞上的不同表面分子，如CD16、NKG2D、NKp46或NKp30，作为免疫疗法。这些NKCEs中最先进的是一种短半衰期的CD30×CD16双特异性抗体，用于治疗霍奇金淋巴瘤，可以作为单一疗法、与检查点抑制联合或与自然杀伤细胞输注联合使用。最近，开发了针对抗原如EGFR或BCMA的半衰期延长的四价IgG基双特异性抗体，以及利用双重靶向实现肿瘤选择性的三特异性抗体。对称的三特异性NKCEs通过ADCC特别针对通过其CD16结合区域共表达EGFR和PDL1的细胞，使用两种合一抗体技术。另一种激活自然杀伤细胞的方法依赖于双特异性融合蛋白，该蛋白由NKG2D配体（例如UL-16结合蛋白2（ULBP2））与针对HER2的scFv融合，以实现有效的ADCC介导的肿瘤细胞杀伤。或者，保留FcγRIII结合的双特异性抗体，针对NKp46或NKp30和各种肿瘤抗原，可以提供强大的抗肿瘤效果。与TCEs不同，其中FcγR结合是不需要的，这些双特异性抗体依赖于保留或增强的FcγRIII结合，以实现有效的自然杀伤细胞参与。值得注意的是，当IL-2变体被融合到NKp46双特异性抗体上，产生四功能分子时，由于同时诱导自然杀伤细胞扩增，效果大大增强。另一个积极研究的领域是双特异性抗体，这些抗体通过结合，例如，巨噬细胞和中性粒细胞上的FcαRI受体（CD89）或通过双特异性IgE抗体的IgE受体，参与吞噬作用或MDCs以及中性粒细胞的杀伤。或者，肿瘤靶向双特异性抗体可以阻断肿瘤细胞上基于'不要吃我信号'的CD47–SIRP1α相互作用，以便这些细胞被MDCs攻击和吞噬。双特异性CD19 x CD47或间皮素x CD47抗体结合了肿瘤靶向和CD47抑制以及通过效应功能完整的Fc部分招募效应细胞。在这种情况下，对CD47具有低亲和力的双特异性抗体有利于克服不必要的结合到红细胞上的CD47。 各种团队应用这一概念进行PDL1×CD47共靶向。或者，SIRPα融合蛋白可以用来阻断CD47–SIRPα“不要吃我”信号。 共刺激双特异性抗体  有效、持久且局部限制的抗肿瘤免疫反应需要共刺激和共抑制信号来紧密调节细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞的激活、分化和维持。TNFRSF家族成员（如4-1BB、CD40、OX40、TNFRSF18（也称为糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白（GITR））、CD27或CD30）以及CD28免疫球蛋白超家族（如CD28、CTLA4、PD1、诱导性T细胞共刺激因子（ICOS）和B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减因子（BTLA））及其相应的配体，在通过细胞-细胞接触（如抗原呈递细胞（APCs）和T细胞之间）提供的局部免疫调节信号中发挥着显著作用。这些受体为T细胞提供了所谓的信号2，这对于维持TCR通过肽-MHC-TCR相互作用或通过TCE交联TCR所提供的信号1是必需的。针对这些免疫调节途径的靶向可能增强免疫疗法。研究表明，针对共刺激受体的激动性单克隆抗体通常只会导致微弱的激活，但这种激活可以通过FcγR介导的受体超聚集显著增加。此外，抗体与受体之间的化学计量比、结合亲和力和表位特异性等因素可以影响共刺激抗体的活性。因此，降低免疫调节抗体的亲和力可以作为一种策略，通过增加受体聚集来增强激动性活性，这一原则经常应用于双特异性抗体激动剂（见上文）。然而，由于增加的趋化因子和细胞因子产生导致的免疫相关系统性不良事件是共刺激抗体药物开发的限制因素。抗体-细胞因子融合蛋白和双特异性抗体能够以目标依赖的方式提供共刺激信号，通过双重靶向两种不同的共刺激受体或通过靶向共刺激受体和CPI来规避这一限制。 肿瘤靶向共刺激双特异性抗体  用一个臂结合到TAA上，另一个臂结合到免疫细胞上的共刺激受体上的双特异性抗体，可以通过在癌细胞和免疫细胞之间跨作用来局部介导受体聚集，从而提供信号2。目前正在临床试验中的共刺激双特异性抗体包括针对4-1BB、CD40和CD28的分子。T细胞激活后诱导表达的4-1BB使其成为增强CD8 T细胞反应的T细胞共刺激的有吸引力的靶标。使用针对4-1BB的激动性抗体（如urelumab和utomilumab）作为单一疗法在临床试验中的安全性问题和较差的疗效，使人们重新将努力集中在可以克服这些毒性的双特异性抗体上，通过引入肿瘤特异性共刺激。大约一半的癌症靶向共刺激双特异性抗体在临床试验中通过4-1BB发挥作用。先进的双特异性抗体包括PRS-343（cinrebafusp），一种针对HER2和4-1BB的四价双特异性抗体-抗钙蛋白融合蛋白，在IND使能研究中被发现耐受性良好，没有明显和相关药物相关毒性；FAP-4-1BBL（RG7872），作为单一疗法和与PDL1抑制联合使用时显示出药理活性；或englumafusp alfa，正在研究中作为与glofitamab联合用于DLBCL的信号2提供者。其他在临床试验中通过4-1BB进行肿瘤选择性共刺激的双特异性抗体目标包括EGFR、PSMA、CLDN18.2、B7H4、CEACAM5、HER2、PDL1（见下文）和FAP48。此外，使用CD28作为共刺激受体的双特异性抗体，目前在临床试验中。通过与APC上的CD80（也称为B7.1）或CD86（也称为B7.2）的结合，CD28为幼稚T细胞提供了必要的二次信号，以实现完全的T细胞激活和存活。这种信号也可以通过激动性CD28抗体提供，即使在没有初级TCR参与的情况下，如超激动剂TGN1412所示，它在I期研究中因大量细胞因子释放综合征而显著失败。后来发现，TGN1412特别在低剂量下作用于调节性T细胞（Treg细胞），而在高剂量下激活传统T细胞和Treg细胞，为选择性靶向T细胞亚群提供了窗口，但也突出了T细胞共刺激与超激活之间的微妙平衡。一些双特异性抗体可以以目标依赖的方式提供这种二次共刺激信号，以增强肿瘤限制性的抗肿瘤T细胞反应。值得注意的是，双特异性抗体可以被设计为单独使用时活性有限且无毒性，但可以增强T细胞激活和TCEs的抗肿瘤活性。REGN5837是一种针对CD22和CD28的双特异性抗体，已进入与针对CD20的TCE odronextamab联合用于NHL治疗的I期试验。肿瘤靶向CD28双特异性抗体也可以与PD1协同作用，提供长期抗肿瘤免疫反应，目前，多个针对TAAs如EGFR、MUC16、PSMA、B7-H3、CD19、CD22或PDL1的双特异性抗体正在进行临床试验，与检查点抑制联合使用或作为单一疗法。 MDCs和树突细胞激活双特异性抗体  CD40在包括APCs、其他MDCs和B细胞在内的多种细胞类型中表达，但也在广泛的恶性细胞上表达。单克隆激动性CD40抗体可以通过诱导APCs成熟和激活抗原特异性T细胞和其他免疫细胞来触发抗肿瘤效应，从而促进肿瘤特异性免疫反应，特别是通过启动细胞毒性T细胞。除了具有剂量限制毒性的激动性CD40抗体外，还开发了针对CD40和各种TAAs如CEACAM5、EpCAM或间皮素的双特异性抗体。与其他TNF超家族成员一样，受体聚集在受体激活中起着关键作用。将CD40激动性抗体与针对肿瘤靶向抗原的抗体结合在双特异性抗体中，允许共刺激活性定向到TME，从而提高安全性和有效性。