GITR x PD-1

一家研发投入（2024上半年14亿元）等同于信达生物的医药巨头，在2005年之后已经没有创新药获批上市了。 2005年太模糊，一代人都老去了。如果想起那年夏天万人空巷看超级女声决赛，记忆还会稍许激活。 2024H1，上海医药以1394亿元营收登顶A股医药之巅，对其考古发现，在新药研发上的失误是触目惊心的， 今年5月以来，上海医药连续终止12个新药研发项目，创下中国药企砍管线之最，近7亿元研发投入打水漂。再往前回溯，上海医药迄今仅有安柯瑞（重组人5型腺病毒）、凯力康（尤瑞克林）、培菲康（双歧杆菌三联活菌）3款创新药上市，上市时间分别为2005年、2005年、1995年。 近20年（2006年至2024年）累计研发投入超200亿元，却没有一款创新药获批上市，这是何其严重的低效和浪费。 海正药业、长春高新也有类似问题，医药国企是否有必要直接参与创新药竞争市场？依靠现金流优势和商业渠道优势，通过产业基地、产业投资基金、外部合作参与研发资源配置，是否更有效率？ 上海医药2020年财报披露的创新药管线，最终获批上市的有多少？ 01  砍了又砍 上一篇文章《两千亿大厂大砍管线》（2024年6月），表达过对从俄罗斯BIOCAD公司引进的PD-1单抗命运的担心，现在，大刀终于落下。 上海医药砍管线迄今共有3批。5月1日公告终止I010 (EGFR-TKI)、B002（HER2单抗）、B003（HER2 ADC）临床开发；6月8日公告终止B001（CD20单抗）、B001-A（CD20单抗）、I022（CDK4/6抑制剂）乳腺癌一线、I022-K （CDK4/6抑制剂）临床开发；10月1日公告终止5个新药研发项目。其中，最离谱的是B001-A（CD20单抗），2021年6月获批开展临床试验，之后未开展临床。 I020（MET抑制剂）：拟用于NSCLC治疗，2018年5月获批开展临床试验，目前处于I期临床试验结束阶段，累计研发投入4145.07万元。 B006（CD30单抗）：拟用于间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤的治疗，2018年7月获批开展临床试验，目前处于I期临床试验结束阶段，累计研发投入4422.53 万元。 B007（CD20单抗）：拟用于 B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗，2021年1月获批开展临床试验，目前处于I期临床试验结束阶段，累计研发投入5040.03万元。其他适应症的临床试验及后续开发仍正常进行中。 I008：由中药雷公藤主要活性成分雷公藤甲素通过提纯、加工、化学结构修饰改造而获得的专利化合物，拟用于类风湿关节炎的治疗，2019年5月获批开展进一步的探索性临床试验，目前处于II期临床试验结束阶段，累计研发投入6218.75万元。I008-A项目艾滋慢性异常免疫激活适应症的临床试验及后续开发仍正常进行中。 BCD-100（PD-1单抗）：拟用于宫颈癌的治疗，2021年2月获批在国内开展III期临床试验，目前处于 III 期临床试验收尾阶段，累计研发投入5900.80万元。NSCLC临床试验及后续开发仍在正常进行中。 如果上海医药这位国企老大哥有感情，对I008（雷腾舒）类风湿关节炎适应症开发终止，可能会满怀伤感吧，毕竟有15年的牵绊。2009年，上海医药首次强调研发与技术创新，自主研发新品数量位居国内医药行业领先水平，全年研发投入2.6亿元，把抗类风湿性关节炎原创药、国家1.1类化学药I008（雷腾舒）作为首批重磅推出，进入I期临床阶段，然后每有临床进展，都会在财报中披露，直到成为弃儿。 上海医药对CD20单抗有蜜汁执念，共开3条管线，自己把自己卷死。其中，B001、B007适应症均为B细胞非霍奇金淋巴瘤，前者于2016年8月获批开展临床试验，然后一直停止在I期临床阶段，估计失败但不甘心，又于2021年1月启动后者的临床试验，然后又失败了。这个靶点成药难度很大吗？迄今已有4款国产CD20靶点药物获批上市。 02  错了又错 上药老大哥竟然是国内BD鼻祖，早已开启Bigpharma与Biotech合作的先河。2011年2月，上海医药与复旦张江签订重大新药创制研发的战略合作协议，在未来6年内出资1.8亿元与复旦张江共同进行4个药物品种的研究开发和产业化全面合作，包括多替泊芬、重组高亲和力TNF受体、硫酸长春新碱脂质体（LVCR）和重组人淋巴毒素α衍生物（LT）。当时的自我评价“此次合作是上药研发转型的标志性举措，从原先以内部为主的研发组织转向开放的多渠道合作的研发模式”，放在现在也不过时。 但是这却翻出上海医药砍管线的旧账。2019年2月，上海医药终止与复旦张江合作研发的多替泊芬（累计投入5760.36万元）、重组人肿瘤坏死因子受体突变体-Fc融合蛋白注射液（累计投入6973.55万元）的临床试验。 