RAD51

前言在过去的几十年中，对DNA损伤反应（DDR）途径的理解不断加深，拓宽了肿瘤学的治疗领域。越来越清楚的是，DNA损伤反应缺陷导致的细胞基因组不稳定性导致了癌症的发生。另一方面，这些缺陷也可以作为一个治疗机会。越来越多的DDR靶向药物已迅速扩展到参与DDR途径的多个成员的抑制剂，包括PARP、ATM、ATR、CHK1、WEE1和DNA-PK。目前，这些DDR成分的抑制剂，其中一些正处于临床研究中。此外，新的证据表明DDR抑制剂对传统癌症治疗的敏感性，以及DDR途径和免疫检查点抑制剂（ICI）反应之间的相关性，这些都促进基于DDR抑制剂的联合治疗。靶向DNA修复途径的药物正在肿瘤治疗领域显示出越来越大的作用。DNA损伤与DNA损伤反应为了保持基因组的完整性，复杂的DNA修复系统被用来对抗各种形式的DNA损伤，这些机制被称为DNA损伤反应。DDR通路分为三个功能上相互交织的部分：检测DNA损伤的传感器、触发信号级联的信号转换器和阻碍DNA修复的效应器。这些途径不是相互排斥的过程，而是相互协调，形成DNA修复的精确调控网络。             碱基切除修复（BER）和核苷酸切除修复（NER）所有生物体的基因组都在不断地经历微妙的变化，这是由于内源性产生的各种基因毒物，如活性氧（ROS）、电离辐射以及烷基化剂等环境损伤所致。DNA中的大多数细微变化，如单链断裂（SSB），都是通过BER途径修复的。BER首先由受损的碱基启动，然后切除碱基并用新合成的DNA替换。然后，脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（APE）切割AP位点，在损伤位点形成3′OH末端。最后，DNA聚合酶和DNA连接酶在去除损伤碱基产生的核苷酸缺口处被招募，从而封闭缺口。BER负责修复小损伤，而使DNA螺旋结构变形的较大的双链断裂（DSB）则需要NER途径修复。NER机制涉及一种关键蛋白质，即切除修复交叉互补蛋白1（ERCC1），它会清除断裂点附近的DNA，然后用正常的DNA复制进行替换。同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）在哺乳动物细胞中，HR和NHEJ是修复DSB的两条主要途径。由于同源姐妹染色单体是新DNA合成所需的模板，HR途径可以在S/G2细胞周期阶段修复DSB，而NHEJ在除M期外的所有细胞周期阶段都是活跃的。HR分析来自基因组其他部分的同源序列，收集断裂位点丢失的信息。HR首先切除断裂端，随后通过Brca2和Rad51形成Rad51核蛋白丝，开始检索同源序列，并促进断裂DNA和同源模板之间形成连接分子，完成修复。NHEJ比HR更简单一些，直接将断裂端重新连接在一起。NHEJ所需的基本因子是由Ku70/Ku80和DNA依赖性蛋白激酶的催化亚单位（DNA-PKcs）组成的异二聚体，其识别DSB并促进NHEJ的下游信号因子，如XRCC4、XLF和DNA连接酶IV。虽然NHEJ机制较为简单，但有时会导致重排，而HR被认为不会产生错误。除HR和NHEJ外，一种DSB修复途径与这两个主要DSB修复途径具有相似的机制，但在遗传上不同，称为替代末端连接（a-EJ）途径。a-EJ途径既可以与HR共享类似的起始过程，也可以与NHEJ一样组成无同源模板的DNA末端连接因子。目前，越来越多的研究开始关注a-EJ通路作为NHEJ或HR活性受损癌细胞的潜在治疗靶点。错配修复（MMR）除了暴露于基因毒素的细胞所产生的损伤外，DNA损伤也可能来自异常的DNA处理。针对复制相关错误的DNA修复途径称为MMR。在DNA合成过程中，MMR纠正核苷酸错误整合，从而防止分裂细胞中永久性的DNA改变。因此，基因突变或表观遗传沉默导致的MMR缺陷可能导致自发突变的发生率增加，这通常与遗传性和散发性癌症有关。跨损伤合成与模板置换DNA损伤耐受性（DDT）作为修复复制停滞DNA损伤的一种基本旁路机制，允许DNA复制穿过阻碍元件。跨损伤合成（TLS）是两种不同的DDT模式之一，取决于一种特殊的TLS聚合酶的功能，而不是复制性DNA聚合酶，其可以直接跨过损伤部位复制。由于TLS聚合酶的校对活性不足，TLS机制是容易出错的，这增加了突变的风险。毫不奇怪，TLS是细胞突变的主要来源。相反，DDT的另一种模式，即模板置换（TS），涉及在姐妹染色单体上重组到同源DNA模板，这类似于HR过程，被认为比TLS更准确。TLS和TS的修复活动开始于复制叉之后，这表明它们可能发生在DNA复制期间或之后，TS开始于S期早期，TLS开始于S期晚期。范可尼贫血（FA）途径范可尼贫血是一种罕见的遗传病，由范可尼基因的双等位基因突变引起，受影响的患者伴有对DNA损伤的反应不足。范科尼贫血已被确定为一种DNA修复途径，可清除阻碍DNA复制和转录的屏障，即DNA链间交联（ICL）。ICL可由醛类在多种代谢反应（如脂质过氧化和乙醇代谢）和化疗（如铂）期间形成。而链内交联通过NER途径修复，而ICL主要通过FA途径修复。通过UHRF1蛋白和FANCM–MHF1–MHF2复合物检测ICL后，FA核心复合物被招募到染色质中，并单泛素化底物FANCI和FANCD2。泛素化FANCD2-I为各种DNA内切酶招募支架蛋白，从而完成对交联处DNA的识别和核苷酸的切除，从而得到适合重组修复的DNA底物。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶途径众所周知，DNA甲基化剂能够抑制DNA甲基化并产生广泛的DNA加合物，如O6-甲基鸟嘌呤（O6MeG）和O4-甲基胸腺嘧啶，这可能导致碱基错配和随后的点突变。其中，O6MeG被认为是甲基化剂诱导的DNA加合物的主要来源，可导致突变和致癌。O6MeG可以通过O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（也称为MGMT）在单步自杀反应中修复。MGMT将受损鸟嘌呤O6位点的甲基转移到半胱氨酸残基，从而防止基因突变。可以想象，MGMT降低了烷化剂在癌细胞中的作用，可能导致化疗耐药。MGMT启动子的甲基化会阻碍其转录，因此可以用来提高细胞对烷化剂的敏感性。DDR治疗应用的机制与正常细胞相比，肿瘤细胞对DNA损伤敏感性增加的潜在机制在于三个主要方面：至少一条DDR途径的缺陷、复制应激的升高和内源性DNA损伤的增加。DDR缺陷尽管DDR缺陷与癌症的发生和发展有关，但DDR途径中的缺陷也为靶向肿瘤细胞提供了治疗机会。携带DDR缺陷的肿瘤细胞导致基因组不稳定性增强，并依赖剩余的DDR途径生存。作为一种治疗方法，剩余DNA修复途径的组合靶向产生了一种被称为“合成致死”的概念。合成致死的概念基于两个同时发生的功能丧失遗传事件，其中任何一个单独都不会导致损伤，而是共同作用导致细胞死亡。当癌细胞特有的DDR途径发生一种基因改变时，由DDR抑制剂引起的第二种功能丧失事件将在不影响正常细胞的情况下对癌细胞合成致死。复制应激真核细胞复杂的DNA复制系统在细胞分裂过程中受到细胞周期中各种蛋白质的严格调控。许多DNA核苷酸需要精确聚合以确保细胞内稳态。阻碍或终止复制叉进展的内源性或外源性障碍激活保守的细胞反应途径，称为复制应激。复制应激的分子机制是DNA聚合酶的进展停滞和随后DNA聚合与DNA解旋酶的解偶联。诱导复制应激的一个例子是G1/S细胞周期检查点缺陷，其原因可能是pRb功能丧失、CDKN2A缺失或细胞周期蛋白D1或细胞周期蛋白E扩增。 内源性DNA损伤一些内源性性DNA损伤是中性pH条件下低浓度氢离子和氢氧根离子的作用造成的，如脱嘌呤和脱嘧啶作用。细胞内环境对于染色体DNA来说，还具有其他危险，其中最严重的来自氧化过程，在线粒体产生的一些中间产物，如ROS，可能会从线粒体渗出，进入细胞质。这样的中间产物包括超氧离子、过氧化氢和羟自由基。在肿瘤代谢中，低PH值、缺氧和高水平的ROS在肿瘤微环境（TME）中普遍存在。靶向DNA修复途径的抑制剂目前利用DDR缺陷的抗癌策略在很大程度上是通过开发抑制DNA修复过程中分子的靶向药物来解决的。聚ADP-核糖聚合酶（PARP）抑制剂PARP抑制剂的发展是合成致死的典型代表。PARP1和PARP2是关键的DDR酶，通过带负电荷的聚ADP-核糖（PAR）链修饰靶蛋白，感知DNA损伤并传递信号。PARP1与受损DNA结合后的结构变化激活其催化功能，促进DNA修复效应分子的招募和DNA损伤部位周围染色质的结构重塑，而染色质的动态重塑将在很大程度上影响DNA修复的效率。                        鉴于PARP在促进DNA有效修复中的关键作用，PARP抑制剂可以选择性地杀死同源重组缺陷的肿瘤细胞。PARP抑制剂是BRCA突变肿瘤的一种很有前途的治疗策略。聚ADP-核糖水解酶（PARG）抑制剂PARG通过在DNA损伤后水解PAR核糖键来逆转PARP酶的作用。同样，PARG在DNA复制和修复中的积极作用导致PARG缺陷细胞对DNA损伤剂的敏感性增加。尽管大量研究表明PARP抑制剂与合成致死率之间存在相关性，但对PARG抑制剂治疗机制的研究却相对滞后。据报道，乳腺癌细胞中HR蛋白（如BRCA1/2）的缺失可刺激PARG抑制细胞的合成致死性，PARG抑制剂COH34可诱导BRCA突变或对奥拉帕利耐药的卵巢癌和乳腺癌细胞死亡。然而，在其他癌细胞中报告了相互矛盾的结果。在六个测试的乳腺癌细胞系中，只有一个BRCA缺陷的细胞系对PARG抑制剂PDD00017273敏感，而五个细胞系对PDD00017273（包括BRCA突变的细胞系）无效。共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ATM）抑制剂DDR信号级联由一系列蛋白磷酸化驱动，ATM、ATR和DNA-PKs是参与该过程的关键激酶。被DNA双链断裂激活，ATM被MRE11-RAD50-NBS1（MRN）复合物招募到DSB位点。ATM底物包括p53、CHK1和CHK2，它们的磷酸化将导致S内或G2/M细胞周期阻滞。尽管ATM在DNA修复等多种分子过程中起着典型作用，但它也具有非典型功能，包括剪接体置换。ATM被认为是肿瘤抑制因子，ATM缺陷或突变在实体瘤和B细胞淋巴瘤中比较常见。ATM突变可能导致共济失调毛细血管扩张症，这是一种神经退行性疾病，其容易导致癌症。目前有几种ATM抑制剂正在研究用于癌症治疗。共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关蛋白（ATR）抑制剂与由DSB触发的ATM不同，ATR被复制蛋白A（RPA）包裹的单链DNA激活并被招募。单链DNA可以通过DSB的核溶解处理以及复制DNA解旋酶与DNA聚合酶的解偶联产生。细胞内ATR信号涉及一系列下游分子的磷酸化，触发广泛的反应，包括阻断细胞周期检查点、DDR和细胞凋亡。与其他DDR蛋白如PARP相比，ATR抑制剂的开发相对滞后。原因可能包括ATR分子的大尺寸和对其晶体结构缺乏了解。此外，其在所有PIKK中的高度同源活性位点以及对共激活蛋白的需求进一步限制了其药物设计。CHK1抑制剂检查点激酶CHK1通过磷酸化和招募一系列调节蛋白，积极参与ATR和ATM启动的DNA损伤反应。CHK1通过磷酸化CDC25A来调节S期内检查点，导致CDC25A降解，随后S期细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）活性降低，CHK1对CDC25C和WEE1的磷酸化调节有丝分裂和G2/M检查点。此外，CHK1还磷酸化Thr-309上的RAD51，促进其在HR期间与BRCA2的相互作用。CHK1水平升高与更差的预后、疾病复发和治疗抵抗相关，这进一步支持CHK1抑制的治疗潜力。WEE1抑制剂作为对DNA损伤的反应，激活的ATR使Chk1磷酸化，Chk1又使WEE1和CDC25磷酸化。与活性被磷酸化抑制的CDC25相比，WEE1被激活，然后磷酸化下游CDK1上的Tyr15和Thr14以抑制其活性，导致G2/M周期阻滞，为DNA损伤修复留出时间。此外，通过磷酸化CDK1上的Tyr15，WEE1还可以在DNA复制完成之前阻止S期向G2期的进展。虽然WEE1抑制剂的原理是明确的，但其临床应用受到其治疗窗口的限制。目前，大多数临床研究集中于WEE1抑制与化疗药物的联合应用。DNA-PK抑制剂DNA依赖性蛋白激酶是一个由DNA激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，大量表达在几乎所有哺乳动物的细胞中。DNA-PK是DNA修复的关键蛋白激酶， 参与了NHEJ的过程 。在各种肿瘤类型（包括胃肠道癌、肺癌和肝细胞癌）中都观察到DNA-PK表达上调，并且与较高的肿瘤分级和不良预后相关。DNA-PK抑制剂的开发主要集中在DNA-PKcs的催化活性上，而新的抗DNA-PKcs方法，如DNA-PKcs抑制性microRNA或靶向Ku异二聚体的抑制剂，则基于ATP结合位点的同源模型。目前，大多数DNA-PK抑制剂的临床研究集中在与癌症化疗或放疗联合使用的效果。小结细胞对DNA损伤的反应是一个复杂的过程，涉及各种信号网络和蛋白质，它们在特定的癌症类型中被差异激活或失活。肿瘤中增加的复制应激和DNA修复缺陷为我们治疗癌症提供了机会，使得癌细胞比正常细胞更容易受到DDR抑制。目前，以PARP抑制剂为典型的靶向DDR途径的药物已经走向临床应用，并且在肿瘤治疗中展现出令人鼓舞的前景。进一步，确定这些DDR抑制剂的最佳剂量、组合和时间表，减少不良反应，更理想地提高疗效将是未来的方向。此外，对每一种肿瘤进行表征，以确定其失控的DDR成分的具体特征，将有助于癌症患者的个性化治疗。参考文献：1.  Targeting DNA repair pathway in cancer:Mechanisms and clinical application. MedComm (2020). 2021 Dec; 2(4):654–691.声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

