PRAME x CD3

TIS2024第四届自免疾病细胞疗法与干细胞疗法论坛重磅来袭，点击图片查看重磅嘉宾，合作详询：王晨 180 1628 8769 （扫码立即报名获取TIS2024免费票） 肿瘤免疫治疗群雄并起，TCR疗法在实体肿瘤治疗中展现出了巨大潜力。随着TCR蛋白药Kimmtrak (tebentafusp)和TCR-T细胞药Tecelra (Afami-cel)的陆续上市，TCR疗法终于全面进入商业化阶段，开启肿瘤免疫治疗新篇章。 ——维渡纵横 作    者  |  郭维；郭允乐 来    源  |  维渡纵横 微    信  |  Yunle_G 刊    号  |  Vol.116 目   录 [向上滑动阅览]              1. TCR功能结构和工程化              2. TCR抗原筛选技术简介              3. TCR疗法的靶点分布情况              4. TCR疗法的药物形态分类              5. TCR疗法的临床研究进展              6. TCR疗法的生产工艺研究              7. TCR疗法的的产业链分析              8. TCR疗法的市场和商业化              9. TCR疗法的资本市场表现              10. 总结与展望 TCR疗法起源于1986年，巴塞尔免疫研究所Michael Steinmetz博士首次将一个T细胞的TCR基因转移到另一个T细胞中，从而赋予第二个T细胞相同的抗原特异性。2002年，Rosenberg团队率先从黑色素瘤组织中分离出肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocyte，TIL），体外扩增回输后特异性杀伤黑色素瘤细胞，但由于TIL的提取扩增工艺等难点，科学家开始探究能否在正常外周血淋巴细胞（Peripheral blood lymphocyte，PBL）上导入已知的抗原特异性TCR基因进行治疗。2004年，Rosenberg团队首次将靶向MART-1的自体TCR-T进行回输，参与试验的17名患者中有2人出现了肿瘤缩小，证明了基因改造TCR用于肿瘤治疗的可行性(Science 2006, 314, 126)，拉开了TCR疗法的帷幕[盘点TCR-T细胞疗法, 维渡纵横, 2021]。 TCR疗法已经演变成基于peptide-MHC（pMHC）识别为主的“TCR-T细胞疗法”、“TCR蛋白药”、“TCR类抗体药”三种疗法，其中，TCR-T细胞疗法领域于2024年8月1日获批一款上市，TCR蛋白药领域于2022年1月27日获批一款上市。 Vol.1 TCR的结构和工程化   TCR是T细胞表面的特异性受体，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物，通过识别并结合MHC呈递的抗原，从而激活T细胞，促进T细胞的分裂与分化。MHC（Major Histocompatibility Complex，MHC）即主要组织相容性复合体，是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称，人类的MHC被称为HLA，可将细胞内蛋白分解后的片段呈现在细胞表面，TCR通过与MHC相结合来判断靶细胞是否正常，如果T细胞发现MHC呈现出的蛋白片段是变异的，就会杀死该靶细胞。 1.1 TCR功能和信号转导 TCR是T细胞表面的特异性受体，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR的作用是识别抗原，是T细胞表面的特征性标志。TCR基因重排能够形成约10E18种TCR序列，形成容量庞大的TCR库，赋予个体几乎是无限的抗原识别和应答能力，保证个体在多变环境中能和外来抗原(病原体)发生有效的免疫应答。在不同个体中同一TCR能够识别相同pMHC，为TCR的通用性奠定了基础。 为了提供宿主保护，免疫系统将病原体和肿瘤等转化为短肽(抗原肽，最多24个残基)，与主要组织相容性复合体(MHC)结合形成“抗原肽-MHC分子复合物”(肽负载MHC ，pMHC)，呈递给T细胞受体（TCR）特异性识别，激活T细胞增殖并引发特定的细胞免疫应答。（注:人类的MHC被称为HLA，对应抗原肽-HLA分子复合物为pHLA） 图1. TCR-CD3与pMHC复合物 小贴士 MHC        主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。人类的MHC被称为HLA (Human Leukocyte Antigen，HLA)， 即人白细胞抗原，位于人6号染色体短臂上。小鼠MHC被称为H-2，位于小鼠17号染色体上。MHC分为MHC I、MHC Ⅱ、MHC Ⅲ三类。       MHCⅠ位于一般细胞表面上，提供一般细胞内部的特殊状况。比如该细胞遭受病毒感染，则将病毒外膜碎片之氨基酸链透过MHC提示在细胞外侧，可以供CD8+ T细胞等辨识以进行杀伤。       MHC Ⅱ大多位于抗原呈递细胞(APC)上，如巨噬细胞、DC等，提供细胞外部的状况，如组织中有细菌侵入，则巨噬细胞进行吞噬后，把细菌碎片利用MHC提供给辅助T细胞，启动免疫反应。        MHC Ⅲ 主要编码补体成分、肿瘤坏死因子(TNF)、热休克蛋白70(HSP70)、21羟化酶基因(CYP21A、CYP21B)等。         HLA是人类多态性最丰富的遗传系统，位于第6号染色体短臂6P21.31区，长3600kb。1999年已完成全部序列分析及基因定位，在此区域内共确认了224个基因座位，其中128个为功能性基因，其中39.8%和免疫功能相关。HLA基因根据其编码分子的分布与功能不同分为3个区，即Ⅰ类基因区，Ⅱ类基因区，Ⅲ类基因区。 TCR激活可促进许多信号转导级联反应，通过调控细胞因子产物、细胞生存、增殖和分化来最终决定细胞命运。 图2. TCR的激活过程 TCR激活的早期事件是由淋巴细胞蛋白质酪氨酸激酶 (Lck)对TCR-CD3复合体胞质一侧的免疫受体酪氨酸依赖性活化基序 (ITAMs) 的磷酸化作用。CD45受体的酪氨酸磷酸酶可调节Lck和其他Src家族酪氨酸激酶的磷酸化和激活。Zeta链相关蛋白激酶(Zap-70)受到招募，聚集至TCR-CD3复合体处并激活，从而启动对下游接头蛋白或骨架蛋白的招募和磷酸化。SLP-76被Zap-70磷酸化后促进招募Vav(一种鸟苷酸交换因子)、接头蛋白NCK和GADS以及一种可诱导T细胞激酶 (Itk)。磷脂酶Cγ1 (PLCγ1) 被Itk磷酸化后导致磷脂酰肌醇-4,5 二磷酸 (PIP2) 的水解，产生第二信使甘油二酯(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。DAG激活PKCθ和MAPK/Erk 通路，二者均可促进转录因子NF-κB活性。IP3触发Ca2+从ER释放, 并促使细胞外 Ca2+通过钙离子释放活化Ca2+ (CRAC)通道进入细胞。钙离子结合的钙调蛋白 (Ca2+/CaM) 激活钙调磷酸酶，后者通过转录因子NFAT促进IL-2的基因转录。取决于细胞类型和环境，这些通路中某些位点的反馈调节可得到不同结果。来自其他的细胞表面受体(如 CD28 或 LFA-1)信号的参与会进一步调控细胞反应。 图3. TCR信号转导 1.2 TCR的结构组成 根据TCR组分的不同，T细胞可被分为αβT细胞、γδT细胞 (1-5%外周血T细胞和粘膜部位的T细胞)，αβTCR和γδTCR虽然相似，但也有诸多不同。目前研究较多的是αβT细胞。 TCR分为可变区(V)和恒定区(C)，V区包括具有抗原结合位点的膜远端免疫球蛋白样结构域；C区是一个完整的基因片段，包括膜-近端免疫球蛋白样结构域、连接肽(CP)、跨膜区(TM)区、细胞质尾部 [J Leukoc Biol. 2020, 107(6):1045-1055]。TCRαβ和TCRγδ的V区表现出相似的总体结构，但C区却有很大差异。 αβTCR由α链和β链 (TCRαβ) 组成。α链和β链是跨膜糖蛋白，通过二硫键连接形成了抗原结合异二聚体 (图3, 蓝色)，即TCR；TCRαβ分为可变区(V)和恒定区(C)，V区中CDR(互补决定区)形成抗原结合位点，可进一步分为CDR1、CDR2、CDR3。TCR识别抗原的信号主要通过TCR-CD3复合体 (CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ，图3灰色) 转导，与CD3通信的β链中的FG环(FG Loop)显示为紫色。图3还标出了CD3糖基化模式和细胞内基序，如基于免疫受体的活化基序 ITAM (绿色) 、CD3ε中的富含脯氨酸的序列PRS (红色)。 γδTCR由γ链和δ链组成，形成抗原结合异二聚体 (TCRγδ，橙色) 。与αβTCR不同的是，CD3亚基排列不同、FG环短得多、配体结合亚基之间的二硫键位置不同、CD3糖基化模式也不同。 图4. 人类αβ和γδTCR的结构 αβTCR和γδTCR的配体识别涉及α、β、γ、δ链的CDR1、CDR2和CDR3，CDR3是配体结合TCR链中变化最大的区域。αβTCR的激活配体为pMHC，通常CD4+ T细胞识别MHC II类上呈递的肽，CD8+ T细胞识别MHC I类上呈递的肽。相反，大多数γδTCR无法识别MHC分子，其配体是多种多样的，缺乏共同性质，不像αβ TCR的配体那样遵循一般原则，包括脂质呈递、应激诱导的MHC样分子、其他非MHC细胞表面分子、可溶性蛋白质、小肽，导致γδTCR活化的分子机制复杂，这与大多数γδT细胞缺乏CD4和CD8表达高度相关。 图5. 人类αβ和γδTCR的激活机制 小贴士 CD4+/CD8+       T淋巴细胞分为CD4+和CD8+两大类。       CD4+ T细胞为辅助性T细胞，是免疫应答的“指挥官”，CD4+T细胞识别MHCⅡ类分子所提呈的外源性抗原肽，活化后主要分化为Th，主要通过膜表面的分子和所分泌的细胞因子与其它细胞交换信息，发号施令。       CD8+ T细胞为杀伤T细胞，CD8+ T细胞识别MHCⅠ类分子所提呈的内源性抗原肽，活化后主要分化为CTL，能够直接杀伤被微生物感染的宿主细胞，清除病原体在体内的“加工厂”和“避风港”。       CD4+ T细胞是不均一的细胞群，按其功能可包括"辅助性T细胞"和"迟发型超敏性T细胞"， 前者为调节性T细胞，后者为效应性T细胞。CD8+ T细胞也是不均一的细胞群，按其功能可包括"抑制性T细胞"和"杀伤性T细胞"，前者为调节性T细胞，后者为效应性T细胞。 αβTCR识别pMHC可能是使CD4/CD8偶联Lck靠近αβTCR所必需的，以启动信号转导。由于γδT细胞缺乏CD4和CD8，γδTCR可以形成大量游离Lck池，以诱导对任何抗原的反应信号转导。这表明，如果Lck未被CD4或CD8隔离，则可以正向选择识别除pMHC之外的抗原的αβT细胞。 图6. 野生型及嵌合型αβ/γδTCR的抗原结合异二聚体 来自αβTCR的区域以蓝色表示，来自γδTCR的区域以橙色表示。第1、3、5、6、7、8列中的TCR的天然配体是pMHC，而第2和第4列中的TCR天然配体是T22 (图5、图4)。这为TCR工程化提供了一定的设计基础。 1.3 工程化TCR技术 基于TCR的结构，利用工程化TCR的新技术有ImmTAC、TCRm、TRuCs、TAC、STAR/HIT等。 1.3.1 ImmTAC ImmTACs (免疫激动单克隆T细胞受体) 是使用工程化、可溶性、亲和增强的单克隆TCRs (mTCRs) 设计的。ImmTACs是一种新型的双特异性生物大分子，基本上是融合蛋白，结合了工程化的TCR靶向系统和单链抗体片段 (scFv) 效应器功能。Immunocore公司的核心技术就是ImmTACs，由工程化改造的TCR以及抗CD3的scFv组成，改造后的TCR显著提高亲和力，比抗原抗体亲和力高出9倍，特异性识别并结合肿瘤细胞表面的pHLA，抗CD3的scFv则能够吸引、招募T细胞至肿瘤细胞周围并激活T细胞发挥肿瘤杀伤作用。2022年美国和欧盟分别批准了Immunocore公司的全球首个TCR蛋白药物tebentafusp，用于治疗转移性葡萄膜黑色素瘤。2023年该药物销售额高达2.387亿美元(折合人民币约17.37亿元)，其中1.698亿美元来自美国，6760万美元来自欧洲，130万美元来自其它地区。 图7. 免疫激动单克隆T细胞受体(ImmTAC) 在ImmTACs的构建中， TCR能够识别来自人类白细胞抗原 (HLA) 呈递的细胞内靶点的肽。ImmTAC通过特异性靶向肿瘤细胞表面的HLA-肽复合物，并通过scFv抗体片段与CD3的相互作用促进T细胞介导的效应器功能。ImmTAC还以剂量依赖性方式激活CD8+ T细胞，并能有效地重定向和激活效应和记忆CD8+和CD4+细胞。ImmTAC通过分泌多种细胞因子表现出多功能反应，如TNF-α、IFN-γ、IL-6、MIP1α-β和IFN-γ诱导蛋白10。 选择合适的"靶抗原"是ImmTACs的关键，质谱技术、pMHC多聚体技术有助于识别合适的抗原。值得注意的是，TCR工程化T细胞也表现出非预期靶向毒性。总的来说，ImmTACs已被证明能增强TCR-T细胞的抗肿瘤反应，但其安全性有待进一步研究。 1.3.2 TCR mimic 除了ImmTACs，另一类双特异性T细胞结合蛋白称为TCR mimic（TCRm），使用两个抗体来源的单链抗体，通过多肽接头共价连接。一个scFv与癌细胞上的pHLA分子表位结合，而另一个scFv与T细胞上CD3复合体的成员结合。使用单链抗体作为抗原结合域的一个优点是，它们可以使用高通量技术如噬菌体和酵母展示文库从头产生。TCR mimic很小(~55 kDa)，使靶细胞和T细胞之间能够密切相互作用。TCR mimic的形式更多样，包括TCRm-CD3双特异性抗体形式、TCRm-ADC形式、CAR形式 [Front Oncol. 2022,12:1027548]。 TCR和TCR mimic的功能、结构和分子动力学比较表明，这两种抗原受体以不同的方式结合他们的靶标，这些差异部分归因于抗体的可变区与TCRs的取向不同。TCR通常结合pHLA复合体的广泛区域，以肽的核心为中心；许多TCR mimic偏向于HLA结合肽的末端或HLA螺旋。 图8. TCRmimic 1.3.3 TRuC TRuC (T细胞受体融合结构) 是一种与T细胞受体亚单位融合的抗体结合域，设计用于有效识别肿瘤表面抗原。