例如，针对CD40和CEACAM5或EpCAM的四价双特异性抗体的概念验证表明，与单一CD40抗体相比，它们增强了T细胞交叉启动。针对间皮素和CD40的双特异性抗体（ABBV-428）在体外和体外模型中展示了增强的APC和T细胞激活，并且在I期试验中显示出可接受的安全性概况。为了在肿瘤内而不是外周选择性激活CD40，生成了FAP×CD40，一种包含两个CD40结合位点和一个FAP结合位点的双特异性抗体。该抗体提供了一个强烈的FAP依赖性CD40刺激信号，展示了良好的安全性概况以及肿瘤积聚和肿瘤内免疫激活，目前正在进行I期临床试验。MP-0317是一种多功能设计ankyrin重复蛋白（DARPin），应用相同的概念，针对FAP、CD40和HSA进行半衰期延长，目前正在进行I期临床研究。或者，双特异性抗体可以通过Clec12a标记物直接靶向树突细胞。 双特异性抗体的双重共刺激  在免疫细胞上双重靶向两种不同的共刺激受体已被用于诱导强大的抗肿瘤反应。FS120是一种针对活化T细胞上表达的4-1BB和OX40的四价双特异性抗体，以一种不依赖FcγR的方式激活CD4和CD8 T细胞。这种活性需要两个受体的共刺激才能有效激活免疫细胞并发挥抗肿瘤活性，支持使用四价双特异性抗体双重靶向共刺激受体以诱导有效的受体聚集和激活的概念。在动物研究中，FS120的替代品没有引起肝脏炎症和肝毒性，这是激动性4-1BB抗体观察到的限制。FS120目前正在进行I期临床试验。类似的方法中，开发了一种双价双特异性抗体，用于双重靶向4-1BB和CD40（BNT-312，tecaginlimab），因此靶向T细胞和APCs。APCs的CD40激活导致共刺激分子的上调和免疫刺激性细胞因子的分泌，从而在不依赖CD4 T细胞帮助的情况下，实现强大的CD8 T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。 双特异性抗体用于双重检查点抑制和共刺激  抗共刺激受体的抗体还被与CPIs结合使用，以释放T细胞免受抑制信号的影响，同时增强T细胞反应，特别是在对检查点抑制有抵抗力或难治性的肿瘤中。大多数目前正在临床试验中的双特异性抗体使用跨作用的方式结合这些信号，通过靶向肿瘤细胞上的PDL1和免疫细胞上的共刺激受体，其中4-1BB是最突出的靶标。超过十种不同的针对PDL1和4-1BB的双特异性抗体正在进行I期或II期试验。II期候选物包括一种IgG-anticalin融合蛋白（PRS-344），其中配体结合anticalin框架代表第二特异性，一种双价双特异性IgG抗体（acasunlimab，也称为GEN1046）和一种三价，三特异性单链二抗体-scFv融合蛋白，进一步包含一个HSA结合位点以延长半衰期（NM21-1480）。这些类型的双特异性抗体可以增强免疫反应，超越单一抗体及其组合，进一步提供针对PDL1表达肿瘤细胞的靶向共刺激，以及TME中的MDCs和肿瘤引流淋巴结。与此一致，TME中表达4-1BB的肿瘤浸润CD8 T细胞亚群表达高水平的PD1，因此容易受到PDL1×4-1BB双特异性抗体的治疗。值得注意的是，由于4-1BB信号需要超聚集，与PDL1的结合可以导致TME中条件聚集和激活的4-1BB，减少肝脏毒性，如四价双特异性IgG-scFv（ABL503）所示。遵循这一概念的进一步双特异性抗体包括四价双特异性单克隆抗体（FS222）和双价双特异性IgGs，如MCLA-145。同样，CD28共刺激和检查点抑制可以通过在肿瘤内顺式作用的T细胞双重靶向进一步实现。ATOR-1015的可行性已得到证明，它是一种针对OX40的IgG，融合到针对CTLA4的优化版本的V型域的CD86上。与4-1BB类似，CTLA4和OX40在活化的T细胞上上调，并由Treg细胞表达，特别是在TME中。与GITR和ICOS不同，CD27由naive T细胞表达，因此有助于促进新的T细胞反应。 PDL1×CD27双特异性抗体在临床前研究中比PD1阻断和CD27共刺激的组合更有效，同时展现出良好的安全性概况。在概念上类似的方法中，PD1的结合位点与其他TNF超家族的共刺激成员结合，包括4-1BB（如与IBI319结合）、GITR和ICOS（XmAb23104）。GITR也在活化的T细胞上上调，并由Treg细胞恒定表达，在其中发挥着增强初始免疫反应的关键作用。PD1×GITR-L双特异性融合蛋白的概念验证已经展示。对于这些药物中的一些，与联合或分别协同效应相比，检查点抑制的相对贡献并不一定确立。 新兴概念  支持双特异性抗体开发的概念从早期探索性方法迅速发展到临床开发，双特异性抗体现在已确立为治疗原则。然而，双特异性抗体领域仍在不断进展，以进一步探索和扩展技术和应用。学术界以及生物技术和制药工业追求的各种早期探索性双特异性抗体方法是有希望的，其中一部分可能提供尚未由当前开发中的双特异性抗体解决的治疗概念。本综述的范围不允许我们涵盖所有或许多这样的早期方法，实际上在这个快速增长的领域中可能无法全面覆盖。因此，我们通过提及一些我们认为相关并有潜力进一步推动基于双特异性抗体的癌症治疗界限的新兴主题来结束我们的综述。 三特异性TCEs与集成共刺激  共刺激信号可以与双特异性TCEs结合，以促进有效的T细胞激活。这已经通过上述的双特异性TCEs和共刺激双特异性抗体的组合实现，但也通过在双特异性TCE中包含第三个结合位点来针对共刺激受体，从而生成三特异性抗体。目前有两种这样的三特异性TCE正在进行临床试验，它们针对TAA和CD3，并进一步包含一个针对CD28的结合位点。SAR443216是一种三价三特异性免疫球蛋白基抗体，针对HER2×CD3×CD28，包含一个突变的IgG4，缺乏Fc介导的效应功能。这种三特异性抗体目前正在I期临床试验中，能够激活初级CD4和CD8 T细胞，诱导T细胞增殖，释放细胞因子和颗粒酶B以及T细胞介导的HER2表达肿瘤细胞的杀伤，包括HER2表达低的细胞。类似地，一种针对在多发性骨髓瘤中过度表达的CD38的结合位点与CD3和CD28结合位点结合在三特异性抗体SAR442257中，目前也在I期临床试验中。 前药方法  一种新兴的方法旨在通过提供“安全关键”的特异性作为前药，在肿瘤处选择性激活，从而生成具有高度肿瘤特异性功能的双特异性抗体。一些应用于失活抗体以生成前药并在肿瘤处重新激活的概念如图4所示。前药转化为功能性双特异性抗体可以通过肿瘤微环境中存在的肿瘤特异性蛋白酶等环境触发因素来实现。例如，具有空间屏蔽的双特异性抗体可以通过蛋白酶激活。需要肿瘤特异性蛋白酶表达的蛋白酶激活TCEs，即所谓的probodies，需要肿瘤特异性蛋白酶在TME中的表达才能激活。另一种早期阶段的双重肿瘤靶向方法依赖于从两个具有分裂CD3ε结合基团的双特异性抗体中肿瘤特异性组装功能性CD3ε抗体片段。这些实体需要被设计为在循环中作为单独实体时不活跃，以便它们只在肿瘤抗原结合和随后的原位组装后被激活，如已经为半抗体或前药激活链交换（PACE）分子所描述的那样。这类分子面临的主要挑战仍然是以单体形式大规模生产它们，并防止在没有目标结合的情况下过早组装。通过目标链交换介导的分裂型I细胞因子的重建就是一个例子，说明如何实现肿瘤特异性组装。值得注意的是，最近开发了一种引入到抗4-1BB抗体结合位点的ATP依赖性开关，以增加肿瘤选择性并避免靶上、靶外毒性。这种开关使用肿瘤中升高的ATP水平作为触发因素，可能也适用于其他结合实体。 