TNF-α x AR x IL-6

摘要:人类猴痘病毒（Mpox）被归类为痘病毒科（Poxviridae）的成员，属于正痘病毒属。Mpox具有双链DNA，并且已知有两个遗传谱系：起源于西非和刚果盆地的谱系，通常被称为中非谱系。Mpox可以通过天花疫苗接种或治疗剂进行治疗。修改天花疫苗用于治疗和预防Mpox已被证明是有益的，因为天花病毒和Mpox病毒之间有很强的联系，并且它们被归类为同一科。使用两种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的天花疫苗（ACAM2000和JYNNEOS）对Mpox的交叉保护是有效的。然而，ACAM2000有潜在的显著不良反应，如心脏问题，而JYNNEOS的风险较低。此外，尽管天花疫苗已停止使用40年，但Mpox仍以改变的特征重新出现。两种针对SARS-CoV-2及其多种变体的领先mRNA疫苗的安全性和有效性已在临床试验和随后的数据分析中得到证明。这种第一种mRNA治疗模型涉及向患者注射信使RNA以产生目标蛋白并引发免疫反应。高效力、安全给药的可能性、低成本制造和快速开发只是RNA疫苗的一些好处，为传统疫苗提供了可行的替代方案。在预防Mpox感染方面，mRNA疫苗非常有效，并且有一天可能会取代现有的全病毒疫苗。因此，本文的目的是提供对正在进行的Mpox mRNA疫苗的研究、开发和测试的概述。 引言 猴痘病毒（Mpox）可能是痘病毒科（Poxviridae）和正痘病毒属（Orthopoxvirus）中不常见的成员。西非和刚果盆地的谱系，通常被称为中非谱系，是两种基因上不同的Mpox谱系。Mpox具有双链DNA（dsDNA）。1958年，在哥本哈根血清研究所，该病毒在猴子中被发现，并被命名为“Mpox”。1970年8月，一名发烧的9岁男孩在刚果民主共和国（DRC）的Basankusu医院被诊断出首例Mpox感染。2003年，美国中西部地区首次在非洲以外地区出现Mpox。这次爆发中，土拨鼠，美国本土动物，被命名为储库，而不是猴子和松鼠。从加纳传入的感染冈比亚囊鼠将Mpox病毒传入土拨鼠，进而传入美国。此外，关于Mpox的进化历史以及病毒在非洲的多样化时间和地点，仍然有许多未知之处。世界卫生组织（WHO）表示，截至2022年7月20日，在2022年5月首次在英国确认后，Mpox爆发已蔓延至82多个地点。这项流行病学研究报告了2022年马德里爆发的前5周内508例确诊的人类Mpox病例。在这次大规模爆发中，几乎所有病例（99%）发生在与男性发生性关系的男性（MSM）中，皮疹主要发生在生殖器、会阴或肛周区域，以及腹股沟区域的淋巴结肿大，表明在性活动中的密切身体接触在这次爆发中的传播中高度相关。2022年5月，一场新的Mpox大流行在所有六个WHO地区被检测到。WHO于2022年7月23日宣布其为公共卫生紧急情况。在当前大流行之前，Mpox已在中非和西非国家的各个地区有记录。此外，非非洲人群中的绝大多数Mpox病例归因于前往疾病流行国家的国际旅行或进口牲畜。由于天花疫苗引起的免疫下降，Mpox有潜力感染全球人口。虽然该病毒通常不会在健康免疫系统的个体中引起显著的死亡率，但如果它传播到免疫受损的个体、儿童、老年人、孕妇或有包括糖尿病在内的合并症的个体，可能会发生严重的疾病和死亡。据推测，95%的感染个体通过亲密接触传播。发现41%感染HIV的人是同性恋或双性恋男性，占感染者的98%。此外，到2022年，3-6%的确诊病例已经死亡。非洲以外的首例Mpox记录发生在2003年美国中西部。共有71人感染了该病毒；然而，没有报告死亡病例。2005年，在苏丹记录了49例病例；随后的基因分析研究揭示，病毒的来源可能不是苏丹而是DRC。非洲记录了更多的麻疹病例，DRC从2011年到2014年每年报告大约2000例。2017年9月，记录了118例确诊病例；2018年9月，英国报告了首例病例。自2022年5月以来，当前爆发的病例在欧洲、大洋洲、亚洲和美洲的非流行地区报告。超过70个国家共有16000人被证实死亡；目前的死亡人数为0.03%。病毒的地理传播可能归因于从受疾病影响的国家进口或国际运输受感染的动物。Mpox在全球范围内以集群爆发的形式出现，不仅引起了WHO的关注，也促使国际卫生组织以高度警惕和广泛合作。从目前在不同国家流行的Mpox DNA分离物的基因组测序初步结果表明，影响多个国家的爆发可能归因于西非谱系。值得注意的是，从多个国家获得的Mpox基因组序列与西非谱系发现的谱系存在差异。然而，需要进一步研究以确定这些突变或基因组变化对病毒的传播性、毒力和免疫逃逸的影响。尽管Mpox症状通常持续两到四周并且是自限性的，但严重病例可能会发生，并且有3%到10%的病死率。然而，一些获得许可的药物和疫苗只给予患有严重疾病或免疫系统受损的人。目前还没有针对Mpox感染的有效和安全的治疗方法。天花疫苗接种已在大多数社区和国家停止，导致免疫力下降。尽管有证据表明天花疫苗可以85%地保护Mpox，但自从WHO在1980年宣布天花病毒灭绝以来，就没有提供过针对天花病毒的免疫接种。此外，在孕妇中，通过胎盘的传播与先天性Mpox有关，这可能在分娩期间和分娩后以及新生儿中表现出来。保护的持续时间尚不清楚。如果疫苗接种减少性Mpox传播，爆发将被控制并防止在最初高风险群体内外进一步传播。 抗病毒药物治疗已经感染了致病性正痘病毒的个体将提供即时的好处，与疫苗相比，疫苗的保护效果是延迟的。抗病毒药物在控制疫情方面的有效性尚未得到检验，因为在天花根除运动期间它们并不可用。抗病毒治疗无疑将对未接种疫苗的Mpox患者进行治疗和控制疾病传播有利。还开发了多种核酸检测技术来检测和表征Mpox。DNA聚合酶（E9L）和包膜蛋白（B6R）是实验中关注的两个正痘病毒基因。目前还没有针对Mpox引起的疾病获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的特定治疗方法。然而，有几种抗病毒药物（Tecovirimat、Cidofovir、Brincidofovir和静脉注射天花免疫球蛋白（VIGIV））是为治疗天花而开发的，现在正在用于治疗Mpox。然而，关于它们治疗Mpox感染的效力没有信息。 鉴于WHO宣布Mpox感染为全球公共卫生紧急情况，各国必须优先考虑及时和全面评估效力和效果，以确保为迅速实施疫苗接种做好准备。WHO在2022年6月24日发布了关于Mpox免疫接种的临时建议，强调目前不需要也不建议广泛接种。在疫苗效力的合作研究中，使用标准化程序和数据收集方法至关重要。WHO非常重视为疫苗接种倡议提供支持，其中包括监测和接触者追踪。此外，WHO强调需要在这种特定环境中实施有效的公共卫生沟通和强大的药物警戒。JYNNEOS疫苗已获准在美国当前的疾病爆发期间用于天花和Mpox预防。JYNNEOS可以被ACAM2000替代，ACAM2000已获批准用于帮助天花和Mpox预防。在III期临床试验中，改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）显示出有利的安全性。然而，重要的是要注意，在MVA能够获得许可用于一般人群作为预防天花和Mpox感染的预防措施之前，还需要进行更大规模的疫苗研究。产品的定价是要考虑的因素之一。因此，使用ACAM2000或MVA对Mpox和天花进行暴露后疫苗接种仍然是首选选项。尽管有潜力，ACAM2000和MVA疫苗尚未满足全球医疗需求。新研究表明，使用JYNNEOS疫苗接种仅部分增加了针对Mpox的中和抗体（nABs）的产生。因此，为了对抗当前的Mpox，迫切需要一种安全、有效且易于获得的特定Mpox疫苗。使用核酸疫苗可以开发出针对该疾病的安全有效疫苗。大规模疫苗生产也容易且便宜。mRNA疫苗在预防病毒感染方面提供了许多优势。这些包括它们能够快速且大规模合成、出色的安全记录无需核输入以及在刺激体液和细胞免疫反应方面的效力。一旦进入，细胞将mRNA解释为一组指令并构建与病原体上的抗原结合的蛋白质。免疫系统将这些外来抗原识别为入侵者，动员称为ABs和T细胞的防御，并为免疫系统准备可能的未来攻击。斯坦福医学院的研究人员发现，旨在对抗COVID-19的辉瑞/BioNTech mRNA疫苗在刺激杀手T细胞方面表现出优越的效力，这是免疫系统的关键组成部分，与严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的自然感染相比，SARS-CoV-2是2019冠状病毒病（COVID-19）的病因。多项研究提供了支持使用脂质纳米颗粒（LNPs）作为mRNA疫苗传递机制的有利使用的证据，由于在抑制Mpox方面取得了显著进展。这种现象的原因是纳米颗粒（NPs）被广泛认为是连续传递的可靠机制，确保了mRNA的完整性，增强了细胞吸收，并提高了核酸在宿主细胞内的传递和释放效率。研究人员还应推进对Mpox、其临床管理和感染控制和预防专业知识的了解，特别是在公共卫生人员中。应保证平等获得医疗保健和疫苗的机会，并充分解决MSM社区中的歧视和污名化问题。最后，研究人员应启动国际伙伴关系，进行临床研究，以检验Mpox疫苗和抗病毒药物的有效性和安全性。 考虑到关于Mpox的现有条件，应特别关注接种这种病毒。因此，在这项研究中，我们将检查Mpox的不同特征、预防方法和不同设计的mRNA疫苗。 Mpox的特征和结构 1970年在非洲报告了首例人类Mpox感染。正痘病毒的自然储库是小型啮齿动物，人类和灵长类动物是偶然宿主。天花免疫接种诱导对Mpox的交叉保护。六十年前，全球天花根除计划（GSEP）和Mpox在非洲共存。2022年人类Mpox爆发引发了对Mpox对GSEP倡议可能影响的文献评估。由于两种正痘病毒是相同的，证明没有非人类天花储库对评估GSEP至关重要。发现非人类天花储库非常遥远。人类Mpox限于未接种疫苗的个体，并未在接种天花疫苗的人类中表现出来。1989年之前，在DRC的监测确定Mpox极不可能在人类中持续存在，并发展成为重大的公共卫生问题。在天花疫苗接种停止几十年后，2005年至2007年在DRC的Mpox监测显示，人类Mpox的发病率增加了20倍，这与以前接种天花疫苗的比率大大降低有关。 天花仅在人与人之间传播，没有公认的人畜共患宿主；相反，猴痘可以通过动物宿主传播给人类。人类猴痘在西非和中非的农村社区间歇性地存在，那里的血清学调查由WHO资助。1986年之前，基于人群的调查估计，12-15%的儿童对正痘病毒有抗体。患者的平均年龄仅为四年半。338例猴痘病例中有245例归因于动物来源。从加纳进口的啮齿动物贸易引发了疫情，这些啮齿动物被作为异国情调的宠物出售。有推测这些啮齿动物通过动物与动物的接触将感染传播给了共同饲养的土拨鼠，土拨鼠也是作为宠物购买的。尽管报告了47例确诊和可能的病例，但没有死亡发生。大多数病变是孤立的皮肤病变。为与人类病例和商业啮齿动物有直接接触的个体提供了天花疫苗（DryVax，Wyeth）。2003年美国爆发的两例人与人之间的传播可能是一个因素；然而，与感染啮齿动物的接触仍然是可能的。 在电子显微镜下，猴痘具有可识别的椭圆形或砖形结构，具有大小在200到400纳米之间的脂蛋白包膜。尽管是一种DNA病毒，猴痘在与糖胺聚糖结合并进入宿主细胞后，在感染细胞内完成其生命周期。为了进入宿主细胞，还提出了使用经典的凋亡模拟机制。其他方法包括通过基于肌动蛋白的大胞饮作用机制的内体摄取，或通过病毒包膜上的配体与宿主细胞的质膜受体（如硫酸肝素或硫酸软骨素）的相互作用，这导致病毒包膜的片段分散在质膜中。然后病毒将酶和病毒蛋白分泌到细胞质中，削弱细胞防御并促进早期基因表达，导致早期蛋白的发展，DNA复制和中间转录因子的创造。具有每个侧面的侧体的外膜，保护膜结合，一个充满dsDNA基因组和转录因子的酶填充的核心。 以前的研究表明，猴痘基因组与天花基因组高度相似，大约为96.3%。这种相似性归因于猴痘基因组内的基本酶和蛋白。此外，在190个开放阅读框（ORFs）中发现了60多个氨基酸残基。在56,000-120,000的核苷酸位置，猴痘，一个非常保守的中央编码区序列（CRS），被各种末端包围，包括倒置末端重复（ITRs）。猴痘基因组的ITR区域至少有四个已识别的ORFs。猴痘病毒颗粒包含30多种膜和结构病毒蛋白以及与DNA依赖性RNA聚合酶相关的转录酶。病毒有两种不同的传染性形式，即细胞外包膜病毒（EEV）和细胞内成熟病毒（IMV）。EEV被认为在早期扩散中起着至关重要的作用，而IMV是在细胞溶解时产生的。IMV和EEV基本上非常不同，因为IMV缺乏最外层的膜层并以不同的方式感染细胞（图1）。然而，这两种病毒颗粒具有不同程度的病毒蛋白整合。尽管猴痘复制复杂，但它与其它正痘病毒的复制方式广泛接受为相同。 图1 被双链DNA猴痘病毒感染的细胞将同时具有细胞内成熟的病毒（IMV）和细胞内包膜病毒（IEV）。猴痘是最大和最复杂的病毒之一，其特征为砖形结构，长度在220-450纳米，宽度在140-260纳米。它由核心、侧结构、外膜和外脂蛋白包膜四个组成部分构成。核心由双链病毒DNA和核心纤维组成，是中心组件。栅栏层是一个围绕这一特定层的不可渗透结构。中央的核、侧体和栅栏层都被包含在外膜中。 猴痘感染中的免疫反应 先天和适应性免疫有助于正痘病毒的识别和根除。正痘病毒利用许多DNA感应系统，如DNA依赖性蛋白激酶、Toll样受体9（TLR-9）、环状鸟苷酸-腺苷酸（环状GMP-AMP，cGAMP）合成酶和干扰素γ（IFN-γ）可诱导蛋白16，来触发免疫反应。核因子κB（NF-κB）和IFN信号通路由于DNA感应器激活刺激干扰素基因（STING）而被激活。正痘病毒产生dsRNA中间体，刺激TLR3和蛋白激酶R（PKR）。PKR和TLR激活NF-κB和IFN途径。真核翻译启动的2A复合体也被PKR磷酸化，通过这种机制抑制mRNA翻译。在识别病毒并启动早期先天反应后，随后的病毒根除严重依赖适应性免疫反应。大多数造血抗原呈递细胞（APCs）是CD14+单核细胞。这些细胞可以向CD4+和CD8+T细胞展示猴痘抗原，因此有助于细胞因子的产生，消除感染细胞和宿主的血清学反应。感染淋巴结的肺和纵隔淋巴管，以及窦充满了免疫阳性的单核细胞，用于痘病毒抗原，表明这些细胞是淋巴和随后的血液传播的主要载体。淋巴组织、皮肤、口腔粘膜、胃肠道、生殖系统和肝脏的病变似乎是通过与单核细胞相关的病毒血症进行系统性病毒传播的结果。研究人员假设单核吞噬系统在促进病毒在系统性感染期间向全身的二级和三级部位传播中起着至关重要的作用。猴痘抗原仅在表现出形态缺陷的组织中看到，主要局限于成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DCs）和受损组织的上皮细胞。自然杀伤细胞（NK细胞）与单核细胞一样，在先天免疫中起着关键作用，可能影响适应性免疫反应。NK细胞在控制猴痘病毒载量方面的作用在CAST/EiJ小鼠中被揭示，然而，病毒清除与NK细胞数量或活性之间没有相关性。由于缺乏NK细胞，这种菌株特别容易受到正痘病毒感染。最近的一项研究表明，感染猴痘的食蟹猴（通过平均46.1倍在感染后第8-9天和感染后第7天的23倍）的淋巴结和外周血液中NK细胞数量迅速增加。感染显著损害了许多NK细胞亚群在快速增殖之前的迁移能力，导致它们在淋巴和/或炎症区域的招募受到不利影响。此外，已经显示趋化因子受体如CXCR3、CCR5、CCR6和CCR7表现出下调。此外，已经证明，从血液和淋巴结分离的NK细胞在颗粒化和产生IFN和肿瘤坏死因子（TNF）的能力上有所降低。IL-15治疗在预防CAST/EiJ小鼠的致命猴痘感染方面显示出效果，即使在CD4+和CD8+T细胞数量减少的情况下也是如此。这意味着观察到的保护作用可能归因于NK细胞的扩增。IL-15治疗的给药已被观察到引起短暂增加的CD8+T细胞和NK细胞群体，它们表现出分泌IFN。猴痘的两个谱系在致病性方面不同。中非谱系引起更严重的疾病，具有出色的病死率。这种病原体的显著致病性归因于其阻碍T细胞受体介导的T细胞激活和阻碍人类细胞产生促炎细胞因子的能力，如TNF-α和IFN-γ。中非谱系还具有一个基因，可以防止补体酶的工作，这导致了一个关键的免疫调节组成部分，有助于其更高的毒力。然而，研究表明，主要组织相容性复合体（MHC）表达或MHC分子的细胞转运不受猴痘毒力的影响。西非谱系的较低毒力是由于ORF中的缺失和片段化造成的。 作为正痘病毒属的成员，天花病毒在人类中引起严重且高度传染性的疾病。