轻车熟路。 上海医药自研的I001片（SPH3127，化学药品1类）是新一代口服非肽类小分子肾素抑制剂，针对高血压适应症的NDA上市申请根据CDE的要求于2024年4月重新提交资料后收到CDE受理通知并恢复审评，有望打破长期没有创新药上市的僵局。 但走通自研逻辑还有漫漫长路。 存量管线仍有被砍的可能。从俄罗斯引进3个生物类似药和3个创新生物药，其中创新生物药包括PD-1单抗已被砍掉，IL-17抗体产品、GITR抗体产品进度不明。 上海医药对细胞疗法也饶有兴趣，2020年已有3个项目处于临床前阶段，直到203年底仅有B019（靶向CD19和CD22的自体CAR-T）正式启动I期临床试验，累计投入研发费用约5905.17万元。前景如何，拭目以待。 2016年，47岁周军出任上海医药董事长，感叹“岁月静好的小时代结束了，沧海横流的大时代开始了”。研发投入从2015年6.18亿元，增至2020年19.72亿元，5年翻了三倍多。周军在2020年董事长致辞中充满激情：“创新，既是穿越时代的主旋律，也是引领每行乐句的最强音……预计到2021年底，我们的管线数量将进入3字头时代，并有多个项目进入临床III期。” 拼数量从来没有输过，在周军落马后，上海医药最新管线数量已进入5字头时代，2024H1研发投入14.04亿元，同比增长15.26%，占工业销售比重11.03%，临床申请获得受理及进入后续临床研究阶段的创新药管线50项（含美国临床II期3项）。 但周军拼数量的政绩观早已过时，我们都知道创新药应该立足于未满足的临床需求，差异化+国际化成为主流逻辑。 大面积砍管线，研发效率极低，这是浪费国有资源，也是对政府补贴的辜负。2011年上海医药承担的10个国家“重大新药创制”科技重大专项“十一五”计划第一、二批项目已完成技术验收，获得的国家新药创制专项产学研联盟基金、上药专项等市级科研基金到帐超过5500万元。 我们以前分析过，迄今没有任何一家国企搞创新药是成功的，国资药企的优势在于资源禀赋，包括商业流通、品牌中药，却不能很好解决创新药研发的效率、风险和激励问题。 上海医药作为医药基础设施运营商，掌控国家医药供应链的血脉，2017年成为中国最大的进口药品代理商，2018年拿下15个新药（包括K药、O药）进口总代资格，2023年引入进口总代品种29个，2024H1引入进口总代品种8个。上海医药拥有9个中药核心品牌中药板块，2023年收入98.17亿元，同比增长10.30%，生脉饮、胃复春、六神丸等品种销售收入平均增速超40%，2024H1收入51.92亿元，同比增长1.41%，而同期整个医药工业端都是下滑的。 上药生物医药产业基地作为上海生物医药创新孵化基地，在9月正式开业运营，成功吸引国家级生命健康研究院、国投产业投资母基金、上海生物医药基金等机构以及德国拜耳、循曜生物等十多家创新企业入驻。 做自己擅长的事。

▎药明康德内容团队编辑（来源：上海交通大学） 长期以来，人们通过手术、化疗、放疗和靶向药物等策略来治疗肿瘤，主要聚焦于肿瘤细胞的直接杀伤，不可避免地带来肿瘤耐药和治疗副作用等问题。近年来，通过免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体-T（CAR-T)细胞治疗等免疫疗法调动免疫系统，来识别和消除肿瘤细胞，展现出改变恶性肿瘤治疗格局的潜力。免疫治疗中的免疫检查激动剂通过增强免疫细胞的活性，激活免疫系统发挥抗肿瘤作用。目前，针对GITR、OX40和STING等通路的免疫激动剂正在临床试验阶段。而目前已有免疫激动剂存在免疫系统过度激活、不同患者个体化差异大、精准治疗药物开发难度高等问题，导致临床受益患者的比例仍然较低。代谢异常是肿瘤发生和发展的普遍且关键特征。目前，一些抗肿瘤代谢药物通过调控肿瘤异常代谢通路，能够一定程度抑制肿瘤生长。然而，现有代谢治疗药物存在体内半衰期短、脱靶效应明显和容易干扰正常细胞代谢等问题。 近日，上海交通大学变革性分子前沿科学中心凌代舜教授团队和上海交通大学医学院李方园教授团队合作，在Nature Nanotechnology发表题为“An artificial metabzyme for tumour-cell-specific metabolic therapy”的研究论文。该研究首次聚焦肿瘤广谱代谢标志物作为代谢免疫检查点，提出全新的肿瘤代谢激活免疫治疗策略。 团队创新合成了一种模拟黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidoreductase，XOR）中铁和四面体钼原子构象的FeMoO4生命体系催化剂，称为“人工代谢酶”。该人工代谢酶能够催化肿瘤细胞内黄嘌呤转化为尿酸；尿酸分子作为新的“定位和激活信号”，实现激活免疫系统的功能，诱导其附近的巨噬细胞向M1表型极化，使其特异性识别并吞噬肿瘤细胞，从而精准地实现肿瘤特异性的代谢激活免疫治疗（图1）。