图4 | 双特异性抗体领域的新兴概念。a, 带有集成共刺激的三特异性T细胞招募剂（TCEs），用于通过CD3结合同时激活T细胞受体（TCR）（信号1）和通过结合CD28进行共刺激（信号2）。b, 双特异性抗体（bsAb）前药的作用方式。用于生成前药并重新激活所需作用位点的抗体的一般概念包括：阻断结合位点以使抗体失活，以及通过蛋白酶诱导激活被阻断的抗原结合位点，对目标环境（如酸性pH或ATP）的亲和性调节，以及由于通过高浓度局部富集互补前药而进行的组装或交换反应。c, 通过结合表面抗原（肿瘤相关抗原（TAA））和降解分子，例如膜E3连接酶，实现蛋白酶体靶向嵌合体（PROTAC）方法，这导致细胞表面目标的内化和蛋白酶体降解。d, 例如通过基因疗法将bsAb传递到CAR-T细胞中。e, 细胞因子模拟bsAb触发细胞因子受体途径，如通过将受体域引入立体接近性，模仿细胞因子作用的IL-2Rβ–IL-2Rγ异二聚体。 PROTAC双特异性抗体  另一个新兴概念和新的作用机制最近被描述，它使用双特异性抗体通过靶向降解来灭活与增殖相关的过程。类似于新兴的双特异性或多特异性小分子蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）领域，双特异性抗体可以被设计为触发内部化并随后降解参与癌症发展和/或进展的表面蛋白。这样的双特异性抗体同时结合到被靶向降解的蛋白质，以及触发结合目标蛋白的内部化和随后降解的因素，如膜可及的E3泛素连接酶或转铁蛋白受体。目前还没有已知的抗体-PROTAC概念进入临床研究，但这类实体的开发与“标准”双特异性抗体的开发完全兼容，并为靶向新途径并尽快将其概念带入临床提供了独特的可能性。 双特异性抗体的传递  双特异性抗体发展的另一个重要新兴概念是局部生产和随后的局部传递双特异性抗体，例如通过脂质纳米粒子介导的mRNA传递CLADN6 TCE，溶瘤病毒或类似基因疗法的方法，包括CAR-T细胞。 细胞因子模拟抗体  最后，双特异性抗体也可以作为细胞因子模拟物或所谓的合成细胞因子激动剂。在这种情况下，已经描述了scFvs或基于单一结构域Vhh的方法，通过模仿IL-2或IL-15、IL-18、I型干扰素和IL-10有效地触发细胞因子信号。或者，可以通过使用分裂方法使用新设计的IL-2模拟蛋白neoleukin实现肿瘤特异性细胞因子受体激动活性。这种基于抗体的细胞因子模拟物在癌症免疫疗法中可能有各种应用。 展望  双特异性抗体领域近年来取得了显著进展，到2023年底，已有十多种双特异性抗体获得批准，许多不同的方法正在临床测试中。然而，我们认为，由于癌症的异质性和适应性，这些方法中不太可能有一种成为通用的癌症免疫疗法。相反，抗体将需要为特定应用量身定制，并将依赖于与其他方法的结合，以最大化它们的疗效和安全窗口。具有多重特异性的抗体治疗的发展增长可能会在未来几个领域发生：针对具有明确依赖性的肿瘤的肿瘤相关RTKs的双特异性抗体；用于以增加的选择性靶向肿瘤的双特异性ADCs；用于靶向降解适用于各种途径的细胞表面蛋白的双特异性PROTACs；以及用于癌症免疫疗法的多特异性抗体。在后一个领域，特别是对于非常有效的基于T细胞的疗法，如TCEs或CAR-T细胞，识别高度肿瘤选择性抗原将是至关重要的，将需要能够通过肿瘤特异性蛋白酶激活和更好地调节效应功能来特别实现肿瘤特异性活性，同时保护正常组织。另一个重要方面是提供双重检查点抑制和/或补充共刺激信号给T细胞，以维持和延长T细胞反应，如已被证明对CAR-T细胞疗法的临床成功至关重要。重要的是，这种方法不仅适用于与TCEs的组合，也适用于与内源性免疫方法的组合。另一个重要方面是通过激活先天免疫系统，包括自然杀伤细胞、MDCs和树突细胞，促进二次免疫反应的产生。与其他癌症药物一样，通过改进的诊断方法和新的发展范式，使双特异性抗体和多特异性基于抗体的治疗能够在疾病早期应用于患者将是实现治愈癌症患者目标的关键。

摘要：治疗性抗体在临床上的广泛应用已经改变了包括罕见和具有挑战性条件在内的许多疾病的药物疗法格局。然而，外源生物制剂的给药可能会潜在地触发不希望的免疫反应，例如产生抗药物抗体（ADAs）。现实世界的经验已经揭示了ADA发生与不满意的治疗结果以及免疫相关不良事件之间的明确相关性。通过回顾性检查涉及免疫原性分析的研究，我们注意到人们越来越强调阐明基于抗体的治疗药物的免疫原性表位谱，以机制性理解免疫原性的产生，并理想地减轻风险。因此，我们在这里全面总结了实验和计算方法在治疗性T细胞和B细胞表位表征方面取得的进展。此外，本文特别强调了生物治疗药物去免疫原性驱动的表位成功实践。 1.引言 由于其卓越的生物活性、特异性和安全性，治疗性单克隆抗体（mAbs）是治疗蛋白（TPs）中最有前途的类别之一，现在已成为生物制药行业组合的重要组成部分。尽管有许多优点，作为外来大分子，mAbs和其他基于抗体的TPs（图1a）可能会引发不需要的体液免疫反应，通过触发抗药物抗体（ADAs）的发展，这些抗体通过调节生物治疗药物的效力、药代动力学和药效学（PK/PD）以及免疫相关的安全性特征，表现出多样的临床意义（图1b）。根据mAbs（即，嵌合型、人源化、全人源）的遗传来源，位于框架区（FR）或互补决定区（CDRs）中的非生殖系内容可能导致治疗后显著的ADA出现。ADA（既有预先存在的也有治疗后出现的）的程度需要在整个药物给药过程中密切监测，正如监管当局所要求的。对于涉及具有高免疫原性风险的生物治疗药物的临床研究，可能需要在研究结束后延长ADA监测，因为一些个体中ADA的持续存在。 图1. 免疫原性对基于抗体治疗药物的影响。(A) 不同基于抗体治疗药物的结构图。mAb，单克隆抗体。KIH，旋钮-孔洞。BiTE，双特异性T细胞引导剂。ADC，抗体-药物偶联物。Fv，可变片段。(B) 对基于抗体治疗药物的影响。结合到mAb的表位的ADA引发中和能力，从而导致治疗效果减弱。ADA还可能触发I型（IgE介导）和II型（IgG介导）超敏反应的发生。一旦ADAs（IgM或IgG）和治疗药物形成免疫复合物，就可能发生与III型超敏反应相关的不良事件。免疫复合物的大尺寸也导致治疗药物从血液中更快清除。该图表是在BioRender.com上创建的。 近年来，许多工程化基于抗体的治疗药物（例如，抗体-药物偶联物、多特异性抗体）和抗体类似分子（例如，重链可变域[VHHs]、设计的ankyrin重复蛋白）正在作为药物或TP组分开发，许多产品已进入临床阶段。值得注意的是，随着多域生物治疗药物（MDBs）、细胞疗法和基因疗法等创新生物模式的爆发，ADA风险的复杂性和特异性有所增加。因此，需要一种综合策略来评估和表征免疫原性，以促进生物制药的非临床发现、临床开发以及上市后监测。 ADAs的产生涉及两种机制：T细胞非依赖性（Ti）和T细胞依赖性（Td）B细胞激活（图2）。Ti过程是由治疗药物的重复表面抗原通过多价交联B细胞受体（BCR）启动的，随后是BCR信号的激活和抗体的快速分泌。通过Ti途径产生的抗体主要是短暂存在的五聚体免疫球蛋白M（IgM），由于缺乏体细胞超突变和亲和力成熟过程，它们对目标的结合亲和力低。在生物制药研究中，一个已经很好地阐明的Ti介导的抗体产生情况是，在给药聚乙二醇化纳米药物后出现的抗聚乙二醇（PEG）IgM。另一方面，IgG类型的ADAs，具有高亲和力和长期持久性，主要是通过Td途径产生的，这涉及通过内质体-溶酶体系统由抗原呈递细胞（APCs）如树突细胞（DCs）摄取和水解TPs。