徐寒梅中国药科大学二级教授（博导），海洋药学专业负责人，江苏省合成多肽药物发现与评价工程研究中心主任，国家药典委员会委员，国家级高层次人才项目入选者。主编出版 3 部论著（《新药非临床研究与开发》《抗肿瘤药物药理学实验指南》《酶类药物学》），发表学术论文 213 篇（SCI 收录 81 篇）， 申请国内专利 32 项（获授权 24 项），培养研究生 160 名（博士 29 名）。主办“第十四届中国国际多肽学术会议暨第五届亚太国际多肽学术会议”，多次受邀参加国内外学术会议报告。研究领域涉及多肽药物研发、全新微肽发现及机制研究、长链非编码 RNA 与疾病关系的分子机制。主持课题包括国家自然科学基金、国家 “863”计划、国家重大专项和重大横向课题等项目 30 余项。先后获中国药科大学“十三五”科技突出贡献奖，联合国教科文组织和平中心“2020 跨文化科技大使”，教育部技术发明奖一等奖，中国产学研合作创新成果 奖二等奖，江苏医药科技进步奖一等奖、二等奖各 1 次，中国发明创业成果奖一等奖，江苏省科学技术奖一等奖，江苏省高校“青蓝工程”中青年学术带头人，内蒙古组织部 “草原英才”等奖励和荣誉。优化规律间隔成簇短回文重复序列相关核酸酶 9 敲入效率的研究进展 PPS 洪秀，李臣诚，徐寒梅 *（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 210009）[ 摘要 ] 基因编辑技术可以通过在基因组 DNA 中精确插入、缺失或替换而人为地修饰靶位点的遗传物质。近年来，随着规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9, CRISPR/Cas9）系统的发展，研究人员对各种细胞基因组进行编辑的能力大大提高，但由于同源定向修复（homologous directed repair, HDR）效率低下，许多通过抑制非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）或增强 HDR 的方法，如化学调节、同步表达和同源臂优化等被开发出来用以提高基于 CRISPR/Cas9 系统的精确基因敲入效率，重点介绍这些方法如何优化 Cas9 敲入效率的最新进展。 基因编辑是针对靶基因进行插入、敲除和定点突变以完成精确修饰的基因工程技术 [1]，目前包括锌指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）技术、转录激活因子样效应核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术和规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，CRISPR/Cas9）技术[2]。天然的CRISPR/Cas9 系统由Cas9，CRISPR 衍生 RNA（CRISPR-derived RNA，crRNA）和反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）3 部分组成，crRNA 和 tracrRNA 通过局部碱基配对形成引导RNA（guide RNA，gRNA），与 Cas9 蛋白结合并引导其识别和切割目标 DNA 序列 [3]。CRISPR 介导的基因编辑使研究人员能够使用 Cas9 和适当的 gRNA 在基因组特定位置有效地引入双链断裂，并且通过非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源定向修复（homologous directed repair，HDR）2 种修复途径，实现突变或外源基因插入 [4]。NHEJ 修复方式通过在双链断裂处引入小的插入或缺失，造成基因移码突变；当外源模板存在时，可通过 HDR 实现基因的精准修复或片段插入 [5]。尽管 CRISPR/Cas9 可通过 HDR 介导基因敲入，但 HDR 仅在 G2 和 S 期细胞中活性较高，因此，对于神经元细胞等分裂缓慢或处于有丝分裂后期的细胞并不适用；此外，NHEJ途径是细胞中 DNA 修复的主要方式 [6]。因此，上述2 种因素导致 HDR 介导的基因修复效率较低，仅为0.1%~6.5%[7]。CRISPR 系统递送是实际应用的关键，目前它能通过 3 种形式被递送到细胞中，包括 DNA（质粒DNA）、信使 RNA（messenger RNA，mRNA）以及核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP），不同的递送形式在病毒载体或非病毒载体的协助下进入细胞，从而完成靶标基因的编辑。第 1 种 DNA 递送需将 Cas9 蛋白、单向导 RNA（single guide RNA，sgRNA）的 DNA 序列构建于质粒载体中，再对质粒进行病毒包装（如慢病毒、腺相关病毒等），最终 Cas9 蛋白和 sgRNA 序列在病毒介导下进入细胞从而起始基因编辑。它操作简单且成本低，适用于基因功能的研究，但存在如下缺点：1）质粒载体过大，从而导致病毒包装效率和递送效率降低；2）DNA 序列需经转录、翻译形成 Cas9 蛋白、sgRNA 再起始编辑功能，降低了编辑效率；3）转染后的 Cas9 基因序列不易去除，导致 Cas9 蛋白长期存在细胞中，易引发更大的毒性和副作用 [8]。第2 种 mRNA 递送是将 Cas9 的 mRNA、sgRNA 序列在非病毒载体的介导下递送至靶细胞，起始基因编辑。这种递送形式的优点是由于 mRNA 无需转录，经翻译后即可启动基因编辑，使得编辑效率高于DNA 递送形式，且因 mRNA 不会长久维持在细胞中，从而降低了 CRISPR 系统的脱靶率。不过，由于 mRNA 的稳定性较差，对递送载体有较高要求。第 3 种 RNP 递送是将 Cas9 蛋 白、sgRNA 组装成RNP，然后通过非病毒载体直接递送于细胞中起始基因编辑，为目前最高效的 CRISPR/Cas9 基因编辑策略。该递送形式优势明显，递送至细胞后无需转录、翻译过程，直接起始基因编辑，从而能显著提高编辑效率，且 RNP 一般在细胞内 48 h 即可降解，不会在细胞中长期存在，从而降低了对细胞的毒性和不良影响，极大降低脱靶率，此外 RNP 递送不受细胞类型限制，使编辑更加精准、高效。但是 RNP转染的缺点是编辑时间较短，需在一段时间内提供足够的编辑工具，以便进行足够的编辑；并且，由于需要大量合成 Cas9 蛋白和 sgRNA，导致 RNP 转染的成本相对较高；在实验中选择RNP 转染还需要考虑 sgRNA 和 Cas9 蛋白的适配性。总之，CRISPR技术的快速发展提高了研究人员对细胞进行精确基因编辑的能力，但 CRISPR/Cas9 技术目前仍面临递送效率低、HDR 效率低、脱靶性，以及毒性和副作用等多种问题 [9]。鉴于 Cas9 诱导断裂的 HDR 效率相对较低，本文主要通过对供体模板及递送方式的优化，外源加入调控 NHEJ 或 HDR 相关信号通路、染色质开放或关闭状态、细胞周期的小分子化合物，构建敲除或过表达细胞系或利用小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）调控细胞信号通路关键蛋白的表达，以及对 Cas9 系统的优化等方法来优化Cas9 敲入效率，从而提高编辑的特异性和减少脱靶效应，提升基因编辑的传递效率和导入能力，并实现更大片段的精准编辑，加速了基因编辑技术向临床转化，对于解决基因编辑面临的主要难点具有重要意义。1供体模板的优化策略常见供体模板有质粒、双链 DNA（double strand DNA，dsDNA）和单链 DNA（single-stranded DNA，ssDNA）3 种。质粒作为基因敲入模板，不仅制备周期长，且高浓度导入会造成较强的细胞毒性 [10]。因此，研究者常使用 dsDNA 或 ssDNA 作为供体模板。对于小片段的插入，通常选用 ssDNA 供体；对于荧光蛋白或基因表达盒等大片段插入，则一般选择dsDNA 和质粒供体。值得注意的是，左右同源臂一般以待敲入的目的细胞基因组为模板扩增，以避免不同细胞基因组差异导致左右同源臂不同源而降低 HDR 效率。由于通过同源重组修复途径敲入大于 2 000 bp 的长基因片段很难成功实现，因此，供体模板的设计是基因敲入实验所面临的主要挑战之一。下面将对模板选取及设计过程中可能遇到的问题进行归类分析，如根据敲入目标片段的长度和靶标的类型选择合适的模板的类型及设计最佳的同源臂大小来提高敲入效率（见表 1）。1.1供体模板的设计在基因编辑实验中，当插入目标片段长度小于 2 000 bp 时，ssDNA 在包含较短同源臂的情况下可以产生比 dsDNA 更高的 HDR 效率；无论使用 ssDNA 或 dsDNA 供体，使用非前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）链供体的HDR效率略高于PAM链供体，Liang等[11]研究表明，最优ssDNA的总长度约为200个碱基，30个碱基的3'端短同源臂和 40 个碱基的 5' 端长同源臂组成的不对称同源臂供体 DNA 在诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）中可实现 45% 的敲入效率。此外，当 sgRNA 的切割位点位于敲入位点上游 5 bp 或下游 3 bp 时，基因的敲入效率最佳。值得注意的是，为了避免二次切割，可将对应 sgRNA 的PAM 或邻近 PAM 的序列进行同义突变。当目标片段长度大于 2 000 bp 时，选择同源臂长度为 600 ~ 2 000 bp 的质粒或 dsDNA 更加合适。然而哺乳动物细胞中对于长片段 DNA 的精准插入效率非常低，Gao 等 [12] 开发了简单的基因组编辑方法，称为转录偶联 Cas9 介导的编辑（transcription-coupled Cas9-mediated editing，TEd）， 当 插 入 大DNA 片段时它可以实现比传统 Cas9 介导的编辑更高的效率。