TRuCs由靶向肿瘤相关抗原的特异性抗体融合到5个TCR亚基（TCRα、TCRβ、CD3ϵ、CD3γ和CD3δ）的胞外N-末端组成，为工程化T细胞提供了新的靶向特异性和HLA非依赖性靶细胞清除能力，可被相应的靶细胞激活。 图9. T细胞受体融合结构 (TRuC) 与第二代CAR-T细胞相比，该方法显示出更好的抗肿瘤效果。此外，TRuCs支配TCR复合体的全部信号机制，而CARs仅利用分离的CD3ζ胞内段的有限信号。 1.3.4 TAC TAC (T细胞抗原偶联剂) 是另一个工程化TCR细胞，以非MHC依赖性方式诱导更有效的抗肿瘤反应并降低毒性。TAC嵌合蛋白通过与CD3结构域的结合，从而形成TCR/CD3复合物并获得更多的T细胞应答。 图10. T细胞抗原偶联剂 (TAC) TAC受体的活性与CD3结合域的选择密切相关。例如，与UCHT1相比，来自OKT3（muromonab-CD3）的单链抗体具有较低的细胞因子产生和细胞毒性，这可能导致实质上不同的功能结果。与第二代CARs相比，TAC基因工程化的T细胞不仅有利于过继后在实体瘤的更大浸润，而且减少了T细胞在表达抗原的健康组织中的扩增和肿瘤外毒性。 1.3.5 STAR/HIT 合成TCR抗原受体(STAR)/HLA非依赖性TCR(HIT)是一种非HLA限制性受体，是一种异源二聚体，它用抗体的VH/VL结构域取代TCR的可变区(图11g)。由于TCR可变区与VH/VL结构域具有相似的大小和三维折叠，可以互换替换。通过保留TCR恒定域，STAR/HIT受体重新招募CD3信号分子的完整复合体。在抗原刺激后，STAR/HIT受体诱导TCR-like信号，使对抗原位点密度较低的靶细胞的反应性增强。 图11. 基于TCR疗法的分子结构汇总 Vol.2 TCR的抗原筛选技术   近年来，随着高通量测序技术、质谱流式细胞技术、计算生物学的快速发展，研究人员开发了多种TCR抗原筛选技术用于解析TCR及其特异性识别的抗原信息。 2.1 抗原筛选靶向TCR 肿瘤新抗原被不断挖掘并成为潜在靶点，目前已经开发出多种利用目的抗原来反向筛选肿瘤新抗原靶向的高特异性、高亲和力TCR [朱润棣，李贵登. 肿瘤精准靶向免疫治疗的关键：T细胞受体抗原筛选技术 [J]. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2024, 31(1): 10-18]。 2.1.1 细胞杀伤/因子筛选法 酶联免疫斑点检测 (ELISPOT技术) 通过抗体检测T细胞受到抗原刺激后分泌的细胞因子的变化来评估TCR的抗原反应性，该方法操作简单，灵敏度高，但计数误差、抗体特异性等对筛选结构影响较大。 铬释放法是一种细胞毒测定方法，将T细胞与放射性同位素51Cr标记的靶细胞共培养，检测上清中靶细胞裂解后所释放的51Cr放射脉冲数，量化T细胞对靶细胞的特异性杀伤。该法51Cr半衰期较短，难以多次测定。 NFAT-荧光素酶筛选技术是在T细胞中表达活化T细胞核因子(NFAT)-荧光素酶报告基因，靶细胞与T细胞共培养时，抗原与特异性TCR的结合启动NFAT信号通路，激活下游荧光素酶的表达，荧光素酶催化底物的氧化反应，产生荧光，通过检测荧光强度来测定T细胞中荧光素酶活性，以此评估T细胞的抗原特异性。该法灵敏度高、结果重复性好、易于检测且相对安全。 2.1.2 基于pMHC筛选法 基于TCR-pMHC识别特异性，一系列TCR抗原筛选技术被开发出来，由于可溶性pMHC单体与TCR的亲和力较弱，通过pMHC多聚化可增强pMHC与TCR之间的结合稳定性，其中pMHC四聚体是由四个pMHC单体分子通过链霉亲和素聚合形成可溶性的四聚体，已成为鉴定抗原特异性T细胞的“金标准”，具有较高的特异性和敏感性。研究者们开发了多种携带不同标记、标签的pMHC多聚体技术用于高通量抗原特异性TCR的筛选，如荧光标记的pMHC多聚体、重金属离子标记的pMHC多聚体、DNA条形码标记的pMHC多聚体，其中DNA条形码标记的pMHC多聚体可实现高通量TCR抗原筛选。pMHC四聚体已广泛应用于疫苗研发、细胞治疗研究等，并具备诊断试剂开发潜能。但这一技术需要预先确定的抗原肽信息，需要合成多肽文库和pMHC多聚体组装。 图12. pMHC四聚体筛选法 2.1.3 微流控和单细胞测序筛选法 结合液滴微流控与单细胞测序技术，为TCR抗原筛选提供了新的策略和方向，同时获得了抗原特异性TCR的序列信息。微流控系统生成的微液滴可作为细胞反应容器，每个微液滴都是独立的反应单元，将T细胞与靶细胞包裹其中，避免细胞间相互干扰，独立地进行相互作用，再通过单细胞测序获得序列信息，大大提高了检测的灵敏度和TCR筛选通量。 2.2 TCR定向筛选抗原 单细胞测序和免疫组库测序的应用积累了大量双链配对的TCR序列数据库，如IMGT、IEDB、VDJdb等，为了获得这些TCR特异识别的肿瘤抗原信息，研究者利用噬菌体、酵母细胞、哺乳动物细胞、病毒等蛋白表达系统，构建出多种抗原表位展示文库以实现对TCR抗原的筛选，包括：酵母抗原展示系统、哺乳动物细胞展示系统、噬菌体抗原展示系统。 2.3 库对库双向筛选 个体TCR和肿瘤突变抗原的数量巨大，开发“抗原文库”对“TCR文库”的筛选技术具有重要的意义。 2.3.1 基于慢病毒感染的筛选技术 研究人员开发了一种携带荧光蛋白基因的突变型VSV-G假型慢病毒感染体系，使其失去与细胞表面低密度脂蛋白受体结合的能力，无法感染靶细胞，但保留了膜融合能力。通过在体外病毒生产过程中共表达特定表面结合蛋白的方式，将外源蛋白展示在病毒表面，成为以外源蛋白承担受体结合作用的病毒抗原展示系统。改造后的慢病毒通过其表面展示的靶蛋白与细胞膜上受体相互作用实现细胞特异性感染。将多种携带不同pMHC的突变型VSV-G病毒混合后，感染表达TCR文库的T细胞群，通过流式细胞术分离被感染的细胞并进行测序，同时获得配对的TCR和抗原的序列信息。 研究者进一步将“荧光蛋白”与“病毒结构蛋白”相融合，使得编码荧光蛋白的基因无需整合到细胞基因组中，两小时即可在被感染的细胞表面检测到荧光蛋白，缩短了筛选时间。 该法解决了仅能通过单一抗原或单一TCR筛选的局限性，实现了TCR文库与抗原文库的双向筛选。 2.3.2 YAMTAD筛选技术 酵母抗原展示系统具有较大的展示规模和筛选通量，可与流式细胞术有效结合。研究人员建立了酵母凝集介导的TCR抗原发现系统(YAMTAD)。在MATa酵母和MATα酵母中分别转入TCR-CDR3突变体-报告基因与pMHC突变体基因，同时转入交配启动的荧光报告子。将表达同源TCR与pMHC的酵母细胞共培养，经流式细胞术筛选双荧光的二倍体，通过NGS获得TCR与抗原的基因序列。该法具有更高的展示效率，并可达到10E8的筛选规模。YAMTAD系统对低亲和力相互作用的灵敏度较低，可能会遗漏部分TCR与pMHC的配对信息。 Vol.3 TCR疗法的靶点分布   上述多种TCR抗原筛选技术的升级将TCR疗法靶点选择范围进行了扩容，它不仅可以识别细胞表面抗原，同时也可以识别一些抗体、小分子难以靶向的细胞内抗原。 选择理想的抗原是提高抗肿瘤效率和降低相关毒性的关键，肿瘤特异性、免疫原性是选择抗原的首要考虑因素。人类肿瘤抗原主要分为肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA）和肿瘤特异性抗原（tumor-specific antigen，TSA）两大类。表面抗原通常是TAA，正常组织也可以表达。而近90%的实体瘤靶向依赖于TSA。尽管TCR-T可以靶向所有肿瘤抗原，但迄今为止已确定的有足够安全性和有效性的靶点数量仍然有限，通常选择在肿瘤中高表达但在正常组织中低表达的靶抗原来限制潜在的脱靶效应，导致当下可用的靶点有限，主要集中在NY-ESO-1、MAGE、KRAS、AFP、HBV、HPV、PRAME、WT1、EBV等已被证实的抗原进行开发。 维渡纵横从公开信息总结TCR疗法的靶点分布统计如下表所示。 表1. TCR疗法的靶点分布统计 Vol.4 TCR疗法的药物类型   随着研究的不断深入，TCR疗法呈现出不同的药物类型，包括TCR-T细胞疗法、TCR蛋白药、类TCR抗体药物，并逐渐成为国内外药企的热门布局方向。 4.1 TCR-T细胞疗法 肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）治疗是最早被研究并开展临床试验的，但TIL成分复杂且来源受患者个体情况的影响较大，极大地限制了TIL治疗的应用。为了获得靶点明确、作用专一且来源容易的肿瘤杀伤T细胞，研究人员利用病毒载体或非病毒载体途径开发出TCR-T细胞，通过向外周血来源的T细胞转入特异基因就能获得肿瘤特异性杀伤细胞。 图13. TCR-T治疗流程 TCR-T细胞临床治疗肿瘤的一般流程为①抽取外周血分离T细胞；②加入CD3/CD28磁珠和IL-2活化T细胞；③通过病毒载体等途径将TCR基因转导入活化的T细胞形成TCR-T；④TCR-T细胞继续培养扩增至合适数量；⑤将足够数量的TCR-T细胞经静脉回输给患者。 2024年1月31日，Adaptimmune宣布其靶向MAGE-A4的TCR-T细胞疗法Afami-cel的上市申请获得FDA受理并获得优先审评资格，2024年8月1日，Afami-cel获得批准，成为全球首个上市的TCR-T细胞药物，也是十多年来治疗滑膜肉瘤的第一个有效疗法。 4.2 TCR蛋白药物 相对于TCR-T细胞技术而言，TCR可溶蛋白是一种新型的双特异性或多特异TCR蛋白药物，是一种T细胞重定向分子，融合了“抗原识别域”和“T细胞激活域”两个功能结构，即工程化改造的高亲和力TCR和抗CD3(或CD28、4-1BB等)的scFv组成，改造后的TCR部分负责识别肿瘤pHLA复合物，T细胞活化抗体部分负责招募并活化T细胞发挥杀伤肿瘤作用。 与双特异性抗体通过结合靶细胞表面蛋白发挥作用[双特异性抗体掀起投资热潮. 维渡纵横, 2020]不同，TCR蛋白药物则是通过特异性结合提呈到靶细胞表面的pHLA，模拟了自然的T细胞识别过程，实现T细胞向肿瘤细胞的定向攻击。 图14. T细胞重定向免疫肿瘤药物的不同平台 图15.  T细胞重定向作用机制 (A)结合细胞表面蛋白方式; (B)结合pHLA复合物方式; (C)ImmTAC分子(结合pHLA复合物方式)和BiTE分子(结合细胞表面蛋白方式)的双特异性靶向 2022年1月27日FDA批准的全球第一款治疗不可切除或转移性葡萄膜黑色素瘤疗法Kimmtrak（tebentafusp）就是在天然的TCR上进行亲和力优化，通过识别靶抗原gp100-pHLA并结合T细胞上的CD3募集T细胞，来实现肿瘤杀伤作用，打破了眼睛来源黑色素瘤近40年的新药空窗期。 图16. TCR蛋白药Kimmtrak (tebentafusp) 图17. 首款TCR蛋白药作用机制 4.3 TCR类抗体药物 TCR类抗体（TCR mimic antibody, TCR mAb, TCRm）主要是通过筛选出亲和力和特异性远高于TCR的抗体来替代TCR，即将TCRαβ结构域替换为抗体片段的可变域，从而做到有效靶向胞内/外抗原。TCR类抗体拥有抗体的优良成药性以及较长的半衰期，兼具TCR独有的识别细胞内抗原的特性，是近年来逐渐兴起且拥有巨大发展潜力的新型免疫治疗大分子。 图18. TCR蛋白和TCR类抗体的结构差异 不同于传统抗体，TCRm抗体模拟TCR的识别方式靶向肿瘤细胞内抗原，识别肿瘤细胞表面上的肽/MHC复合物。并且TCRm抗体的作用机制广泛，可以触发ADCC、CDC、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。此外，TCRm抗体还可以转化为嵌合抗原受体(CAR)结构，通过T细胞介导肿瘤细胞的特异性识别和杀伤。 Vol.5 TCR疗法临床进展   5.1 海外TCR疗法临床进展 根据维渡纵横和医药魔方数据，截至2024年8月5日，海外地区共计2个TCR疗法获批上市，分别为Immunocore的TCR蛋白药tebentafusp和Adaptimmune的TCR-T细胞药物afamitresgene autoleucel (Afami-cel)；此外共计57个进入注册制临床试验阶段。 图19. 海外TCR疗法临床进展统计 TCR疗法的疾病领域主要聚焦在肿瘤领域、罕见病领域、血液领域。已经获批适应症分别为滑膜肉瘤、葡萄膜黑色素瘤；其余适应症处于临床试验阶段，包括非小细胞肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、HPV相关癌症、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、肛门癌、宫颈癌、骨髓增生异常综合征、滑膜肉瘤、急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、胃癌、结直肠癌、黏液样/圆细胞型脂肪肉瘤、胰腺癌、尿路上皮癌、乳腺癌、头颈癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌等。 维渡纵横根据公开信息整理海外进入注册制临床试验的产品如下表所示。 表2. 国外进入临床试验阶段的TCR疗法 5.2 国内TCR疗法临床进展 国内TCR疗法起步较海外晚，共计15个产品进入中国注册制临床试验阶段，包括TCR-T和STAR-T类型，其中香雪制药TAEST16001进入II期临床，天科雅、可瑞生物、恒瑞源正等处于I期临床阶段。 表3. 国内进入临床试验阶段的TCR疗法 国内布局TCR蛋白药物的企业较少，进展最快的为“可瑞生物”，其次为“肽源生物(鼎成肽源)”、“镔铁生物”、“立凌生物”、“灵识质源”。对TCRm有一定布局的企业为百奥赛图。国内TCR蛋白药和TCRm均处于临床前阶段。 Vol.6 TCR疗法生产流程   6.1 TCR-T生产工艺流程 TCR-T细胞疗法是通过单采技术，从患者的外周血中收集和分选出自体淋巴细胞，再使用慢病毒载体或mRNA等基因工程手段，将特定的肿瘤抗原特异性T细胞受体(TCR)基 因导入离体T细胞的基因组(DNA)中，使得这些细胞能够一致性地在细胞膜上装载这种TCR的蛋白分子，再将这些细胞的数量经过体外扩增后回输给患者，直接杀伤肿瘤或激发机体免疫功能间接杀伤肿瘤。 图20. TCR-T生产简图 (来源:赛科成) 具体步骤如下： ① 筛选和确定肿瘤上合适的特异性抗原，以及对抗原有高度特异性的TCR αβ链序列； ② 从患者体内分离出T细胞； ③ 将TCRαβ序列包入病毒基因组，构建病毒载体； ④ 病毒转染T细胞，将目标TCR序列引入T细胞，从而获得特异性TCR-T细胞； ⑤ TCR-T细胞体外培养、大量扩增； ⑥ 将数量合适的TCR-T细胞回输患者体内。 