从TPs衍生的短肽可能与抗原处理细胞内的MHC II类分子复合，然后被运输到DCs表面，允许与生发中心的滤泡辅助T淋巴细胞（Tfh）表达的特定表位T细胞受体（TCR）结合。 图2. T细胞依赖性和非依赖性B细胞激活途径的示意图。DC，树突细胞。pMHC II，肽-MHC II复合物。TCR，T细胞受体。BCR，B细胞受体。该图表是在BioRender.com上创建的。 DCs在抗原处理过程中成熟并产生对CD4+辅助T细胞激活所必需的细胞因子。与MHC II限制性肽段相关的互补TCR被定义为T细胞表位（TCEs）。激活的、抗原许可的Tfh群体进一步与已经遇到并呈现相同抗原的B细胞结合，并产生诱导B细胞向分泌ADA的浆细胞成熟的必需细胞因子。在这一点上，一部分B细胞获得了在二次免疫后更快反应的潜力，并分化为记忆群体。在B细胞的抗原处理过程中，称为B细胞表位（BCEs）的抗原内特定区域被BCRs识别，以促进它们的摄取和处理。虽然理论上TCEs可以分布在整个抗原蛋白中，但BCEs限于BCRs/抗体直接可访问的表面积。TCEs和BCEs的存在共同决定了ADA产生的可能性。因此，研究人员需要通过检查TCEs和BCEs（它们可能重叠也可能不重叠）来明确评估生物治疗药物的免疫原性风险。 进行分层免疫分析以检测总ADA和中和ADA（Nab）是TPs开发的标准实践，正如监管指南和行业白皮书（或建议）所支持的。然而，基于完整治疗药物的免疫分析并不能提供深入的信息，如表位谱，这些信息包含了概述抗治疗免疫影响的关键见解。因此，已经开发了许多方法来表征TCE/BCE以满足不同的研究目的。在这项工作中，我们旨在通过重点介绍用于特别分析基于抗体的治疗药物的TCEs和BCEs的方法，提供免疫原性评估的战略概述。 2.实验策略用于TCE发现和免疫风险降低  TPs的免疫原性主要由Td免疫反应决定。因此，可以预先在早期发现阶段进行TCEs为重点的免疫原性评估，用于领先评估，或事后用于临床免疫原性表征，对于勾画候选药物的开发能力至关重要。由于外源性Td免疫反应的一些关键步骤可以通过培养的细胞重现，因此开发了许多体外检测平台来监测生物治疗药物的T细胞介导的免疫原性。这些方法涉及测量与HLA II分子的物理或功能性结合的治疗药物衍生肽，如表1所总结。以下段落中的例子说明了不同的TCE表征方法。值得注意的是，这些策略，即体外结合、免疫肽组学和基于细胞的方法，通常以综合方式利用。 2.1.体外HLA结合 肽-MHC II结合是Td免疫原性先决条件，在CD4+ T细胞激活之前。考虑到肽-MHC II相互作用的分子特征得以保留，研究人员试图通过检查合成肽与MHC II分子的结合来调查抗原的TCE谱。体外HLA结合测定用于鉴定或验证治疗性mAbs（如英夫利昔单抗）的TCE簇，这是一种嵌合型肿瘤坏死因子（TNF）靶向mAb，在人类中具有相当的免疫原性。Hamze等人的研究中合成了来自英夫利昔单抗重链和轻链的重叠15-肽，并将其分组为亚池进行体外结合测定。结果发现，位于重链（HCDR2、HCDR3）、轻链框架区1和2（LFR1、LFR2）附近的肽与许多HLA II等位基因结合得足够好。由于结合测定通常与其他方法一起进行，而不是单独用于TCEs的去新识别，我们在后续部分讨论了更多涉及基于抗体的药物免疫原性分析的例子。 体外结合测定的使用也促进了对许多治疗蛋白（TPs）酶替代疗法免疫原性风险的理解。促红细胞生成素（EPO）通常用于恢复纯红细胞再生障碍患者对EPO产生自身抗体的红细胞生成。因此，提出了诸如引入N-糖基化或消除T细胞表位（TCEs）的蛋白质工程策略来规避免疫原性问题。Tangri等人使用来自野生型人类EPO的合成肽库进行了体外HLA II结合筛选。令人惊讶的是，几乎所有肽都显示出与一个或多个HLA II等位基因结合的亲和力。在肽筛选阐明的TCE景观基础上，通过修改最具免疫原性的肽并随后通过外周血单核细胞（PBMCs）增殖测定来实现EPO的去免疫原性。HLA II结合测定也用于表征和减少因子VIII（FVIII）的免疫原性，FVIII是血友病A患者缺乏的关键凝血因子。与EPO类似，临床研究表明，在治疗过程中，大量接受野生型FVIII的患者发展出抑制性抗体。Steinitz等人使用合成肽库鉴定了八个T细胞表位簇。在随后的研究中，通过使用具有单突变肽的HLA II结合测定定位了一个关键的表位肽后，研究人员随后定位了关键残基。相应地产生了去免疫原性FVIII突变体，并通过T细胞功能测定进行了验证。 肽-MHC II结合的机制理解得到了大规模体外肽结合研究的证实。例如，Wang等人进行了最全面的肽-MHC II结合筛选，共有180个库，每个库有一个固定氨基酸的位置和另外19个位置是所有20种天然残基的等量混合物。这些库被测试了结合亲和力，并产生了约40,000个结合亲和力数据点，涉及全球人群中频率较高的26个HLA II等位基因。基于对肽-MHC II结合的深入阐明以及实验结合亲和力数据的积累，许多计算TCE预测算法已被实施，以替代体外MHC II结合测定用于初始表位筛选。体外结合测定通常用于验证来自替代策略的候选肽。然而，需要注意的是，结合表位不一定是随后引发免疫反应的“功能性表位”。因此，MHC II结合测定通常与体外T细胞测定结合使用，以功能性验证抗原衍生肽。 2.2.免疫肽组学 体外结合测定提供了一种无偏的方法，全面检查任何给定TPs的潜在TCEs，但它并不考虑生理条件下的抗原处理。MHC相关肽蛋白质组学（MAPPs）测定是一种基于细胞的体外方法，用于鉴定由DC自然呈现的MHC II限制性肽。为了建立这种测定，需要从PBMCs中最初分离出CD14+单核细胞，并通过分化混合物处理以获得高HLA II表达的DCs。通过TPs脉冲处理后细胞裂解，pMHC II复合物可以免疫沉淀，通过质谱（MS）鉴定HLA相关肽组。通常需要来自多个捐赠者的原代细胞，以覆盖HLA II的多态性。 MAPPs测定已广泛用于确定来自基于抗体治疗药物的TCEs。例如，涉及MAPPs测定的多项研究揭示了英夫利昔单抗的CD4 TCEs。在英夫利昔单抗的重链CDR2、CDR3、轻链LFR1等几个区域鉴定了TCE簇。正如预期的那样，MAPPs测定鉴定的大多数肽根据体外数据被确认为HLA II配体。在Karle等人的研究中，通过MAPPs结合细胞增殖测定评估了secukinumab（临床批准的抗白细胞介素[IL]-17A mAb，用于治疗斑块状银屑病）的免疫原性。与五种具有不同免疫原性风险的市场mAbs相比，secukinumab在MAPPs测定中发展出最低密度的TCE簇。有趣的是，所有六种mAbs的肽呈现水平与临床ADA发生率之间发现了相关性，强调了MAPPs测定对临床免疫原性风险评估的预测能力。Casotta等人对natalizumab（一种用于治疗多发性硬化症的抗整合素4 mAb）的Nab进行了深入表征。通过使用来自患者衍生的、natalizumab特异性B细胞的pMHC II纯化的MAPPs测定，发现了一个单一的TCE，略位于LCDR2上游，决定了对natalizumab的免疫原性。有趣的是，这个表位似乎是可工程化的，这促使产生了去免疫原性变体在体内进行测试。 为了提高MAPPs测定的效率和一致性，Lee等人开发了一种半自动化工作流程，以简化样品准备步骤（即，细胞裂解、免疫沉淀、洗涤和洗脱）。