CD16a x BCMA

摘要：双特异性抗体（bsAb）和多特异性抗体（msAb）包含多种格式，能够同时结合多个表位，解锁了治疗以前难以治疗或不治之症的机制。早期评估候选抗体的开发潜力可以降低潜力低的抗体的等级，并提升最有前途的候选抗体进行进一步开发。基于蛋白质的治疗需要一套严格的开发潜力要求才能具有竞争力（例如高浓度配方和长半衰期），而这些要求的评估需要一套强大的方法工具箱，其中很少有经过验证用于询问bsAbs/msAbs。在评估bsAbs/msAbs的开发潜力时，需要考虑的重要因素包括它们的分子格式、免疫原性的可能性、特异性、稳定性和高产量生产的潜力。在这里，我们总结了开发潜力评估的关键方面，并提供了如何为给定的bsAb/msAb制定全面计划的指导。 1.介绍 抗体工程的进步已经发展出了多样化的生产和纯化流程，以推进各种大小和复杂性不同的分子格式。双特异性抗体（bsAb；具有两种不同结合特异性的抗体）和多特异性抗体（msAb；具有三种或更多不同结合特异性的抗体）允许在多种疾病领域进行新颖的治疗应用。然而，与传统单克隆抗体（mAb）开发相比，实现双特异性或多特异性所需的典型抗体流程和格式的偏差带来了额外的挑战，并且与开发潜力评估的最佳实践相关的信息很少。本综述总结了bsAbs/msAbs开发潜力的关键考虑因素，这些因素在药物开发过程中集体评估时有助于最大化技术成功的可能性。 通过不变簇分化3（CD3）与靶向肿瘤相关抗原（TAA）的相互作用，招募T细胞来识别T细胞受体/主要组织相容性复合体（MHC），已有几种利用这种免疫细胞重定向策略的分子获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，包括blinatumomab（Blincyto®，抗CD19）、teclistamab（Tecvayli®，抗BCMA）、mosunetuzumab（Lunsumio®，抗CD20）、glofitamab（Columvi®，抗CD20）、talquetamab（Talvey®，抗GPRC5D）、elranatamab（Elrexfio®，抗BCMA）和epcoritamab（Epkinly®，抗CD20）。除了免疫细胞重定向，双特异性和多特异性还被用于增加对细胞亚型（例如，用于治疗转移性非小细胞肺癌的volrustomig）的特异性和克服常见的抗性途径（例如，用于治疗EGFR外显子20插入突变的非小细胞肺癌的amivantamab）。 单克隆抗体（mAbs）作为治疗多种疾病和条件的治疗选择的引入，为患者提供了许多以前未满足的医疗需求的解决方案，或者提供了比早期护理标准更有效和/或更安全的治疗。尽管mAbs的治疗成功是不可否认的，但仍有许多未满足的医疗需求。 bsAbs/msAbs是一类能够同时结合多个靶标的大分子，从而解锁了传统mAbs无法提供的新颖作用机制（MOA）和生理特性。bsAbs已被用于肿瘤学中，通过同时结合所需的免疫细胞和肿瘤细胞本身，有效地治疗多种癌症。bsAb T细胞接合器（TCEs）绕过了通过招募T细胞来识别肿瘤相关抗原的T细胞受体/主要组织相容性复合体（MHC）的需要。几种利用这种免疫细胞重定向策略的分子已经获得了FDA的批准，包括blinatumomab（Blincyto®，抗CD19）、teclistamab（Tecvayli®，抗BCMA）、mosunetuzumab（Lunsumio®，抗CD20）、glofitamab（Columvi®，抗CD20）、talquetamab（Talvey®，抗GPRC5D）、elranatamab（Elrexfio®，抗BCMA）和epcoritamab（Epkinly®，抗CD20）。除了在肿瘤学中的应用，bsAbs在2017年通过emicizumab（Hemlibra®）的批准中展示了成功，这是一种bsAb，能够识别酶因子IXa和底物因子X[凝血因子IXa（FIXa）×FX]，用于治疗血友病。 尽管FDA尚未批准任何msAbs，但在临床前和早期临床开发中已经披露了几个有前景的分子。随着我们对疾病病因学的理解的进步，bsAbs/msAbs有望通过多因素靶向潜在生物学或通过增强药代动力学（PK）和药效学（PD）属性来进一步改善结果。 虽然同时结合多个靶标的能力是bsAbs/msAbs的优势，但将多个异质结合基团整合到单个分子中也存在风险，需要在开发潜力计划中通过仔细的临床前评估、选择和修改来考虑和最小化。例如，虽然CD3 TCE bsAbs/msAbs可以有效地将T细胞与TAA结合起来，但微量杂质的存在或稳定性差可能导致异常的T细胞激活，这可能导致患者的不良反应。此外，开发潜力可能取决于上下文，如在静脉注射抗体不导致免疫原性的情况下，皮下注射相同疗法却导致免疫原性的情况，正如Janssen在voxalatamab（JNJ-63898081）中的经验，这是他们的前列腺特异性膜抗原（PSMA）×CD3 bsAb。 早期、有目的、主动的抗体开发潜力评估和修改对于最小化后期开发中昂贵且耗时的挫折以及高效地识别具有成为安全、有效和可制造治疗潜力最大的分子至关重要。 任何格式的基于抗体的治疗药物的开发路径都是漫长而复杂的，需要大量的财务和人力资源。因此，开发潜力应在药物开发过程的早期进行评估，并减轻风险，以最大化整体成功的可能性。可接受的开发潜力，此处定义为分子对药物开发和给药过程中的测试、制造、储存和给药要求的适应性，因此是任何药物开发计划成功的关键标准。与mAbs相比，bsAbs/msAbs的开发带来了额外的独特挑战，因为它们固有的结构复杂性。虽然每种bsAb/msAb格式都会呈现不同的挑战，但有广泛适用于它们开发的总体方法，可以作为起点，并在需要时在方法上进行偏差。 潜在抗体治疗的开发潜力评估是多因素的，有越来越多的工具和流程可用于协助预测低风险分子。需要考虑的重要开发潜力因素包括了解给定bsAb/msAb的分子格式，以及评估它们的免疫原性、特异性、稳定性和可制造性的策略和方法。 2.抗体格式 在人类中，天然抗体由四个多肽链组成，组织成两个相同的轻链和两个相同的重链。抗原识别是通过两个相同的可变抗原结合（Fab）区域进行的。蛋白质和抗体工程的进步带来了各种不同的bsAb/msAb格式，这些格式从免疫球蛋白（Ig）样格式变化到高度工程化的分子，这些分子与传统IgG的相似性最小，这些主题有无数的变化（图1）。这些不同的bsAb/msAb格式与传统mAbs相比具有独特的属性，并有可能实现精确的功能性属性以治疗一系列疾病。Wilkinson和Hale最近发表的一篇出版物中对抗体设计的多样性进行了深入调查。 图1. 常见的单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（bsAb）和多特异性抗体（msAb）配置。a. 标准免疫球蛋白G抗体；b. 对称IgG样双特异性抗体；c. 含有scFv和sdAb的双特异性抗体；d. 多价双特异性抗体；e. 多特异性抗体。 基于IgG的bsAb/msAb格式通常保留天然蛋白质的可结晶片段（Fc）区域，通常可以细分为对称或不对称格式。这些bsAbs/msAbs通常依赖于有目的的突变来增强链配对效率，以及修改Fc介导的功能或半衰期延长。 基于片段的分子，如单链可变片段（scFv）或驼类重链可变域（VHH），通常不包含Fc区域，保留抗原结合的最小要求，允许连接不同的结合片段。通常引入不同长度的连接子来连接具有独特功能属性的不同部分。虽然这些偏离传统IgG格式的变化是必要的，以便启用或改善功能性活动，但它们也影响了其开发潜力。 确保bsAbs/msAbs的适当开发潜力和可制造性需要特别考虑抗体格式。一般起点是确定正在评估的新型格式与“IgG样”的相似程度，与天然蛋白质的偏差越大，需要越来越严格的审查。例如，为了推动bsAb的轻链和重链的正确组装而应用的有目的的突变，可能会降低稳定性，增加免疫原性，和/或改变Fc功能。 同样，虽然缺乏Fc的格式，如scFvs，可能提供更好的生物分布和更高的效力，它们通常容易高度聚集，并可能导致分子没有所需的溶解度和稳定性水平的最终治疗。此外，通常需要双特异性格式或多特异性格式的连接子，这些格式附加了额外的scFv或Fab到IgG框架，这些连接子本身可能会引入免疫原性或显著改变药代动力学（PK）属性。 一旦传统的IgG骨架被修改以允许双特异性或多特异性，就需要定制的制造过程，以获得足够数量的高纯度bsAb/msAb。一个主要考虑因素是，每种独特的格式通常需要不同的纯化策略。例如，由于许多基于片段的抗体缺乏Fc，它们需要偏离用于典型IgG的基于蛋白A亲和色谱的纯化策略。由此产生的bsAbs/msAbs通常具有缩短的半衰期，需要在配方中进行额外考虑，如持续静脉内输注或修改，如与聚乙二醇或人血清白蛋白融合，以延长半衰期，实现更有利的PK特性。 此外，许多双特异性和多特异性格式可以引入多种格式特定的杂质，这些杂质对许多分析和纯化方法提出了独特的挑战。这些格式特定的杂质在生物物理属性（如分子量和等电点（pI））上可能与所需的双特异性产品几乎相同，需要开发定制的分析测定和/或纯化方法。 对双特异性和多特异性格式的修改也可能影响蛋白质表达水平，因此可能不适合高通量生产和开发潜力调查。因此，必须仔细考虑不同格式及其产生足够产量和产品质量以进行高通量开发潜力测定的能力。综合考虑，正在开发中的格式与所需的治疗候选属性应指导开发潜力评估策略。 2.1.格式考虑 虽然这里没有回顾bsAb/msAb工程策略的细节，但了解为什么做出某些工程选择以及分子格式的修改如何影响功能是重要的，这使得一个知情的过程能够从功能和开发潜力的角度权衡候选分子的相对风险。就与目标结合相关的功能而言，bsAb/msAb格式可以在两个一般类别中相互偏离：结合价（即，任何目标的结合基团数量）和结合几何学（即，组装分子中靶向基团的相对方向）。 这些两个维度的变化如何产生改善活性的例子包括zanidatamab，这是一种HER2靶向双特异性抗体，它采用了scFv和Fab，从而改善了受体聚集和补体依赖性细胞毒性，以及BiTE（双特异性T细胞接合器）格式，这是两个scFv分子的融合，是第一个商业批准的TCE。这种格式虽然容易聚集，但在目标肿瘤细胞和T细胞之间实现了短的细胞间距离，这可以导致与更IgG样的bsAbs相比显著增强的细胞毒性效力。 BiTE格式的演变是双亲和性重定向抗体格式，它包括一个经过工程改造的二硫键，连接了两个可变域（Fv）的重链可变域（VH）和轻链可变域（VL）的交叉融合。分子格式对活性和开发潜力的耦合影响是过去二十年的积极研究领域。 Loh等人比较了八种不同的HER2 × CD3“结-孔”Fc基础bsAb格式在稳定转染池中的表达、纯化容易性、热稳定性、抗原结合和功能表征。在这项研究中，几何学和价的变化没有影响表达水平或热稳定性，但增加scFv的数量导致了更高的异质性和聚集倾向。Madsen 等人进行的一项类似研究通过使用带有10个氨基酸连接子的单域抗体（sdAb）与IgG融合，生成了针对PD-L1 × HER2的不同几何结构的双特异性抗体（bsAbs），并评估了它们的生产、稳定性、抗原结合以及CD16a结合特性。将sdAbs融合到重链的N-或C-末端通常可以提高产量，但某些融合分子导致分子组装不良，高价分子显示出胶体稳定性低的迹象。 此外，与bsAbs/多特异性抗体（msAbs）格式相关，翻译后修饰、片段和格式相关杂质（如错配物种和半抗体）对功能性活动的影响应在定义关键质量属性（CQAs）时考虑。Lippold 等人报道了一种开发2 × 1TCE的优雅方法，该方法使用功能性CD3亲和色谱结合质谱（MS）来定义CQAs，这可能是一种广泛可定制的方法，用于分析化学稳定性风险及其对功能性活动的影响。总之，格式优化是调节bsAbs/msAbs活性的强大方式，但必须与适当选择的开发性检测一起进行。 2.2.生成bsAb/msAb分子的共同组成部分 尽管许多bsAb/msAb格式尝试主要使用来自典型人类IgG的分子组分，但这些分子的复杂性需要偏离。如下所述，多肽连接元件和VHH部分特别是非IgG元素，在bsAb/msAb分子的工程中常用。 多肽连接子可以分为刚性、柔性和体内可裂解连接子。它们不仅用于将不同的蛋白质结构域连接在一起，还可以有其他效果，例如增加活性、调节药代动力学(PK)特性、在体内释放蛋白质结构域，或将治疗剂定向到特定的组织或器官。多肽融合到Fc结构域、转铁蛋白或人血清白蛋白通常用于延长抗体的半衰期，通常需要使用连接子。此外，多肽连接子通常用于构建单链靶向结构域，如单链可变片段(scFvs)，以及将这些结构域与其他蛋白质组分融合，以修改结合价数，并实现不同的双特异性和多特异性几何结构，而不引入额外的链配对复杂性。通常，在这些应用中使用多甘氨酸-丝氨酸(G4S)n连接子的变体，其中整体长度被优化以最小化聚集倾向，同时保持位点可及性。连接子长度和组成的优化是格式设计的关键组成部分，正如在CD19 × CD3双特异性串联二价体的优化中所展示的，连接子的变化被证明影响折叠效率、稳定性和活性。已经展示了几种稳定多肽连接子的策略，例如通过点突变减少蛋白酶敏感性，从而改变裂解基序，应用稳定框架突变，修改融合几何结构和连接子锚点，引入二硫键，变化连接子长度，以及添加谷氨酸和赖氨酸残基以提高溶解性。VHHs，也称为Nanobodies®，是由骆驼科动物自然产生的只有重链的单变量域抗体。它们缺乏传统抗体中与VL结构域配对所需的疏水界面，因此具有高溶解性和小尺寸(15 kDa)等特征。它们的热稳定性可能有所不同，但许多VHHs具有独特的能力，在热暴露后重新折叠并恢复抗原结合， 因此，与传统的靶向单元如Fab或scFv相比，它们表现出额外的稳定性特征，后者在热暴露后通常显示出不可逆的聚集。VHHs通常具有更长的、高度可变的互补决定区(CDR)3环，这些环补偿了缺失的VL结构域。这些扩展的CDR3环实现了高亲和力和特异性结合，并有助于通过形成折叠覆盖结构来屏蔽否则暴露的疏水残基。与传统的scFv相比，scFv由最小的IgG结合域VH和VL通过多肽连接子连接而成，并且由于它们的“呼吸”界面容易聚集，VHHs是有趣的替代品，作为靶向单元，以实现额外的抗原结合能力和价数在双特异性抗体/多特异性抗体上，具有优越的开发性属性，并避免许多IgG样双特异性格式中常见的链配对复杂性。首个VHH衍生抗体caplacizumab(Cablivi®)在2019年的批准为VHH在双特异性抗体/多特异性抗体中的增加使用奠定了基础。在双特异性抗体/多特异性抗体中使用VHHs已被证明用于靶向FcγRIII，在TNF × F4/80双特异性抗体中，Vδ2-TCE，在双特异性和三特异性VH在CD1d × Vγ9H SEED结构体中，等等。以及在一种增强对HIV株特异性中和能力的双特异性抗体中。 3.免疫原性 生物治疗剂可能具有免疫原性，即在患者体内引起对治疗剂本身的不需要的免疫反应，通常通过产生结合治疗剂的抗体，可能影响安全性和/或有效性。免疫原性可能导致治疗抗体在临床开发过程中的药物失败，导致资本、时间和资源的大量损失。抗药物抗体(ADA)是免疫原反应的标志。ADAs可以降低治疗效果，引起不良反应，甚至导致严重的副作用。T细胞通过反应治疗抗体中的特定序列在决定免疫反应中发挥关键作用，这些序列由抗原呈递细胞(APCs)在人类白细胞抗原(HLAs)中呈递。