TCR-T产品的上游研发工作是"筛选"及"亲和力优化"针对肿瘤抗原特异性的TCR，该TCR分子决定了TCR-T细胞安全有效的抗肿瘤能力；下游的TCR-T"细胞制备"和"质量控制"则决定了TCR-T终产品质量。 TCR-T制备工艺与质量研究仍处于起步阶段，国内工业界仍没有成熟的体系可以借鉴套用。建立完整的工艺及质控体系是保障TCR-T产品的有效性、稳定性和一致性的关键。TCR-T产品在生产原材料、生产工艺、过程控制、辅料、包装容器、稳定性等方面与CAR-T细胞产品有相似之处，在质量评价方面可参考相关的指导原则和考虑要点及国外如美国FDA和欧盟EMA先进疗法相关的指导原则。 6.2 TCR蛋白药生产流程 TCR蛋白药弥补了TCR-T细胞治疗的一些局限性。首先，自体TCR-T往往成本高昂，制备复杂，部分患者不适宜单采，导致这一方法可及性较差。TCR蛋白药在成本、生产、可及性、PK特性、安全性方面都更具有优势，并且能够应用到更多疾病领域。 TCR蛋白药的开发需要极高的"TCR亲和力优化"，高技术门槛限制了大部分公司进入该领域，全球只有少数几家公司如Immunocore、Immatics、可瑞生物具有TCR蛋白药管线。可瑞生物长期致力于高通量天然TCR筛选平台和SMART-TCR亲和力优化体系，是国内最早开展和进展最快的TCR蛋白药生物科技公司。 TCR蛋白药开发的核心技术是TCR亲和力优化，然后经由工程化改造的高亲和力及特异性的TCR和抗CD3的scFv组成双特异性融合蛋白分子，通过重组蛋白生产工艺即可完成，具体开发流程如下： ① 利用超灵敏质谱等手段确定样本库中最佳的肽-人类白细胞抗原(pHLA)； ② 利用专有的亲和力优化技术筛选更高特异性的TCR； ③ 利用TCR质量评估平台确保只有最佳的TCR才会进入到亲和力优化步骤； ④ 在有六个pHLA结合区域的数十亿个离散突变的TCR中利用专有的筛选技术如噬菌体展示技术等筛选亲和力高达百万倍同时特异性高的TCR； ⑤ 利用体外毒理性评价平台评估分子潜在脱靶结合或交叉反应性，以确定治疗窗口，并提供首次入人体的起始剂量； ⑥ 利用基于大肠杆菌等微生物发酵制造平台规模化生产重组蛋白，商业化推出TCR蛋白药产品。 Vol.7 产 业 链 分 析   7.1 TCR-T细胞药产业链 TCR疗法中，TCR-T为免疫细胞治疗之一，免疫细胞治疗作为一种前沿的治疗方法，从细胞的采集、存储到科研与临床应用，已经形成了一个完整的产业链。 7.1.1 上游分析 上游包括细胞资源库、仪器设备、试剂耗材、模式动物，是行业的基石，为中下游提供了必要的资源和支持。 细胞资源库的建立是免疫细胞治疗的第一步。这些库存储了大量的免疫细胞，可以在需要时迅速提供。目前，中国已有多家企业如中源协和、南京新百等在全国范围内建立了细胞资源库，为研究和治疗提供了强大的支持。  仪器设备、试剂耗材和模式动物是研究的另一大支柱。细胞治疗中使用的仪器设备和试剂耗材大多依赖进口，如生物反应器、细胞分离设备、检测设备、培养基等，国际知名品牌如通用、贝克曼、赛默飞、思拓凡、安捷伦等都在中国市场有着广泛的业务。 模式动物和类器官研究目前正实现国产化替代，国内企业包括昭衍新药、药康生物、大橡科技等。 7.1.2 中游分析 免疫细胞治疗的中游是行业的核心，直接决定了治疗的效果和前景。中国已经在全球免疫细胞治疗研究领域中占据了重要的位置，处于第一梯队。特别是基于CAR-T、TCR-T、TIL、CAR-NK、CAR-M等技术的研究，中国在这一领域的研究已经达到了国际先进水平。 CAR-T领先企业包括传奇生物、科济生物、驯鹿生物、恒润达生、合源生物、艺妙神州等； TCR-T领先企业包括香雪制药、可瑞生物、天科雅、恒瑞源正、科士华、镔铁生物、肽源生物(鼎成肽源)、呈源生物等； TIL领先企业包括沙砾生物、君赛生物、西比曼、卡替医疗、劲风生物、智瓴生物、循生生物、蓝马医疗、华赛伯曼等； CAR-NK/NK领先企业包括英百瑞、先博生物、国健呈诺、达博生物、晨泰医药、中盛溯源、启函生物、星奕昂、恒润达生、传奇生物、恩瑞恺诺、贝斯昂科、恩凯赛药、优凯瑞等； CAR-M领先企业包括赛元生物、元迈细胞、鲲石生物、巨世康济等 [巨噬细胞疗法行业研究报告. 维渡纵横, 2022]。 7.1.3 下游分析 免疫细胞治疗的下游是行业的终端即临床应用，直接关系到治疗的普及和应用。截止目前，中国市场只有CAR-T产品获批上市，其他领域尚未获批。随着政策的支持和医疗机构的参与，免疫细胞治疗在中国的临床应用也将得到更广泛的推广，不仅为患者带来了新的治疗机会，也为整个行业带来了巨大的市场潜力。 7.2 TCR蛋白/TCRm产业链 TCR蛋白即融合蛋白，TCRm即类抗体，其产业链适用于重组蛋白产业链和抗体产业链，上游包括细胞株、菌种转染试剂、培养基、耗材、仪器设备等；中游即为TCR蛋白和TCRm药物生产商，领先企业包括可瑞生物、肽源生物(鼎成肽源)、镔铁生物、灵识质源、立凌生物、百奥赛图；下游即临床应用单位。 Vol.8 市场规模和商业化   8.1 市场规模 根据沙利文公司发布的数据显示，预计全球肿瘤患者年度新增人数将从2022年的2023万增长至2030年的2445万，肿瘤药物市场将从2022年的2050亿美元增长至2023年4586亿美元，细胞与基因治疗占比将从24.5%上升到47.9%。根据Business Research Insights数据，2022年全球免疫细胞治疗市场规模为24.56亿美元 (175.39亿元人民币)，到2029年将达到171.4亿美元 (1223.98亿元人民币)，预测期内复合年增长率为74.1%。 根据医药经济报统计，中国免疫细胞治疗市场正迅速扩张，预计从2021年的13亿元增长至2030年的584亿元，年均增长率达到53%。在这一增长中，CAR-T细胞疗法市场预计将从2亿元增长至287亿元，包括TCR-T在内的其他免疫细胞治疗市场将从10亿元增长至297亿元。而根据头豹研究院2021年数据显示，单从中国TCR疗法的潜在需求来预测，2021至2025年中国TCR疗法潜在市场容量从387亿元增长至1041亿元，年复合增长率为28.1%。 8.2 TCR疗法商业化 首个获批的TCR疗法是Immunocore公司的TCR蛋白药Tebentafusp，商品名为Kimmtrak，于2022年1月获批上市，是一款靶向gp100的TCR与靶向CD3的scFv的融合蛋白，在III期临床数据中打败了K药和CTLA-4单抗，获FDA批准用于治疗HLA-A*02:01基因型、转移性或不可切除的葡萄膜黑色素瘤，美国定价为40万美元/年。2022年首年销额达1.41亿美元，2023年销售额达2.49亿美元；2024年第一季度净销售额达到7034.2万美元，同比增长36%，在获批的38个国家和地区中，美国净销售额占比71.1%，欧洲占比26.9%，欧美销售合计占比98%，是绝对主战场。 第二个获批的TCR疗法是Adaptimmune的TCR-T细胞药物Afami-cel （afamitresgene autoleucel），商品名Tecelra，FDA于2024年8月1日批准用于二线治疗既往接受过化疗治疗的不可切除或转移性滑膜肉瘤成人患者，且肿瘤表达MAGEA4，同时HLA-A*02:01P阳性、HLA-A*02:02P阳性、HLA-A*02:03P阳性、HLA-A*02:06P阳性。Tecelra定价为72.7万美元，公司预计该产品的年销售峰值可能高达4亿美元。 Vol.9 资 本 市 场 表 现   近日，香雪制药发布其TCR-T细胞疗法纳入优先评审后，在九个交易日股价涨幅超过210%；东北制药收购TCR-T细胞疗法企业肽源生物(鼎成肽源)，连续两个交易日股价涨幅21.22%。可见国内资本对TCR疗法的热度颇高。 截至目前，涉及到TCR疗法的相关公司共计10家上市公司：Immunocore (IMCR) 是一家纳斯达克上市公司，聚焦于TCR蛋白药物的开发，当前市值18.5亿美元；Immatics (IMTX) 是一家纳斯达克上市公司，具有TCR-T和TCR蛋白药双平台，当前市值12.1亿美元；东北制药 (000597) 通过并购方式进入到TCR-T和TCR蛋白药领域，当前市值62.2亿元；香雪生命是创业板上市公司香雪制药 (300147) 的控股子公司，香雪制药当前市值为53.2亿元；Lyell Immunopharma (LYEL) 是一家纳斯达克上市公司，具备TIL、CAR-T和TCR-T平台，当前市值3.7亿美元；TScan (TCRX) 是一家纳斯达克上市公司，公司对T细胞的生理靶点进行迅速和无偏倚筛选来开发治疗癌症和传染病的TCR药物，当前市值3.18亿美元；百奥赛图 (HK2315) 是一家港股上市公司，主要技术平台为抗体技术，包括TCR抗体，当前市值24.4亿港币；Adaptimmune (ADAP) 是一家纳斯达克上市公司，聚焦于TCR-T疗法，当前市值2.9亿美元；永泰生物 (HK6978) 是一家港股上市公司，主要技术平台为EAL和CAR-T疗法，同时拓展到TCR-T领域，当前市值15.9亿港币；Tevogen (TVGN) 是一家纳斯达克上市公司，主营未经基因修饰的现成T细胞治疗产品，当前市值1.1亿美元； 从2020年至2024年8月20日，共有57家TCR相关概念的公司获得多轮融资，主要地区在美国和中国，维渡纵横统计了涉及TCR概念的生物科技公司近年来的最新融资情况，如表4所示。 表4. 具备TCR疗法概念的公司融资情况 Vol.10 总 结 与 展 望   随着TCR蛋白药Kimmtrak (tebentafusp)和TCR-T细胞药Tecelra (Afami-cel)的陆续上市，TCR疗法终于全面进入商业化阶段，开启肿瘤免疫治疗新篇章。但由于TCR疗法的高技术壁垒，目前上市产品的定价颇高，这也是未来TCR疗法冲刺高销售峰值的可能障碍之一。维渡纵横更加期待国内TCR疗法的商业化和全球化，或将带来更高的性价比，期盼香雪生命科学、可瑞生物、天科雅等新锐生物科技公司给全球实体肿瘤患者带来福音。 END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 TIS2024第四届免疫细胞疗法与干细胞疗法论坛重磅来袭，合作详询：王晨 180 1628 8769

CDR813 and CDR505 programs further broaden pipeline of cancer-specific targeted therapies ZÜRICH, Switzerland I June 25, 2024 I CDR-Life Inc. today announced an expansion of its pipeline of novel T cell engagers (TCE) with the addition of CDR813 and CDR505. CDR813 is a highly potent and selective TCE candidate targeting tumors expressing PRAME (preferentially expressed antigen in melanoma) in HLA-A*02:01 patients. PRAME is a clinically validated pan-cancer target expressed in a broad set of tumors including non-small cell lung cancer (NSCLC), endometrial cancer, melanoma and ovarian cancer, but not in normal tissue. A bi-valent and bi-specific antibody-based TCE, CDR813 targets a PRAME peptide presented on tumor cells by the HLA-A*02 complex and the CD3 receptor on T-cells with unparalleled potency and specificity. CDR505 is a TCE targeting KK-LC-1, a novel HLA-A*01 target relevant in common cancer populations not yet addressed by other T cell receptor (TCR) therapeutics. While most TCE programs target the HLA-A02 haplotype, CDR505 targets KK-LC-1/HLA-A*01, expanding the potential of TCEs to benefit a large patient population with high unmet need. Preclinical data on CDR505 was presented at the American Association for Cancer Research (AACR) Annual Meeting in April 2024. “With our continued investment in building a broad pipeline of unique, potent and highly cancer-targeted therapies, we are expanding the promise of our differentiated T cell engager platform to treat a range of solid tumors,” said Christian Leisner, Ph.D., Chief Executive Officer at CDR-Life. “Importantly, the CDR813 and CDR505 programs are geared toward populations with significant unmet medical need, increasing our reach to benefit more patients.” About CDR-Life CDR-Life is developing powerful T-cell engagers (TCE) to eradicate hard-to-treat solid tumors. Our integrated antibody-based TCE platform unlocks access to a wide range of cancer antigens. We are leveraging this platform to advance a pipeline of potent and selective TCE therapeutics targeting intracellular and surface tumor antigens. With a team of proven drug development experts and backed by leading cross-Atlantic investors, we are working to empower patients’ own immune systems to eliminate tumors. SOURCE: CDR-Life