通过这种工作流程测试了一系列临床mAbs，结果表明，具有临床免疫原性风险的抗体可以鉴定出肽簇。更重要的是，一些揭示的肽与其他小组以前发表的结果很好地一致，表明这种新型测定工作流程的稳健性和可靠性。此外的研究还表明，其他因素的选择，如DC培养基、免疫沉淀珠子和抗体对MAPPs测定结果的影响。与依赖于给定长度的合成肽的体外结合测定不同，MAPPs测定作为一种强大的工具，展现出额外的生理相关性，因为它只揭示了自然呈现的TCEs。这也使得可以检查参数，如侧翼氨基酸和翻译后修饰等对TCE形成的影响。尽管如此，肽检测灵敏度仍然是MAPPs测定的最大限制因素，特别是当测试具有低免疫倾向的分子时。包括但不限于细胞培养、pMHC II免疫沉淀、色谱分离和MS检测的因素需要优化，以实现满意的免疫肽组学结果。 2.3.基于细胞的功能测定 体外功能测定为从计算预测、体外结合筛选和MAPPs测定中鉴定的抗原肽诱导的免疫反应提供了可靠的验证。此外，基于细胞的实验可以用来确认通过表位消除成功去免疫原性。 在T细胞依赖性（Td）免疫原性生成途径中，pMHC II-TCR结合后的抗原特异性CD4+ T细胞扩增（图2）。因此，测量T细胞增殖和激活是监测免疫原特异性T细胞反应的有利方法。T细胞增殖测定可以在PBMCs的背景下执行，或者使用纯化的DCs和自体CD4+辅助T细胞（也称为DC-T细胞测定）。在前一种情况下，测试化合物被置于PBMCs中足够时间以刺激T细胞增殖，这反映了分析物的免疫原性。对于DC-T细胞测定，需要先用治疗剂脉冲处理纯化的DCs，然后刺激自体CD4+ T细胞。如Gokemeijer等人在一项调查中指出的，T细胞增殖测定在两种格式中在测定参数方面都有很大的不同，例如供体数量、对照选择、读数等，由生物制药行业的研究人员执行。 许多例子强调了T细胞增殖测定在推进基于抗体治疗药物的开发能力方面的价值。例如，治疗性mAbs的结晶片段（Fc）可以被工程化以适应不同的药理特性，例如减少抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。在Wilkinson等人的研究中，创建了ADCC消除的人类IgG1 Fc变体，并通过T细胞增殖测定筛选了携带相应突变的肽的免疫新表位。与代表野生型Fc序列的肽相比，含有L234/235A突变的肽，这是mAb工程中常用的ADCC耗竭策略，在PBMC增殖测定中没有显示出增量的T细胞反应。Steven等人报道了通过体外成熟过程对针对人血清白蛋白（HSA）的鲨鱼可变域（VNAR）的去免疫原性。将随机突变引入到先前构建的huE06v1.10中，这是一个人化的抗HSA VNAR，并对其进行了DC-T细胞测定以评估免疫原性。因此，建立了表现出完整目标结合能力和最小免疫原性的克隆BA11。 T细胞增殖测定不断发展，以增强其在免疫原性评估中的稳健性。例如，由于抗原特异性CD4+ T细胞自然丰度低，T细胞增殖测定的灵敏度有些不尽人意。在这方面的限制下，Siegel等人开发了一种创新的DC-T共培养测定，涉及重新刺激步骤以增强测定灵敏度。具体来说，在CD4+ T细胞和抗原脉冲DCs共培养几天后，向共培养中添加新鲜制备的、抗原挑战的自体单核细胞，以进行额外的T细胞刺激。通过这个工作流程，作者成功地再现了以前出版物中鉴定的TP衍生TCE肽引起的免疫效应。此外，这些肽的去免疫原性对应物显示出减弱的DC-T测定反应，表明了这个测定平台的稳健性。另一项研究表明，在PBMC测定的背景下，使用其他T细胞激活标记物，如CD134和CD137，可以特别概述抗原反应性CD4+ T细胞群体。研究人员通过测试14种不同免疫潜力的生物制剂，证明了体外刺激后CD4+ T细胞中CD134+/CD137+群体的比例与临床ADA发生率很好地相关。这些报告强调了进一步协调体外测定的必要性，以更准确地预测TPs的临床免疫原性。 与T细胞增殖测定一起，酶联免疫吸附点（ELISpot）测定也用于可视化抗原特异性T细胞激活。与T细胞激活相关的细胞因子（例如，IL-2，干扰素[IFN]-γ）通常用作ELISpot测定的读数，以检查TPs的Td免疫原性。与酶联免疫吸附测定（ELISA）相比，后者测量大量细胞培养的总细胞因子水平，当需要量化分泌细胞因子（功能性）细胞群体时，ELISpot更为有利。在上述Spindeldreher等人的研究中，通过使用抗原负载的PBMCs挑战的CD4+ T细胞进行IFN-γ ELISpot测定，验证了MAPPs测定中鉴定的ixekizumab衍生肽。PE38是用于构建重组CD22靶向免疫毒素moxetumomab pasudotox的细菌衍生毒素。由于PE38的非人源性，moxetumomab pasudotox在临床上表现出相当高的免疫原性，这促使人们努力发展PE38的去免疫原性版本。Mazor等人使用合成的PE38衍生肽通过ELISpot测定鉴定了PE38的TCEs。随后产生了TCE耗尽的去免疫原性PE38，并通过消除的T细胞免疫反应进行了验证。在治疗肽中引入非天然氨基酸（unAA）已被广泛实施，部分是为了免疫原性管理的兴趣。Azam等人通过将unAA引入模型抗原，流感血凝素（HA）肽HA306-318，进行了概念验证研究。正如ELISpot和体外肽结合测定所证实的那样，修改后的肽显示出受损的T细胞启动能力以及不同程度的减少HLA II结合。 值得注意的是，无论是表位肽还是完整的TPs都可以作为T细胞增殖测定的输入。肽无疑提供了更多以表位为中心的观点，而完整的TPs提供了关于整体免疫原性潜力的更全面的见解。然而，使用完整TPs进行基于细胞的免疫原性分析的主要担忧源于化合物的作用机制。大多数免疫调节治疗剂自然地向T细胞传递刺激性信号，这导致强烈的T细胞激活和增殖，很难区分免疫原性触发的细胞扩增。在这种情况下，DC-T细胞测定可能更可行，因为它避免了被测试代理直接激活T细胞。否则，肽（或重叠肽池）可能作为PBMC测定的输入材料，以突出特定表位的T细胞激活。而不是利用通用程序，应为每个项目计划一种适合目的的方法，通过整合一系列体外测定。Xue等人报告了对ATR-107的系统免疫原性评估，ATR-107是一种高度免疫原性的抗IL-21受体（IL-21 R）mAb。在这项研究中，作者观察到当由ATR-107而不是对照mAb脉冲时，T细胞的增殖更强，并通过MAPPs测定鉴定了位于轻链CDR2（LCDR2）的ATR-107衍生的TCE簇。更重要的是，通过进行内化测定，表明ATR-107的免疫反应部分归因于其与DCs的抗原处理和呈现机制的有效参与，这可以通过药物靶标（IL-21 R）在DCs上的高表达来解释。在另一项研究中，研究人员比较了三种人源化mAbs（即mAb1、mAb2和mAb3）针对同一靶标的T细胞扩增、DCs激活和抗原处理，并通过了MAPPs测定鉴定了TCEs。mAb1引起的更好的T细胞增殖归因于APCs的激活。在90%的患者中表现出免疫原性的mAb3在体外未能促进T细胞增殖，可能由于缺乏DC激活。然而，来自MAPPs数据的合成肽簇引发了强大的CD4+ T细胞反应。这些发现表明，依赖任何单一平台来估计候选分子的潜在免疫原性风险是不充分的。 3.BCE 映射方法的范围  与可以通过体外测量确定的TCE不同，体液免疫反应是由不同组织中的多种细胞类型完成的，这不能轻易地通过体外或离体系统重现。