CD37 x CD20

摘要：双特异性抗体（bpAbs）能够结合抗原上不同且不重叠的表位。这种独特的结合模式使得bpAbs除了单特异性抗体和双特异性抗体（bsAbs）之外，还能发挥新的机制作用，使其成为多种适应症（包括肿瘤学和传染病）的有效治疗手段。双特异性结合可以带来更高的亲和力和特异性，促进拮抗作用，锁定目标构象，并导致高阶目标聚集。这些抗体-目标复合物可以引发强烈的激动作用，增强免疫效应功能，或导致目标快速下调调节和溶酶体转运。这些特性不仅对治疗性抗体具有吸引力，而且越来越多地被探索用于其他模式，如抗体-药物偶联物、T细胞接合器和嵌合抗原受体。近期在bpAb工程上的进展已经使得构建越来越复杂的格式成为可能，这些格式开始在临床上显示出希望。 1.引言 在2022年美国新批准的药物中，抗体疗法占了30%。在开发中的抗体中，观察到高度工程化分子的数量显著增加，包括双特异性抗体（bsAbs）。双特异性抗体（bpAbs）是bsAbs的一个子集，对同一分子靶标的特有、不重叠的表位具有特异性。这种独特的结合模式建立于30多年前，能够实现差异化的作用机制（MoAs）。在过去十年中，随着临床试验中首次取得成功，bpAbs的治疗潜力已变得明显。这些开创性的分子为当今临床开发中越来越多的bpAbs铺平了道路（表1）。本综述提供了bpAbs的不同格式和MoAs、当前的临床管线和前景的概述。 2.双特异性格式 在抗体发现和工程方面的进展使得组装针对不同表位的结合域的bpAb格式越来越复杂，这些格式采用不同的架构。格式的选择取决于目标生物学和提议的MoA。关键的设计考虑因素包括目标表位、单个结合域的数量和性质、半衰期延长和效应功能介导域的添加，以及确保所有域正确组装成功能性bpAb的策略。后者可以简单到将单个域与灵活的链接器串联在一个单一蛋白中，或者在含有结晶片段（Fc）域的bpAbs中，取决于多达四个不同蛋白与相应的引导突变在重链（HCs）和轻链（LCs）中的配对。预测有效的表位对是困难的，无论是通过理性设计还是通过抗体混合物。因此，能够高效地生成和筛选给定bpAb格式中的大量表位对矩阵是关键。除了功能性和可行性之外，在选择bpAb格式时，开发性考虑至关重要。早期对bpAbs的生物物理责任进行测试可以减少动物研究和临床试验中失败的风险。同样，bpAb格式的选择可能影响下游制造和质量控制，因为bpAb格式复杂性可能导致不良的开发性或由于bpAb格式复杂性导致的错配副产品。 迄今为止在临床上测试的bpAbs不仅具有多样的格式，而且还涉及大量单个结合域（图1）。单链抗体格式，如单域抗体（sdAbs）和单链可变片段（scFvs）特别容易在双特异性格式中配对。因此，首批进入临床的两种bpAbs，ALX-0651和BI 1034020，由串联的sdAbs组成。基于抗体片段的bpAbs通常在循环中的半衰期较短，需要进一步工程化以提高暴露量。小尺寸使sdAbs成为嵌合抗原受体（CARs）的理想构建块，如双特异性CAR-T疗法ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel）和OriCAR-017所突出的。 迄今为止在临床上测试的大多数bpAbs具有更规范的、含有Fc的架构，可以根据HC轴的对称性进行分类（图1）。对称bpAbs由相同的HC或HC/LC对组成，而不对称分子由具有不同结合域的不同半部分组成。四价分子MEDI4276和BAT2022是对称bpAbs的例子。 图1. 在临床试验中评估的双特异性抗体结构。条纹域代表常见的轻链VL或IgG4 Fc。REGN5093-M114每个抗体平均含有3.2个非特异性结合的药物。MBS301不包含增强六聚体化的突变；*药物与抗体的比例和结合位点与所示示例不同。 对称型双特异性抗体（bpAbs）由相同的重链（HC）或重链/轻链（HC/LC）对组成，而不对称型分子则由不同的两半组成，具有不同的结合域。四价分子MEDI4276和BAT2022是对称型bpAbs的例子，具有2+2的价数（每个整数描述分子中存在的相同亲和位点的数量），并且单链可变区片段（scFv）或单域抗体（sdAb）分别附加在HC的N端或C端。 另一方面，KN060是一个对称型双特异性抗体，具有串联的sdAb臂，没有轻链。类似于KN060，三特异性抗体TAVO412通过串联的sdAb臂实现双亲和位点靶向，该臂嵌入在更复杂的不对称格式中。 不对称型双特异性抗体通常依赖于Fc突变，以促进双特异性抗体产品的纯化或指导异二聚体形成。例如，REGN5093的两个HC被设计成对蛋白A具有不同的亲和力，允许纯化异二聚体产品。 另一方面，GEN3009是一个不对称型双特异性抗体，具有Fc域导向突变，确保两个不同的HC正确配对。除了HC异二聚体外，正确的LC配对对不对称型双特异性抗体来说可能是一个挑战。在GEN3009的例子中，通过两个亲本抗体的温和体外反应实现正确的配对，允许HC重组而不打乱原始的LC配对。REGN5093展示了一种避免LC配对问题的整体策略，它由两个不同的HC与两个相同的LC配对组成。这些共同的LC可以直接从具有定义的LC多样性的发现平台中获得，如REGN5093的例子，或者从现有的LC中工程化，如anbenitamab和GR2002。 ISB 1442和SAR441236是不对称型双特异性抗体的例子，它们通过增加Fab或scFv结构域扩展了免疫球蛋白G（IgG）结构，分别实现更高的价数，甚至在SAR441236的情况下实现三亲和位点结合。较小的不对称格式，如基于片段-Fab的zanidatamab或基于片段的TNB-738也可以被利用。Zanidatamab将scFv结构域与完整的Fab臂配对，而TNB-738从两个sdAb中衍生出其结合臂，并添加了一个惰性的LC以便于制造。除了免疫球蛋白折叠，双亲和位点设计的ankyrin重复蛋白（DARPin），MP0274，突出了替代框架的潜力。 Labrijn等人全面回顾了所有双特异性格式。 图2. 双特异性抗体的作用机制。(a) 双特异性抗体在顺式或反式中的强靶标结合的示意图。双特异性抗体可以解锁新的生物学活性，例如 (b) 双通路抑制，(c) 锁定外域在酶学上不活跃的状态，或 (d) 双特异性受体靶向以形成更高阶的复合物并引发激动作用。 (e) 另外，双特异性抗体在反式中的结合可以导致受体和Fc结构域聚集，从而快速内化和溶酶体运输或强烈的效应功能，特别是补体依赖的细胞毒性。 3.双特异性抗体的作用机制 3.1.双亲和位点靶向通过亲和力增强结合 与同一目标上的两个不同、不重叠的表位结合，导致双特异性抗体与其它抗体相比具有独特的属性。许多双特异性抗体显示出比它们的单亲和位点亲本抗体更强的结合力和更慢的解离速度。这是由于对同一（顺式）或不同（反式）目标分子上的两个不同表位的亲和力结合。亲和力定义为单个分子通过多个非共价相互作用的组合以及一旦建立了第一次相互作用，结合和重新结合事件的可能性增加。 针对不同表位的抗体片段可以通过亲和力链接来增加目标亲和力，如基于sdAb的、临床评估的双特异性抗体ALX-0651和BI 1034020所强调的。与单价或双价单克隆抗体（mAbs）相比，双特异性抗体的解离可以显著更慢，使它们成为优越的拮抗剂、反向激动剂或反向拮抗剂。顺式结合形成1:1的双特异性抗体目标复合物对于这些应用来说可能很重要，以避免不需要的激动剂活性。 除了表位选择，结合域的几何排列、sdAb连接优化和亲和力调节对于实现期望的作用机制（MoA）和最大化效果至关重要。Kast及其同事证明，结合域的几何形状对于人表皮生长因子受体2（HER2）的双特异性及四价融合蛋白的拮抗作用至关重要，某些配置显示出激动剂活性。同样，针对表皮生长因子受体（EGFR）的三价抗纤维连接蛋白融合蛋白的不同结构在受体下调中显示出不同的效果。对于基于sdAb的拮抗剂，最佳的取向和连接属性可以通过顺式结合实现超高亲和力。最后，临床双特异性抗体ISB 1442依赖于仔细调节的CD38和CD47亲和力以减少靶向毒性。ISB 1442的抗CD47 Fab已被设计为弱亲和力，以实现对CD47阳性红细胞的最小反应性。高亲和力的双特异性抗CD38臂能够在CD38低表达的肿瘤细胞上实现强烈的目标参与和高特异性。 双特异性抗体的高亲和力和缓慢解离也适合于招募免疫细胞。例如，刘及其同事通过融合两个针对不重叠表位的sdAbs与一个抗CD3 Fab，设计了一种T细胞结合抗HER2双特异性抗体。得到的构建物在HER2阳性细胞上的结合比相应的单特异性亲本分子增加了30倍，并在体内HER2低表达模型中显示出优越的肿瘤抑制活性。同样，Rennert等人设计了一种针对C型凝集素结构域家族12成员A（CLEC12A）的双特异性桥接蛋白，该蛋白由其分泌并招募抗CD19 CAR-T细胞。双特异性靶向实现的高亲和力导致增强的抗CD19 CAR-T细胞毒性。由于sdAbs的小尺寸，CAR可以直接配备双特异性抗体，如cilta-cel和OriCAR-017所示。这些CAR的高亲和力双特异性结合可以实现增强和持久的效果。如上所述，对于基于sdAb的拮抗剂，仔细选择表位和连接优化可能是关键。3.2.双特异性抗体能够实现双途径抑制，并且可以锁定受体和外酶的构象 结合两个不重叠的表位可以为双特异性抗体（bpAbs）解锁独特的活性。例如，通过针对低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）的双特异性抗体实现了双通路抑制，同时阻断Wnt1和Wnt3a介导的β-连环蛋白信号通路，显著地没有激动剂活性。 或者，双特异性抗体可以通过物理限制其靶标来使其失活。针对HER2的双特异性DARPin的晶体结构揭示了结合和扭曲两个HER2受体，阻止了与EGFR家族成员形成具有信号能力的二聚体。 此外，针对CD38和CD73的双特异性抗体，包括临床双特异性抗体TNB-738，被证明通过将各自的细胞外结构域锁定在催化非活性状态来作为酶抑制剂。 尽管单独的亲本抗体没有显示出任何活性，但针对CD73的双特异性抗体具有亚纳摩尔级的活性，并实现了超过90%的抑制。 双特异性抗体可以形成免疫复合物，导致激动剂活性、快速目标内化、溶酶体运输和改善的免疫效应功能。 双特异性抗体的一个独特特性是它们能够通过同时在反式中结合两个不重叠的表位来形成高阶免疫复合物。目标交联是多种作用机制的基础，包括增强的激动剂活性、Fc介导的效应功能或清除可溶性目标以及受体下调。 双特异性抗体的聚集可以促进激动剂活性，特别是对于依赖交联以实现有效下游信号传导的受体。 双特异性抗体也可能独特地激活多组分受体复合物。例如，Shi等人设计了一种针对β-klotho的两个不同表位的双特异性抗体，β-klotho是成纤维细胞生长因子受体1c（FGFR1c）的共受体。 双特异性靶向既必要又足以引发强大的激动剂活性。双特异性抗体通过双特异性抗体增加Fc结构域的局部浓度，从而可以改善效应功能。 这种效应已在被单克隆抗体靶向的多价复合物中观察到，例如被治疗性单克隆抗体利妥昔单抗靶向的B细胞标记CD20。 双特异性抗体的结合可以扩展这种机制到更多的目标。例如，zanidatamab形成的大HER2聚集被证明比亲本单克隆抗体的组合导致更强的补体依赖性细胞毒性（CDC），这是由于Fc结构域的预组织和C1q沉积的增加。 这种效应在引入六聚体增强点突变的Fc结构域的针对CD37的双特异性抗体GEN3009中进一步放大。 尽管Fc聚集的效果不那么明显，但双特异性抗体已被证明也可以通过增加与自然杀伤（NK）细胞上的FcγRIII受体的结合来改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。 类似地，通过针对白细胞介素6（IL6）的双特异性抗体聚集，增加了Fcγ受体在吞噬细胞上的结合，并促进了可溶性目标的快速清除。 交联的受体筏已被证明可以迅速内化并运输到溶酶体，导致目标的快速下调。 值得注意的是，交联效率及其相关效应可能取决于表位选择以及双特异性抗体：目标几何形状。 快速内化和溶酶体运输使双特异性抗体成为抗体药物偶联物（ADCs）中越来越受欢迎的构建模块，它们推动了肿瘤输送和细胞毒素有效载荷的细胞内释放，如MEDI4276、REGN5093-M114和zanidatamab zovodotin所示。 与单特异性药物相比，针对叶酸受体α（FRα）的双特异性ADC IMGN151显示出优越的有效载荷输送。 由于这种效应与细胞表面FRα密度无关，人们推测IMGN151增加的有效载荷输送是通过增强FRα阳性细胞上的结合事件而不是聚集，这应该随着受体密度的增加而减少。然而，这两种机制并不是相互排斥的，需要进一步的研究来阐明IMGN151的作用机制。3.3.同时结合不同的表位可以克服抗性机制 在治疗病毒感染中常见的挑战是找到一种广泛中和抗体（bnAb），它结合在衣壳蛋白的保守区域，并产生持久的反应。单价抗体可以针对保守区域，但容易受到突变逃逸的影响，因为它们对病毒施加了选择性压力。类似于小分子药物的鸡尾酒疗法，bnAbs的组合已被证明通过降低单次突变逃逸变体的机会，有效减少单药治疗的抗性。 双特异性广泛中和抗体结合了鸡尾酒疗法的临床益处和单一药物剂量使用的便利性，使它们成为开发中令人兴奋的领域。 