首先研究者发现处于转录耦合状态的供体 DNA 能够显著提高绿色荧光蛋白（gene fluorescent protein，GFP）的精准插入效率，随后基于上述发现设计开发了一系列优化的 TEd 基因编辑系统，通过在同源供体 DNA 上引入启动子以形成 TC-donor（transcription-coupled HR-donor）， 并在其转录产物 TC-RNA 的 3' 端添加多个 MS2 茎环结构（MS2 binding loops）以及在 Cas9 上融合 MS2适配体的结合结构域，该团队发现优化后的 TEd 系统对于 GFP 的精准插入效率可以达到传统方法的 10倍左右，并在高达 10 000 bp 的 DNA 片段敲入方面也获得了很好的效果。总之，在 Cas9 实验中，当插入片段长度小于2 000 bp 时，ssDNA 供体可提供更短的同源臂，获得比 dsDNA 形式的模板更高的插入效率；当目标片段长度大于 2 000 bp 时，应选择同源臂长度为 600 ~2 000 bp 的质粒或 dsDNA。与相同长度的 ssDNA 供体相比，长 dsDNA 供体更有可能产生细胞毒性：供体越长，细胞毒性就越明显，且增加较长 dsDNA 供体的浓度也会导致毒性的产生。dsDNA 供体的另一问题是它们更倾向于插入整个供体序列，包括同源组。此外，在设计 HDR 供体 DNA 的时候，还应该注意以下 2 点：1）如果在 HDR 实验中使用 Cas9 核酸酶，最好使用与目标 DNA 的 2 条链匹配的同源序列检测 ssDNA 供体；2）当使用 Cas9 系统时，要避免在 HDR 修复后重新产生 PAM 位点。设计 ssDNA供体序列，应在 PAM 位点引入同义突变，这样 RNP就不能识别修复后的序列。否则，Cas 核酸酶可能会重新切割修复后的 DNA，除了所需的 HDR 突变外，还会形成 NHEJ 介导的插入缺失。因此，设计 HDR供体模板时，要注意区分短型插入和长型插入。对于较短或中等长度插入，建议使用 ssDNA 作为 HDR 供体模板。根据敲入目标片段的大小选择合适的供体类型及最佳长度的左右同源臂，并对 PAM 位点引入同义突变，同时，也要考虑敲入不同靶标的难易程度，从而不断提高 HDR 介导的敲入效率。1.2 供体模板的修饰对供体模板进行化学修饰或组蛋白修饰将提高其稳定性及基因编辑效率。考虑到 dsDNA 在细胞内极易被降解、敲入效率低，Akhmetzyanova 等 [13] 研究发现，双链模板的末端修饰能提高供体的稳定性，他们采用体外合成 Cas9-RNP 和 5' 端修饰的短同源臂dsDNA 供体进行结合，选择了 13 种化学基团对双链模板进行修饰，并选用 HCT116 细胞进行筛选和效率测试，结果发现所有修饰均能在不同程度上提高编辑效率，其中利用化学基团 C6-聚乙二醇 5' 端修饰的dsDNA 模板能够将敲入效率提高为未修饰模板的 5~6 倍，并且在 293T 细胞中将长度为 700 bp DNA 片段的敲入效率提高到 65%。此外，在短的 ssDNA 模板的5'端或3'端添加硫代磷酸二酯键能提高其稳定性，减少核酸外切酶的影响，从而提高在 iPSC 和 Jurkat细胞等核酸酶水平高的细胞中的编辑效率。另外，在基于 HDR 的基因编辑中，通常以纯化或“裸露”的 DNA 为供体模板。但细胞中的DNA 是被组蛋白包裹成染色质的天然形式存在的，而组蛋白 H3K36 三甲基化（H3K36me3）是人类细胞HDR 至关重要的修饰，Cruz-Becerra 等 [14] 发现，与裸 DNA 供体模板相比，组蛋白修饰的染色质供体模板能够更有效地发生同源链配对，其基因编辑效率是裸 DNA 供体模板的 2.3~7.4 倍。综上，利用 5' 端化学修饰的 dsDNA 作为模板，结合高稳定和低脱靶性的 Cas9-RNP 递送，能够实现比未修饰情况下高出 5 倍的敲入效率，并且在人类胚胎肾脏细胞中对长度为 700 bp 的 DNA 片段实现了效率达 65% 的敲入。通过用更稳定的硫代磷酸二酯键替代磷酸键，对 ssDNA 供体进行末端修饰，可以增强其稳定性。该策略不仅大幅度地提高了敲入效率，也极大地缩短了制备周期，给未来的基因编辑实验和基因治疗手段提供了更大的可能性。另一方面，H3K36me3 和 H3K4me3 甲基化修饰介导人类细胞中的同源重组与 Cas9 融合，使得 HDR 效率提高了 3 倍，且减少了脱靶效应，证明了组蛋白修饰提高了 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 修复效率。1.3 供体模板与 Cas9 的递送形式目前有以下几种方法可将 CRISPR/Cas9 及其组分递送到目标细胞，包括 Cas9-RNP，Cas9-mRNA和 Cas9 质粒形式以及病毒、非病毒等载体。1.3.1 Cas9-RNP Cas9-RNP 复合物由 Cas9 蛋白和sgRNA 组成，该形式递送 Cas9 蛋白和 sgRNA 是最直接简便的方法，无需转录和翻译过程，能直接快速启动基因编辑过程，脱靶率低且毒性小。但由于Cas9-RNP 复合物尺寸较大不易包封，该形式递送存在一定的难点 [15]。Chandrasekaran等[15]通过电转将 Cas9/sgRNA导入原代 T 细胞，成功实现了近 40% 的基因编辑效率；进一步引入 HDR 模板，产生了 20% 的基因敲入效率。Kim等[16] 通过电转的方式将 Cas9/sgRNA 递呈至人红白血病细胞系（K562），通过改变 sgRNA靶向不同的位点，分别获得 16%~72% 的编辑效率，平均效率为 44%。在其他方式难以转染的人成纤维细胞和多能干细胞中，通过电转也能分别得到 19%和 23% 的基因编辑效率。1.3.2 Cas9-mRNA RNA 水平递送编码 Cas9 蛋白的mRNA 和 sgRNA，mRNA 能较快启动基因编辑，但该递送方法的局限性在于 mRNA 本身稳定性差且在体内外都容易受到 RNA 酶的降解，限制了基因编辑的持续时间，降低了基因编辑效果 [17]。Liu 等 [18] 发现结合了二硫键的脂质纳米颗粒BAMEA-O16B可以高效地将 Cas9 mRNA 和 sgRNA传递到细胞中。研究表明，使用BAMEA-O16B同时递送 Cas9 mRNA 和 sgRNA 可以抑制 293T 细胞的 GFP 表达，基因编辑效率高达 90%。 1.3.3 Cas9 质粒 由于稳定性高、操作简单、成本低等优点，从 DNA 水平递送编码 Cas9 蛋白和sgRNA 的质粒成为常用的递送形式。然而递送质粒会降低基因编辑效率，延长 Cas9 切割时间从而增加脱靶率 [18-19]。Liu 等 [18] 设计了基于聚合物/无机杂化纳米粒子的双重靶向递送系统，将 CRISPR/Cas9 质粒递送至人乳腺癌细胞 MCF-7 细胞核中，基因编辑效率高达90%。Zhang 等 [19] 研发了基于聚乙二醇-b-聚乳酸-羟基乙酸二嵌段共聚物 [poly (ethylene glycol)-b-poly (lactic-co-glycolic acid)，PEG-b-PLGA] 纳米颗粒的递送系统，其能够将 CRISPR/Cas9 质粒 DNA 递送至多个器官的血管系统中，并实现了 80% 的基因编辑效率。1.3.4 病毒和非病毒载体 病毒载体是 CRISPR/Cas9系统最常用的递送载体，但病毒载体可能会导致宿主产生有害的免疫原性和突变，限制了其应用；非病毒载体具有免疫原性低、无内源病毒重组的优点，因而纳米粒子制剂载体受到广泛的关注 [20]。基于阳离子脂质体的纳米颗粒常用于递送CRISPR/Cas9 系统，Zhang 等 [21] 合成了新型聚乙二醇磷脂修饰的阳离子脂质纳米粒子递送系统，从而使体外 A375 细胞的转染效率达 47.7%，且含有酯基的可生物降解的脂质样化合物在体内外均表现出有效的 Cas9 mRNA 递送。壳聚糖也是良好的聚合物载体，Qiao 等 [22] 将红色荧光蛋白包封在壳聚糖中形成带正电荷的纳米颗粒，将 Cas9-RNP 和 ssDNA 供体同时递送到细胞质中，具有很高的基因组编辑效率且无细胞毒性。目前，基因编辑体内递送相关的免疫原性问题仍需进行全面分析，体内已存在的与递送载体相关的中和抗体有可能对基因编辑形成干扰，对 Cas9 或其他基因编辑元件的细胞免疫反应可导致转染细胞被清除，基因编辑在转染细胞中长期持续的表达也可能激活适应性免疫反应。与长期表达的递送方式相比，瞬时递送的优势就在于能够降低脱靶的概率，这在体内基因编辑中尤其重要，因为即使非常低频的脱靶在长期表达时也可能导致癌变。Cas9-mRNA 为快速、稳定性差且在体内外都易受到降解的递送形式，适用于周期短的实验研究；Cas9 质粒稳定性高、操作简单、成本低，是常用的体外递送形式，但由于各类转染试剂存在细胞毒性，并且切割时间长，容易引起脱靶效应；与以 DNA/RNA 为基础的递送技术相比，RNP 体系直接在体外将 Cas9 蛋白和 gRNA 组装形成 RNP 复合物，通过电转法等方式导入靶细胞，实现 Cas9 的瞬时表达。该递送形式使细胞毒性更低，半衰期更短，同时采用其进行基因编辑可带来更低的脱靶效应。由于 RNP 在血液中易被蛋白酶降解，RNP 介导的CRISPR 基因编辑更多用于体外实验 [23]。目前病毒载体仍然是临床试验的常用载体。病毒载体可实现高转染效率，但是存在包装外源片段长度有限、免疫原性强和具有潜在脱靶效应等局限性。其中，慢病毒宿主范围广，基因容量大，感染效率高，能整合基因到宿主细胞，实现长期稳定表达，常构建稳定株；腺相关病毒免疫原性低，具有多种血清型，体内扩散能力强，常用于体内研究；腺病毒携带外源基因片段大，感染效率高，主要用于体外难感染的细胞。非病毒载体的原理是采用人工合成的载体材料的物理化学性质来介导基因的转移，包括脂质纳米颗粒、电穿孔、细胞穿透肽等作为递送方式。与病毒载体相比较，非病毒载体具有安全性高、包装尺寸大、免疫原性弱、靶向性可控的优点，但实验耗材成本高，存在细胞毒性，部分细胞类型递送效率低 [24-25]。因此，研究人员可根据实验需求选取合适的递送方式，例如 Cas9-RNP，Cas9-mRNA，Cas9 质粒以及通过病毒和非病毒载体包装的递送系统，包括阳离子脂质体的纳米颗粒、壳聚糖等，从而能在体内外有效提高基因编辑效率。2 调控 DNA 双链断裂修复的小分子化合物 如前所述，自然界中 HDR 的频率非常低，哺乳动物细胞通过多种机制优先使用 NHEJ 进行 DNA 双链断裂（double-strand break，DSB）修复，除了有丝分裂外，NHEJ 在整个细胞周期中都是活跃的，而 HDR 仅限于 S 期和 G2 期活跃。研究表明，NHEJ小分子抑制剂、HDR 激活剂和细胞周期抑制剂可影响 DSB 修复的不同方面，使 DSB 修复平衡转向HDR，有利于提高 CRISPR/Cas9 系统的基因敲入效率（见图 1），如细胞周期抑制剂可通过延长细胞周期的 S 期和 G2 期的长度以提高 HDR 的效率 [26]。目前开发的小分子化合物已被用于提高 HEK 293细胞、人类 iPSCs、小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）和小鼠胚胎中的 HDR 效率（见表 2）。2.1 调控 HDR 与 NHEJ 相关信号通路的小分子 参与双链断裂 DNA 修复途径的某些小分子通过作用于 DNA 修复过程中的关键蛋白以有效提高敲入效率（见图 1）。DNA 修复途径包括 HDR和 NHEJ。HDR 激活剂或 NHEJ 抑制剂可有效提高 HDR 敲 入 效 率。 其 中 HDR 激活剂有 RS-1 和brefeldinA；NHEJ 抑制剂包括 SCR7，L755507，NU7026，白藜芦醇，NU7441 和 KU-0060648。RAD51 是有丝分裂细胞中催化 DNA 同源重组修复过程中同源配对的唯一蛋白，其通过介导 DNA链配对和交换而参与 DNA 同源重组修复。Song 等[27]研究表明，RS-1 可激活 RAD51 蛋白，使 RAD51 蛋白与 DNA 的结合更稳定，从而将 HDR 修复效率提高 3 倍，值得注意的是，高浓度 RS-1 具有较强的细胞毒性。胞内蛋白运输抑制剂能抑制物质从内质网向高尔基体的运输，Hong 等 [28] 研究发现，使用胞内蛋白运输抑制剂 brefeldinA，可将 HDR 效率提高 2 倍。