1980年，由于全球性的疫苗接种运动，利用来自密切相关的牛痘病毒（VACV）的疫苗，天花被宣布灭绝。目前尚无已知针对人类猴痘感染的特定干预措施。相比之下，1980年代扎伊尔的实证证据表明，在根除工作中接种天花疫苗的个体也显示出显著的猴痘感染交叉保护。然而，目前50岁以下年龄组的相当一部分人没有天花疫苗接种记录，且最初在全球根除工作中使用的疫苗目前不可获得。在2022年全球猴痘爆发期间，为被认为对猴痘高度易感的人群提供了超过一百万剂现代化的天花疫苗，用于暴露前和暴露后的预防。随着对天花疫苗的免疫力下降，猴痘有可能在全球人口中增加。42年前，在中国使用天坛型牛痘病毒（VTT）来保护人们免受天花的侵害。重要的是要找出43年前或更早接种疫苗的人对天花的免疫程度，以及他们的免疫系统对猴痘的敏感性。一项研究使用294名志愿者来了解剩余体液免疫的水平。他们观察了牛痘特异性IgG水平、nABs滴度和猴痘A29L、B6R、A35R和M1R的交叉ABs。结果显示，人群对天花疫苗保持体液免疫，而VTT特异性NAb水平随年龄下降。在1981年之前，应该接受VTT的大部分人群仍然对猴痘免疫，特别是针对A35R和B6R抗原的ABs。基于这些结果，似乎大多数中国人群在天花疫苗接种后至少保留VTT特异性IgG ABs 42年。这些ABs可能提供一定程度的猴痘保护。研究人员发现，60人（89.6%）和40人（70.1%）的接种者分别有抗猴痘IgG和Nabs。在30%的疫苗接种者中，研究人员看到了对正痘病毒和猴痘肽池的T细胞反应。因此，研究表明，40-60年前接种天花疫苗的人群中有相当一部分表现出体液交叉免疫。然而，较小的子集（30%）的接种者对猴痘显示出T细胞特异性反应。 在COVID-19大流行期间，SARS-CoV-2病毒出现了新的变种，表现出逃避先前感染或初始疫苗获得的部分免疫力的能力。这促使开发更新的疫苗，以提供针对奥密克戎和其他令人关注的SARS-CoV2病毒变种的交叉保护。目前尚不清楚猴痘基因组中是否发生类似的突变，以及是否需要对疫苗进行未来的修改以维持免疫力。根据在卢瓦尔河谷进行的法国研究，发现有9人在免疫后六个月内突破了猴痘，尚不清楚这是否是由于免疫力下降、MVA-BN疫苗引起的猴痘特异性nAB反应水平相对较低，或是否预示着能够逃避疫苗诱导免疫力的新猴痘变种的出现。暴露前预防研究表明，突破病例的数量有限，尽管疫苗估计的有效性约为85%，但仍然可以预期。例如，Sagy等人在接种一剂疫苗后21至47天发现了5例突破猴痘。 此外，猴痘病毒已被确定具有编码多种病毒蛋白的能力，这些病毒蛋白在规避宿主的免疫反应中起着至关重要的作用。这些物质可以干扰合成与炎症相关的基因的关键转录因子，如干扰素调节因子3（IRF3）和NF-κB，并阻碍负责病原体识别的受体的信号通路。猴痘除了降低IFNα/β合成和阻碍蛋白激酶R（PKR）介导的途径外，还可以干扰干扰素信号。猴痘还分泌针对TNF、IFN-γ、IL-1β、IL-18和IL-6等重要炎症分子的蛋白。此外，猴痘可以通过合成几种破坏凋亡途径的病毒蛋白来抑制感染细胞的凋亡。猴痘免疫调节因子的另一个例子是补体控制蛋白（CCP），它阻止补体激活途径的启动。猴痘中非扎伊尔株表达的D14，抑制补体激活，但这种病毒蛋白并非西非猴痘株的特征。最后，猴痘可能通过阻止T细胞和NK细胞的激活来抑制免疫细胞功能（图2）。 图2 展示了猴痘感染可能的免疫病理学，包括体液免疫、先天免疫、适应性免疫和免疫逃逸。(a) 猴痘病毒抑制趋化因子（CCR5、CXCR3和CCR6）的表达，耗尽NK细胞功能并减少IFN-γ和TNF-α的分泌。(b) 猴痘病毒引起嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞等粒细胞和单核细胞的异常。猴痘可能阻止自然杀伤细胞释放炎症细胞因子和清除病毒感染的细胞。猴痘也可能阻碍T细胞受体的跨信号传递，破坏适应性免疫反应。(c) 通过抑制抗病毒的I型干扰素反应，猴痘避免了先天免疫反应。猴痘可能通过降低mRNA产生和抑制I型干扰素，从而绕过蛋白激酶R途径，该途径介导蛋白激酶R的磷酸化。通过干扰MAPK/ERK1/2途径的磷酸化，猴痘也可能减少炎症介质的产生。通过增加ATK途径的磷酸化，它抑制了细胞凋亡。e) 猴痘患者可能因为一种中和病毒的单克隆抗体可能通过附着在细胞上的Fc受体（FcR）上的Fc区域增强病毒进入细胞而有更糟糕的预后。与猴痘感染引起的细胞因子风暴相关的是大量的辅助性T细胞2（Th2）免疫反应。这种反应的特点是血清中IL-4、IL-6、IL-5、IL-8和IL-10水平的增加，以及与Th1相关的细胞因子（如IFN-α、IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12）的减少。同时观察到总抗体滴度的增加，以及IgG和IgM水平的上升。 猴痘感染疫苗 通过预防严重疾病和降低住院率，疫苗被视为抗击猴痘的关键方法。然而，对一种正痘病毒的免疫反应可以检测到其他正痘病毒。这种发现所导致的保护水平可能因不同正痘病毒之间的相关程度而异。人们认为，免疫学上越来越天真的人群是自天花免疫结束以来猴痘发病率上升的原因。由于免疫交叉反应，可以开发多种动物模型来测试疫苗和抗病毒药物。这种交叉反应有两个主要原因。首先，因为正痘病毒在许多序列上具有相似性，特别是在免疫学上重要的蛋白质方面，所以有许多共同的免疫表位。此外，至少有24种膜和结构蛋白被ABs靶向。有证据表明，天花疫苗可能提供一些针对猴痘的保护，并减轻其临床表现。目前，美国战略国家储备（SNS）中有三种天花疫苗：ACAM2000®、JYNNEOS（也称为IMVAMUNE、IMVANEX、MVA-BN）和Aventis Pasteur天花疫苗（APSV），这些疫苗可以在研究性新药（IND）程序下用于天花。 1980年，世界卫生组织（WHO）宣布全球根除了自然发生的天花。然而，随后对生物恐怖主义的担忧和猴痘的爆发促使在21世纪初基于VACV进一步授权天花疫苗接种。第一批天花疫苗，如Dryvax，是使用淋巴源的Lister/Elstree、Ikeda和纽约市卫生局VACV菌株开发的，这些菌株是在动物皮肤上培养的。相比之下，第二和第三代疫苗的开发包括使用细胞培养技术，以提高其安全性。目前，在美国，有两种官方授权的天花疫苗。美国FDA在2007年批准了基于复制VACV的第二代天花疫苗ACAM2000。ACAM2000基于Dryvax克隆。被认为对天花病毒高度易感的人应该进行积极疫苗接种作为预防措施。然而，不建议在这个人群中特别进行针对猴痘的免疫接种。ACAM2000在高度免疫抑制的个体中禁忌，因为可能会出现显著不良反应，如心肌心包炎，特别是在那些之前没有接触过天花的人中。通过在原代细胞培养或鸡蛋中使用病毒的多次通过作为减毒技术，已经实现了基于进一步减毒VACV的替代疫苗的开发。2019年，FDA批准了Jynneos。Jynneos被归类为第三代活体、非复制、减毒免疫接种，专门设计用于预防天花。2022年5月17日，在确认美国首例正在进行的猴痘流行病例后，作为预防疾病的措施，开始了由Bavarian Nordic开发的MVA疫苗JYNNEOS的接种。2022年6月28日，美国国家免疫计划提议向已经暴露或疑似暴露于猴痘的个体皮下注射疫苗。这一建议旨在扩大符合免疫资格的人群范围，作为扩大的暴露后预防（PEP）策略的一部分。2022年8月9日，FDA发布了紧急使用授权（EUA），允许经皮内注射0.1毫升JYNNEOS，增加了可用的疫苗库存。接种JYNNEOS的患者不会面临患上心肌心包炎或心肌病等严重副作用的风险。然而，ACAM2000疫苗可能会有严重的副作用，如呼吸困难、面部肿胀、头晕和心肌心包炎风险增加。ACAM2000和JYNNEOS是美国FDA批准的疫苗。然而，ACAM2000有更高的显著副作用风险，包括心脏问题，而JYNNEOS较少。因此，JYNNEOS比ACAM2000更可取。此外，建议在有暴露猴痘疾病风险的个体中使用JYNNEOS进行暴露前预防正痘病毒感染。APSV，一种复制能力牛痘疫苗，可在许可免疫不可用或不适用时，在研究性新药申请（IND）或EUA下进行接种。预计ACAM2000和APSV的安全性将具有可比性。人们还假设，像ACAM2000一样，APSV会导致心肌心包炎。美国FDA已在ACAM2000不适用或不可用的情况下给予APSV有条件的批准，作为IND或EUA。 使用牛痘的Lister（Elstree）菌株对开发LC16 m8疫苗至关重要，这是一种活体、复制、第三代天花免疫接种。这种特定的疫苗自1975年以来已在日本获得正式授权用于积极免疫接种。2022年8月，日本当局扩大了疫苗的范围，包括防范猴痘。由于更好的安全性和减毒表型，这些疫苗可以给予免疫受损的患者。通过动物研究获得的数据确定这些猴痘疫苗的有效性，这表明在非人灵长类动物中接种这些疫苗提供的保护，以及临床试验的数据，这些试验确立了它们在人类中的免疫原性（表1）。 猴痘感染新型疫苗 开发新型疫苗以对抗新兴和传染性疾病受到重大概念和科学挑战的阻碍。COVID-19大流行凸显了开发既安全又高效的疫苗配方所面临的挑战。这些配方通常基于流行的生物平台，如完整的减毒或灭活的SARS-CoV-2病毒、非复制性人类或猿猴腺病毒DNA载体，这些载体使用病毒的部分，或特定的mRNA模板，针对病毒刺突（S）糖蛋白的部分。为了降低疫苗篡改的风险并优先考虑研究人员的安全，当前生产和分发基于生物平台的病毒疫苗的协议需要使用高度规范的生物安全设施，以及严格的冷链和包装线。此外，由于它们的稳定性和特异性差，第二代疫苗不是针对亚单位疫苗的实用方法。另一方面，控制合成技术使得为许多致命疾病生成疫苗配方成为可能，如疟疾和COVID-19，这些疫苗成本低、稳定、特异性强、无毒且安全。因此，探索针对猴痘的新型疫苗策略对于降低感染风险至关重要。有希望的方法包括灭活疫苗、活减毒疫苗、病毒样颗粒（VLPs）、重组蛋白疫苗、核酸疫苗和基于NP的疫苗。 细胞内mRNA递送是由最先进技术辅助的，由LNPs领导。mRNA生产的最关键的组成部分是离子化脂质，它通常与磷脂、甾醇和脂锚定聚乙二醇（PEG）一起存在于LNPs中。根据分析，蛋白质表达不是决定疫苗效力的唯一因素。其他变量也起作用。NP生物物理特性已知会影响免疫原性，就像其他疫苗方法一样。NPs的大小影响它们刺激免疫系统的能力和当它们被用作基于蛋白质的疫苗的纳米载体时在组织和细胞中的分散。脂质体的大小是另一个影响T辅助细胞与T辅助细胞2比率（Th1/Th2）的因素。因此，与更大或更小的囊泡相比，250至750纳米之间的囊泡引发更强的Th1反应。另一方面，多层囊泡可能会触发更多的Th2反应。研究还表明，LNPs触发免疫系统的能力受到它们表面电荷的影响。例如，带正电荷或负电荷的囊泡比不带电荷的囊泡引发更强的抗体中和反应。由于它们与先天免疫系统组分的相互作用，阳离子脂质增强了LNP配方mRNA疫苗的免疫原性，从而实现适当的治疗效果。 LNP在其他mRNA递送方法（如单核吞噬系统（MPS）、细胞摄取促进、最小免疫原性和内体捕获）方面的优势使其成为一个新兴的候选者。mRNA加载的LNP遇到的几个障碍之一是免疫接触，包括先天和适应性免疫以及与LNP组分的相互作用。然而，LNP组成突出了一个重大障碍，即通过细胞质运输将mRNA临床递送到目标组织。因此，它们可能通过增加疫苗吸收到DCs和阻止mRNA与非APCs的相互作用来减少不良副作用的可能性。了解mRNA-LNP治疗引起这些不良效果的机制并制定预防措施至关重要。身体对PEG化LNPs的反应产生抗PEG抗体，这可能导致不良效果。立即超敏反应的重要细胞，嗜碱性粒细胞或肥大细胞，是IgE抗体结合到FcεRI的地方。作为介质，几种酪氨酸激酶被激活。身体在给药时将抗PEG IgM与PEG化脂质体结合。这个复合物激活了经典的补体途径，并由于Kupffer细胞吞噬作用迅速退出血流，这个过程被称为加速血液清除（ABC）现象。这种类胰蛋白酶刺激嗜碱细胞、肥大细胞和巨噬细胞，产生炎症介质。这种介质通过与平滑肌、内皮和自主效应细胞的受体结合，激活补体（C）激活相关的伪过敏（CARPA）。mRNA-LNP基于药物可能触发自身免疫的方式有：（1）先天免疫系统对LNPs作为佐剂的反应，导致自身免疫过程进行；（2）mRNA作为自身抗原，通过TLR7启动自身免疫过程；（3）在mRNA-LNP疫苗的情况下，免疫系统得到加强，可能加剧自身免疫反应。研究人员发现，编码四种参与病毒附着、进入和传播的高度保守的猴痘表面蛋白的mRNA-脂质NP疫苗可以诱导针对猴痘特异性免疫和异源保护，以应对致命的VACV挑战。与当前的猴痘疫苗MVA相比，mRNA疫苗产生了更大的中和和细胞扩散抑制活性针对猴痘和VACV，以及增强的Fc效应Th1偏向的体液免疫对四种猴痘抗原和四种VACV同源物。然而，用两种、三种或四种猴痘抗原表达的mRNA疫苗接种可防止与疾病相关的体重减轻和死亡。然而，用单一猴痘抗原mRNA疫苗接种对VACV挑战提供了最小的保护。抗体活性从中和到非中和不等，因此为什么多价猴痘mRNAs比MVA提供优越的交叉保护。研究人员证明，针对四种高度保守的病毒表面抗原的mRNA基础疫苗通过引发强效抗体迅速抑制病毒感染，对VACV提供了显著的保护。表达四种高度保守的猴痘抗原的mRNA疫苗是Freyn等人在另一项调查中评估的潜在疫苗之一。关于诱导免疫反应和预防小鼠的致命感染，mRNA疫苗的表现与MVA相当或更好。此外，研究人员还检测到对疫苗编码的四种VACV同源物和四种猴痘抗原的更高Fc效应Th1偏向的体液免疫。虽然包含编码两种、三种或四种猴痘抗原的mRNA的多价疫苗与MVA免疫相当或更好地保护了免受与疾病相关的体重减轻和死亡，但编码单一猴痘抗原的mRNA疫苗只提供了有限的VACV挑战保护。这些发现鼓励开发针对正痘病毒的mRNA疫苗，以便在爆发期间迅速响应。另外，使用两种IMVs（A29L和M1R）和两种EEVs（A35R和B6R）开发了猴痘四价mRNA疫苗mRNA-ALNP和mRNA-B-LNP。小鼠两次肌肉注射mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP后，发展出强大的VACV特异性nABs和猴痘特异性IgG抗体。此外，它在小鼠中促进了针对猴痘的保护性记忆B细胞和杀手T细胞免疫的发展。来自mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP免疫小鼠的血清被动转移也保护了裸鼠免受VACV挑战。小鼠在接受两次mRNA-A-LNP或mRNA-B-LNP剂量时免受VACV感染。结论mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP都是安全有效的免疫选择，可用于预防猴痘流行和其他由正痘病毒引起的爆发，包括天花。 在另一项研究中，J.W.Hooper等人表明，在用由四种VACV基因（L1R、A27L、A33R和B5R）组成的DNA疫苗接种后，猕猴在面对猴痘的致命攻击时免受严重疾病的影响。用单一基因（L1R）免疫的动物患上了严重疾病，但活了下来，该基因指定了一个病原体nABs靶标。这是首次证明针对天花-猴痘免疫的亚单位疫苗策略的可行性。猴痘E8L蛋白被显示包含一个环形神经节苷脂结合基序，根据另一项调查。这个基序由三个潜在的B线性表位共享，可以用来提供安全有效的猴痘疫苗。由于这三个序列在E8L蛋白中被鉴定出来，建议将它们用作未来猴痘特异性疫苗配方中的免疫原（重组蛋白、合成肽或基于遗传的）。这种基于脂筏/神经节苷脂的策略除了目前的治疗方法外，还可能为未来病毒流行提供治疗和疫苗反应。根据现有数据，仍然需要推进有效和安全的新型疫苗的开发，这些疫苗专门针对猴痘。这需要在宣布猴痘为之前探索创新的疫苗方法，包括VLPs、重组蛋白、核酸（mRNA或DNA）和基于NP的疫苗。 为了提高疫苗的特异性和效力，研究人员开发了专注于保守抗原的亚单位疫苗。这些疫苗以纯化蛋白或质粒DNA的形式接种，或通过病毒载体疫苗进行。这些方法特别针对导致感染的两种不同的免疫学形式的痘病毒，即成熟病毒粒子和包膜病毒粒子。核酸疫苗在安全性和效力方面显示出与传统灭活疫苗相当，有效地模拟了疫苗接种过程。此外，使用工业手段生产这些疫苗既经济又简单。为了确定最有效的疫苗，评估许多因素至关重要，如对机体的影响、反应原性、安全性、细胞毒性以及与疫苗接种相关的潜在副作用，特别是在那些处于较高风险或更容易出现不良结果的人群中。2022年非洲以外地区猴痘爆发突显了缺乏已显示效力和最小不良反应的疫苗。