有趣的是，这种代谢调节促进了肿瘤细胞间代谢与免疫系统的相互作用，从而引发免疫细胞对肿瘤细胞的协同攻击。这是一种化学生物学驱动肿瘤细胞特异性代谢激活免疫治疗的范式创新。该人工代谢酶展示了在生命体系代谢画布上靶向改造肿瘤细胞的潜力，将肿瘤细胞自己定位为一个燃烧的“火花”来刺激免疫系统的定点激活。 ▲图1. FeMoO4人工代谢酶用于肿瘤细胞特异性代谢激活免疫治疗（图片来源：原始论文[1]） 为了仿生模拟XOR中Mo和Fe辅因子结构，作者发展了一种“溶蚀-吸附-锚定”单原子界面工程技术，基于MoO3-x基质实现Fe单原子可控掺杂，Fe原子掺杂比例可高达20.72 wt%。通过控制Fe原子掺杂过程中的晶格重构，作者成功构建了具备类XOR金属原子催化构象（Fe2+和四面体Mo4+活性中心）和催化活性（黄嘌呤、尿酸）的FeMoO4人工代谢酶（图2）。 ▲图2. FeMoO4人工代谢酶的设计与构建（图片来源：原始论文[1]） 作者通过透射电镜、元素分析、球差电镜和同步辐射等手段，证实了Fe以单原子形式均匀分布在FeMoO4人工代谢酶结构中。研究还发现，FeMoO4人工代谢酶中Fe和Mo元素价态分别为Fe2+/Fe3+和Mo4+/Mo5+/Mo6+；此外，Fe的掺杂显著提高了Fe-O-Mo的电子转移效率，为在生命体系高效催化肿瘤细胞代谢产物黄嘌呤奠定了理化结构基础（图3）。 ▲图3. FeMoO4人工代谢酶的理化性质分析（图片来源：原始论文[1]） 作者通过密度泛函理论（DFT）计算发现，FeMoO4人工代谢酶通过与氢氧根反应形成OH-Fe复合结构，该复合物有助于黄嘌呤的质子转移，从而降低反应能垒，提高尿酸的产生效率。此外，Fe原子掺杂引起的MoO3晶格重排，显著提高了FeMoO4人工代谢酶对黄嘌呤底物的吸附能力和表面电子活性，这在黄嘌呤转化为尿酸的催化过程中起到了关键作用（图4）。 ▲图4. XOR类酶催化活性机制研究（图片来源：原始论文[1]） 作者在细胞和动物层面探究了FeMoO4人工代谢酶的代谢调控性能。FeMoO4人工代谢酶在入胞后不会直接杀伤肿瘤细胞，仅仅是将肿瘤细胞内黄嘌呤催化为尿酸。而尿酸分子作为“定位和激活信号”诱导邻近的巨噬细胞向M1表型极化，并激活NLRP3/IL-1通路，从而使巨噬细胞能够识别并吞噬“被定位”的肿瘤细胞。作者进一步构建了B16F10荷瘤小鼠模型，并发现肿瘤组织中黄嘌呤含量显著高于正常组织，这为FeMoO4人工代谢酶的肿瘤选择性代谢调控奠定了生物学基础。通过空间代谢组学等技术，作者证实了经静脉注射FeMoO4人工代谢酶后，肿瘤组织中尿酸水平显著升高，且这一变化与FeMoO4人工代谢酶在肿瘤组织中的时空分布高度一致（图5）。 ▲图5. FeMoO4人工代谢酶活体代谢调控研究（图片来源：原始论文[1]） 更令人振奋的是，FeMoO4人工代谢酶能够有效抑制B16F10肿瘤的生长。通过流式细胞术和质谱流式分析等技术，作者发现FeMoO4人工代谢酶显著提高了肿瘤组织中M1型巨噬细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和成熟树突状细胞（DCs）的比例，同时上调了IL-1、TNF-和IL-12等促炎细胞因子的水平。根据上述结果，作者得出结论：尿酸分子作为“定位和激活信号”介导肿瘤细胞与免疫细胞的之间的相互作用：1）尿酸诱导邻近的巨噬细胞向M1表型极化，并激活NLRP3/IL-1通路，从而使巨噬细胞能够识别并吞噬“被定位”的肿瘤细胞；2）尿酸和促炎细胞因子IL-1能够增强DCs和T细胞等免疫细胞活性，从而特异性激发抗肿瘤免疫应答。此外，FeMoO4人工代谢酶与PD-1单抗联用能够更有效地抑制肿瘤生长，并延长小鼠的生存期（图6）。 ▲图6. FeMoO4人工代谢酶介导肿瘤特异性代谢激活免疫治疗（图片来源：原始论文[1]） 这项研究聚焦天然代谢酶人工模拟和肿瘤-免疫细胞互作调控，合成特定调控代谢通路和代谢产物的人工代谢酶，提出一种新型代谢免疫检查激动策略，为代谢异常相关重大疾病（包括肿瘤、心血管疾病、痛风、糖尿病等）提供基于人工代谢酶的全新代谢免疫调控策略，开创化学生物学驱动的精准代谢治疗新范式。 该工作得到了上海交通大学樊春海院士的建议和帮助，后继将依托上海交通大学转化医学国家科学中心平台，进行成果的临床转化研究。研究得到了国家重点研发计划、国家万人计划科技创新领军人才计划、国家自然科学基金、上海市"科技创新行动计划"系列项目的共同资助和支持。 原始论文： [1] Hu, X., Zhang, B., Zhang, M. et al. An artificial metabzyme for tumour-cell-specific metabolic therapy. Nat. Nanotechnol. (2024). https://doi.org/10.1038/s41565-024-01733-y