由于缺乏完整的临床研究来审查双特异性抗体/多特异性抗体，这些替代格式的免疫原性风险的数据很少。最近批准的双特异性抗体/多特异性抗体的报告，或目前在临床开发中的那些，表明不同抗体模式的ADA发病率和这些ADAs的临床结果各不相同，包括TCEs、双免疫检查点抑制剂和各种肿瘤相关抗原(TAAs)的双结合物。这些不同的结果突出了需要从早期临床前阶段到临床阶段开发全面的免疫原性风险评估策略，以促进选择、设计和开发具有降低患者免疫原潜力的最优双特异性抗体/多特异性抗体。下面提供了一个概述，说明可以有助于塑造对双特异性抗体/多特异性抗体治疗剂的免疫反应的多种因素，包括与产品相关的因素、与患者相关的因素和与疾病相关的因素。此外，我们简要讨论了目前可用于预测、监测和减轻双特异性抗体/多特异性抗体在临床前开发阶段的免疫原性的工具和进展。 3.1.基于序列的风险 与所有蛋白质治疗剂一样，对双特异性抗体/多特异性抗体产生免疫反应的主要风险决定因素之一是原始氨基酸序列。双特异性抗体/多特异性抗体通常包含大量工程化序列元素，这些元素使得不同的功能域能够非自然地连接到一个分子中。此外，这种双特异性抗体/多特异性抗体特有的工程通常与额外的抗体工程方法结合，如人源化突变(将小鼠CDRs移植到人抗体框架中)和Fc效应子修饰(要么调节Fc受体介导的效应子功能，要么通过修改与新生儿Fc受体(FcRn)的结合来延长半衰期)。这些新颖的工程序列可能通过引入新抗原或暴露可以被APCs处理和呈递的隐蔽表位来增加免疫原性，从而激活T细胞反应。因此，免疫原性风险评估和减轻策略最好从双特异性抗体/多特异性抗体的工程阶段开始，并在整个表征和筛选过程中使用越来越彻底的方法。通过设计低风险抗体结构使用脱免疫和耐受化(introduction of T regulatory cell epitopes)方法，由计算预测工具和可用的体外/离体确认试验的组合指导，可以实现降低免疫原性。 3.2.计算机模拟免疫原性风险评估 在抗体发现阶段早期，通常会首先应用计算机模拟(in silico)的T细胞表位筛选和预测工具。有多种商业、公共和学术平台可用于筛选抗体序列中的T细胞表位（通常是9到15个氨基酸的序列），以预测可能与HLA分子结合的序列。这些预测工具仅基于抗体的主要序列来识别潜在的T细胞表位。更复杂的计算方法能够使用同源建模和分子动力学模拟等技术生成抗体结构的三维模型。这些方法允许评估可能影响免疫原性的结构特征，如溶剂暴露的环、翻译后修饰和构象灵活性。 计算机模拟预测工具有助于在bsAb/msAb的早期开发过程中识别潜在的免疫原性区域，并允许选择潜在的免疫原性较低的分子或应用进一步的蛋白质工程技术来降低候选分子的风险。这些计算机模拟方法具有高通量和相对较低成本的优势。然而，这些计算工具通常存在一些局限性，例如倾向于过度预测，同时未能充分反映人类群体中发现的重要HLA II类多态性。 因此，建议使用各种体外和离体方法，包括免疫测定和基于细胞的测定，对这些假定的T细胞表位进行进一步的检测。 3.3.体外HLA I类和II类结合测定 HLA结合测定评估肽段在体外与不同HLA等位基因结合的能力，并补充计算机模拟预测工具。纯化的HLA-II肽段（通常是重叠的15个氨基酸的肽段）在一系列浓度下与单体HLA-II分子共同孵化。使用多种方法，包括荧光光谱、生化测定（例如，酶联免疫吸附测定）或表面等离子共振（SPR）来量化结合亲和力和动力学。通常，这些测定以高通量规模进行，能够快速筛选大量的肽库。这些结合测定的一个固有困难是全球人群中各种HLA-II等位基因的正常分布的代表性有限。为了克服这一局限性，HLA-II结合测定通常使用共享表位结合基序的HLA-DR等位基因组，也称为超类型等位基因，能够代表全球超过95%的人类HLA分布。 由于HLA-I分子的高度多态性和结构/构象对结合亲和力的影响，HLA-I结合测定的使用较少，尽管已经描述了几种测定和方法，包括基于荧光激活细胞排序（FACS）的MHC稳定化测定、竞争测定、分型B细胞系或使用HLA的基于细胞的测定。 虽然HLA结合测定可以提供有关特定HLA等位基因结合的有意义的信息，但由于它们依赖于感兴趣的肽段的最佳设计和纯度，因此存在一些局限性。这种依赖性可以直接影响肽-HLA相互作用的结合和稳定，并导致假阴性结果。此外，虽然从HLA结合测定获得的数据可能表明特定肽基序可能与HLA等位基因结合，但这些数据并没有考虑到这种肽基序是否能够在APC表面的HLA分子上被处理和呈递。 3.4.MHC相关肽蛋白质组学 MHC相关肽蛋白质组学（MAPPs）方法在识别存在于APC表面相关HLA分子上的已处理肽段方面被证明是有价值的，特别是鉴于液相色谱/质谱（LC/MS）灵敏度和蛋白质组分析工具的最新进展。在这种方法中，完整的bsAb/msAb分子被装载到体外生成和成熟的单核细胞衍生的树突状细胞（DCs）上，以使DCs摄取和处理抗体，然后细胞裂解和分离肽-MHC复合物，这些复合物稍后被解离并通过MS测序进行测序。 MAPP测定的通量相对较低，主要是由于DC生成的限制。因此，MAPPs通常在临床前开发过程的后期阶段使用，并用于有限数量的开发候选物。从MAPPs获得的数据可以帮助识别可能被工程化以降低免疫原性的主导抗原肽序列。当这些个体的DCs被包括在分析中时，这种方法还可以揭示健康和疾病个体之间在抗原处理和呈递方面的差异。 尽管从MAPP测定中收集到的有价值的信息，但仔细解释至关重要。当评估bsAbs/msAbs与APCs（如DCs）的潜在直接或间接相互作用时，bsAbs/msAbs增加了一层复杂性。在使用MAPPs测定针对DCs表达的靶标或对DC功能重要的途径（如CD40×CD11c或LAG-3×PD-L1 bsAbs）的bsAbs/msAbs时，应考虑这种相互作用。 这些靶标的结合可能会干扰这些细胞中的抗原呈递机制，这反过来可能会影响该测定识别真实主导抗原序列的能力。在使用MAPPs测定之前，可以使用DC结合测定和评估DC成熟、激活和细胞因子测量的测定来了解bsAb/msAb对DCs的影响。 此外，评估bsAbs/msAbs对内源性蛋白的已知表位呈递的影响也可以提供对抗体与MAPP测定潜在干扰的洞察。 通过MAPPs识别的主导抗原序列表明这些序列可能通过抗原呈递机制被处理和呈递；但这并不一定意味着这些序列会转化为T细胞反应。因此，建议进行进一步的确证性体外T细胞激活和增殖实验，特别是当对感兴趣的序列进行进一步重设计可能会对抗体的效力或特异性产生重大影响时。 3.5.T细胞激活和增殖实验 各种体外T细胞激活和增殖实验已经开发出来，并越来越多地被用来评估治疗性抗体候选物的免疫原性。这些实验大多数使用新鲜分离或冷冻保存的健康或疾病个体的外周血单个核细胞（PBMCs）、去除CD8 T细胞的PBMCs，或与单核细胞衍生的树突状细胞（DCs）共培养的分离CD4 T细胞。PBMCs可以被整个抗体刺激，允许抗原呈递细胞（APCs）摄取、处理和呈递肽序列给原始T细胞，导致T细胞激活、增殖和细胞因子分泌。流式细胞术通常用于评估通过标记PBMCs与细胞示踪染料来评估抗原特异性T细胞增殖。此外，使用特定的T细胞激活标志物如CD25、CD69、HLA-DR、CD134和/或CD137通常与增殖评估结合使用，以了解T细胞的激活状态和对刺激的反应程度。 激活的T细胞产生的细胞因子也可以通过流式细胞术进行细胞内细胞因子染色或通过酶联免疫吸附点（ELISpot）或多重荧光斑点（FluoroSpot）实验进行评估。 尽管基于PBMC的实验被认为是最简单且接近体外模拟复杂抗原呈递和T细胞激活过程的设置，但它们受到能够响应特定抗原刺激的前体原始T细胞数量相对较低的限制，导致实验灵敏度降低。DC-T细胞实验提供了一个替代方案，克服了这一限制，作为一个较不复杂的体外系统，允许免疫反应的基本组成部分之间的抗原特异性相互作用，即DCs和T辅助细胞。 虽然这些实验越来越被接受，但它们与bsAbs/msAbs的兼容性需要确认。bsAbs/msAbs通常针对T细胞或其他免疫细胞表达的受体或配体。在这些例子中，使用完整的抗体进行刺激可能不合适，因为免疫反应可能主要由抗体的MOA和与免疫细胞的直接结合驱动，而不是由抗原刺激驱动。这可以通过使用来自抗体序列的重叠肽段库而不是完整的抗体来克服。然而，使用肽段库有自己的局限性，包括更高的成本和可能识别出不一定在体内由APCs处理或呈递的肽段的风险。因此，使用MAPPs实验数据来指导设计和生产感兴趣的序列以在这些体外实验中进行测试可能是有益的。此外，bsAbs/msAbs由于抗体在所需格式中的错配组装，携带更高的杂质风险，导致产生其他不想要的错配格式，这可能会影响体外实验的性能，并导致对免疫原性风险的潜在误解。 因此，使用高纯度的测试文章准备这些实验至关重要。 3.6.B细胞表位和体外B细胞实验 虽然CD4 T细胞在导致ADA产生的免疫反应中起着关键作用，但B细胞也直接识别、结合、内化、处理和呈递治疗性抗体的表位给T辅助细胞，导致原始B细胞分化为记忆和产生高亲和力（IgG）ADAs的浆细胞。然而，体外B细胞实验受到在体外诱导B细胞反应的生物学复杂性的限制。已经描述并商业化了几种评估B细胞在体外刺激后分泌IgG/IgM的比色和荧光B细胞ELISpot实验，这些ELISpot实验主要关注评估记忆B细胞反应。目前尚无强大的实验可用于测量原始B细胞对体外刺激的IgG产生，主要是由于从IgM到IgG产生过程中涉及的免疫过程的复杂性。 在缺乏强大的体外B细胞实验的情况下，已经开发了几种用于预测B细胞表位的计算工具，如免疫表位数据库和分析资源SEPIA。 许多这些预测方法使用序列衍生特征，包括氨基酸组成、亲水性、表面可及性、β-转角和主链柔韧性来提高B细胞表位预测性能，这通常相对于现有的T细胞表位预测工具是有限的。 3.7.与产品关键质量属性相关的风险因素 CQAs是在适当的限制、范围或分布内存在的物理、化学、生物学或微生物学属性或特征，以确保所需的产品质量。 CQA相关的免疫原性风险因素是在治疗性抗体开发过程中的重要考虑因素。 由于分子设计的相对复杂性，bsAbs/msAbs通常与许多制造挑战相关，如增加的聚集、降低的稳定性和由于存在不想要的错配抗体格式而导致的产品相关杂质，这些都影响bsAb/msAb的免疫风险、与先天免疫细胞上的模式识别受体的相互作用以及意外佐剂效应导致打破耐受。 PBMC和全血实验是经常用来评估CQA相关免疫原性风险的工具。 这些实验能够广泛代表特定人群，通常被认为比其他基于细胞系的实验格式更具临床相关性。这些实验中通过与抗体孵化后分泌的细胞因子和趋化因子水平的量化来测量免疫原性反应。这些类型的实验面临的挑战包括从大量供体（通常>25）中获取足够数量的PBMC和新鲜全血样本，以及高供体间变异性。 重要的是，必须考虑特定bsAb/msAb的作用机制（MOA）来解释这些实验获得的数据。通常首先进行全血或PBMC实验以获得更广泛的风险评估，然后进行其他体外实验以进一步进行机制性特征描述。 3.8.与患者相关的风险因素 预先存在的反应性是随着基于抗体治疗领域，特别是bsAbs/msAbs的快速增长而日益受到关注的问题，尽管其对药物安全性和有效性的影响尚不清楚。最近有关bsAb/msAb免疫原性的报告表明，在临床药物开发阶段考虑实施对药物未接触受试者预先存在反应性的筛选和特征化策略是必要的。 许多正在开发的bsAb/msAb模式针对的目标已经使用其他生物治疗药物进行了探索，包括mAbs和抗体药物偶联物。在某些情况下，bsAbs/msAbs可能使用以前开发或批准的抗体的抗体臂，如上文提到的JNJ-61178104（以前称为COVA322）bsAb，它建立在阿达木单抗的骨架上。 在这些情况下，针对先前生物治疗的ADA反应可能导致由于快速记忆回忆反应而对bsAb/msAb的免疫原性反应增强。因此，应考虑对患者进行预先存在的反应性筛选，特别是在有生物治疗药物治疗史的患者中。此外，这种预先筛选可能有助于在预期出现显著免疫原性反应和相关不良事件时定义潜在的患者排除标准。 虽然目前主要在临床环境中使用筛查或治疗前时间点的患者样本来评估预先存在的ADA，但预先存在的ADA的高流行率表明，在临床前开发阶段早期使用健康或药物未接触的捐赠者的人类血清进行更严格的评估是有必要的。用bsAb给药的受试者中出现的治疗性ADA与在健康捐赠者中检测到的预先存在的ADA相关，并且预先存在的ADA的表位特异性能够预测临床ADA的表位偏好。 在评估LY3415244的安全性和免疫原性的1期试验中也有类似的观察结果，其中所有12名入组的患者都对至少一个bsAb臂产生了治疗性ADA。针对anti-TIM-3臂的ADA被发现更早出现，并对大多数患者的可溶性TIM-3目标参与产生负面影响。在最近的一项调查中，评估了60个正常人类血清样本中针对LY3415244的预先存在的ADA反应性，分析同样发现，正常人类血清样本中针对LY3415244的预先存在的ADA免疫原性主要针对TIM-3 CDRs。 3.9.治疗相关风险因素 包括给药途径、药物剂量和给药方案以及使用免疫调节共治疗药物，都是影响生物制剂免疫原性风险的因素，包括bsAbs/msAbs。大多数治疗性抗体通过静脉注射或皮下注射给药。尽管普遍接受的观点是皮下注射治疗性抗体与更高的免疫原性风险相关，但目前临床批准的抗体的数据并不支持这一假设。然而，与皮下注射相关的独特的免疫原性挑战可能对bsAbs/msAbs特别重要。皮下注射通常需要相对于静脉注射的高浓度给药。因此，与增加的bsAb/msAb聚集体以及其他产品属性相关的挑战可能在通过皮下途径产生更高的免疫反应中发挥重要作用。这一假设得到了pasotuxizumab这一例子的支持，这是一种PSMA × CD3 bsAb TCE，在1期研究中评估了静脉和皮下给药。 虽然静脉组的患者中没有检测到任何ADA，但所有接受皮下治疗的患者都发展出非短暂的ADA。此外，在这些患者中超过93%的人发现中和性ADA，并且没有人对局部糖皮质激素治疗有反应。当JNJ-63898081，另一种PSMA × CD3 bsAb TCE，通过静脉和皮下给药给试验参与者时，也报告了类似的结果。 药物剂量和给药方案也可能强调bsAbs/msAbs的免疫反应风险，因为由于细胞因子释放综合征等毒性，给药通常限于相对于mAbs的较低剂量。与msAb/msAb的较低剂量可能潜在地导致ADA介导的药物清除增加和次优的PK和PD性能。此外，治疗持续时间也是一个需要考虑的重要因素，尽管其与免疫刺激性bsAbs/msAbs在肿瘤学中的相关性可能不清楚，因为这些方案不需要长期治疗。此外，可能需要长期治疗的bsAbs/msAbs，如那些用于自身免疫性疾病的，可能从其自身的免疫抑制MOA中受益，导致免疫原性降低。最后，与抗炎药物或化疗的联合治疗也可能影响bsAbs/msAbs的免疫潜力。 3.10.作用机制风险因素 最近批准的bsAbs/msAbs的数据，以及其他在临床开发中的bsAbs/msAbs，表明这些bsAbs/msAbs的作用机制在它们在患者中的免疫潜力中起着关键作用。根据分子的不同，可以增加或减少免疫原性。例如，批准用于B细胞恶性肿瘤的bsAb TCEs，如CD19 × CD3 blinatumomab和BCMA × CD3 teclistamab，显示出最小的ADA发病率（<2%），可能由于它们的B细胞耗竭MOA。