在猴痘流行期间使用这种疫苗可能有助于预防或减少感染，作为那些靠近确诊病例人群的暴露前预防（PrEP）。 mRNA疫苗 DNA中存储在细胞核中的遗传指令被运送到细胞质中，那里的核糖体负责将它们翻译成蛋白质。mRNA治疗可能恢复由特定蛋白质功能丧失引起的疾病治疗中的蛋白质活性，而大多数传统药物通过结合和阻断过度活跃的疾病引起蛋白。此外，mRNA治疗预计将只产生预期的影响，正如核酸序列所描述的。mRNA也比抗体或细胞治疗更容易大规模生产和纯化。此外，mRNA寿命短，无法进入细胞核，因此极不可能导致遗传变化。信使RNA在疫苗开发中的使用也是新颖的。尽管mRNA疫苗对公众来说是相对较新的，但专家们已经研究了一段时间。编码刺突蛋白的DNA序列作为mRNA疫苗合成的模板，然后被包装成基于脂蛋白的载体，以促进其被细胞迅速吸收并在体内保护免受破坏。当肌肉内注射时，疫苗到达更远的区域，mRNA分子进入细胞，在那里它们可能帮助加快翻译过程。当mRNA进入体内时，将触发体液免疫反应，促使B细胞成熟为记忆B细胞。通过这种方式，记忆B细胞在随后的暴露中可能有效地阻断抗原。两种最常见的mRNA疫苗已被证明在临床研究中对SARS-CoV-2及其多种变体安全有效。由Pfizer-BioNTech（纽约，纽约，美国）和Moderna（剑桥，马萨诸塞州，美国）制造的两种基于mRNA的疫苗已获得FDA授权。mRNA-1273，或“Spikevax”，是一种狂犬病疫苗。FDA为18岁以上的成年人授予了mRNA-1273的EUA。传统的、非复制型和自复制（自我扩增）mRNA基础疫苗是三种主要类型。非复制构建中使用的mRNA是短而基础的，它不编码可能无意中触发免疫反应的任何蛋白质。感兴趣的免疫原编码在一个由5′和3′非翻译区（UTRs）包围的编码序列内，一个5'帽子结构的7-甲基鸟苷（m7G）通过三磷酸桥连接到第一个核苷酸，以及一个3′-聚（A）尾部。5′ m7G帽子抑制5′-3′外切核酸酶介导的降解，激活翻译启动因子，并促进有效翻译，同时也防止被细胞质RNA传感器、RNA螺旋酶视黄酸诱导基因I（RIG-I）识别。5′和3′ UTRs的大小和组织以及这些区域中的调节元素也影响最大基因表达。mRNA疫苗构建的翻译和稳定性取决于聚（A）尾部及其长度。序列工程（密码子优化）和核苷酸改变（例如，用假尿苷替换尿苷）通过减少TLR识别和对mRNA构建的先天免疫反应来提高翻译效率。由于DNA依赖RNA聚合酶在构建合成过程中产生小的核糖核苷酸和双链RNA杂质，因此mRNA纯度至关重要。通过抑制先天免疫反应和产生I型干扰素和炎症细胞因子，刺激蛋白质翻译和合成，这些反应是由这些模式识别受体识别的污染物去除时触发的。然而，在其自然状态下，mRNA不能用于治疗。缺乏有效、耐受良好的递送机制一直是开发mRNA疫苗的主要障碍，直到最近。细胞吸收和易位的需求是主要障碍。mRNA分子面临着由于细胞膜上的负电位而造成的严重障碍。裸露的mRNA太大且带有很强的负电荷，无法被动穿透细胞膜，使其容易受到核酸酶的消化。自复制mRNA和非复制mRNA疫苗构建包含相同的属性，包括5′帽子序列、5′和3′翻译区（UTRs）、带有编码序列（CDS）的开放阅读框（ORF）和3′聚（A）尾部。自复制mRNA疫苗提供了质粒DNA疫苗的多功能性，以及改善的免疫原性和安全性。对这些疫苗按预期工作至关重要的是到达细胞的细胞质，那里编码和放大抗原蛋白。由于RNA的亲水性和大的净负电荷，细胞吸收受到阻碍。使用电穿孔或弹道颗粒的物理传递，以及与阳离子脂质或聚合物的静电复合，已被作为解决这个问题的潜在解决方案进行了研究，以改善细胞吸收。在自复制mRNA疫苗的初始临床前测试中，小动物和非人类灵长类动物显示出强大的先天和适应性免疫反应。关于mRNA不稳定性和大规模生产的实用性的担忧长期以来一直对创建mRNA疫苗的可能性表示怀疑。在现代，这些担忧被视为技术广泛采用的不可逾越的障碍。现在可以生产足够数量和质量的非放大mRNA疫苗以满足监管标准，并且它们正在人类临床试验中研究。如果自复制mRNA疫苗在人类试验中的有希望的结果得到免疫原性、效力和可接受性方面的类似优异结果的证实，这个平台有潜力将核酸疫苗建立为人类疫苗的灵活新工具。 非病毒途径施用的自复制mRNA疫苗的未来是光明的：它们可能成本低、有效、易于扩展且适应性强。自复制mRNA像病毒一样通过扩增其基因组和宿主细胞的抗原编码mRNA来发挥作用。这导致宿主免疫系统对抗原产生强大且持久的反应，包括体液和细胞免疫反应。此外，从理论上讲，自复制mRNA可以编码任何真核序列，而无需修改生产过程。这将允许与当前疫苗相比，更快和更适应的研究与开发时间表，以便更快地应对新的传染病。非复制mRNA（NRM）构建体由编码序列（CDS）编码，其5′和3′端被非翻译区（UTRs）包围，具有5′帽结构和3′-聚（A）尾部。自复制mRNA（SAM）构建体包含可以调节细胞内mRNA扩增的附加复制酶组分。NRM和SAM在LNPs中配制，这有助于封装mRNA构建体，从而促进细胞吸收并防止降解。通过其传递系统，mRNA通常通过膜衍生的内吞途径进入细胞。内体逃逸促进mRNA进入细胞质。定位在细胞质中的核糖体迅速将NRM构建体转化为目标蛋白，然后进行翻译后修饰。核糖体还能够迅速翻译SAM构建体，生成对mRNA自我扩增至关重要的复制酶装置。核糖体促进将自我扩增的mRNA构建体翻译为目标蛋白，然后进行翻译后修饰。所考虑的蛋白以细胞内、跨膜或分泌形式产生。适应性和先天免疫反应识别目标蛋白。 mRNA治疗在降低预先存在或抗载体免疫风险、提高安全性、精确剂量控制以及多次给药潜力方面提供了许多优势。Pardi等人进行了一个实验，他们通过静脉注射将单剂量的LNP封装的修饰核苷mRNAs给药，这些mRNAs编码抗HIV-1 nAB VRC01的重链和轻链，在小鼠体内。研究人员观察到这种给药后的血清中功能性AB水平显著升高。此外，这种干预有效地保护了人源化小鼠免受HIV-1感染。 LNP-mRNA货物在注射后不久通过内吞作用到达肌肉细胞，随后mRNA被翻译以产生亚稳态三聚体前融合S蛋白。肌肉旁边的血管动脉网络可能稍后吸引已经渗透的APCs。使用细胞翻译机制和其他细胞质组分通过每个注射的mRNA产生一个结构良好且完全功能的蛋白是mRNA疫苗的一个优势。使用全长S蛋白的mRNA疫苗的翻译产物中包括一个跨越氨基酸1至15的信号肽，允许蛋白质被转移到质膜或从细胞质中释放。一旦主要被内体衍生的蛋白酶体分解，I类主要组织相容性复合物（MHCs）将包括大部分蛋白质，并分别呈现给CD8+和CD4+T细胞。II类MHC复合物由转染mRNA疫苗或其内吞免疫原的DCs组装，然后呈现给免疫细胞。然而，通过B细胞激活的体液免疫反应是mRNA疫苗接种的主要方法。通过CD40的结合和与同源CD4+T细胞的相互作用激活后，幼稚B细胞将在淋巴器官中增殖并发展成记忆B细胞或分泌ABs的浆细胞。亲和力决定了新激活的B细胞是否会发展成长寿命的浆细胞或休眠的记忆B细胞。浆细胞产生的ABs在血液中循环，并在次级抗原暴露时结合和中和抗原，防止携带抗原的病毒感染其目标细胞。如果没有足够的ABs，记忆B细胞就不会被触发以产生随后的免疫反应。 mRNA疫苗还具有自我佐剂特性。当ssRNA被TLR7和TLR8在内体中识别时，会激活髓样分化标记88（MyD88）信号。TLR3、视黄酸诱导基因I蛋白（RIG-I）、黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）和其他分子识别dsRNA并触发TIR结构域含适配体诱导干扰素-β（TRIF）和线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）分子的激活，进而介导I型干扰素IFN AB形成、特定细胞免疫反应和自我佐剂效果通常通过上述过程由mRNA疫苗诱导（图3）。 图3 基于脂质的NPs和信使RNA的结构。一个mRNA分子包含以下组分：5'端帽、3'非翻译区(UTR)、开放阅读框、聚(A)尾，以及5'和3'非翻译区(UTRs)。大多数mRNA疫苗通过脂质纳米颗粒(LNPs)进行传递。LNPs通常包含胆固醇、磷脂、可电离脂质和PEG偶联脂质等脂质组分。携带抗原mRNA的LNPs被用来制造猴痘mRNA疫苗，这些抗原在转染细胞中的产生和定位如图C所示。树突细胞和其他抗原呈递细胞(APCs)摄取mRNA-LNPs或局部产生的抗原。为了刺激CD4和CD8 T细胞，这些APCs必须首先前往淋巴结。CD8 T细胞的启动导致产生细胞毒性T淋巴细胞，这些细胞可能通过从内部破坏来消除病原体。T滤泡辅助细胞(Tfh)和Th1细胞是CD4 T细胞启动抗原的两种可能结果。Tfh细胞帮助激活生发中心(GC)反应。疫苗接种引起GC反应，导致产生分泌抗体的长寿浆细胞(LPLCs)和亲和力成熟的记忆力B细胞(MBCs)。由LPLCs产生的抗体类别转换到与Th1或Th2相关的抗体，受Tfh细胞向Th1或Th2表型的倾斜影响。 mRNA疫苗载体及其优势和挑战 有效地将信使RNA疫苗输送到人类细胞中是一个巨大的挑战。由于裸露的mRNA是外源核酸，因此会被核酸酶迅速分解，并且免疫系统很容易识别它。作为疫苗的裸露mRNA的药效作用要少得多。保护给定的mRNA免受核酸酶的破坏，并促进其运输到细胞中，对于提高mRNA疫苗的免疫学效果是必要的。最近的发展提高了mRNA作为疫苗平台的雄心。例如，通过使用假尿苷等核苷类似物进行RNA化学修饰，显著增强了体内蛋白质合成，这减轻了未修饰核苷酸引起的翻译抑制。高效液相色谱（HPLC）纯化的应用通过消除体外转录副产品，包括可能阻碍mRNA翻译的dsRNA，提高了mRNA的翻译效率和纯度。脂质和LNPs已被用于运输小分子药物和siRNAs。LNPs的使用显著提高了mRNA的体外和体内传递效率。实施新的配方技术，包括连续流动微流体装置，促进了任意尺寸和规模的NPs的一致合成。mRNA COVID-19疫苗中的LNPs由四个基本组成部分构成。胆固醇、中性磷脂、聚乙二醇（PEG）脂质和可电离阳离子脂质。存在带正电荷（在低pH下）的可电离胺基，在颗粒形成期间可以与带负电荷的mRNA相互作用。这有助于在导入期间通过膜融合。此外，PEG-脂质的目的是调节颗粒大小并作为立体屏障以防止与储存相关的聚集。这些元素与mRNA一起，通过快速混合生产方法产生尺寸在60到100纳米之间的颗粒。例如，针对SARS-CoV-2的nCoVsaRNA和ARCoV疫苗候选物的平均颗粒大小分别为75和89纳米。目前的mRNA-LNP COVID-19疫苗的缺点是需要在（超）低温下储存。通过确定这些疫苗不稳定的潜在原因，可能可以提高mRNA-LNP产品的稳定性，从而便于在较低温度下储存疫苗。 阳离子脂质体最初作为mRNA疫苗的脂质体传递系统。脂质体是由磷脂单层或多层排列组成的球形囊泡。由通常包括极性头基和非极性尾部的材料组成，该囊泡具有容纳目标基因的水性内部。这些基团之间的疏水和亲水相互作用刺激了囊泡的形成。通过静电作用，带正电荷的阳离子脂质与带负电荷的mRNA组装形成脂质复合物（LP），这是一个多层囊状复合物。LP中封装的mRNA对RNase降解具有抵抗力，允许其在不降解的情况下传递。然而，由于阳离子脂质在生理环境中带正电荷，它们容易与生物液体中其他带负电荷的分子发生相互作用。此外，它们容易被免疫细胞捕获，这最终损害了它们的传递能力。pH响应性阳离子脂质在这一基础上被筛选并制成各种mRNA传递载体结构。 多年来，阳离子聚合物如聚(L-赖氨酸)、聚乙烯亚胺(PEI)、DEAE-葡聚糖、聚(β-氨基酯)(PBAE)和壳聚糖已广泛用于核酸的传递。在最基本的形式中，当过量的阳离子聚合物与核酸结合时，会形成静电结合的阳离子聚合物复合物。尽管已经制造了大量的聚合物，但它们在传递核酸方面并不像LNPs那样先进，而且很少有研究在动物上有效使用它们来提供疫苗。将PBAE与聚乙二醇(PEG)-脂质共形成mRNA/PBAE/PEG-LNPs。这些NPs通过静脉注射显示它们可以将mRNA传递到动物肺部。使用促红细胞生成素作为报告基因，研究了一种名为聚(胺-酯)(PACE)的可生物降解聚合物在静脉注射后基因传递的背景下。 作为体外转录(mRNA)的初始传递试剂，研究了二乙氨基乙基(DEAE)-葡聚糖。后来的研究表明，DEAE-葡聚糖在传递mRNA方面的效率比脂质介导的转染低100到1000倍。这一发现也促进了包括mRNA在内的核酸的基于脂质的转染试剂的发展，从而阻碍了聚合物载体的进展。进行了一项全面的研究，评估了mRNA传递后的功能和抗原特异性T细胞反应。为此，将聚合物聚乙烯亚胺(PEI)和PBAE与商业转染试剂Lipofectamine™ 2000和1,2-二油基-3-三甲基氨基丙烷(DOTAP)/1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)进行了比较。每种载体中都存在复合有gag HIV-1抗原的mRNA。在用与阳离子脂质复合的gag mRNA免疫的小鼠的脾脏和淋巴结中，鉴定了分泌IFN-γ的针对gag的T细胞。然而，这并不适用于用裸露或聚合物复合mRNA免疫的小鼠。PEI及其衍生物是经常使用的阳离子聚合物。这些物质表现出水溶性，与氨基相关的大量正电荷密度，并且已被验证为体外转染的mRNA载体。PEI因其高分子量（即超过25 kDa）而具有危险性。这种现象的可能原因是阴离子血清蛋白附着在多聚体表面，这是由于阳离子聚合物与阴离子血清血浆蛋白之间的相互作用。然而，随后尺寸的增加是暂时的，因为附着在多聚体表面的蛋白质最终防止了颗粒的聚集。为了解决这些困难，已经进行了许多努力。通过鼻内给药环糊精共价2 kDa PEI，首次展示了阳离子聚合物介导的mRNA疫苗转染的可行性和有效性。环糊精与PEI的结合促进了沿多胺主链的电荷密度的位移，导致细胞毒性降低，同时保持了可质子化的基团，最终增强了转染。 猴痘感染中的mRNA疫苗 在这项研究中，使用蛋白质组学和结构疫苗学方法设计了针对猴痘的mRNA和多表位疫苗(MVC)。首先，研究人员从猴痘蛋白质组中分离出10种可能用作疫苗靶标的蛋白质。然后使用结构疫苗学方法为B细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和辅助T淋巴细胞(HTLs)绘制了这些蛋白质的表位。使用适当的连接子将9个CTL、6个B细胞和5个HTL的表位组合起来创建MVC(多表位疫苗)和基于mRNA的疫苗。通过分子对接、结合自由能计算和体外克隆，发现在大肠杆菌K12菌株中高效表达和建议的MVC与TLR2之间有很强的相互作用。免疫模拟的结果显示，注射后的抗原滴度在第5天达到峰值，然后在IgM、IgG、IgM+IgG、DCs、IFN-gamma和IL(白细胞介素)产生后迅速下降，表明设计的疫苗候选物可能有效地诱导针对猴痘的免疫反应。通过改变连接子和佐剂附着可能进一步增强针对猴痘的免疫反应，尽管这在当前研究中尚未经过测试。由于研究，使用高度抗原性和非过敏性肽创建了既有效又动态的疫苗，以对抗猴痘。这项研究使用免疫信息学方法基于mRNA创建了猴痘疫苗模型。为了更好地预测T细胞和B细胞表位，根据其抗原性、过敏性和毒性评分选择了三种蛋白质。为了提高免疫反应，使用与表位特异性连接子和佐剂连接的主要T细胞和B细胞表位设计了疫苗结构。为了创建既稳定又高度免疫原性的疫苗，插入了Kozak序列、MITD序列、tPA序列、Goblin 5'和3' UTRs以及聚(A)尾部。研究人员使用分子建模和3D结构验证预计疫苗结构将具有高质量。基于人群覆盖和表位保守性，假设开发的疫苗模型将对多种猴痘致病株提供更好的保护。在考虑了几个对接分数和理化及免疫学因素后，Mpox-V4最有前途。通过分子动力学和免疫学模拟评估，预计最佳疫苗模型将具有高结构稳定性和与免疫受体结合的高亲和力，以诱导针对猴痘的细胞和体液免疫原性反应。对这些优先结构在实验室和人类中的进一步研究可能为有效和安全的猴痘疫苗铺平道路。 两剂针对猴痘的四价mRNA疫苗（mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP）在另一项研究中被开发出来。这些疫苗的灵感来自猴痘特异性抗原A29L、A35R、M1R和B6R。小鼠在接受mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP的两次肌肉注射后，会促进产生针对猴痘的IgG抗体和针对VACV的中和抗体。