CD137，又名4-1BB，是一类T细胞共刺激受体，属于肿瘤坏死因子受体超家族（Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily，TNFRSF）。CD137激动性抗体已被证实可以通过激活T细胞来达到抗肿瘤的作用。目前尚无CD137小分子/抗体激动剂药物被批准上市。2024年8月23日，中国科学院上海有机化学研究所丁克研究员和暨南大学陈良教授联合在Science子刊Science Advances杂志在线发表题为“Human/mouse CD137 agonist, JNU-0921, effectively shrinks tumors through enhancing the cytotoxicity of CD8+ T cells in cis and in trans”的研究性文章，共同报道了首个CD137小分子激动剂JNU-0921的开发及其在肿瘤免疫治疗中的机制研究。 CD137 免疫检查点疗法在肿瘤免疫治疗领域中使很多癌症患者大大受益，显著缓解患者病症、延长患者生存期。该法的原理是相当于“刹车”的作用，消除癌细胞对T细胞的抑制作用，激活T细胞的效应能力。根据免疫检查点的作用机制可以分为抑制性免疫检查点和共刺激性免疫检查点：前者包括PD-1、CTLA-4、LAG3、TIGIT、BTLA、TIM-3和CEACAM1等，后者包括CD137（4-1BB）、OX40、CD27、CD28、CD40L、ICOS、GITR和LIGHT等。 图1  T细胞表达的共刺激/抑制受体及其配体相互作用的示意图（图源自Immune Network, 2020） 目前，共刺激受体的激动性药物研究正成为炙手可热的研发方向之一。其中，明星分子4-1BB作为一种强大的T细胞共刺激受体备受瞩目：4-1BB信号的激活能增强NK细胞抗体依赖性的细胞毒性功能；增强效应T细胞的细胞毒性功能，促进其分化和记忆能力，上调细胞炎症因子的分泌，保护其不被凋亡，将Treg重编程为具有抗肿瘤活性的细胞毒性CD4+ T细胞并提高机体的抗肿瘤能力。因此对4-1BB这一重要靶标的生理功能以及激动剂药物进行探究是非常有必要的。4-1BB根据白细胞分化抗原簇的命名又被称之为CD137。 CD137的天然结合配体是4-1BBL，又称作CD137L，在人体中位于19p13.3染色体，是一个II型跨膜蛋白，主要表达在DC细胞、B细胞和巨噬细胞等抗原呈递细胞上，并随着这些细胞的激活而进一步上调。与CD137一样，CD137L可以在非造血细胞中表达，例如内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞。CD137L也可在造血干细胞、中性粒细胞和成纤维细胞上被检测到。 多款CD137单克隆抗体已进入临床研究。其中，Bristol-Myers Squibb公司的Urelumab（BMS-663513, IgG4）和Pfizer公司的Utomilumab（PF-05082566, IgG2）进展最快，均处于临床II期。临床结果发现，Urelumab具有剂量依赖的肝毒性和引起疲劳等副作用，而Utomilumab虽安全性提高，但疗效有限。 研究成果 1.     CD137小分子激动剂的先导化合物筛选和分子优化 NFAT作为免疫应答中诱导基因转录的一类重要的转录因子参与细胞功能调节，并作为关键调节点参与细胞中多条信号传导通路的调节。为了进行小分子化合物的筛选，作者首先建立了一个稳定的Jurkat克隆（人T细胞系）细胞Jurkat-CD137-NFAT-luciferase（即JC-luc），包含过表达的hCD137以及一个由NFAT结合元件控制的荧光素酶基因组成的转基因，从而刺激hCD137导致荧光素酶表达 (图2A)。并通过CRISPR/Cas9敲除Jurkat-NFAT-luciferase中的hCD137基因获得J-luc-sgCD137。用激动性抗CD137抗体 (aCD137) 处理JC-luc细胞可以诱导强大的荧光素酶活性，但在J-luc-sgCD137细胞中没有出现。因此，JC-luc细胞是评估潜在CD137小分子激动剂的理想选择。 图2小分子化合物筛选系统原理图及筛选结果 随后，作者对已上市小分子药物库进行了筛选。结果发现，Ataluren (AT，图2B) 在JC-luc细胞中以剂量和时间依赖的方式诱导了强大的荧光素酶活性。然而，在功能验证性实验中，与DMSO相比，aCD137能够显著提高WT小鼠CD4+、CD8+ T的分裂增殖能力（图3A-C）、促进原代T细胞的激活（图3D-G）以及上调IL-2、IFNG和Perforin的产生和分泌（图3H-M），而AT对CD4+和CD8+ T细胞均没有活化作用。 