另一方面，针对B细胞上共刺激分子的bsAbs/msAbs，ABBV-428，一种间皮素-CD40 bsAb，在1期临床试验中显示出高ADA发病率（63%），可能由于其对B细胞的CD40激动效应和对药物PK的影响。非B细胞耗竭TCEs也可能由于其MOA涉及广泛的T细胞激活而带来更高的免疫原性风险，如AMG 211，一种CEA × CD3双特异性T细胞-引导剂，它在所有接受>3.2 mg高剂量治疗的患者中诱导了ADA，并在高滴度下暴露量下降，导致停药。 免疫调节性bsAbs/msAbs通过激活共刺激通路或拮抗抑制通路（如CTLA-4 × PD-1和CTLA-4 × OX-40双特异性抗体）可能会对患者造成更高的免疫原性风险，导致ADA发生率增加，因为它们相对于针对相同靶点的单抗单药治疗能够释放更强的免疫细胞激活。这一概念得到了抗PD-1和抗CTLA-4单抗的单药治疗和联合治疗报告的支持。当nivolumab与ipilimumab联合使用时，ADA发生率较单药治疗（11%）显著提高，报告为26-38%。 类似地，当抗PD-L1抗体durvalumab与化疗联合使用时，ADA发生率极低（<1%），而与抗CTLA-4抗体tremelimumab和化疗联合使用时，ADA发生率则较高。 与这些观察结果一致，LY3415244，一种针对TIM-3和PD-L1的bsAb，也被报告在所有给药的患者中诱导ADA。最近，在针对HER2和4-1BB的bsAb PRS-343的1期研究中也报告了类似的观察，PRS-343的给药导致ADA发生率为28%。 尽管存在这些趋势，免疫原性仍然难以预测，因为并非所有这些机制总是导致免疫原性增加。 另一个与作用机制相关的风险因素是抗体与其可溶性或膜寡聚靶标形成免疫复合物的能力。由于bsAbs/msAbs能够结合多个靶点，免疫复合物形成的风险可能更高。大型免疫复合物被广泛认为通过增加APCs的摄取以及通过交联和激活B细胞受体的T细胞非依赖性激活B细胞来增强免疫反应。针对炎症细胞因子TNF和IL-17A的bsAb JNJ-61178104支持这一概念，因为其给药已被证明在所有患者中诱导ADA。 尽管目前对免疫调节性bsAbs/msAbs的临床免疫原性数据有限，但现有证据表明它们与增加的免疫原性风险和更高的ADA发生率相关。因此，作用机制的考虑应成为bsAb/msAb开发过程中全面免疫原性风险评估策略的重要组成部分。重要的是，这些考虑也应适用于上述讨论的各种体外和体外工具的兼容性，考虑到正在开发的抗体的作用机制，以及这对这些实验数据解释的影响。 总之，随着bsAbs/msAbs领域的快速发展，以及关于与这一类抗体相关的免疫原性和安全风险的知识逐渐可用，开发全面的免疫原性风险评估策略对于实现最佳抗体开发至关重要。这些免疫原性风险评估策略可以在临床前阶段涉及各种计算工具以及体外和体外实验，同时关注与bsAb/msAb开发相关的重要药物、患者和治疗相关风险考虑。 4.特异性 在双特异性抗体（bsAbs）和多特异性抗体（msAbs）的开发中，多特异性（在蛋白质组中对靶点外的结合）和多反应性（对带电或疏水蛋白、膜或其他生理表面的非特异性结合）都是不希望出现的属性，它们可以改变疗效、清除率和组织分布。这些不需要的效果可能导致靶点外毒性、免疫原性和生产上的挑战。 多特异性可以由几种机制引起，例如与不相关靶标的分子模拟或CDRs中的可塑性，这些特征可能因在同一抗体上具有多个互补决定区而加剧。多反应性归因于不希望的抗体表面属性，例如电正性、电负性和疏水性表面斑块或Fv和Fc的电荷不平衡。在bsAbs/msAbs中，与从亲本分子行为预期的相比，多特异性和多反应性都可以被调节。这些差异可以归因于结合价的改变和/或复杂的互补决定区间相互作用。然而，尽早识别可能产生靶点外效应的抗体至关重要，建议在将亲本分子重新格式化为bsAbs/msAbs之前对其进行评估。 4.1.计算机预测 众多的计算机模拟工具已被开发出来，用于评估抗体特征以预测多反应性。抗体的特性，如序列组成、互补决定区（CDR）的长度和表面特性（即电荷和疏水性），通常从同源模型中得出，已被用来创建多反应性的预测模型。 具有大量电荷在其CDR上的抗体或高疏水性可能具有加速的清除率，对他们的治疗有效性产生负面影响。这种加速清除被认为是由于抗体表面的正电荷可能与负电荷的细胞膜或细胞外基质相互作用，导致 增加的组织吸收和血液清除。几个小组已经评估了使用许多可用的在硅片上的工具来探索抗体开发能力，但这些工具的广泛适用性对bsAbs/msAbs的探索较少。Jain等人。系统地评估了在硅片上派生的特征和体外指标之间的关系， 评估了许多开发能力方面。 虽然预测体外测定结果的能力大于那些仅从计算派生指标派生出来的，总体正电荷被发现对多特异性有害，更大的负电荷区域似乎有益，其他基于序列的趋势对氨基酸组成和位置在CDRs中证实了其他研究，这些研究正在调查多反应性。此外，许多在硅片上的指标的数量下降超出了确定的可接受分布（通常称为标志或违规行为）随着临床路径的进展（即，批准的抗体具有最少的在硅片上的标志）。同样，Zhang等人。生成了用于识别潜在多特异性的物理化学 规则，通过评估序列和结构特征与测定之间的相关性来探测自关联和结合到各种多特异性试剂在137个临床阶段抗体上。最近对1000个mAbs的生物信息学分析系统地 确定了多反应性和非多反应性抗体之间的关键差异，目标是扩展对属性的理解推动多反应性超出疏水性，电荷和CDR环灵活性。多反应性抗体往往有CDRs，平均产生轻微的亲水性，中性电荷的结合表面，可能潜在地允许与广泛的配体进行弱相互作用。这些数据被用来构建一个计算框架，可以识别多反应性抗体，准确率为75%。最近开发的机器学习方法已被用来预测纳米抗体和scFv中的多反应性。这些可变域格式是bsAbs/msAbs中越来越常见的组成部分，因为它们不需要非轻链的共价配对，因此产生较少的格式特异性错配物种。哈维等人。使用一个合成库，旨在模仿一个天真的骆驼库并将其排序到结合池到多特异性试剂（PSR）使用FACS。结果被用来训练逻辑回归和神经网络模型来分类纳米体多反应性。有几个预测特征为多反应性例如，存在精氨酸和色氨酸；然而，它们被位置强烈混淆。值得注意的是，他们的模型能够建议突变以减少估计的多反应性。Lim等人，通过训练四种监督式机器学习方法，利用这些数据计算了19,426个已知多反应性档案的scFv的基于序列和基于结构模型的特征，并得出结论，表现最好的模型具有与多个不同的CDR和全局抗体特征相关的特征，包括CDRH3中的色氨酸数量、等电点（pI）和径向旋转半径。然后，这些模型与基于自然语言的模型描述符相结合，以从scFv特征中提取额外的信息。表现最佳的集成模型在识别多反应性scFv方面的精确度和准确率超过75%。可用于特异性预测的在硅片上工具的数量和可变性可能会令人生畏，而且很少有模型专门针对bsAbs/msAbs的独特属性进行了设计。因此，建议主要使用这些方法作为在开发过程的早期对几个候选分子进行初步评估，以识别抗体和相关的在硅片上指标，这些指标落在任何一个预测的极端。这些数据可以作为进一步实验探究策略的有用指南。 4.2.体外特异性测定 评估PK属性是与特异性相关的主要开发能力属性。事实上，mAbs的长消除半衰期是这类治疗药物的主要优势。调节清除率的最重要元素是Fc中含有的分子在内质网隔室中依赖pH的特定FcRn结合。BsAbs/msAbs通常通过扰动或移除Fc-常驻FcRn相互作用来大幅度改变这一档案。分析FcRn亲和液相色谱使用从pH 5.5到8.8的线性pH梯度来分离IgG异构体、降解产物和工程抗体，如bsAbs/msAbs，基于它们在不同pH下对FcRn的亲和力。与野生型IgG相比，突变体的洗脱峰档案和保留时间的变化与FcRn转基因小鼠中的PK档案相关。尽管普遍认为Fc在FcRn介导的循环中起主导作用，但还表明，可变域的净电荷也影响与FcRn的结合，正如brakinumab所示，其Fv净电荷较高，但与ustekinumab相比具有类似的pI。FcRn有一个扩展的负电荷表面补丁和增加的brakinumab结合，阻止了在生理pH下与FcRn的有效解离，并减少了其终端半衰期。在中性pH下从FcRn的缓慢释放已被证明对两个具有类似pI和生物物理属性的bsAbs的PK产生不同的影响。 除了FcRn独立特性如单克隆抗体（mAbs）的Fv电荷、目标结合和定位、多特异性和多反应性或糖基化变化可能导致不期望的增加清除率，影响mAbs的药代动力学（PK），这些特性对于双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）的开发同样重要。特别值得注意的是，针对CD3的bsAb TCEs通常具有与不良PK相关的多反应性标志，部分原因是许多针对CD3的抗体结合到CD3 epsilon极端N-末端的电负性线性表位，并且具有较高的等电点（pI）值。基于结构的方法和使用基于酵母的检测平台的抗体工程已被证明可以纠正这种多反应性行为，同时增加对CD3的亲和力。 测试更广泛的多反应性和多特异性，这与药代动力学不佳、制造困难和耐受性问题有关，由于人类蛋白质组和其他生理表面呈现的巨大潜在非目标空间，这是一项挑战。人类细胞微阵列技术可以在体外分析人类蛋白质组，以减少体内非目标毒性和加速清除的风险。 筛选多特异性性还可以包括结合由CHO、HEK或Sf9细胞提取物制成的PSRs，其中包含溶解的膜蛋白。这种方法可以作为基于展示的方法的反筛选，如针对SARS-CoV-2的基于纳米抗体的四价bsAb所示。 如上所述，局部正电荷可以导致通过增强FcRn结合、防止FcRn-抗体解离和有效回收来加速清除率。虽然可以从序列或通过毛细管等电聚焦等直接方法估算抗体的pI，但它是多反应性的一个差指标，因为它不显示电荷斑块或局部不平衡，通常更倾向于使用结构衍生方法，如Fv电荷对称性和空间电荷图（SCM）。 除了静电相互作用外，抗体的疏水性是多特异性以及潜在胶体稳定性问题的可靠指标。可以通过分析疏水相互作用色谱上的保留时间和洗脱曲线来评估抗体的疏水性。某些抗体germlines，如VH1–69，由于它们的重链CDR2更疏水，更可能产生疏水性较高的抗体，但这种倾向可以通过工程方法和生物物理评估来最小化。 在bsAbs/msAbs的临床前阶段进行特异性测试，应考虑作为降低开发和制造风险的两阶段方法。应评估每个亲本抗体，并仅选择低风险的亲本抗体或结合域进行重组成bsAbs/msAbs。重组成后，应在衍生的bsAb/msAb上重复相应的特异性测定，以确认所应用的设计和格式没有显著改变每个亲本抗体或结合域的特性。选择具有良好特异性特性的低风险亲本序列是有效生成可开发bsAbs/msAbs的先决条件。 5.稳定性 抗体的稳定性包括许多分子内在和药物相关的外在组成部分，包括热稳定性、胶体稳定性、耐蛋白水解性和血液中的化学稳定性。这些领域的缺陷可能导致制造过程中的困难、影响货架期以及改变抗体的免疫原性和活性。 5.1.热稳定性 热稳定性是承受热应用时蛋白质展开和降解的能力。成功开发的抗体的一个关键特性是它们良好的热稳定性，这主要由mAbs中的Fab区域决定，但对于bsAbs/msAbs可能不那么明显。就稳定性而言，Fv区域具有最高程度的变异性，因为其主要序列因每种抗体而异。 低热稳定性可能使抗体更容易聚集，限制了它们作为治疗性抗体的潜力。抗体热稳定性的一个有用估计值是其熔化温度（Tm），定义为抗体在其展开状态的浓度等于其在折叠状态的浓度的温度。抗体包含几个区域，包括可变Fv区域和恒定CL、CH1、CH2和CH3区域。这些区域中的每一个都是伪独立的，因此在不同区域之间通常观察到不协同的展开。众所周知，IgG1 CH2区域的Tm约为70°C，CH3区域的Tm约为82°C。 一项研究发现，当通过异二聚体CH3界面构建bsAbs时，所得抗体的CH3热稳定性显著降低，与K409突变相关的Tm降低约为12°C。 Fv、CH1和CL区域倾向于协同展开，其Tm可以根据可变区域序列跨越大范围。差示扫描量热法（DSC）用于建立不同区域的热稳定性和热力学特性。 差示扫描量热法（DSC）特别适合于双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs），因为它可以通过额外的信息，如展开焓变，来识别不同区域的展开事件，但由于仪器限制和样品需求，通常相对低通量。相比之下，差示扫描荧光法（DSF），也称为热移测定，基于色氨酸和酪氨酸在展开时的内在荧光或添加荧光染料，通常高通量。这种技术在高通量环境中的一个典型用例是识别低稳定性抗体进行优先级降低，这些抗体的Tm接近或低于CH2热展开温度。 除了热展开外，许多DSF仪器还能够检测由热展开引起的聚集体形成，这导致光散射增加。这种聚集的起始温度通常用于筛选各种配方对聚集倾向的影响。 bsAbs/msAbs的形式对热稳定性有若干重要影响。一般来说，bsAb/mAb设计策略很少相对于亲本mAbs增加热稳定性。因此，建议在开发过程早期评估亲本抗体的热稳定性，并且理想情况下应降低热稳定性低的mAbs的优先级。在bsAb/msAb工程之后，通常一个或多个重组成的可变区域会失去热稳定性。设计可能如何影响亲本抗体不同区域的热稳定性，理想情况下应通过DSC进行评估，DSC非常适合解耦大多数mAb和bsAb格式中存在的众多展开事件。使用不需要突变Fv区域的bsAb/msAb格式，如VHH域，可能完全避免基于重组成的热稳定性下降的不可预测性。 已经开发和优化了几个bsAb平台和结合域的工程解决方案，以避免热稳定性的损失。对于目标域，包括在Fabs的VH-VL和CH1-CL界面、scFvs的可变域之间、scFvs的连接和可变域之间引入二硫键，或在scFvs的连接和可变域之间引入二硫键。后一种方法被证明可以将二硫键固定的scFvs的热稳定性提高约10°C。用于保持热稳定性的其他方法包括合理工程或随机突变方法的组合、人源化到更稳定的框架、或将稳定框架残基转移到不太稳定的框架上。 5.2.化学稳定性 化学稳定性指的是抗体一级序列中共价键的完整性以及重链-重链或重链-轻链之间。基于抗体的治疗药物的化学稳定性可能受到多种不同的降解途径的影响，包括脱酰胺作用、异构化、氧化、二硫键交换、N-末端焦谷氨酸形成、C-末端赖氨酸剪切、片段化和糖基化。 根据这些降解事件的位置与亲和位点和恒定域的关系，抗体的活性或半衰期可能会受到影响。一个众所周知的例子是曲妥珠单抗，其中LC-Asn30的脱酰胺对效力有轻微影响，而HC-Asp102的异构化显著降低了其效力。由于氧化应激，蛋氨酸氧化为蛋氨酸亚砜可能会对抗体产生几种影响，如报告的单克隆小鼠抗体OKT3。在Fc区域的M428/M252处蛋氨酸氧化可能会影响与FcRn的结合，从而影响抗体的回收，这会减少抗体的半衰期。任何影响亲和位点活性或Fc效应功能的化学降解都是有害的。因此，选择化学稳定的靶向单元以限制项目失败的风险非常重要。bsAb/msAb格式及相关的连接子或突变应用于生成bsAbs/msAbs也可能影响化学稳定性。化学稳定的靶向单元在重组成bsAbs/msAbs时可能会遇到不可预见的化学稳定性问题；因此，仔细评估亲本和衍生的bsAbs/msAbs都很重要。