这些疫苗不仅具有强大的细胞免疫反应，而且在小鼠体内具有持久的效应记忆T细胞和生发中心B细胞活性，并对猴痘有偏向性。mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP的双重给药为小鼠提供了额外的VACV挑战保护。当被动转移来自mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP免疫小鼠的血清时，裸鼠可免受VACV挑战的保护。研究人员在体内研究中证明，猴痘四价mRNA疫苗是安全的，因为没有一种mRNA-A-LNP或mRNA-B-LNP引起任何显著的不良影响。根据研究，注射部位没有显示出任何异常的皮肤反应迹象。由于疫苗不会引起主要的皮肤反应（也称为“接种”），因此没有自体接种或意外接种的风险，这与ACAM2000形成对比（在像ACAM2000这样高度复制的疫苗中，疫苗部位的损伤通常用作成功疫苗接种的标志）。这些基于mRNA的疫苗显示出作为预防措施的前景，不仅针对猴痘，还针对其他正痘病毒，如天花。 在美国，科学家们创造了一种针对猴痘的多价mRNA疫苗（Mpoxac-097）并在小鼠中测试了其免疫原性。然后将连接五个猴痘病毒抗原（A29L、E8L、M1R、A35R和B6R）的串联2A肽进行了密码子优化。这种疫苗可以保护免受VACV挑战，并产生强大的免疫反应，包括针对猴痘的nABs和T细胞反应。接受Mpoxac-097的小鼠没有显示出显著的病理变化。总之，比较了Mpoxac-097、Mix-5和单价抗原LNP mRNA的免疫原性与多价猴痘mRNA疫苗候选物。由于Mpoxac-097产生广泛的nABs和针对猴痘的特异性T细胞反应，因此在接种Mpoxac-097疫苗后可能会避免VACV挑战。Mpoxac-097与Mix-5一样有效和具有免疫原性。由于其制造过程更简单，抗原串联共表达仍然很吸引人。用Mpoxac-097免疫的小鼠没有出现任何显著的病理变化。综合来看，研究人员的结果表明，多价猴痘mRNA疫苗是可行的。作为单独研究的一部分，生成了表达猴痘蛋白M1R和A35R的A35R-M1R融合体（VGPox1和VGPox2）以及A35R和M1R的封装全长mRNA的组合（VGPox3）。在所有三种疫苗的单次免疫后，最早在第7天检测到抗A35R的总IgGs。在接种VGPox 1和2后，很快产生了抗M1R的总IgGs；然而，直到第35天，VGPox 3才显示出任何显著的抗M1R抗体。nAB和T细胞免疫反应显示出类似的模式。接触到致死剂量的病毒的小鼠在接受任一组mRNA疫苗接种后免受感染，并且病毒从他们的肺部被清除。这些数据表明，与两个单独蛋白的共表达相比，编码A35R和M1R融合蛋白的新mRNA疫苗激发了更强的抗病毒免疫。与目前的全病毒疫苗一样有效，如果更多的话，mRNA疫苗对于保护免受猴痘病毒的侵害同样有效。 研究人员进行了一组表达各种病毒抗原组合的多组分猴痘疫苗候选物的开发和合成，例如M1R、E8L、A29L、A35R和B6R。这是通过使用LNP封装的mRNA疫苗平台实现的，该平台由Zhang等人开创。在小鼠中给予两剂mRNA疫苗候选物，即AR-Mpox5和AR-Mpox4a，已经诱导了强大的抗体反应和特定的T辅助1型（Th1）偏向的细胞反应。这已通过体外和体内特征描述得到证明。接受五价和四价疫苗候选物接种的小鼠，即AR-Mpox5和AR-Mpox4a，在VACV挑战中表现出增强的保护。猴痘mRNA疫苗候选物在BALB/c小鼠在高剂量VACV感染后减轻体重方面显示出效力。在进行临床试验之前，最好进行更多的研究，以评估预防措施在其他动物模型中的效力，如使用循环猴痘株的非人灵长类动物挑战模型。在接受多组分mRNA疫苗的AR-Mpox5和AR-Mpox4b接种组中，观察到显著的抗原特异性CD8+T细胞反应。多组分mRNA疫苗在暴露于各种抗原时，诱导了倾向于产生Th1细胞因子的CD4+T细胞的免疫反应。同样，在接受三剂多价天花DNA疫苗的猕猴中，观察到偏向Th1的抗原特异性细胞免疫反应。相反，接种MVA的小鼠在产生IFN-γ的CD8+T细胞群体中显著增加。 正痘病毒和猴痘mRNA疫苗 这项研究表明，本研究中针对猴痘、天花和牛痘的疫苗配方，通过使用in silico疫苗技术进行重复接种，有效地诱导了强大的体液和细胞免疫反应。在进行in silico疫苗接种后，B细胞群体被激活，导致免疫球蛋白、CD8 T细胞毒性和CD4 Th细胞、记忆细胞和细胞因子的产生增强。根据物理化学标准，该疫苗显示出稳定性并展现出理想的品质，分子对接显示与MHC分子良好的结合。由于本工作中抗原的遗传相似性，开发了一种针对所有三种病毒共有保守表位的mRNA疫苗。选择抗原A29、A30、A35、B6和M1，以开发普遍适用的基于mRNA的免疫接种。使用在保守区域发现的B细胞和T细胞表位，开发了多表位mRNA构建体。通过免疫信息学分析，这些表位通过比较猴痘、牛痘和天花的序列来确定。疫苗构建体显示出稳定性，并通过免疫信息学分析与MHC分子最佳结合。免疫模拟分析触发了体液和细胞免疫反应。基于in silico研究结果，建议本研究中开发的通用mRNA多表位疫苗候选物可能对猴痘、天花和牛痘具有潜在的保护作用。这对于推进旨在减少可能毁灭性大流行的发生的战略可能具有重要意义。 对牛痘的广泛研究表明，其一些抗原，包括A27、L1、A33和B5，与其他正痘病毒的同源抗原在免疫原性方面非常相似。这些结果确立了使用牛痘抗原作为疫苗靶标，以创建通用痘病毒疫苗的可行性。在科学调查领域，一组学者使用四种不同的牛痘病毒抗原，包括A27、L1、A33和B5，制造了一种新型的痘病毒疫苗候选物，称为mRNA-ALAB-LNP。在接种单一疫苗后，小鼠表现出抗L1抗体的强劲产生，同时对A33、A27和B5的免疫反应相对较弱。第二次注射后，所有IgG滴度均超过5个对数，其中抗A33 IgG的滴度在这四种抗原中最高。高结合抗体水平显示对牛痘有很强的中和能力。在测试的四种抗原中，只有A33被证明可以显著促进IFN-γ的细胞反应。血清IgG对匹配的猴痘抗原A35、M1、A29和B6的反应与对牛痘抗原的反应一样强，甚至更强，这表明编码四种牛痘抗原的mRNA-ALAB可能是未来针对猴痘、天花和其他正痘病毒感染的疫苗开发有希望的候选物。 另一项旨在创建针对猴痘的多价mRNA疫苗，该疫苗将针对EV和MV表面蛋白，并分析其有效性和保护的分子基础。在BALB/c小鼠中评估了四种mRNA疫苗的免疫原性，这些疫苗包含EV（A35R和B6R）、MV（A29L、E8L、H3L和M1R）或EV和MV表面蛋白的不同组合。第一次疫苗接种后7天，看到了动态的免疫反应，并且两次疫苗接种后，通过ELISA确认对所有免疫原产生了强大的IgG反应。观察到的更高累积IgG反应与相关的VACV中和活性之间的相关性，突出了每个免疫原在刺激免疫反应和根除VACV感染中的累积效应。此外，基于mRNA的疫苗引发了偏向Th1表型的CD4+T细胞反应，并针对抗原。研究了包含EV和MV表面抗原不同组合的mRNA疫苗在保护小鼠模型免受致命VACV挑战方面的效力。结果表明，包含EV和MV抗原的疫苗配方展示了最高水平的保护。这项研究的结果为MPV多价mRNA疫苗的保护机制提供了见解，并为开发更强大、更安全的mRNA疫苗以减轻未来猴痘爆发奠定了基础。根据研究作者的说法，mRNA-LNP疫苗显示出引发针对猴痘的免疫反应并提供针对致命VACV挑战的交叉保护的能力。该疫苗包含四种已知高度保守并在病毒附着、进入和传播过程中发挥关键作用的猴痘表面蛋白的组合。基于mRNA的疫苗接种导致对猴痘的四种抗原和VACV的四种同源物产生了更明显的Fc效应Th1偏向的体液免疫反应。此外，这些疫苗对猴痘和VACV都显示出增强的中和和细胞扩散抑制特性。这一发现与使用MVA平台的现有猴痘疫苗形成对比。表达两种、三种或四种猴痘抗原的mRNA疫苗在预防与疾病相关的体重减轻和死亡方面显示出效力。然而，单一猴痘抗原mRNA疫苗仅对VACV挑战提供了部分保护。与MVA的同源保护相比，具有中和和非nABs活性的多价猴痘mRNAs提供了显著的交叉保护。这些结果表明，针对四种高度保守的病毒表面抗原的基于mRNA的疫苗可能通过诱导高度功能性的ABs迅速减少病毒感染，从而保护免受VACV的侵害。 正痘病毒和猴痘mRNA疫苗 研究表明，夏等人开发的疫苗配方针对猴痘、天花和牛痘，通过使用in silico疫苗技术进行重复接种，有效地诱导了强大的体液和细胞免疫反应。这些抗原mRNA-LNPs单独（每个5微克）或平均组合在低剂量（每个0.5微克）下给予两次，尽管四种抗原mRNA-LNPs的免疫原性可能存在差异，但仍能引发针对猴痘的特异性IgG抗体和强大的针对VACV的中和抗体。在小鼠中，VACV感染导致体重减轻和死亡，而接受两次5微克剂量的A27、B5和L1 mRNA-LNPs，或平均混合四种抗原mRNA-LNPs（每种剂量为5微克）的小鼠受到保护。他们收集的数据支持这些抗原mRNA-LNP疫苗候选物可能在对抗猴痘和类似正痘病毒感染方面有用。桑等人在另一项研究中开发了两种猴痘四价mRNA疫苗，即mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP。这些疫苗使用两种IMVs（A29L和M1R）和两种EEVs（A35R和B6R）制造。在接受两次肌肉注射mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP后，小鼠显示出产生针对猴痘的特异性IgG抗体和强大的针对VACV的中和抗体的能力。在小鼠中，对猴痘的免疫反应包括诱导记忆B细胞免疫和杀手记忆T细胞免疫。通过被动转移来自接受mRNA-A-LNP或mRNA-B-LNP免疫的小鼠的血清，实现了对裸鼠的VACV挑战的保护。接受不同剂量的mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP的小鼠显示出可比的抵抗VACV挑战的能力。研究人员展示了mRNA-A-LNP和mRNA-B-LNP作为针对猴痘流行病和其他由正痘病毒引起的爆发的潜在疫苗的安全性和有效性。 研究人员通过在转录前结合DNA质粒的简化制造技术，创建了两种多抗原mRNA疫苗候选物，这些候选物编码四种（M1、A29、B6、A35，称为Rmix4）或六种（M1、H3、A29、E8、B6、A35，称为Rmix6）猴痘抗原。研究人员发现，尽管Rmix6产生的细胞免疫反应明显大于Rmix4，但这些猴痘多抗原mRNA疫苗候选物对VACV具有相似有效的交叉中和免疫反应。单独封装每个编码抗原的mRNA是一种常见的开发多抗原mRNA疫苗的方法，尽管一次性覆盖所有mRNA更有效。由于不同的LNP生产，可以很容易地确认每种mRNA疫苗成分的免疫原性。此外，接受两种疫苗候选物接种的小鼠免受致命的VACV挑战的保护。根据对猴痘单个抗原诱导的B细胞受体（BCR）谱系的分析，M1抗原有效地诱导了中和抗体反应。此外，所有中和抗体在前20种最常见的抗体中似乎都针对与7D11相同的构象表位，表明可能存在病毒免疫逃逸的潜在弱点。根据这些结果，来自简化生产方法的Rmix4和Rmix6似乎是对抗猴痘的良好选择。（表2）。 未来展望 临床建模研究的结果显示对猴痘的保护性免疫很少。这表明，在猴痘重新出现的现阶段，由于缺乏对这种疾病的免疫力，大多数人有感染病毒的危险。猴痘的复发感染可能构成挑战。全世界已有超过80,000例猴痘确诊病例，康复者被认为对再次感染免疫。然而，最近有一个案例似乎再次感染了。研究人员在这篇评论中报告了在意大利米兰的圣拉斐尔医院发现的两例可能的猴痘再次感染。这些病例表明猴痘可能存在两次再感染。研究人员在最初的病例临床和病毒学治愈后，对第二次发作进行了检测，发现循环阈值高、症状短暂、临床表现类似于猴痘，并且可检测到中和抗体。对于最近开始的猴痘，循环阈值高，表明病毒水平低。其他可能解释再感染的理论包括性污染或组织储库中的复发。其他人的共感染可能导致或加剧症状，或者可能使再感染更容易。此外，研究人员从两个患者收集的样本中分离并测序了猴痘，这些样本来自第一次发作。他们无法从第二次发作的样本中分离病毒，可能是由于循环阈值高表明的低病毒载量。SARS-CoV-2也可能有负面影响。尽管基因组数据不能确认存在两种不同的病毒，因此是再感染（与复发相反，复发将呈现相同的病毒），但临床医生需要意识到猴痘再感染的潜力，并应通过病毒培养和测序进行调查。此外，猴痘再感染的潜力对传播和疫苗政策具有影响。此外，如果猴痘中发生特定突变，降低天花疫苗对猴痘的效力，情况可能会变得更加严重。尽管猴痘的确诊病例数量每天都在下降，但病毒仍然存在于全球，并可能以相同的谱系返回或传播到其他地区，包括中非。由于其出色的安全性、生产成本效益、高效力和快速开发，mRNA疫苗的出现显著改变了疫苗学领域。临床试验为支持两种主要的针对SARS-CoV-2及其许多变体的mRNA疫苗的安全性和有效性提供了证据。目前正在使用的JYNNEOS是一种来自减毒、非复制性正痘病毒株-改良安卡拉-巴伐利亚北欧（MVA-BN）的活疫苗。与其他疫苗不同，MVA-BN无法在人体内部复制。此外，它在不产生严重不良效果的情况下引发针对正痘病毒的体液和细胞免疫反应。基于上述观察，目前可用疫苗的有效性仍然值得怀疑。人们普遍认为，它未能提供预期和必要的有效性，以遏制疾病的传播，以及与疫苗相关的严重并发症的复发发生率可能超过猴痘引起的发病率和死亡率。因此，迫切需要开发表现出针对猴痘增强特异性、安全性和有效性的新型疫苗。关于这一点，研究人员建议在宣布猴痘为大流行病和实施准备活动变得更加困难之前，开发和测试更新的灭活和/或mRNA疫苗，以克服现有疫苗的缺点。然而，在过渡期间，直到这些疫苗经过测试并商业化，MVA-BN疫苗可以被用来减缓疾病的传播，因为它在比较ACAM2000疫苗时具有更高的效力和更安全的配置文件。 由于SARS-CoV-2的新变种的出现，人群对它的抵抗力正在下降，这导致了mRNA疫苗的重新设计。mRNA疫苗的好处在于，它们可以通过改变免疫原性转基因来快速针对变种进行修改。传统疫苗通常涉及培养大量活性病毒，然后进行灭活，这可能需要数周甚至数月的时间。另一方面，mRNA疫苗可以快速生产、测试和创建。基于仅从COVID-19 mRNA疫苗中获得的信息，为猴痘开发mRNA疫苗可能提供一种更简化的方法来预防另一场可能具有毁灭性的病毒大流行。这一主动措施将有效减轻可能随之而来的严重健康和社会经济后果。 美国唯一批准使用的小pox疫苗是改良的安卡拉-巴伐利亚北欧牛痘疫苗。在猴痘大流行期间，确保ACAM2000®天花疫苗（一种既定的预防措施）和实验性的APSV（一种潜在的替代干预措施）的可用性至关重要。在美国，现在已经开发出两种疫苗来减轻猴痘感染的风险和严重程度。这些疫苗被称为JYNNEOS（有时被称为Imvamune或Imvanex）和ACAM2000。JYNNEOS已成为正在进行的猴痘流行的疫苗选择。尽管同时封装所有mRNA对于多抗原mRNA疫苗生产更可取，但隔离和封装每个编码抗原的mRNA是标准做法。使用单独的LNP准备，可以快速轻松地测试mRNA疫苗的每个组分的免疫原性。研究人员进一步证明，猴痘多抗原mRNA疫苗候选物可以诱导针对VACV的强大交叉中和免疫反应。此外，Rmix6诱导的细胞免疫反应显著高于Rmix4。 基于mRNA的疫苗相比标准疫苗提供了几个潜在的优势，如以下几点：除了引发体液和细胞介导的免疫反应外，这些疫苗还具有几个有利的特性。首先，它们没有传染性成分，也不会稳定地整合到宿主细胞的基因组中。其次，它们对健康个体具有良好的耐受性。第三，它们具有成本效益，并且可以快速生产，使用易于标准化和可扩展的程序。第四，它们增强了有效应对广泛出现的爆发的能力。最后，它们表现出高度的耐受性。例如，疫苗在预防传染病方面具有重要意义，mRNA疫苗技术在预防COVID-19方面的应用展示了其作为平台的有效性和安全性。使用猴痘mRNA序列A29L、M1R、A35R和B6R作为灵感，研究人员在一项研究中创建了两种猴痘mRNA疫苗候选物，称为MPXfus和MPXmix。MPXfus是一个由四个抗原蛋白组成的单组分系统，它们通过柔性连接物串联融合，并由单个mRNA编码为融合蛋白。MPXmix是一个多组分系统，由四个mRNA分子组成，每个分子对应一个特定的抗原蛋白。使用Lignum NPs将同等质量的MPXfus或MPXmix用于免疫小鼠，以评估和比较这两种潜在的Mpx疫苗所引发的免疫反应。