针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的双特异性广泛中和抗体BAT2022，被证明能够结合所有主要的关注变体，包括一个不再被一个亲本抗体识别的受体结合域（RBD）突变体。 对于HIV，三特异性广泛中和抗体SAR441236和几个临床前分子通过针对病毒衣壳蛋白上的多个表位显示出前景。 防止抗性的多价靶向对于肿瘤相关抗原（TAA）的靶向也可能是临床上有用的。肿瘤细胞可以通过选择性剪接消除靶向的表位。人们推测，双特异性CAR-T细胞可以通过同时针对两个表位来防止肿瘤逃逸。 虽然进一步的机制研究将很重要，但这对于癌症免疫疗法是一个有趣的前景。虽然概念上不同，Spangler和同事证明了针对EGFR的三特异性靶向可以恢复对西妥昔单抗耐药的异种移植模型的疗效，这些模型在下游信号通路中有突变。 最有效的三特异性构建物实现了单独使用双特异性或单特异性构建物无法实现的受体下调水平。3.4.治疗应用和模式 迄今为止，大多数双特异性抗体已开发用于肿瘤学应用，并且随着cilta-cel的批准，首个基于双特异性抗体的细胞疗法已获批用于复发和难治性多发性骨髓瘤。 许多其他双特异性抗体目前正在早期临床试验中，用于血液癌症的治疗，包括ISB 1442和OriCAR-017，它们都处于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤的I期。 对于实体瘤的治疗，许多双特异性抗体针对HER2，HER2是一种受体酪氨酸激酶，涉及包括细胞增殖在内的多种细胞功能。在20-25%的乳腺癌患者中观察到HER2的高水平过表达。 通过结合临床单克隆抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗靶向不重叠的结构域IV和II，分别针对两个不同的HER2表位，以前已被证明可以显著改善治疗结果和预后。 HER2的重要性和双表位靶向的临床先例可能解释了管线中大量的抗HER2双特异性抗体，包括anbenitamab和zanidatamab，这是两个最先进的针对HER2的双特异性抗体。 其他杰出的肿瘤学靶标也通过双特异性抗体进行追求，包括通过REGN5093（-M114）和IMGN151分别针对间充质-上皮转化因子（MET）和叶酸受体α（FRα）。 在肿瘤学之外，临床候选药物SAR441236和BAT2022突显了双特异性抗体在传染病中的潜力。阻碍广泛实施针对急性感染的bnAbs的一个挑战是逃逸变体的出现，正如最近的SARS-CoV-2大流行所说明的那样。 针对单一表位的单克隆抗体只在突变逃逸变体发展并广泛传播之前有效，这使得既定的疗法无效。针对多个表位的bnAbs，如针对SARS-CoV-2的双特异性抗体BAT2022或针对HIV的三特异性抗体SAR441236，可以克服急性和慢性疾病中单突变逃逸变体的出现，允许持续使用和更持久的患者反应。 大多数临床双特异性抗体作为裸抗体发挥作用，以治疗病毒感染，通过相应的受体抑制或促进细胞信号传导，或者如TNB-738通过抑制酶活性。越来越多地，双特异性抗体被用于作为ADCs的一部分进行有效载荷输送，因为它们独特的作用机制促进了内化和溶酶体运输，如上所述。目前有六种双特异性ADC正在临床评估中，其中三种也在作为裸双特异性抗体进行研究。此外，双特异性抗体的高亲和力和选择性使其成为工程化高效T细胞招募者和CARs的有吸引力的选择。 在本节中，我们讨论了已在临床中进行测试或正在测试的双特异性抗体的结构、作用机制和活性，这些分子的数据是可用的。3.5.ALX-0651 Ablynx的ALX-0651，一种针对CXCR4的双特异性串联单域抗体，是第一个针对GPCRs的临床使用的生物制剂，并且据我们所知，是第一个进入临床的双特异性抗体（2011年）。虽然ALX-0651的单个单域抗体构建模块显示出中性拮抗剂活性，但双特异性ALX-0651不仅显示出更高的亲和力，而且还显示出针对CXCR4的反向激动剂活性。 临床前数据表明ALX-0651在阻断CXCR4介导的病毒进入以及诱导快速干细胞动员方面是有效的。尽管临床前数据支持开发，但由于缺乏对标准护理的优越性，ALX-0651已被终止。3.6.BI 1034020 BI 1034020是由Ablynx和勃林格殷格翰开发的一种双特异性、半衰期延长的串联单域抗体。这种双特异性抗体针对大脑中淀粉样蛋白β（Aβ）的两个独立表位，旨在用于阿尔茨海默病的治疗。BI 1034020的I期研究于2013年开始，但在发生与药物相关的严重不良事件后被终止。3.7.MEDI4276 MEDI4276是由Medimmune开发的一种针对HER2的抗体药物偶联物（ADC），于2015年进入临床。MEDI4276由一种基于曲妥珠单抗scFv的四价双特异性抗体组成，该抗体靶向HER2的域IV，并在mAb 39S的重链N端融合，后者靶向域II。这种双特异性抗体向HER2过表达的肿瘤细胞输送四个位点特异性结合的tubulysin有效载荷，在那里ADC被内化并运输到溶酶体以释放细胞毒素。与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合不同，MEDI4276可以交联受体，从而实现快速内化和通过将HER2从循环重定向到溶酶体降解，有效实现细胞质输送。异种移植肿瘤模型显示，MEDI4276对HER2低表达肿瘤以及对ado-trastuzumab emtansine耐药的肿瘤都具有高效性，从而满足了高度未满足的医疗需求。在I期剂量递增研究中，MEDI4276在HER2阳性乳腺癌和胃癌中显示出临床活性，但最终由于不利的毒性概况而被终止。3.8.西他卡苯自溶 Ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel），据我们所知，是迄今为止第一个也是唯一一个获批的基于双特异性抗体的治疗。cilta-cel最初由Legend Biotech开发为LCAR-B38M，是一种第二代自体CAR-T疗法，特点是具有两个单域抗体的双特异性外结构域，这些单域抗体针对B细胞成熟抗原（BCMA）的不同表位。双特异性靶向实现了比单特异性构建更高的亲和力结合和卓越的功效。基于CARTITUDE-1 Ib/II期研究（NCT03548207）的深度和持久反应以及可管理的安全性概况，cilta-cel在2022年获得批准。总体反应率高达97.9%，甚至高于初始I期研究（NCT03090659）观察到的87.8%。有趣的是，cilta-cel的批准仅在idecabtagene vicleucel（ide-cel）批准后的一年，ide-cel是一种具有单特异性BCMA靶向的类似CAR-T疗法。虽然应该谨慎比较各自的临床试验，但双特异性cilta-cel似乎在反应率和反应持续时间方面都优于单特异性的ide-cel。3.9.Zanidatamab和zanidatamab zovodotin Zanidatamab（ZW25）是一种由Zymeworks专有的Azymetric Fc平台衍生的双特异性抗体，它结合了一个针对HER2域IV的scFv和识别域II的Fab臂。Zanidatamab跨细胞膜结合两个HER2分子，引起细胞膜上受体的明显重组。除了快速内化和下调外，Fc结构域的聚集引起了强烈的补体依赖性细胞毒性（CDC），这在曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或它们的组合中是观察不到的。双特异性HER2结合在体内异种移植模型中显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合更优越的抗肿瘤活性。Zanidatamab在具有不同HER2表达水平的多种肿瘤患者中显示出安全性。目前正在进行多项临床试验，包括针对乳腺癌的II期试验(NCT04224272)和针对晚期胃食管腺癌的III期试验(NCT05152147)。Zanidatamab也在探索用于输送细胞毒性微管抑制剂。这种双特异性ADC，zanidatamab zovodotin(ZW49)，已被证明是免疫原性细胞死亡标志物的强诱导剂，并且对一系列HER2表达水平的乳腺癌和胃癌患者衍生的异种移植模型非常活跃。目前正在进行I期临床试验(NCT03821233)。3.10.MP0274 由Molecular Partners开发的MP0274通过DARPins实现双特异性HER2靶向，DARPins是可像串珠一样串联的替代框架。四价MP0274分子包含一个分别针对HER2域I和IV的DARPin，以及两个用于延长半衰期的人类血清白蛋白结合域。像基于IgG的抗HER2双特异性抗体一样，MP0274交联HER2受体，在各种HER2阳性细胞系和小鼠模型中显示出与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合相当的抗肿瘤活性。然而，MP0274可能通过稳定AKT调节的叉头转录因子FOX03a导致诱导凋亡，展现出独特的作用机制。在HER2阳性实体瘤患者的I期研究中，MP0274显示出良好的暴露和有利的安全性概况。一位先前接受过曲妥珠单抗和帕妥珠单抗治疗的转移性乳腺癌患者对MP0274显示出持续反应，确立了临床概念验证。回顾性生物标志物分析揭示，这位患者是唯一一个携带HER2阳性、PI3K野生型遗传标志的患者，且在最高剂量水平，这表明在良好的MP0274暴露下，患者选择可能导致更高的反应率。然而，由于战略原因，MP0274的进一步临床开发已被停止。3.11.Anbenitamab和JSKN003 Alphamab Oncology基于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗设计了一种双特异性HER2靶向抗体anbenitamab(KN026)。通过组合旋钮-入-孔和静电导向突变实现了相应HCs的异二聚体Fc配对。基于HER2相互作用残基的结构阐明，设计了一种可以与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗HC分别有效配对的通用LC。由安进公司开发的双特异性抗体anbenitamab显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合更强的抗肿瘤活性，这一效果在不同HER2水平的多种肿瘤细胞系中均有体现，并且在小鼠模型中活性相当。初步特性分析表明，anbenitamab保留了其亲本单克隆抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），同时能够同时结合HER2的两个不同表位。anbenitamab于2018年进入临床试验，并在至少接受过一线治疗（包括曲妥珠单抗）的晚期转移性乳腺癌患者中显示出良好的安全性。 在第二项临床试验中，anbenitamab在HER2表达的晚期胃癌和胃食管结合部癌患者中表现出良好的耐受性。基于初步的积极活性，anbenitamab目前正在进行多项临床试验的评估，包括两项注册研究：作为HER2阳性晚期或转移性胃癌的二线治疗（NCT05427383），以及作为HER2阳性复发或转移性乳腺癌的一线治疗（NCT05838066），两者均与化疗联合使用。将anbenitamab与拓扑异构酶I抑制剂结合，得到了双特异性抗HER2抗体药物偶联物JSKN003，目前正在进行首次人体I期研究，针对晚期实体瘤（NCT05494918）。 3.12.额外的HER2靶向bpAbs 此外，MBS301、BCD-147、TQB2930和KM257是基于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的四种额外的临床阶段抗HER2双特异性抗体。MBS301结合了曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的去岩藻糖化半抗体，它们在工程CHO细胞系中分别生产，并通过体外使用结-洞突变异二聚体化。从Fc结构域中去除岩藻糖可以增强ADCC活性，结合双特异性靶向，可在不同HER2水平的肿瘤细胞系中以及在小鼠模型中产生强大的活性。目前正在进行一项I期临床研究（NCT03842085），评估MBS301用于治疗HER2阳性复发或转移性恶性实体瘤的效果。Biocad的BCD-147采用了一种不对称scFv-Fab格式，并已在健康志愿者中进行了I期研究（NCT03912441）。结构相似的TQB2930由泰国天晴药业开发，正在研究用于HER2阳性实体瘤的裸抗体（NCT05380882）以及作为抗体药物偶联物（TQB2102）在HER2阳性乳腺癌（NCT06115902）和胃癌中的应用。最后，轩竹生物制药正在开发不对称的通用LC双特异性抗体KM257，目前正在临床研究中，用于HER2阳性实体瘤（NCT05320874）以及作为抗体药物偶联物（KM501）在HER2阳性晚期实体瘤（NCT05804864）中的应用。 3.13.SAR441236 针对HIV的有效广谱中和抗体（bnAbs）的识别和开发由于病毒的高遗传多样性而面临挑战。大型和小分子单一疗法在很大程度上失败了，因为选择性压力增加了突变逃逸变体的机会。使用bnAbs组合的临床前和临床研究表明，靶向多个表位可以提高疗效。 