摘要：癌症治疗中最大的挑战是以最小的损伤正常细胞来根除癌细胞。靶向治疗已经发展起来以应对这一挑战，与传统癌症治疗相比，显示出显著增加的治疗指数。由于其对目标抗原的非凡高特异性，抗体成为靶向治疗代理家族中的重要成员。治疗性抗体使用一系列机制直接或间接杀死癌细胞。早期的抗体被开发出来直接对抗癌细胞上的目标。随后是连接技术的进步，使得抗体-药物偶联物（ADCs）的生产成为可能，这些偶联物将细胞毒性有效载荷引导到癌细胞。我们对T细胞生物学的理解的提高，导致了免疫检查点抑制抗体的生产，这些抗体通过激活T细胞间接杀死癌细胞。甚至最近，双特异性抗体被设计合成，以重定向患者的T细胞杀死癌细胞。在这篇综述中，我们总结了治疗性抗体用来靶向癌细胞的不同方法。我们讨论了它们的作用机制、目标特异性的结构基础、临床应用以及正在进行的研究以提高疗效和减少毒性。 1. 引言 在过去的一个世纪中，发展了诸如化疗和放疗等有效的治疗手段来治疗癌症。不幸的是，这些方法通常缺乏足够的特异性，无法在不引起难以忍受的毒性的情况下，使用足够高的剂量来根除癌细胞。单克隆抗体可以提供所需的特异性水平，从而大幅扩大治疗窗口，有些抗体甚至能够区分相差一个氨基酸或经过翻译后修饰的两种抗原。20世纪70年代发展的杂交瘤技术首次允许生产和筛选针对人类抗原的高度特异性小鼠单克隆抗体。其次，将人类抗体恒定区嫁接到小鼠抗体可变区的能力，产生了具有更好治疗效果和较少副作用的嵌合抗体（图1）。第三，20世纪90年代转基因小鼠模型和噬菌体展示系统的应用，使得能够针对癌症靶点产生全人源抗体。随着这些技术进步和临床需求的增加，过去25年见证了基于抗体治疗的爆炸性增长。自1997年以来，已有50多种基于抗体的肿瘤治疗药物获得了美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的批准（补充表1）。除了基于抗体的治疗外，抗体片段也被用来生成嵌合抗原受体（CARs）进行T细胞工程。在这篇综述中，我们专注于FDA和EMA批准的基于抗体的治疗以及正在临床前和临床开发中进展的抗体。我们讨论了用于产生嵌合、人源化和人源抗体的相继使用的方法的演变。我们详细说明了正在开发用于靶向癌细胞的一系列格式，如单特异性抗体、免疫检查点抑制剂、双特异性抗体和偶联抗体。最后，我们总结了为应对当前癌症靶向抗体开发中的挑战而进行的新兴研究。 2. 抗体生成 用于识别针对肿瘤抗原的治疗性单克隆抗体或抗体片段的一系列技术。这些技术包括使用目标抗原对啮齿动物进行免疫、噬菌体或酵母展示技术、从人类和小鼠中克隆单B细胞，以及从骆驼科动物中识别单域抗体（称为纳米抗体）。抗体的进一步临床应用开发涉及抗体工程，使其与人类免疫系统越来越兼容。 2.1 嵌合抗体和人源化抗体 单克隆抗体传统上是通过1975年Cesar Milstein和Georges Kohler开发的杂交瘤技术生产的。在这个过程中，B细胞是从免疫特定抗原的小鼠脾脏或淋巴结中分离出来的，然后与Sp2/0这样的骨髓瘤细胞系融合，形成称为杂交瘤细胞系的杂交细胞。通常通过酶联免疫吸附测定（ELISA）筛选杂交瘤克隆以检测蛋白结合，并通过流式细胞术检测细胞结合。杂交瘤技术能够稳健且成本有效地生成一系列小鼠单克隆抗体。然而，注入人体的小鼠抗体会产生人抗鼠抗体（HAMA）免疫反应，限制了它们的疗效并增加了不良反应。因此，获得监管批准的大多数小鼠抗体后来都被撤回（图1）。Blinatumomab（一种双特异性T细胞激活剂，靶向CD19），使用两个小鼠衍生的单链可变片段（scFv）格式，缺乏可结晶片段（Fc），是唯一在临床上广泛采用的小鼠抗体。 为了减少在患者中诱导免疫反应，小鼠抗体的恒定区被替换为人类恒定区，以产生嵌合抗体（图1）。利妥昔单抗（抗CD20）和西妥昔单抗（抗表皮生长因子受体（EGFR））（表1）是最早通过将小鼠抗体2B8和225的可变区连接到人类免疫球蛋白G1（IgG1）重链和人类κ轻链恒定区而产生的嵌合抗体之一。然而，带有小鼠可变区的嵌合抗体仍可被识别为外来物质，导致可能清除治疗性抗体的人抗嵌合抗体（HACA）免疫反应。这可能限制了嵌合抗体的重复应用并阻碍了它们的临床开发。为了进一步减少不必要的免疫反应，通过1980年代开发的称为“人源化”的过程增加了小鼠单克隆抗体的人类含量。人源化涉及将小鼠抗体的互补决定区（CDR）仅嫁接到人类抗体的框架区域（图1）。曲妥珠单抗是通过将小鼠人类表皮生长因子受体2（HER2）抗体mumAb4D5的CDR移植到人类抗体框架中而开发的首批人源化抗体之一，类似的策略被用于开发奥比妥珠单抗（抗CD20）、帕博利珠单抗（抗程序性细胞死亡蛋白1（PD1））和阿特珠单抗（抗PD1配体1（PDL1））（表1）。 除了小鼠杂交瘤技术外，还开发了兔杂交瘤技术，用于生产针对肿瘤抗原（如间皮素）的兔单克隆抗体。CDR嫁接方法已被调整以人源化兔单克隆抗体，如针对间皮素的YP218，用于临床开发。监管机构批准的大多数治疗性抗体是使用杂交瘤方法生成的，随后工程化成嵌合或人源化形式，并广泛用于癌症治疗（图1）。 2.2 全人抗体 1990年代开发的两种技术使得生成全人抗体成为可能：人类抗体噬菌体展示和表达人类抗体的转基因小鼠模型。为了生成产生人类抗体的转基因小鼠，人类Ig基因座或可变区被插入到小鼠基因组中，同时破坏小鼠Ig基因。从小鼠中分离出免疫目标抗原的B细胞，用于单B细胞克隆和测序。转基因小鼠平台XenoMouse（Abgenix/Amgen）、VelocImmune（Regeneron）和HuMab（Medarex/Bristol Myers Squibb）产生了9种获批的针对癌症靶标的人类抗体：daratumumab（抗CD38）、ipilimumab（抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4））、nivolumab（抗PD1）、ofatumumab（抗CD20）、panitumumab（抗EGFR）、durvalumab（抗PDL1）、cemiplimab（抗PD1）、tisotumab（抗组织因子（TF））和relatlimab（抗淋巴细胞激活基因3（LAG3））（表1）。这些抗体的成功临床开发导致了KyMouse（Kymab）、OmniRat（Ligand）、H2L2 Mouse（Harbour Antibodies）、Trianni Mouse（Trianni Inc/AbCellera）和RenMab（Biocytogen）等多个转基因小鼠平台的快速崛起。 图1 | 抗体组分。a, 抗体由两个相同的轻链和重链组成，它们通过二硫键连接在一起，呈现出Y字形结构。每个轻链和重链都包含一个可变区（VL和VH），负责抗原结合，以及恒定区（CL和CH），决定抗体的半衰期和效应功能。酶促处理可以将抗体分解成两个片段，分别命名为片段抗原结合（Fab）和可结晶片段（Fc）。轻链和重链的可变区共同构成可变片段（Fv），是保留抗原结合能力的最小片段。制造的Fv片段通过柔性肽连接起来，形成一个称为单链可变片段（scFv）的单一链。根据来自每个物种的肽序列量，抗体被分为小鼠、嵌合、人源化和人类抗体。a Belantamab mafodotin 被撤回，但可能会根据正在进行的试验重新获得批准。Teclistamab（一种人源化和人类抗体的组合）在此图中被视为人源化抗体。CDRs，互补决定区。 展示技术为人类抗体开发提供了另一种平台。使用噬菌体展示，可以从多样性超过10^10的大型文库中分离出人类单链可变区（scFv）或片段抗原结合（Fab）片段（图1）。噬菌体展示技术通常使用M13丝状噬菌体来表达与噬菌体pIII外壳蛋白融合的抗体片段，如scFv。噬菌体文库用固定在微孔板或珠子上的目标抗原进行筛选。非特异性噬菌体结合物被洗去，剩余的特异性结合物被收集用于下一轮筛选。通常需要3到5轮筛选来分离特异性结合物。这个过程称为噬菌体淘选，它模仿体外免疫选择。使用下一代测序的新方法有助于快速识别稀有结合物。Dyax生产的噬菌体展示系统产生了三种获得监管批准的全人抗体：ramucirumab（抗血管内皮生长因子受体2（VEGFR2））、necitumumab（抗EGFR）和avelumab（抗PDL1）（表1）。此外，由Dyax、Cambridge Antibody Technology、MorphoSys等产生的多个噬菌体展示衍生的人类抗体目前正在进行临床试验。转基因小鼠和噬菌体展示技术都有其独特的优势。通常，转基因小鼠平台倾向于产生具有更理想生物物理特性和在临床试验中表现更好的抗体，而噬菌体展示允许选择针对特定表位的抗体。除了噬菌体展示，细胞表面展示（酵母、细菌和哺乳动物）、核糖体展示和mRNA展示技术已被用于抗体生成。酵母和哺乳动物细胞表面展示允许在真核细胞的细胞表面表达重组抗体片段。这使得可以通过流式细胞术分离抗原特异性细胞，并发现高亲和力结合物。Sintilimab，一种特异性针对PD1的人类IgG4抗体（表1），是通过酵母细胞表面展示分离的，目前正在接受FDA监管审查以获得批准。 2.3 比较嵌合、人源化和全人抗体 生产嵌合、人源化或全人抗体的目标是减少针对抗体的免疫反应，这种反应带有中和风险和不良反应（例如，输注反应和过敏反应），并随着重复给药而增加。对各种抗体治疗的人类临床试验的大规模分析显示，使用嵌合、人源化和全人抗体时，免疫原性逐渐下降。然而，该研究没有检查较低的免疫原性是否会导致更好的肿瘤消退或患者生存。几种FDA批准和EMA批准的嵌合、人源化和全人抗体针对常见的癌症抗原，如CD20、HER2和EGFR，尽管它们在不同的表位上具有不同的结合特性（表1）。 ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；ADCP，抗体依赖性细胞介导的吞噬作用；ASPS，肺泡软组织肉瘤；BCC，基底细胞癌；CDC，补体依赖性细胞毒性；dMMR，错配修复缺陷；HCC，肝细胞癌；HNC，头颈癌；IgG，免疫球蛋白G；MCC，默克尔细胞癌；MSI-H，微卫星高度不稳定性；NA，数据不可用；PMBCL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤；RCC，肾细胞癌；SCC，鳞状细胞癌；TNBC，三阴性乳腺癌。 比较针对CD20（利妥昔单抗与奥比妥珠单抗或利妥昔单抗与奥法木单抗）、HER2（曲妥珠单抗与马格图珠单抗）和EGFR（西妥昔单抗与帕尼图珠单抗）的抗体的III期临床试验已经证明，总生存率相似，治疗相关治疗中断的比率也相似，表明具有等效的治疗效力。然而，大量的HAMA免疫反应阻碍了针对二唾液神经节苷GD2的小鼠抗体的开发，并且在使用利妥昔单抗治疗自身免疫性疾病的患者中观察到了强烈的HACA免疫反应。对HACA免疫反应的担忧，加上简化了人源化和全人抗体生成的技术进步，增加了这两种格式的使用。进入当前临床试验的抗体要么是人源化的，要么是全人产品（图1和补充表2），根据以前的试验结果，人源化和全人抗体在患者中倾向于展示相似的治疗效力。 2.4 不同格式的抗体治疗 根据它们的结构和功能机制，抗体治疗可以分为三种主要格式——单特异性抗体、双特异性抗体和与有效载荷（如药物、毒素或放射性同位素）偶联的抗体（图2）。 2.5 单特异性抗体格式 单特异性抗体格式涉及全长免疫球蛋白，它们结合到目标抗原上。在五种免疫球蛋白亚型（IgG、IgM、IgA、IgE和IgD）中，只有IgG能够结合到新生儿Fc受体（FcRn），从而带来长半衰期（大约21天）。针对癌症的抗体利用IgG亚型来利用这一延长的半衰期，通常每21天给药一次。大多数FDA批准和EMA批准的抗体以及正在开发的抗体都使用单特异性IgG抗体格式（见图1自然发生的IgG抗体的基本结构）。IgG抗体有四个亚类（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4），大多数治疗性抗体使用IgG1亚类。单特异性抗体格式的目标抗原是细胞表面蛋白，主要是在实体癌中过度表达的生长因子受体（例如，在乳腺癌、胃癌和胃食管癌中过度表达的HER2；在结肠癌中过度表达的EGFR；在肺癌中过度表达的MET）。对于血液恶性肿瘤，抗体通常针对由不同免疫细胞亚群表达的细胞表面糖蛋白（也称为簇分化（CD）标记），例如B细胞恶性肿瘤中的CD19和CD20；T细胞恶性肿瘤中的CD52和CC基序趋化因子受体4（CCR4；也称为CD194）；浆细胞恶性肿瘤中的CD38和B细胞成熟抗原（BCMA；也称为TNFRSF17）。目标及其相应的抗体列在表1中。 2.5.1 作用机制 抗体与癌细胞结合通过多种机制导致癌细胞死亡。直接阻断生长因子的生存信号和阻断血管生成导致肿瘤血液供应中断是这些抗体对实体肿瘤消退的两个主要机制。相比之下，血液恶性肿瘤中针对的CD标记通常在促进癌细胞存活方面没有重要作用，尽管一些研究表明针对CD20或CD52的抗体可以诱导非caspase依赖性的程序性细胞死亡。相反，抗体通过招募和激活免疫效应细胞来诱导细胞毒性。每个IgG抗体亚类赋予抗体不同的效应功能。IgG1亚类Fc片段对巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞表达的激活Fcγ受体（FcγRs；FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIIb）有很强的亲和力。FcγR结合导致巨噬细胞和NK细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），直接杀死癌细胞（见图2）。最早获得FDA批准的两种抗体是针对恶性B细胞表达的CD20的利妥昔单抗和针对过度表达HER2的乳腺癌细胞的曲妥珠单抗，这两种抗体都使用常见的IgG1亚类。IgG1诱导ADCC和ADCP的能力最终导致癌细胞死亡，并且可以通过Fc工程进一步增强。支持这一作用机制的是，例如携带FcγRIIIa等位基因中纯合子158缬氨酸/缬氨酸的患者对利妥昔单抗和曲妥珠单抗的反应更高。