免疫反应分析的结果表明，MPXfus和MPXmix都能在小鼠中引发强大的细胞免疫反应和高水平的抗原特异性抗体。此外，病毒中和实验的结果表明，用MPXfus或MPXmix免疫的啮齿动物的血清在VACV存在时表现出显著的中和活性。此外，MPXfus和MPXmix诱导的抗原特异性抗体的滴度、细胞免疫反应水平或针对VACV的nABs活性之间没有观察到显著差异。在不同的研究中，创建了三种编码猴痘蛋白A35R和M1R的mRNA疫苗。这些疫苗包括A35R胞外域与M1R蛋白的融合体（VGPox 1和VGPox 2）以及A35R和M1R的封装全长mRNA的组合（VGPox 3）。这项工作表明，在抗病毒免疫方面，由猴痘A35R胞外域和信号肽组成的融合蛋白的mRNA疫苗优于亚致死活体VACV-WR病毒。由于VGPox 1和VGPox 2在接种后7天就早期诱导了针对病毒的体液免疫，人群免受致命的VACV挑战的保护。研究人员结果中猴痘和牛痘之间的强烈相似性使它们更加显著。这表明VGPox 1或2可能是针对其他正痘病毒的有效mRNA疫苗。尽管这项工作提供了关于mRNA疫苗对猴痘的有效性的有见地的信息，但应注意许多限制。例如，研究人员使用VACV而不是猴痘进行了体外中和和体内测试。进一步将mRNA疫苗与非人灵长类动物中的其他许可疫苗（如JYNNEOS）进行比较的研究可能会在这些结果上建立。继续评估当前疫苗的安全性和有效性以预防猴痘至关重要。因此，创建一种具有广泛应用潜力的新疫苗来预防猴痘及其不断增长的变种，可能为应对感染的动态性质提供有用的预防策略。许多研究表明，基于mRNA的LNP优于传统疫苗技术，因为它产生更高水平的nABs、更有效的猴痘特异性T细胞反应和对猴痘的保护。亲脂性药物的安全性取决于剂量和组合，并且不可能预测长期不良影响，特别是在许多剂量后，因为目前没有长期健康结果数据。在低风险患者中广泛使用mRNA疫苗之前，应该进行研究进展，重新评估利弊。此外，重要的是全面评估疫苗有效性的各个方面，包括反应原性、细胞毒性测试结果、安全性和不良反应，特别关注那些处于更高风险或更脆弱的人。这种评估对于辨别传统和新型疫苗在效力方面的最优选择至关重要。BNT166疫苗候选物编码的表面抗原存在于猴痘的两种感染形式中，使它们能够有效地对抗病毒复制和感染性。两项基于mRNA的多价疫苗候选物的安全性、耐受性、反应原性和免疫原性将在临床试验（NCT05988203）中进行评估。亚研究A是一项I期、开放标签、剂量递增试验，旨在评估两种多价疫苗候选物（BNT166a和BNT166c）在大约64名健康参与者中的安全性、免疫原性和反应原性，这些参与者之前没有接种过牛痘疫苗或没有天花疫苗接种史。两剂将在大约31天间隔内给予。如果赞助商选择不激活BNT166c组，则不会进行随机化。亚研究B是一项随机化、观察者盲、赞助商非盲的I期亚研究，旨在评估两种多价疫苗候选物（BNT166a和BNT166c）在大约32名之前接种过天花疫苗的健康参与者中的安全性、免疫原性和反应原性。两剂将在大约31天间隔内给予。参与者将按照1:1的比例进行随机分配。如果赞助商选择不激活其中一个组，这个亚研究将是一个开放标签的亚研究，只有一个组。I/II期试验的目标是招募196名健康参与者，他们要么没有接种过牛痘疫苗，要么没有已知或疑似的天花疫苗接种史。 mRNA疫苗的开发是一个快速发展的领域。众多mRNA疫苗正在进行针对各种疾病的临床试验，包括癌症和流感。与mRNA疫苗相关的一个重要障碍是它们无法承受极端寒冷和热稳定性。CureVac开发的一种热稳定的疫苗(CvnCoV)显示出不到50%的临床效力，这表明当前的目标是创造一种表现出“高临床效力”的热稳定疫苗。鉴于科学文献中缺乏关于mRNA疫苗稳定性的数据，有必要进行精心设计的研究，使用延长时间、各种辅料和储存温度来填补现有的知识空白。基于研究人员掌握的有限信息，他们推断疫苗缺乏热稳定性可以归因于它们所使用的合成mRNA的困难特性。此外，根据研究人员的发现，mRNA疫苗的热稳定性可以通过有或没有实质性配方修改来增强。作为提高mRNA疫苗稳定性和储存条件的可行替代方案，例如，脱水mRNA LPN悬浮液的替代技术，如冻干，将发挥作用。提高疫苗热稳定性的第二种方法是通过mRNA序列优化。在他们的第一个热稳定疫苗临床试验初步失败之后，CureVac目前正在开发第二种COVID-19疫苗，该疫苗结合了非编码区域mRNA优化。此外，在LPN中包括辅料，如脂质和胆固醇，可能会使疫苗容易受到氧化降解。因此，通过优化NP组分和生产过程，可以提高疫苗的稳定性。最后，一项理论研究提出，重新利用mRNA生成双链区域可能是提高疫苗稳定性的另一种策略。由于可及性不足，几个低收入和中等收入国家面临mRNA疫苗的显著未满足需求。这表明可及性仍然是低疫苗接种率的一个重要决定因素，超过了对疫苗犹豫的担忧。根据研究结果，全球COVID-19疫苗公平性仍然是一个重大问题。迫切需要集中努力提高疫苗接种率，特别是在覆盖不足和对疫苗有大量未满足需求的国家。重要的是要减少疫苗获取的障碍，确保mRNA疫苗的可用性和传播，并克服疫苗犹豫，以减少未满足的需求，实现不同地理区域的更高疫苗接种率。 结论 鉴于该病毒与SARS-CoV-2相比具有较低的传染性，并且天花疫苗已显示出对猴痘的效力，研究开发针对性疫苗候选物和探索治疗方法的重要性不容忽视。当前的大流行，如COVID-19，继续威胁全球健康，凸显了需要负担得起的疫苗，这些疫苗可以用来保护全球人口免受传染病的侵害。此外，大多数感染猴痘的人从未接种过天花疫苗。结果可能有助于政府设计或倡导针对最危险人群的公共卫生政策和免疫计划。对天花疫苗产生的抗体是交叉反应性的，这意味着它们可以识别并对抗其他正痘病毒。此外，COVID-19大流行凸显了需要对猴痘病毒进行新的生物技术研究，以促进低成本治疗和疫苗的创造。最后但同样重要的是，鉴于当前流行病可能导致严重疾病和死亡，必须立即进行严格、良好控制的前瞻性试验以证明效力。在处理意外情况时，核酸平台表现出色。尽管成功将随时间衡量，但自从获得FDA批准以来，mRNA疫苗的开发和测试速度是显著的。核酸技术然后可以评估和专利治疗和预防效应分子，如抗体。SARS-CoV-2展示了在没有灵活的基础设施的情况下，要始终领先于一个快速适应的代理可能有多困难。mRNA疫苗可以迅速开发、评估并大规模生产。mRNA疫苗中缺乏活病毒使它们成为更安全的选择。然而，mRNA疫苗也有自己的问题。尽管疫苗的mRNA可能在注射后迅速被销毁或产生细胞因子风暴，过敏反应、肾衰竭、心力衰竭和梗死仍然是可能的不良反应。考虑到相关技术的快速发展，这种疗法的传递和稳定性可能只是时间问题。生物/纳米技术、复杂的纳米/制造以及开放报告和数据共享方面的突破，使得能够迅速开发出在猴痘感染期间有效的mRNA疫苗技术。在将猴痘标记为大流行之前，还有时间创造一个引人注目且安全的新一代疫苗，以根除病毒或开发创新的疫苗平台。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:多发性骨髓瘤是一种骨髓浆细胞的癌症，约占血液恶性肿瘤的10%。尽管它通常不可治愈，但在过去25年中开发的一系列显著的新疗法已经使大多数患者实现了持久的疾病控制。本文简要介绍了多发性骨髓瘤的临床特征以及现代疗法利用的多发性骨髓瘤生物学方面。然后回顾了关键的当前和新兴的治疗方式，包括cerblon调节剂、蛋白酶体抑制剂、单克隆抗体、其他分子靶向疗法（selinexor、venetoclax）、嵌合抗原受体T细胞、T细胞结合双特异性抗体以及抗体-药物偶联物。对于每种方式，讨论了其作用机制和临床考虑。这些疗法在现代治疗路径中被组合和序列化，在文章的结尾进行了讨论，这些已经导致近年来多发性骨髓瘤患者的治疗结果有了显著的改善。 1.多发性骨髓瘤（MM）的简要临床入门 多发性骨髓瘤（MM）是一种骨髓浆细胞的癌症，约占血液恶性肿瘤的10%。在美国，其发病率为每10万人中有7人，中位发病年龄为69岁。一种被称为单克隆丙种球蛋白病（MGUS）或根据病情轻重称为隐匿性MM的恶性前体浆细胞增生，被认为会发展成所有MM病例。与MM相比，MGUS较为常见，影响约3%的50岁以上人群，且大多数MGUS患者不会发展成MM。隐匿性MM患者有不同程度的MM风险，有些病例类似MGUS，而其他病例则表现出高近远期MM风险，根据临床和遗传因素，在诊断后2年内高达80%。MM及其前体在非洲后裔个体中更为常见。 从前体状况发展到活跃的MM通常伴随着一个或多个标志性的临床并发症：(a) 由于骨髓抑制引起的贫血，(b) 溶骨性骨病变、病理性骨折和/或由于恶性浆细胞激活破骨细胞而引起的高钙血症，以及(c) 由于MM细胞分泌的单克隆免疫球蛋白游离轻链高肾流量而引起的肾脏损伤。现代MM治疗，这是本综述的重点，能够在几乎所有患者中实现初步的细胞减少和临床改善。尽管一小部分MM患者可能在接受一线治疗后被治愈或实现无限期的疾病静止，但大多数患者会复发。复发的患者通常可以通过几条连续的治疗线来维持疾病控制，直到发展成最终致命的难治性疾病。 MM患者的预后在过去几十年中有了显著改善。国家癌症研究所监测、流行病学和结果计划（SEER）统计报告显示，2012-2018年被诊断的患者5年生存率为58%，而1995-1997年被诊断的患者为32%。最近的一份报告表明，现代疗法的中位总生存期为10年，并且对于能够获得最新疗法的患者，生存期可能会进一步提高。然而，根据临床和细胞遗传学分期系统定义的预后亚组之间，结果仍然存在相当大的异质性。 2.关于多发性骨髓瘤生物学的简要介绍 MM的两个广泛的遗传亚组可能代表了在生发中心反应中暴露于抗原的B细胞中不同的起始事件。一个组以染色体14易位为特征，将选择性癌基因的表达置于强大的免疫球蛋白重链（IgH）增强子的控制之下；这些易位可能源于异常的类别转换重组。第二组以超二倍体为特征，可能源于生发中心增殖期间的染色体错分。这些异常的B细胞克隆分化为长寿的骨髓浆细胞。随后，次级遗传病变和表观遗传异常累积，导致一些患者从MGUS发展到有症状的MM，在此期间出现了相当大的克隆内异质性。与遗传和表观遗传异常的进展同时，发展到有症状的MM也可能取决于抗MM免疫的减弱和骨髓微环境的许可变化。 大多数MM疗法利用了浆细胞生物学，这在最近的综述中得到了全面回顾。三种转录因子—IRF4、BLIMP-1和XBP1—在从快速增殖的生发中心B细胞生成和功能中发挥关键作用。在生发中心反应中，IRF4在B细胞中的逐渐增加激活了Prdm1的表达，Prdm1编码BLIMP-1，它抑制B细胞转录程序，有助于维持高水平免疫球蛋白合成所需的增强的未折叠蛋白反应（UPR），并增加免疫球蛋白基因转录。Xbp1，其活性由内质网中蛋白质过载响应的替代剪接调节，驱动UPR基因的表达。持续的IRF4表达对浆细胞存活是必需的，尽管其作用尚未完全阐明。与在正常浆细胞中的作用不同，IRF4在MM细胞中发挥不同的作用，例如驱动在正常浆细胞中被抑制的Myc癌基因的表达。MM细胞对UPR的依赖和IRF4表达是蛋白酶体抑制剂和cerblon调节剂治疗机制的基础。 正常浆细胞和MM细胞都依赖于来自骨髓微环境的外源信号来维持生存，而MM细胞重塑骨髓微环境以支持生长和逃避抗MM免疫；这些效应中的许多是通过MM细胞和骨髓基质细胞之间的相互作用介导的。例如，B细胞成熟抗原（BCMA），一个重要的细胞表面MM免疫治疗靶点，与其在骨髓基质细胞上的配体相互作用；这导致信号传导，增加抗凋亡BCL-2家族蛋白MCL-1的表达和NF-κB信号，从而促进人类MM细胞的生长。一系列令人眼花缭乱的相互作用有助于抑制抗MM免疫，并涉及先天[例如，诱导髓源性抑制细胞和肿瘤相关巨噬细胞，自然杀伤（NK）细胞抑制]和适应性（例如，诱导Th17和调节性T细胞）免疫反应的扭曲。 3.治疗途径 我们首先回顾构成现代MM治疗的主要治疗类别，然后讨论如何将这些治疗整合到治疗途径中。在每个部分，我们都讨论当前和新兴的方法。尽管传统的细胞毒性化疗在MM管理中仍然发挥作用，但本综述侧重于最近开发的药剂，这些药剂在很大程度上已经取代了细胞毒性化疗，并对MM患者预期生存的显著改善负有责任。本综述也不深入讨论糖皮质激素在MM治疗中的作用，尽管糖皮质激素是最早的MM治疗方法之一，并且继续是许多联合方案的组成部分。 3.1.分子靶向治疗 本节讨论了一些在MM细胞中具有明确靶点的小分子，以及在某些情况下，微环境。 Cereblon结合剂。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的Cereblon结合剂包括沙利度胺（自1997年批准）、来那度胺（2006年）和泊马度胺（2013年）；这一类中的新兴药物包括iberdomide和mezigdomide。Cereblon结合剂通常被称为IMiDs（免疫调节咪唑啉类药物）或CELMoDs（Cereblon E3连接酶调节药物）。这个类别通过沙利度胺在上市前未能识别出致畸性，而在怀孕期间作为恶心药物销售的灾难性失败，走向了目前在MM治疗中的使用。几十年后，尽管在其作用机制完全被理解之前，Barlogie及其同事基于其抗血管生成特性，在MM中临床评估了沙利度胺，并证明了与当时使用的标准疗法相比具有显著的疗效。其他同期研究识别了沙利度胺的免疫调节特性，包括抗TNFα和抗IL6效应以及NF-κB活性的抑制，提出了其抗MM特性的多效性机制的可能性。直到2010年，Cereblon作为E3泛素连接酶复合体的一个组成部分，被确定为沙利度胺致畸效应的相关分子靶点。随后的重大研究阐明了沙利度胺和来那度胺在Cereblon和转录因子IKZF1和IKZF3（分别称为Ikaros和Aiolos）之间形成分子桥，这导致它们的泛素化和随后的蛋白酶体降解。IKZF3的降解，反过来，显著降低了IRF4的转录，IRF4是MM细胞存活的关键转录因子，如上所述。这种机制也解释了这些药物的多效性免疫调节特性，因为IKZF1/IKZF3降解的效果取决于细胞背景。在T细胞中，IKZF3的缺失刺激了IL2转录，解释了来那度胺激活T细胞的能力；这些药物激活NK细胞的类似机制。这些免疫调节机制为将Cereblon结合剂与其他MM免疫疗法合理组合提供了基础，尤其是单克隆抗体daratumumab和elotuzumab。 来那度胺和泊马度胺在结构上是沙利度胺的衍生物，并且对Cereblon的亲和力依次更强。所有这些都是口服给药。这三种FDA批准的药物具有不同的毒性特征，值得注意的是外周神经病变（沙利度胺）、骨髓抑制（来那度胺和泊马度胺）和肾脏依赖的药代动力学（来那度胺）。这些药物作为单一疗法或在MM治疗中（见“现代治疗途径”部分）的组合中使用。研究性药物iberdomide和mezigdomide的Cereblon结合亲和力甚至高于泊马度胺，这可能绕过某些抗性机制；这些药物在早期临床研究中显示出临床疗效，并正在进行进一步的临床开发。 IMiDs在MM治疗中的成功确立了通过Cereblon结合适配分子重定向泛素连接酶活性作为一种新的药理机制来诱导目标蛋白降解。这种方法正在通过新分子设计适应，统称为PROTACs（靶向蛋白降解的嵌合体），将Cereblon与替代降解目标联系起来，如前列腺癌的雄激素受体、乳腺癌的雌激素受体和B细胞恶性肿瘤的Bruton酪氨酸激酶。 蛋白酶体抑制剂。FDA批准的蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米（自2003年批准）、卡非佐米（2012年）和伊扎佐米（2015年）。MM细胞对蛋白酶体抑制剂的特别敏感可能是由于它们对UPR的巨大依赖。蛋白酶体有三个主要的蛋白水解活性——类胰蛋白酶样、类脲酶样和类胰酶样活性——每种活性都由其蛋白水解核心的不同亚基介导。蛋白酶体抑制剂模仿这些蛋白水解单元的肽底物，在尝试这些人工底物的蛋白水解过程中，共价结合并灭活蛋白酶活性位点。硼替佐米针对类胰蛋白酶和类脲酶亚基；卡非佐米和伊扎佐米主要抑制类胰蛋白酶样亚基。硼替佐米和伊扎佐米都可逆地结合蛋白酶体，而卡非佐米则不可逆地结合。卡非佐米的不可逆结合可能是其更强的临床活性和克服硼替佐米抗性能力的原因。与卡非佐米相比，硼替佐米表现出非特异性的非蛋白酶体丝氨酸蛋白酶的抑制作用，这可能是其引起外周神经病变的倾向的原因。硼替佐米和卡非佐米都有心脏毒性的风险，其机制尚不清楚，以及药物诱导的血栓性微血管病，这可能是由于补体介导的机制和遗传倾向；这两种毒性可能在卡非佐米中更常见。自硼替佐米首次在复发/难治性MM中显示出疗效以来，蛋白酶体抑制剂已在MM治疗中进行了研究。 