SAR441236，由赛诺菲公司进行的I期临床开发（NCT03705169），由具有双重特异性的交叉双变量Ig样（CODV-Ig）臂与具有第三独特特异性的Fab臂配对，使其成为一种三特异性广谱中和抗体。临床前体内数据表明，三特异性广谱中和抗体在减少病毒载量和预防非人灵长类动物（NHP）类似的人类免疫缺陷病毒（SHIV）病毒挑战模型中的感染方面更为有效。3.14.GEN3009 Genmab结合其专有的DuoBody和HexaBody技术，设计了GEN3009，这是一种针对CD37的双特异性抗体，具有增强的Fc介导的六聚体化。这种双特异性抗体包含互补的Fc突变，这些突变引导体外控制的Fab臂交换反应中的异二聚体化，并通过E430G突变增强六聚体化。由于双表位靶向加上增强的六聚体化导致的Fc结构域密度的局部增加，与单一亲本单克隆抗体或组合相比，在B细胞淋巴瘤细胞系以及患者来源的慢性淋巴细胞白血病样本中均显示出优越的补体依赖性细胞毒性（CDC）。Fc结构域聚集进一步增加了ADCC和ADCP，导致在几种细胞系衍生的异种移植模型以及患者来源的非霍奇金淋巴瘤异种移植中产生强大的抗肿瘤活性。GEN3009已在复发或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者中进行了首次人体试验（NCT04358458），但由于战略原因，最近停止了进一步的临床开发。3.15.REGN5093和REGN5093-M114 Regeneron的双特异性抗MET常见轻链抗体，REGN5093，作为抗体（NCT04077099）和作为抗体药物偶联物（NCT04982224）已进入临床。源自Regeneron专有的VelocImmune平台，REGN5093有效地抑制了配体独立的MET和HGF诱导的信号传导。DaSilva等人表明，REGN5093创造了具有2:2化学计量比的抗体-受体复合物，与单特异性抗体形成1:2复合物形成对比。这些更大的复合物可能导致REGN5093所见的MET降解，这是由于回收效率降低和bpAb：受体复合物的溶酶体流量增加所致。Regeneron进一步利用REGN5093的这一特性，通过在其上结合专有的细胞毒素美登素载荷来开发REGN5093-M114。该分子在MET依赖性和MET非依赖性肿瘤模型中均显示出疗效，进一步证明了双特异性抗体药物偶联物方法的效用。3.16.OriCAR-017 Oricell的双特异性GPRC5D靶向CAR-T细胞疗法，OriCAR-017，已进入临床，用于治疗复发和难治性多发性骨髓瘤（NCT05016778）。类似于cilta-cel，OriCAR-017 CAR包含串联的单域抗体，靶向GPRC5D上的两个不同表位。作者推测，双特异性靶向增加了他们的CAR-T细胞疗法的特异性和亲和力，从而提高了疗效。报告了有利的I期安全性和有效性数据，并支持OriCAR-017的进一步开发。3.17.SARS-CoV-2 中和双特异性抗体（bpAbs） MABS由SARS-CoV-2引起的全球大流行促使全球范围内的大量研究工作，多个研究小组展示了使用单域抗体（sdAbs）等抗体片段作为构建双特异性抗体（bpAbs）的基石的效用。 一些研究表明，双特异性抗体通过要求多个同时突变，大大减少了突变逃逸的发生率。与通常限于通过阻断RBD-ACE2界面来阻断的传统单价结合物不同，双特异性抗体的顺式结合显示了阻断和构象变化，而双特异性结合则在多聚体中进行了阻断和多聚体化。已进入临床的最先进的针对SARS-CoV-2的双特异性抗体BAT2022已完成了I期安全性和耐受性研究（NCT05518695）。BAT2022是一个对称的2+2 Fc含量分子，由一个sdAb分子连接到HC的C末端。BAT2022保持了其作为广谱中和抗体对抗多种SARS-CoV-2亚变体的有效性，展示了作为治疗性抗体的效用。多余的。3.18.ISB 1442 Ichnos Sciences的ISB 1442是一种基于专有的BEAT 2.0（基于TCR的双特异性抗体结合）平台的双特异性抗体，它与一个串联Fab臂上的两个不同的CD38表位具有高亲和力结合，并结合一个低亲和力的CD47 Fab臂以阻断吞噬细胞上的信号调节蛋白α（SIRPα）。低CD47亲和力旨在防止对红细胞的靶向毒性，同时在高亲和力双特异性CD38臂的引导下结合时实现强大的抗肿瘤活性。结合Fc突变以增强效应功能，ISB 1442不仅影响ADCP，还表现出ADCC和CDC。临床前数据表明，这种复杂的MoA可能比单一靶点药物具有更高的疗效和安全性。因此，ISB 1442目前正在进行一项针对复发/难治性多发性骨髓瘤患者的I/II期临床研究（NCT05427812）。3.19.TNB-738 Ancora Biotech的TNB-738是一种由Teneobio的专有转基因UniRat平台衍生的两个sdAbs组成的不对称抗CD38双特异性抗体，它们与不同的CD38表位具有高亲和力结合。TNB-738使用结-洞突变实现重链配对，一个完全沉默的IgG4 Fc以消除效应功能，以及在一个臂上使用惰性的kappa LC和CH1以提高可制造性。目前正在健康志愿者中进行I期剂量递增（NCT05215912），TNB-738通过酶抑制发挥作用。3.20.IMGN151 Immunogen的下一代FRα ADC已进入临床（NCT05527184），紧随其第一代FRα ADC mirvetuximab-soravtansine之后，该药物于2022年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的加速批准。IMGN151包含一个scFv臂与一个mirvetuximab Fab臂配对，每个臂都结合FRα的独特和不重叠的表位。IMGN151的双特异性靶向模式增强了FRα阳性细胞上的结合事件，从而在高、中、低FRα表达的细胞系中实现了优越的载荷传递。双特异性抗体结合增加的传递以及更有效的连接子-载荷可能允许IMGN151比mirvetuximab soravtansine治疗更广泛的患者群体。 4.结论和展望 从单特异性单克隆抗体的组合中演变而来，双特异性抗体已通过2022年FDA批准的首个基于双特异性抗体的疗法证明了其临床安全性和有效性。临床管线中的双特异性抗体基于多种格式，除了存在Fc结构域以增强稳定性和效应功能外，没有明确的趋势。最终，生物学决定了双特异性抗体的设计。与传统的单克隆抗体、双特异性抗体甚至针对不同表位的单克隆抗体组合相比，双特异性抗体提供了独特的作用机制，使它们成为多种适应症有吸引力的治疗选择。双特异性抗体结合的亲和力可以实现高度选择性的肿瘤靶向，如双特异性抗体ISB 1442的特性，这些特性还可以使T细胞引导者或CAR-T细胞等治疗方式受益，正如双特异性CAR-T疗法cilta-cel的临床成功所突出的那样。目前正在临床测试的大多数双特异性抗体已被证明可以影响TAA聚集以改善受体激动、效应功能和/或有效的内化和溶酶体运输。除了治疗性单克隆抗体外，这种作用机制特别适合改善向肿瘤的细胞毒性载荷传递，正如目前正在评估的六种ADC所说明的那样。或者，双特异性结合可能通过增强结合事件来改善载荷传递，正如对IMGN151的推测。除了高亲和力结合和受体聚集，双特异性抗体已被用于其他作用机制，如双通路抑制、多组分靶标的激活，或者如抗CD38双特异性抗体TNB-738的例子，锁定一个在酶学上不活跃的状态。在传染病领域，双特异性抗体有希望解锁具有增强持久反应、对多样化病毒景观更广泛有效，并且可能大大限制突变逃逸变体出现的广谱中和抗体。该领域正从双特异性抗体转向三特异性抗体甚至更高级的抗体，以应对一些最具挑战性的人类疾病，如HIV和SARS-CoV-2。随着进入临床的双特异性抗体数量的增加，双特异性抗体在靶向治疗中具有巨大的潜力。目前的双特异性抗体临床格局显示出对HER2靶向药物及其依赖于受体聚集的相关作用机制的强大集中。HER2的突出可能可以用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合疗法的临床先例来解释。然而，随着新技术使更复杂的结构更容易获得，我们预计双特异性抗体的靶标和适应症的数量将大幅增加。以前用传统单克隆抗体在临床上失败的靶标可能因双特异性抗体的独特作用机制而变得可获得，并且可能出现特别适用于双特异性抗体的新靶标。正如SAR441236和临床前研究所强调的，三特异性或更高价的结构可以扩展双特异性抗体的效果，甚至解锁新的作用机制。通过首个双特异性抗体治疗的批准得到验证，双特异性抗体的临床管线正在迅速扩展，并将激发对这个独特的抗体类别进行更多研究，以充分利用双特异性抗体在靶向治疗中的潜力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：化学免疫疗法和细胞疗法是复发/难治性（R/R）淋巴瘤治疗的主要手段。这些治疗中出现的耐药性和常见毒性限制了它们在实现期望的响应率和持久缓解方面的作用。抗体-药物偶联物（ADC）是一种新型靶向疗法，已证明在治疗包括淋巴瘤在内的各种癌症中具有显著的疗效。迄今为止，已有三种ADC药物被批准用于不同类型的淋巴瘤，这标志着该领域取得了重大进展。在本文中，我们旨在回顾ADC的概念及其在淋巴瘤治疗中的应用，分析目前批准的药物，并讨论ADC开发正在进行的进展。 1.引言 淋巴瘤是一组来自不同类型淋巴细胞（B细胞、T细胞或自然杀伤（NK）细胞）在不同成熟阶段的克隆性增殖的恶性肿瘤。过去几十年来，不同类型淋巴瘤的发病率一直在增加。化学免疫疗法和细胞疗法仍然是不同亚型淋巴瘤常用的治疗手段。大多数化疗方案的治疗效果指数较窄，导致广泛的毒性。此外，耐药性的出现是最常见的原因之一，阻碍了它在复发和难治性（R/R）情况下的使用。针对表面抗原的单克隆抗体，如利妥昔单抗和奥比妥珠单抗，已经彻底改变了淋巴瘤的治疗。抗体-药物偶联物（ADCs）是一种高度靶向的药物，将针对特定表面抗原的单克隆抗体（mAb）与细胞毒素分子连接起来。毒素只传递给表达表面抗原的细胞，具有高度的肿瘤特异性和有限的系统暴露。美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准了三种用于治疗淋巴瘤的ADC药物，分别是本妥昔单抗、波拉图单抗和洛卡图单抗。 在本文中，我们将回顾ADC的概念，重点关注它们的结构、工程和在淋巴瘤治疗中的作用。此外，我们将提供目前批准的ADC在这一设置中的综合分析，以及正在进行的进展的概述。这包括突出来自临床前和临床试验的有希望的结果，以及讨论下一代ADC开发的未来方向。 2.ADC的基本结构  ADC由抗体、药物（有效载荷或细胞毒素）和连接子组成。抗体结合恶性细胞表面表达的特定抗原。一旦结合，ADC被内化，细胞毒素有效载荷释放到细胞内，导致细胞周期终止和凋亡。在周围目标阴性细胞中也可以看到细胞毒性效应，当药物扩散到它们中并引起“旁观者杀伤”时，这是一种当有效载荷从被内化和降解的ADC释放或当药物释放到细胞外空间后从目标细胞释放时发生的细胞死亡。值得注意的是，为了获得更好的结果和更少的副作用，抗原和抗体之间的结合需要尽可能特异性。有效载荷的内化率、连接子的稳定性和相应抗体的选择是影响ADC在临床实践中使用的一些变量。 2.1. 单克隆抗体 选择合适的抗体是ADC工程中的关键步骤；它通常被设计为特异性结合癌细胞表面表达的目标抗原。理想的单克隆抗体应具有低免疫原性、低交叉反应性、长的血浆半衰期，以及对肿瘤细胞表面抗原的高结合亲和力。最常用的类别是免疫球蛋白G（IgG），更具体地说是IgG1亚型，因其血清稳定性。在ADC开发的早期阶段，主要使用小鼠来源的抗体。然而，这些抗体报告有很高的失败率，可能归因于它们缺乏临床效益，同时引起严重的免疫原性相关的不良效应。这些ADC也被人类抗小鼠抗体迅速清除，限制了它们的疗效。此外，这些早期ADC中使用的连接子在人体循环中不稳定，导致有效载荷过早释放，大大降低了效果并增加了毒性。自从出现显著降低免疫原性的人源化小鼠单克隆抗体以来，已经取代了小鼠抗体，导致更优化的设计，如2000年FDA批准的针对CD33阳性急性髓系白血病患者的首个ADC药物吉妥单抗奥佐米星。迄今为止，已有十四种ADC获得FDA市场批准，其中三种如前所述已获批准用于治疗淋巴瘤。其中，只有本妥昔单抗使用嵌合抗体。嵌合抗体是通过融合不同物种的域（例如，整个小鼠或兔的可变区与人类来源的恒定域）设计的。相比之下，人源化抗体含有嵌入人类来源的Fab区和恒定区的外来氨基酸段。因此，它们较少免疫原性，是更安全的选择。在全人抗体中，没有一部分是小鼠来源的，与人类化抗体相比，它们在免疫反应中的发生率更低；例如FDA批准的enfortumab vedotin。 2.2. 有效载荷 ADC的理想有效载荷应具有低免疫原性、长半衰期、小分子量、在抗体的水性环境中良好的溶解度、在循环和溶酶体中的高稳定性、体外亚纳摩尔半最大抑制浓度（IC-50）以及有助于与抗体结合的官能团，同时保持ADC的内化特性。每个抗体平均结合两到四个强效的细胞毒素分子。目前，ADC设计中最受欢迎的两类有效载荷是微管破坏剂和DNA靶向剂（图1）。 图1. 设计ADC时常用的十种不同有效载荷的分子结构 微管抑制剂可以根据它们的作用机制分为两大类。第一组包括微管稳定剂。