如果检测到降解事件，它们有时可以通过适当的配方条件来减轻。但重要的是要注意，强大的化学稳定性对于体内给药后的稳定性很重要，因此工程方法通常比配方筛选更可取。导致抗体降解的常见事件包括脱酰胺作用、异构化和片段化。脱酰胺作用是抗体中普遍存在的修饰，它发生在生产、储存或体内，并且更容易影响天冬酰胺残基，以及在较小程度上影响谷氨酰胺残基。脱酰胺作用是通过主链酰胺氮对侧链酰胺的羰基碳的亲核攻击和随后氨的丢失，导致通过天冬酰-琥珀酰亚胺（Asu）中间体形成天冬氨酸，通常在中性或碱性pH下加速。 相反，天冬氨酸通过Asu中间体的水解异构化通常在酸性pH下加速，并导致异天冬氨酸或天冬氨酸的形成（在中性条件下的比例为3:1）。异构化不依赖于水的存在，因此也可能发生在冻干的抗体配方中。 识别化学降解风险最直接的方法是通过对一级氨基酸的简单基序分析。然而，任何给定基序的降解倾向高度可变，并且取决于额外的结构因素，如溶剂可及性和二级结构构象，以及诸如pH、温度、辅料等外在因素。因此，基序方法仅作为化学责任风险的初步评估，任何情况都应通过额外的分析来确认。最近，基于结构和同源模型的方法已被开发出来，以更好地评估这些降解事件的可能性，某些位置和溶剂暴露的CDR环中的序列基序被识别为脱酰胺、异构化和氧化的热点。 虽然从开发的角度来看，Fv区域的降解通常是最具问题的，但这些修饰也常位于IgG的恒定区域。 化学稳定性问题可以通过强制降解研究来识别，这些研究通过故意将治疗性抗体暴露于应力条件下，在其整个生命周期中进行调查。这些研究可以包括长时间暴露于高温、低/高pH值、冻融循环、搅拌、糖基化、光照和生理或氧化应激。这些研究通常结合实验方法来检测和定量任何化学修饰，如离子交换和疏水相互作用色谱、标记和HPLC-UV-Vis、通过质谱的肽图、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或毛细管电泳和等电聚焦。 这些研究劳动密集、耗时且耗费材料，通常在发现过程的后期阶段对较少数量的抗体进行，通常在细胞系开发前。根据检测到的任何化学责任的位置，这些研究的样本通常也通过结合和活性测定来表征，以评估任何化学降解事件是否影响对目标的结合亲和力或抗体的活性和回收。抗体治疗中化学稳定性受损的另一种表现是片段化，可以分为非酶促和酶促片段化。非酶促片段化在抗体中经常观察到，主要在恒定区域，最有可能在上铰链区域，由于其动态环结构，可能性最高。 在上铰链区域的非酶促片段化发生在蛋白质主链中，通过诸如β-消除、直接水解、介导的裂解或自由基催化等化学反应，这取决于溶剂条件，如碱性或酸性pH值、温度以及自由基或金属的存在。非酶促片段化也可能伴随着二级、三级和四级结构以及构象灵活性发生，将序列空间中相距甚远的侧链带到局部环境中。非酶促片段化事件经常发生在天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺残基上，其中除了甘氨酸外，其他残基都可以通过它们的侧链介导片段化事件。CH1恒定区域的K(133)STSGGT环可能是一个常见的裂解位点，产生两个约35和15千道尔顿的片段，CH2区域（G236-G237，D270-P271）的其他位点也被发现可以迅速裂解。酶促片段化通常由蛋白酶裂解介导，这发生在mAbs和bsAbs/msAbs的生产和纯化过程中，铰链区域是酶促裂解最常见的位点。在所有情况下，片段化主要通过如天然尺寸排除色谱或SDS-PAGE等分离方法检测。与任何已识别的化学稳定性问题一样，需要根据裂解位点在Fv或恒定区域的位置评估其对抗体活性的影响。检测bsAbs/msAbs中片段化的工作与mAbs相同，但由于存在两个或更多的靶向区域，事件的复杂性和分配裂解基序的难度可能会增加。 此外，双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）可能会经历一个更为严格的纯化过程，包括额外的色谱步骤来去除与格式相关的杂质，因此任何化学稳定性的缺陷在制造过程中可能变得更加明显或累积。 焦谷氨酸的形成通常出现在抗体重链和轻链的N-末端，特别是当N-末端残基是谷氨酰胺时，对于谷氨酸来说则较少见。焦谷氨酸的形成可以通过非酶促的自发环化在体外通过亲核攻击N-末端主链酰胺氮对侧链酰胺形成稳定的五元环与H2O离去基团，或在体内由谷氨酰胺环化酶催化，这是一种在人类、动物和植物中发现的酶。如果控制不当，焦谷氨酸的形成可能导致抗体异质性，并可能影响制造过程中关键质量属性（CQAs）的维持。对于bsAbs来说也是如此，由于所有链的N-末端在某些双特异性格式中可能不同，检测和控制焦谷氨酸形成的复杂性增加了。 主要发生在赖氨酸侧链胺基和较小程度上的N-末端胺基和精氨酸的糖基化是一种非酶促的糖基化修饰，可以改变对抗原的亲和力，影响抗体的效力，并增加聚集。这种现象在治疗性抗体中很常见，并已在bsAbs中得到证实。这种糖基化事件通常由细胞培养中的发酵过程或储存期间引起，当含有蔗糖的配方水解导致非还原糖时，这会通过低pH和高温度加速。因此，制造过程需要严格控制，以通过适当的生产和配方条件满足CQAs。糖基化可以通过硼酸盐或离子交换色谱、毛细管等电聚焦、LC/MS方法和比色法检测。 5.3.胶体稳定性和粘度 胶体稳定性指的是折叠蛋白通过自相关沉淀在溶液中的倾向，由电荷不平衡、疏水斑块、融合蛋白界面解离和结合以及与离子的相互作用介导。 粘度是描述给定抗体配方流动阻力的相关属性，由不希望的分子间蛋白-蛋白相互作用引起，这些相互作用由胶体和构象浓度依赖行为介导。这些相互作用可能源于与部分原子电荷分布、等电点和偶极矩相关的变量域的静电属性，或导致自相关的疏水属性和形状互补性。对于高浓度的治疗性bsAbs/msAbs配方，胶体稳定性和粘度是重要的属性。通常通过盐或PEG诱导沉淀、静态光散射、多角度光散射和动态光散射（DLS）来评估蛋白质治疗剂的胶体稳定性。DLS可以在高通量设置中确定扩散相互作用参数（kD），特别适合评估配方条件及其在搅拌等应激条件下对胶体稳定性的影响。胶体稳定性通常在含有scFv域的bsAbs/msAbs中受损，由于VH-VL界面的柔韧性增加，这种柔韧性通过可逆解离和结合形成寡聚体，这一过程取决于蛋白质浓度，并可能受到pH值、离子强度和其他辅料的影响。Majumder等人证明，一个易于聚集的scFv-bsAb在组氨酸和谷氨酸的等摩尔缓冲液组合中具有改善的胶体稳定性，展示了配方对改善胶体稳定性的潜力。 自相互作用测定评估抗体在高浓度（>100 mg/mL）下配制用于治疗管理时的胶体稳定性风险。由于bsAbs中靶向臂的价数通常减少，mAbs中自相互作用测定观察到的趋势在bsAbs/msAbs中可能减弱，但不太可能完全消失。此外，任何bsAbs/msAbs平台的设计突变以强制正确的重-重和重-轻界面组装，如引入电荷对和疏水界面工程，如果突变部分或完全暴露或引起构象变化影响抗体表面属性，可能带来自相关风险。因此，重要的是只考虑低风险的靶向单元进行重组成bsAbs/msAbs，并通过自相互作用测定再次评估重组成分子对不希望的自相互作用的倾向。评估自相互作用的方法包括动态光散射（DLS）、亲和捕获自相互作用光谱（AC-SINS）、电荷稳定自相互作用光谱（CS-SINS）和生物层干涉测量（CSI-BLI）。DLS是一种广泛使用的评估抗体自相关性的技术，可以在微孔板格式中进行，使用少量抗体评估数百个样本。DLS测量增加的水动力半径作为蛋白质浓度的函数。从在相对较低的抗体浓度（1-20 mg/mL）下进行此分析得出的kD与高达175 mg/mL浓度的29种不同mAbs的粘度测量结果相关性良好。在AC-SINS中，抗体被吸附到金纳米颗粒上，产生高局部蛋白质浓度，模拟浓缩的抗体溶液。吸引的自相互作用减少固定抗体之间的粒子间距离，导致最大吸收波长（等离子体波长，λp）的红移。AC-SINS在高通量板格式中识别具有高自相关风险的抗体，同时在稀薄浓度（<50 μg/mL）下使用极少量的样本。这种方法通常用于筛选临床前阶段的抗体胶体稳定性风险。这种方法进一步发展为通过聚赖氨酸涂层通过电荷稳定（CS-SINS）筛选某些配方条件和弱酸性缓冲条件。虽然bsAb重组成可能导致衍生的bsAb与亲本mAb相比AC-SINS得分降低，但由于bsAbs AC-SINS得分与粘度风险之间关系不太明确，因此必须选择低风险的mAb进行重组成。 在生物层干涉测量（CSI-BLI）中，抗体通过其Fc区域装载到生物层干涉测量生物传感器上，以测量自结合反应。Fab可用于通过氢键配对、离子相互作用或疏水相互作用进行结合，该测定可以在低样品量（15μg）的高通量格式下进行。 抗体候选物和配方的粘度风险通常通过使用粘度计直接测量。由于高浓度配方需要大量样品，通常在开发过程的相对后期进行此实验。将单克隆抗体重组成bsAbs/msAbs可能会导致粘度增加，因为在存在两个靶向单元时会出现新的相互作用，特别是如果这些单元具有相反的静电属性。混合两种低粘度mAbs（pI分别为6.3和9.3）的粘度数据与相关bsAb的高粘度相关。新型几何结构导致的更大的bsAbs/msAbs也可能导致粘度问题，如一项研究中所示，一种双变量域免疫球蛋白bsAb比亲本mAb更粘稠，粘度的增加归因于bsAb的整体大小。有几种策略可以预防适用于mAbs和bsAbs/msAbs的粘度问题。首先选择对其预期给药途径具有有利的低粘度行为的bsAbs/msAbs非常重要。选择低粘度亲本抗体进行双特异性IgG重组可能无法预测具有有利粘度的bsAb/msAb，正如Tilegenova等人所证明的，用一个抗IL-13/IL-17双特异性IgG4抗体进行的研究发现，怀疑引起阳离子-π和/或π-π相互作用的芳香族点突变降低了双特异性的粘度，并且对一个在150 mg/mL时粘度高的单特异性抗GCGR IgG1抗体也成功。从蛋白质序列或结构计算的Fv净电荷可以表明潜在的粘度风险。Fv电荷<2的抗体被认为是高风险，因为它们可能有负电荷斑块，可能驱动与恒定域中的正电荷斑块自相关。此外，Fv电荷对称参数，即VH和VL的净电荷乘积，也可以表明由于自相关引起的粘度风险。 总之，稳定性评估是非常多维的，并且是全面开发性评估的关键要素。在目标给药途径和粗略配方的背景下最好评估稳定性。有大量的测定可用于这些测量，这些测定在实施的难易程度、通量和预测能力上有所不同，一个结构良好的评估策略应该在开发过程中利用多种测定。5.4.体内稳定性 治疗性抗体在给药后数天和数周内的体内物理化学稳定性可能对药物效力、清除和免疫原性有影响。与mAbs一样，IgG样的bsAbs/msAbs最好具有提供长半衰期的药代动力学（PK）特性。由于它们的半衰期较长，因此可以减少给药频率并改善患者依从性。与mAbs一样，bsAbs/msAbs的体内稳定性可以通过检测其在体内的浓度随时间的变化来评估，这通常通过ELISA或基于质谱的检测来完成。体内稳定性的测定对于预测药物效力和评估长期给药方案的可行性至关重要。 由于它们在循环中的半衰期大约为3周，内源性和重组抗体可以经历与治疗性抗体在制造和储存过程中类似的体内生物转化事件，包括异构化、氧化、糖基化、二硫键修饰、N-末端焦谷氨酸形成、C-末端赖氨酸剪切和蛋白水解裂解。在体内对抗体药物的生物转化事件的检测和定量是治疗性抗体开发中一个相对较新且日益增长的领域，这一领域面临着一些技术挑战。 血清是血液的一个亚室，含有富含白蛋白、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、同型半胱氨酸和其他小硫醇的异质环境，这可能导致抗体二硫键的重新排列，特别是对于IgG和IgG4。根据局部环境和溶剂暴露，这种混乱可能与使用工程二硫键以增强热和胶体稳定性的bsAb/msAb格式相关。 在啮齿动物和非人灵长类动物中进行的血清稳定性研究和药代动力学（PK）评估有助于评估bsAbs/msAbs的稳定性，并在开发性评估的早期识别潜在的责任。PK与抗原结合能力之间的关系可以用来识别体内不稳定的开发候选物。例如，体内脱酰胺作用可能导致抗原结合的丧失，影响效力，并可能引起潜在的关注。 IgG1、IgG2和IgG4亚类的的治疗性抗体可能容易受到木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和链球菌免疫球蛋白降解酶的重组蛋白酶裂解，不同的酶特异性和裂解效率主要基于它们各自的铰链序列。此外，IgG1可以被肿瘤微环境中的蛋白酶如基质金属蛋白酶裂解，或者在循环中，而IgG2则较不易受到裂解。IgG1两个重链的下铰链的裂解可能对Fc效应功能产生负面影响，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性，因为裂解位点靠近Fcy受体和C1q的结合位点，可能与自身炎症性疾病中mAbs的治疗抵抗性有关。蛋白酶裂解事件可能以类似的方式影响IgG型bsAbs/msAbs格式的铰链区域，具有潜在的意想不到的裂解敏感性、特异性和效率。因此，应在临床前开发阶段监测这些裂解事件。许多bsAb格式使用甘氨酸-丝氨酸的扩展连接序列来系上额外的模态并增加价数，这些可能容易受到体内蛋白水解裂解的影响。 相反，最近已经利用在实体瘤的肿瘤微环境中优先表达的某些蛋白酶的存在来激活被蛋白酶可裂解的域或肽段掩盖的bsAb TCEs，以限制它们在循环中的靶向毒性。在另一个例子中，蛋白酶敏感的连接子被用来将两个域抗体系成一个bsAb分子，用于治疗性口服治疗炎症性肠病。 6.可制造性 可制造性是分子开发性评估的一个组成部分。通过可制造性评估，可以更深入地了解分子行为，从而设计出既注重质量又注重数量的制造过程和控制策略。这种评估最好在代表性材料上进行，评估与产品质量、可扩展性和工艺产量相关的大规模生产过程的技术可行性。通常，可制造性评估分子适应平台流程和方法，以支持简化的开发工作。及早识别CQAs（关键质量属性）和工艺及分析开发的风险，可以减轻开发挑战，并允许优先分配工艺开发资源。开发候选物的可制造性是实现供应高质量、纯化和配方化的抗体以推进毒理学研究、临床研究和商业化的关键考虑因素。执行严格和全面的临床计划以及满足商业化视角下的供应链目标所需的抗体数量，突出了建立强大和可扩展制造工艺的基本需求。 6.1.双特异性抗体/多特异性抗体的制造考虑 从可制造性的角度来看，单克隆抗体（mAbs）已经通过发表的报告和行业指导文件得到了很好的表征。自1986年首个单克隆抗体商业化以来，已经开发了许多可制造性工具，并对潜在的责任进行了表征，降低了将单克隆抗体治疗推进到制造过程中的相关风险和挑战。 尽管双特异性抗体/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）作为一类治疗药物取得了进展和势头，但与单克隆抗体相比，支持其开发到制造的资源相对较少，这主要是因为它们在临床和商业制造方面的历史相对有限。此外，bsAbs/msAbs的结构异质性除了必须克服的单克隆抗体工艺障碍外，还提出了几个可制造性挑战。 6.2.工艺考虑 上游工艺考虑 在开发稳定表达bsAb/msAb的细胞系时，上游处理考虑不仅必须评估典型的开发标准，如蛋白质滴度、细胞系稳定性、群体倍增时间、翻译后修饰以及在预测设备、材料、培养基和饲料背景下的可制造性，而且还必须额外评估完整bsAb/msAb分子正确组装的可能性。 