DNA 连接酶Ⅳ（DNA ligase IV，LIG4）是 NHEJ途径的关键酶，Ray 等[29] 发现 SCR7 是 LIG4 的抑制剂，能抑制 NHEJ 活性，在 A549 细胞中，相较于未处理的对照组，SCR7 使靶位点的插入效率提高约 3 倍。β3-肾上腺素能受体是一类 G 蛋白偶联受体，Murakami等 [30] 研究发现 L755507 和 NU7026 是β3-肾上腺素能受体激动剂，可增强 CRISPR 介导的HDR 效率，最佳使用剂量为 5 μmol·L-1，并且在 24 h以内效果最佳，可将敲入效率提高 3 倍。为了研究DNA 依赖性蛋白激酶催化亚单位（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）对 DSB的 NHEJ 修复途径的影响，Sak 等 [31] 评估了 DNAPKcs 特异性抑制剂 NU7441 对不同状态的非小细胞肺癌细胞株 DSB 修复的细胞周期特异性作用，结果显示 NU7441 以细胞周期依赖性的方式抑制 NHEJ的效率。Robert 等 [32] 研究显示，DNA 蛋白激酶抑制剂 NU7441 和 KU-0060648 能抑制 NEHJ 活性，将 HDR 效率提高 3 倍。Li 等 [33] 研究发现，白藜芦醇可抑制 LIG4 的表达，使猪胎儿成纤维细胞的 HDR 效率提高 2~3 倍。此外，他们还发现白藜芦醇以剂量依赖性的方式抑制 S 期猪胎儿成纤维细胞，而 HDR 相关基因如RAD51 和 RAD52 的表达与白藜芦醇呈剂量依赖性增加。因此，白藜芦醇通过与多个 DNA 损伤相关蛋白相互作用，增加了 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 效率。综上，为了提高 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 效率，研究人员可选择性使用小分子化合物，如 HDR 激活剂 RS-1 和 brefeldinA 分别作用于靶标 RAD51 和高尔基体，将敲入效率提高 2~ 3 倍；NHEJ 抑制剂包括SCR7，L755507，NU7026，NU7441，KU-0060648和白藜芦醇等，通过作用于不同的靶标，主要有LIG4，DNA 蛋白激酶和 β3-肾上腺素能受体，抑制NHEJ 修复途径，从而使 HDR 修复效率提高 2~5 倍。2.2 调控染色质开放或关闭状态的小分子靶向 DSB 的可及性主要取决于染色质状态，并且 DNA 有效修复的第一步是允许修复途径相关的蛋白质结合，HDR 与 NHEJ 的修复平衡与染色质结构的状态相关。染色质结构的开放或关闭状态主要由组蛋白乙酰化和去乙酰化的平衡控制，而组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰化酶（histone acetylase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）严格调控。乙酰化导致开放活跃的染色质状态，HDAC 使组蛋白去乙酰化，实现染色质致密卷曲。HDAC 抑制剂可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化水平，促进开放染色质位点，从而调控CRISPR/Cas9 的基因编辑效率 [34]。HDAC 抑制剂能抑制 NHEJ 关键因子的去乙酰化，显著增加 G2/M 期的细胞百分比，并相应减少了 G1/S 期的细胞数量，从而促进HDR 修复途径。Li 等 [35] 通过评估组蛋白修饰剂如 HDAC 抑制剂和HAT（靶点包括 p300/CBP，Tip60 和 MOZ）抑制剂对 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑效率的影响，证明了抑制 HDAC1 和 HDAC2 的活性，能够增强 HDR介导的基因敲入效率；相反，抑制 HDAC3 会降低基因编辑效率。因此，HDAC 抑制剂作为内源性途径调控因子，能抑制 NHEJ 修复途径，提高 HDR 修复效率，为细胞自身修复途径的基因编辑提供有力条件。2.3 调控细胞周期的小分子由于 HDR 发生在细胞周期的 S 期和 G2 期，所以一些研究将细胞周期抑制剂与基因编辑相配对，使细胞周期同步化并将靶细胞阻滞或延迟在 S 期或G2 期从而提高 HDR 效率（见图 2）。细胞周期抑制剂通过抑制微管聚合来使细胞停滞在 G2/M 期。Lin 等 [36] 对 6 种可逆化学细胞周期抑制剂进行了评估，包括 4 种 G1/S 阻滞剂（阿菲迪霉素、羟基脲、含羞草素和胸腺嘧啶），1 种 G2/M阻滞剂（诺考达唑）和 1 种 M/G1 阻滞剂（洛伐他汀），该研究发现诺考达唑和另一 G2/M 阻滞剂（ABT-751）可通过作用于 β 微管蛋白来增强 CRISPR/Cas9 活性，将 HDR 修复效率提高 3~6 倍。周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）是调节细胞周期进程的异二聚丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在 S 期阶段该酶的活性增加激活了 HDR修复通路的关键标志，如激活 DNA 末端切除过程。Smirnikhina 等 [37] 利用 CDK 抑制剂靛红素，通过在S 期或 G2 期阻滞靶细胞，提高了 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 修复效率。细胞分裂周期7 相关蛋白激酶（cell division cycle seven associated protein kinase，CDC7）属于丝氨酸-苏氨酸激酶，可被 Dbf4 依赖性激酶（Dbf4-dependent kinase，DDK）激活，是细胞进入 S 期的必要因子，抑制 CDC7 蛋白可导致细胞周期停滞在 G1/S 期。CDC7/DDK 复合体使微小染色体维持蛋白（minichromosome mantenance protein，MCM） 维 持 磷 酸 化， 从 而 启动 G1/S 期的过渡。Wienert 等 [38] 研究发现 XL413 为CDC7 抑制剂，能够可逆地阻断 MCM 的磷酸化，并在 S 期早期阻滞细胞。在 K562 细胞中，XL413将增强型蓝色荧光蛋白（enhanced blue fluorescence protein，EBFP）和增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的基因编辑效率分别提高了1.4 和 1.8 倍。此外，敲低蛋白 CDC7 能在可逆的 S 期减缓过程中激活 HDR 途径，使许多情况下（包括原代 T 细胞）的 HDR 修复效率提高 3.5 倍。综上，使用不同细胞周期蛋白抑制剂将靶细胞阻滞或延迟在 S 期或 G2 期可针对性地提高 HDR 修复效率。不过，细胞周期抑制剂可能引起部分细胞凋亡，研究者需要进行预实验探索最适浓度。3调控 DNA 双链断裂修复的关键蛋白表达 除了 NHEJ 抑制剂或 HDR 激活剂，还可通过构建敲除细胞系或利用 siRNA/ 短发夹 RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲低或过表达修复通路关键蛋白来提高 CRISPR/Cas9 诱导的 HDR 效率，如敲低 Ku70，Ku80，DNA-PKcs，p53 结合蛋白 1（p53-binding protein 1，53BP1），以及过表达 RAD51 和RAD52（见表 3[39-48]），具体作用机制如图 3 所示。Chu 等 [39] 发现，在 HEK293/TLR 细胞中，Ad4蛋白处理能降低 LIG4 的表达，显著抑制了 NHEJ的效率。该研究还发现利用 siRNA 降低 LIG4 的表达可使 HDR 效率提高 2.8 倍。Li 等 [40] 利用 siRNA减少 NHEJ 通路中关键因子 Ku70 和 Ku80 的表达，增加了多个 HDR 效率，包括同源重组、单链退火和单链寡核苷酸介导的 DNA 修复。DNA-PKcs 是磷脂酰肌醇 3-激酶相关激酶（phosphoinositide 3-kinase-related kinase，PIKK）家族的成员，该家族包括具有高度同源的催化结构域的蛋白质，如 PI3K，毛细血管扩张性共济失调突变蛋白（ataxia-telangiectasia mutated protein，ATM），ATR（ATM and Rad3 related）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）[41]。DNA-PKcs 的激酶活性在 NHEJ 启动步骤中起着重要作用，Liu 等 [41] 研究表明 DNA-PKcs表达下调可使 HDR 效率增加 2.8 倍。53BP1 是真核细胞中 DSB 修复途径选择的关键调控因子，通过抑制末端切除导致 NHEJ 优先于HDR，使得 HDR 启动受限。Canny 等 [42] 通过阻断53BP1 在 DNA 损伤位点的积累，发现53BP1 抑制剂可以提高人类和小鼠细胞中 HDR 依赖基因组编辑的效率，最高可提高 5.6 倍，并提高了基因靶向性和与 dsDNA 或 ssDNA 供体的染色体基因转换。RAD51 和 RAD52 是 HDR 过程中的关键蛋白，Kurihara 等 [43] 研究发现在神经元细胞中共转染过表达 RAD51，敲入效率提高了 2.5 倍。Shao 等 [44] 研究显示，RAD52 在 293T 细胞中的过表达，使 HDR修复效率增加 3 倍。该课题组还发现 RAD52 和SCR7 的联合使用将 HDR 效率提高约 40%。CtBP相互作用蛋白（CtBP-interacting protein，CtIP） 是 同 源 重 组 早 期 步 骤 的 关 键 蛋 白， 主 要作为辅因子诱导减数分裂重组蛋白 11（meiotic recombination 11，MRE11）核酸内切酶对 DNA 末端切割，激活 HDR 途径 [45]。Charpentier 等 [46] 研究发现，CtIP 最小的 N 端片段可激活 HDR 修复，从而提高了靶位点的基因编辑效率。Engeland 等 [47] 研究显示，P21 蛋白与许多转录因子相互作用，P21 蛋白能抑制 CDK4 的活性，使周期抑制蛋白 Rb 不能发生磷酸化，细胞周期相关转录因子 E2F 不能释放，进而使细胞周期停滞在 S/G1 期，从而增加 HDR 效率。Gutshner 等 [48] 试图通过直接同步 Cas9 的表达与细胞周期进展来激活 HDR 修复活性，结果发现将人 Geminin 蛋白的 N 端区域与 Cas9 融合，诱导Cas9 在 G1 期降解，使目标 DNA 切割限制在 S/G2 期，HDR 效率增加至 87%。综上，干扰或过表达 DSB 修复途径关键蛋白的策略有利于生成精确基因修饰的细胞系和生物体，研究者可通过 siRNA 减 少 Ku70，Ku80，LIG4，DNA-PKcs，53BP1，CDK，CtIP 等表达或对蛋白RAD51 和 RAD52 过表达从而提高 HDR 修复效率，抑制 NHEJ 修复活性。除了通过调控 DSB 修复的关键蛋白表达的策略之外，Ye 等[49] 开发了新的方法，用 CRISPR 激活（CRISPRa） 或 CRISPR 沉 默（CRISPRi）来调节NHEJ 和 HDR 通 路，CRISPRi 或 CRISPRa 复合物能抑制 NHEJ 修复途径并激活 HDR 修复，显著提高CRISPR 介导的基因编辑的 HDR 效率。4优化 Cas9 系统从 Cas9 蛋白的性质出发，如表面电荷、末端残基及拓扑结构，可以对其进行修饰或改造，使其更适配于不同载体系统的体内递送，促进 Cas9-RNP的基因编辑。具体包括如下方法：1）Cas9 核酸酶的末端修饰，如添加标签蛋白或融合蛋白结构域；2）基于 Cas9 蛋白的结构特点和催化原理对其进行工程化改造，从而筛选出优异的 Cas9 突变体；3）对 Cas9 拓扑结构进行调整，如与特定蛋白功能域融合，或同时表达多个 sgRNAs 或 Cas9 实现 CRISPR/Cas9 系统的多重编辑及调控 [50]。