硼替佐米最初作为静脉注射进行评估，但随后的研究表明，皮下给药同样有效，但与降低外周神经病变的风险和提高便利性相关。卡非佐米每周一次或两次作为静脉注射给药。卡非佐米在多个剂量下获批；现在认识到更高剂量更有效，可能是因为能够额外结合类脲酶和类胰酶样蛋白酶体亚基，但也与更多的心脏毒性相关。伊扎佐米是唯一一种FDA批准的口服可用的蛋白酶体抑制剂。 Selinexor。Selinexor是一种口服XPO1（也称为CRM1）核出口蛋白抑制剂。靶向核出口是一种在肿瘤学中新颖的治疗方法，其理论依据是XPO1的过度表达和其底物（包括肿瘤抑制蛋白）在许多人类癌症中的错位。临床前研究表明，XPO1表达与较短的生存期相关，并且selinexor在体外和在小鼠模型中表现出强烈的抗MM活性。Selinexor在2019年被FDA批准用于治疗复发/难治性MM，在I/II期研究中显示出临床疗效，后来在III期试验中得到确认。尽管selinexor与地塞米松联合获批，但每周两次的剂量导致具有挑战性的毒性，包括恶心、乏力和细胞减少症。在实践中，selinexor通常每周一次与其他MM治疗联合使用，基于I/II期研究显示更好的耐受性。 Venetoclax。Venetoclax是一种口服BCL-2抑制剂，已获得FDA批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病。它在MM中的使用值得注意，因为它是第一种有效性仅限于细胞遗传学或转录定义的MM患者亚组的治疗。BCL-2家族蛋白调节促凋亡和抗凋亡信号的平衡；BCL-2依赖性通常是B细胞的特征，而浆细胞则转变为依赖MCL-1，这是另一种BCL-2家族蛋白。然而，一部分MM表现出更典型的B细胞转录组和表观遗传学特征，以至于使用venetoclax抑制BCL-2在临床上是有效的。尚未为venetoclax的疗效建立精确的生物标志物用于临床，尽管venetoclax的疗效在具有IgH易位t(11;14)的MM亚组中明显富集；在这组复发/难治性患者中，约40%对venetoclax单药治疗有反应。因此，t(11;14)是一个有用的但不是完美的反应预测因子，偶尔没有t(11;14)的患者可能对venetoclax有反应。由于venetoclax在未经选择的患者中的随机临床试验表明可能对反应可能性低的患者造成伤害，因此限制venetoclax的使用在有合理反应概率的患者中是很重要的。 3.2.单克隆抗体 目前已有三种单克隆抗体获得FDA批准用于MM治疗：daratumumab和isatuximab（针对CD38）以及elotuzumab（针对SLAMF7）。Daratumumab和elotuzumab均于2015年获批；isatuximab于2020年获批。 Daratumumab。CD38在淋巴细胞和髓系细胞的亚群中广泛表达，但正常浆细胞和MM细胞通常在造血谱系中表现出最高的CD38细胞表面水平。Daratumumab是一种完全人源的抗CD38抗体，用于治疗MM。Daratumumab被认为通过多种机制发挥抗MM活性：(a) 与先天免疫效应细胞（如巨噬细胞和NK细胞）上的Fc受体结合，导致细胞介导的细胞毒性、吞噬作用或通过Fc交联诱导凋亡；(b) 在CD38结合后启动补体级联反应，产生膜攻击复合物，随后使MM细胞通透，并与吞噬细胞上的补体受体结合；(c) 通过消除表达CD38的免疫抑制人群（如髓源性抑制细胞和调节性T细胞和B细胞）以及抑制CD38的烟酰胺二核苷酸酶外酶功能，刺激抗MM免疫，这可能通过影响T细胞亚群和腺苷产生而有助于免疫抑制。Daratumumab可以作为静脉注射或通过与透明质酸酶复合的较新制剂作为皮下注射给药。皮下制剂更方便，显示出无法区分的疗效，并且较少引起过敏反应。除了仅偶尔严重的过敏反应外，其他值得注意的毒性包括略微增加的感染风险和轻度细胞减少症。Daratumumab还与红细胞上的CD38结合，这导致在交叉配血过程中出现假阳性结果；这可以通过修改交叉配血方案来解决，并且如果需要红细胞输血，患者应告知他们的医疗保健提供者他们正在接受daratumumab治疗。 Daratumumab最初作为单一疗法被证明是有效的，后来在早期MM治疗中与其它药物联合使用。如上所述，人们认为daratumumab和激活先天免疫细胞的IMiDs之间存在机制协同作用，这些细胞是抗体效力的细胞介导机制所必需的。 Isatuximab。Isatuximab是一种针对CD38的嵌合单克隆抗体，FDA批准其作为单一疗法和联合治疗用于MM治疗。Isatuximab和daratumumab结合CD38分子的不同表位。临床前研究表明不同的功能特性，与daratumumab不同，isatuximab能够在没有Fc交联的情况下直接诱导MM细胞凋亡。这些在临床前研究中表征的不同的功能特性的临床意义尚不确定。Isatuximab和daratumumab尚未在前瞻性临床试验中直接比较。分别进行但设计相似的isatuximab和daratumumab的试验结果相似。一项小型研究评估了isatuximab在接受并对抗daratumumab产生耐药性的患者中的使用，没有产生客观反应，中位无进展生存期仅为1.6个月，表明isatuximab通常对对抗daratumumab产生耐药性的患者无效。由于isatuximab是最近开发的，目前只能作为静脉注射使用，因此它不像daratumumab那样常用。 Elotuzumab。Elotuzumab是一种针对SLAMF7（也称为CS1）的人源化单克隆抗体，SLAMF7是一种细胞表面糖蛋白。SLAMF7在恶性和正常浆细胞上高度表达，在NK细胞、CD8+ T细胞、活化B细胞和成熟树突细胞上表达水平较低。SLAMF7介导MM细胞和骨髓基质细胞之间的接触，但其在MM发病机制中的确切作用尚不确定。Elotuzumab不诱导补体介导的细胞毒性，因此其治疗机制在很大程度上依赖于通过NK细胞上的传统Fc受体结合（即抗体依赖性细胞介导的细胞毒性），直接激活NK细胞通过SLAMF7在NK细胞上的结合，以及促进NK细胞和MM细胞之间的同型CS1-CS1相互作用。也许由于这些不同的功能特性，elotuzumab在临床上作为单一药物几乎没有疗效，但与IMiDs联合使用是有效的，如上所述激活NK细胞。实际上，两项随机对照试验已经证明，与IMiDs和地塞米松相比，elotuzumab与lenalidomide或pomalidomide和地塞米松联合使用时，总生存期更长。Elotuzumab的耐受性良好，III期研究没有证明elotuzumab/IMiD/地塞米松联合使用与IMiD/地塞米松联合使用相比有显著的额外毒性。 3.3.嵌合抗原受体T细胞疗法 嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法涉及体外激活和基因修饰自体T细胞，使其表达一种细胞表面受体，该受体结合恶性细胞上的细胞表面靶标，并向T细胞传递激活信号，导致T细胞直接对恶性细胞产生细胞毒性。CAR T细胞在临床上的成功是基础免疫学、合成生物学和基因工程的胜利，首次在表达CD19的B细胞恶性肿瘤中得到证明。抗CD19 CAR T细胞现在已获得FDA批准用于治疗B细胞急性淋巴细胞性白血病、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。 MM通常不表达CD19，因此在MM中发展CAR T细胞已集中在其他细胞表面靶标上。由于CAR T细胞通常比单克隆抗体产生更强大和持久的细胞毒性，如果靶标抗原在正常组织上表达，就有更大的脱靶毒性潜力。此外，共表达在T细胞上的CAR T细胞靶标会创造出CAR T细胞对其他CAR T细胞的细胞毒性，称为CAR T细胞手足相残。 基于这些原因，CD38和SLAMF7被认为是MM CAR T细胞治疗开发的次要靶标，研究主要集中在BCMA（如上所述）以及最近更多关注的GPRC5D（G蛋白偶联受体，C类，5组），后者在MM细胞上的表达更为受限。抗BCMA CAR T细胞治疗对MM的临床疗效代表了首次证明抗CD19 CAR T细胞的成功可以转化为另一个抗原。两种抗BCMA CAR T细胞治疗——idecabtagene vicleucel（ide-cel）和ciltacabtagene autoleucel——已获得FDA批准用于MM。 抗BCMA CAR T细胞的主要毒性也观察到与用于MM的抗CD19 CAR T细胞相似。最值得注意的是，这些包括细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞神经毒性综合征（ICANS）、感染风险和持续的细胞减少症。CRS被认为是由于CAR T细胞在体内增殖后，通过激活的CAR T细胞的二次激活先天免疫细胞而发展起来的。在最轻微的形式中，CRS仅导致发烧，但CRS可以发展为低血压、呼吸窘迫和多器官衰竭，需要重症监护，可能导致死亡。CRS似乎是由过度的IL6产生驱动的，使用抗IL6受体抗体tocilizumab治疗在大多数情况下是有效的。大多数接受CAR T细胞治疗的患者都发生了CRS。ICANS的机制尚不清楚，但幸运的是，ICANS比CRS更少见。ICANS的表现可以从轻度震颤到严重的脑病，伴有脑水肿和潜在的致命并发症。皮质类固醇是ICANS治疗的主要手段，因为针对IL6的疗法通常无效。感染风险是由MM的免疫抑制效应、CAR T细胞对正常BCMA表达浆细胞的活性以及CAR T细胞输注前进行的淋巴耗竭化疗的淋巴毒性效应驱动的。可能会发展出与所使用的化疗剂量不成比例的深度和持续时间的细胞减少症；这种并发症的机制尚不确定。 抗BCMA CAR T细胞共享抗CD19 CAR T细胞的毒性，并且还有一组不确定潜在机制的神经毒性。在cilta-cel的I期研究中，一小部分患者在晚些时候经历了帕金森病特征的运动和认知障碍。这种综合征在某些情况下是致命的。尸检发现基底神经节的T细胞浸润，尽管尚不确定这种综合征是否是由于CAR识别靶蛋白（即隐匿BCMA表达或另一种蛋白质上的交叉反应表位）引起的。尽管这种毒性更常与cilta-cel报告，但ide-cel的美国处方信息也报告了帕金森症的实例。偶尔的周围神经病变，包括颅神经麻痹，也已报告与cilta-cel和ide-cel都有。 几个实际考虑影响CAR T细胞治疗在MM中的应用。目前，CAR T细胞治疗需要与制造商签约并拥有必要的专业知识的专门中心，用于白细胞分离、细胞治疗处理和毒性管理。目前可用的产品还需要几周的制造和释放测试。这些因素限制了CAR T细胞治疗在不在细胞治疗中心附近或有需要紧急治疗的疾病并发症的患者中的可行性。 基于这一人群的II期研究，ide-cel和cilta-cel均已获得FDA批准，用于接受四线或更多MM治疗的患者。反应率，表明至少有50%疾病负担减少的患者比例，对于已经对如此多的先前MM治疗产生耐药性的患者来说是显著的：ide-cel为81%，cilta-cel为97%。持久性也令人印象深刻，ide-cel的中位无进展生存期为12个月，cilta-cel在24个月随访后尚未达到。最近的随机III期试验现在已显示，与早期治疗线后复发疾病的标准选择相比，ide-cel和cilta-cel的无进展生存期更长。尽管ide-cel和cilta-cel可能会改善MM患者的长期生存，但这些至少在它们迄今为止测试的临床环境中，不是MM的可靠治愈疗法。基于上述研究中可用的生存趋势，大多数接受目前可用CAR T细胞治疗的患者预计将最终经历疾病进展。这些结果与CD19+恶性肿瘤中的CAR T细胞治疗结果形成对比，其中一部分先前无法治愈的复发疾病患者在长期随访后似乎被治愈。 在这篇综述中，全面讨论多发性骨髓瘤（MM）中潜在的CAR T细胞抗性机制超出了范围，但有一些在临床评估中出现的策略值得一提： 提高T细胞的适应性：MM的免疫抑制效应和广泛的先前MM治疗，具有淋巴毒性特性，可能会削弱从严重复发/难治性MM患者制造的CAR T细胞产品的效力。为了对抗这一点，ide-cel和cilta-cel正在临床评估中，用于对一线MM治疗有反应的患者，在这一点上，MM的负担应该很低，治疗引起的T细胞功能障碍也较少。我们从比较早期与晚期治疗线的MM患者的T细胞以及一线MM治疗中抗BCMA CAR T细胞的试点临床试验的结果支持这些方法。使用来自健康供体的同种异体T细胞是提高T细胞适应性的另一种方法。这种同种异体方法利用了基因编辑技术的进步，通过破坏内源性T细胞受体来降低移植物抗宿主病的风险。最近报告的ALLO-715的结果令人鼓舞，这是一种利用这种方法的同种异体抗BCMA CAR T细胞产品。 缩短制造时间：尽管第一代CAR T细胞方法在生长促进条件下培养T细胞数天以产生足够的细胞剂量，但最近的数据表明，缩短这个体外扩增期并注入较低的细胞剂量允许CAR T细胞在体内更生理的增殖，可能具有更优越的临床疗效。使用缩短培养条件制造的抗BCMA CAR T细胞的初步临床结果产生了一个分化程度较低的T细胞表型，尽管细胞剂量较低，但临床反应令人印象深刻。这种缩短的制造过程还有潜力通过减少制造周转时间和成本，增加CAR T细胞治疗的可及性。 绕过BCMA丢失：BCMA的遗传丢失似乎在少数情况下发生在抗BCMA CAR T细胞治疗后，尽管在体内CAR T细胞活性的初始期间BCMA的暂时减少似乎更为常见，并可能导致抗性。BCMA由γ分泌酶从MM细胞表面切割，这可以通过药理学抑制，导致细胞表面BCMA密度大幅增加。口服生物可利用的γ分泌酶抑制剂治疗可以安全地与抗BCMA CAR T细胞治疗结合使用。除了BCMA之外，针对其他抗原也会绕过BCMA的丢失。在最近展示了GPRC5D作为MM中有利的CAR T细胞靶标之后，使用抗GPRC5D CAR T细胞的I期研究在之前接受过抗BCMA CAR T细胞治疗后进展的患者中显示出有希望的疗效。 3.4.T细胞双特异性抗体 与早期CAR T细胞并行，开发了一种双特异性分子，这些分子在体内与T细胞和癌细胞共结合，作为重定向自体T细胞特异性的替代方法。这些分子的T细胞结合臂通常结合CD3，这是T细胞受体复合体的一个组成部分，传递激活信号。采用这种策略的首个FDA批准的癌症疗法是双林妥莫单抗，它结合CD3和CD19，用于治疗B细胞急性淋巴细胞性白血病。已经研究了这些双特异性分子中连接两个抗原结合域的多种配置。双林妥莫单抗是一个重链和轻链免疫球蛋白可变片段的异质二聚体，通过短肽链连接。与全长抗体相比，这种相对较小的格式导致半衰期短，需要持续的静脉输注。同样配置的抗BCMA/CD3双特异性分子AMG420是第一个在I期临床试验中显示对复发/难治性MM有效性的药剂。在复发/难治性MM中，反应率为70%，与CAR T细胞获得的反应相媲美。 正在开发多种作为全长抗体格式化的抗BCMA/CD3双特异性分子，具有更长的半衰期，适合间歇性给药。首个获得FDA批准（通过加速批准途径）的此类药剂是特利司他单抗，它在中位五线治疗后疾病复发的MM患者中展示了63%的反应率，其中69%的反应持续至少12个月。还开发了针对GPRC5D和Fc受体同源5（FcRH5），一种MM中的新型细胞表面靶标的双特异性抗体，并显示出类似的临床反应，包括之前用抗BCMA双特异性抗体或CAR T细胞治疗的患者中有持久反应的报告。 双特异性抗体的毒性与CAR T细胞相似，反映了它们相似的作用机制。虽然承认跨试验比较的局限性，但双特异性抗体可能比CAR T细胞具有较低的高级别CRS或ICANS风险。大多数双特异性抗体正在作为持续剂量疗法进行研究，直到疾病进展，遵循大多数现代MM治疗的范例。持续剂量的双特异性抗体可能导致与CAR T细胞相比更持久的体内T细胞重定向，后者在大多数患者的前几个月内的体内活性似乎会减弱。在BCMA导向的双特异性抗体的情况下，这种持续的长期抗BCMA T细胞活性导致由于正常浆细胞的严格耗尽，导致深刻的体液免疫抑制。尽管复发/难治性MM患者接受任何治疗都有很高的感染风险，但新出现的数据显示，与持续剂量的抗BCMA双特异性抗体治疗的患者相比，感染风险和机会性感染的发生风险明显更高。GPRC5D导向的双特异性抗体的风险可能较低。接受BCMA导向双特异性抗体治疗的患者需要预防性抗病毒治疗以防止带状疱疹再激活，并补充免疫球蛋白以对抗体液免疫麻痹。这种感染风险促进了中断治疗的替代剂量策略的兴趣，在深度反应的患者中中断治疗以允许免疫重建。这种方法的初步结果与cevostamab，一种抗FCRH5/CD3双特异性抗体，一直很好，几乎所有患者在停止治疗后都能维持持久的MM控制。