开发bsAb/msAb上游工艺可能非常具有挑战性，因为几个变量可能影响正确与错误组装分子的比例，以及错误组装物种的身份和相对丰度。载体和序列设计、选择克隆性和正确组装分子产量的过程，以及细胞培养和蛋白质表达的多因素性质（如上所述），都是需要考虑的关键因素。使用导向突变，如knob-into-hole突变，结合细胞系开发选择和上游工艺开发考虑，通常用于努力优化粗提物中正确配对目标分子的浓度。 尽管在细胞系开发和上游处理方面取得了进展，但在细胞培养上清液中存在错配的bsAb/msAb并不罕见，制造过程中还需要在下游成功纯化此类产品相关杂质的方法。 下游工艺考虑 在下游处理中，上游bsAb/msAb制造过程中产生的错配变体是不受欢迎的，它们作为工艺杂质，给纯化过程带来额外负担。在典型的单克隆抗体制造过程中，半抗体和抗体片段是常见的杂质，但具有显著结构和生化特性差异的变体更容易使用依赖分子电荷差异的色谱方法分离。这对bsAbs/msAbs的可制造性提出了特别的挑战，因为潜在的错误组装分子，如几个四链bsAb分子中的那些，可能表现出难以用制造中常用的分离方法区分的生物物理特性。不同质量的产品相关杂质也可能影响纯化和表征方法，包括由于bsAb/msAb变体的聚集倾向增加而产生的重大制造挑战。因此，在开发bsAb/msAb候选物时及早评估可制造性是非常有利的，以确定由于链错配而产生的结构变体之间的分子属性差异是否提供了足够的分辨率，以实现大规模成功纯化。变体之间的pI差异是主要关注点，因为在大规模制造中广泛使用了pH和/或电导依赖的色谱过程。 也可以利用其他纯化方法从其他属性中分离产品相关变体，包括利用疏水相互作用色谱针对变体之间的疏水性差异，或依靠独特的属性组合通过多模式色谱方法实现分离。虽然结合多种纯化方法可以增加成功分离配对的bsAbs/msAbs与错配变体的可能性，但涉及的额外时间和成本通常是不受欢迎的。在制造过程中，定制与建立可靠的平台流程相反，突出了开发需要有限工艺定制的bsAbs/msAbs的价值。 使用适当的分析方法对于生产中双特异性抗体/多特异性抗体（bsAb/msAb）的特性描述至关重要。除了典型的与产品相关的、宿主细胞相关的以及其他与工艺相关的杂质外，建立一个足够灵敏的分析方法以区分正确和错误组装的抗体产品非常重要。在开发过程中，区分这些变体的可制造性和工艺开发至关重要。此外，这种材料可能用于临床前研究，强调了其质量的重要性。当考虑制造规范时，批量放行标准推动目标分子的最终浓度以及任何指定杂质在可接受的范围内。液相色谱/质谱（LC/MS）方法，包括去糖基化完整质谱，通常能够区分错配变体，识别包含错配的重链（HC）和/或轻链（LC）组合的分子，以及正确配对的bsAbs/msAbs。随着bsAb/msAb药物开发向商业化发展，另一个关键的分析挑战是生物测定法的开发。bsAb/msAb的生物测定法必须准确且可重复地反映分子的双重作用机制和潜在的机制协同作用。将这些组合到单一测定中可能证明是一个重大挑战，评估是否需要开发两个单独的生物测定法是建立适当分析策略时的一个重要因素。7.结论 首个基于bsAb和msAb的药物开发涉及大量投资，用于制造和评估这些新兴分子，以满足现代治疗药物所期望的严格的安全性和有效性标准。治疗性双特异性抗体的开发有着悠久且研究深入的历史，始于20世纪60年代双特异性F(ab)2分子的形成，并于2018年首个双特异性药物blindumomab获得FDA批准。随后，用于生成这些复杂分子的蛋白工程方法以及高效评估其功能和开发性属性所需的技术和知识都有了显著改进。这些努力的结果是，过去几年有数百个bsAb/msAb分子进入临床研究，为临床上评估这些令人兴奋的分子提供了独特的治疗潜力。同时在体内对多个靶标采取行动的能力为药物开发提供了组合机会，并有望改变许多疾病的治疗格局。因此，用于工程化和评估这些独特分子的方法必须继续发展，以满足这一机会并为患者提供价值。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:尽管开发了多种治疗药物，多发性骨髓瘤仍然无法治愈。最近，T细胞重定向免疫疗法已成为治疗难治性骨髓瘤的有希望的策略。使用嵌合抗原受体（CAR）-T细胞和双特异性抗体的临床试验已在三重难治性患者中展示了成功的抗骨髓瘤反应。然而，需要考虑并妥善管理与激活的免疫细胞的靶向/非靶向反应相关的独有且不想要的免疫效应。本综述总结了用于治疗难治性骨髓瘤的双特异性抗体的最新进展。它概述了它们开发的历史，以及它们的机制作用和它们在骨髓瘤治疗中当前和潜在的未来角色的讨论。随着越来越多的证据出现，为CAR-T细胞疗法的时机提供信息，临床试验的结果以及双特异性抗体的现成特性也表明了它们的治疗时机。这些发现将促进双特异性抗体与其他适当药物联合用于难治性骨髓瘤的进一步开发和应用。 1.引言 多发性骨髓瘤治疗领域已经开发了多种治疗药物，包括单克隆抗体（mAbs）、免疫调节药物（IMiDs）和蛋白酶体抑制剂（PIs）。这些药物的组合治疗方案已经取得了更好的临床反应，延长了多发性骨髓瘤患者的生存期。然而，由于多发性骨髓瘤细胞的肿瘤间和肿瘤内异质性，技术上多发性骨髓瘤仍然无法治愈。 为了克服这个问题，一种有希望的策略是改变当前的治疗方式及其在多发性骨髓瘤治疗后期的组合。同时，开发新的治疗方式对于改善治疗结果也很重要。最近，T细胞重定向免疫疗法，如嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法和双特异性抗体疗法，已经被开发出来以增强治疗效果。临床试验已经证明，即使在三重难治性多发性骨髓瘤患者中，也产生了显著的抗骨髓瘤T细胞反应。由于双特异性抗体作为一种现成的治疗方式具有优势，因此不仅进行了单药治疗，还进行了与其他药物联合治疗难治性多发性骨髓瘤的临床试验。另一方面，与免疫细胞强烈激活相关的特有和不想要的免疫效应，如细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），已经出现，除了细胞减少症外，还需要仔细管理。 2.双特异性抗体的基础知识 在这篇综述中，我们重点关注了用于治疗难治性多发性骨髓瘤的双特异性抗体的最新进展。概述了它们开发的历史，以及它们的机制作用，以及它们在多发性骨髓瘤治疗中的当前和未来状况。双特异性抗体的基本结构由一个Fc区域和两个相同的可变区域组成（图1a）。由于可变区域的氨基酸序列在不同抗体之间不同，它决定了抗体对目标抗原的结合特异性和能力。在20世纪60年代，首次描述了产生具有两个不同可变区域的抗体的概念。然后在20世纪80年代，在建立了生产mAbs的杂交瘤方法之后，杂交-杂交瘤组合使双特异性抗体的生成成为可能（图1b）。在基因工程技术的基础上，两个单链片段变量（scFvs）与连接序列融合，即所谓的双特异性T细胞引导剂（BiTE），于1995年首次合成（图1c）。BiTE旨在识别两个目标抗原——上皮细胞黏附分子（EpCAM）和CD3——用于实体瘤的治疗。在血液系统恶性肿瘤领域，2000年开发了一种特异性为CD19和CD3的BiTE，并随后对患有惰性淋巴瘤的患者进行了1期临床试验，证明了CD19 x CD3 BiTE的安全性和有效性。这开创了一系列临床试验，证明了blinatumomab（CD19 x CD3）对治疗难治性急性淋巴细胞白血病是有效的。这些发现最终导致了用于治疗其他血液系统恶性肿瘤的新双特异性抗体的开发。 图1 双特异性抗体的概念。a 传统抗体具有一个恒定（Fc）区域和两个相同的抗原结合位点，由轻链（VL）和重链（VH）的可变区组成。b 双特异性抗体具有两个可变区，分别针对两种不同的抗原。为了激活针对肿瘤细胞的人类T细胞，其中一个通常特异性结合人类CD3分子，另一个结合肿瘤抗原。作为模型，展示了通过杂交瘤技术产生的双特异性抗体，如卡妥索单抗。c 双特异性T细胞引导者（BiTE）配备了两个单链片段变量（scFvs），它们与一个柔性连接序列融合。BiTE能够通过结合人类CD3分子和肿瘤抗原，使人类T细胞与肿瘤细胞结合。 最近开发的双特异性抗体是基于三个组成部分设计的。一个特定于主要由T细胞表达的免疫调节蛋白，如CD3、4-1BB、CD28或PD1，另一个与肿瘤细胞表达的抗原结合。由于抗体或基于配体的方式对这两个组成部分都很灵活，它们可以针对非HLA/肽复合物以及HLA/肽复合物，而不考虑T细胞的HLA限制。重要的是，这两个组成部分通过一个“核心”部分进行多聚化，该部分可以是连接序列、免疫球蛋白的Fc区域或载体蛋白，如白蛋白。采用这种方法，到目前为止已经开发了100多种不同的结构。 为了阐明双特异性抗体的特异性和反应性，在图2中总结了两种重要的反应性。非靶向反应主要指的是产生的双特异性抗体本身对无关抗原的交叉反应，但对于一些类型的双特异性抗体，也可能考虑可能的自我激活。Catumaxomab（EpCAM x CD3）是首个获准用于治疗由实体瘤引起的恶性腹水的双特异性抗体。它具有两个可变区域分别结合EpCAM和CD3，以及一个野生型Fc区域（图1b）。不幸的是，在临床试验中，静脉注射catumaxomab引起了暴发性肝炎。随后的免疫组化分析表明，肝脏中的Kupfer细胞和T细胞可能通过野生型Fc和CD3在没有EpCAM阳性靶细胞的情况下相互交互，导致自我激活。因此，在最近的双特异性抗体中，通常使用突变型或IgG4型Fc区域，这些区域不能结合表达Fc受体的细胞，以避免由于免疫细胞的自相残杀而引起的不必要的毒性。同时，也需要仔细考虑靶向反应（图2）。肿瘤和正常细胞/组织之间在靶抗原表达水平上的明显差异对于最小化靶向/非肿瘤反应很重要。此外，双特异性抗体对肿瘤细胞的靶向反应增强将导致严重的CRS。当靶抗原在肿瘤细胞上高度表达和/或患者体内仍有高肿瘤负担时，应该小心，并可能需要使用tocilizumab和皮质类固醇进行CRS管理。 图2 由双特异性抗体诱导的靶向和非靶向反应。a 非靶向反应可能是两种类型之一。如果双特异性抗体包含野生型Fc区域，可能在没有肿瘤细胞的情况下在人类T细胞和NK细胞之间产生人工免疫突触，导致自我激活。b 如果双特异性抗体与正常细胞表达的不相关抗原发生交叉反应，可能会发生不想要的T细胞对正常细胞的反应。c 当正常细胞表达目标抗原时，双特异性抗体可能诱导不想要的靶向/肿瘤反应。这种靶向/肿瘤反应的程度将由肿瘤细胞和正常细胞之间目标抗原表达的差异决定。d 强烈的靶向（对肿瘤）反应将导致T细胞产生的细胞因子数量增加。从这个角度来看，细胞因子释放综合征的管理需要仔细注意。注意黑色双特异性抗体的颜色从b到d表示Fc区域的突变，以避免招募表达Fc受体的免疫细胞。 3.双特异性抗体在临床试验中被批准并测试用于治疗骨髓瘤 针对骨髓瘤治疗的双特异性抗体主要针对B细胞成熟抗原（BCMA）。其他特异性针对G蛋白偶联受体家族C组5成员D（GPRC5D）、Fc受体同源5（FcRH5）和CD38。截至2023年底，三种双特异性抗体—teclistamab、elranatamab和talquetamab—已被食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗四线治疗后的三重难治性骨髓瘤，类似于CAR-T细胞疗法。尽管这些尚未在日本获得批准，但针对日本患者的临床试验已经取得了有希望的结果。表1总结了针对骨髓瘤的双特异性抗体，每个抗体的重要点如下所述。 3.1.AMG-420和pavurutamab（AMG-701） 在骨髓瘤双特异性抗体研究的初期，AMG-420是第一个被开发的。由于AMG-420是一种基于BiTE的模式，针对BCMA，需要持续给药以维持其血清浓度。一项为期4周的静脉注射1期临床试验显示，总体反应率达到31.0%，最多10个周期。Pavurutamab是一种双特异性抗体，具有突变的Fc区域以阻止与NK细胞的相互作用，实现了30.0-40.0%的反应率。不幸的是，这两种药物的临床试验现在已经停止。 3.2.Teclistamab（JNJ-64007957） Teclistamab是针对BCMA和CD3的双特异性抗体，基于DuoBody技术，是FDA批准用于治疗难治性骨髓瘤的第一种双特异性抗体。在1/2期临床试验中，165名三重难治性骨髓瘤患者接受了皮下注射的teclistamab。在平均14.1个月的随访期间，总体反应率达到63.0%，完全反应率为39.4%。CRS在72.1%的患者中观察到（3级；0.6%，4级；0%），中性粒细胞减少症（70.9%）、贫血（52.1%）和血小板减少症（40.0%）也发生了，表明需要管理这些不良事件。 3.3.Elranatamab（PF-06863135） Elranatamab是一种针对BCMA和CD3的人源化双特异性抗体，最近也被FDA批准用于难治性骨髓瘤。在一项1期临床试验中，88名患者接受了单药治疗（n=23，静脉注射；n=65，皮下注射），平均随访12.0个月，客观反应率达到64.0%，包括38.0%的患者完全反应或更好。CRS在87.3%的患者中发生，但重要的是没有超过3级。中性粒细胞减少症（74.5%）、贫血（67.3%）、淋巴细胞减少症（52.7%）和血小板减少症（50.9%）也被观察到。在另一项2期临床试验中，招募了123名尚未接受BCMA导向治疗的患者。这些患者每周接受一次皮下注射的elranatamab，然后在六个周期后每两周一次。客观反应率达到61.0%，35.0%的患者实现了完全反应或更好；此外，50名接受每两周治疗的应答者中有40名维持了6个月以上的反应。在15个月的随访点，反应持续时间（DOR）、无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）分别为71.5%、50.9%和56.7%。观察到的不良事件包括CRS（57.7%；没有3级或4级）、中性粒细胞减少症（48.8%）、贫血（48.8%）、淋巴细胞减少症（26.8%）和血小板减少症（30.9%），但水平表明它们的耐受性。 3.4.Abbv-383（TNB-383B） Abbv-383是一种针对BCMA和CD3的双特异性抗体。在1期临床试验中，124名患者每3周接受一次静脉注射的Abb-383。在122名患者中，客观反应率达到57.0%，其中43.0%的患者有非常好的部分反应（VGPR）或更好。CRS在57.0%的患者中观察到（60mg剂量扩展队列中为71.0%），但超过3级的严重性很少见。所有患者中报告了中性粒细胞减少症（37.0%）、贫血（29.0%）、淋巴细胞减少症（15.0%）和血小板减少症（23.0%）。还在220名患者中进行了Abbv-383的进一步研究。 3.5.Alnuctamab（CC-93269） Alnuctamab是一种针对BCMA和CD3的2+1 T细胞引导者。在1期试验中，73名之前接受过3种以上治疗线的患者接受了皮下注射的alnuctamab。在平均7.4个月的随访期间，总体反应率达到54.0%，alnuctamab的生物利用度半衰期为14天。CRS在56.0%的患者中发生，但没有超过3级的情况。中性粒细胞减少症（55.0%）、贫血（47.0%）和血小板减少症（37.0%）也被观察到。 