4.1 Cas9 的修饰 CRISPR/Cas9 介导的同源重组修复是由 Cas9在 gRNA 介导的双链断裂后，在切割位点利用供体DNA 进行的修复途径。供体 DNA 在切割位点的富集程度将决定同源重组能否发生，供体 DNA 在切割区域的低浓度是同源重组的限速步骤。基于此问题，Ling 等 [51] 采用非天然氨基酸偶联技术实现 Cas9 蛋白与供体 DNA 的直接或间接偶联，将其共递送进入体内，实现切割区域供体 DNA 的有效富集，在细胞水平实现同源重组水平大幅提升10~20 倍。此外，使用含叠氮基的氨基酸对 Cas9 蛋白进行化学修饰，通过加成反应缀合供体 ssDNA 或DNA 衔接子，从而将修饰的或未修饰的供体 DNA模板募集到 RNP 复合物中，结果显示用 G1367-AeF（苯丙氨酸突变位点 G1367）RNP 和二苄基环辛炔（dibenzocyclooctyne，DBCO）修饰的 ssDNA 共转染细胞的 HDR 效率增加了1.6 倍。Huang 等[52] 开发了 Cas9 ProSNA-sgRNA 核糖核蛋白递送系统，通过在 Cas9 蛋白 N 端修饰 3 个连续的 GALA 肽促进核递送效率。结果显示 Cas9 ProSNA RNP 在 4 种不同的细胞中的基因编辑效率为 32%~47%。4.2 Cas9 突变体 CRISPR/Cas9 推动了基因编辑技术的发展，但PAM 要求限制了精确基因编辑方法的适用性，使目标编辑发生在 PAM 的特定距离或特定范围内 [53]。不过，随着人们对 Cas9 蛋白三维结构和作用机制的深入认识，通过对 Cas9 蛋白进行工程化改造就逐渐成为优化提升 CRISPR/Cas9 系统的有力手段。该方法以 Cas9 蛋白的结构特点和催化原理为指引，对Cas9 蛋白相应的结构域进行设计改造，来筛选性能更为优异的 Cas9 突变体。Huang 等 [54] 研究发现通过定向进化生成的 4 种Cas9 突变体能够共同靶向人类基因组中大多数富含嘧啶的 PAM 序列。结果显示 Nme2Cas9 突变体成功突破了传统 PAM 的限制，并实现高效的基因编辑。Wang 等 [55] 研究发现将微生物单链退火蛋白（single chain annealing protein，SSAP）与催化失活的 dCas9结合形成无切割的基因编辑器 dCas9-SSAP 具有较低的目标误差和最小的脱靶效应，可有效插入千碱基的序列，效率约达 20%。4.3 Cas9 蛋白与特定功能蛋白融合目前通过将特定蛋白或功能域与 Cas9 融合，可以有效提高 HDR 敲入效率。单碱基编辑和引导编辑器（prime editor，PE）编辑可实现精准的碱基替换和片段的插入而无需 DSB过程。该系统通过对靶位点的“搜索”和“替换”，可实现 4 种碱基之间的任意替换及小片段的精准插入和删除，克服了 CRISPR/Cas9 系统介导的 HDR 效率低和碱基编辑系统不能实现碱基颠换的困难 [56]。 Peterka 等[57]将逆转录酶和野生型 SpCas9 进行融合构建了 PEn 蛋白，利用常规的先导编辑向导RNA（prime editing guide RNA，pegRNA），PEn可通过同源依赖性 DSB 修复机制实现小 DNA 插入，效率达 50%。Jiang 等 [58] 将具有双链切割活性的 Cas9 与逆转录酶融合，并结合 2 条靶向互补 DNA链 pegRNA，开发出了 PEDAR 系统，它可以高效地诱导 20 ~ 700 bp 片段的缺失和 30 bp 片段的插入。Adikusuma 等 [59] 同样利用野生型 SpCas9 构建了新的PE 系统，并且将蛋白、pegRNA 和 nicking sgRNA 整合在同一质粒中进行表达，该系统在 293T 细胞中平均编辑效率可达 67%。此外，将该系统注射小鼠胚胎，在新生小鼠中最高可以实现 100% 的编辑效率。Aird等[60]将HUH核酸内切酶与Cas9融合表达，实现了稳定的共价 RNP-ssDNA 复合体，结果显示通过 HUH-Cas9 融合蛋白与 ssDNA 共价结合可使HDR 效率增强 30 倍。Ma 等 [61] 将最小基元 Brex27与 spCas9 融合构建成 miCas9，研究发现以 Cas9-mRNA 形式递送时，miCas9 的编辑效率提高了 2.5倍；此外，Ma 等 [62] 将 Cas9 与全长睡美人（sleeping beauty，SB）转座子（Cas9- SB）、SB 的 RED 结构域（Cas9-N123） 和 SB 的 PAI 结 构 域（Cas9-N57）融合，经流式细胞术（flow cytometry，FCM）分析显示，Cas9-N57 融合蛋白将 HDR 编辑效率提高了 1.5 倍。由于 HDR 增强子（HDR-enhancer，HE）是同源重组早期阶段的关键蛋白 CtIP 发挥活性所必需的最小 N 末端多聚化结构域，因此 HE 可通过增强HDR 提高Cas9 基因敲入效率。Charpentier 等 [63] 将HE 与 Cas9 融合，结果显示 Cas9-HE 融合物在包括人类细胞系、iPSCs 和大鼠受精卵中获得的基因编辑效率为仅用 Cas9 的 2 倍或更高。如前所述，Cas9-HE 融合物允许在若干实验系统中获得更高的转基因整合效率。此外，使用 Cas9-HE 非常简单且不需要使用基因修饰的细胞或药理学试剂，极大地提高了基因编辑应用的靶向范围，从而有利于提高 HDR 效率。HDR 和 NHEJ 之间的平衡与位点特异性的染色质状态相关。研究发现 CRISPR/Cas9 诱导 DSB的 NHEJ 修复效率在常染色区域较高，而微同源末端连接（microhomology-mediated end joining，MMEJ）和 HDR 偏向异染色质 [64]。因此可通过染色质重塑因子来调控染色质状态，使平衡偏向 HDR。Chen 等 [65] 将染色质重塑因子 PRDM9 与 Cas9 融合，将 HDR 效率提高了 3 倍，且未增加脱靶效应。 综上所述，将 Cas9 蛋白与特定功能蛋白，包括逆转录酶、内切酶、同源重组关键蛋白以及染色质重塑因子，融合表达的策略具有较高的基因组特异性，是未来基因组工程应用的有效工具。4.4 gRNA 优化和表达策略多重编辑CRISPR/Cas9系统与 TALEN 和 ZFN等核酸酶相比具有很大优势，其意味着多个 sgRNAs或 Cas9 能够同时表达从而极大地提高了 CRISPR/Cas9 系统进行基因编辑或转录调控的效率和靶向范围，多重编辑性使该系统在生物工程领域得到极大应用和发展。Hsieh-Feng 等 [66] 研究表明，高效表达多个 sgRNAs 在实现优化或多重基因组编辑中起着关键作用，研究发现各种 CRISPR/Cas9 的表达盒配置、转录本处理过程和传递策略都优化 sgRNA 的表达。此外，通过修饰或改变 sgRNA 识别区长度，可实现 CRISPR 系统的多重编辑或调控。CRISPR/Cas9 系统的特异性主要体现在 sgRNA对 Cas9 切割位点的特异性识别与结合，增强细胞内sgRNAs 的稳定性和特异性有助于提高基因组编辑效率，减少脱靶效应。基于 sgRNA 的骨架结构，可在特定位点进行修饰或改造，例如截短或延长 sgRNA 的 5'端或 3' 端来增减其长度；引入 2' 核糖化学修饰 sgRNA的骨架。此外，sgRNA 含有保守的核酸序列，可合理设计与之碱基互补配对的序列，复合成双链连接到载体上，从而提高递送效率 [67]。Wang 等 [68] 针对 sgRNA种子区核糖 2'-OH 与 Cas9 蛋白之间的相互作用位点，发现可利用特定位点的化学修饰来调节Cas9蛋白活性，通过在这些特定的位点引入 1 个发光性基团，实现了Cas9 活性的光学控制，从而间接调控基因编辑效率。综 上， 研 究 人 员 通 过 工 程 化 Cas9 蛋白或sgRNA 等方式，使 CRISPR/Cas9 系统的靶向范围、靶向特异性和保真性均得到了拓展和提高。当然，无论是通过针对 Cas 蛋白自身结构的优化改造，还是采用优化设计 sgRNA 等方式，均能在一定程度上提升 CRISPR/Cas9 系统的应用性能。5总结与展望CRISPR/Cas9 诱导的 HDR 是精确可控的基因组 DNA 编辑工具 [69]。然而，由于哺乳动物细胞对NHEJ 的偏好性大于 HDR，基于 HDR 的精准基因敲入效率很低，因此，综合考虑细胞周期和 DSB 修复的关系对于提高基因敲入效率至关重要。目前，可采用在 ssDNA 或 dsDNA 供体末端引入化学修饰以增强供体稳定性，供体共价连接到CRISPR/Cas9 系统上提高切割位点局部浓度的方法提高基因敲入效率。但这些方法存在操作困难、成本高等问题。因此，需要进一步优化供体模板，以促进 CRISPR/Cas9 介导的基因敲入在临床治疗中的应用。此外，该系统还受限于 PAM 序列的依赖性和脱靶效应，应用在人类疾病基因治疗时需要提高其保真性、安全性等因素。例如通过优化 Cas9 蛋白或gRNA 从而拓宽 PAM 序列识别范围并提高靶向特异性，通过融合效应结构域或进行转录调控。CRISPR/Cas9 系统在临床试验中的递送主要依赖于物理途径和病毒载体，这受到细胞损伤和安全性问题的严重阻碍。非病毒纳米载体的开发将有助于拓展 CRISPR/Cas9 系统的医学应用。有效和安全的递送策略仍然是 CRISPR/Cas9 系统临床应用的主要挑战。研究人员需根据每种 CRISPR/Cas9 模式的作用机制和理化性质，合理设计载体，使基因组编辑效率最大化，脱靶风险最小化。尽管研究人员已对 CRISPR/Cas9 技术进行了广泛的探索，但该技术的特异性还有待进一步提高，以减少脱靶风险，确保安全性。此外，CRISPR/Cas9系统具有多重编辑的优势，可应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行筛选，极大促进了基因编辑技术在生物工程领域的发展和应用。然而，对于 sgRNA 在细胞内的机制及其对Cas9 竞争作用的了解仍有待加强。参考文献 ：[1] Cong L, Zhang F. 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引言细胞周期作为生命活动的基本过程，对于维持生物体的健康和稳定至关重要。它涉及一系列精确控制的事件，这些事件确保了DNA的正确复制和分配给子细胞。因此，对细胞周期的深入了解不仅是基础生物学研究的核心内容，也对癌症等疾病的预防和治疗具有重要意义。细胞周期的进程受到多种蛋白质的调控，这些蛋白质的表达、定位及功能在细胞周期各阶段间发生动态变化。通过研究蛋白质在细胞周期中的行为，我们可以揭示其对细胞分裂、DNA复制和细胞死亡等关键生命过程的影响。此外，蛋白质组的动态变化还反映了细胞对内外环境变化的响应，为我们理解细胞生物学提供了新的视角。3月6日Cell杂志报道的研究“Proteome-scale movements and compartment connectivity during the eukaryotic cell cycle”，采用先进的生物信息学方法和高通量蛋白质组学技术，构建了酵母细胞周期过程中的蛋白质组动态变化图谱。研究人员利用卷积神经网络（CNN）对成千上万的活细胞图像进行空间和时间上的解析，揭示了大约20种亚细胞定位类别中蛋白质的周期性变化。此外，还开发了一个基于Web的数据访问工具，能够通过酵母基因或其人类同源基因的名称搜索相关数据，以探索细胞周期中全局蛋白质动态。Highlights该研究通过应用两种独特的卷积神经网络(Convolutional Neural Networks, CNNs)于成百万活酵母细胞的图像，解析了真核细胞周期(Eukaryotic cell cycle)期间蛋白质组(Proteome)在浓度和定位上的动态变化。研究模式图（Credit: Cell）创造了一个基因组规模、高时空分辨率的酵母细胞周期蛋白质组图谱(Genome-scale high-resolution spatiotemporal map of the yeast cell cycle proteome)，为理解细胞周期的基本生物过程提供了系统级的视角。