图3 AT未能活化小鼠脾脏原代T细胞 综上所述，AT是一种弱效、低特异性的CD137激动剂：尽管它能够激发CD137信号，但只能在JC-luc细胞中CD137高表达的情况下才会发生。因此，为了筛选出高效且特异性更高的CD137小分子激动剂，作者对AT的化学结构进行了系统的结构优化。 AT的化学结构由三个芳环串联而成，作者采用生物电子等排及骨架跃迁等经典药物设计策略，分别对三个环的类型及其取代基进行了系统的结构优化，设计并合成一系列小分子化合物，并通过JC-luc细胞实验验证改构后的化合物对细胞中luciferase活力的影响（图4C-4F）。结果表明，当1,2,4-噁二唑3-位为间位羧基取代的苯基时，活性最佳；当5-位为萘基时，化合物2-25处理后的luciferase活力值最高，相对荧光值达2.23，EC50值最低（64 nM）；噁二唑的改造对活性不利。因此，后续对2-25（即JNU-0921）的生物学功能进行了探索。 特异性实验：与DMSO相比，anti-huCD137和JNU-0921均能显著促进JC-luc细胞中luciferase活力，而在J-luc、J-luc-sgCD137细胞中均没有促进作用（图4G）。这提示我们，JNU-0921靶向CD137的特异性高，没有脱靶活性。同时，通过RT-qPCR实验发现JNU-0921能够显著促进JC-luc细胞中IFNG和GZMB的转录水平（图4H）。 小鼠原代细胞增殖、激活和细胞因子分泌实验：与DMSO相比，JNU-0921和aCD137均能够显著提高WT小鼠CD4+、CD8+ T的分裂增殖能力（图4I-J）、促进原代T细胞的激活（图4K-N）以及上调IL-2、IFNγ的产生和分泌（图4O-R）。而相比之下，在KO小鼠中并没有观察到这些实验现象。这说明，JNU-0921是以CD137依赖的方式促进T细胞的活化。 以上结果表明，JNU-0921是一种有效的特异性激动剂，能够激活人和小鼠CD137。 图4 2.     JNU-0921通过直接与CD137的胞外结构域结合激活CD137信号 确认了JNU-0921对CD137的特异性激活作用后，作者进一步探究了JNU-0921具体是如何激活CD137信号通路的。 三聚体CD137Ls结合并引起CD137的三聚化，然后招募TNFR相关因子(TRAF) 并引发下游NF-κB和MAPK信号传导。为了确定JNU-0921具体是影响了CD137信号通路中的哪个环节，作者首先考察JNU-0921是否影响CD137的寡聚化。根据荧光素酶互补实验原理构建了两个质粒，分别是pCDH-CD137-Nluc和pCDH-CD137-Cluc，当两个质粒在细胞中共表达后，如果CD137分子之间发生多聚化，则Nluc和Cluc相互靠近并正确配位，从而产生荧光素酶活性。实验发现，在Jurkat细胞中JNU-0921能够以时间和剂量依赖的方式显著增强荧光素酶活力（图5A-B）。根据激光共聚焦实验原理，进一步构建了pCDH-CD137-GFP和pCDH-CD137-mCherry两个质粒，当两个质粒在293T细胞中共表达后，如果CD137分子之间发生多聚化，则GFP和mCherry靠近或重叠，并显示出强烈的共定位信号。实验发现，JNU-0921能够显著增强CD137-GFP和CD137-mCherry的共定位（图5C-D）。同时，根据CO-IP实验原理，进一步构建了pCDH-CD137-Nluc-3xFlag和pCDH-CD137-Cluc-Myc两个质粒，当两个质粒在293T细胞中共表达后，如果CD137分子之间发生多聚化，那么通过IP拉下来的蛋白会增多（Flag拉Myc显）。实验发现，JNU-0921能够增强CD137-Flag共免疫沉淀CD137-Myc的能力（图5E）。这些结果说明，JNU-0921能够结合并促进CD137寡聚化。 那么，JNU-0921是如何直接与CD137发生相互作用的呢？作者分别构建了hCD137胞内段/胞外段的293T-Luc细胞（CD137-IN、CD137-EXtra），在过表达胞外段蛋白的293T细胞中的荧光素酶互补实验结果显示，JNU-0921能够以剂量依赖的方式显著增强荧光素酶活力（图5F）。而相比之下，JNU-0921对过表达胞内段蛋白的293T细胞中荧光素酶活力的增强程度要小的多。同时，激光共聚焦实验结果显示，JNU-0921能够显著促进CD137-Extra-TM-GFP和CD137-Extra-TM-mCherry的共定位（图5G-H）。另外，免疫共沉淀实验结果显示，JNU-0921能够明显促进CD137-Extra-TM-Nluc-Flag免疫共沉淀CD137-Extra-TM-mCherry-Myc的能力（图5I）。而相比之下，CD137-Intra-TM-GFP-Flag却未能免疫沉淀CD137-Intra-TM-mCherry-Myc。