因此，BCE分析通常是通过使用来自动物或人类研究中获得的ADA样本进行无细胞实验来执行的。已经建立了多样化的策略来表征TPs的BCE谱，如下所述。鉴于ADAs的异质性本质，我们特别讨论了多克隆抗体（pAbs）的表位映射，与mAbs相比，其表征可能更具挑战性。实验方法，如配体结合测定（LBA）、质谱（MS）和结构分析，通过不同原理揭示了抗体-抗原结合界面。本节讨论的每种策略的适应性、费用以及时间消耗都列在表2中。每种技术都提供了独特的优势和限制，强调了需要一个综合策略来明确理解生物治疗药物的表位谱。 3.1.基于LBA的方法 基于LBA的表位映射的基本原理是在抗原的不同片段或突变体中描绘抗体的结合偏好（定性或定量）。许多学术和工业实验室都报告了他们开发的内部表位映射测定，并有许多商业选项可供具有不同研究目标和目标的研究人员使用。通过几个案例研究，我们详细阐述了基于LBA的方法如何帮助揭示域、肽段和残基水平分辨率的表位信息。 3.1.1.域特异性表征 美国食品药品监督管理局建议评估ADA与MDBs相关ADA的不同临床相关域的结合特异性。Gorovits等人提出了一种通用的逐步策略，以满足MDBs相关ADA的域特异性表征的要求。作为ADA域特异性分析的代表性研究，Stubenrauch等人报告了在非人灵长类动物研究中，通过域检测和竞争测定（DDA和DCA）来检查由靶向免疫细胞因子（TIC）诱导的ADA的域特异性的实践。简而言之，TIC的三个基本模块，即抗原结合片段（Fab）、Fc和细胞因子域，分别纯化并用作诱饵（DDA）或竞争者（DCA），以分析ADA结合偏好。根据DDA和DCA结果的一致性，所有12个受试者都表现出针对Fab和/或细胞因子域的ADAs，而只有一个受试者发展出针对Fc的ADAs。另一项典型研究涉及对moxetumomab pasudotox的域特异性分析，这是一种高度免疫原性的CD22靶向免疫毒素，由结合域（BD）和毒素PE38组成。Vainstain等人建立了桥接测定，使用每个域作为抑制剂来测量域特异性ADAs的相对丰度。他们的方法也得到了验证，并应用于临床研究，揭示了36/67和66/67的Nab阳性受试者分别表现出针对BD和PE38的ADAs。 域特异性分析也已经在涉及多特异性抗体的研究中实施，这些抗体包含两个或更多目标结合域。Luong等人开发了一种基于细胞的域特异性Nab测定，以支持PF-07257876的临床开发，这是一种双特异性抗体，共同靶向PD-L1和CD47。值得注意的是，作者提出了一种独特的基于珠子的Nab提取方法，用于测定之前，并观察到从非中和ADAs中显著减少的假阴性。从Nab的域特异性中可以获得更多的见解，以更好地解释有关PK、效力和安全性的临床观察。 与基于终点测量的免疫测定不同，表面等离子共振（SPR）可以监测配体-受体结合的动力学，也可以用来量化ADAs对药物分子的占据。Lewis等人报告了一种基于SPR的策略，用于表征血浆中凝血因子VIII的C2域特异性抗体的存在。然而，域特异性分析代表了表位映射的基本方法，因为它获得的表位分辨率相对较低。应以案例特定方式部署更复杂的测定，以明确指出介导ADA-TP相互作用的BCEs。 3.1.2.肽结合方法 与基于肽的TCE映射类似，可以通过与合成肽库的体外结合测定来研究BCE。肽库的覆盖范围从单个蛋白质到整个蛋白质组，具体取决于研究目的。基于肽的表位映射的第一个尝试是由Barteling等人报道的，他们将口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1分解为208个合成肽。鉴定了一个七肽区域作为抗体产生的主要表位。Brand和同事开发了一种肽筛选测定，以检查由Fabry病患者产生的ADAs识别的人类α-半乳糖苷酶A（AGAL）上的BCEs，这些患者没有功能性AGAL。如所示，许多患者对AGAL及其同源物α-半乳糖苷酶B共享的肽产生了ADAs，这表明了对ADA交叉反应性的严重关注。 几项研究利用肽筛选来表征对高免疫原性治疗性mAbs（如英夫利昔单抗和阿达木单抗）的ADAs的表位谱。通过筛选覆盖英夫利昔单抗全长序列的15-肽，研究人员鉴定了六个ADA表位，其中四个位于TNF结合界面内，支持了英夫利昔单抗在临床上与免疫原性相关的效力丧失。同一小组在另一项涉及阿达木单抗的研究中后来鉴定了类似分布模式的表位。此外，肽微阵列已被广泛用于明确指出来自病原体和食物过敏原的多克隆BCEs（pBCEs）。 肽也可以在细胞展示系统中呈现，以绕过化学合成过程。Rockberg等人创建了一个细菌展示的人类表皮生长因子受体2（HER2）的随机片段cDNA库，并用它来映射几种抗HER2 pAbs的域特异性。通过对每个pAbs结合的细菌进行测序，作者揭示了每个pAbs池可以靶向的一个到五个域。基于相位展示系统的类似策略也可以建立，以揭示由病原体或毒素诱导的pBCEs。 肽筛选用于表位映射的主要缺点是其无法再现构象和不连续表位。一些化学策略已被提出，旨在模拟肽阵列上的构象表位。Timmerman等人建立了一个通过化学交联在特定位置引入的肽内半胱氨酸的构象肽阵列。这项技术已成功商业化，并用于鉴定利妥昔单抗的构象表位。然而，非线性表位的广泛复杂性使它们极其难以通过任何通用化学策略来重建。 对一系列带有点突变的肽进行二次筛选可以提供残基水平的表位信息。在Geyson等人的研究中，确定了一个单一的6-肽作为高潜力线性表位后，生成了一个深入的库，包含120个六肽，每个六肽都包含一个来自亲本肽的单点突变，并揭示了Leu148和Leu151这两个关键残基决定了抗病毒抗体的结合能力。 尽管存在显著的局限性，但由于分辨率适中、成本相对较低且易于解释，肽筛选的BCE精细映射被广泛采用。整合额外的补充策略可能有助于弥补肽筛选相关的空白。 3.1.3.突变扫描 深度突变扫描（DMS）结合细胞分选，能够高通量地识别完整蛋白质上的功能决定性残基。对于表位映射，特别是需要创建并表达目标蛋白质带有单个氨基酸突变的DNA库。这里的假设是一旦关键的表位残基缺失，抗体就不再与抗原结合。展示负抗体结合信号的细胞群体将被分离并进行深度测序，以随后揭示这些关键残基。如所指出的，DMS有助于发现通过氨基酸到丙氨酸库筛选无法识别的表位。值得注意的是，DMS在最近SARS-CoV-2爆发的相关研究中贡献显著。通过筛选SARS-CoV-2受体结合域（RBD）的酵母展示突变库，Greaney等人鉴定了三个关键的RBD-驻留表位，这些表位被中和pAbs识别。在这些表位区域内发生的突变，以不同程度恢复了病毒的感染，通过减少抗体介导的中和能力。 一种不同的pBCEs映射方式是将pAbs库拆分为mAbs，以单独表征BCE。Onda等人从用免疫毒素PE38免疫的动物中鉴定了总共60个mAbs，并通过相互竞争结合和点突变筛选鉴定了七组表位。随后，该研究小组开发了一系列去除先前工作中识别的BCE的变体，并通过体内研究确认了减少的免疫原性以及持续的效力。在概念验证研究中的成功转化为新免疫毒素LMB-100的开发，这是通过将针对间皮素的Fab与截断的、BCE耗尽的毒素PE24连接而生成的。LMB-100目前正在进行临床试验，用于治疗表达间皮素的肿瘤（例如NCT02798536，NCT02810418）。在之前提到的涉及natalizumab的研究中报告了类似的策略。通过研究从两名接受natalizumab治疗的患者中分离出的单克隆Nabs，检查了决定Nab结合的关键CDR定位残基。 