一个用于定量分析活细胞中蛋白质的时空动态的管线。这个管线结合了多种技术和方法，包括荧光显微镜成像、基因工程、计算机辅助的图像分析和机器学习。具体来说，该流程可能涉及以下步骤：使用荧光蛋白（如GFP）标记特定的蛋白质，以便在活细胞中可视化这些蛋白质；利用高通量显微镜成像技术捕捉大量细胞的图像，其中细胞表达不同的荧光蛋白融合体；使用图像处理和分析软件，自动化地分割和识别单个细胞及其相关的荧光信号，以评估蛋白质在细胞中的位置和表达量；通过应用机器学习算法和神经网络来分类和解析图像数据，比如识别不同的细胞周期阶段或蛋白质在细胞内的特定定位。（Credit: Cell）利用CNNs分析静态活细胞图像，实现了蛋白质定位和浓度的时空剖析(Temporal and spatial dissection)。发展了基于Web的工具(Web-based tool)，通过酵母基因或人类直系同源基因(Human orthologs)的名称进行数据访问，增强了数据的可用性和互动性。通过单细胞蛋白质组测量与细胞周期解析的转录组(Transcriptome)和核糖体印记(Ribosome profiling)数据的结合，揭示了翻译后调控(Post-translational regulation)在决定细胞周期特异性蛋白质浓度中的重要作用。细胞周期中蛋白质运动及其与细胞器互连性的概览。(A) 展示了细胞周期中不同定位类别的蛋白质定位变化的数量及其平均幅度（以DeepLoc激活的平均变化表示；红色条）。插图显示了所有蛋白质运动案例中涉及指定定位类别的比例。(B) 描述了不同定位类别之间在蛋白质运动方面的互连性。标有a、b、c、d的四个方框区域在图S2D中进一步分析。(C) 描述了每个主要细胞周期过渡期间的蛋白质运动图。每个节点代表一个不同的定位类别。蓝色节点的大小反映了在特定类别中定位增加的蛋白质的总数。灰色节点代表没有增加蛋白质定位的类别。箭头的粗细反映了从一个定位类别移动到另一个定位类别的独特蛋白质的数量。(D) 展示了每个细胞周期过渡期间运动蛋白质的功能富集情况（Credit: Cell）细胞周期中蛋白质浓度动态。(A) 显示了所有蛋白质（共3,806种，约占总蛋白质含量的70%）相对于G1 Pre-START的总浓度变化（以校正后的平均自发荧光GFP表示）。每个重复测量的平滑曲线分别绘制。(B) 从G1 Pre-START到G1 Post-START，2,853种GFP荧光强度至少高于背景5%的蛋白质浓度的百分比变化。根据蛋白质丰度与细胞大小的缩放关系对蛋白质进行分组。垂直虚线表示每组中的中位数变化。插图显示了在G1阶段显示正、负及无差异性缩放的蛋白质比例。(C) 图3B中蛋白质组的功能富集或削减情况。(D) 热图展示了细胞周期中细胞质（共85种）和线粒体（共58种）核糖体蛋白（RPs）的浓度动态。(E) 相对于G1 PreSTART，图(D)中蛋白质浓度的变化（平均值±标准误 [线和阴影，分别]，单位如A所示）。(F) 热图显示了被识别为周期性的蛋白质的浓度动态，按照在每个细胞周期阶段之前浓度递减的顺序排列。展示了在所有指定细胞周期阶段中水平高于细胞自发荧光的蛋白质（共731种）。为G1 Pre-START、G1 Post-START和S/G2-有丝分裂期达到峰值的蛋白质提供功能富集分析。(G) 显示周期性浓度蛋白质在每个细胞周期阶段表现出的最大或最小浓度或丰度的相对比例。(H) 展示了周期性蛋白质（共545种）在细胞周期中蛋白质浓度和总蛋白质含量的最大变化（三次重复中的平均值），这些蛋白质具有允许对这些参数进行可信定量评估的特征。（Credit: Cell）细胞周期特异性蛋白浓度动态的多层次调控，展示了细胞周期中蛋白浓度、转录水平和翻译效率三个方面的动态变化及其相互关系。(A) 部分展示了一个Circos图，这是一种用于展示数据间关系的可视化工具。图中以不同颜色表示蛋白浓度（红色）、转录水平（灰色）和翻译效率（蓝色）的数据集。每个数据集的图标大小反映了该数据集中的命中数（即检测到的特定变化的蛋白数量）。例如，蛋白浓度数据集有810个命中，而翻译效率数据集有213个命中，因此红色的图标大约是蓝色的3.8倍。图中还总结了不同数据集之间的共有命中数及蛋白浓度命中在其他数据集中的百分比。(B-D) 这些折线图展示了在不同细胞周期阶段，平均归一化的转录水平和蛋白浓度的变化。x轴表示细胞周期的进展，灰色圆圈表示G1期。为了更好地展示连续两个细胞周期的动态变化，每个分组的平均信号都呈现了两次（从G1期后期开始，一直到有丝分裂后期）。(E) 部分展示了一些特定基因的细胞周期特异性剖面，这些基因在蛋白浓度、转录水平和翻译效率上都表现出周期性变化。这包括归一化的转录水平、翻译效率和蛋白浓度数据，从而提供了对这些基因在细胞周期中如何被调控的深入了解。（Credit: Cell）细胞周期周期性蛋白质组的时空分析，通过图示和数据呈现了细胞周期中蛋白质在空间位置和浓度上的变化。(A和B) 这两个网络图总结了蛋白质在细胞周期的任何阶段从较大区域（如细胞质或细胞核）向更局限的区域（如细胞质或核的边缘，或更狭窄的区域如细胞质或核的聚焦/小点）的移动。图中的连线粗细代表在指定的细胞器间移动的蛋白质数量。大的黑色节点代表定位类别，其大小反映了相应细胞器的物理大小。例如，大节点代表细胞质和细胞核；较小的节点代表它们的边缘；最小的节点代表其中的更局限区域，如细胞质或核的焦点/小点。(C) 展示了两个示例蛋白质（Flc1和Ubx6）的簇图横截面和显微照片，这两个蛋白质显示了细胞器内部的移动。(D和E) (D) 部分显示了具有指示的周期性模式的基因的多功能性程度；(E) 部分显示了这些基因在遗传交互中的参与程度。(F-I) 这些通量网络总结了细胞周期周期性蛋白质组。定位类别被表示为大的灰色节点。每个蛋白质由一个小节点表示，其颜色显示在特定细胞周期转换中的浓度变化。连线将每个蛋白质节点与发生变化的两个定位类别连接起来。线的粗细表示定位变化的幅度，箭头指示方向。例如，Gin4的浓度从G1前期到G1后期增加，它在细胞质的定位减少而在芽点的定位增加。这种动态分别为G1前期到G1后期（F）、G1后期到中期（G）、中期到末期（I）以及末期到G1前期（H）所展示。（Credit: Cell）细胞周期解析的表型组学用于功能分析和探索，通过数据和图像展示了特定蛋白质在细胞周期中的行为及其功能意义。(A) 展示了Ymr295c蛋白的簇图横截面和显微照片。这部分描绘了Ymr295c在不同细胞周期阶段的空间定位变化。(B) 该地图展示了与Ymr295c有最高定位相似性的十种蛋白质在细胞周期中的特定移动。这揭示了Ymr295c可能与这些蛋白在功能或定位上有相关性。(C) 空间分析的功能富集（SAFE）分析用于探究具有与Ymr295c类似（皮尔逊相关系数≥0.5）的细胞周期特定定位轮廓的蛋白质（n = 40）。图上的虚线形状表示在酵母遗传交互（GI）全球相似性网络上富集的生物过程。(D) 在YPD和SD培养基上对指定菌株进行斑点稀释实验，考察了在卡泊芬净（CAS）存在下的生长情况。Set-1和Set-2表示起始于不同预培养的斑点（RT，室温）。(E) 在CAS存在下，采用液体培养基对野生型（WT）和ymr295cΔ细胞株进行生长实验，其中细胞表达的是HO或YMR295C，通过MoBY质粒实现。(F) 示意图展示了1,3-β-葡聚糖合成酶复合体的结构。(G) 液体培养中指定菌株的互补实验，菌株通过MoBY质粒表达HO、YMR295C或RHO1，在RT或38°C下培养。(H–J) 在RT、37°C和CAS存在下的室温，采用斑点稀释实验测试野生型和特定突变菌株，这些菌株携带了诱导型URA3或YMR295C的Gal质粒。（Credit: Cell）Strategies高通量活细胞成像(High-content live-cell imaging): 研究团队使用高通量活细胞成像技术收集了成百万活酵母细胞的图像，这些细胞表达了与绿色荧光蛋白(GFP)融合的蛋白质，以直观地监测蛋白质在细胞中的位置和数量。应用卷积神经网络(Convolutional Neural Networks, CNNs): 研究人员开发了两种不同的卷积神经网络，专门用于处理大量的活细胞图像。这些网络能够自动地、准确地识别细胞周期的各个阶段，并对蛋白质的定位和浓度进行分类和量化。-第一个网络用于细胞周期阶段的自动分类(Automated cell cycle-stage classification)，基于细胞的形态特征（如细胞大小、芽孢出现的时机和大小）来确定细胞处于细胞周期的哪个阶段。-第二个网络（DeepLoc）用于自动识别细胞内蛋白质的亚细胞定位(Subcellular localization)。数据整合与分析(Data integration and analysis): 将单细胞成像数据与转录组(Transcriptomics)和核糖体印记(Ribosome profiling)数据结合起来，以深入理解蛋白质表达和调控的多层面机制。这种多维数据整合为揭示翻译后调控(Post-translational regulation)在细胞周期中的作用提供了宝贵的见解。周期性评分(Periodicity scoring): 采用了多种算法来评估蛋白质在细胞周期中的周期性变化，包括de Lichtenberg方法、JTK_CYCLE、持续同源性(Persistent homology)和Lomb-Scargle方法。这些方法有助于识别具有细胞周期依赖性周期变化的蛋白质，无论是在表达量还是在亚细胞定位上。基于Web工具的开发(Web-based tool development): 创建了一个用户友好的网络工具，允许通过酵母基因名称或它们的人类同源基因名访问和探索蛋白质的细胞周期动态数据。提高了数据的可访问性和互动性，将进一步促进了生物学发现。Behind the Scenes细胞周期进程中的蛋白质组动态细胞周期对蛋白质定位与浓度的影响细胞周期的各个阶段对蛋白质的定位与浓度有着显著的影响，这些变化对于细胞的正常功能和生命周期至关重要。蛋白质的空间分布和数量调节，不仅影响细胞分裂、DNA复制和修复等基本生命活动，还涉及到细胞对环境变化的响应和信号转导过程。蛋白质定位的周期性变化G1阶段：在细胞周期的G1阶段，某些蛋白质会从细胞质迁移到核内，参与DNA损伤修复和复制准备过程。例如，细胞周期抑制蛋白p53在受损DNA存在时累积于核内，激活DNA修复机制。S阶段：在DNA复制期间，复制叉稳定性蛋白和染色体复制相关蛋白的定位发生显著变化，它们集中于复制起点，确保DNA复制的准确性和完整性。有丝分裂期：分裂期特定的蛋白质，如纺锤体检查点蛋白，会在染色体分离前后定位于纺锤体，监控染色体的正确分配到子细胞中。蛋白质浓度的周期性变化周期性表达蛋白质：某些蛋白质的表达呈现明显的周期性变化，如周期蛋白和细胞周期依赖性激酶（CDKs）。这些蛋白质的浓度在细胞周期的特定阶段急剧上升，推动细胞进入下一周期阶段。蛋白质稳定性与降解：蛋白质的稳定性和降解也受细胞周期调控。例如，周期蛋白的快速降解是有丝分裂结束和G1阶段开始的关键事件。蛋白质修饰：磷酸化、泛素化等后翻译修饰在细胞周期中起到重要作用，通过改变蛋白质的活性、定位或稳定性，影响其浓度和功能。综合调控机制细胞通过复杂的调控网络，精确控制蛋白质的定位和浓度，以适应细胞周期的需要。这包括转录后调控、蛋白质降解机制以及蛋白质间的相互作用。此外，多种信号传导路径参与到细胞周期蛋白质的调控中，如p53信号通路、Wnt/β-catenin通路等，它们通过调节特定蛋白质的表达和活性，共同促进细胞周期的有序进行。蛋白质周期性变化的全景图在细胞周期的不同阶段，蛋白质的表达模式和活性状态呈现出显著的周期性变化。这种变化不仅是细胞周期顺利进行的基础，也是细胞适应环境变化、响应内部信号的关键机制。通过系统性地分析这些周期性变化，我们能够深入理解细胞生命活动的内在逻辑和调控网络。蛋白质周期性变化的机制转录调控：细胞周期特定阶段的启动因子和抑制因子，通过调控下游目标基因的转录，实现蛋白质表达的周期性变化。