这些药物通过抑制微管解聚和促进聚合来增强丝状体的稳定性，使丝状体功能降低。第二组由破坏微管的物质组成，阻止微管蛋白组装和成熟微管的发展。在ADC开发中使用和研究的主要微管抑制剂包括长春碱类、紫杉醇类、auristatins、美登素类、隐孔菌素、海葵素和圆盘菌素。auristatins如单甲基auristatin E (MMAE)通过阻止α-和β-微管蛋白单体聚合并触发凋亡来破坏微管并阻止细胞分裂。结合区域位于两个纵向排列的微管二聚体的β1-微管蛋白和α2-微管蛋白亚基之间。根据体外研究结果，auristatin-微管蛋白键合形成环状或螺旋形聚集体，改变微管的功能。长春碱类如长春新碱或长春碱，以及隐孔菌素和多拉斯他汀，诱导微管形成类似的弯曲结构构象。 在细胞周期的任何阶段，DNA损伤剂通过双链断裂、烷基化、插入和交联四种主要机制可以杀死癌细胞。最常用的DNA损伤有效载荷是卡利烯胺、二酮霉素、吡咯并苯并二氮杂环（PBD）、多柔比星和喜树碱类似物。针对BCL-2抑制剂、剪接体抑制剂和针对RNA聚合酶II的转录抑制剂等靶向药物是具有不同作用机制的额外有效载荷。 值得注意的是，根据FDA对15种含有PBD有效载荷的ADCs的肿瘤学分析，PBD有效载荷的毒性概况更高，这表明常见的不良事件包括可能的血管渗漏综合征、转氨酶升高、骨髓抑制、胃肠事件、代谢效应、肌肉骨骼事件、神经病变、呼吸困难和肾损伤，所有这些都源于PBD的非靶向输送；该分析表明，2013年至2017年间47%的PBD偶联ADCs的新药申请被中止。这些高效ADCs发生危及生命的毒性的更高发生率是一个限制。 目前减轻PBD毒性的机制包括药物-连接子组分的聚乙二醇化，这显著提高了ADC的耐受性。另一种机制是使用对氨基苄氧羰基（PABC）自毁间隔基，在连接臂-药物中；该间隔基具有稳定的二硫键，允许在细胞内快速释放自由有效载荷，从而实现更好的血浆稳定性和与可裂解连接臂相比提高的毒性。后一项研究认为，肽连接的和二硫键连接的PBD ADC在两种不同的淋巴瘤模型中提供了相似的疗效，并且二硫键连接的PBD ADC具有更好的安全性。第三种机制是通过减少PBD结构中的一个亚胺官能团进行化学修饰，从而将DNA交联的PBD二聚体转变为DNA烷基化代谢物，称为吲哚喹喔啉二聚体（IGN），这在小鼠肿瘤模型中实现了更有效的载荷释放，其中小鼠能够耐受更高剂量的IGN偶联ADC。 近期在有效载荷方面也取得了进展。主要的进展是免疫调节ADC，如干扰素基因刺激剂（STING）激动剂、Toll样受体（TLR）激动剂和使用蛋白酶体靶向嵌合体（PROTAC）策略的目标蛋白降解剂（TPD）。STING激动剂激活干扰素和其他细胞因子的产生，从而增强免疫和抗肿瘤反应。将STING激动剂作为有效载荷纳入ADC可以实现其向肿瘤目标的传递，具有更高的疗效和由于免疫激活导致的过度炎症反应而减少的毒性。STING激动剂的例子包括DMXAA、c-di-AMP、c-di-GMP、cGAMP、ADU-S100、MK-1454、SB11285、BMS-986301、E7766、MSA-1和MSA-2；它们主要在乳腺癌中被探索。TLR激动剂通过增强肿瘤微环境中抗原呈递细胞的抗原呈递，改善先天和适应性抗肿瘤免疫，从而促进更多细胞毒性T细胞的促进和活性。它们在局部癌症中发挥作用，例如，BCG（TLR2/4激动剂）用于膀胱非浸润性癌，AS04（TLR4激动剂）用于宫颈癌，以及咪喹莫特（TLR7激动剂）用于表皮基底细胞癌。目前，许多TLR激动剂正在作为ADC中的有效载荷在癌症免疫疗法中进行研究。一个例子是BDC-1001（TLR7/TLR8激动剂与抗HER2抗体偶联的ADC），在临床前模型中显示出有希望的结果。目前正在进行一项I/II期临床试验，该试验正在招募表达HER2的晚期实体瘤患者（NCT04278144）。PROTAC是一种催化作用于小剂量的催化剂，它通过泛素化介导的蛋白水解作用靶向特定的蛋白质。当PROTAC有效载荷与抗体偶联时，它会产生PROTAC催化行为和抗体的组织特异性的新型组合，具有更好的疗效和更少的限制。在表达HER2的细胞中存在成功的例子。这些在ADC设计中的微妙改进具有巨大的潜力，通过不断的研究可以为肿瘤学带来更好的结果，并为包括淋巴瘤在内的其他癌症类型的发展打开大门。 2.3. 化学连接臂 连接臂是成功开发ADC的最重要和最复杂的部分，因为它们形成了治疗和抗体之间的联系。它们的结合机制、稳定性和化学性质对于防止意外释放药物进入血流以及在癌细胞内吞后促进容易裂解至关重要，允许有效载荷仅在预期的地点释放。它们在确定ADC的药代动力学、药效学和治疗窗口方面至关重要。目前FDA批准的ADC使用两类连接臂，它们在有效载荷释放机制上有所不同：可裂解和不可裂解连接臂。最常用的四种可裂解连接臂是β-葡萄糖醛酸酶敏感连接臂、谷胱甘肽（GSH）敏感二硫键连接臂、卡他蛋白B敏感连接臂和腙连接臂。前面描述的旁观者效应，它影响肿瘤微环境中的正常细胞和没有或低目标表达的肿瘤细胞，更有可能发生在使用可裂解连接臂的ADC中。 不可裂解连接臂与可裂解连接臂相比，具有更好的血浆稳定性、较低的非目标毒性和抗蛋白水解降解的能力，因为它们与抗体的氨基酸残基具有不可还原的键。通常，不可裂解连接臂由硫醚或马来酰亚胺己酰基团形成。附着在由降解的抗体衍生的氨基酸残基上的不可裂解连接臂必须在ADC内化后，由细胞质和溶酶体蛋白酶完全分解抗体部分才能释放有效载荷。图2展示了一般的基本结构。 图2. ADC的一般基本结构。ADC由一个嵌合或人源化（免疫原性较低）的抗体组成，该抗体对淋巴瘤癌细胞表面表达的抗原具有强烈的结合活性。抗体应在循环中具有较高的半衰期，以便被输送到目标细胞表面。抗体与不同结构的有效载荷（主要是微管抑制剂或DNA相互作用）相连，这些是具有理想药物/抗体比例的高效药物。抗体与有效载荷之间的连接是通过可裂解或不可裂解的连接臂实现的，这些连接臂应具有精确的结合、在循环中的稳定性，并确保在目标处有效分配有效载荷。 3.FDA批准用于淋巴瘤的ADC  截至2023年，已有三种ADC获得了FDA对各种类型淋巴瘤的批准，分别是Brentuximab Vedotin（BV）、Polatuzumab Vedotin（PV）和Loncastuximab Tesirine（LT），如表1所示。 Brentuximab Vedotin（BV）由针对CD30的IgG1嵌合单克隆抗体“cAC10”和细胞毒素MMAE组成，它们通过一个稳定的连接臂（Cathepsin可裂解连接臂和对氨基苄基-羰基间隔基）结合在一起。嵌合单克隆抗体cAC10与CD30结合，随后通过内吞作用和随后与溶酶体的囊泡融合，在溶酶体中，溶酶体半胱氨酸蛋白酶裂解连接臂，释放MMAE直接进入癌细胞内，从而导致癌细胞毒性。抗体和MMAE之间的连接系统设计为在循环中稳定，由马来酰亚胺己酰基间隔基、蛋白酶敏感的二肽Val-Cit、自毁PABC基团以及二肽和药物之间的附加间隔基组成。后者具有自裂解的能力，并有助于卡他蛋白B进入其裂解序列。马来酰亚胺部分与抗体重链和轻链中的半胱氨酸残基的末端硫醇形成硫醚键，将连接臂连接到抗体。由蛋白酶裂解Cit-PABC酰胺键产生的不稳定PABC取代的MMAE中间体，通过自发的1,6-消除反应，产生自由的MMAE分子、CO2和对氨基苄基醇。值得注意的是，CD30在恶性淋巴瘤细胞上表达非常强，在正常组织上表达较少。与单独的抗体相比，BV可以使CD30+细胞系的生长停滞高达340倍。BV的结构和作用机制如图3所示。cHL的恶性Reed-Sternberg细胞以表达CD30为特征，CD30是肿瘤坏死因子超家族的成员，鉴于其对一小部分活化的B细胞、T细胞和嗜酸性粒细胞的表达限制，它代表了单克隆抗体治疗的理想靶点。BV在未经治疗的cHL患者和R/R疾病中表现出显著的活性，导致在这些情况下获得FDA批准。 图3. BV的结构和作用机制。它由一个针对淋巴瘤细胞上CD30抗原的单克隆抗体组成。结合后，整个ADC-抗原复合物被细胞内运输到溶酶体，在那里释放MMAE（有效载荷），干扰细胞核中的微管结构，导致细胞周期停滞和凋亡。 ECHELON-1 III期试验将1334名未经治疗的III期或IV期cHL患者随机分配接受BV-AVD（Brentuximab Vedotin、Adriamycin、Vinblastine、Dacarbazine）或ABVD（Adriamycin、Bleomycin、Vinblastine、Dacarbazine）。试验显示BV-AVD组的2年修正无进展生存期（PFS）为82%，而ABVD组为77%，风险比（HR）为0.77，6年总生存期（OS）分别为93.9%和89.4%，HR为0.59。基于ECHELON-1的结果，FDA批准BV与化疗联合用于成人未经治疗的III期或IV期cHL的治疗。最近，SWOG S1826试验被开发出来，比较BV-AVD与N-AVD（Nivolumab、Adriamycin、Vinblastine、Dacarbazine）对儿童和成人新诊断的晚期cHL（III期或IV期）患者的疗效。S1826研究表明，Nivo-AVD的1年PFS（94%）优于BV-AVD（86%），HR为0.48，并且两组的不良事件（AE）概况相当，因此它目前是未经治疗的cHL的一线治疗的首选方案。 尽管年轻患者更容易耐受多药化疗方案，但由于多种因素，包括合并症、身体状况差、无法耐受全剂量化疗以及治疗相关AEs增加，老年cHL人群的治疗结果较差。一项多中心II期研究评估了60岁及以上患者的序贯BV方案，随后进行AVD化疗，并在随后进行BV维持治疗。研究报告了84%的2年PFS率和93%的2年OS率。这种序贯方法提高了这一脆弱人群中cHL的治愈率，是新诊断cHL老年人的首选方案。 在R/R cHL环境中，BV最初在自体造血干细胞移植（ASCT）失败的患者中进行了研究。BV单药治疗显示总响应率（ORR）为75%，完全缓解（CR）为34%，中位无进展生存期（mPFS）为5.6个月。值得注意的是，CR患者的中位持续响应时间（mDOR）为20.5个月。这些结果导致BV首次获得FDA批准，用于治疗ASCT失败或至少两个先前的多药化疗方案失败的cHL患者。随后，AETHERA III期试验包括了接受过ASCT并具有以下不利风险之一的cHL复发难治性疾病患者，例如原发性难治性HL、初次缓解<12个月的复发HL，或一线治疗后复发时的结外受累。AETHERA研究表明，ASCT后早期巩固使用BV将mPFS提高到42.9个月，而对照组为24.1个月，HR为0.57。基于AETHERA试验，FDA随后扩大了BV的批准范围，用于治疗ASCT巩固后有高复发或进展风险的cHL患者。 除了前述的FDA批准外，BV还根据CheckMate 744 II期研究的结果，被国家综合癌症网络（NCCN）指南推荐与Nivolumab联合用于复发或难治性cHL患者的二线或后续治疗。该研究评估了涉及Nivolumab加BV，随后对次优反应患者使用BV加Bendamustine的风险分层响应适应方法。CheckMate 744研究表明，59%接受BV和Nivolumab治疗的患者，以及94%随后接受BV和Bendamustine治疗的患者，实现了完全分子反应（CMR）。这些结果明显优于历史上60至70%的CMR率，为R/R环境中的更高治愈率奠定了基础。 正在进行的BV在cHL的试验如图2所示。 BV在CD30阳性T细胞淋巴瘤中的作用 系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）中CD30的普遍表达，以及在外周T细胞淋巴瘤-未另行指明（PTCL-NOS）、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITL）和成人T细胞白血病或淋巴瘤（ATLL）等亚型中的高表达，为在T细胞淋巴瘤中靶向CD30提供了强有力的理由。 一项针对至少一种联合化疗方案失败后的R/R ALCL患者的II期研究显示，86%的患者实现了客观反应，其中57%为CR，mDOR为12.6个月。这项研究的结果导致FDA批准BV用于R/R PTCL。ECHELON-2试验旨在比较BV与环磷酰胺、多柔比星和泼尼松（A+CHP）联合使用与标准CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松）治疗未经治疗的CD30阳性PTCL患者的疗效和安全性。A+CHP显示出48.2个月的mPFS，与CHOP的20.8个月相比，具有可比的安全性概况。5年PFS分别为A+CHP的51.4%和CHOP的43%（HR 0.7），5年OS分别为A+CHP的70.1%和CHOP的61%（HR 0.72），两组之间的安全性概况相当。随后的亚组分析显示，S-ALCL主要从A+CHP中受益，而AITL和PTCL-NOS亚组的益处尚不明确。 除了PTCL，BV在皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）中的作用也得到了探索。ALCANZA III期试验包括了接受过一线系统治疗的原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤（pcALCL）或表达CD30的蕈样真菌病（MF）的患者。