3.6.Linvoseltamab（REGN5458） Linvoseltamab是一种针对BCMA和CD3的双特异性抗体。在252名参加临床试验的患者中，73名被分配到1期，179名（n=104，50mg；n=75，200mg）被分配到2期。客观反应率分别为64.0%（200mg队列，包括1期研究中的12名患者）和50.0%（2期研究中的50mg队列），6个月反应持续的概率分别为89.0%（200mg）和85.0%（50mg）。治疗相关的不良事件包括CRS（37.0%，200mg；53.0%，50mg；>3级1.0-2.0%）、疲劳（32.0%，200mg；33.0%，50mg）、贫血（28.0%，200mg；40.0%，50mg）和感染（43.0%，200mg；59.0%，50mg）。 3.7.Talquetamab（JNJ-64407564） Talquetamab靶向骨髓瘤细胞上的GPRC5D和CD3，也已被FDA批准用于临床。进行了包括两个阶段（剂量递增阶段；剂量扩展阶段）的1期临床试验。在总共232名患者中，一部分接受了皮下注射的talquetamab（n=30，405μg/周；n=44，800μg/每2周），反应率分别为70.0%和64.0%，中位反应持续时间分别为10.2个月和7.8个月。除了血液学毒性外，CRS在两个组中分别观察到77.0%和80.0%，但超过3级的严重性非常罕见。所有患者中报告了中性粒细胞减少症（67.0%和36.0%）、贫血（60.0%和43.0%）、淋巴细胞减少症（40.0%和39.0%）和血小板减少症（37.0%和23.0%），但皮肤相关事件和味觉障碍被认为是与GPRC5D靶向相关的靶向/肿瘤不良事件。 3.8.Cevostamab（BFCR4350A） Cevostamab是一种针对FcRH5和CD3的双特异性抗体。在1期研究中，160名患者被纳入并每3周接受一次静脉注射的cevostamab。总体反应率分别为54.5%（160mg）和36.7%（90mg），平均随访6.1个月。作为常见的不良事件，CRS（80.0%）、中性粒细胞减少症（18.1%）和贫血（31.9%）被报告。重要的是，这项研究包括了已经接受过CAR-T细胞疗法、双特异性抗体和/或BCMA靶向治疗的患者。在他们中，总体反应率分别为44.4%（CAR-T细胞）、33.3%（双特异性抗体）、50.0%（抗体-药物偶联物）和36.4%（抗BCMA靶向剂）。因此，cevostamab单药治疗可以在T细胞重定向治疗后诱导抗骨髓瘤反应，这似乎主要针对BCMA。 4.新双特异性抗体的开发，用于包括骨髓瘤在内的恶性肿瘤治疗 除了上述提到的双特异性抗体外，已开发了新的模式以提高骨髓瘤和其他恶性肿瘤治疗效果。 4.1.共刺激双特异性抗体 激活人T细胞的双特异性抗体能够结合肿瘤细胞抗原和CD3分子。通过这种人工免疫突触，相对于未经激活的T细胞，中心/效应记忆T细胞更倾向于被激活以针对肿瘤细胞。已经生成了结合肿瘤抗原和共刺激分子（如CD28或4-1BB（肿瘤抗原×CD28，肿瘤抗原×4-1BB））的共刺激双特异性抗体，以有效刺激T细胞，允许向T细胞传递足够的次级信号以激活（图3）。此外，4-1BB的参与似乎也能激活针对肿瘤细胞的NK细胞。也有报道其他共刺激双特异性抗体，如CD40×4-1BB，这些可以诱导树突细胞成熟，从而成功激活和扩增T细胞。另一方面，有迹象表明，表达耗竭标记物的T细胞，如PD1，也可能由于PD1与肿瘤细胞上的PDL1之间的相互作用而无法充分激活。为了解决这个问题，已经开发了新的共刺激双特异性抗体，可以结合PDL1和CD28或4-1BB，将抑制信号转化为激活信号（图3）。这些模式尚未应用于骨髓瘤的治疗，但已在临床试验中测试了使用抗骨髓瘤药物与抗PD1或PDL1抗体联合治疗难治性骨髓瘤。未来，CD3靶向双特异性抗体与共刺激双特异性抗体的组合可能能够进一步提高难治性骨髓瘤和其他恶性肿瘤患者的临床结果。 图3 共刺激双特异性抗体。一种特异性针对肿瘤抗原和CD28或4-1BB的双特异性抗体能够产生人工次级免疫突触，模仿生理共刺激信号，充分激活针对肿瘤细胞的人类T细胞。此外，针对PDL1和共刺激分子（CD28或4-1BB）的双特异性抗体可以通过不仅转换正向共刺激信号，还阻断PD1-PDL1轴来调节PDL1的抑制信号。图示为基于BiTE的共刺激双特异性模式示例。BsAb：双特异性抗体。 4.2.桥接双特异性T细胞引导者（B-BiTE） 最近的双特异性抗体被设计为选择性激活人T细胞，以避免在不针对肿瘤细胞的情况下T细胞和NK细胞之间的不希望的自我激活。换句话说，它们失去了诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）的潜力，同时获得了强大的T细胞反应性。此外，由于它们通常针对肿瘤细胞和骨髓瘤细胞表达的单一抗原，表达低水平目标抗原的肿瘤能够逃逸和生长。为了克服这些与双特异性抗体相关的障碍，已经报告了一种称为桥接BiTE（B-BiTE）的新概念。B-BiTE具有两个针对人免疫球蛋白G和人CD3的Fc区域的scFvs（图4a），因此无法直接诱导抗骨髓瘤效应。然而，如果在给药前将一系列临床可用的单抗与B-BiTE结合，带有B-BiTE的武装单抗（mAb/B-BiTE复合物）可以基于额外的人T细胞反应性和保留的人NK细胞反应性，诱导“双重淋巴细胞激活”（图4b，c）。此外，可以通过使用现有的单抗轻松快速地产生一系列mAb/B-BiTE复合物，这表明通过使用两种或更多不同的mAb/B-BiTE复合物进行顺序治疗，可能可以实现深入和持久的抗骨髓瘤反应。 图4 桥接双特异性T细胞引导者（B-BiTE）。a B-BiTE的概念。B-BiTE是BiTE技术的一种模式，其中两个scFvs与人类IgG Fc和人类CD3ε结合，并与一个连接序列融合。b 通过B-BiTE与针对肿瘤抗原的人类IgG的Fc区域结合，可以轻松生成新的双特异性抗体，即mAb/B-BiTE复合物。c 通过mAb/B-BiTE复合物介导的人类T细胞和NK细胞的双重淋巴细胞激活，可以诱导增强的抗骨髓瘤效应。 小林等人详细研究了B-BiTE的特性。首先，他们确认B-BiTE可以与单抗结合，而不会中断NK细胞对目标细胞的激活。接下来，使用daratumumab和elotuzumab治疗骨髓瘤，在没有针对CD38和SLAMF7的临床可用双特异性抗体的情况下，他们成功地产生了daratumumab/B-BiTE和elotuzumab/B-BiTE复合物。这些基于B-BiTE的新型双特异性抗体在保留NK细胞反应性的同时成功地诱导了T细胞反应性，与单独使用单抗相比，在体外和体内都增强了抗骨髓瘤效应。mAb/B-BiTE复合物可能在体内稳定约72小时，表明长期激活T细胞似乎没有被观察到。此外，图2中总结的不希望的非目标反应对mAb/B-BiTE复合物没有观察到，而目标/肿瘤反应性，包括由daratumumab/B-BiTE和elotuzumab/B-BiTE复合物介导的免疫细胞的兄弟相残反应，被认为可能可以忽略不计。在mAb/B-BiTE复合物存在的情况下，NK细胞反应确实加强了骨髓瘤细胞的目标T细胞反应，但并没有增加T细胞激活引起的炎症细胞因子水平。最后，使用daratumumab/B-BiTE和elotuzumab/B-BiTE的顺序治疗似乎克服了骨髓瘤的抗原异质性，并确实在与没有B-BiTE的两种单抗和单独的mAb/B-BiTE相比，诱导了足够和持久的抗骨髓瘤效应。另一方面，应该谨慎考虑B-BiTE在体内偶然与自身反应性免疫球蛋白和/或副蛋白偶联的可能性，因为这些意想不到的mAb/B-BiTE复合物可能会引起自身免疫性疾病。需要进一步分析，这种模式有潜力成为难治性骨髓瘤和其他血液恶性肿瘤的一种新的免疫治疗形式。 4.3.其他双特异性和三特异性抗体以及NK细胞引导者 ISB1342是一种靶向CD38和CD3的双特异性抗体，已经开发出来。它对CD38的结合亲和力很高，而对CD3分子的结合亲和力则适当调节，以避免因强烈T细胞激活而导致的严重CRS 。由于ISB1342可以结合到daratumumab不同的CD38部分，因此可能可以使用ISB1342与daratumumab的顺序和联合疗法。临床前结果表明，ISB1342在体外和体内都诱导了成功的抗骨髓瘤效应，因此目前正在进行1期临床试验。 为了绕过骨髓瘤细胞的逃逸并克服它们的异质性，已经开发并测试了双重靶向CAR-T细胞。例如，已经报道了BCMA x CD19、BCMA x CD38、BCMA x SLAMF7和BCMA x GPRC5D双重靶向CAR-T细胞。相比之下，为了通过一种模态同时结合CD3的两种不同抗原来特异性针对骨髓瘤细胞，需要设计三特异性抗体。例如，已经报道了BCMA x CD38 x CD3靶向的三特异性抗体ISB2001，并且现在计划为患有难治性骨髓瘤的患者进行1期临床试验。有趣的是，已经合成了一种能够结合CD38、CD3和CD28的三特异性抗体。这种模态通过同时传递共刺激信号，充分激活了人T细胞，结果在体内模型中减少了调节性T细胞并诱导了成功的抗骨髓瘤反应。因此，目前正在进行1期研究以测试这种方法的有效性。 还为骨髓瘤治疗开发了一种可以结合肿瘤细胞和NK细胞的NK细胞引导者。AFM26是一种基于TandAb的四价模态，靶向BCMA和CD16a，RO7297089也是BCMA和CD16a的双特异性。这些模态诱导了对骨髓瘤细胞的细胞毒性，但使用RO7297089a的1期试验似乎与BCMA的T细胞引导者相比显示出不充分的结果。 5.将双特异性抗体与其他治疗方式结合用于骨髓瘤治疗 如上所述，现在推荐在包括抗CD38单抗、IMiDs和PIs在内的4种先前治疗后，对难治性骨髓瘤患者使用双特异性抗体。为了改善临床结果，正在进行一系列临床试验，研究使用双特异性抗体与单抗、IMiDs和PIs的联合疗法（表2）。重要的是，由于双特异性抗体和CAR-T细胞都可以在骨髓瘤治疗的相似时间点使用，本段讨论了应该先使用哪种模态，以及如何使用这些药物以最大化治疗效果。 5.1.与双特异性抗体的联合疗法 如表2所示，已经设计了使用teclistamab（MajesTEC）、elranatamab（MagnetisMM）、linvoseltamab（LINKER-MM）、talquetamab（MonumenTAL/TRIMM）和cevostamab（CAMMA）的临床试验。其中，已经测试了与daratumumab、isatuximab、IMiDs（lenalidomide、pomalidomide）、PIs（bortezomib、carfilzomib）和类固醇（dexamethasone）的双特异性抗体联合疗法。基本上，通常使用daratumumab，可能是为了通过双特异性抗体在试验中缺乏的补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）活性来增强其抗骨髓瘤效应。伽马分泌酶抑制剂可能有助于抑制骨髓瘤细胞中BCMA抗原的脱落。此外，daratumumab可能消除CD38阳性的调节性T细胞，从而增加T细胞数量及其细胞毒性。环磷酰胺也可能能够与双特异性抗体联合减少高肿瘤负荷患者的调节性T细胞数量。有趣的是，已经在RedirecTT-1试验中研究了两种不同的双特异性抗体—teclistamab和talquetamab的组合。在63名患者中，所有剂量的总体反应率为84.0%，推荐的2期剂量（RP2D）为92.0%。更多细节将在未来公布。 5.2.双特异性抗体和CAR-T细胞疗法：应该先开始哪个？ 基本上，如果可用，双特异性抗体（与上述其他模态联合）简单地应用于不适合CAR-T细胞的患者。然而，在既适合双特异性抗体又适合CAR-T细胞的患者中，可能需要仔细考虑。已经分析了先前接触过BCMA靶向双特异性抗体的骨髓瘤患者使用CAR-T细胞的顺序疗法。在这项研究中，7名患者对BCMA靶向双特异性抗体治疗有抗性，接受ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel）治疗的患者的总体反应率为57.1%（4名患者），平均反应持续时间为8.2个月。另一项研究发现，在19名先前接受过双特异性抗体治疗的患者中，有16名在T细胞重定向治疗后达到了84.0%的总体反应率（n=10，双特异性抗体；n=9，CAR-T），这些患者的中位PFS为28.9个月。重要的是，82.0%的患者先前接受过GPRC5D x CD3双特异性抗体治疗，只有18.0%的患者接触过BCMA x CD3双特异性抗体，表明切换T细胞重定向疗法的目标抗原可能有效。 为了将临床上可用的CAR-T细胞疗法应用于骨髓瘤患者，需要收集自体外周血单核细胞（PBMCs）以产生CAR-T细胞。患者的T细胞适应性，代表T细胞的主要功能之一，主要由未经激活、记忆和终末分化的T细胞比例决定，可能会影响CAR-T细胞生产的成功。实际上，表现出未经激活/中心记忆T细胞特征的CAR-T细胞在给药后似乎会在体内诱导长期抗肿瘤效应。另一方面，用双特异性抗体重定向的T细胞会通过激活进一步分化，导致耗尽的T细胞数量增加，这些细胞可能不是CAR-T细胞的适当资源。 尽管需要进一步分析，但如果患者不是虚弱的，他们的疾病状况由于染色体异常和疾病进展而构成高风险，并且他们适合CAR-T细胞疗法，那么在双特异性抗体给药之前尽早收集PBMCs可能更好。在等待CAR-T细胞制造的同时，通常需要对接受白细胞分离术的患者进行调理，以减少骨髓瘤细胞的负担。在这些患者中，除了其他模态（单抗、IMiDs和/或PIs）之外的双特异性抗体作为过渡疗法来抑制骨髓瘤细胞生长是有希望的。最近的分析表明，体内效应CD8+ T细胞的克隆扩增对于实现足够的抗骨髓瘤反应很重要，耗尽的CD8+ T细胞的丰度可能与BCMA x CD3双特异性抗体治疗后的不良临床反应相关。由于双特异性抗体的治疗间隔可以重新激活人类T细胞，因此需要考虑适当的治疗持续时间，以避免体内T细胞耗竭。因此，这些结果表明，在更早的治疗线上应用双特异性抗体也更好，以最大限度地发挥它们的抗骨髓瘤效应。双特异性抗体对CAR-T细胞疗法靶向相同或不同抗原治疗后的骨髓瘤的疗效需要进一步评估。Cevostamab在CAR-T细胞疗法后可以发挥作用。目前正在进行2期临床研究，以阐明使用BCMA CAR-T细胞疗法后序贯治疗cevostamab能否实现无最小残留疾病（MRD）的抗骨髓瘤反应。 值得注意的是，同种异体T细胞、诱导多能干细胞（iPS）分化的T细胞和/或NK细胞可以作为下一代资源，用于制造CAR-T细胞和CAR-NK细胞，作为现成的产品。人类NK细胞可以从脐带血中收集，可能具有作为“通用”和“多才多艺”的细胞资源的潜力，因为它们不仅可以诱导ADCC反应，而且在将CD3和T细胞受体一起转导到NK细胞时，还可以诱导人工T细胞反应。一旦这些第三方衍生的新鲜CAR表达细胞在临床上可用，双特异性抗体的使用将发生巨大变化，从而进一步提高难治性骨髓瘤的治疗。 6.管理与双特异性抗体治疗相关的不良事件 图2展示了上一节讨论的可能的非目标反应和不希望的靶向反应。这里总结了一些重要的与双特异性抗体临床使用相关的不良事件。CRS和ICANS在双特异性抗体剂量递增时大多被观察到，但与CAR-T细胞相比，3级以上的严重程度通常很少见。