IgG1亚类还结合补体蛋白C1q，导致通过补体依赖性细胞毒性（CDC）的癌细胞死亡。 图2 | 抗体格式和作用机制。a, 根据结构和作用机制，治疗性抗体可以分为三种不同的格式：单特异性抗体、双特异性抗体，以及与药物、毒素或放射性同位素偶联的抗体。b, 单特异性抗体结合癌细胞上的抗原，通过多种机制导致细胞死亡，包括破坏生长因子受体（如人类表皮生长因子受体2（HER2））的生存信号，激活免疫细胞（如通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的自然杀伤（NK）细胞介导的杀伤和通过抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）的巨噬细胞介导的杀伤），以及通过激活补体级联反应（补体依赖性细胞毒性（CDC））。免疫检查点阻断抗体结合并激活免疫细胞，如T细胞，导致免疫介导的癌细胞死亡。双特异性抗体结合两种不同的抗原。大多数双特异性抗体设计为结合T细胞（T细胞激活剂）和癌细胞，并将T细胞重定向以杀死癌细胞。非T细胞激活的双特异性抗体结合癌细胞表面的两种不同抗原，导致直接杀死癌细胞。抗体-药物偶联物（ADCs）、免疫毒素和放射性同位素偶联抗体携带有毒载荷，增强了抗体杀死癌细胞的能力。BCMA，B细胞成熟抗原；EGFR，表皮生长因子受体；gp100，糖蛋白100；GPRC5D，G蛋白偶联受体家族C组5成员D；FcγR，Fc γ受体；PD1，程序性细胞死亡蛋白1；PDL1，PD1配体1；scFv，单链可变片段；TCR，T细胞受体。 尽管大多数直接介导癌细胞死亡的癌症靶向抗体更倾向于使用IgG1亚类（见表1），但一个例外是帕尼图珠单抗，一种IgG2 EGFR抗体。IgG2抗体只能弱激活NK细胞和补体，而是通过招募髓系细胞来介导癌细胞死亡。目前市场上的单克隆抗体主要是IgG1。除了效应功能外，IgG亚类的选择还基于结构稳定性、循环半衰期、制造经验以及监管批准、缺乏免疫原性或意外副作用，以及公司开发组合中特定IgG亚类的可用性。 研究了曲妥珠单抗的Fab片段与HER2胞外域复合物的结构，为治疗机制提供了首个结构基础。曲妥珠单抗结合HER2的第四个亚域，阻止其同源二聚体形成，进而减少细胞增殖（蛋白质数据银行（PDB）：1N8Z；见图3a）。结构技术的进步促成了首个应用冷冻电镜（cryo-EM）技术获得的HER2与两种靶向HER2的抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗复合物的结构[61]。与曲妥珠单抗不同，帕妥珠单抗通过与HER2的第二亚域相互作用，抑制HER2与HER3配体诱导的异源二聚体形成，破坏下游信号传导（见图3a）。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的结合表位相隔约60埃（Å），HER2-曲妥珠单抗-帕妥珠单抗复合物结构指导了双特异性抗体Zanidatamab的设计，该抗体与两种HER2表位相互作用，具有改善的治疗效力。 结构生物学技术也被用来理解利妥昔单抗的治疗机制；具体来说，利妥昔单抗如何促进CD20的聚集。在最初的高分辨率结构中，似乎CD20形成了同源二聚体，利妥昔单抗的Fab片段结合到每个CD20单体的胞外区域（PDB：6VJA；见图3b）。利妥昔单抗两个Fab片段之间的距离表明单一利妥昔单抗IgG分子无法结合CD20同源二聚体。使用全长IgG利妥昔单抗进行的额外电子显微镜研究提供了首个证据，表明利妥昔单抗交联两个CD20同源二聚体，结果形成一个大的超分子复合物，确立了利妥昔单抗的结合机制。 2.5.2 单特异性抗体Fc工程 大多数IgG1抗体的效应功能由Fc域介导。数十年的研究增进了我们对Fc域与不同Fc受体相互作用的理解，并协助工程化具有理想效应功能的抗体。在临床前研究中显示增加活性的常见Fc域修饰包括去岩藻糖基化（从Fc区域去除岩藻糖以增加FcγRIIIa结合）或关键残基的氨基酸替代（例如S239D和I332E，增加与Fc受体的结合），两者都导致增强的ADCC和ADCP。两种在临床使用的抗体具有去岩藻糖基化的Fc（靶向CD20的奥比妥珠单抗和靶向CCR4的莫加木单抗）以增强它们的免疫效应功能（见表1）。随机临床试验（GALLIUM和GOYA研究）评估了利妥昔单抗（未经Fc修饰的CD20抗体）或奥比妥珠单抗（Fc去岩藻糖基化的CD20抗体）在不同淋巴瘤亚型中的益处。在GOYA研究中，两组患者的结果相似。GALLIUM研究显示接受奥比妥珠单抗治疗的患者有更好的无进展生存期（PFS），但未能证明总体生存益处，这是肿瘤学中的重要基准。此外，GALLIUM研究也因使用比利妥昔单抗更高剂量的奥比妥珠单抗而受到批评，这可能混淆了PFS结果。两种在Fc域具有氨基酸替代以增加ADCC的抗体已获得FDA批准：HER2抗体Margetuximab和CD19抗体Tafasitamab（见表1）。III期试验比较了Margetuximab与曲妥珠单抗（Fc未经修饰的HER2抗体）在乳腺癌患者中的疗效。尽管早期分析显示Margetuximab减少了癌症进展，但最终分析中两组的总体生存率相同。基于这些临床试验结果，Fc工程化抗体治疗癌症患者的益处仍然不清楚。 2.5.3 免疫检查点抑制剂 在过去十年中，另一组靶向免疫细胞调节检查点的单特异性抗体对癌症患者显示出显著的临床疗效。目前11种FDA批准和EMA批准的免疫检查点抑制抗体现在被用于治疗20多种不同类型的癌症，包括肺癌、黑色素瘤、肾细胞癌、头颈鳞状细胞癌（见图4a,b），预计近期将有更多的这些抑制性抗体获得批准（见表1）。免疫检查点抑制剂在大多数癌症类型中显示出20-30%的响应率。然而，某些恶性肿瘤如霍奇金淋巴瘤和皮肤癌、微卫星高度不稳定性（MSI-H）癌症、PDL1表达升高的癌症、突变负担高（每兆碱基≥10个突变），以及与病毒相关的一些癌症的响应率显著更高。 2.5.4 作用机制 免疫检查点阻断抗体抑制了对T细胞起负向调节作用的途径，从而重新激活细胞毒性T细胞以杀死癌细胞（见图2）。在临床试验中正在研究的20多个免疫检查点中，治疗性抗体已经获得FDA或EMA批准的三个蛋白或途径是CTLA4、PD1-PDL1和LAG3。免疫检查点抑制剂的作用机制已在其他综述文章中广泛讨论，因此这里只简要提及。CTLA4、PD1和LAG3的表达是在T细胞刺激后诱导的，其主要目的是限制T细胞激活的程度。PD1与其配体PDL1和PDL2相互作用，这在癌细胞表面经常过度表达。PD1与其配体的结合导致招募酪氨酸磷酸酶，该磷酸酶去磷酸化T细胞受体（TCR）下游的信号分子。这阻止了TCR介导的T细胞增殖（信号1），并减弱了T细胞对癌细胞的响应，使肿瘤能够逃避免疫系统。CTLA4与T细胞共刺激受体CD28竞争结合抗原呈递细胞（APCs）上的CD80和CD86。CTLA4与这些配体的结合阻止了CD28共受体信号传导（信号2），从而抑制T细胞激活并损害对癌症的免疫反应。同样，当LAG3与主要组织相容性复合体（MHC）II类分子或纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）结合时，LAG3表达对T细胞和NK细胞功能的负向调节作用。破坏这些相互作用的抗体通过降低激活阈值允许增强的T细胞激活，使耗尽的T细胞“重新激活”，并将新的T细胞克隆招募到肿瘤中。免疫检查点抑制剂也可能对调节性T细胞（Treg细胞）有不同的影响，这是一群在肿瘤微环境中抑制免疫活动的T细胞亚群。一些使用小鼠模型和人类体外模型的研究表明，PD1和CTLA4阻断可以选择性地耗尽Treg细胞并增强抗肿瘤免疫。然而，在接受免疫检查点抑制剂治疗的患者中并未观察到这种Treg细胞耗竭，因此，与Treg细胞失活相比，细胞毒性T细胞的压倒性重新激活可能是推动免疫检查点抑制剂介导的肿瘤回归。 图3 | 抗体-抗原相互作用的结构基础。a, 针对人表皮生长因子受体2 (HER2) 的抗体结合不同的HER2表位。冷冻电镜 (cryo-EM) 结构显示了与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的片段抗原结合 (Fab) 域结合的HER2胞外域 (ECD)（PDB ID: 8Q6J）。b, CD20同源二聚体与两个利妥昔单抗Fab域复合物的冷冻电镜结构（PDB ID: 6VJA）显示每个CD20分子与一个利妥昔单抗Fab结合。利妥昔单抗通过交联CD20二聚体形成大的超分子复合物来促进CD20的聚集。c, 针对程序性细胞死亡蛋白1 (PD1) 的抗体结合不同的PD1表位。Pembrolizumab Fab（橙色和金色；PDB ID: 5GGS）和Nivolumab Fab（洋红色和粉色；PDB ID: 5GGR）与PD1配体1 (PDL1)（白色）在PD1（青绿色）上的结合位点重叠，阻止了PD1-PDL1相互作用。所有蛋白质分子都显示了表面表示。d, PD1-PDL2（PDB ID: 6UMT）和PDL1抗体Atezolizumab（PDB ID: 5XXY）结构的对齐。结构分析表明，PDL2的残基Trp100适合PD1内部的口袋并有助于PD1-PDL2结合。PDL2中同样的残基（Trp100）扰乱了Atezolizumab与PDL2的结合。e, Ipilimumab（PDB ID: 5TRU）和Tremelimumab（PDB ID: 5GGV）Fab域与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA4)的复合物结构显示出具有大的埋藏表面积的类似结合表位，有效地竞争天然配体CD80和CD86的结合。f, p53(R175H)多肽-主要组织相容性复合物 (MHC) 结合抗体平行于MHC分子内部的肽结合槽结合（PDB ID: 6W51）。相比之下，p53(R175H)特异性T细胞受体 (TCR) 垂直于肽结合槽结合（PDB ID: 6VQO）。 PD1阻断抗体是目前使用最广泛的免疫检查点抑制剂。七种获批的PD1阻断抗体（nivolumab、pembrolizumab、cemiplimab、dostarlimab、retifanlimab、tislelizumab和toripalimab）和两种目前正在临床试验中的抗体（见表1）使用IgG4格式，该格式不能有效地激活补体级联反应，并且与IgG1亚型相比具有较弱的Fc受体结合。因此，IgG4格式可能保护表达PD1的效应T细胞不被意外地通过ADCC或CDC杀死。针对LAG3的抗体relatlimab也使用类似的IgG4格式。所有IgG4抗体都带有S228P突变以防止Fab臂交换（见表1）。在获批的PD1抗体中，只有pembrolizumab的全长结构已被确定。该结构揭示了Fc域内CH2域旋转，完全暴露了糖蛋白。与其他报道的Fc域结构相比，这种CH2域构象是这些IgG亚类的分子灵活性的新描述，并且可以进一步研究以了解这种构象如何有助于较弱的Fc受体结合。相比之下，PDL1和CTLA4阻断抗体使用IgG1格式。尽管atezolizumab和durvalumab使用修饰过的Fc域限制了FcR介导的效应功能，avelumab和ipilimumab使用未修饰的Fc域保留了CDC和ADCC活性。尽管在临床试验中没有PD1和PDL1阻断抗体的直接比较以确定它们的效力，但对PD1途径阻断抗体的临床试验的荟萃分析得出结论，PD1抗体比PDL1抗体略为有效，可能是因为PD1抗体阻断了PD1与PDL1和PDL2的相互作用。值得注意的是，使用具有功能性Fc区域的IgG1格式的avelumab在肺癌、卵巢癌、胃癌和头颈癌患者中未能表现出益处，尽管其他免疫检查点抑制剂在这些相同癌症类型的患者中表现出成功。因此，使用IgG1格式及其介导效应T细胞杀伤的潜力可能导致其次优的试验结果。 已经确定了本文描述的几种免疫检查点抑制剂抗体与其目标蛋白复合物的结构基础。这些结构揭示了表位界面的多样性、复合物的埋藏表面积以及抗体结合后目标蛋白的构象变化。两种PD1阻断抗体，pembrolizumab（PDB ID：5GGS）和nivolumab（PDB ID：5GGR），尽管每种抗体与PDL1配体结合位点广泛重叠，但它们在不同的表位结合PD1（见图3c）。PDL1靶向抗体（atezolizumab、durvalumab、avelumab）与PDL1和PDL2复合物的晶体结构鉴定了一个关键残基PDL2（Trp100），它阻碍了抗PDL1抗体与PDL2的结合，并提供了PDL1和PDL2之间选择性的机制[92,95,96]（PDB ID：5XXY）（见图3d）。PDL1中相应的残基是丙氨酸，允许PDL1与atezolizumab结合。与PD1结合抗体相比，两种CTLA4靶向抗体，ipilimumab（PDB ID：5XJ3）和tremelimumab（PDB ID：5GGV），共享类似的结合表位，有效地与天然配体CD80和CD86竞争（见图3e）。与CD86相比，抗体与CTLA4复合物更大的埋藏表面积（约600 Ų）有助于这种作用机制。 2.5.5 免疫检查点抑制剂的毒性 免疫检查点阻断抗体通过普遍的免疫激活介导癌细胞的死亡，但有时这种激活可能会错误地针对健康组织。免疫检查点抑制抗体具有非常明显的不良反应谱，被称为免疫相关不良事件（irAEs）。这些irAEs包括各种表现，如皮肤、胃肠道、肝脏、内分泌、肺和心脏事件。尽管不常见，但严重的甚至可能致命的毒性偶尔可能会由于免疫检查点抑制而产生。在许多情况下，需要暂时使用糖皮质激素、肿瘤坏死因子（TNF）拮抗剂、麦考酚酸莫非尔或其他免疫调节剂进行免疫抑制以管理irAEs。 2.6 双特异性抗体格式 第二种格式包括多样化的双特异性抗体类别。与单特异性抗体不同，双特异性抗体结合两种不同的抗原或表位。这些抗原可以位于相同的目标细胞上，也可以位于不同的细胞上。针对两种不同细胞的双特异性抗体主要是T细胞激活剂，将癌细胞与效应T细胞交联；因此，它们被称为T细胞激活剂（TCE）双特异性抗体。在交联后，效应T细胞被激活，通过释放细胞毒性颗粒和淋巴因子来杀死结合的目标癌细胞（见图2）。另一类双特异性抗体作用于同一目标细胞表达的不同抗原，如两种不同的生长因子受体。这样的双特异性抗体通过阻断目标生长因子受体的增殖信号，并通过激活NK细胞和巨噬细胞对抗癌细胞来杀死目标细胞。 2.6.1 双特异性T细胞激活剂 2014年Blinatumomab的监管批准导致这种基于抗体治疗的类别爆炸性增长。原型TCE双特异性Blinatumomab是一种小型54-kDa融合蛋白，大约是IgG抗体的三分之一大小（见表2）。Blinatumomab由双特异性抗体所需的最小元素组成；一个针对癌症的scFv（抗CD19）通过甘氨酸-丝氨酸肽连接与一个T细胞结合scFv（抗CD3）连接。