在平均45.9个月的随访中，试验偏爱BV组，ORR为54.7%对12.5%，mPFS为16.7对3.5个月。同样，与医生选择相比，BV组的下一次治疗的中位时间显著更长（14.2对5.6个月；HR 0.27）。基于ALCANZA试验的结果，FDA批准BV用于治疗接受过先前系统治疗的pcALCL或表达CD30的MF患者。目前，BV正在许多早期阶段的试验中进行评估，这些试验包括在表2中。 波拉图珠单抗（PV）由一种抗CD79B的人源化IgG1单克隆抗体组成，通过一个可被蛋白酶裂解的马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-PABC肽段连接臂与MMAE结合。一旦波拉图珠单抗与CD79b结合，它就会被内吞并通过内质网运输到溶酶体，在那里发生连接臂裂解，导致有效载荷释放到细胞内诱导凋亡。PV的结构和作用机制如图4所示。 图4. PV的结构和作用机制。PV由一个针对淋巴瘤细胞上的CD79b抗原的单克隆抗体组成。结合后，整个ADC-抗原复合物被内吞到内质体，并与溶酶体融合。然后连接臂被裂解以释放MMAE（有效载荷），这反过来导致细胞核中的有丝分裂停止和细胞死亡。 5.1. PV在弥漫大B细胞淋巴瘤中的应用 弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）最常见的形式。虽然利妥昔单抗的加入显著提高了CHOP化疗的治愈率，但大约40-50%的患者最初反应后会出现难治性疾病或复发。 POLARIX是一项具有里程碑意义的III期研究，评估了PV加入R-CHP（利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、泼尼松）在DLBCL一线治疗中的疗效，并与R-CHOP进行了比较。POLARIX证明了pola-R-CHP组2年PFS为76.7%对70.2%，（分层HR 0.73）。两组的整体安全性概况相似。值得注意的是，pola-R-CHP的益处在60岁以上的患者、国际预后指数（IPI）在3到5之间的患者以及具有活化B细胞样亚型的DLBCL患者中观察到。相反，在60岁或以下的患者、有大量疾病、较低IPI评分或滤泡中心B细胞样亚型的DLBCL患者中没有明显益处。基于POLARIX试验，pola-R-CHP是第一个在DLBCL一线治疗中证明比R-CHOP具有更好PFS的方案，并获得了FDA对先前未经治疗的DLBCL、未另行指明（NOS）、高级别B细胞淋巴瘤（HGBL）或IPI评分为2或更高的患者的批准。 POLAR BEAR III期试验比较了mini-R-CHOP与pola-mini-R-CHP作为老年DLBCL患者的一线治疗。初步安全性数据显示，两种方案在老年人（69%在80至90岁之间）和脆弱人群中（16%脆弱，12%的ECOG表现状态为3）都是可耐受的，用波拉图珠单抗替代长春新碱并没有导致3到4级血液学毒性或神经病变的发生率更高。值得注意的是，pola-mini-R-CHP组的胃肠道不良事件频率更高（31%对16%）。基于POLARIX试验的结果，人们倾向于假设pola-mini-R-CHP可能显示出比mini-R-CHOP更好的PFS。因此，这项研究的结果备受期待。 在R/R DLBCL环境中，评估PV安全性和有效性的第一项试验是Ib/II期试验，该试验比较了PV与利妥昔单抗（R）和苯达莫司汀（B）联合使用与单独BR对不适合移植的R/R DLBCL的疗效。pola-BR组显示更高的CR（40%对17.5%），更长的mPFS（9.5对3.7个月，HR 0.36），以及更高的mOS（12.4对4.7个月，HR 0.42）。然而，它导致了更高比例的3到4级中性粒细胞减少症（46.2%对33.3%）、贫血（28.2%对17.9%）和血小板减少症（41%对23.1%），尽管3到4级感染的发生率相似（23.1%对20.5%）。与PV相关的周围神经病变在43.6%的患者中观察到，但大多数是1到2级并解决了。这项试验导致了2019年6月pola-BR的初步批准及其在这种情况下的广泛使用。 波拉图珠单抗的另一个有希望的组合在Ib/II期试验中得到证明，该试验结合了Mosunetuzumab，一种针对CD20和CD3的人源化IgG1双特异性抗体，在R/R DLBCL、HGBCL、转化的FL或3b级FL中。在平均23.9个月的随访中，59.2%的患者对波拉图珠单抗加Mosunetuzumab有反应，45.9%的患者达到了CR。mPFS为11.4个月，mOS为23.3个月。这种方案被良好耐受，最常见的AE是25%患者的中性粒细胞减少症。总的来说，这些结果表明波拉图珠单抗和Mosunetuzumab的组合可以在不适合移植的R/R LBCL中带来具有临床意义的反应和有利的安全性概况。 5.2. PV在其他B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中的应用 除了DLBCL，包括PV的联合疗法也在惰性B-NHL中进行了探索。在Ib/II期试验中，评估了波拉图珠单抗、奥比妥珠单抗（G）和来普尼（Len）联合治疗R/R FL的安全性和有效性。在平均27个月的随访后，结果显示ORR为76%，CR率高达63%，尽管没有达到预先设定的活性阈值。在平均43.3个月的随访后，mPFS和mOS尚未达到，而4年的里程碑PFS为53%。这些结果与R/R FL的现有标准化疗选择相当，并支持在FL中进一步研究Pola-G-Len方案。 PV的疗效也在套细胞淋巴瘤（MCL）中进行了研究。在一项针对R/R MCL的II期研究中，PV与Mosunetuzumab联合用于先前接受过两线或以上治疗的患者，包括布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂（BTKi），并显示出75%的高ORR和70%的CR。然而，需要更多的结果数据来评估其在MCL中的作用，对于对化疗免疫疗法和BTKi耐药的患者迫切需要新的方案。 6.隆卡图珠单抗  CD19是一种在B细胞分化的最早阶段直到浆细胞发育过程中表达的表面糖蛋白。除了正常的B细胞，CD19也在大多数B细胞淋巴瘤中表达。与CD20相比，CD19表现出更均匀的表达，并在抗CD20靶向治疗后的小部分CD20阴性肿瘤中保留，使其成为免疫疗法和联合疗法的选择性靶点。隆卡图珠单抗（LT，ADCT-402）是一种ADC，由一种人源化抗CD19单克隆抗体组成，通过一个可被卡他蛋白裂解的连接臂与高度细胞毒性的DNA小沟交叉链接吲哚喹喔啉二聚体毒素（PBD二聚体）结合。由于其快速的内吞动力学、运输到溶酶体和在循环中的稳定性，LT是针对CD19最有效的ADC。LT的结构和作用机制如图5所示。 图5. LT的结构和作用机制。LT由单克隆抗体Loncastuximab通过可裂解连接臂(统称为Tesirine)与PBD二聚体(有效载荷)相连。该抗体与淋巴瘤细胞上的CD19抗原结合，之后整个复合物被内吞并合并到溶酶体中。接着，PBD被释放到细胞质中，它移动到细胞核，在那里发生DNA交叉链接，导致细胞死亡。 6.1. LT在弥漫大B细胞淋巴瘤中的应用 LT在人体I期研究中显示出对R/R NHL具有临床意义的活性，这导致了LOTIS-2研究，该研究评估了其在R/R DLBCL中的疗效。LT显示出48.3%的ORR，其中50%的应答者达到了CR。虽然mPFS为4.9个月，但达到CR者的mDOR为13.4个月。它展示了通常被良好耐受的安全概况，中性粒细胞减少症是最常见的3级AE（26%），其次是血小板减少症（18%）和γ-谷氨酰转移酶升高（17%）。显著的抗肿瘤活性、持久的反应和可接受的安全概况导致了2021年FDA批准用于治疗经过两线或以上系统治疗后的R/R大B细胞淋巴瘤。批准包括那些有DLBCL NOS、由低级别淋巴瘤引起的DLBCL和HGBL。 在具有里程碑意义的LOTIS-2研究之后，LT与其他靶向疗法的组合，如LOTIS-3中的ibrutinib和LOTIS-5中的单克隆抗CD20抗体rituximab对R-GemOX（利妥昔单抗、吉西他滨和奥沙利铂）进行了评估，但目前尚不清楚这些组合是否会进入临床应用（表2）。 6.2. LT在滤泡性淋巴瘤中的应用 LT在复发/难治性非霍奇金淋巴瘤(R/R NHL)的I期研究中进行了评估，其中在滤泡性淋巴瘤(FL)中显示了78.6%的客观反应率(ORR)。在2023年美国血液学会(ASH)会议上，最近展示了将LT与利妥昔单抗联合应用于R/R FL的II期试验的非常鼓舞人心的结果。该试验显示了95.2%的客观反应率，其中包括66.7%的完全缓解(CR)和28.6%的部分缓解(PR)的比率。 7.其他正在研究、开发和评估用于治疗淋巴瘤的抗体药物偶联物  7.1 针对CD19的抗体药物偶联物  7.1.1 科尔图珠单抗拉伐坦辛  科尔图珠单抗拉伐坦辛（SAR3419）是一种IgG1抗体（huB4），通过二硫键交联剂SPDB与细胞毒素药物DM4相连，靶向CD19。CD19是一种在血液形成分化过程中的B淋巴细胞系高度表达的蛋白，从早期B细胞到成熟B细胞，并在大多数B细胞恶性肿瘤中保持表达。两项II期试验已经研究了科尔图珠单抗拉伐坦辛作为单药或联合用药的使用。一项正在进行的试验正在检查其在R/R DLBCL患者中单药治疗的使用，初步数据显示ORR为44%；然而，mPFS、mOS和DOR尚未得出。它具有可接受的安全性概况，药物在41名患者中有4名因不良事件而中断。另一项试验检查了科尔图珠单抗拉伐坦辛与利妥昔单抗联合用于DLBCL患者，显示出ORR为31.1%，在复发疾病患者中疗效最高（ORR 58.3%），与难治疾病（ORR 43%）或一线治疗（ORR 15.4%）形成对比。总体而言，它显示出mPFS为3.9个月，mOS为9个月，DOR为8.6个月。 7.1.2 德尼珠单抗马佛多汀 德尼珠单抗马佛多汀（SGN-19A或SGN-CD19A）是另一种针对CD19的ADC。它是一种抗体（hBU12-491），通过不可裂解的马来酰亚胺己酰基连接臂与MMAF偶联。一项主要纳入了B-ALL患者（n = 59）的I期试验，以及侵袭性B细胞淋巴瘤（n = 6）和伯基特白血病/淋巴瘤（n = 6），显示DOR为27个月。每3周给药一次，在B-ALL中显示CRc（CR+CRi+CRp）为35%。在六名伯基特白血病/淋巴瘤患者和六名B-LBL患者中，每组只有一名达到CR。最常见的AEs是发热（54%）和恶心（52%）。另一项主要纳入了R/R DLBCL（n = 53），以及MCL（n = 5）和FL（n = 3）的I期试验，与前一次试验相比，在DLBCL中显示出略高的活性，ORR为33%，CR为22%，复发病例的DOR为39周，难治病例为41周。最常见的AEs与眼睛相关：视力模糊（65%）和干眼（52%）。德尼珠单抗马佛多汀在两项II期试验中进一步与化疗联合研究，一项将其与RICE化疗联合用于R/R DLBCL或3B级FL，与单独RICE进行比较，而另一项研究了其与R-CHOP或R-CHP联合对照R-CHOP单独作为DLBCL或3B级FL的一线治疗；然而，这两项试验都被赞助商终止。 7.2 针对CD22的抗体药物偶联物 7.2.1 伊诺珠单抗奥佐加霉素 CD22是一种135 kDa的I型跨膜糖蛋白，是一种在未成熟和成熟B细胞上表达的B细胞系特异性蛋白。它在B细胞恶性肿瘤包括大多数淋巴瘤和白血病中上调表达。目前有两种针对CD22的ADC正在淋巴瘤中进行研究。第一种是伊诺珠单抗奥佐加霉素（CMC-544），一种IgG4 kappa单克隆抗体，带有N-乙酰-γ-卡利奇霉素二甲基肼，一种卡利奇霉素的半合成衍生物，通过4'-乙酰苯氧基丁酸连接，于2017年8月获得FDA批准用于R/R B细胞ALL。一项I期试验研究了其在R/R B细胞NHL患者中的应用，显示79名入组患者的ORR为39%，在FL中为68%，在DLBCL中为15%。然而，DOR很短，DLBCL的mPFS为10.4个月，FL为49天。患者中有90%出现最常见的AE，即血小板减少。一项针对顽固性B细胞NHL（n = 81）的II期试验显示了类似的结果，ORR为67%，CR为31%，mPFS为12.7个月。 7.2.2 匹那珠单抗韦德汀 匹那珠单抗韦德汀（Pina，DCDT2980S，RG-7593）是一种抗CD22的单克隆IgG1抗体，通过可裂解的马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-PABC连接臂与MMAF偶联。一项I期试验显示，与利妥昔单抗联合使用相比，作为单药治疗使用时显示出更高的疗效，DLBCL组的ORR分别为25%和17%。在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中未见客观反应。在II期试验ROMULUS中进一步检查了其与利妥昔单抗的联合使用，与R-pola相比，在DLBCL患者中显示出更优越的反应，但在FL患者中没有；DLBCL队列在R-Pina（n = 42）上显示ORR为60%，CR为26%，而R-Pola（n = 39）上为ORR 54%，CR 21%。在这项试验中，两者的AEs相当，R-pina组DLBCL队列的3-5级AEs为79%，R-Pola为77%。