这些事件可能与高肿瘤负担和更高剂量的双特异性抗体有关。因为ICANS通常由CRS先发生，其中发生发热、低血压和/或低氧血症，所以通常首先可以管理CRS。根据美国移植和细胞治疗学会（ASTCT）共识分级指南，应给予tocilizumab和皮质类固醇。Anakinra是FDA批准的IL-1受体拮抗剂，也可以考虑使用，因为除了IL-6之外，IL-1信号也可以加剧CRS相关毒性。Dasatinib是一种酪氨酸激酶抑制剂，可以阻断人T细胞的Src/Lck信号。它可以可逆地抑制T细胞激活，因此可能允许调节T细胞对肿瘤的反应并最小化不良事件。 已经观察到一些血液学不良事件，如中性粒细胞减少症、贫血、淋巴细胞减少症、血小板减少症和低丙种球蛋白血症。也经历了超过3级的细胞减少症（大约10.0-60.0%的中性粒细胞减少症，15.0-50.0%的贫血，10.0-50.0%的淋巴细胞减少症，10.0-30.0%的血小板减少症）和低于400 mg/dL的低丙种球蛋白血症（70.0-90.0%）。应考虑对由于白细胞减少而可能发生的水痘-带状疱疹病毒和真菌感染（包括肺孢子虫）进行预防。还需要考虑对细菌感染和COVID-19的疫苗接种。对于超过3级的中性粒细胞减少症患者，建议使用粒细胞集落刺激因子（G-CSF），但最好在间隔后给予，以避免加剧CRS。尚未阐明为什么即使谱系细胞不表达目标抗原，也会诱发细胞减少症，但已经讨论了由于细胞因子释放和浆细胞减少而引起的旁观者效应的可能性。 7.结论 我们总结了目前和新型的用于治疗骨髓瘤的双特异性抗体。应该仔细注意双特异性抗体引起的非目标/目标不良事件的可能性。同时，为了最大化T细胞重定向疗法，避免T细胞耗竭也很重要。在考虑难治性骨髓瘤的CAR-T细胞疗法的时机时，临床试验的结果和双特异性抗体作为现成模态的特点可能会进一步促进它们在未来的发展和应用，与其他抗骨髓瘤药物联合用于骨髓瘤。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:尽管开发了多种治疗药物，多发性骨髓瘤仍然无法治愈。最近，T细胞重定向免疫疗法已成为治疗难治性骨髓瘤的有希望的策略。使用嵌合抗原受体（CAR）-T细胞和双特异性抗体的临床试验已在三重难治性患者中展示了成功的抗骨髓瘤反应。然而，需要考虑并妥善管理与激活的免疫细胞的靶向/非靶向反应相关的独有且不想要的免疫效应。本综述总结了用于治疗难治性骨髓瘤的双特异性抗体的最新进展。它概述了它们开发的历史，以及它们的机制作用和它们在骨髓瘤治疗中当前和潜在的未来角色的讨论。随着越来越多的证据出现，为CAR-T细胞疗法的时机提供信息，临床试验的结果以及双特异性抗体的现成特性也表明了它们的治疗时机。这些发现将促进双特异性抗体与其他适当药物联合用于难治性骨髓瘤的进一步开发和应用。 1.引言 多发性骨髓瘤治疗领域已经开发了多种治疗药物，包括单克隆抗体（mAbs）、免疫调节药物（IMiDs）和蛋白酶体抑制剂（PIs）。这些药物的组合治疗方案已经取得了更好的临床反应，延长了多发性骨髓瘤患者的生存期。然而，由于多发性骨髓瘤细胞的肿瘤间和肿瘤内异质性，技术上多发性骨髓瘤仍然无法治愈。 为了克服这个问题，一种有希望的策略是改变当前的治疗方式及其在多发性骨髓瘤治疗后期的组合。同时，开发新的治疗方式对于改善治疗结果也很重要。最近，T细胞重定向免疫疗法，如嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法和双特异性抗体疗法，已经被开发出来以增强治疗效果。临床试验已经证明，即使在三重难治性多发性骨髓瘤患者中，也产生了显著的抗骨髓瘤T细胞反应。由于双特异性抗体作为一种现成的治疗方式具有优势，因此不仅进行了单药治疗，还进行了与其他药物联合治疗难治性多发性骨髓瘤的临床试验。另一方面，与免疫细胞强烈激活相关的特有和不想要的免疫效应，如细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），已经出现，除了细胞减少症外，还需要仔细管理。 2.双特异性抗体的基础知识 在这篇综述中，我们重点关注了用于治疗难治性多发性骨髓瘤的双特异性抗体的最新进展。概述了它们开发的历史，以及它们的机制作用，以及它们在多发性骨髓瘤治疗中的当前和未来状况。双特异性抗体的基本结构由一个Fc区域和两个相同的可变区域组成（图1a）。由于可变区域的氨基酸序列在不同抗体之间不同，它决定了抗体对目标抗原的结合特异性和能力。在20世纪60年代，首次描述了产生具有两个不同可变区域的抗体的概念。然后在20世纪80年代，在建立了生产mAbs的杂交瘤方法之后，杂交-杂交瘤组合使双特异性抗体的生成成为可能（图1b）。在基因工程技术的基础上，两个单链片段变量（scFvs）与连接序列融合，即所谓的双特异性T细胞引导剂（BiTE），于1995年首次合成（图1c）。BiTE旨在识别两个目标抗原——上皮细胞黏附分子（EpCAM）和CD3——用于实体瘤的治疗。在血液系统恶性肿瘤领域，2000年开发了一种特异性为CD19和CD3的BiTE，并随后对患有惰性淋巴瘤的患者进行了1期临床试验，证明了CD19 x CD3 BiTE的安全性和有效性。这开创了一系列临床试验，证明了blinatumomab（CD19 x CD3）对治疗难治性急性淋巴细胞白血病是有效的。这些发现最终导致了用于治疗其他血液系统恶性肿瘤的新双特异性抗体的开发。 图1 双特异性抗体的概念。a 传统抗体具有一个恒定（Fc）区域和两个相同的抗原结合位点，由轻链（VL）和重链（VH）的可变区组成。b 双特异性抗体具有两个可变区，分别针对两种不同的抗原。为了激活针对肿瘤细胞的人类T细胞，其中一个通常特异性结合人类CD3分子，另一个结合肿瘤抗原。作为模型，展示了通过杂交瘤技术产生的双特异性抗体，如卡妥索单抗。c 双特异性T细胞引导者（BiTE）配备了两个单链片段变量（scFvs），它们与一个柔性连接序列融合。BiTE能够通过结合人类CD3分子和肿瘤抗原，使人类T细胞与肿瘤细胞结合。 最近开发的双特异性抗体是基于三个组成部分设计的。一个特定于主要由T细胞表达的免疫调节蛋白，如CD3、4-1BB、CD28或PD1，另一个与肿瘤细胞表达的抗原结合。由于抗体或基于配体的方式对这两个组成部分都很灵活，它们可以针对非HLA/肽复合物以及HLA/肽复合物，而不考虑T细胞的HLA限制。重要的是，这两个组成部分通过一个“核心”部分进行多聚化，该部分可以是连接序列、免疫球蛋白的Fc区域或载体蛋白，如白蛋白。采用这种方法，到目前为止已经开发了100多种不同的结构。 为了阐明双特异性抗体的特异性和反应性，在图2中总结了两种重要的反应性。非靶向反应主要指的是产生的双特异性抗体本身对无关抗原的交叉反应，但对于一些类型的双特异性抗体，也可能考虑可能的自我激活。Catumaxomab（EpCAM x CD3）是首个获准用于治疗由实体瘤引起的恶性腹水的双特异性抗体。它具有两个可变区域分别结合EpCAM和CD3，以及一个野生型Fc区域（图1b）。不幸的是，在临床试验中，静脉注射catumaxomab引起了暴发性肝炎。随后的免疫组化分析表明，肝脏中的Kupfer细胞和T细胞可能通过野生型Fc和CD3在没有EpCAM阳性靶细胞的情况下相互交互，导致自我激活。因此，在最近的双特异性抗体中，通常使用突变型或IgG4型Fc区域，这些区域不能结合表达Fc受体的细胞，以避免由于免疫细胞的自相残杀而引起的不必要的毒性。同时，也需要仔细考虑靶向反应（图2）。肿瘤和正常细胞/组织之间在靶抗原表达水平上的明显差异对于最小化靶向/非肿瘤反应很重要。此外，双特异性抗体对肿瘤细胞的靶向反应增强将导致严重的CRS。当靶抗原在肿瘤细胞上高度表达和/或患者体内仍有高肿瘤负担时，应该小心，并可能需要使用tocilizumab和皮质类固醇进行CRS管理。 图2 由双特异性抗体诱导的靶向和非靶向反应。a 非靶向反应可能是两种类型之一。如果双特异性抗体包含野生型Fc区域，可能在没有肿瘤细胞的情况下在人类T细胞和NK细胞之间产生人工免疫突触，导致自我激活。b 如果双特异性抗体与正常细胞表达的不相关抗原发生交叉反应，可能会发生不想要的T细胞对正常细胞的反应。c 当正常细胞表达目标抗原时，双特异性抗体可能诱导不想要的靶向/肿瘤反应。这种靶向/肿瘤反应的程度将由肿瘤细胞和正常细胞之间目标抗原表达的差异决定。d 强烈的靶向（对肿瘤）反应将导致T细胞产生的细胞因子数量增加。从这个角度来看，细胞因子释放综合征的管理需要仔细注意。注意黑色双特异性抗体的颜色从b到d表示Fc区域的突变，以避免招募表达Fc受体的免疫细胞。 3.双特异性抗体在临床试验中被批准并测试用于治疗骨髓瘤 针对骨髓瘤治疗的双特异性抗体主要针对B细胞成熟抗原（BCMA）。其他特异性针对G蛋白偶联受体家族C组5成员D（GPRC5D）、Fc受体同源5（FcRH5）和CD38。截至2023年底，三种双特异性抗体—teclistamab、elranatamab和talquetamab—已被食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗四线治疗后的三重难治性骨髓瘤，类似于CAR-T细胞疗法。尽管这些尚未在日本获得批准，但针对日本患者的临床试验已经取得了有希望的结果。表1总结了针对骨髓瘤的双特异性抗体，每个抗体的重要点如下所述。 3.1.AMG-420和pavurutamab（AMG-701） 在骨髓瘤双特异性抗体研究的初期，AMG-420是第一个被开发的。由于AMG-420是一种基于BiTE的模式，针对BCMA，需要持续给药以维持其血清浓度。一项为期4周的静脉注射1期临床试验显示，总体反应率达到31.0%，最多10个周期。Pavurutamab是一种双特异性抗体，具有突变的Fc区域以阻止与NK细胞的相互作用，实现了30.0-40.0%的反应率。不幸的是，这两种药物的临床试验现在已经停止。 3.2.Teclistamab（JNJ-64007957） Teclistamab是针对BCMA和CD3的双特异性抗体，基于DuoBody技术，是FDA批准用于治疗难治性骨髓瘤的第一种双特异性抗体。在1/2期临床试验中，165名三重难治性骨髓瘤患者接受了皮下注射的teclistamab。在平均14.1个月的随访期间，总体反应率达到63.0%，完全反应率为39.4%。CRS在72.1%的患者中观察到（3级；0.6%，4级；0%），中性粒细胞减少症（70.9%）、贫血（52.1%）和血小板减少症（40.0%）也发生了，表明需要管理这些不良事件。 3.3.Elranatamab（PF-06863135） Elranatamab是一种针对BCMA和CD3的人源化双特异性抗体，最近也被FDA批准用于难治性骨髓瘤。在一项1期临床试验中，88名患者接受了单药治疗（n=23，静脉注射；n=65，皮下注射），平均随访12.0个月，客观反应率达到64.0%，包括38.0%的患者完全反应或更好。CRS在87.3%的患者中发生，但重要的是没有超过3级。中性粒细胞减少症（74.5%）、贫血（67.3%）、淋巴细胞减少症（52.7%）和血小板减少症（50.9%）也被观察到。在另一项2期临床试验中，招募了123名尚未接受BCMA导向治疗的患者。这些患者每周接受一次皮下注射的elranatamab，然后在六个周期后每两周一次。客观反应率达到61.0%，35.0%的患者实现了完全反应或更好；此外，50名接受每两周治疗的应答者中有40名维持了6个月以上的反应。在15个月的随访点，反应持续时间（DOR）、无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）分别为71.5%、50.9%和56.7%。观察到的不良事件包括CRS（57.7%；没有3级或4级）、中性粒细胞减少症（48.8%）、贫血（48.8%）、淋巴细胞减少症（26.8%）和血小板减少症（30.9%），但水平表明它们的耐受性。 3.4.Abbv-383（TNB-383B） Abbv-383是一种针对BCMA和CD3的双特异性抗体。在1期临床试验中，124名患者每3周接受一次静脉注射的Abb-383。在122名患者中，客观反应率达到57.0%，其中43.0%的患者有非常好的部分反应（VGPR）或更好。CRS在57.0%的患者中观察到（60mg剂量扩展队列中为71.0%），但超过3级的严重性很少见。所有患者中报告了中性粒细胞减少症（37.0%）、贫血（29.0%）、淋巴细胞减少症（15.0%）和血小板减少症（23.0%）。还在220名患者中进行了Abbv-383的进一步研究。 3.5.Alnuctamab（CC-93269） Alnuctamab是一种针对BCMA和CD3的2+1 T细胞引导者。在1期试验中，73名之前接受过3种以上治疗线的患者接受了皮下注射的alnuctamab。在平均7.4个月的随访期间，总体反应率达到54.0%，alnuctamab的生物利用度半衰期为14天。CRS在56.0%的患者中发生，但没有超过3级的情况。中性粒细胞减少症（55.0%）、贫血（47.0%）和血小板减少症（37.0%）也被观察到。 3.6.Linvoseltamab（REGN5458） Linvoseltamab是一种针对BCMA和CD3的双特异性抗体。在252名参加临床试验的患者中，73名被分配到1期，179名（n=104，50mg；n=75，200mg）被分配到2期。客观反应率分别为64.0%（200mg队列，包括1期研究中的12名患者）和50.0%（2期研究中的50mg队列），6个月反应持续的概率分别为89.0%（200mg）和85.0%（50mg）。治疗相关的不良事件包括CRS（37.0%，200mg；53.0%，50mg；>3级1.0-2.0%）、疲劳（32.0%，200mg；33.0%，50mg）、贫血（28.0%，200mg；40.0%，50mg）和感染（43.0%，200mg；59.0%，50mg）。 3.7.Talquetamab（JNJ-64407564） Talquetamab靶向骨髓瘤细胞上的GPRC5D和CD3，也已被FDA批准用于临床。进行了包括两个阶段（剂量递增阶段；剂量扩展阶段）的1期临床试验。在总共232名患者中，一部分接受了皮下注射的talquetamab（n=30，405μg/周；n=44，800μg/每2周），反应率分别为70.0%和64.0%，中位反应持续时间分别为10.2个月和7.8个月。除了血液学毒性外，CRS在两个组中分别观察到77.0%和80.0%，但超过3级的严重性非常罕见。所有患者中报告了中性粒细胞减少症（67.0%和36.0%）、贫血（60.0%和43.0%）、淋巴细胞减少症（40.0%和39.0%）和血小板减少症（37.0%和23.0%），但皮肤相关事件和味觉障碍被认为是与GPRC5D靶向相关的靶向/肿瘤不良事件。 3.8.Cevostamab（BFCR4350A） Cevostamab是一种针对FcRH5和CD3的双特异性抗体。在1期研究中，160名患者被纳入并每3周接受一次静脉注射的cevostamab。总体反应率分别为54.5%（160mg）和36.7%（90mg），平均随访6.1个月。