热漂移实验发现，与对照相比，在50℃-72℃范围内JNU-0921能够结合并稳定CD137胞外蛋白，使其相对不容易因高温而变性析出（图5J-K）。以上结果说明，JNU-0921通过结合CD137蛋白的胞外段从而促进CD137寡聚化。 接下来，作者将JNU-0921与CD137全长分子进行了分子模拟对接研究。对接结果显示，JNU-0921嵌合在CD137胞外段形成的一个凹槽中。JNU-0921的羧基与K69侧链、C68位主链之间形成氢键相互作用（图5L）。进一步地，作者通过定点突变的方式对关键氨基酸进行单点突变，将69位赖氨酸突变成精氨酸（Arg，R），将68位半胱氨酸突变成丝氨酸（Ser，S）。热漂移实验显示，JNU-0921并不能结合和稳定CD137-K69R蛋白，而仍然能够结合和稳定CD137-C68S蛋白（图5M-O）。同时，荧光素酶互补实验分析显示，JNU-0921对CD137-WT蛋白和CD137-C68S蛋白多聚化的影响程度相当，而对CD137-K69R的多聚化作用显著减弱。这些数据表明，在JNU-0921与CD137胞外段发生相互作用的过程中，K69与JNU-0921之间的氢键相互作用发挥了主要作用。 综上所述，JNU-0921通过与CD137胞外段的K69侧链基团发生氢键相互作用而促进CD137多聚化，而与C68位点主链之间的相互作用的存在与否对JNU-0921结合CD137胞外段的影响并不显著。 图5 3.     JNU-0921有效激活CD137的信号传导 CD137三聚化后招募下游TRAFs多聚体，包括TRAF1：(TRAF2)2、(TRAF2)3和TRAF3：(TRAF2)2，并激活ERK、MAPK和NF-κB信号通路。因此，作者首先探究CD137在对JNU-0921刺激的反应中招募了哪些TRAFs复合体。借助CRISPR/Cas9技术，构建了同时敲除了TRAF1、TRAF2和TARF3的293T细胞系。荧光素酶互补实验分析显示，JNU-0921能够以剂量依赖的方式显著促进TRAF3-Nluc和TRAF2-Cluc的多聚化，相比之下对TRAF1-Nluc和TRAF2-Cluc、TRAF2-Nluc和TRAF2-Cluc多聚化的影响程度要小的多（图6A）。激光共聚焦实验显示，JNU-0921能够显著增强TRAF3-GFP和TRAF2-mCherry的共定位信号（图6B-C）。免疫共沉淀实验分析显示，JNU-0921能够增强TRAF2-Flag免疫共沉淀TRAF3-Myc的能力。而相比之下，JNU-0921均不能增强TRAF1与TRAF2或TRAF2与TRAF2的相互作用（图6D）。这些实验结果说明，JNU-0921促进CD137寡聚化之后招募了下游的TRAF3：(TRAF2)2复合体。 P65和IκB是NF-κB信号通路中的成员，二者磷酸化增强程度能够反应出该信号通路的激活程度。WB实验显示，JNU-0921能够以剂量依赖的方式明显增强Jurkat细胞中P65和IκB的磷酸化水平（图6E）。同样，在WT小鼠激活的脾脏原代细胞中也发现，JNU-0921和aCD137均能够明显促进IκB的磷酸化水平，且是剂量依赖的。而相比之下，在CD137KO小鼠的原代细胞中并没有观察到这一趋势（图6F）。此外，RT-qPCR实验分析显示，JNU-0921和aCD137均能显著提高WT小鼠中NF-κB信号通路下游靶基因如BCL-XL、BCL-2、BFL-1和Survivin等抗凋亡因子的转录水平，而在CD137KO小鼠中则没有发现促进作用（图6G-J）。小鼠原代细胞中的实验数据进一步证明，JNU-0921是特异性靶向CD137而发挥作用的。因此，JNU-0921能够通过CD137激活NF-κB信号通路。 图6 综上表明，JNU-0921结合CD137后招募TRAF3：（TRAF2）2复合体，进而激活NF-κB信号通路并上调抗凋亡因子的表达。 4.     JNU-0921通过激活T细胞免疫从而抑制肿瘤生长 MC38是一种源于小鼠结肠癌的非免疫原性肿瘤，因其具有独特的生物学特征如免疫逃避、生长速度快、易于操控等特点而被广泛应用于肿瘤免疫治疗、药物筛选等各个方面。Rag1（Recombination activating gene 1）是参与免疫球蛋白VDJ重组的RAG复合物成分。Rag1纯合敲除（Rag1-/-）小鼠体内缺乏成熟的T细胞和B细胞，NK细胞比例略有增加。作者通过在WT和Rag1-/-小鼠皮下种植MC38移植瘤模型来探究JNU-0921在体内治疗肿瘤的能力。结果显示，JNU-0921在WT小鼠中显著抑制了MC38肿瘤的生长，而在Rag1-/-免疫缺陷小鼠中则没有抑制作用（图7A-C）。流式细胞术检测分析发现，JNU-0921治疗之后WT小鼠肿瘤中浸润的CD8+ T细胞比例显著增加（图7D）。因此，JNU-0921可能是通过激活CD8+ T细胞免疫功能而促进抗肿瘤作用。 