在FL队列中，AEs略低，R-Pina和R-Pola的3-4级AEs分别为62%和50%。 7.3 针对CD25的抗体药物偶联物 卡米达卢单抗特西林 CD25是一种I型跨膜蛋白，是白细胞介素-2受体α链，是一种在活化的B细胞、活化和调节性T细胞以及髓系前体上表达的蛋白，在包括淋巴瘤和白血病在内的各种肿瘤中过度表达。卡米达卢单抗特西林（ADCT-301，HuMax-TAC）是一种IgG1单克隆抗体，通过可被卡他蛋白裂解的缬氨酸-丙氨酸二肽连接臂与PBD二聚体弹头（SG3199）偶联。一项I期试验检查了其在R/R cHL（n = 133）和R/R NHL（n = 56）中的疗效，其中在cHL患者中显示出71%的优越ORR和42%的CR，与R/R NHL相比（ORR 38%和CR 9%）。3级及以上AEs包括GGT水平升高（15%）、皮疹（12%）和贫血（11%）。更重要的是，3.8%的患者出现了严重的神经系统事件，包括吉兰-巴雷综合征（GBS）/多神经根病变，27.4%的患者因不良反应而中断治疗。尽管研究报告的CR令人鼓舞，但FDA建议不要提交用于治疗R/R HL的批准文件，因此其未来仍不明朗。 7.4 针对CD37的抗体药物偶联物 纳拉图珠单抗艾美曲辛 CD37是一种参与细胞膜组织和共刺激信号的跨膜蛋白，主要在成熟B细胞上表达，在T细胞、巨噬细胞/单核细胞和粒细胞上表达较少。它在成熟的B细胞恶性肿瘤中高度表达，如CLL，在DLBCL中表达不一，CD37阳性范围从40%到90%的病例，而在急性淋巴细胞性白血病（ALL）和HL中低表达或缺失。纳拉图珠单抗艾美曲辛（IMGN529）是一种IgG1单克隆抗体，通过硫醚连接臂N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)与美登木素DM1偶联，靶向CD37。 纳拉图珠单抗艾美曲辛最初在R/R B细胞淋巴瘤的I期试验中研究，结果显示最小的效果，总有效率（ORR）为13%。然而，纳拉图珠单抗艾美曲辛与利妥昔单抗联合的II期试验结果显示，在DLBCL中ORR更高，达到44.7%，完全缓解（CR）为31.6%，在FL中的响应率略高，ORR为57%，CR为36%。在中位随访15个月和21.8个月时，DLBCL和FL亚组的中位持续缓解时间（mDOR）尚未达到。治疗总体上被良好耐受，如在FACT-Lym QoL的淋巴瘤子量表上平均提高了三点的生命质量（QoL）测量所示。总体而言，目前尚不清楚它是否会进入III期研究。 7.5 针对CD70的抗体药物偶联物 Vorsetuzumab Mafodotin CD70是一种共刺激分子，也是肿瘤坏死因子超家族的成员，它在抗原激活的B细胞、T细胞、NK细胞和成熟的树突状细胞上短暂表达。它在实体瘤和血液学恶性肿瘤中异常表达。Vorsetuzumab Mafodotin (SGN-75)是一种ADC，靶向CD70分子和微管毒素分子，连接到单甲基奥瑞斯他汀F（MMAF）。在R/R CD70+ NHL的I期试验中显示出不可接受的毒性，主要是血小板减少症。此外，SGN-CD70A是一种通过稳定、可被蛋白酶裂解的肽基连接臂与PBD二聚体偶联的工程半胱氨酸单克隆抗体（EC-mAb），靶向CD70。同样，它也与不可接受的毒性相关，并且只有适度的活性。 7.6 针对ROR1的抗体药物偶联物 7.6.1. Zilovertamab Vedotin ROR1是一种酪氨酸激酶跨膜受体，表达在未成熟的B淋巴细胞、内分泌腺和小肠上。它在血液学恶性肿瘤中高度表达，尤其是B细胞淋巴瘤。Zilovertamab Vedotin (MK 2140或VLS-101)是一种针对ROR1的人源化IgG1单克隆抗体，通过可被蛋白酶裂解的连接臂与MMAE偶联。在一项具有里程碑意义的I期试验中，Zilovertamab Vedotin在R/R MCL患者中显示出47%的ORR，CR为20%，在R/R DLBCL患者中ORR为60%。II期waveLINE-004研究，将Zilovertamab Vedotin作为R/R DLBCL的单药治疗，显示出略低的疗效，ORR为30%，有10%的患者实现了CR。最常见的3-4级AEs是中性粒细胞减少症（18%），其次是贫血（15%）。目前有额外的研究正在进行招募；一项是将Zilovertamab Vedotin与R-CHP联合用于DLBCL的前线治疗的II期试验，另一项是评估其与R-GemOX联合对照R-GemOX单独用于R/R DLBCL的II/III期研究。 7.6.2. Cirmtuzumab-ADC-7 另一种针对ROR1的ADC是Cirmtuzumab，一种针对ROR1的单克隆抗体，通过UC-961连接臂与MMAE偶联。在I/II期，Cirmtuzumab与ibrutinib联合用于R/R MCL或治疗未经验（TN）或R/R CLL的管理。在MCL队列中，Cirmtuzumab显示出80%的ORR，35%的患者实现了CR。值得注意的是，在中位随访14.9个月时，mPFS尚未达到。在CLL队列中，结果随着成熟仍然令人鼓舞，TN和R/R CLL患者的mPFS在中位随访14个月和7个月时也未达到。总体而言，该研究正在进行中，结果看起来很有希望。 7.7 临床前开发中的ADCs 7.7.1. 新型CD30靶向ADC：SGN-35C SGN-35C在组成上与BV相似，都是抗CD30抗体，但在连接臂上有所不同，它连接的是一种新型的喜树碱衍生的拓扑异构酶1抑制剂有效载荷。在CD30阳性ALCL和HL细胞系上进行的体外和体内研究，包括那些对BV有抗性的细胞系，显示出治疗诱导的细胞毒性。值得注意的是，这种效果扩展到了CD30阴性细胞，表明了旁观者效应。非人灵长类动物模型也证实了其安全性。下一步是人类临床试验，目前正在计划中。 7.7.2. CD19靶向ADC：IKS03 IKS03由一种针对CD19的人源化抗体组成，设计用于位点特异性结合PBD前药有效载荷。它通过生物结合激活，产生一种药物与抗体比率为2的偶联物。体外和体内研究已经证明了其在多种CD19阳性淋巴瘤细胞系中的有效细胞毒性，最值得注意的是在含有经常在R/R NHL中观察到的遗传异常的MCL和DLBCL异种移植模型中，如CCND1 t(11;14)易位和三重打击淋巴瘤，涉及BCL-2、BCL-6和c-MYC的基因重排。此外，与其他使用PBD前药的ADC相比，它展示了更低的非特异性有效载荷从偶联物中的释放率，包括LT。目前正在进行I期临床试验NCT05365659，以评估其在晚期B细胞NHL患者中的安全性。 7.7.3. CXCR5靶向ADC：VIP924 VIP924是一种首创的ADC，靶向CXCR5，由一种可被legumain裂解的连接臂和一种微管蛋白抑制剂（KSPi）有效载荷组成。CXCR5是一种趋化因子受体，在B细胞和T细胞来源的淋巴瘤上高度表达，并参与调节肿瘤细胞侵袭、生长和迁移的途径。一项体内研究比较了VIP924与PV和LT在MCL的人性化小鼠模型中的效果。结果表明VIP924在抑制肿瘤生长、提高存活率和耐受性方面的优势。值得注意的是，与LT不同，VIP924组的动物没有经历细胞减少症。这些有希望的结果支持在人类临床试验中进行进一步研究的需求。 8.ADCs的未来发展方向 最近在设计位点特异性ADCs、利用双特异性抗体以及修改可裂解连接臂方面取得了进展，以期使ADCs更有效、更高效，同时最小化毒性。一种新颖的偶联化学方法涉及位点特异性附着，其中一些技术利用抗体中的天然链间二硫键，而其他技术则需要生物工程将酶促偶联标签整合到抗体序列中。尽管在淋巴瘤中尚未探索，但位点特异性偶联已在实体恶性肿瘤（如乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌）中得到评估。其中一种应用是ThioMab技术，它涉及使用工程化半胱氨酸进行位点特异性偶联。使用这种技术生产的ADC包括抗MUC16 ADC，它由在曲妥珠单抗的轻链和重链的特定位置插入半胱氨酸残基组成，然后与MMAE上的硫醇基团结合。此外，pClick技术提供位点特异性偶联；然而，它使用天然抗体和近距离激活的交联剂，不涉及任何生物工程。ThioBridge技术包括一种可裂解的连接臂，也使用天然抗体，并由三碳桥接附着提供增强的稳定性。此外，最近创新的AJICAP第二代技术通过利用硫酯化学的选择性裂解反应，实现了无聚集挑战的位点特异性ADC的生产，并有望成为无需抗体工程的位点特异性ADC。最后，通过不同的方法（如糖基重塑、转谷氨酰胺酶或脂酸连接酶方法）对天然抗体进行无标签酶促修饰，作为推进ADC发展的潜在工具具有潜力。 一类有前景的ADCs由双价双特异性抗体组成，如在HER-2靶向ADC中所示。双特异性抗体靶向两个不重叠的表位，随后诱导受体聚集和内化。这类ADCs已在乳腺癌中显示出疗效，并且在临床前研究中检查了MET过表达肿瘤，提供了有效的细胞毒性。 关于连接臂的最新进展，工作集中在制造稳定以避免非目标有效载荷释放的连接臂，但也容易在目标部位裂解以有效传递。这导致制造具有pH和微环境依赖性裂解的连接臂，允许ADCs在细胞内释放有效载荷。 这些进展正处于开发或临床前阶段研究中，有望提高下一代ADCs在包括淋巴瘤在内的各种癌症中的治疗效果。 9.结论  ADCs是革新了霍奇金和非霍奇金淋巴瘤治疗的新方法。抗体、连接臂和有效载荷的进步将导致ADCs的进一步发展，对淋巴瘤具有更高的特异性和细胞毒性。虽然获得抗性将是一个限制因素，但与其他新型药物的联合疗法，如单克隆抗体、分子靶向疗法和双特异性抗体，将为新的突破性治疗铺平道路。我们迫切需要创新的I期研究，以更好地理解ADCs在不同疾病环境中的作用，因为我们的目标是提高淋巴恶性肿瘤的治愈率。

摘要:癌症的特征是无限的增殖和转移，传统的治疗策略通常会导致药物抗性的获得，从而突出了对更个性化治疗的需求。mRNA疫苗通过转录和翻译将外源性目标抗原的基因序列传递到人体细胞中，刺激身体产生针对编码蛋白的特定免疫反应，从而使身体能够获得针对这些抗原的免疫保护；这种方法可能被用于个性化癌症治疗。自近期冠状病毒大流行以来，mRNA疫苗的开发取得了实质性进展并得到了广泛采用。在当前的综述中，讨论了mRNA疫苗的开发、它们的作用机制、影响其功能的因素以及疫苗当前的临床应用。重点放在mRNA疫苗在癌症中的应用，旨在突出这种新颖且有前景的治疗方式的独特进展和剩余挑战。 1.引言 癌症仍然是对人类健康构成严重威胁的疾病，其发病率持续上升。近年来，新发病例数和癌症相关死亡人数呈显著上升趋势。癌症的发生是一个多因素、多步骤和复杂的过程，其病因尚未完全明确；然而，人们普遍认为它与吸烟、感染、职业暴露、环境污染、不健康饮食和遗传因素等多种因素密切相关。随着生命科学和技术的快速发展，我们对肿瘤的理解更加深入。寻找更有效的治疗方法以提高癌症患者的生存率，仍然是医学研究的核心话题。 mRNA疫苗是一种核酸制剂，可以通过特定的递送系统，通过转录和翻译的方式，将外源性目标抗原的基因序列传递到细胞内，转录的蛋白刺激身体产生特定的免疫反应，从而使身体获得免疫保护。mRNA疫苗是在灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和病毒载体疫苗之后的新一代疫苗。随着基于RNA的技术不断进步，这种创新的治疗模式预计将取代传统疫苗，并可能有能力解决与小分子和抗体疗法相关的问题。除了在传染病中的应用，mRNA疫苗还为包括癌症、罕见病和神经系统疾病在内的疾病提供了更有效和持久的治疗机会。mRNA疫苗不仅一次覆盖多种肿瘤抗原，还通过同时递送人类白细胞抗原（HLA）-I和HLA-II分子，激活更广泛的T细胞反应，从而实现更全面的多角度攻击。因此，mRNA疫苗具有显著的抗癌潜力。目前，全球有数十项与mRNA肿瘤疫苗相关的临床试验正在进行，包括（但不限于）黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌，某些试验中，mRNA疫苗与其他肿瘤免疫药物联合使用。最近开发的mRNA-4157疫苗，已被美国食品药品监督管理局（FDA）宣布为“突破性疗法认定”，并被欧洲药品管理局纳入“优先药品”计划，预计将成为首个上市的mRNA肿瘤疫苗。 本文综述了癌症的当前治疗方法以及mRNA疫苗的开发和现状。在此基础上，还讨论了mRNA疫苗在肿瘤治疗中的价值。 2.癌症治疗  癌症是全球主要的公共卫生问题。根据美国癌症协会发布的最新全球癌症数据，预计2023年美国将有1,958,310例新癌症病例和609,820例死亡。在不同类型的癌症中，前列腺癌、肺癌、支气管癌和结直肠癌几乎占男性所有病例的一半（48%），其中仅前列腺癌就占所有诊断的29%。对于女性，乳腺癌、肺癌和结直肠癌占所有新诊断癌症的52%，其中乳腺癌（BCa）单独占女性癌症的31%。在预计的癌症死亡中，男性中肺癌、前列腺癌和结直肠癌死亡人数最多，女性中肺癌、乳腺癌和结直肠癌死亡人数最多（图1A）。 图1. (A) 不同性别癌症的基本流行病学特征。(B) 肿瘤疫苗的主要类型。 由于医学方法的不断进步，治疗癌症的方法越来越多。根据癌症的类型和阶段以及患者的具体情况，选择合适的治疗可以显著延长生存时间并提高生活质量。癌症的治疗方法主要包括手术、化疗、放疗和免疫疗法。