Blinatumomab通过抗CD19 scFv结合B细胞，并同时通过抗CD3 scFv连接并激活T细胞，导致B细胞死亡（见图2）。Blinatumomab在一系列B细胞恶性肿瘤中显示出活性（见图4c,d），并获得批准用于治疗B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）。随后获得监管批准的TCE双特异性抗体采用了Blinatumomab的基本设计（见图5a）。 图4 | 使用免疫检查点抑制剂或双特异性抗体重新激活或重新定向T细胞对癌细胞的治疗效果。a,b, 来自一位患有头颈鳞状细胞癌（HNSCC）并涉及左侧舌边缘的个体的氟脱氧葡萄糖（FDG）-正电子发射断层扫描（PET）图像（a）和用苏木精和伊红（H&E）染色的肿瘤切片（b）。该患者接受了免疫检查点抑制剂nivolumab和ipilimumab的治疗，并经历了肿瘤负担的大幅减少。治疗中的H&E切片显示角蛋白碎片（KD）和周围的多核巨细胞（箭头）以及治疗中的FDG-PET图像显示舌边缘FDG摄取的减少。c, 一位患有B细胞淋巴瘤的患者的CT扫描，在治疗前和接受靶向CD19的双特异性抗体T细胞激活剂blinatumomab治疗4周后。该患者对blinatumomab有部分反应。箭头指向纵隔中受累的淋巴结肿瘤。d, 另一位患有B细胞淋巴瘤的患者的骨髓活检样本，在治疗前和接受blinatumomab治疗15天后。肿瘤细胞以蓝色显示（苏木精染色），T细胞以棕色显示（CD3染色）。部分a和b改编自，Springer Nature。部分c和d经，AAAS许可转载。 制药公司经常为使用不同架构和组装双特异性抗体的方法的独特TCE格式注册商标。常见的格式包括双特异性T细胞激活剂（BiTE）（Amgen）、Duobody（Genmab）、DART（MacroGenics）和Xmab（Xencor），Blinatumomab使用BiTE格式。Tebentafusp是一种独特的TCE双特异性格式，名为ImmTAC，它将针对黑色素瘤细胞中表达的糖蛋白-100（gp100）-人类白细胞抗原（HLA）-A02复合物的亲和增强型TCR与抗CD3 scFv连接。Tebentafusp在转移性葡萄膜黑色素瘤患者中显示出优越的总生存率，导致其在2022年获得批准。在过去的2年中，有六种针对血液恶性肿瘤的新型双特异性抗体获得了监管批准。这些包括teclistamab和elranatamab（BCMAxCD3），以及talquetamab（G蛋白偶联受体家族C组5成员D（GPRC5D）xCD3）用于多发性骨髓瘤，以及mosunetuzumab、epcoritamab和glofitamab（CD20xCD3）用于B细胞淋巴瘤（见表2）。然而，TCE双特异性抗体在实体瘤中的批准落后。然而，针对实体恶性肿瘤的TCE双特异性抗体的临床试验激增，让人们看到了这一策略将增加其效用的广度的希望。最近有关针对小细胞肺癌中delta样蛋白3（DLL3）的TCE双特异性抗体的I期试验的积极报告令人鼓舞，并表明实体瘤障碍将被突破。 2.6.2 双特异性抗体靶向同一细胞上的不同抗原 双特异性抗体也被设计为结合目标癌细胞上的两种不同的抗原或表位，而无需与效应T细胞结合。它们的抗癌效果是通过阻断两条增殖信号通路来介导的，从而最大化了抗肿瘤活性。除了它们的受体阻断活性外，这些双特异性抗体还可能被设计为包含一个功能性的IgG1 Fc域，使它们能够通过非T细胞的免疫效应途径如ADCC、ADCP和CDC杀死癌细胞。Amivantamab是首个靶向癌细胞表达的EGFR和MET（表2）的受体阻断双特异性抗体，并获得监管批准用于治疗带有外显子20插入突变的非小细胞肺癌。Amivantamab阻断了EGFR和MET通路的信号传导，这些通路驱动了一部分肺癌，比单一受体结合抗体的组合更有效。此外，Amivantamab的IgG1 Fc域被设计为低岩藻糖水平，这增强了FcγRIIIa的结合和NK细胞介导的ADCC。Zanidatamab采用了类似的双特异性设计，它用每个Fab臂结合两种不同的HER2表位（表2）。这些臂针对HER2的第二个和第四个亚域，分别是已批准用于治疗HER2阳性乳腺癌的HER2靶向抗体帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的结合位点。临床前研究表明，与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合相比，Zanidatamab增强了HER2聚集、受体下调，并增加了CDC介导的HER2阳性癌细胞的杀伤。在I期临床试验中，Zanidatamab对一系列HER2阳性实体瘤显示出令人鼓舞的活性。 ADCC，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；ALL，急性淋巴细胞性白血病；CRS，细胞因子释放综合征；Ig，免疫球蛋白；irAEs，免疫相关不良事件；IV，静脉注射；kDa，千道尔顿；scFv，单链可变片段；TLS，肿瘤溶解综合征。带有Fc的双特异性抗体还带有Fc突变，这些突变使得异源重链能够配对（未显示）。 2.6.3 双特异性抗体Fc工程 Blinatumomab的血清半衰期很短，大约为2小时，因为这种小多肽可以快速被肾脏清除，并且缺乏FcRn介导的循环所需的Fc域。由于其半衰期短，Blinatumomab通过连续静脉输注给药，以维持一致的血清浓度。连续输注装置需要额外的医疗资源，增加成本，并且与间歇输注相比，对患者来说不够方便。在Blinatumomab之后获得监管批准的双特异性抗体具有更高的分子量，大多数包含一个延长半衰期的Fc域（见表2）。具体来说，Tebentafusp的分子量约为75kDa，高于肾脏滤过的截止值，因此不会被肾脏快速清除。然而，Tebentafusp缺乏Fc域，因此具有相对较短的半衰期为7.5小时。Mosunetuzumab、Teclistamab、Epcoritamab、Glofitamab和Elranatamab包含IgG1、IgG2或IgG4 Fc域（见表2），这增加了它们的分子量超过Tebentafusp（约145kDa），并使FcRn能够结合。这些修改延长了血清半衰期，并允许间歇（每周）剂量。添加这样的Fc域倾向于被包括在所有即将到来的双特异性抗体设计中。由于IgG1 Fc片段对巨噬细胞和NK细胞上的Fcγ受体有很强的亲和力，带有IgG1 Fc片段的TCE双特异性抗体可能通过抗CD3 scFv与巨噬细胞或NK细胞（通过IgG1 Fc片段）交联，导致巨噬细胞或NK细胞无意中杀死T细胞，反之亦然。已经在Fc域引入了氨基酸替代（例如，在Mosunetuzumab中的N297G或在Glofitamab中的P329G、L234A和L235A）以消除FcγR结合并减少无意中的免疫细胞杀伤（见表2）。使用IgG2或IgG4 Fc域的TCE双特异性抗体可能不需要这样的Fc域沉默，因为它们与FcγRs的相互作用较弱。 2.6.4 双特异性抗体的毒性 TCE双特异性抗体由于使用相同的抗癌机制——通过T细胞激活来杀死目标细胞（表2），因此具有类似的不良反应。毒性水平与携带TCE双特异性抗体靶标的细胞（肿瘤或正常细胞）的总身体负担有关。TCE双特异性抗体可诱导全身性炎症，特征为发热、不同程度的缺氧、低血压，偶尔多器官衰竭，统称为细胞因子释放综合征（CRS）。神经毒性是与TCE双特异性抗体相关的另一种独特的不良反应，表现为意识混乱和震颤，以及言语和行为的改变。CRS和神经毒性的病理生理学尚不完全清楚，可能与干扰素γ（IFNγ）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-1和IL-10等细胞因子水平升高有关。接受TCE双特异性抗体治疗的患者需要密切监测，可能需要使用糖皮质激素或抗细胞因子药物如IL-6中和抗体tocilizumab进行免疫抑制。此外，为预防或减少CRS和神经毒性，已实施了几种策略，包括逐渐增加TCE双特异性抗体剂量、预防性糖皮质激素，以及在开始TCE双特异性抗体治疗前使用化疗减少肿瘤负担。受体阻断双特异性抗体无法激活T细胞，因此不会引起TCE双特异性抗体通常观察到的CRS或神经毒性。受体阻断双特异性抗体的不良反应与它们的单特异性抗体类似，如amivantamab引起的皮疹（也见于靶向EGFR的抗体cetuximab和panitumumab）和zanidatamab引起的心力衰竭（也见于靶向HER2的抗体trastuzumab）（表2）。 图5 | 双特异性抗体和偶联抗体的发展时间线。a, 双特异性抗体的时间线。b, 药物偶联、免疫毒素偶联和放射性同位素偶联抗体的时间线。a Catumaxomab，一种上皮细胞黏附分子(EpCAM)xCD3双特异性抗体，于2009年获得欧洲药品管理局(EMA)批准用于治疗恶性腹水，但后来因商业原因被制造商撤回。ADC, 抗体-药物偶联物；ALL, 急性淋巴细胞性白血病；B-ALL, B细胞前体急性淋巴细胞性白血病；BCMA, B细胞成熟抗原；AML, 急性髓系白血病；CEA, 癌胚抗原；EGFR, 表皮生长因子受体；FDA, 美国食品药品监督管理局；gp100, 糖蛋白100；HCL, 毛细胞白血病；MRD, 最小残留病；NHL, 非霍奇金淋巴瘤；NSCLC, 非小细胞肺癌；OS, 总生存期；PFS, 无进展生存期；TCR, T细胞受体。 2.7 偶联抗体格式 第三种主要格式涉及与有毒载荷连接的抗体，如细胞毒素（抗体-药物偶联物（ADCs））、细菌或植物毒素（免疫毒素）或放射性同位素，这增强了抗体杀死癌细胞的能力。在这一组中，ADCs迄今为止是最广泛使用的形式，而毒素偶联和放射性同位素偶联抗体尚未得到广泛采用（见图5b）。 2.7.1 抗体-药物偶联物 ADCs是通过将肿瘤靶向抗体与细胞毒素连接而构建的（见图2）。ADC分子与细胞表面抗原的结合导致它们的内化，随后在细胞内释放细胞毒素。这允许选择性地将细胞毒素输送到癌细胞，同时保留大部分健康组织。ADC的关键组成部分包括肿瘤靶向抗体、细胞毒素和连接抗体与细胞毒素的连接子（表3）。ADC的成功取决于这些关键组成部分的最佳选择，以及用于将连接子连接到抗体的偶联方法，这通常决定了药物-抗体比率（DAR）。 大多数ADC使用人源化或人类IgG1作为肿瘤靶向抗体（除了brentuximab使用嵌合IgG1，以及gemtuzumab和inotuzumab使用人源化IgG4）。如上所述，使用IgG1的普及是由于其长的血浆半衰期约为21天（例如，与IgG3的半衰期为7天相比），以及其能够结合Fc受体，通过ADCC和ADCP增强靶细胞的杀伤（例如，与在ADCC和ADCP中效率较低的IgG2和IgG4相比）。两种ADC，gemtuzumab和inotuzumab，使用IgG4，其对FcγRII和FcγRIII的亲和力较低，从而限制了ADCP，同时可能由于减少了ADC通过Fc受体进入免疫细胞的非特异性吸收，而减少了毒性。 大多数连接子将细胞毒素连接到IgG1抗体主链上的随机赖氨酸或半胱氨酸残基上。一个有效的连接子在血液中最小化细胞毒素的早期释放，同时促进在首选目标位置的活性药物的控制释放。连接子通常被分类为可裂解和不可裂解。十二种获批的ADC中有十种使用可裂解连接子，如肽连接子、腙连接子、二硫键连接子或CL2A连接子（表3）。最早开发的用于药物附着的连接子之一是使用腙键的可裂解连接子。这种连接子用于将抗肿瘤抗生素calicheamicin连接到gemtuzumab和inotuzumab ADCs。腙键设计为在靶细胞溶酶体内部的酸性条件下分解，以释放calicheamicin。然而，腙键可能在血浆中发生水解，导致药物分子的非预期释放，从而引起系统毒性。第二种可裂解连接子是肽连接子，需要在溶酶体内部通过cathepsin B选择性裂解。四种ADC使用mc-VC-PABC二肽连接子，由Seagen首次开发用于生成使用CD30靶向抗体连接到微管抑制剂单甲基auristatin E (MMAE)的ADC brentuximab（表3）。Brentuximab与化疗结合在几种不同类型的淋巴瘤患者中显示出显著的疗效，并被认为是霍奇金淋巴瘤和CD30+外周T细胞淋巴瘤的一线治疗标准。Brentuximab的成功导致了mc-VC-PABC二肽连接子的广泛采用。Seagen与Roche、Astellas和Genmab合作，分别使用mc-VC-PABC二肽连接子开发了靶向CD79B、nectin-4和TF的ADC。第三种可裂解连接子是二硫键连接子，其中连接子裂解是通过细胞内部高浓度的谷胱甘肽介导的。带有二硫键连接子的ADC包括mirvetuximab，在卵巢癌患者的III期临床试验中显示了生存益处。与可裂解连接子相比，不可裂解连接子对各种分解机制都有抵抗力。有效载荷在靶细胞的溶酶体内降解抗体后释放。两种ADC，trastuzumab emtansine和belantamab mafodotin使用不可裂解连接子进行药物附着。临床前研究表明，由于不可裂解连接子的血浆稳定性增加，对非靶细胞的毒性较低。然而，可裂解和不可裂解连接子尚未在临床试验中直接比较，一个比另一个的优势仍然不清楚。 肿瘤细胞杀伤过程由附着在肿瘤靶向抗体上的细胞毒素执行。药物通常是一种具有高细胞杀伤效力的小分子（半数最大抑制浓度（IC50）≤5纳摩尔），通过三种机制之一诱导细胞死亡——直接DNA损伤、破坏微管网络或抑制拓扑异构酶活性（表3）。目前使用的药物IC50差异很大，从5纳摩尔（Dxd，一种拓扑异构酶抑制剂）到5皮摩尔（pyrrolobenzodiazepines (PBDs)，一类DNA损伤剂）。然而，ADC的效力取决于药物的IC50和DAR。因此，带有强效PBD载荷和相对较低DAR约2.3的loncastuximab tesirine，以及带有效力较低的载荷Dxd但相对较高DAR约8.0的trastuzumab deruxtecan，都能在几种体内模型中诱导完全的肿瘤回归。在临床试验中也观察到了带有高DAR的ADC结合新型连接子设计的益处。Trastuzumab emtansine和trastuzumab deruxtecan共享相同的HER2靶向抗体。然而，尽管trastuzumab emtansine携带微管抑制剂DM1（IC50为2纳摩尔，DAR 3.5）通过不可裂解连接子结合，trastuzumab deruxtecan使用药物Dxd（IC50为5纳摩尔，DAR 8.0）与可裂解连接子结合。在比较两种ADC的III期临床试验中，trastuzumab deruxtecan显示出更高的反应率（79.7%对34.2%）和总生存率（94.1%对85.9%，在12个月时）。