随后，作者利用WT小鼠EG7移植瘤模型进行实验验证。将EG7种植至小鼠皮下，3天后待肿瘤成型再回输OT1 CTLs，再用JNU-0921治疗两周。实验结果显示，JNU-0921能够显著促进CTLs去杀伤EG7，抑制肿瘤生长，显示出显著的抗肿瘤作用（图7E-H）。为了探究JNU-0921治疗对肿瘤微环境中T淋巴细胞免疫功能的影响，流式检测和分析发现JNU-0921的治疗能够显著上调肿瘤浸润CD8+ T细胞中IL-2、IFNγ和GZMB的表达，提高CD8+中央记忆T细胞的比例，并且抑制TIM-3、PD-1和CTLA-4等耗竭marker的表达（图7I-O）。这提示JNU-0921能够在体内激活CD8+ T细胞、促进其记忆形成并抑制其耗竭。同时，流式分析还发现，JNU-0921的处理能促进肿瘤浸润CD4+ T细胞中IL-2和GZMB的表达，提高CD4+中央记忆T细胞的比例，并且抑制TIM-3和PD-1的表达（图7P-R）。此外，JNU-0921治疗还降低了肿瘤结节中Treg细胞的绝对数量。 综上所述，JNU-0921通过激活T细胞免疫而有效缩小肿瘤。 图7 5.     JNU-0921增强CTL的效应和记忆功能 进一步探究JNU-0921在抗肿瘤过程中对免疫系统产生的具体影响，首先，作者在小鼠原代细胞实验上探究JNU-0921对CD8+ T细胞效应功能的影响。将WT B6小鼠和CD137KO小鼠脱颈处死，取脾研磨获得原代细胞，用Recombinant Human IL-2、2-ME、anti-moCD3、anti-moCD28刺激后，加入药物处理。实验发现，JNU-0921能够显著增强WT小鼠CD8+ T细胞的分裂增殖能力（图8A-B）并促进T细胞激活，上调CD25和CD69的表达（图8C-D），而在CD137KO小鼠中则没有增强作用。 在免疫系统抗肿瘤的过程中发挥杀伤作用的主要是肿瘤浸润细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。因此，作者进行细胞杀伤实验以验证JNU-0921能否促进杀伤作用。首先构建P815-aCD3模型：向小鼠肥大细胞瘤细胞P815上过表达anti-mouse CD3 scFv，那么T细胞可以不依赖MHC呈递抗原的方式识别靶细胞P815-aCD3。杀伤实验结果显示，JNU-0921和aCD137均能显著促进WT小鼠CD8+ T细胞的杀伤作用（图8E-F），而在CD137KO小鼠中则没有增强作用。CD8+ T细胞在杀伤肿瘤细胞时会产生和分泌细胞效应因子，而细胞因子分泌实验也显示出JNU-0921处理以后能够显著促进WT小鼠CD8+ T细胞IFNγ、Perforin的表达（图8G-H）。 综上所述，JNU-0921增强CD8+T细胞的效应功能。 图8 OT1小鼠被广泛应用于多肽在CD8+ T细胞对抗原的阳性选择和应答中的作用，是用于体内研究CD8+ T细胞生物学的理想材料。OT1小鼠的脾脏原代细胞在体外用OVA257-264抗原肽进行刺激2-3天后，流式检测会发现CD8+ T细胞比例占95%及以上。因此，作者采用OT1小鼠去更有针对性地探究JNU-0921对CD8+ T细胞效应功能的影响。 细胞分裂和激活实验分析显示，与上述WT小鼠中观察到的结果一致，JNU-0921显著增强了OT1 CD8+ T细胞的分裂能力（图9I-J）并促进T细胞的激活（图9K-L），而在OT1/CD137KO小鼠中则没有增强作用。杀伤实验结果表明，JNU-0921显著增强了OT1 CD8+ T细胞的杀伤能力（图9M-N）。与杀伤作用增强对应的，JNU-0921显著提高了CD8+ T细胞IFNγ、Perforin的表达水平（图9O-P），而在OT1/CD137KO小鼠中则没有增强作用。 图9 随后，作者考察了JNU-0921对记忆性CD8+ T细胞分化的影响。采用EG7反复刺激OT1 CTL生成CD8+记忆T细胞 (图10A)。FACS数据显示，JNU-0921可诱导OT1初始CD8+ T细胞分化成CD44+CD62L+细胞 (图10B-C)，同时下调包括PD-1、CTLA-4和TIM-3在内的耗竭标志物的表达 (图10D-F)。RT-qPCR分析显示，JNU-0921处理增加了抗凋亡因子的转录水平，包括BCL-XL、BCL-2、BFL-1和Survivin (图10G-J)。 图10 此外，为了明确阐明JNU-0921对体内记忆细胞分化的影响，作者采用表达卵白蛋白 (LM-OVA) 的单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 感染CD45.1 C57BL/6J小鼠，然后在第二天通过尾静脉注射转移CD45.2 OT1 CTL。按照早期方案，在JNU-0921治疗45天后，分析脾脏和血液中中央记忆T细胞的比例 (图11A)。