作为常见的不良事件，CRS（80.0%）、中性粒细胞减少症（18.1%）和贫血（31.9%）被报告。重要的是，这项研究包括了已经接受过CAR-T细胞疗法、双特异性抗体和/或BCMA靶向治疗的患者。在他们中，总体反应率分别为44.4%（CAR-T细胞）、33.3%（双特异性抗体）、50.0%（抗体-药物偶联物）和36.4%（抗BCMA靶向剂）。因此，cevostamab单药治疗可以在T细胞重定向治疗后诱导抗骨髓瘤反应，这似乎主要针对BCMA。 4.新双特异性抗体的开发，用于包括骨髓瘤在内的恶性肿瘤治疗 除了上述提到的双特异性抗体外，已开发了新的模式以提高骨髓瘤和其他恶性肿瘤治疗效果。 4.1.共刺激双特异性抗体 激活人T细胞的双特异性抗体能够结合肿瘤细胞抗原和CD3分子。通过这种人工免疫突触，相对于未经激活的T细胞，中心/效应记忆T细胞更倾向于被激活以针对肿瘤细胞。已经生成了结合肿瘤抗原和共刺激分子（如CD28或4-1BB（肿瘤抗原×CD28，肿瘤抗原×4-1BB））的共刺激双特异性抗体，以有效刺激T细胞，允许向T细胞传递足够的次级信号以激活（图3）。此外，4-1BB的参与似乎也能激活针对肿瘤细胞的NK细胞。也有报道其他共刺激双特异性抗体，如CD40×4-1BB，这些可以诱导树突细胞成熟，从而成功激活和扩增T细胞。另一方面，有迹象表明，表达耗竭标记物的T细胞，如PD1，也可能由于PD1与肿瘤细胞上的PDL1之间的相互作用而无法充分激活。为了解决这个问题，已经开发了新的共刺激双特异性抗体，可以结合PDL1和CD28或4-1BB，将抑制信号转化为激活信号（图3）。这些模式尚未应用于骨髓瘤的治疗，但已在临床试验中测试了使用抗骨髓瘤药物与抗PD1或PDL1抗体联合治疗难治性骨髓瘤。未来，CD3靶向双特异性抗体与共刺激双特异性抗体的组合可能能够进一步提高难治性骨髓瘤和其他恶性肿瘤患者的临床结果。 图3 共刺激双特异性抗体。一种特异性针对肿瘤抗原和CD28或4-1BB的双特异性抗体能够产生人工次级免疫突触，模仿生理共刺激信号，充分激活针对肿瘤细胞的人类T细胞。此外，针对PDL1和共刺激分子（CD28或4-1BB）的双特异性抗体可以通过不仅转换正向共刺激信号，还阻断PD1-PDL1轴来调节PDL1的抑制信号。图示为基于BiTE的共刺激双特异性模式示例。BsAb：双特异性抗体。 4.2.桥接双特异性T细胞引导者（B-BiTE） 最近的双特异性抗体被设计为选择性激活人T细胞，以避免在不针对肿瘤细胞的情况下T细胞和NK细胞之间的不希望的自我激活。换句话说，它们失去了诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）的潜力，同时获得了强大的T细胞反应性。此外，由于它们通常针对肿瘤细胞和骨髓瘤细胞表达的单一抗原，表达低水平目标抗原的肿瘤能够逃逸和生长。为了克服这些与双特异性抗体相关的障碍，已经报告了一种称为桥接BiTE（B-BiTE）的新概念。B-BiTE具有两个针对人免疫球蛋白G和人CD3的Fc区域的scFvs（图4a），因此无法直接诱导抗骨髓瘤效应。然而，如果在给药前将一系列临床可用的单抗与B-BiTE结合，带有B-BiTE的武装单抗（mAb/B-BiTE复合物）可以基于额外的人T细胞反应性和保留的人NK细胞反应性，诱导“双重淋巴细胞激活”（图4b，c）。此外，可以通过使用现有的单抗轻松快速地产生一系列mAb/B-BiTE复合物，这表明通过使用两种或更多不同的mAb/B-BiTE复合物进行顺序治疗，可能可以实现深入和持久的抗骨髓瘤反应。 图4 桥接双特异性T细胞引导者（B-BiTE）。a B-BiTE的概念。B-BiTE是BiTE技术的一种模式，其中两个scFvs与人类IgG Fc和人类CD3ε结合，并与一个连接序列融合。b 通过B-BiTE与针对肿瘤抗原的人类IgG的Fc区域结合，可以轻松生成新的双特异性抗体，即mAb/B-BiTE复合物。c 通过mAb/B-BiTE复合物介导的人类T细胞和NK细胞的双重淋巴细胞激活，可以诱导增强的抗骨髓瘤效应。 小林等人详细研究了B-BiTE的特性。首先，他们确认B-BiTE可以与单抗结合，而不会中断NK细胞对目标细胞的激活。接下来，使用daratumumab和elotuzumab治疗骨髓瘤，在没有针对CD38和SLAMF7的临床可用双特异性抗体的情况下，他们成功地产生了daratumumab/B-BiTE和elotuzumab/B-BiTE复合物。这些基于B-BiTE的新型双特异性抗体在保留NK细胞反应性的同时成功地诱导了T细胞反应性，与单独使用单抗相比，在体外和体内都增强了抗骨髓瘤效应。mAb/B-BiTE复合物可能在体内稳定约72小时，表明长期激活T细胞似乎没有被观察到。此外，图2中总结的不希望的非目标反应对mAb/B-BiTE复合物没有观察到，而目标/肿瘤反应性，包括由daratumumab/B-BiTE和elotuzumab/B-BiTE复合物介导的免疫细胞的兄弟相残反应，被认为可能可以忽略不计。在mAb/B-BiTE复合物存在的情况下，NK细胞反应确实加强了骨髓瘤细胞的目标T细胞反应，但并没有增加T细胞激活引起的炎症细胞因子水平。最后，使用daratumumab/B-BiTE和elotuzumab/B-BiTE的顺序治疗似乎克服了骨髓瘤的抗原异质性，并确实在与没有B-BiTE的两种单抗和单独的mAb/B-BiTE相比，诱导了足够和持久的抗骨髓瘤效应。另一方面，应该谨慎考虑B-BiTE在体内偶然与自身反应性免疫球蛋白和/或副蛋白偶联的可能性，因为这些意想不到的mAb/B-BiTE复合物可能会引起自身免疫性疾病。需要进一步分析，这种模式有潜力成为难治性骨髓瘤和其他血液恶性肿瘤的一种新的免疫治疗形式。 4.3.其他双特异性和三特异性抗体以及NK细胞引导者 ISB1342是一种靶向CD38和CD3的双特异性抗体，已经开发出来。它对CD38的结合亲和力很高，而对CD3分子的结合亲和力则适当调节，以避免因强烈T细胞激活而导致的严重CRS 。由于ISB1342可以结合到daratumumab不同的CD38部分，因此可能可以使用ISB1342与daratumumab的顺序和联合疗法。临床前结果表明，ISB1342在体外和体内都诱导了成功的抗骨髓瘤效应，因此目前正在进行1期临床试验。 为了绕过骨髓瘤细胞的逃逸并克服它们的异质性，已经开发并测试了双重靶向CAR-T细胞。例如，已经报道了BCMA x CD19、BCMA x CD38、BCMA x SLAMF7和BCMA x GPRC5D双重靶向CAR-T细胞。相比之下，为了通过一种模态同时结合CD3的两种不同抗原来特异性针对骨髓瘤细胞，需要设计三特异性抗体。例如，已经报道了BCMA x CD38 x CD3靶向的三特异性抗体ISB2001，并且现在计划为患有难治性骨髓瘤的患者进行1期临床试验。有趣的是，已经合成了一种能够结合CD38、CD3和CD28的三特异性抗体。这种模态通过同时传递共刺激信号，充分激活了人T细胞，结果在体内模型中减少了调节性T细胞并诱导了成功的抗骨髓瘤反应。因此，目前正在进行1期研究以测试这种方法的有效性。 还为骨髓瘤治疗开发了一种可以结合肿瘤细胞和NK细胞的NK细胞引导者。AFM26是一种基于TandAb的四价模态，靶向BCMA和CD16a，RO7297089也是BCMA和CD16a的双特异性。这些模态诱导了对骨髓瘤细胞的细胞毒性，但使用RO7297089a的1期试验似乎与BCMA的T细胞引导者相比显示出不充分的结果。 5.将双特异性抗体与其他治疗方式结合用于骨髓瘤治疗 如上所述，现在推荐在包括抗CD38单抗、IMiDs和PIs在内的4种先前治疗后，对难治性骨髓瘤患者使用双特异性抗体。为了改善临床结果，正在进行一系列临床试验，研究使用双特异性抗体与单抗、IMiDs和PIs的联合疗法（表2）。重要的是，由于双特异性抗体和CAR-T细胞都可以在骨髓瘤治疗的相似时间点使用，本段讨论了应该先使用哪种模态，以及如何使用这些药物以最大化治疗效果。 5.1.与双特异性抗体的联合疗法 如表2所示，已经设计了使用teclistamab（MajesTEC）、elranatamab（MagnetisMM）、linvoseltamab（LINKER-MM）、talquetamab（MonumenTAL/TRIMM）和cevostamab（CAMMA）的临床试验。其中，已经测试了与daratumumab、isatuximab、IMiDs（lenalidomide、pomalidomide）、PIs（bortezomib、carfilzomib）和类固醇（dexamethasone）的双特异性抗体联合疗法。基本上，通常使用daratumumab，可能是为了通过双特异性抗体在试验中缺乏的补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）活性来增强其抗骨髓瘤效应。伽马分泌酶抑制剂可能有助于抑制骨髓瘤细胞中BCMA抗原的脱落。此外，daratumumab可能消除CD38阳性的调节性T细胞，从而增加T细胞数量及其细胞毒性。环磷酰胺也可能能够与双特异性抗体联合减少高肿瘤负荷患者的调节性T细胞数量。有趣的是，已经在RedirecTT-1试验中研究了两种不同的双特异性抗体—teclistamab和talquetamab的组合。在63名患者中，所有剂量的总体反应率为84.0%，推荐的2期剂量（RP2D）为92.0%。更多细节将在未来公布。 5.2.双特异性抗体和CAR-T细胞疗法：应该先开始哪个？ 基本上，如果可用，双特异性抗体（与上述其他模态联合）简单地应用于不适合CAR-T细胞的患者。然而，在既适合双特异性抗体又适合CAR-T细胞的患者中，可能需要仔细考虑。已经分析了先前接触过BCMA靶向双特异性抗体的骨髓瘤患者使用CAR-T细胞的顺序疗法。在这项研究中，7名患者对BCMA靶向双特异性抗体治疗有抗性，接受ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel）治疗的患者的总体反应率为57.1%（4名患者），平均反应持续时间为8.2个月。另一项研究发现，在19名先前接受过双特异性抗体治疗的患者中，有16名在T细胞重定向治疗后达到了84.0%的总体反应率（n=10，双特异性抗体；n=9，CAR-T），这些患者的中位PFS为28.9个月。重要的是，82.0%的患者先前接受过GPRC5D x CD3双特异性抗体治疗，只有18.0%的患者接触过BCMA x CD3双特异性抗体，表明切换T细胞重定向疗法的目标抗原可能有效。 为了将临床上可用的CAR-T细胞疗法应用于骨髓瘤患者，需要收集自体外周血单核细胞（PBMCs）以产生CAR-T细胞。患者的T细胞适应性，代表T细胞的主要功能之一，主要由未经激活、记忆和终末分化的T细胞比例决定，可能会影响CAR-T细胞生产的成功。实际上，表现出未经激活/中心记忆T细胞特征的CAR-T细胞在给药后似乎会在体内诱导长期抗肿瘤效应。另一方面，用双特异性抗体重定向的T细胞会通过激活进一步分化，导致耗尽的T细胞数量增加，这些细胞可能不是CAR-T细胞的适当资源。 尽管需要进一步分析，但如果患者不是虚弱的，他们的疾病状况由于染色体异常和疾病进展而构成高风险，并且他们适合CAR-T细胞疗法，那么在双特异性抗体给药之前尽早收集PBMCs可能更好。在等待CAR-T细胞制造的同时，通常需要对接受白细胞分离术的患者进行调理，以减少骨髓瘤细胞的负担。在这些患者中，除了其他模态（单抗、IMiDs和/或PIs）之外的双特异性抗体作为过渡疗法来抑制骨髓瘤细胞生长是有希望的。最近的分析表明，体内效应CD8+ T细胞的克隆扩增对于实现足够的抗骨髓瘤反应很重要，耗尽的CD8+ T细胞的丰度可能与BCMA x CD3双特异性抗体治疗后的不良临床反应相关。由于双特异性抗体的治疗间隔可以重新激活人类T细胞，因此需要考虑适当的治疗持续时间，以避免体内T细胞耗竭。因此，这些结果表明，在更早的治疗线上应用双特异性抗体也更好，以最大限度地发挥它们的抗骨髓瘤效应。双特异性抗体对CAR-T细胞疗法靶向相同或不同抗原治疗后的骨髓瘤的疗效需要进一步评估。Cevostamab在CAR-T细胞疗法后可以发挥作用。目前正在进行2期临床研究，以阐明使用BCMA CAR-T细胞疗法后序贯治疗cevostamab能否实现无最小残留疾病（MRD）的抗骨髓瘤反应。 值得注意的是，同种异体T细胞、诱导多能干细胞（iPS）分化的T细胞和/或NK细胞可以作为下一代资源，用于制造CAR-T细胞和CAR-NK细胞，作为现成的产品。人类NK细胞可以从脐带血中收集，可能具有作为“通用”和“多才多艺”的细胞资源的潜力，因为它们不仅可以诱导ADCC反应，而且在将CD3和T细胞受体一起转导到NK细胞时，还可以诱导人工T细胞反应。一旦这些第三方衍生的新鲜CAR表达细胞在临床上可用，双特异性抗体的使用将发生巨大变化，从而进一步提高难治性骨髓瘤的治疗。 6.管理与双特异性抗体治疗相关的不良事件 图2展示了上一节讨论的可能的非目标反应和不希望的靶向反应。这里总结了一些重要的与双特异性抗体临床使用相关的不良事件。CRS和ICANS在双特异性抗体剂量递增时大多被观察到，但与CAR-T细胞相比，3级以上的严重程度通常很少见。这些事件可能与高肿瘤负担和更高剂量的双特异性抗体有关。因为ICANS通常由CRS先发生，其中发生发热、低血压和/或低氧血症，所以通常首先可以管理CRS。根据美国移植和细胞治疗学会（ASTCT）共识分级指南，应给予tocilizumab和皮质类固醇。Anakinra是FDA批准的IL-1受体拮抗剂，也可以考虑使用，因为除了IL-6之外，IL-1信号也可以加剧CRS相关毒性。Dasatinib是一种酪氨酸激酶抑制剂，可以阻断人T细胞的Src/Lck信号。它可以可逆地抑制T细胞激活，因此可能允许调节T细胞对肿瘤的反应并最小化不良事件。 已经观察到一些血液学不良事件，如中性粒细胞减少症、贫血、淋巴细胞减少症、血小板减少症和低丙种球蛋白血症。也经历了超过3级的细胞减少症（大约10.0-60.0%的中性粒细胞减少症，15.0-50.0%的贫血，10.0-50.0%的淋巴细胞减少症，10.0-30.0%的血小板减少症）和低于400 mg/dL的低丙种球蛋白血症（70.0-90.0%）。应考虑对由于白细胞减少而可能发生的水痘-带状疱疹病毒和真菌感染（包括肺孢子虫）进行预防。还需要考虑对细菌感染和COVID-19的疫苗接种。对于超过3级的中性粒细胞减少症患者，建议使用粒细胞集落刺激因子（G-CSF），但最好在间隔后给予，以避免加剧CRS。尚未阐明为什么即使谱系细胞不表达目标抗原，也会诱发细胞减少症，但已经讨论了由于细胞因子释放和浆细胞减少而引起的旁观者效应的可能性。 7.结论 我们总结了目前和新型的用于治疗骨髓瘤的双特异性抗体。应该仔细注意双特异性抗体引起的非目标/目标不良事件的可能性。同时，为了最大化T细胞重定向疗法，避免T细胞耗竭也很重要。在考虑难治性骨髓瘤的CAR-T细胞疗法的时机时，临床试验的结果和双特异性抗体作为现成模态的特点可能会进一步促进它们在未来的发展和应用，与其他抗骨髓瘤药物联合用于骨髓瘤。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。