此外，trastuzumab deruxtecan延长了表达低水平HER2的乳腺癌患者的生存期，使其成为第一种在HER2低表达乳腺癌中有效的ADC。最近，fam-trastuzumab deruxtecan在一系列高HER2表达的实体瘤中显示了肿瘤回归，并获得了FDA对肿瘤不可知论HER2导向治疗的首次批准。 2.7.2 ADCs 的毒性 ADCs被认为是靶向药物，比传统的细胞毒素化疗药物有更好的耐受性。然而，大多数患者在使用ADCs时会经历某种形式的毒性。大多数ADCs共有的毒性包括输液反应、细胞减少症、感染、肝酶升高、胃肠道症状（腹泻、呕吐和便秘）和胚胎-胎儿毒性（表3）。 DM1和DM4是美登素1的衍生物。DXd是Exatecan的衍生物，用于ADC。SN38是伊立替康的活性代谢产物。ADC，抗体-药物偶联物；ALL，急性淋巴细胞性白血病；AML，急性髓系白血病；BCMA，B细胞成熟抗原；DAR，药物-抗体比率；FRα，叶酸受体α；GSK，葛兰素史克；HER2，人表皮生长因子受体2；mc，马来酰亚胺己酰；mc-VC-PABC，马来酰亚胺己酰-缬氨酸-对氨基苄氧羰基；MMAE，单甲基奥瑞他汀E；MMAF，单甲基奥瑞他汀F；PBD，吡咯并苯并二氮杂环；PTCL，外周T细胞淋巴瘤；SMCC，琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚甲基)环己烷-1-羧酸酯；TF，组织因子；TNBC，三阴性乳腺癌。 a 2023年，FDA撤销了belantamab mafodotin的生物制品许可，EMA建议不更新其市场授权，因为确证性DREAMM-3试验未能证明无进展生存期的改善。正在进行的试验表明，belantamab可能会重新获得批准。b Trastuzumab deruxtecan获得FDA批准用于HER2低表达乳腺癌（免疫组织化学评分1+）和所有高HER2表达的实体瘤（免疫组织化学评分3+）。 某些毒性与使用特定有效载荷有关，例如与微管抑制剂（MMAE、DM1、DM4）相关的周围神经病变和与calicheamicin相关的肝毒性。其他毒性是针对共同抗原的ADCs共有的。例如，靶向HER2的ADCs可能导致心力衰竭和介导间质性肺病。 2.7.3 免疫毒素偶联物或免疫毒素 免疫毒素有两个组成部分，一个靶向抗体或抗体的Fv片段，以及通常来自细菌或植物毒素的细胞毒素。靶向抗体或Fv片段结合到目标细胞，允许选择性地输送毒素。毒素来自细菌，如假单胞菌外毒素A（PE）和白喉毒素（DT），或来自植物，如蓖麻毒素。从理论上讲，任何用于生成ADC的靶向抗体都可以用于免疫毒素。然而，尽管在过去几年中有12种ADC获得批准，只有一种免疫毒素，moxetumomab pasudotox，获得了FDA和EMA的批准，用于治疗毛细胞白血病（图2和5b）。Moxetumomab是一种融合蛋白，结合了CD22结合Fv与截断的假单胞菌外毒素A（PE38），由国家癌症研究所（NCI）的I. Pastan开发。当进入目标细胞时，PE38毒素与延伸因子2（EF2）结合并阻断蛋白质合成。Moxetumomab在毛细胞白血病患者的临床试验中展示了41%的高完全反应率，并在2018年获得监管批准。然而，由于临床采用率低，moxetumomab的生产在2023年停止。Moxetuzumab和其他研究性免疫毒素面临了几个挑战，包括高免疫原性导致治疗效力丧失和狭窄的治疗窗口导致毒性，如毛细血管渗漏综合征（CLS）和溶血性尿毒症综合征（HUS）。Moxetumomab的低采用率也可能是由于其复杂的管理过程，包括毒性预防、预处理和后处理水化、需要安全监测以避免不良反应以及在毛细胞白血病中有替代疗法的可用性。尽管过去几年的几项临床试验已经评估了靶向BCMA、间皮素和其他与癌症相关的抗原的免疫毒素的疗效，但目前没有一种正在进行监管审查，也没有预计将在不久的将来获得批准。 2.7.4 抗体-放射性同位素偶联物 抗体-放射性同位素偶联物由一个靶向抗体与一个放射性同位素链接而成。放射性同位素发射α粒子或β粒子，导致目标细胞DNA链断裂，从而导致细胞死亡。抗体-放射性同位素偶联物不需要内化就能诱导细胞死亡，这提供了与ADCs和免疫毒素相比的独特优势，包括旁观者效应。α粒子是大型带正电荷的粒子，由两个质子和两个中子组成，具有相对短的有效范围约为50-100微米。相比之下，β粒子是小型带负电荷的电子（比α粒子小约8000倍），具有较长的有效范围约为0.5-10毫米，但具有较少的DNA损伤能量。β粒子发射体的例子包括碘-131、镥-177和钇-90。两种获得FDA批准和/或EMA批准的抗体-放射性同位素偶联物，90Y-ibritumomab和131I-tositumomab，将β粒子发射放射性核素连接到靶向CD20的抗体上（图2和5b），用于治疗B细胞淋巴瘤。90Y-ibritumomab和131I-tositumomab在临床试验中展示了65-80%的总反应率和20-30%的完全反应率。两项研究都观察到了一些可预测的治疗相关不良效果，包括由于健康骨髓暴露于辐射而导致的长期严重细胞减少症，131I-tositumomab的放射性碘引起的甲状腺功能减退症，以及继发性恶性肿瘤，如骨髓增生异常综合征（MDS）和白血病。尽管有高反应率，这些药物并未得到广泛的临床使用，2012年只有75名患者接受了131I-tositumomab治疗。因此，131I-tositumomab在2013年自愿撤回。90Y-ibritumomab仍然适用于复发或难治性低级别B细胞淋巴瘤患者，但报告表明只有少数患者正在接受这种治疗。批准数量有限和临床采用率低可能是因为需要一个多学科团队，包括医学肿瘤学家、放射肿瘤学家、药理学家和物理学家，来开发并在临床上部署这些分子。很少有中心具备这样的能力，因此，抗体-放射性同位素偶联物的使用落后于ADCs。 3. 挑战与未来展望 肿瘤药物开发是一个艰难的过程，成功率为3-7%。目前尚缺乏针对肿瘤学中抗体基础治疗的成功率数据，但大约18%进入I期临床试验的治疗性抗体（包括肿瘤学在内的所有适应症）会继续进行药物上市146。这些低数字反映了药物开发过程中遇到的众多障碍。治疗性抗体的开发是一个资源密集型的多步骤操作。它需要针对目标抗原生成一定数量的抗体，然后选择几个具有理想结合和生物物理特性的领先候选物。然后，领先的抗体会在体内使用小鼠模型进行有效性测试，使用非人灵长类动物进行毒性和药代动力学测试，随后进行人体首次临床试验。尽管在小鼠模型中显示出有希望的有效性，但多种抗体由于在非人灵长类动物或人体首次临床试验中的毒性而未能通过临床开发。尽管存在这些障碍，但以下描述的几种抗体显示出令人鼓舞的临床前和临床数据，可能会在未来几年改变患者护理。 3.1 新靶点  实体瘤构成了新癌症患者的大多数。与实体瘤相关的患者中有相当一部分以转移性疾病出现，需要系统性治疗，这种治疗很少是治愈性的。因此，转移性肺、结肠、胰腺、乳腺、前列腺、肝脏和胆管癌共同导致了大多数癌症死亡（见图6）。然而，与血液恶性肿瘤相比，实体瘤的抗体开发滞后主要是因为缺乏可靶向的抗原。不同的淋巴瘤亚型约占所有癌症死亡的3%，并且有五种肿瘤抗原（CD19、CD20、CD79b、CD30、CCR4和PD1）被治疗性抗体靶向。相比之下，约占癌症死亡21%的肺癌只有一个可靶向的肿瘤抗原（EGFR-MET）。此外，约占癌症死亡8%的胰腺癌、6%的前列腺癌和3%的脑癌完全没有FDA批准和/或EMA批准的治疗性抗体。这种差异很大程度上是因为淋巴瘤和骨髓瘤起源于正常的B细胞，这些细胞表达明显的可靶向抗原（见图6）。此外，正常的B细胞可以在不产生不可忍受的后果的情况下被根除。不幸的是，在实体瘤中，目标抗原的发现很少带来线索。因此，新的靶点鉴定可能需要涉及对大量患者样本进行单细胞测序，以寻找在癌症和正常组织中差异表达的抗原。 图6 | 常见实体瘤和血液瘤的抗体靶点。这些图表显示了美国前15位癌症类型的死亡百分比与批准的抗体及晚期临床试验中的抗体所靶向的独特抗原数量。抗原靶点在每种癌症组织旁边展示。注意，非小细胞和 小细胞肺癌被归类在“肺”下；霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和中枢神经系统（CNS）淋巴瘤被归类在“淋巴瘤”下；急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性髓系白血病（CML）和其他白血病被归类在“白血病”下。不论组织类型，微卫星高度不稳定（MSI-H）癌症都有资格接受免疫检查点抑制剂治疗，HER2阳性实体瘤有资格接受HER2导向治疗的trastuzumab deruxtecan，并未包括在分析中。镥Lu177 vipivotide tetraxetan用于前列腺癌的治疗没有被包括在内，因为靶向部分不是抗体。癌症死亡百分比和批准的靶点数量的数据分别来自 https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics/all-cancer-facts-figures/2023-cancer-facts-figures.html 和抗体协会。a 程序性细胞死亡蛋白1（PD1）治疗仅在霍奇金淋巴瘤中获批。b B7-H3被认为是肿瘤相关抗原，可能是免疫检查点抗原。 此外，最近针对claudins、HER3、成纤维细胞生长因子受体2B (FGFR2B)、DLL3、结缔组织生长因子（CTGF，亦称CCN2）和前列腺六跨膜上皮抗原1 (STEAP1)的临床试验显示出令人鼓舞的结果。目前正在II/III期临床试验中的抗体靶点列在图6和补充表2中。最后，一种创新的方法来绕过缺乏肿瘤特异性抗原是通过多种抗原的组合靶向。大多数癌症缺乏在健康组织中不存在的真正特异性抗原的表达。因此，靶向只在肿瘤中共同表达而不在健康组织中表达的抗原组合，可能提供一条可行的治疗途径。利用布尔逻辑AND门的临床前研究，需要两个或三个目标激活细胞毒性机制，已经展示了肿瘤回归，但它们尚未在临床试验中得到测试。 一些细胞表面蛋白聚糖，如软骨素和肝素，是癌症和其他人类疾病中信号通路的重要调节因子。软骨素蛋白聚糖已被证明促进肿瘤血管化，并调节与肿瘤生长相关的信号传导途径，它们在多种癌症类型中表达。糖磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定的细胞表面HSPGs，如glypicans，在癌症中过度表达，表明它们是潜在的肿瘤相关抗原。已经开发了针对GPC1、GPC2和GPC3的抗体和CAR T细胞，分别用于治疗胰腺癌、神经母细胞瘤和肝癌。 3.1.1 肿瘤特异性抗原 大多数目前批准的基于抗体的治疗针对肿瘤相关抗原或组织特异性抗原。肿瘤相关抗原，如HER2，在癌细胞中过度表达，但也由正常组织的一个亚群表达，尽管表达水平较低。癌症和正常组织之间表达水平的差异提供了治疗窗口。组织特异性抗原，如CD20，在癌细胞（B细胞淋巴瘤）和正常细胞（B细胞）中表达水平相似。针对这类组织特异性抗原的治疗旨在同时消除正常细胞和癌细胞，因为正常B细胞的耗尽可能在临床上是可以接受的。针对B细胞谱系癌症的CD19、CD20、CD38和BCMA的治疗代表了组织特异性治疗性抗体最成功的例子。对于起源于较少可有可无的组织如T细胞的癌症，针对TCR β链恒定区 (TRBC) 和TCR β链可变区 (TRBV) 的抗体已经开发出来，以靶向所有克隆性癌细胞，但只针对正常T细胞的一部分，从而保留足够的正常组织以执行其功能。一些新兴的抗体靶点包括肿瘤特异性抗原，这些抗原仅由癌细胞表达，不由正常细胞表达。肿瘤特异性抗原的主要例子是新抗原，它们是由MHC分子呈递的突变肽。这些突变肽是携带来自癌症细胞标志性突变（点突变、小插入/删除、移码突变、融合和剪接变体）的蛋白质的氨基酸变化的短蛋白质水解产物。来自诸如BRAF、RAS、PIK3CA、TP53和异柠檬酸脱氢酶（IDH）等突变癌症驱动基因的公共新抗原，为癌细胞提供了极其独特的靶点，可以用来造福患者。这些公共新抗原目前正在被双特异性抗体靶向，并且在针对携带TP53和RAS突变的癌症的临床前研究中显示出令人鼓舞的活性。已经有多方面的努力描述了抗体识别新抗原的结构基础。p53(R175H)突变肽-MHC与p53(R175H)特异性TCRs和抗体复合物的晶体结构已经确定。TCRs共享一个明显的“规范”垂直结合取向至肽-MHC分子，偏向突变位点。相比之下，p53(R175H)新抗原特异性抗体使用一种非规范的并行结合模型沿肽的长度（见图3f）。此外，抗体对p53(R175H)新抗原的亲和力比相应的TCR高约100倍。不同的结合模式可能有助于抗体的特异性和高亲和力。 3.1.2 细胞内抗原 抗体无法穿透细胞膜，因此只能靶向细胞表面抗原。细胞内抗原可以与MHC分子相关联地呈现在细胞表面，使它们成为可靶向的。以这种方式，tebentafusp靶向细胞内抗原gp100，该抗原在黑色素瘤中过度表达，并与HLA-A*02:01相关联呈现在细胞表面。目前正在开发抗体以靶向诸如人类端粒酶逆转录酶（hTERT）、MUC1、NY-ESO1、TCR γ替代阅读框蛋白（TARP）、p53、WT1和黑色素瘤优先表达抗原（PRAME）等癌细胞特异性过度表达的细胞内蛋白，其中针对PRAME的靶向在临床试验中显示出令人鼓舞的初步结果。 3.1.3 肿瘤微环境中的抗原 癌症发展于一个复杂的免疫细胞、成纤维细胞和细胞外基质的混合物中，这被称为肿瘤微环境。早期基于抗体的针对癌症相关成纤维细胞或细胞外基质的靶向尝试未能产生临床效益。目前的研究表明，肿瘤微环境中的免疫细胞如肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、树突细胞和骨髓源抑制细胞（MDSCs）是众所周知的驱动对免疫检查点抑制剂的抗性的因素。因此，耗尽或阻断这些免疫抑制细胞的功能可能使肿瘤对免疫检查点抑制剂敏感。早期阶段的临床试验已经证明了通过靶向巨噬细胞集落刺激因子1受体（CSF1R）、髓细胞表达触发受体1（TREM1）和TREM2的抗体介导的TAMs抑制的安全性和可行性。临床前研究也表明，使用激动性CD40单克隆抗体增强肿瘤微环境中树突细胞的功能可以增强T细胞介导的肿瘤回归。针对胰腺癌患者的CD40抗体的临床试验患者耐受性良好，并已显示出增强的T细胞激活和渗透到肿瘤中。T细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3（TIM3）受体由一系列免疫细胞如淋巴细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞表达，TIM-3拮抗性抗体同样可以通过调节肿瘤微环境促进肿瘤杀伤。