然而，虽然这种策略提供了最高水平的表位分辨率，但涉及的相当大的工作量在许多情况下可能不可行。 3.2.基于质谱的方法 质谱策略是另一种广泛使用的方法，用于解析蛋白质复合物的高级结构信息。作为一种具有卓越灵敏度的分析器，质谱已经被用于生物和制药研究数十年，并且已经使用了几代基于质谱的方法来解码关于抗原-抗体识别的结构信息。在这一部分，我们将深入探讨这些方法如何促进映射pBCEs的努力。 3.2.1.蛋白质酶解切除/提取 蛋白质酶解切除/提取（PROTEX）-质谱策略依赖于通过固定化抗原捕获的蛋白质酶解抗原肽的质谱鉴定。根据抗原-抗体复合物形成和酶介导的抗原降解的顺序，这种方法可以分为表位切除（结合先于消化）和表位提取（消化先于结合）。表位切除/提取结合质谱检测为最少的材料输入提供了宝贵的表位信息。一些研究报告了其对pAbs的使用，如Opuni等人的调查。其中，Roth等人通过表位切除-质谱表明，活动性抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎患者的抗髓过氧化物酶自身抗体与健康受试者相比具有不同的表位特异性。考虑到PROTEX-MS在广泛的实验设置中的众多研究中的应用，将其作为分析ADAs表位的潜在策略是合理的。PROTEX-MS的一个潜在限制是它依赖于蛋白质水解消化来释放适当长度的肽以精确确定表位位置。因此，抗原的内在因素，如大小、序列和在天然构象中的可及性，都会影响酶解后的输出。此外，不连续的表位可能不会被有效回收，特别是当抗原的三维结构不可用时。 3.2.2.蛋白质足迹分析 一种称为蛋白质足迹分析的先进质谱策略已被越来越多地用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。原则上，蛋白质的溶剂暴露区域可以通过特定试剂进行修饰（可逆或不可逆），并通过蛋白质-蛋白质相互作用诱导的修饰轮廓（足迹）可以通过质谱随后进行检查。Liu等人全面回顾了基于质谱的蛋白质足迹分析的方法和应用。 氢-氘交换结合质谱（HDX-MS）广泛用于研究蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质构象变化。目标蛋白质的溶剂暴露区域通过氢到氘的可交换性进行标记。由于HDX效率几乎完全由溶剂中的暴露状态决定，因为每个氨基酸（除脯氨酸外）都有一个单一的背骨氢，HDX-MS通常被认为是一种无偏的足迹分析方法，用于概述高级蛋白质结构。与一些使用纯化的pAbs进行分析的案例研究不同，Stander等人表明，HDX-MS可以利用免疫后产生的非富集pAbs池，进一步扩展了这种策略的稳健性和适应性。 HDX-MS的一个主要技术障碍是由于原子交换过程的可逆性导致氘原子的损失。为了克服这个缺点，通过共价修饰一个或几个首选残基，开发了许多不可抑制的标记方法。快速光化学氧化蛋白质（FPOP）依赖于使用来自KrF激光脉冲的过氧化氢产生的羟基自由基标记蛋白质。Genentech最近的一项概念验证工作涉及基于FPOP的临床候选双特异性抗体的ADA表位映射。据报道，根据FPOP-MS数据，ADAs可以识别两个臂中的重链和轻链的CDRs。有趣的是，在ADAs存在的情况下，两个臂上另外两个区域逐渐暴露，表明ADAs可能作为TPs的变构调节剂。 3.3.结构生物学方法 揭示抗原-抗体复合物的结构提供了BCEs的原子级分辨率。X射线晶体学和核磁共振（NMR）广泛用于获取抗原-mAb复合物的结构，这对理解mAbs的特异性和作用模式具有重要意义。Cassotta等人展示了纳他利珠单抗-单克隆ADA复合物的晶体结构，但据我们所知，尚无研究报告成功实施任一技术捕获抗原-pAbs结构。 电子显微镜（EM）目前是实现大尺寸和异质性大分子复合物结构可视化的最可行方法，这些是NMR和X射线晶体学的瓶颈。2018年首次报告了使用EM多克隆表位映射（EMPEM）进行pBCE可视化。在这项研究中，从接种HIV包膜（Env）疫苗的家兔血清中纯化的IgG被消化以释放Fab，随后与Env孵育形成Env-pAbs复合物，然后进行负染色EMPEM（nsEMPEM）。作者通过检查不同时间点样本的染色模式，观察了免疫过程中pAbs多样性的时间变化。此外，在低频率下还鉴定了一个未报告的抗体类别，它位于Env叶片之间结合。类似的实验流程后来用于其他类型病毒和疫苗的表位映射研究。迄今为止，尚无研究报告使用nsEMPEM可视化TP-ADA复合物。尽管如此，我们仍然对EMPEM在未来免疫原性评估中的实施持乐观态度，考虑到这项技术的日益普及。 4.计算表位预测  药物开发者对预测与生物治疗药物相关的免疫原性风险有着浓厚的兴趣。考虑到为候选筛选生成的大量mAb候选物，再加上实验方法的技术障碍和高成本，依靠实验策略在早期开发阶段进行免疫原性评估是不切实际的。然而，随着免疫信息学的快速发展，许多计算平台已经出现，以加速基于TCE和BCE预测的免疫原性评估。所有开发者都应认识到，抗药物免疫反应是一个多因素过程，其中许多与化合物相关（例如，配方、聚集）和与患者相关（例如，免疫状态、遗传背景）的属性起着关键作用。因此，应谨慎应用基于序列的计算免疫原性分析的见解以进行决策。当前TCE和BCE预测工具的可用性和性能如下。 4.1.T细胞表位预测 体外T细胞预测通常由抗体开发者执行，以便在早期阶段提供快速和高通量的免疫原性评估。由于CD4+ T细胞反应在触发抗药物免疫反应中发挥决定性作用，因此已经做出了广泛努力，以推进MHC（HLA）II呈现的肽表位的计算预测。HLA II类基因由三个位点编码，即DR、DP和DQ，它们在人类群体中都表现出极端的多态性。尽管HLA II具有广泛的变异性，但源自抗原的肽总是使用9-mer核心区域与MHC II分子的结合槽相互作用，尽管结合槽外的侧翼残基似乎对结合有所贡献。P1、P4、P6和P9的侧链面向MHC II结合口袋，使这四个位置成为决定肽-MHC II相互作用选择性和亲和力的关键“锚定残基”。每个不同的MHC II分子都呈现其独特的9-mer肽核心偏好，特别是四个锚定位点。肽-MHC结合的高度限制模式使基于序列的预测成为免疫原性风险评估的可行方法。 免疫表位数据库（IEDB，http://www.iedb.org）已经积累了超过44,000个MHC II配体结合亲和力数据，以实现算法开发的模型训练。已经开发了多种定量矩阵驱动（例如，SMMalign）和机器学习驱动平台（例如，NNalign），用于预测针对已知序列的HLA II等位基因的TCE（请参阅Doneva等人的综述，了解TCE预测方法的全面收集）。Nielsen等人在NN-align的基础上开发了Ethician，以实现更准确的泛特异性HLA-II表位预测，以克服只有有限数量的HLA等位基因已经实验研究了它们的表位特异性的障碍。这种方法通过包含来自MAPPs测定的肽洗脱数据进一步改进。截至2023年9月，Ethician 4.1已根据IEDB的自动基准测试结果被指定为最推荐的方法。 算法区分免疫原性与非免疫原性肽的能力通常通过曲线下面积（AUC）反映，其范围从0.5（随机预测）到1.0（完全准确预测）。迄今为止，许多MHC II表位预测方法可以实现AUC>0.8，这通常是令人满意的。所有当前的MHC II表位预测工具都基于计算算法计算的肽-MHC II结合亲和力，这通常会导致免疫原性的过度预测。