双特异性抗体在MM中的临床结果代表了显著的进展，实现了与CAR T细胞疗法反应相似的临床反应，具有间歇剂量的现成药品的可用性和便利性。与CAR T细胞一样，双特异性抗体的效力取决于患者T细胞的健康状况，这为正在进行的双特异性抗体在更早的MM治疗线中的临床评估提供了理由。需要进一步的临床研究来了解各种双特异性抗体和CAR T细胞在标准MM治疗背景下的最佳顺序。尽管由于I/II期试验中较低的顶级反应率，人们很容易得出双特异性抗体比CAR T细胞疗法略逊一筹的结论，但CAR T细胞试验可能已经选择性地招募了较少侵袭性MM患者，这些患者能够等待几周完成患者特异性制造。对于对双特异性抗体有反应的患者，反应的质量和持续时间似乎与CAR T细胞实现的反应相当。 3.5.抗体-药物偶联物 抗体-药物偶联物是针对细胞表面靶标的单克隆抗体，与强效化疗分子偶联。这些强效化疗药物如果系统性给药会太有毒，但抗体偶联允许将化疗药物靶向输送到癌细胞并最小化系统性暴露。几种抗体-药物偶联物已经获得FDA批准用于其他癌症。Belantamab mafadotin是一种利用微管抑制剂单甲基auristatin F的抗BCMA抗体-药物偶联物。Belantamab基于II期试验中的反应率和反应持久性有希望，获得了加速FDA批准，尽管当III期试验将belantamab与pomalidomide/dexamethasone对照方案进行比较时未能证明改善无进展生存期，批准随后被撤销。其他正在进行的belantamab III期试验可能会证明其益处并导致完全FDA批准。 4.现代治疗路径 上述疗法的快速发展、进行总生存期为终点的III期试验所需的长期随访时间，以及现代疗法的高成本（这阻碍了所有监管管辖区和医疗体系中现代疗法的统一采纳）已经造成了关于哪种疗法序列和组合能够带来最佳长期生存结果的证据缺口。尽管存在这种不确定性，仍有多种治疗路径可用，为大多数MM患者带来出色的结果、长期疾病控制和良好的生活质量。对这些路径的深入回顾可以在其他地方找到。 在这里，我们回顾主要主题，并强调共识和不确定性的领域。 4.1.初始治疗 现代一线治疗通常包括由两种现代药物和每周地塞米松组成的三联方案。最有效且研究最充分的三联方案是将来普尼莫德和地塞米松与硼替佐米或达拉图单抗结合使用（即，将IMiD与蛋白酶抑制剂或抗CD38单克隆抗体结合）。来普尼莫德、硼替佐米和地塞米松的组合与仅用来普尼莫德和地塞米松相比，提高了总体生存率。在来普尼莫德或达拉图单抗不用于一线治疗的地区，通常使用硼替佐米和沙利度胺与地塞米松的组合。与双联方案相比，三联方案产生更可靠的初始反应、逆转呈现的并发症和优越的长期生存。 作为初始治疗的一部分，使用更有效的蛋白酶抑制剂卡非佐米替代硼替佐米似乎并不能改善结果。由抗CD38抗体、IMiD、蛋白酶抑制剂和地塞米松组成的四联方案已经评估，并与三联方案相比，产生更优越的深度反应和无进展生存期；四联方案是否比将第四种药物保留用于后续治疗线延长总体生存期仍不确定。一些专家主张普遍使用四联方案，而其他人建议在具有高风险特征或对三联疗法反应不足的患者中更有选择性地使用。 自体干细胞移植（ASCT）涉及给予骨髓消融性细胞毒性化疗，然后输注先前收集的自体造血干细胞，以实现造血重建。ASCT在年轻、健康的患者中经过初步治疗反应后得到了广泛的研究，并一直发现可以改善无进展和总体生存；使用现代疗法，将ASCT推迟到二线治疗可能会产生类似的长期结果。 在几个月的多药物一线治疗后，无论是否进行ASCT，低剂量来普尼莫德维持治疗可以改善无进展生存期；在进行ASCT的患者中，维持治疗可以改善总体生存期。 上述一线治疗序列在绝大多数患者中实现了数年的疾病控制，对一些人来说是不确定期的疾病控制。接受维持治疗的患者将进行定期的实验室检测和临床评估，以监测疾病进展。 4.2.复发疾病的治疗 在上述一线治疗序列中经历疾病进展的患者将接受二线治疗。二线治疗的选择取决于一线治疗中使用的药物、以前治疗中经历的毒性、疾病进展的速度和医学合并症。与一线治疗一样，三联方案优于双联方案。大多数患者能够接受多次连续的治疗线用于复发疾病。复发疾病的治疗可以分为早期（一至三线治疗）和晚期（四线或更多治疗）复发。在早期复发中使用的基于证据的三联方案包括将抗CD38抗体与IMiD或卡非佐米结合，卡非佐米与泊马度胺结合，或将Elotuzumab与IMiD结合；所有这些方案也都包括每周地塞米松。晚期复发的治疗依赖于II期研究，这些研究证明了以前在新组合中使用的药物的安全性和临床疗效，这些药物通常只批准用于晚期复发治疗（特别是Selinexor、CAR T细胞和双特异性抗体），以及偶尔使用细胞毒性化疗。 随着患者经历多次复发，重要的是让他们参与关于生命终结护理的讨论，并为患者及其家人准备无法治疗的复发的可能性。尽管如此，对于复发疾病的MM患者来说，提供多条治疗线非常重要。一些证据指向高流失率，表明一些患者可能没有被提供可能有效的复发方案。与专门照顾MM患者的肿瘤科医生咨询可以在患者的个性化决策中提供价值，特别是在晚期复发时。 4.3.不确定性领域 两个重要的不确定性领域是使用反应适应性治疗，特别是使用敏感的可测量残留疾病（MRD）测定来指导管理，以及对MM前体条件患者的早期干预。 微小残留病（MRD）引导的治疗。现在许多MM患者实现了完全反应，在这些患者中无法通过标准检测方法检测到MM。已经开发出更敏感的MRD检测方法，可以在许多患者中检测到MM。回顾性研究一致表明，实现MRD阴性反应的患者有改善的结果，尽管大多数MRD阴性患者最终会经历疾病进展。这些一致的回顾性研究将MRD状态与治疗结果联系起来，使MRD检测可用于咨询患者预后。正在进行的前瞻性试验正在评估基于MRD结果调整治疗强度的方法。 疾病拦截。明确定义的MM前体条件，MGUS和冒烟型MM，以及MM的不可治愈性，提出了在MM发展之前通过早期干预前体条件可能预防或治愈MM的可能性。随着MM治疗变得更安全、更有效，以及从这些前体条件过渡到有症状MM的生物学定义更加明确，这些疾病拦截策略变得更加有吸引力。对于是否应该对高风险冒烟型MM患者进行治疗，目前还没有共识。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

IDC2024第六届化学创新药与改良型新药研发论坛：聚焦Protac、分子胶、CNS、小分子GLP-1、改良型新药研发过程。合作展位事宜请联系：李欣欣 158 0045 2389Science 最新发表-分子胶突破的曙光旭医研究 2023/10/30目录前言1 分子胶定义及发展现状  1.1 定义  1.2 作用机制  1.3 分子胶种类      1.3.1 传统分子胶          1.3.1.1 “天然胶”          1.3.1.2 非天然分子胶       1.3.2 新型分子胶：非降解型分子胶  1.4 发展历程  1.5 上市药物2 技术分析  2.1 靶向蛋白质降解TPD （Targeted protein degradation）       2.1.1 TPD的关键优势       2.1.2 PROTAC       2.1.3 分子胶和PROTAC对比  2.2 合成路线  2.3 技术难点3 市场分析  3.1 市场规模  3.2 国外代表企业    3.2.1 C4 Therapeutics    3.2.2 Monte Rosa    3.2.3 Orionis Biosciences  3.3 国内代表企业    3.3.1 康朴生物    3.3.2 标新生物    3.3.3 珃诺生物    3.3.4 格博生物    3.3.5 达歌生物    3.3.6 宇耀生物4 未来发展趋势参考文献0前言2023 年 8 月 17 日，来自美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心 ( MSKCC ) 的研究团队在国际顶级期刊 Science 发文， Chemical remodeling of a cellular chaperone to target the active state of mutant KRAS ，受到分子胶作用机制的启发，基于天然产物开发了一种通过与亲环蛋白 CYPA 形成三元复合物选择性地靶向 KRAS G12C 的小分子抑制剂，再一次打破了 KRAS 不可成药的传说，靶向激活状态的 KRAS G12C ，具有更快、更优秀的抗肿瘤疗效。这类分子胶药物为更多没有明确靶点的“不可成药”蛋白提供了新的药物研发思路。与传统的抑制剂不同，分子胶不是通过竞争抢占蛋白空间结构来发挥作用，而是通过改变蛋白形成新的构型，然后驱动这些蛋白具备新功能来发挥其生理功能。也因此，分子胶极大扩展了小分子药物可靶向成药靶点范围。近年来，其已经成为了创新药研发领域最热门的研究方向之一。1分子胶定义及发展现状1.1 定义分子胶是一种诱导接近的小分子，可以对各种生物过程进行精确的时间控制，例如信号转导、转录、染色质调节以及蛋白质折叠、定位和降解。作为接近的化学诱导剂，分子胶可以通过形成三元复合物促进两种蛋白质的二聚化或共定位，从而产生多种生物学和药理学功能。图1 分子胶1.2 作用机制   降解型分子胶通过诱导E3泛素连接酶底物受体与靶蛋白之间发生相互作用，泛素化并降解目标蛋白。分子胶可以增强和稳定蛋白质相互作用；还能修复因突变而减弱的蛋白质相互作用；且诱导 E3 泛素连接酶与蛋白质靶标的相互作用，进而触发靶蛋白的多聚泛素化，通过蛋白酶体降解；分子胶还可以调节蛋白质功能来增加酶的活性。图2 分子胶和分子胶降解剂及其作用机制资料来源：美迪西生物医药、旭医资本1.3 分子胶种类1.3.1 传统分子胶1.3.1.1 “天然胶”细胞外蛋白诱导细胞内相关蛋白磷酸化等翻译后修饰是一种天然的共价但可逆的分子胶(图 3Ai)。此外一些甲基和乙酰转移酶使用类似的可逆(通过脱甲基酶和脱乙酰基酶)对接方法，从而实现在转录沉默和激活中增强其信号(图3Aii)。抗原肽可以充当MHC呈现蛋白和T细胞受体之间的分子胶粘合剂(图3Aiii)。1.3.1.2 非天然分子胶有许多以天然分子为基础改造得到的分子胶（FK1012和雷帕霉素）可以通过融合方式导致细胞凋亡或生长抑制；也有通过linker连接的杂天然分子胶（dTAG系统）可导致蛋白降解；也有合成的分子胶（thalidomide 和 lenalidomide）来降解蛋白等(图3B-D)。1.3.2 新型分子胶：非降解型分子胶非降解型分子胶通过聚焦非E3泛素连接酶，精妙设计的候选药物，招募体内“灵活性好、表达量充分、安全性极高”的工具蛋白（包括各类伴侣蛋白、支架蛋白等），促进工具蛋白与靶点蛋白形成稳定的复合物，从而让靶点蛋白无法通过与其预期结合的蛋白相互作用，将蛋白间的信号传递阻断，从而锁定靶点蛋白。目前，研发非降解型分子胶公司主要针对靶标为RAS蛋白、核受体等，国内外代表性公司包括美国Revolution Medicines公司、上海宇耀生物科技有限公司等。图3：常见分子胶种类及发挥功能的机制来源：医药速览、旭医资本1.4 发展历程1991年：分子胶的概念首次被提出，环孢菌素A（cyclosporin A）和FK506以分子胶的形式发挥作用；1996年：第一个设计合成的分子胶分子FK1012使用于小鼠体内研究；2000年左右：雷帕霉素（Rapamycin）以免疫抑制剂的作用而经FDA批准上市，且后又雷帕霉素类似物陆续上市；2014年后：分子胶水降解剂兴起，且目前已有分子胶水降解剂进入临床研究。图4 分子胶发展史来源：药观海、旭医资本1.5 上市药物cereblon（CRBN)E3连接酶调节剂/免疫调节药物（IMiDs）分子胶是目前唯一的获批上市的降解剂药物，目前被批准上市的分子胶药物有来那度胺（Lenalidomide），沙利度胺（Thalidomide）和泊马度胺（Pomalidomide）。2技术分析2.1 靶向蛋白质降解TPD （Targeted protein degradation）TPD通过调节宿主蛋白降解系统来发挥治疗效果，可分为泛素-蛋白酶体系统以及溶酶体系统，两类系统具有不同的应用场景。泛素化-蛋白酶体系统主要降解细胞内可溶性的蛋白，如激酶、核受体、转录因子等，其中PROTAC和分子胶从研究广泛热度、公司和管线数量、临床试验进度来看都是目前TPD发展最成熟的两个。2.1.1  TPD的关键优势TPD对高亲和力配体结合的依赖性降低，更易发现具有低纳摩尔效力的候选药物。同时靶向降解是催化过程，单个降解剂可以降解多个目标蛋白，在小剂量的情况下提供更高的效率。相对于蛋白抑制剂需要结合活性位点来抑制蛋白，TPD通过募集靶点参与多个蛋白降解过程来破坏蛋白质所有功能，从而降低耐药性产生，并且增加了对非酶蛋白这类“不可成药”蛋白进行降解的可能性。2.1.2  PROTAC已知最早关于通过嵌合降解剂接管细胞蛋白质降解系统的构想报道出现在1999年一家生物技术公司Proteinix提交的专利中。这个构想侧重于利用泛素驱动的天然蛋白质降解系统进行治疗，通过设计小分子来招募E3连接酶以降解目标蛋白。2001年，首个体外概念验证研究展示了肽基蛋白质靶向嵌合分子Protac-1可以招募E3连接酶β-TRCP成功降解了癌症相关蛋白MetAP2；从此PROTAC（蛋白质降解靶向嵌合物）这个名词开始被引入。后续研究发现来自HIF1α的一个肽可以通过与VHL E3连接酶结合形成穿膜型PROTACs的构建，这些PROTACs可以降解多种蛋白质。2.1.3 分子胶与PROTAC对比图5 分子胶和PROTAC结合对比PROTAC中有两个配体通过一个灵活的连接剂相连，这个连接剂可以弯曲和扭转，使两个蛋白质能够形成联系（图5）。与PROTAC不同，分子胶（Molecular glues）是单价小分子（分子量<500 Da），它们重塑了E3连接酶受体的表面，促进了新的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）。分子胶可以通过挤入蛋白质-蛋白质界面之间更直接地增强E3连接酶和目标蛋白之间的复合物形成 （图5）。分子胶通常被定义为与两个蛋白质表面相互作用来诱导或增强这两个蛋白质相互之间亲和力的小分子。降解型分子胶因具有分子量小、代谢性质优异、利于口服等诸多优势，已有多家国际和国内药企均在布局，已成为目前难成药靶点药物开发的热点，但其仍存在理性设计难度大、靶点相对集中，竞争激烈等问题，亟需新的颠覆性技术破局研发痛点。非降解型分子胶药物可与绝大多数偶然发现的传统降解型分子胶形成差异化。非降解型分子胶与传统降解型分子胶的差别如下：1、基于非降解型分子胶平台开发的药物不局限于传统E3泛素连接酶的限制；2、非降解型分子胶直接结合伴侣蛋白或支架蛋白等与靶标蛋白形成三元复合体，抑制效果更全面、高效，且不易耐药；3、从分子设计角度来看，非降解型分子胶可进行模块化设计，分子胶有两个模块有机组合形成，一部分用于结合靶点蛋白，另一部分用于结合伴侣蛋白。该技术大规模扩展到更多难成药靶点蛋白，也可以做到靶器官给药，对特定疾病尤其是肿瘤做到超精准治疗。表1 不同靶向药物技术开发平台 来源：医药速览、旭医资本2.2 合成路线确定分子胶化合物需要广泛的理性研究, 包括结构生物学、生物化学、生物物理学、谱学和基因变异组学等。分子胶先导化合物的发现和优化流程，包括共晶结构、计算机建模、分子对接分析、合理设计的化学文库构建、表型筛选、蛋白质组筛选、生化筛选和构效关系分析等等。2.3 技术难点首先，分子胶通过诱导或稳定E3泛素连接酶和靶蛋白之间的蛋白相互作用，实现对靶蛋白的招募和降解，但是，这种三元复合物的复杂结构导致分子胶无法用化学方法直接设计；其次，分子胶需要特定化学构成完成对靶蛋白的选择性招募，所以缺乏定向设计的化合物文库会让分子胶药物无法进行精准筛选；最后，分子胶和靶蛋白的互作需要一系列复杂的体外和体内生物验证，而且分子胶的先导化合物优化，及其药效药理研究都没有大量数据积累，给药物的临床推进带来挑战。3市场分析3.1 市场规模2001年FDA批准全球首个抗肿瘤分子靶向药物伊马替尼（格列卫®），用于治疗慢性粒细胞白血病，将慢性粒细胞患者的10年生存率提升至83.3%，从此肿瘤治疗领域发生了巨大的变化。根据Frost&Sullivan统计，2018年全球小分子靶向药物市场为414亿美元，预计2022年全球小分子靶向药物市场将达到640亿美元，2016-2022年复合增长率为12.66%，如图6所示。