FACS分析显示，JNU-0921处理增加了脾脏和血液中中央记忆细胞的比例(图11B-D)。 综上所述，JNU-0921能够促进初始CD8+ T细胞向中央记忆T细胞分化并增强其效应功能。 图11 6.     JNU-0921通过增强Th1的辅助功能和抑制Treg活性来增强CTL在trans中的功能 图7数据可知，在JNU-0921治疗的小鼠中，肿瘤浸润的CD4+ T细胞表现出更高的效应和记忆功能，这表明CD4+ T细胞可能参与了JNU-0921的肿瘤缩小作用。事实上，作者也验证了CD4+ T细胞的耗竭会降低JNU-0921的治疗效果，正如CD8+ T细胞的耗竭一样 (图12A-C)。为了研究JNU-0921对CD4+ T细胞极化的影响，作者将JNU-0921作用于Th1和Th2极化条件下培养的CD4+ T细胞。有趣的是，JNU-0921促进Th1极化，抑制Th2分化 (图12D-G)，与前期报道一致。此外，JNU-0921可促进CD4+ T细胞的增殖和活化 (图12H-J)；而在CD137KO小鼠中则没有观察到这些实验现象。这表明，JNU-0921能够促进初始CD4+ T细胞向有利于细胞免疫的方向极化。 为了探索JNU-0921通过增强Th1功能促进CTLs功能的可能性，作者分离CD4+细胞并使其在体外向Th1极化。然后将这些Th1细胞分别以1:1的比例与CFSE标记的WT或CD137KO背景的OT-1 CTL混合。FACS分析显示，Th1能有效促进CTL增殖 (图12K-L)。在此基础上，JNU-0921和aCD137的处理能够进一步显著促进OT1小鼠CD8+ T细胞的增殖，而在OT1/CD137KO小鼠中则没有促进作用 (图12K-L)，无可置疑地表明JNU-0921通过促进Th1的辅助功能来增强CTL的功能。 图12 随后的Treg极化实验发现，JNU-0921和aCD137能够显著下调Treg（CD4+CD25+FOXP3+）的比例及其典型生物标志物CTLA-4和ICOS的表达，说明初始CD4+ T细胞向Treg方向的极化被抑制（图13M-R）。为验证JNU-0921在减弱Treg抑制功能的作用，作者根据Miltenyi Biotec的CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit分选了CD4+CD25-效应性T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞，分别与OT1或OT1/CD137KO脾脏原代细胞以1:1比例进行共孵育，并加入JNU-0921进行处理后流式检测CD8+ T细胞的分裂情况。流式分析显示，CD4+CD25+细胞能够显著抑制T细胞的增殖，这证明了实验体系的有效性。在此基础上，JNU-0921和aCD137的加入能够显著促进OT1 CD8+ T的分裂，而在OT1/CD137KO小鼠中没有促进作用（图13S-T）。实验结果说明，JNU-0921能够逆转Treg对效应CD8+ T细胞增殖的抑制作用。 综上所述，JNU-0921能够诱导初始CD4+ T细胞向有利于抗肿瘤免疫的方向极化，增强Th1促进CD8+ T细胞功能的能力，并逆转Treg对CD8+ T细胞的抑制作用。 图13 小结 激动型CD137抗体的应用受限于严重的肝毒性（Urelumab）和弱效性（Utomilumab）。与抗体相比，小分子激动剂具有更好的药代动力学特性和组织渗透性，且对人类的抗原性较低，更适用于临床治疗，并可能降低治疗成本和不良反应的发生率。鉴于CD137共刺激信号在免疫系统中的重要作用及其抗肿瘤活性，本文开展了CD137的小分子激动剂的开发工作。首先，通过构建针对CD137信号轴的高通量小分子药物筛选系统，成功筛选到小分子先导化合物AT，并通过结构优化获得了一个没有脱靶活性且依赖CD137共刺激信号激活T细胞的化合物JNU-0921。JNU-0921通过CD137激活NF-κB信号通路，有效增强CD4+和CD8+ T细胞的效应和记忆功能，增强Th1辅助功能，削弱Tregs的抑制作用，从而发挥显著的抗肿瘤作用。根据目前文献报道，JNU-0921是首个CD137小分子激动剂，具有显著抗肿瘤活性及低毒性。 本文的通讯作者分别为暨南大学陈良教授、中国科学院上海有机化学研究所丁克研究员和暨南大学周倩副研究员，共同第一作者分别为刘鹭（PhD，暨南大学）、陈峰华（MD，暨南大学）、李姗（PhD，中国科学院杭州医学研究所）和杨童（PhD candidate，暨南大学）。 原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adp8647 撰稿：李姗陈峰华 核对：刘鹭 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