根据抗原的摄取和处理，理论上可以与MHC II结合的表位可能不会由细胞机制功能性地呈现。一些方法已经提出通过检查N-和C-末端基序来识别目标蛋白的蛋白酶裂解位点，但这些方法未能显著改善MHC II限制性表位预测。与MHC I表位预测相比，这远不理想，后者从纳入像NetChop这样的蛋白酶体处理分析工具中大大受益。 T细胞表位的一个子集被调节性T细胞识别，称为Tregitopes，对效应CD4+辅助T细胞的免疫耐受起到抑制作用。Tregitopes最初在IgG的Fc区域被识别，后来扩展到更多非IgG蛋白。据报道，通过在MHC II结合预测的背景下包括Tregitope校正，整体免疫原性预测性能得到了提升。因此，结合Tregitopes以诱导Treg介导的免疫耐受代表了TP去免疫原性的替代策略。 对于基于抗体的治疗药物，由于mAbs的新表位通常位于定义mAbs结合亲和力和特异性的CDRs中，因此通常使用计算TCE预测进行候选筛选，而不是蛋白质工程。然而，计算TCE识别在药物优化中的价值已经在其他模式中得到体现。由Eli Lilly开发的一种抗糖尿病治疗药物度拉糖肽，是通过将人类IgG4的Fc结构域与胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物肽融合而制成的。通过点突变R36G消除了靠近母体肽C末端的一个强表位，从而创造了去免疫原性的GLP-1类似物。涉及FVIII去免疫原性的案例研究也代表了展示由计算平台驱动的免疫原性风险降低的例子。 应该适当评估MHC II表位预测的计算范式的稳健性，以指导决策过程。已经报告了计算评估与临床观察之间的相关关系，但随着样本量的增加，结论是否会受到挑战仍然值得怀疑。虽然许多赞助商倾向于在早期阶段利用计算数据支持开发行动（前瞻性），但只有少数人用它来理解在临床观察到的与免疫原性相关的事件（回顾性）。计算分析可以与体外测定相结合，以支持早期阶段的候选选择（如Xue等人所示例）。还应注意，当前算法仅基于氨基酸序列设计和优化。现有的方法无法评估翻译后或化学修饰等非蛋白质元素的影响。 4.2.B细胞表位预测 与TCE类似，通过建立在各种算法基础上的一系列方法可以实现BCE预测。基于序列的平台，如BepiPred，审查氨基酸的化学和物理性质（包括疏水性、极性和灵活性等因素），以描绘目标抗原内潜在的线性表位。构象表位约占所有BCEs的90%，可以通过DiscoTope和ElliPro等方法预测，这些方法基于已知的抗体结合区域进行训练。深度学习工具的最新进展使高阶蛋白质结构的准确预测成为可能。在DiscoTope的最新版本（3.0）中，结构预测的强大功能被嵌入到之前建立的训练模型中，使得在没有解决结构的情况下对广泛的抗原进行基于结构的BCE预测成为可能。 最近发表了许多具有先进预测稳健性的增强计算方法，其中一些在性能上优于IEDB概述的方法。然而，它们在现实世界案例研究中的表现仍然不尽人意。Cia等人提出了一个独立且严谨的BCE预测方法的基准研究，并使用SARS-CoV-2刺突蛋白作为示例来评估这些方法的性能。由于用于模型训练的表征抗原-抗体共结构的数量不足，没有一种方法达到了期望的性能。此外，当前的结构收集在很大程度上偏向于病原体和药物靶标，这些并不很好地代表自然存在的抗原，特别是对于TPs。在Lin等人的工作中，他们试图去免疫原化VHH支架，Ellipro和BepiPred都未能区分多个VHH变体的免疫原性潜力。的确，鉴于对抗体-BCE相互作用的内在性质缺乏深入理解，大多数BCE预测平台提供的AUC低于0.6，与TCE分析相比远远不够理想。这些不理想的做法促使需要结合实验和计算方法来全面分析pBCEs。目前，药物开发者对BCE预测的价值尚无共识。此外，关于BCE的存在是否仅由蛋白质固有特性决定的问题仍然存在争议。换句话说，值得质疑的是，蛋白质的某些区域，特别是TPs，在BCE识别方面是否是免疫显性的。的确，在利用BCE预测信息进行决策时需要谨慎。 5.结论和未来展望  预计TP开发者将根据监管当局的指导对其TP产品的免疫原性风险因素进行评估。在所有风险因素中，已经意识到免疫原性概况，特别是TCE和BCE景观，在决定基于抗体的治疗药物的开发能力方面具有根本的重要性。在这篇综述中，我们介绍了一个表位驱动的免疫原性评估路线图，介绍了当前的实验和计算方法的集合，用于TCE和BCE鉴定，这个工具箱在基因组和蛋白质组分析的基础上不断扩展。由于每种研究工具都有独特的优势和局限性，我们在此在图3中展示了一个推荐的时间表，指示在药物开发生命周期中何时应用不同的免疫原性评估策略。 图3. 推荐的TPs免疫原性评估行动时间表。不同的计算和实验策略可以执行，以支持从早期发现到市场阶段的免疫原性调查。注意：由于缺乏确凿证据证明其在候选评估中的价值，计算BCE分析以虚线标示。 证据表明，药物开发从表位分析中受益，尤其是以TCE为重点的研究（实验和计算）。通过识别和去除TCE，可以构建具有降低免疫原性风险的先进治疗药物，正如我们讨论的许多例子所显示的。迄今为止，TCE表征已被认为是非临床和临床免疫原性评估的标准程序，因为：1) TCE在决定TPs的免疫原性倾向中起决定性作用，2) 方法更易获得且成熟，能够产生可靠的结果。另一方面，B细胞研究通常在开发的后期进行，因为ADA样本的可用性。尽管如此，BCE与药物学和毒理学结果的联系更紧密，因为它介导了TPs和ADAs之间的物理相互作用。因此，不应低估BCE表征在药物开发中的重要性和益处。总的来说，基于TCE去除的主动免疫原性降低策略自早期开发阶段以来已被成功使用，因为它们更容易识别、操作和验证。相比之下，BCE探测在实验和计算上似乎都更加复杂。BCE信息不直接指导药物优化，而更多地用于监测和表征临床中的免疫原性相关不良效应。尽管如此，目前在TP开发中缺乏共识的计算和体外免疫原性风险评估策略。每个评估中的计划都需要一个针对具体情况、基于风险的工作流程。 尽管上述常规实施的方法，创新平台的出现提供了替代策略，允许研究人员在早期阶段评估TPs的潜在免疫原性。利用微流控芯片系统上的类器官培养，Goyal等人通过共培养原代人血T和B淋巴细胞，重新组装了适应性免疫形成的关键器官——淋巴滤泡。利用这个系统，作者观察到在流感疫苗挑战后成功产生了抗体。然而，适应性免疫的整个过程很难通过体外组织培养来再现。鉴于基于动物的免疫原性研究的转化性差，这在很大程度上归因于不同的免疫库，人们已经努力开发HLA人源化或免疫重建的小鼠模型，以预测非临床阶段的免疫原性。研究表明，使用HLA转基因小鼠可以识别CD4 TCEs，但发现限于特定等位基因。另一方面，免疫重建的小鼠可以通过向免疫缺陷的小鼠注入来自个体供体的免疫细胞来模拟个性化的免疫反应，但需要现实世界的证据来证明这种模型的可行性和可靠性，导致赞助商面临投资回报的担忧。 总之，免疫原性研究领域在近几十年中经历了快速发展。创新技术不断被开发、验证和商业化，这些技术建立在对治疗诱导的免疫原性的先进理解基础上。根据风险因素、样本可及性、预算和时间表，开发者可能会考虑适当的策略来阐明治疗分子的免疫原性潜力，以创造安全有效的药物。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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