图6数据来源：Frost&Sullivan、旭医资本根据Frost&Sullivan统计，2018年中国小分子靶向药市场规模为114亿元，预计2022年中国小分子靶向药市场规模将达224亿元，2016-2022年复合增长率为17.53%，如图7所示。图7数据来源：Frost&Sullivan、旭医资本3.2 国外代表企业据不完全统计，在分子胶领域，国外目前最快的研究进展为临床2期，主要在研阶段的药物及研发机构统计如表2所示。表2 国外分子胶领域的代表企业及研发进度数据来源：公司官网及网络3.2.1 C4 Therapeutics公司介绍C4 Therapeutics成立于2015年，总部位于美国马萨诸塞州剑桥市，公司聚焦蛋白质降解剂研发领域，专注于利用人体对蛋白质水平的自然调节过程来开发新的治疗候选药物，用于治疗癌症、神经退行性疾病以及其他疾病。目前，其药物研发平台TORPEDO ®已展现出强大的生产力，在此平台下诞生的多款癌症相关蛋白降解剂药物已推进至临床试验阶段。它曾和多家药企达成合作协议，包括罗氏、谷歌母公司 Alphabet 旗下的生命科学部门 Calico 、以及Biogen。公司分子胶管线目前，公司在研的产品管线如图8所示。图8 C4 Therapeutics公司产品管线数据来源：C4 Therapeutics 公司官网CFT7455是一款口服生物可利用的MonoDAC降解剂，旨在以更高的亲和力与E3泛素连接酶Cereblon结合来靶向降解蛋白质IKZF1/3，用于治疗多发性骨髓瘤（MM）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）。在临床前研究中，CFT7455已经显示出对Cereblon的高结合亲和力和靶标选择性，可快速、深度降解IKZF1/3蛋白。此药也在2021年8月获得了美国FDA治疗多发性骨髓瘤的孤儿药认定。CFT8634是一款口服生物可利用的BiDAC降解剂，靶向BRD9蛋白，用于治疗滑膜肉瘤和SMARCB1缺失的实体瘤。该药已经在2021年12月获得美国FDA关于IND申请的批准，并在2022年1月启动1期临床试验。CFT1946是一款靶向BRAF V600X突变的蛋白质降解剂，主要用于治疗V600X突变的实体瘤，目前已开始对 BRAF V600X驱动的癌症（包括黑色素瘤、结直肠癌和非小细胞肺癌）进行 1 期临床试验。CFT8919是一款针对EGFR L858R蛋白的降解剂，主要用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC），C4T计划在2022年底完成针对该药的IND申请工作。融资情况3.2.2 Monte Rosa公司介绍Monte Rosa成立于2018年，总部位于瑞士巴塞尔，是一家致力于发现和开发一系列新型分子胶降解剂精密药物的生物技术公司。该公司开发了一个专有的蛋白质降解平台QuEEN，能够快速识别蛋白质靶标和分子胶降解剂。由英国癌症研究所的Raj Chopra教授和Ian Collins教授以及Versant Ventures（一家医疗风险投资公司）创立。学术联合创始人Rajesh Chopra和Ian Collins是分子胶降解剂领域的先驱。如今，Monte Rosa由一支经验丰富的药物发现和开发专家团队领导，他们在靶向蛋白质降解、分子胶、化学、结构生物学、数据科学、疾病生物学、转化医学和临床开发方面拥有数十年的经验。公司分子胶管线基于QuEEN平台，目前Monte Rosa公开的产品管线共有6条。其中，1款产品进入了临床试验Ⅰ期阶段，其余5款产品还处于临床前阶段，如图9所示。图9 Monte Rosa公司产品管线图源：Monte Rosa官网MRT-2359是Monte Rosa正在开发的一种靶向GSPT1的口服分子胶降解剂，用于治疗过度表达一种Myc家族基因（c-Myc、N-Myc和L-Myc）的癌症,例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、血红素恶性肿瘤等。融资情况3.2.3 Orionis Biosciences公司介绍Orionis是一家生物技术公司，在大规模基因组药物发现方面率先进行技术创新，以开发针对癌症及其他领域的新型、高度特异性和可调节的治疗方法。该公司利用其专有的A-Kine生物制剂和Allo-Glue小分子平台来针对重点疾病非常棘手的靶点的成药难题。Orionis还有多种正在开发的用于治疗癌症的潜在“first-in-class”免疫疗法。Orionis的总部位于美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，在根特（比利时）设有研究机构，由企业家，科学家和跨大西洋投资者网络组成的世界级团队运营，并配合战略研发合作。公司分子胶管线目前，Orionis正在迅速推进基于A-Kine平台的癌症治疗生物制剂的深层管线。该平台能够设计用于触发抗肿瘤免疫反应的靶点选择性、条件激活的细胞因子，即使在缺乏普遍的免疫参与且对检查点抑制剂治疗无效的“冷”肿瘤中也能发挥作用。A-Kines平台设计的细胞因子药物以疾病为中心，可以在与靶细胞相互作用时被激活，旨在避免传统细胞因子疗法中观察到的全身毒性。此外，Orionis正在利用其Allo-Glue平台开发多种小分子分子胶。该平台能够以前所未有的规模和复杂程度直接在活细胞中实现高通量药物配体筛选和小分子药物-蛋白质相互作用的定位，并能绘制多达约2万种基因产物（相当于人类基因组）的分子药物相互作用指纹图谱，为合理的药物设计优化策略提供了独特的见解。Allo-Glue平台开发的分子是具有独特的别构作用小分子，能够接近以前被认为无法接近的靶点。它们的作用是改变细胞内蛋白质的构象和功能，从而重编程这些蛋白与其他蛋白质的相互作用模式。Allo-Glue分子诱导的相互作用可导致靶蛋白被细胞的天然蛋白质处理机制降解、抑制或改变功能。公司各产品的研发进度如下图所示。图10 Orionis公司产品管线数据来源：Orionis 公司官网融资情况3.3 国内代表企业在分子胶领域，国内目前最快的研究进展也是临床2期，主要在研阶段的药物及研发机构统计如表3所示。表3 国内分子胶领域代表企业及研发进度数据来源：公司官网及网络3.3.1 康朴生物公司介绍成立于2011年，康朴生物医药是一家处于临床阶段的创新型生物医药企业。聚焦癌症、自身免疫疾病、炎症等治疗领域，康朴生物医药以国际领先的新一代蛋白质泛素化及其降解技术NeoMIDES®和SelPDEiS®、X-SYNERGY®等自主专利技术平台为基础，致力于开发面向全球、具有全球自主知识产权的小分子靶向免疫调节创新药物。产品管线KPG-818是康朴生物医药设计开发的具有全球自主知识产权的新一代口服小分子度胺类药物，归属CRBN E3泛素连接酶复合物调节剂。临床前研究数据表明，KPG-818可以有效下调IL-6、TNF-α等细胞因子的表达水平，高效降解锌指转录因子Ikaros（IKZF1）和Aiolos（IKZF3）。KPG-818在临床前试验中展现了良好的GLP毒理耐受性以及药代动力学成药特点，并在多种血液肿瘤动物模型上显示了卓越的治疗效果，针对不同适应症的研发进度如图12所示。图12 KPG-818针对不同适应症的研发进度图片来源：康朴生物公司官网KPG-121是新一代CRBN E3泛素连接酶复合物CRL4CRBN调节剂，靶向作用酪蛋白激酶1A1（CK1α）和转录因子Aiolos及Ikaros的泛素化和降解。KPG-121具有抑制细胞增殖活性和抗血管生成活性，增强免疫调节功能。与雄激素受体拮抗剂单独治疗相比，在异种移植模型中，KPG-121与雄激素受体拮抗剂（包括恩杂鲁胺、醋酸阿比特龙、阿帕鲁胺或Darolutamide）联用时，能显著提高抗肿瘤效果, 针对不同适应症的研发进度如图13所示。图13 KPG-121针对不同适应症的研发进度图片来源：康朴生物公司官网融资情况3.3.2 标新生物公司介绍标新生物是一家专注肿瘤免疫的蛋白降解小分子药物开发的初创公司，成立于2020年2月，公司孵化自上海科技大学免疫化学研究所，由姜标院士、杨小宝教授等几位在蛋白降解领域深耕多年的科学家领衔创立，与AI药物设计专家、DEL发现平台专家开展深度合作，自主建立药物筛选平台、蛋白质组学平台以及肿瘤动物模型平台，实现了完备的全流程药物开发体系建设。标新生物引进了上海科技大学蛋白降解药物（PROTAD）平台专利包，自主知识产权的双平台（分子胶和PROTAC）使得标新生物拥有差异化的技术路线和发展战略。产品管线GT919：标新生物的核心项目靶向IKZF1/3的针对复发/难治多发性骨髓瘤的分子胶GT919已经进入临床研究。GT929同样靶向IKZF1/3靶点，在弥漫大B细胞淋巴瘤动物模型中显示了极佳的效果。融资情况3.3.3 珃诺生物公司介绍珃诺生物成立于2018年，是一家专注于小分子创新药研发的生物医药企业。公司由在新药研发领域有丰富经验的中美两国资深人士在浙江省杭州市创立，在美国波士顿和中国上海设有办公室。珃诺生物通过自主研发的CHAMP平台，开发肿瘤和其他重大疾病所需的全球创新药物，改善患者长期生存质量，满足未被满足的临床需求。公司专注于开发分子伴侣介导的蛋白质降解技术平台，目前已有多个全球创新的新一类小分子抗肿瘤化合物即将进入临床或处于临床前开发阶段。产品管线RNK05047 是一款选择性靶向BRD4的first in class蛋白质降解剂，是通过珃诺生物的分子伴侣介导的靶向蛋白质降解平台CHAMPTM开发的。融资情况3.3.4 格博生物公司介绍格博生物成立于2021年3月，是一家专注于分子胶 （molecular glue）靶向蛋白降解的新药研发公司，公司针对既往认为“不可成药”的致病蛋白靶点，开发新一代分子胶药物。目前，公司已建立了多维度蛋白降解筛选平台、创新靶点验证平台、分子胶理性设计平台、以及专有高活性分子库。在上海张江科学城和美国加州圣地亚哥市建立了两大研发中心。产品管线GLB-001是格博生物的第一代分子胶产品，于2023年4月获得FDA临床默示许可，目前已在美国进入临床Ⅰ期试验。GLB-002是格博生物自主开发的第二款获批临床试验的分子胶产品，于2023年10月获批临床试验，也是继Iberdomide、Golcadomide和Mezigdomide后的新一代高选择性IKZF1/3分子胶降解剂。临床前数据显示GLB-002具有降解活性强、选择性高、蛋白降解更彻底和克服免疫调节药物获得性耐药的特点。GLB-002是具有全新化学母核结构的CRBN E3连接酶调节剂（CELMoDs）, 通过与CRL4CRBN E3连接酶CRBN相结合，促使转录因子IKZF1（Ikaros）和IKZF3（Aiolos）的泛素化，继而被蛋白酶体降解，激活多种抗肿瘤的下游反应，最终对NHL和MM等血液肿瘤发挥治疗作用。图14 格博生物产品管线图片来源：格博生物公司官网融资情况3.3.5 达歌生物公司介绍达歌生物 （Degron Therapeutics） 于2021年成立，是一家具有独特的分子胶靶向蛋白降解技术平台的新药研发公司。公司由靶向蛋白降解领域的专家，专攻分子胶机制研究的上海科技大学 仓勇 教授和有20多年国际大小药企研发，BD，投资，战略及市场运营多方面经验的 邹丽晖 （Lily Zou） 博士共同创建，目前已组建具有国际化视野和丰富行业经验的研发和管理团队。产品管线WEE1是一款潜在的Best-in-Class新药，全球已有相关抑制剂进入临床，达歌生物则以分子胶降解剂的机制进行设计，由于作用点完全不同，避免了WEE1激酶抑制剂常见的选择性的挑战，不会作用于别的激酶靶点。同时，达歌的降解剂靶向WEE1和IKZF1/3两个不同靶点，不仅可阻止WEE1对细胞周期进展的调控和在癌细胞分裂发生之前对其进行 DNA 修复，还能够增强 T 细胞杀死癌症细胞的活性。Protein A则是达歌生物给予很高期望的First-in-Class项目，该药物通过蛋白组学筛选方法获得，该蛋白在众多癌症和免疫性疾病中扮演着重要角色。图15 达歌生物产品管线图片来源：达歌生物公司官网融资情况3.3.6 宇耀生物公司介绍宇耀生物是一家AI赋能、创新引领，聚焦新技术和新靶点的临床阶段小分子靶向药物研发公司，于2020年在上海成立。公司核心高管拥有深厚的学术积累及工业界开发经验，通过AI辅助靶向G蛋白偶联受体(GPCR)与难成药靶点等的创新药物开发为特色，专注于肿瘤、自身免疫疾病、神经退行性疾病等未满足的重大临床需求，聚焦创新药物的早期发现、临床研究和后续商业化。团队通过数十年基础研究沉淀，目前正进入里程碑集中收获的阶段，多条药物研发管线已在临床前及临床研究中确认了良好的成药性与出色的疗效。产品管线YY001是宇耀生物基于GPCR药物开发平台和AI药物辅助开发平台自主研发的新一代EP4受体小分子拮抗剂，该靶点全球尚无同类药物上市，也是国内首个自主原研高选择性EP4受体拮抗剂。YY201是基于公司Undruggable药物开发平台和AI药物辅助开发平台开发的新型STAT3小分子抑制剂，特异性抑制STAT3双功能位点磷酸化。YY301/YY401/YY501是宇耀生物的超级分子胶产品，计划2024年完成IND申报。宇耀生物独创的超级分子胶技术，聚焦“不可成药”靶点难题，与传统小分子药物相比通过“非占位”方式作用于难成药靶点且不易耐药；同时该技术也克服蛋白质靶向降解技术面临的分子量大、不易口服以及难以理性设计等问题。该技术的出现填补了国内空白，未来具有广阔的市场发展前景。融资情况4未来发展趋势分子胶的进一步发展必须由偶然发现走向系统开发。 与PROTAC相比，分子胶体积通常更小，具有比 PROTAC 更好的药理学性质、更高的膜通透性、更好的细胞摄取和更好的血脑屏障穿透能力。但分子胶的发现存在偶然性，设计原理尚不明晰，新型分子胶的发现方法很大程度上还依赖于大量高通量筛选以及系统验证工作。要从偶然发现发展为合理设计，我们还需要能够模拟和预测分子胶结合的计算工具以及结晶方面的进步，从而增进对蛋白质对接的理解。 计算建模与虚拟筛选，可以帮助分子胶的系统性开发。计算机辅助药物设计加快了小分子药物的开发进度，同样可以用于TPD领域的药物研发。目前，绝大多数与TPD相关的计算建模工作致力于理性设计PROTAC诱导的三元复合物。这些模型会突出蛋白-蛋白界面的空腔，虚拟筛选技术可以找到与这些空腔匹配的分子，并增强靶标与E3连接酶的亲和力。而基于结构导向的药物发现、计算机建模与虚拟筛选将极大促进分子胶设计。截至目前，全球已上市、颇具销售规模的分子胶药并不多，似乎还停留在三大“度胺”那里。国内外企业虽在积极布局，但多数还处于临床阶段。在分子胶药物开发上至今还有很多难题待解，例如缺乏合理的设计策略、难用化学方法直接设计分子胶药物、内在分子机制有待进一步明晰、难打破度胺类药物的局限性、还需要复杂的生物学验证等等。分子胶降解剂将从小分子角度，真正解决许多传统“不可成药“靶点面临的挑战。可以预见，未来2-3年将是分子胶赛道的第一个爆发期，将有更多针对新靶点的first-in-class 分子胶药物进入临床阶段；分子胶的适应症也将极大拓展，从早期的血液瘤，到实体瘤和免疫，再到慢性疾病和中枢神经系统疾病。参考文献1. Rational discovery of molecular glue degraders via scalable chemical profiling. Nat. Chem. Biol. 2020, 16,1199−1207.2. Molecular Glues: The Adhesive Connecting Targeted Protein Degradation to the Clinic.3. The Rise of Molecular Glues. Cell .Pub Date : 2021-01-07 , Stuart L. Schreiber. 4. Molecular Glues for Targeted Protein Degradation: From Serendipity to Rational Discovery.5. 创新小分子靶向药物独立市场研究报告，弗若斯特沙利文，20226. C4 Therapeutics 公司官网ENDIDC2024第六届化学创新药与改良型新药研发论坛：聚焦Protac、分子胶、CNS、小分子GLP-1、改良型新药研发。合作展位事宜请联系：李欣欣 158 0045 2389戳这里，阅读原文立即领取免费参会入场券