然而，单一的治疗方法对癌症的治疗是不够的，简单的治疗方案增加无法达到目标。因此，需要合理和全面地使用各种方法来更好地控制和消除肿瘤；即，应尽可能采用当前的综合多学科方法。 随着疫苗接种因数字时代的新兴创新而得到推广，接种具有个体肿瘤突变的患者可能成为癌症的第一种真正的个性化治疗。所有能够刺激身体产生对抗肿瘤发生病原体因素的制剂或激活特定免疫以对抗癌症的免疫逃逸效应并治疗肿瘤的疫苗都可以称为肿瘤疫苗。预防性疫苗与传统疫苗类似，主要针对与癌症直接相关的病原体微生物，如人乳头瘤病毒（HPV）和乙型肝炎病毒（HBV）。此外，还有针对已经患有癌症的患者的疗效疫苗，这些疫苗通过主要针对肿瘤中存在的“自身抗原”的免疫反应，促进持久的免疫记忆和长期的抗肿瘤反应的建立。 目前，肿瘤疫苗的主要类型如下：i）全细胞疫苗；ii）树突状细胞（DC）疫苗；iii）蛋白质或多肽疫苗；iv）核酸疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗（图1B）。 3.mRNA疫苗概述  mRNA疫苗的历史  在2019年冠状病毒（COVID-19）大流行期间，mRNA疫苗作为几家制药公司用于创建疫苗的尖端技术而受到关注。值得注意的是，第一个进入I期临床试验的潜在疫苗是mRNA疫苗。Brenner等人在1961年首次将mRNA识别为中枢神经系统中的中介遗传元素。Malone等人在1989年发现，当mRNA被包裹在阳离子脂质{N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵}中时，可以成功转染并表达在各种真核细胞中，这是mRNA基药物概念首次被构想出来的时候。20世纪90年代，mRNA疫苗研究蓬勃发展，临床前试验被应用于包括传染病和癌症在内的一系列疾病。1990年，首次成功进行mRNA体内表达的努力是直接注射体外转录的mRNA足以将mRNA引入小鼠骨骼肌细胞。这证明了mRNA疫苗的可行性。1992年，Jirikowski等人发现，将编码催产素和抗利尿激素的mRNA注射到遗传突变的糖尿病小鼠中，可以在注射后几小时内短时间内治愈病情。Martinon等人在1993年报告了一种体外生成的mRNA疫苗，编码流感病毒的核蛋白以激活小鼠的细胞毒性T细胞。Boczkowski等人在1996年首次发现，用mRNA脉冲的DC是触发T细胞反应的可行方法。Zhou等人在1999年展示了mRNA疫苗对抗癌症的潜力，通过直接将糖蛋白100 mRNA包裹在日本血凝病毒脂质体中注射到脾脏，导致黑色素瘤小鼠模型中肿瘤生长受限和生存时间延长。随着研究的进展和实验程序的改进，mRNA疫苗的安全性、有效性和工业制造能力在过去几十年中不断提高。目前，几种mRNA疫苗正在临床环境中进行测试，或随时可用，以对抗癌症和几种传染病，包括寨卡病毒、巨细胞病毒、流感病毒、偏肺病毒和副流感病毒。为了满足及时有效疫苗的需求，自全球严重急性呼吸综合征（SARS）CoV-2大流行以来，核酸疫苗的研究和开发激增。此外，mRNA疫苗的市值已增长至数十亿美元，预示着mRNA基药物，特别是mRNA疫苗的未来发展充满希望（图2）。 图2. mRNA疫苗的研究历史及肿瘤治疗进展。 mRNA疫苗的机制 mRNA疫苗的制造涉及几个相对复杂的步骤。首先，需要设计并合成所需的mRNA序列；该序列通常包括编码目标抗原或其他治疗蛋白的核苷酸序列，并且应包含适当的5'端帽和3'端尾序列以提高mRNA的稳定性和翻译效率。通过体外转录，合成相应的mRNA，体外转录系统通常由RNA聚合酶、缓冲溶液、核苷三磷酸、锌离子和辅助因子组成，以促进转录。将DNA模板与体外转录系统的其他组分混合，构成含有合成mRNA所有必要组分的反应混合物。然后将这个反应混合物放入适当的反应管中，并在适当的条件下进行体外转录反应。在这个反应过程中，RNA聚合酶识别DNA模板并利用它合成mRNA。合成的mRNA需要被纯化和修饰，以去除杂质并提高稳定性，某些mRNA疫苗可能还需要被包裹在脂质体中以提高其稳定性并促进体内细胞摄取。脂质体通常由磷脂和胆固醇等成分组成，可以在水相中形成具有脂质双层结构的微小脂质囊泡。可以添加表面活性剂（如聚乙二醇）以提高脂质体的稳定性和细胞摄取效率。合成的mRNA与脂质体混合形成脂质体-mRNA复合物。这些复合物可以通过内吞作用机制转染到目标细胞中，细胞膜形成内陷以将脂质体-mRNA复合物带入细胞内。内吞的囊泡将脂质体-mRNA复合物包裹在内体中，然后与细胞质中的其他细胞器融合，并将它们的内容物释放到细胞质中。脂质体-mRNA复合物的内容物释放到细胞质后，mRNA分子被细胞内的核糖体识别并翻译（图3）。 图3. mRNA疫苗的生产过程和主要结构。ORF（开放阅读框）、UTR（非翻译区）、PEG（聚乙二醇）。 一部分外来mRNA逃避了普遍存在的核糖核酸酶的破坏，并被个别细胞特有的自然过程（如发育中的树突状细胞的巨胞饮作用）内化为内体途径，由内体释放到细胞质中。宿主细胞的翻译机制将mRNA翻译成抗原蛋白。信号肽决定了编码蛋白一旦产生后的最终位置。这些可能是为了将蛋白质定位到宿主细胞内的适当细胞器而重组创建的，或者它们可能是原始蛋白质序列固有的。作为替代方案，这种编码的蛋白质可能通过其分泌影响附近细胞的功能，如果它被释放到血液中，它也可以影响远处的器官。细胞质中的蛋白酶分解对细胞重要的抗原蛋白，产生抗原肽表位。内质网是抗原肽表位转移、装载到主要组织相容性复合体（MHC I）类分子上并向CD8+细胞毒性T细胞展示的地方。为了获得更强力和持久的免疫反应，需要将蛋白质产品引导到抗原呈递细胞（APCs）中的MHC II类装载区。这可以通过向mRNA添加编码路径信号的序列来实现。一旦产生的抗原肽表位装载到MHC II分子上，就诱导了抗原特异性的CD4+ T细胞反应，并且装载的MHC II肽表位复合物出现在细胞表面（图4）。此外，通过一种称为交叉启动的过程，被DCs摄取的外来抗原也可以被处理并装载到MHC I类分子上。这允许设计、体外生产和递送任何所需序列到任何类型的细胞。当mRNA作为外来基因的载体时，由于其自我佐剂效应，它可能表现出与mRNA病毒相似的某些特征。APCs可以在翻译前识别mRNA，这种识别触发了模式识别受体的激活，包括Toll样受体（TLR）3、TLR7和TLR8。TLR3、TLR7和TLR8可以检测单链和双链（ds）RNA链，而短的和长的dsRNA丝可以在细胞质中被视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑色素瘤分化相关蛋白5检测。因此，可能会激活I型干扰素（IFN-I）途径，可能会产生趋化因子和促炎细胞因子，并可能激活APCs，所有这些都可能触发强大的适应性反应。 图4. mRNA疫苗的一般作用机制示意图。MHC（主要组织相容性复合体）、TCR（T细胞受体）、PFN（穿孔素）、GzmB（颗粒酶B）。 mRNA疫苗的优势 mRNA肿瘤疫苗平台提供了其他癌症疗法所没有的独特优势。与传统的放疗和化疗不同，它们容易受到药物抗性的影响，mRNA疫苗允许同时覆盖多种抗原，从而克服了癌症治疗中的疫苗抗性。mRNA疫苗和免疫检查点抑制剂（ICIs）的结合可以在逆转抗性途径中发挥作用。因此，预计mRNA疫苗将是ICIs的有用辅助手段，两者的结合可能允许为患者实施精确和个性化的治疗。此外，传统的癌症治疗可能会对正常人体细胞造成重大损害，而mRNA疫苗可以更精确地针对肿瘤细胞。此外，mRNA表达的短暂性质确保了抗原刺激是暂时的，有效地降低了慢性炎症或自身免疫反应的可能性。与其他肿瘤疫苗平台相比，mRNA疫苗具有高度的免疫原性，能够刺激患者更广泛的免疫反应。 尽管mRNA肿瘤疫苗显示出临床潜力，但其经济价值也值得注意。作为一种新疗法，mRNA疫苗在方便性和生产成本方面优于其他细胞和基因治疗产品。市场上的其他基因/细胞疗法，如嵌合抗体受体T细胞免疫疗法（CAR-T），目前的价格为数百万美元，这对患者和社会构成了重大的经济负担。这是因为CAR-T需要为患者进行一系列过程，如细胞提取、修改、体外培养和重新输注，并且很难扩大生产规模，因此很难降低单一产品的成本。相比之下，mRNA疫苗是直接体外转录的。mRNA疫苗的合成和生产步骤是标准化的，允许产品的快速和大规模生产，这将导致产品的重大成本优势。因此，预计mRNA疫苗将为经济能力较弱的癌症患者提供福音，因此在当前的医疗环境中具有重要的经济潜力。 鉴于多种优势，mRNA技术比DNA甚至传统疫苗更具吸引力。体外转录（IVT）合成消除了对细胞的需求以及随之而来的监管障碍，使mRNA生产无疑比大规模蛋白质生产和纯化更容易、更快、更清洁，与传统的疫苗方法形成对比。抗原设计的准确性允许更快地响应新出现的大流行和流行病风险，及时有效地应对。mRNA之所以精确，是因为它只产生特定的抗原并触发定制的免疫反应，与减毒或灭活疫苗不同。mRNA可以通过结合模式识别受体触发和/或促进适应性免疫反应，无需佐剂，而亚单位疫苗需要佐剂来引发免疫反应。核酸疫苗受到HLA类型的限制较少，比肽疫苗更有可能引发更广泛的T细胞反应，因为它们可以编码全长肿瘤抗原，这允许APCs同时交叉呈现或呈现多个表位，具有I类和II类患者特异性HLA。 以下描述了mRNA疫苗相对于DNA疫苗的优越之处。由于DNA疫苗无法工作的核膜屏障被移除，因为只有mRNA需要在细胞质中转录，而DNA必须在细胞核中翻译。因此，有丝分裂和非有丝分裂细胞都可能成功转染mRNA疫苗。此外，mRNA很少整合到基因组DNA中，也不会经历插入突变。第三，由于mRNA被生物过程迅速分解，并且在2-3天后不留痕迹，编码抗原的生产只是暂时的。mRNA疫苗平台的灵活性也有助于生产，因为它允许标准化生产，因为对编码抗原的修改不会改变mRNA主干的物理/化学属性。第四，与其他平台相比，由于生产基于体外无细胞转录过程，因此病毒污染物和细胞衍生杂质的安全问题较少。此外，RNA疫苗通常比DNA疫苗引发更强的免疫反应。这一点的原因尚不完全清楚，但一些理论包括低表达DNA感应机制、不同的核酸感应模式识别受体的表达、DNA进入人类细胞的传递效率低下，以及DNA需要穿过细胞和核膜并在细胞核中转录才能成功转染细胞。 mRNA疫苗的潜在限制 尽管当前SARS-CoV-2 mRNA疫苗的成功促进了癌症mRNA疫苗的研究，但在以下章节中讨论了mRNA疫苗在癌症应用中仍然存在限制。 苛刻的保存条件。mRNA是一个不稳定的分子，由于核糖上的羟基存在，容易被环境中的生物核酸酶裂解。它可以在冷冻保存时保持稳定活性，但对于经济欠发达地区来说，存储成本太高。载体基保护剂如脂质纳米颗粒（LNPs）只能将mRNA疫苗保存最多3个月。Cichlidin也能保护mRNA免受酶促降解，但可能使其更难翻译，影响mRNA疫苗的效力。 单独使用时相对较低的抗肿瘤效果。由于mRNA疫苗的稳定性差、蛋白质的生产周期相对较短、肿瘤细胞的异质性以及晚期肿瘤的免疫微环境通常高度免疫抑制，单独使用mRNA疫苗很难在质量上提高抗肿瘤效果。因此，癌症mRNA疫苗的临床研究进展有限。 缺乏长期实验结果。癌症mRNA疫苗的临床试验目前正在进行，通常处于早期开发阶段。特别是个性化癌症mRNA疫苗的临床试验报告结果仍然有限，且治疗效果在患者之间差异很大。癌症mRNA疫苗的长期试验结果仍然缺乏，因此将其作为癌症常规治疗的路线图还很长。有报道称mRNA疫苗可能与某些罕见的致命血栓事件有关，因此mRNA疫苗接种的安全性也值得长期观察。总之，必须监测癌症治疗中mRNA疫苗的长期疗效和副作用。 监管挑战和伦理考虑。针对个体化新抗原的mRNA疫苗的开发和生产针对个人的基因组数据，因此疫苗可能带来监管和批准挑战。 影响mRNA疫苗的因素 尽管mRNA疫苗有所有的好处，它们的基本特性仍然对它们在癌症治疗中的使用施加了某些限制。例如，mRNA和细胞膜的负电荷使mRNA分布更具挑战性。皮肤和血液中含有胞外核糖核酸酶，这些酶容易分解mRNA。由于其固有的免疫原性，mRNA可能通过激活下游与干扰素相关的途径触发先天免疫。矛盾的是，这种固有的免疫原性促进了mRNA的降解，降低了抗原表达，尽管它可能被用作佐剂样效应来增加免疫反应。体外转录产品中经常发现dsRNA污染物。dsRNA可能通过增强I型干扰素的产生，进一步限制了mRNA的翻译并加强了先天免疫的激活。为应对这些问题，已经开发了几种技术来推进mRNA疫苗的科学。 mRNA疫苗的递送系统。众所周知，mRNA的半衰期约为7小时，没有递送系统的情况下其吸收很差。此外，mRNA是一个天然不稳定的分子，容易被内切核酸酶、3'外切核酸酶和5'外切核酸酶分解。将mRNA疫苗应用于癌症的最大挑战之一是在没有足够高的翻译水平的情况下，将mRNA送入足够数量的细胞。这需要高度针对性和有效的mRNA递送机制。迄今为止，已确定的癌症mRNA疫苗的递送载体包括LNPs、聚合物载体、肽载体、DC载体、细胞外囊泡载体和混合载体。 最发达、有前景且广泛使用的mRNA非病毒递送方法之一是LNP。它由四种组分组成，共同作用以包裹和保护脆弱的mRNA核心：胆固醇、辅助磷脂、阳离子或可电离脂质和聚乙二醇（PEG）化脂质。胆固醇用作稳定剂以增加LNP稳定性，可电离阳离子脂质可以促进mRNA的自主聚集形成约100纳米的颗粒，并通过电离在细胞质中释放mRNA，PEG可以延长LNP复合物的半衰期。