翻译后修饰：包括磷酸化、泛素化等修饰方式，这些修饰不仅调节蛋白质的活性，还影响其稳定性和亚细胞定位，从而在细胞周期中发挥重要作用。蛋白质降解：通过泛素-蛋白酶体途径或溶酶体途径，特定蛋白质在细胞周期的某一阶段被降解，以确保细胞周期的有序进行。细胞周期各阶段蛋白质的特征变化G1期：细胞增长相关蛋白质的表达增加，为DNA复制准备必需的物质基础。同时，细胞周期抑制蛋白如p21和p27的浓度上升，监控细胞是否准备好进入S期。S期：DNA复制相关蛋白质，如DNA聚合酶、复制因子C和MCM复合体的表达达到高峰，确保DNA能够准确复制。G2期：细胞检查点蛋白质的表达增加，检测DNA复制是否完整，确保细胞在进入有丝分裂前，DNA无损伤或复制错误。M期：有丝分裂相关蛋白质，如纺锤体组装因子、染色质凝聚蛋白等表达上升，推动染色体分离和细胞分裂。蛋白质周期性变化的功能意义确保细胞周期的有序进行：通过精确调控蛋白质的表达和活性，保证细胞周期各阶段顺利完成，维持细胞生长和分裂的正常秩序。响应细胞内外环境变化：细胞通过调节特定蛋白质的周期性表达，快速适应内外部环境的变化，如应对DNA损伤、营养物质的变化等。调节细胞命运决定：细胞周期蛋白质的变化不仅影响细胞分裂，还涉及细胞分化、凋亡等生命过程，是细胞命运决定的重要因素。蛋白质定位周期性变化举例周期蛋白Cyclin B的定位变化周期蛋白Cyclin B与细胞周期依赖性激酶CDK1结合，形成活性复合物，控制细胞进入有丝分裂期。在有丝分裂早期，Cyclin B主要定位在细胞核内，随着细胞周期的推进，Cyclin B逐渐累积在细胞质中。此定位的周期性变化，是通过磷酸化和去磷酸化调控实现的，关键在于确保细胞在正确的时间触发有丝分裂。DNA修复蛋白Rad51的周期性定位Rad51参与同源重组修复（HR），在DNA复制和修复中起着重要作用。在S期，Rad51主要在核内形成焦点，参与修复复制过程中产生的DNA双链断裂。细胞周期的其他阶段，Rad51的焦点数量显著减少，反映了其在DNA复制和修复过程中的周期性作用。纺锤体组装检查点蛋白Mad2的动态定位Mad2是细胞周期检查点蛋白，监控纺锤体组装和染色体附着状态，防止染色体分配不均。在有丝分裂期间，Mad2在未连接的着丝粒上累积，阻止细胞进入下一阶段，直至所有染色体正确连接至纺锤体。细胞进入有丝分裂晚期，Mad2的定位发生变化，从着丝粒移动至细胞质，参与调控细胞周期的正常进展。细胞周期控制中的蛋白质调控机制细胞周期的顺利进行是生命活动中最基础也是最关键的过程之一。这一过程涉及到众多蛋白质的精确调控，其中不同蛋白质的表达、降解、定位以及活性变化，共同保证了细胞周期的有序进行。蛋白质的周期性表达与降解细胞周期的各个阶段都伴随着特定蛋白质的周期性表达。例如，周期蛋白（Cyclins）及其依赖的激酶（CDKs）是细胞周期进程中最核心的调控因子。它们的活性通过蛋白质的合成与降解来精确调控，从而触发细胞周期的各个阶段。在G1期，Cyclin D的累积触发细胞准备进入S期；而到了有丝分裂期，Cyclin B的降解标志着周期的完成，为新的周期做好准备。蛋白质的定位变化除了蛋白质的表达量外，其在细胞内的定位变化也是调控细胞周期的重要机制。例如，核糖体蛋白质的定位变化对于细胞从G2期过渡到有丝分裂期至关重要。通过精确控制蛋白质在细胞内的位置，细胞能够确保正确的蛋白质在适当的时间和地点发挥作用。蛋白质活性的调节蛋白质的活性调节是细胞周期控制中另一个关键层面。通过磷酸化、去磷酸化等后翻译修饰，细胞能够快速调整蛋白质的活性。例如，CDKs的激酶活性受到周期蛋白结合以及磷酸化状态的调节，这种调节机制确保了细胞周期的正确进展。蛋白质间的相互作用蛋白质间的相互作用是细胞周期调控网络中不可或缺的一环。通过蛋白质复合体的形成，细胞实现了对周期事件的精确控制。例如，E3泛素连接酶的活性依赖于其与特定底物的结合，这一过程关键于调控蛋白质的降解，影响细胞周期的进程。高分辨率空间-时间蛋白质组图谱的构建利用卷积神经网络分析静态活细胞图像随着生物信息学和计算生物学的迅速发展，尤其是深度学习技术在生物医学图像分析领域的广泛应用，卷积神经网络（CNN）已成为分析静态活细胞图像的强大工具。通过这一技术，研究人员能够更精确地理解蛋白质在细胞周期进程中的动态变化及其定位信息，为细胞生物学的研究提供了前所未有的视角。CNN在细胞图像分析中的应用卷积神经网络通过学习大量细胞图像数据，能够自动识别并分析蛋白质在不同细胞周期阶段中的定位模式。这种方法不仅提高了分析的效率和准确性，也能够揭示微妙的、肉眼难以察觉的细胞状态变化。蛋白质定位的自动识别与分类利用CNN，研究人员可以自动识别蛋白质在细胞内的特定定位，并将其分类。这一过程通过训练网络识别不同的亚细胞结构（如细胞核、线粒体、内质网等）中的蛋白质累积来实现。该技术的应用极大地促进了对蛋白质功能及其在细胞生理状态中作用的理解。动态变化的捕捉更进一步，CNN不仅能够识别静态图像中的蛋白质定位，还能分析时间序列图像，捕捉蛋白质在细胞周期进程中的动态变化。这种能力使研究人员能够观察到蛋白质如何响应细胞周期的不同阶段，以及这些变化对细胞功能的影响。尽管CNN在细胞图像分析中展现了巨大潜力，但仍面临一些挑战，如训练数据的质量和数量、网络结构的优化以及解释性问题。未来的研究将需要解决这些问题，进一步提高分析的准确性和效率。此外，随着技术的不断进步，将CNN与其他生物信息学工具和技术相结合，如单细胞测序和蛋白质组学分析，将为细胞周期研究开辟新的路径。蛋白质亚细胞定位的分类与周期性变化在细胞生物学的研究中，了解蛋白质在细胞内不同位置的分布及其变化是至关重要的。蛋白质的亚细胞定位不仅反映了其功能状态，还与细胞周期进程紧密相关。随着科技的进步，特别是高分辨率成像技术与生物信息学分析方法的结合，研究人员现在能够更精确地分类和监测蛋白质在细胞周期不同阶段的亚细胞定位及其周期性变化。蛋白质亚细胞定位的重要性蛋白质的功能依赖于其在细胞内的准确定位。例如，某些蛋白质仅在细胞核内活跃，而有的则在细胞膜附近发挥作用。这种分布特性不仅指示了蛋白质的功能，还涉及到蛋白质如何响应或调控细胞周期的变化。分类方法的进展随着深度学习等计算技术的发展，现在研究人员能够通过自动化的方法对蛋白质的亚细胞定位进行更为精细的分类。这些方法通常基于成像数据，通过识别蛋白质在细胞内不同结构上的分布模式来实现。这不仅提高了分类的精度，也为大规模的蛋白质定位研究提供了可能。蛋白质定位的周期性变化在细胞周期的不同阶段，蛋白质的定位可能会发生变化，反映出其功能的动态调整。通过监测这些变化，研究人员可以揭示蛋白质如何参与调控细胞周期进程，例如，某些蛋白质可能在细胞分裂时从细胞质迁移到细胞核，参与调控基因表达。监测方法的发展高通量成像技术结合自动化图像分析已成为监测蛋白质周期性定位变化的重要手段。这些技术能够连续跟踪单个细胞内蛋白质的定位，捕捉其在细胞周期中的动态变化。此外，结合单细胞测序等技术，研究人员能够从分子水平理解这些变化背后的调控机制。蛋白质浓度变化与细胞周期的关系细胞周期的精确调控是细胞生命活动的基石之一，蛋白质的浓度变化在这一过程中扮演着关键角色。随着细胞周期的进展，不同阶段对特定蛋白质的需求量会发生显著变化，这种动态的蛋白质浓度调整是细胞能够顺利完成生长、DNA复制、分裂等一系列复杂活动的前提。蛋白质浓度的周期性调节机制细胞周期中的蛋白质浓度调节涉及多个层面的机制，包括基因表达的调控、蛋白质的合成与降解以及分子间的相互作用等。这些机制共同作用，确保了蛋白质在细胞周期各个特定阶段以正确的浓度存在，从而促进细胞周期的有序进行。基因表达调控：通过转录因子和增强子等元件，细胞能够在不同周期阶段精准调控特定蛋白质基因的表达。蛋白质合成与降解：蛋白质的生物合成及其通过泛素-蛋白酶体系统的降解在维持蛋白质浓度方面起着关键作用。分子间相互作用：蛋白质之间的相互作用，如形成复合体或通过信号传导途径互作，也会影响蛋白质的稳态浓度。蛋白质浓度与细胞周期控制的关系在细胞周期的控制中，某些关键蛋白质的浓度变化尤为重要。例如，周期蛋白（Cyclins）和周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的浓度变化直接影响细胞周期的推进。周期蛋白的浓度在细胞周期的不同阶段呈周期性变化，其与CDKs结合，激活或抑制CDKs的活性，从而推动细胞周期的前进或停滞。G1阶段：在此阶段，细胞对环境进行评估，决定是否进入S阶段。相关蛋白质的浓度调整为细胞提供了必要的信号。S阶段：DNA复制发生在此阶段，对DNA复制和修复蛋白质的需求量显著增加。有丝分裂阶段：此阶段需要大量的细胞骨架蛋白和动力蛋白以支持染色体的分离和细胞的分裂。随着技术的发展，特别是质谱、流式细胞术、高通量测序等方法的应用，研究人员现在能够更精确地测定细胞内蛋白质的浓度，以及在细胞周期不同阶段蛋白质浓度的变化。这些技术的进步不仅加深了我们对细胞周期调控机制的理解，也为发现新的药物靶点提供了可能。基于Web的蛋白质组数据访问工具在现代生物医学研究中，蛋白质组学数据的获取与分析是理解细胞生理状态变化的关键步骤。特别是在细胞周期研究领域，准确地追踪和分析蛋白质的动态变化对揭示其生物学功能至关重要。随着科技的进步，基于Web的蛋白质组数据访问工具为科研人员提供了强大的数据处理能力，大大提高了研究的效率和深度。蛋白质组数据库与分析平台蛋白质组数据库：多个公共和私有数据库为研究者提供了丰富的蛋白质组学数据，包括但不限于UniProt、ProteomeXchange和PeptideAtlas。这些数据库收录了从不同细胞类型、不同生物种和不同细胞周期阶段收集的蛋白质组数据。分析平台：基于Web的蛋白质组分析平台，如MaxQuant、Skyline以及Proteome Discoverer等，提供了强大的数据分析工具，支持蛋白质鉴定、定量分析和数据可视化等功能。功能特点与应用这些工具的功能特点包括：用户友好的界面：即使是非程序员的生物学家也可以轻松地上传数据、进行分析和获取结果。高度可定制的分析流程：用户可以根据自己的研究需要选择不同的算法和分析路径。云存储与计算：基于Web的工具允许用户访问海量的存储空间和计算资源，无需在本地计算机上安装复杂的软件。数据共享与合作：研究人员可以轻松地与全球的同行分享数据和分析结果，促进科研合作。对细胞周期研究的影响在细胞周期研究中，基于Web的蛋白质组数据访问工具使得研究者能够：追踪细胞周期特定阶段的蛋白质表达变化：这对于理解蛋白质如何调控细胞周期进程至关重要。识别与细胞周期调控相关的关键蛋白质：通过比较不同细胞周期阶段的蛋白质组数据，研究者可以发现潜在的调控因子。探究蛋白质功能：结合其他生物信息学工具，研究者可以深入理解这些蛋白质在细胞周期调控中的具体作用。蛋白质定位与浓度调控的细胞周期阶段特异性G1阶段的蛋白质组特征在细胞周期的G1阶段，细胞准备进行DNA复制之前的一系列准备活动。这一阶段的蛋白质组特征尤其重要，因为它们调节细胞是否进入S阶段（DNA合成阶段），并影响细胞生长、分化及其后续的细胞周期过程。基于细胞周期对蛋白质功能的严格需求，G1阶段的蛋白质组表现出独特的动态变化和调控机制。G1阶段蛋白质的关键功能细胞周期调控因子：周期蛋白D和E型以及它们的激酶伙伴CDK4和CDK6在G1阶段起到关键作用，它们的活性变化直接决定了细胞是否继续向S阶段推进。生长因子信号传导：细胞在G1阶段响应外界生长因子的信号，通过MAPK和PI3K等信号通路，调节蛋白质合成和细胞生长。细胞应激反应：在G1阶段，细胞通过p53和其他应激响应蛋白监控DNA损伤和营养状态，确保细胞在合适的条件下进行分裂。G1阶段蛋白质表达的周期性变化G1阶段蛋白质组的周期性变化是通过精细调控的转录和翻译机制实现的。例如，周期蛋白D的表达受到生长因子刺激和营养状态的影响，而其降解则是通过泛素-蛋白酶体途径调控的。这种动态平衡确保了细胞在适当的时间准备进入S阶段。DNA复制过程中的蛋白质动态DNA复制是细胞周期中至关重要的一环，确保遗传信息的准确复制和传递。在这一过程中，蛋白质的动态调控起到核心作用，包括复制起始点的识别、复制叉的形成、以及DNA链的延伸。复制起始点的蛋白质调控起始复合物的形成：复制的第一步是在DNA上识别起始点并形成起始复合物。此过程涉及多种蛋白质，如ORC（起始识别复合物）、Cdc6、Cdt1以及MCM复合物。