TIM-3拮抗性抗体与目前批准的免疫检查点抑制剂联合在实体瘤患者中展示了可控的安全概况。所有这些抗体抵消肿瘤微环境中的免疫抑制状态，目前正在进行II/III期试验，将确定它们的最终效用。 3.2 针对低密度抗原 目前批准的ADCs和双特异性抗体靶向相对丰富的抗原，如CD19、CD20和BCMA，每个癌细胞上有大约1,000到50,000份拷贝。针对新抗原的主要挑战来自于它们在癌细胞表面的低丰度，有些细胞表达的靶标抗原只有1-10份拷贝。除了新抗原，有效的靶向肿瘤相关或组织特异性抗原也可能因为它们可变的细胞表面密度而受到影响。此外，治疗压力也可能选择表达靶标抗原低的癌细胞克隆。临床前研究表明，双特异性抗体能够杀死每个细胞表达低至1-10个抗原的癌细胞，而ADCs需要1,000份或以上才能杀死细胞。未修饰的全长抗体可能需要更高目标抗原表达。针对这种低密度抗原仍然是一个挑战，优化的抗体工程使得在临床前研究中有效地靶向个位数水平的新抗原成为可能。 3.3 新型免疫检查点抑制剂 2011年ipilimumab的批准标志着免疫疗法时代的到来。免疫检查点阻断剂具有在一些复发的实体瘤患者中诱导长期缓解的前所未有的能力，这导致了大量临床试验的开展。FDA和EMA已经批准了11种不同的针对CTLA4、PD1和PDL1的抗体，用于20多种癌症类型的65多个不同的适应症。继CTLA4、PD1和PDL1靶向初步成功后，还有许多其他免疫检查点如LAG3、T细胞免疫受体含有免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)、V型免疫球蛋白抑制T细胞激活(VISTA)、TIM3、PVRIG、自然杀伤组2A(NKG2A)和OX40等被探索它们在多种癌症类型中诱导缓解的能力。除了针对黑色素瘤的LAG3的relatlimab外，其他都尚未在III期试验中展示所需的治疗活性以获得监管批准。同样，针对CD47的巨噬细胞检查点抑制剂magrolimab在早期试验中显示出令人鼓舞的活性，但在MDS和急性髓系白血病(AML)患者的III期试验中因缺乏效力而停止。目前新型免疫检查点阻断剂的表现低于预期，导致制药行业专注于PD1-PDL1领域，除了现有的九种抗体外，还有五种新的药物正在进行监管审查。尽管PD1-PDL1靶向取得了成功，但只有少数(~20%)的患者对免疫检查点阻断剂有反应，甚至更少的比例(~13%)实现持久缓解。此外，目前的免疫检查点抑制剂与相当大的并发症相关，其中约1%是致命的，约40%是慢性毒性。因此，我们需要超越PD1-PDL1抑制。这将需要改变癌症生物学研究方向和监管机构对抗体药物的批准方法。我们应该优先考虑针对新型免疫检查点调节剂的基础和转化研究，如B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、B7-H3(亦称CD276)、CD27和4-1BB，而不是重新审视已经广泛探索的PD1-PDL1轴和联合疗法。监管机构可能考虑修订批准流程，使新的PD1-PDL1阻断剂在初步III期试验中展示与竞争产品相当的疗效和毒性概况后，获得所有现有适应症的批准。 3.4 新型抗体格式 3.4.1 IgM抗体 所有全长治疗性抗体使用IgG亚型。临床前研究和早期试验正在探索五聚体IgM格式，与IgG格式中可用的两个结合位点相比，它有十个抗原结合位点。这比针对同一表位的IgG抗体提供了更高的结合亲和力。一个例子是IGM-8444，一种高亲和力的五聚体IgM激动剂抗体，针对死亡受体5 (DR5)，在小鼠模型中展示了肿瘤回归，并已进入I期试验。 3.4.2 新型双特异性格式 TCE双特异性格式不断发展，旨在提高疗效，同时减少不良反应。现在有200多种双特异性抗体正在进行临床开发，大多数使用TCE方法针对实体瘤。Glofitamab(一种CD20xCD3双特异性抗体，用于淋巴瘤)和xaluritamig(亦称AMG 509)(一种STEAP1xCD3双特异性抗体，用于前列腺癌)在临床试验中都显示出疗效，并共享一个独特的2:1 T细胞结合双特异性格式，对目标双价结合，对CD3单价结合。这种格式可能比传统的1:1目标至CD3结合设计提供增加的肿瘤细胞杀伤能力。IgM格式的TCE双特异性抗体由于使用五聚体IgM，有一个更令人印象深刻的10:1目标至CD3结合比率。高目标至CD3结合比率设计允许高亲和力目标结合，可能引发增加的目标细胞毒性，同时减少细胞因子分泌。Imvotamab(亦称IGM-2323)，一种CD20xCD3 IgM双特异性抗体的I期试验，在晚期B细胞恶性肿瘤患者中展示了几个完全反应。 3.4.3 双特异性免疫检查点阻断剂 双特异性格式也被用于同时抑制两个免疫检查点，以增强T细胞激活，超出两种单一免疫检查点阻断剂组合所能实现的。针对PD1xLAG3、PD1xCTLA4和PDL1xCTLA4的双特异性免疫检查点阻断剂在早期临床试验中显示出令人鼓舞的疗效。尽管最初的双特异性免疫检查点阻断剂组专注于抑制临床确立的免疫检查点，临床前研究正在调查是否类似的双特异性免疫检查点阻断剂可以通过靶向新型免疫受体如OX40、TIGIT和C型凝集素结构域家族9成员A (CLEC9A)来诱导抗肿瘤免疫。 3.4.4 三特异性抗体 三特异性抗体具有同时与三种不同抗原相互作用的能力。这一功能使三特异性抗体能够与两种不同的癌症相关抗原，如B细胞恶性肿瘤背景下的CD19和CD20，同时通过第三个结合域结合CD3，与细胞毒性T细胞相互作用。这种创新方法有助于减轻由于单一抗原如CD19或CD20的丢失而引起的治疗抗性，因为癌细胞必须同时下调两种抗原才能逃避杀伤。或者，三特异性抗体被设计为与两种T细胞受体，如CD3和CD28相互作用，从而对癌细胞提供更强的激活信号。 3.4.5 纳米抗体 可能引领抗体工程领域重要范式转变的一个研究领域是单域抗体（也称为纳米抗体）的开发。纳米抗体主要来源于驼类重链抗体，它们体积小、易于生产、稳定，并且能够穿透肿瘤或病毒抗原中的隐蔽位点。纳米抗体通常从驼类衍生的噬菌体展示库中分离出来，最近也从转基因小鼠如RenNano和nanomouse中分离得到。纳米抗体有一个长的CDR3环，可以穿透抗原表面的空腔。首个基于纳米抗体的靶向BCMA的CAR T细胞已获得FDA批准，并与基于抗体的CAR T细胞相比显示出改善的疗效。针对CD19或CD20和HER2的纳米抗体衍生药物目前正在临床试验中，分别用于治疗淋巴瘤和乳腺癌患者。纳米抗体是否会提供比当前基于抗体的药物更好的疗效，还有待观察。 3.4.6 可激活抗体 肿瘤微环境通常表现出较低的pH值，含有活跃的蛋白酶酶，并具有在正常组织中缺乏的特定抗原组合。这些独特的属性被用来利用可激活抗体选择性地靶向癌细胞，这些抗体会根据其环境条件的变化而获得或失去功能。在抗体序列的特定位置添加组氨酸残基，使其能够根据pH值的变化与其目标抗原结合。这一原理被用来生成一种靶向HER2的抗体，与正常组织相比，在实体肿瘤的酸性微环境中与HER2的结合更强。类似的工程导致了在酸性溶酶体内从目标抗原（HER2和CTLA4）增加抗体解离，从而促进抗原再循环和在细胞膜上的呈现，并增强抗肿瘤效果。可激活抗体还使用蛋白酶可切割的掩蔽基团来阻断表位结合位点。在肿瘤微环境中掩蔽基团的切割使抗体-抗原结合和抗肿瘤活性成为可能。具有这种掩蔽机制的抗体通常被称为前体疗法，并且正在被用来改善PDL1、CTLA4、EGFR、CD166和CD71在多种实体瘤和血液瘤中的靶向。 最后，癌细胞经常显示一种独特的抗原组合，可以区分癌细胞和非癌细胞组织。正在设计一系列抗体或类似抗体的肽，以实现针对半相合骨髓移植后产生的CD45+ HLA-A2+癌症，以及EGFR+ HER2+乳腺癌的组合性抗原靶向。 3.5 新型偶联抗体 提高ADCs的效力。目前的研究正集中在改进ADC的组成部分（靶向抗体、连接子和药物载荷），以提高ADC的疗效。临床前研究表明，IgG抗体的大分子量（约150 kDa）可能会降低组织穿透力。因此，使用缺少Fc片段的抗体或用小肿瘤靶向肽替换抗体，可能提高ADC的活性。调节连接子设计和增加药物-抗体比率（DAR）可能增强治疗效益。例如，针对细胞表面糖蛋白TROP2（sacituzumab govitecan）的ADC，由于具有高DAR，是首个提高三阴性乳腺癌患者生存率的ADC。Daiichi Sankyo开发的创新四肽连接子，用于trastuzumab deruxtecan，掩盖了载荷DXd的疏水性，并允许均匀连接大量药物，同时保持有利的药代动力学，并最小化药物过早释放到血浆中。这种连接子-载荷组合现在正被几个即将获批的ADC（datopotamab deruxtecan和patritumab deruxtecan）或正在进行临床试验的ADC（ifinatamab deruxtecan）采用。针对叶酸受体α（FRα）的Rinatabart sesutecan，也使用一种新型可裂解连接子来掩盖更具疏水性的有效载荷，即拓扑异构酶-1抑制剂exatecan，从而允许生成更强效的ADC。正在进行晚期临床试验的ADC列在补充表2中。预计这种连接子-载荷组合可以改善对肺癌和结直肠癌患者的HER2靶向，这些患者对HER2靶向ADC trastuzumab deruxtecan的反应率较低。最后，新的药物载荷，如蛋白质降解剂、RNA聚合酶抑制剂、BCL-xL抑制剂、Toll样受体（TLR）激动剂和干扰素基因刺激因子（STING）激动剂，预计将通过使用新的杀伤机制来改进ADC。连接子和偶联技术的进步有助于推动ADC相对于其他偶联格式（如毒素或放射性同位素偶联物或双特异性TCE格式）在临床上的更多采用。目前正在进行临床试验，测试新型ADCs作为单一药物或与化疗或免疫疗法联合使用，其中一些已经取得了有希望的结果。 3.5.1 免疫毒素偶联物 免疫毒素的一个明显限制是产生针对毒素的免疫反应，这降低了半衰期和效力。目前的工作集中在通过去除被宿主免疫细胞识别的表位来减少假单胞菌外毒素的免疫原性。这样的改良免疫毒素可能会提高效力，并允许免疫毒素靶向多种恶性肿瘤。白介素-毒素偶联物的产生是该领域的另一个发展，它利用癌细胞中白介素受体的过度表达。白介素-毒素偶联物的行为类似于抗体-毒素偶联物。Tagraxofusp是一种针对白介素-3受体亚单位α（IL3RA；亦称为CD123）的细胞毒素，由IL-3与白喉毒素融合而成，已被证明对患有浆细胞样树突状细胞肿瘤（BPDCN）的患者有效。同样，denileukin diftitox（2014年撤回以进行制造改进），一种针对IL-2R的细胞毒素，由IL-2与白喉毒素融合而成，对患有皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的患者有效。然而，这些IL-毒素偶联物不被视为基于抗体的药物，因为它们使用受体配体而不是scFv进行肿瘤靶向。 3.5.2 放射性同位素偶联物 在小分子偶联和肽偶联放射性同位素在实体瘤中的成功后，对放射性同位素偶联物重新产生了一些兴趣。将镥-177与一种结合前列腺特异性膜抗原（PSMA）的小分子或与生长抑素受体结合的肽类似物偶联，在前列腺癌和神经内分泌肿瘤患者中展示了显著的肿瘤回归，分别获得了FDA的批准。这种肿瘤靶向小分子-放射性同位素或肽-放射性同位素偶联物的行为类似于抗体-放射性同位素偶联物，但具有不同的结构和药代动力学特征。目前正在进行临床试验，测试针对肾细胞癌患者的碳酸酐酶IX（CAIX）的肽-放射性同位素偶联物，以及针对脑肿瘤患者的GD2、AML患者的CD33、前列腺癌患者的PSMA以及血液恶性肿瘤患者的CD45和CD37的抗体-放射性同位素偶联物。其他方法涉及将肿瘤靶向抗体与α粒子发射体如锕-225（225Ac）偶联。α粒子具有更高的DNA损伤能量加上较短的范围，可能会增加肿瘤特异性细胞毒性，同时限制对周围健康组织的辐射引起的不良反应。 3.6 选择最佳格式 目前批准的基于抗体的治疗针对由癌细胞和正常细胞亚群表达的肿瘤相关抗原。这些抗体需要一个治疗窗口，允许杀死癌细胞，同时限制对正常细胞的非肿瘤毒性。需要谨慎选择抗体格式来利用这个治疗窗口，使用不当的格式可能由于降低的治疗效力或不可接受的毒性而无效。尽管缺乏明确的定量研究和直接比较，但人们普遍认为未经修饰的抗体杀死细胞需要高抗原表达（每个细胞>10,000份拷贝），而ADCs（每个细胞>1,000份拷贝）和TCE双特异性抗体或CAR T细胞（每个细胞>10-100份拷贝）可以杀死表达较低抗原的细胞。因此，对于给定目标，从未修饰的抗体转换为ADC或TCE双特异性抗体格式可以提高效力，但也可能同时增加毒性。这种效应在HER2靶向上得到了体现。HER2由一部分乳腺癌和小胃癌以及一系列正常人类组织表达。使用裸抗体（曲妥珠单抗和帕妥珠单抗）以及后来的ADC（曲妥珠单抗emtansine）对HER2进行靶向治疗，患者耐受性良好，并在HER2高表达的患者中导致肿瘤回归。最近，trastuzumab deruxtecan，一种具有高DAR的HER2靶向ADC，甚至在对以前的HER靶向抗体无反应的低HER2表达癌症中诱导了肿瘤回归。然而，进一步降低HER2靶向阈值的抗HER2 CAR T细胞由于对肺部低HER2表达细胞的靶向、非肿瘤毒性，导致致命的呼吸衰竭。抗HER2 CAR T细胞的致命毒性提出了可能性，即可以类似地靶向低水平HER2表达细胞的HER2靶向TCE双特异性抗体，也可能带来不可接受的毒性。因此，通过双特异性抗体zanidatamab进行HER2靶向采用了双HER2结合策略，而不是TCE方法，并已证明在没有致命毒性的情况下有效。因此，“干净”的目标，即在至关重要的组织中表达最小非肿瘤（如CD19）和低密度目标（如肽-MHC分子）是TCE基础治疗的最佳选择。在非可有可无组织中有一定水平的非肿瘤表达（如HER2）的目标，最好通过未修饰的抗体、ADCs或非TCE双特异性抗体进行靶向。 需要注意的是，特定设计的非肿瘤毒性和效力也取决于目标和药物载荷。例如，DLL3由一部分小细胞肺癌患者表达。在这种情况下，由于与PBD载荷相关的高水平毒性和缺乏生存益处，rovalpituzumab tesirine，一种DLL3靶向ADC的临床开发被停止。然而，I期试验表明，通过TCE双特异性抗体tarlatamab进行DLL3靶向会导致肿瘤回归，并且患者耐受性良好。最终，选择的目标及其抗原密度可能对最佳治疗格式至关重要。 4. 结论 总结来说，由于抗体在与其目标结合时可以提供精确度，基于抗体的治疗在肿瘤领域具有巨大前景。尽管仍存在重大挑战，但新目标以及各种新设计和工程策略预计将为这些挑战提供许多解决方案。更有效的基于抗体的治疗获得监管批准的爆炸性增长可能会继续遵循过去25年的趋势。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。