蛋白质的活性调控：Cdk和Ddk激酶对MCM复合物进行磷酸化，促进复制叉的形成和启动。这一步骤在细胞周期中受到严格的时间控制，确保DNA复制只在S阶段发生。复制叉的动态蛋白质网络复制叉的稳定性和延伸：DNA聚合酶、滑动夹子PCNA以及RFC复合物在复制叉的稳定性和连续延伸中起核心作用。同时，解旋酶如MCM2-7复合物负责解开DNA双螺旋，为复制提供单链模板。应对复制压力：当DNA复制遇到障碍时，Rad17、ATR、Chk1等蛋白质介导的应激响应被激活，以保护复制叉并修复损伤。复制完成后的蛋白质变化终止复制的机制：一旦DNA复制完成，需要去除与DNA复制相关的蛋白质，以及重置复制起始点。此过程涉及到多种蛋白酶和泛素化反应，如Cdc20和APC/C的活化。确保复制完整性的机制：复制完成后，细胞利用Mismatch Repair（MMR）和Homologous Recombination（HR）等机制，检查和修复可能出现的复制错误，确保DNA复制的准确性和完整性。有丝分裂阶段的蛋白质组变化有丝分裂是细胞周期中至关重要的一个阶段，涉及到一系列精密调控的蛋白质动态变化，以确保染色体正确分离并平等地分配给两个子细胞。有丝分裂的启动促进有丝分裂复合物（CPC）的激活：有丝分裂的启动首先需要CPC的激活，其中包括Aurora B激酶和其伴侣蛋白，它们对细胞骨架和染色体凝聚蛋白进行磷酸化，为染色体准备进行正确分离打下基础。SPB和动态微管的重组：细胞极体（SPB）的复制和分离，以及动态微管的快速重组，为染色体分离和细胞质分裂提供物理基础。染色体的准确分离凝聚素复合体的解除：有丝分裂进入中期，凝聚素复合体被逐步降解，使得姐妹染色体能够分离。分离酶的作用：分离酶Securin的降解释放活化的分离酶Separase，后者切割凝聚素，触发染色体的分离。细胞质分裂与蛋白质变化收缩环的形成与作用：在细胞中部形成的肌动蛋白和肌球蛋白构成的收缩环，在有丝分裂末期通过收缩作用导致细胞质分裂。蛋白质降解与重塑：随着细胞进入下一个周期，需要对有丝分裂相关蛋白进行降解和重塑，以保证细胞周期的正确进行。这一过程涉及泛素-蛋白酶体系统的广泛参与。细胞周期退出与复位的蛋白质组特性细胞周期的退出与复位是生物细胞精确控制生长、分裂和死亡的关键环节。在这一过程中，蛋白质组的动态变化起着至关重要的作用。细胞周期退出的调控机制周期依赖性激酶抑制因子的作用：细胞周期的退出通常伴随着周期依赖性激酶（CDK）活性的下降。CDK抑制因子（如p21、p27和p57）的表达增加，是导致CDK活性下降的主要机制之一，从而推动细胞退出分裂周期。E3泛素连接酶的角色：特定的E3泛素连接酶如Skp2和Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC/C)在蛋白质降解中发挥关键作用，它们标记特定的周期性蛋白质进行泛素化，促进其降解，进一步促进细胞周期的退出。细胞复位与再次进入周期的准备细胞复位机制的重要性：细胞在特定条件下可重新进入细胞周期。这需要蛋白质组复位，包括降解已经激活的蛋白质，重新积累周期进程初期所需的蛋白质。转录调控因子的作用：如E2F家族，其活性在细胞周期退出与复位过程中经历动态变化，控制着与细胞周期进程相关的基因表达。生物医学意义疾病治疗：了解细胞周期退出与复位的蛋白质组特性，对于癌症治疗尤其重要。许多肿瘤抑制蛋白（如p53和Rb蛋白）通过调节细胞周期退出来抑制肿瘤生长。因此，针对这些蛋白质路径的靶向治疗策略具有潜在的临床价值。组织再生与修复：细胞周期的有效控制是组织再生和修复的基础。通过调节细胞周期退出与复位的蛋白质组特性，可能促进受损组织的恢复，为再生医学提供新的研究方向。细胞周期进程中的蛋白质组-亚细胞器连接性蛋白质组动态揭示的细胞内通讯在细胞生命活动中，蛋白质组的动态变化不仅反映了细胞自身状态的变化，更是细胞内外通讯的重要媒介。蛋白质组与信号传递信号传递途径：细胞内通讯依赖于信号传递途径，其中蛋白质如激酶、磷酸酶和转录因子等扮演着关键角色。这些蛋白质的活性和定位变化直接影响信号传递途径的激活或抑制，从而调控细胞行为。蛋白质修饰：磷酸化、泛素化等蛋白质后修饰是细胞内通讯的重要机制。这些修饰影响蛋白质的稳定性、活性及亚细胞定位，进而影响细胞信号传递的效率和特异性。细胞周期中的蛋白质组动态周期性变化：在细胞周期的不同阶段，特定蛋白质的表达水平和活性发生周期性变化，如周期蛋白和CDK激酶。这些变化对于细胞周期的精确调控至关重要。细胞应答：细胞对外界信号的响应，如生长因子、应激信号等，通过调节蛋白质组的组成来实现。这些响应确保细胞在适当的环境条件下进入下一细胞周期阶段。蛋白质组在细胞内通讯中的作用信息集成中心：蛋白质组不仅作为信号的发出者和接收者，还充当信息集成中心，将不同信号途径的信息汇聚，以产生协同或拮抗的效应，从而细致调控细胞行为。调节细胞行为：通过调节细胞周期进程、细胞分化、细胞迁移等，蛋白质组动态变化在细胞内通讯中扮演着核心角色。例如，细胞周期进程中蛋白质的定时表达和降解是细胞能够按需增殖或暂停增殖的基础。特定蛋白质在细胞周期不同阶段的局部化变化细胞周期的精确调控依赖于蛋白质的周期性表达及其在细胞内的精确定位。蛋白质局部化的周期性变化G1阶段：在G1阶段，细胞大小和营养状况的监测依赖于位于细胞膜和细胞质的信号分子。例如，生长因子受体在细胞膜上的集聚是细胞进入下一周期的前提条件。S阶段：DNA复制期间，复制叉附近特定的蛋白质如PCNA（增殖细胞核抗原）的集中，确保了DNA复制的精确性和效率。G2阶段：在G2阶段，细胞检查DNA复制是否完整，此时DNA修复蛋白的定位变化对于维持基因组稳定性至关重要。M阶段：有丝分裂期间，染色体凝聚蛋白、动态丝蛋白等的特定定位对于姐妹染色体的正确分离和细胞器的分配至关重要。蛋白质定位变化的调控机制蛋白质修饰：磷酸化、泛素化等后修饰影响蛋白质与其他分子的相互作用，进而改变其在细胞内的定位。信号传递网络：细胞内多条信号传递途径参与调控蛋白质的定位，如MAPK信号通路在调节细胞应对环境压力时，会影响多种蛋白质的定位。细胞骨架的动态变化：细胞骨架的重组也是调节蛋白质定位的重要机制，尤其是在细胞迁移和细胞分裂过程中。局部化变化对细胞周期的影响细胞周期的推进：特定蛋白质在细胞周期不同阶段的局部化变化是细胞周期推进的重要机制之一，如周期素依赖性激酶的激活和抑制。细胞应答与调控：通过局部化变化，蛋白质能够在细胞内形成临时的信号复合体，快速响应外界信号，调节细胞生理状态。蛋白质周期性局部化变化的功能意义在细胞周期进程中，蛋白质周期性局部化变化不仅是一种普遍现象，也承担着重要的生物学功能。这些变化使得蛋白质能够在特定的时空环境中发挥作用，对细胞的生命活动和细胞周期的顺利进行至关重要。确保细胞周期的有序进行：通过在特定阶段精确调控蛋白质的局部化，细胞能够保证各个周期事件发生的顺序性和准确性，避免不必要的错误。调节细胞生理状态：蛋白质的局部化变化影响其活性和功能，从而调节细胞的生理状态，如细胞分化、增殖和程序性细胞死亡。参与信号传递：蛋白质在特定细胞区域的集中，如细胞膜上的受体聚集，能够有效地传递外部信号，启动细胞内的应答机制。维持细胞架构稳定性：结构蛋白在细胞骨架和细胞器定位的变化，对于维持细胞形态和内部架构的稳定性具有重要作用。具体实例核糖体蛋白的核质转运：在细胞周期的G1阶段，核糖体蛋白从核内向细胞质转运，参与蛋白质合成，为DNA复制提供物质基础。周期蛋白及其激酶的核定位信号（NLS）的变化：周期蛋白依赖性激酶（CDK）在细胞周期的不同阶段通过NLS的掩盖或暴露，实现核内外的定位转变，精确调控细胞周期。细胞分裂时期的染色体定位：在有丝分裂期间，染色体通过与纺锤体的动态相互作用确保等分到两个子细胞中，此过程依赖于蛋白质在特定时期的正确定位。研究的主要发现与意义主要发现蛋白质周期性表达与调控： 该研究首次绘制了细胞周期中蛋白质表达的全面图谱，揭示了关键蛋白质如何在不同细胞周期阶段通过量的变化和定位的改变来实现精准调控。细胞周期阶段间的蛋白质互动：研究突破性地揭示了细胞周期不同阶段间蛋白质的相互作用和转移路径，对理解细胞生命活动的内在机制提供了新视角。高通量成像技术在蛋白质组学中的应用： 利用先进的成像技术，该研究实现了对细胞内蛋白质动态的高分辨率观察，为蛋白质组学研究提供了强有力的技术支持。科学意义对基础生物学的贡献： 该研究深化了我们对细胞周期调控机制的理解，为解答生命科学中的基本问题提供了关键线索。疾病治疗的潜在应用：细胞周期的异常调控与多种疾病密切相关，特别是癌症。该研究中发现的关键蛋白质和调控路径可能成为未来治疗策略的新靶点。激发未来研究：通过提供全面的数据集和新的分析方法，该研究为细胞周期的深入研究铺平了道路，同时也为相关领域的研究者提供了宝贵的资源。对细胞周期蛋白质组学未来发展的展望细胞周期蛋白质组学的未来发展蕴藏着巨大的潜力和挑战。随着技术的进步，我们预期将在以下几个方向实现重大突破：深度集成分析：结合转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据，实现细胞周期调控网络的更全面理解。单细胞分析技术的应用：通过高精度单细胞分析，揭示细胞周期内部差异性和细胞间异质性，为个性化医疗提供依据。动态蛋白质组学： 利用实时成像和动态标记技术，捕捉细胞周期中蛋白质的瞬时动态和互作关系。数据处理和可视化：发展先进的数据处理算法和交互式可视化工具，以更直观地呈现复杂的蛋白质组数据。Q&A细胞周期中不同阶段的关键蛋白质有哪些？细胞周期的每个阶段都由特定的关键蛋白质组合控制。在G1期，蛋白质如Cyclin D和CDK4/6起主导作用，负责细胞生长和准备DNA复制。进入S期，Cyclin E和CDK2则促进DNA复制的开始。G2期则由Cyclin A和CDK2控制，它们确保DNA复制的完整性。最后，在M期，Cyclin B和CDK1组合调控细胞的分裂过程。如何利用高通量成像技术研究蛋白质定位的周期性变化？高通量成像技术是研究蛋白质定位变化的强大工具。这一技术结合了荧光显微镜和自动化图像分析，能够实时监测和记录细胞内特定蛋白质的位置变化。通过使用具有荧光标记的蛋白质，可以精确观察这些蛋白质在细胞周期不同阶段的动态定位。此外，结合定量分析软件，研究人员能够对大量细胞进行定量测量，从而获得统计意义上的定位变化数据。蛋白质组动态如何影响细胞周期的正常进行？蛋白质组动态在维持细胞周期的正常进行中起着至关重要的作用。各种蛋白质的周期性表达、激活和降解是控制细胞周期阶段转换的关键因素。例如，在DNA复制的S期，需要特定蛋白质的集合来确保DNA复制的准确性；而在M期，不同的蛋白质组合则促进染色体的准确分配和细胞的分裂。因此，蛋白质组的动态调整对于细胞周期的每个阶段都是必不可少的。细胞周期的调控在疾病治疗中的潜在应用是什么？细胞周期的调控在疾病治疗中具有巨大的潜在应用价值。例如，在癌症治疗中，针对特定的细胞周期蛋白质（如CDK抑制剂）的药物可以抑制癌细胞的生长和增殖。此外，通过了解细胞周期蛋白质的动态变化，可以更好地理解疾病的发病机制，从而开发出更为精准的治疗策略。酵母细胞周期的研究对理解人类细胞周期有哪些帮助？酵母作为一种模型生物，在研究细胞周期方面提供了许多重要的见解。酵母细胞的基本细胞周期调控机制与人类细胞非常相似，因此通过研究酵母细胞周期中的关键蛋白质和调控途径，可以帮助我们更好地理解人类细胞周期的调控机制。这些研究为治疗相关疾病（如癌症）提供了宝贵的基础知识。参考文献https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.02.014Litsios A, Grys BT, Kraus OZ, et al. Proteome-scale movements and compartment connectivity during the eukaryotic cell cycle. Cell. Published online March 1, 2024. doi:10.1016/j.cell.2024.02.014责编|探索君排版|探索君转载请注明来源于【生物探索】End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述