天然磷脂支持纳米颗粒形成脂质双层结构。目前，有LNP-mRNA癌症疫苗正在进行临床试验，例如mRNA-4157。 mRNA疫苗的纯化。体外转录的mRNA产品主要是目标mRNA、非目标mRNA、核苷酸、寡核苷酸和蛋白质的组合。通常使用色谱法将目标mRNA从系统中的其他mRNA杂质中分离出来，而沉淀和提取技术则用于消除mRNA中的常见杂质。dsRNA可能通过增强I型干扰素的产生，而dsRNA是RNA病毒基因组复制中间体的模拟物。因此，通过纯化体外合成的mRNA产品，可以有效地减少mRNA疫苗对I型干扰素免疫反应，同时提高mRNA的翻译效率。在IVT期间，可以通过在更高温度下生成RNA或降低Mg2+含量来减少dsRNA物种。Engel等人检查了dT25共轭寡核苷酸亲和支持树脂（dT25-OAS）的纯化特性；由于其非常高的结合能力，dT25-OAS是大规模mRNA纯化的合适替代品。 mRNA疫苗的分子稳定化。提高蛋白表达通常涉及修改序列和/或结构以提高mRNA稳定性（增加半衰期）和翻译的技术。方法包括延长聚(A)尾、改变5'帽、设计非翻译区（UTR）和开放阅读框（ORF）序列模式以及改变特定的核苷酸序列。这些变化导致蛋白质的大量生产延长了一段时间，从几分钟到超过1周。PERSIST-seq，一个基于RNA测序的平台，最近被创建，用于全面表征各种mRNA库的细胞内mRNA稳定性。该平台已经并继续使mRNA药物增强的计算试验成为可能。 5'帽修饰。5'帽是一种保护结构，可以触发mRNA翻译，防止外切酶切割，并控制前mRNA剪接和核输出等功能。先天免疫系统使用5'帽来区分内源性RNA和外源性RNA。关于体外mRNA加帽，有两种标准方法。第一，通过在mRNA转录系统中加入正常的帽类似物m7GpppG结构，可以完成mRNA加帽和体外转录。第二，在第一次体外转录后，甲基转移酶将Cap 0甲基化为Cap 1以进行mRNA加帽。体外转录中用于mRNA加帽的最常用技术是使用帽类似物进行加帽。现在已经开发了几种帽类似物。在m7G内部的核糖部分改变的抗反向帽类似物（ARCAs）是最常报道的帽类似物。为了提高mRNA的质量，最近还开发了对ARCA结构的额外改变。例如，基于ARCA的磷修饰通过增加mRNA对eIF4E的亲和力，可能通过减少其对脱帽酶的敏感性并提高翻译效率来增加mRNA稳定性。在ARCA中插入一种新型化学改变的帽类似物可以增加mRNA的半衰期，防止它被mRNA脱帽酶2脱帽。2018年，‘CleanCap’，一种共转录加帽技术，被创造为另一种帽类似物。与传统的第一代帽类似物（如mCap和ARCA）相比，它们在较低的效率和反应产率下具有Cap 0结构，这要高效得多。 5'和3'-UTR的优化。mRNA编码区的上游（5'-UTR）和下游（3'-UTR）区域包括mRNA序列的非编码部分或UTR。UTR具有多种功能，包括控制mRNA稳定性、亚细胞定位、翻译效率和mRNA从细胞核输出。通过UTR优化，通常可以增加体内的mRNA表达水平，因此UTR是癌症mRNA疫苗设计的的关键部分。 ORF的密码子优化。ORF区域是mRNA的编码区，因此其翻译速率无疑非常重要。因此，通过选择该区域内的正确密码子，可以最大化mRNA的总翻译效率。为了实现序列优化的目标，使用的方法要么是选择高度表达的蛋白质共有的最佳密码子对，要么是保持目标细胞中高度表达的蛋白质自然存在的每种密码子的相同百分比。此外，为了加快翻译速度，ORF中不常见的密码子通常被替换为具有增加的转运RNA（tRNA）丰度的密码子。在这种情况下，可以确保在生产外来mRNA和/或使用宿主密码子增加高度表达基因的翻译时，具有足够的tRNA水平。为了控制翻译延伸速率，可以优化ORF的鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）含量。另一种与更高GC含量直接相关的密码子优化技术是尿嘧啶枯竭。RIG-I可以识别富含尿嘧啶的区域，当它被激活时，蛋白质表达可能完全停止。 聚(A)尾修饰。在mRNA构建的3'端是一个被称为聚(A)尾的聚腺苷酸区域。它对mRNA的酶稳定性和翻译都很重要。为了控制翻译效率，它特别与几种聚腺苷酸结合蛋白结合，并与mRNA序列5'端的7-甲基鸟苷帽（m7Gppp）合作。根据早期研究，聚(A)尾在控制mRNA的稳定性和翻译效率方面至关重要。发现较长的尾巴可以在多种细胞类型中增加蛋白质表达水平。另一方面，根据Lima等人的研究，较短的聚(A)序列可能会促进这种封闭循环形状以实现有效翻译。总之，为了最大化mRNA的翻译效率，应该根据不同的细胞类型修改聚(A)序列的长度。 修饰核苷酸。某些mRNA核苷酸在mRNA成熟期间经历转录后修饰。可以使用这些天然存在的修饰核苷酸（如5-甲基胞嘧啶和伪尿嘧啶）合成IVT mRNA。当IVT mRNA具有如伪尿嘧啶等修饰核苷酸时，表现出更好的翻译效率和稳定性。这被假设是因为核苷酸防止TLR、RIG-I和RNA依赖性蛋白激酶R（PKR）被激活，使IVT mRNA对细胞质TLR（如TLR3、TLR7和TLR8）以及RIG-I和PKR不可检测。然而，有建议称，未修饰的mRNA疫苗可以帮助免疫系统识别肿瘤细胞，在这种情况下，不需要修改癌症mRNA疫苗。 佐剂。佐剂是一类物质，无论是天然的还是人造的，都能被免疫系统轻易识别并用来增强预期的免疫反应。注射其相应的佐剂可以提高对抗原的免疫反应，即使mRNA疫苗本身具有自我佐剂效应。目前，向mRNA中添加佐剂是一个热门的研究课题。 一种名为TriMix的mRNA佐剂由三种免疫调节分子组成：CD70、CD40配体和活性TLR-4。对III期或IV期黑色素瘤患者进行TriMix mRNA治疗，连同额外的肿瘤抗原mRNAs，这导致持久的临床缓解和增强的免疫反应。最近建立了一种用于c16-r848的mRNA疫苗NP技术的佐剂脉冲。这种技术显著提高了ova特异性CD8+的扩增，这使得激活的T淋巴细胞能够穿透体内的肿瘤床，而在没有佐剂的mRNA疫苗NP中没有观察到这一点。RNActive（curevac Ag）疫苗平台和RNAdjuvant是其他流行的佐剂。此外，某些mRNA递送载体，如精蛋白和阳离子脂质，可能增强佐剂的效果。Pam2Cys是一种合成的中性脂肪酸，可以通过TLR2/6途径发出信号，已被证明能触发体液和细胞应用免疫反应，这使其成为一个有前途的候选佐剂。最近的一项研究将Pam2Cys整合到mRNA-LNP中以提高mRNA疫苗的效力。在使用这种疫苗的预防性和治疗性肿瘤模型中，CD4+和CD8+ T细胞依赖的抗肿瘤反应显著增强，同时记忆抗肿瘤反应也得到了建立。因此，Pam2Cys在开发未来的癌症mRNA疫苗中具有重要价值。 4.mRNA疫苗在传染病中的应用  mRNA疫苗主要用于治疗癌症和传染性疾病。目前，约有140项临床研究正在评估mRNA疫苗治疗各种疾病。自我复制或复制RNA疫苗和非复制mRNA疫苗是已经评估的两种主要类型的RNA疫苗。复制体是自我复制的mRNA，由RNA病毒产生，其结构病毒蛋白被替换为编码RNA聚合酶和抗原的mRNA。因此，这些mRNA增强了免疫原性并延长了蛋白质表达，从而提高了效率。 自我复制的mRNA有两种ORFs，一种编码目标抗原序列，另一种编码病毒复制机制，与传统的非复制IVT mRNA的“成熟”真核mRNA不同。这允许细胞内长期RNA扩增。非复制mRNA疫苗的递送机制可能进一步被识别，因为它可以直接注射到一系列解剖区域或通过体外装载DCs。虽然现在有几种机会使用自我复制的mRNAs来预防传染病，但其作为癌症疫苗的使用主要限于临床前研究，并且只有少数临床研究已经进行。 由病毒感染引起的疾病。基于核酸的疫苗通过在免疫期间在体内表达疫苗抗原，模仿病毒感染来诱导体液和细胞毒性T细胞反应。这一好处对于消除感染或细胞内病原体至关重要，需要强烈的体液和细胞免疫反应来提供有效的保护（图5）。 图5. mRNA疫苗在治疗多种疾病方面展现出巨大潜力。NSCLC（非小细胞肺癌）、HIV（人类免疫缺陷病毒）、HSV（单纯疱疹病毒）、SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）。 引起流感的病毒。避免流感的最有效方法是接种疫苗。与传统疫苗相比，编码流感病毒效应蛋白（s）的保守区域的mRNA疫苗可能诱导产生特定抗体，改善预防和理想的治疗效果。此外，由于开发过程更快，mRNA疫苗对新型流感病毒的开发更简单。这表明mRNA疫苗可以作为管理流感的快速和适应性工具，无论是季节性还是大流行性。 人类免疫缺陷病毒（HIV）。在首次使用裸露的mRNA（ihivarna）结合新的HIV免疫原序列（HTI免疫原）进行的人类临床试验中，使用DC激活方法（trimix：CD40配体（CD40L）+ CD70 + 编码组成性活性TLR4（CATLR4）RNA）和疫苗接种，疫苗安全且耐受性良好。它迅速增加了外周CD4 T细胞中的HIV-1 DNA和RNA，并触发了适度的HIV特异性T细胞反应。激活性佐剂trimix和来自HIV-1结构蛋白的16个保守片段（GAG、pol、Vif和Nef）组成了HTI trimix。它编码了一个强大的激活信号和一个高效的HIV重组抗原，使其成为mRNA基治疗HIV-1的有前途的新型疫苗候选物。根据临床前的发现，它可能成功刺激T细胞，成熟DC的释放和抗病毒细胞因子的释放（特别是IFN-γ）。HTI-TriMix的I期和IIa期临床研究在2019年底完成。IIa期研究中的HIV-1阳性个体在0-2周和4周接受了三次疫苗接种，这是通过超声引导使用腹股沟淋巴结确定的。 单纯疱疹病毒（HSV）。最近开发了一种针对HSV-2病毒颗粒上发现的C、D和E糖蛋白的三价疫苗。在HSV-2侵袭后，疫苗可以保护动物免受生殖器感染和随后的病毒脱落。此外，疫苗产生了交叉反应性抗体，中和了HSV-1并提供了对HSV-1感染的保护。因此，这种疫苗为生殖器HSV-1和HSV-2感染提供了强大的保护，并且是适合人体测试的候选疫苗（图5）。 黄病毒。许多黄病毒，如寨卡病毒、波瓦桑病毒、登革病毒和蜱传脑炎病毒，已使用mRNA疫苗进行治疗并预防感染。对寨卡病毒的mRNA疫苗引起了极大的兴趣。Richner等人创建了一个包含野生型或突变型ZIKV结构基因的LNP包裹的修饰mRNA疫苗，以评估小鼠的免疫原性和保护。在I/II期人类临床研究中，一个类似的疫苗称为mRNA-1893，在10或30微克剂量的初次加强免疫后，导致超过90%的血清转化（图5）。 COVID-19。对COVID-19的mRNA疫苗引起了极大的兴趣。迄今为止，已经生产了几种疫苗，包括mRNA-1273、BNT162、ARCT-021和cvncov疫苗（cv07050101）。mRNA-1273和BNT162b2 COVID-19疫苗几乎相同的94至95%的疫苗效力，以及它们快速的开发和测试周期一年，是科学和医学领域的显著成就。 在开发中的mRNA疫苗中，目前只有针对COVID-19的mRNA疫苗上市。根据已公布的临床数据，COVID-19 mRNA疫苗提供了高水平的保护和安全性。接种mRNA疫苗后，接种者产生的中和抗体水平显著高于那些从COVID-19中康复且未接种疫苗的人，并且表现出增强的免疫反应和记忆。mRNA COVID-19疫苗为16岁及以上个体提供了95%的整体保护，并且能够有效地对20多种病毒变体产生反应。大多数接种mRNA COVID-19疫苗的患者中没有发现临床意义上的安全问题。在一小部分接种新冠mRNA疫苗的人中观察到心肌炎，特别是在年轻男性接种第二剂疫苗后发病率最高。 由细菌感染引起的疾病。针对细菌和寄生虫抗原种类的mRNA疫苗开发尝试有限，其中许多仍处于临床前测试阶段。 Maruggi等人检查了表达A组链球菌抗原（GAS）和无乳链球菌（GBS）的自我放大mRNA疫苗的有效性和免疫原性。自我放大mRNA载体能够有效地产生两种原型细菌抗原：GBS的2a型菌毛骨干蛋白和双突变的GAS溶血素O。在感染GAS和GBS的小鼠中，自我放大mRNA疫苗产生的抗体反应能够持续提供保护。Jawalagatti等人开发了一种创新策略，用于创建可口服的mRNA疫苗。 5.mRNA疫苗在各种肿瘤中的应用  大约25年前，首次展示了基于mRNA的癌症疫苗的可行性。从那时起，mRNA疫苗在癌症治疗中的应用已在多项临床前和临床研究中进行了探讨。到目前为止，只进行了少数几项mRNA癌症疫苗的临床研究。大多数试验集中在急性髓系白血病（AML）、多发性骨髓瘤、间皮瘤、胶质母细胞瘤、恶性胶质瘤和肾细胞癌，以及胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌（BCa）、非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌和结直肠癌的mRNA疫苗，并且仍处于早期阶段（I和II）（图5）。Moderna和默克夏普多美公司宣布，2023年7月，首个mRNA个性化癌症疫苗（mRNA-4157）和抗程序性细胞死亡1（PD-1）单克隆抗体（Keytruda）的组合疗法进入了III期临床试验。这是首个进入III期临床试验的mRNA癌症疫苗。表I总结了mRNA疫苗治疗癌症的临床试验。 胰腺癌。越来越多的数据表明，胰腺癌的肿瘤内和肿瘤间异质性，特别是与免疫微环境和基因改变有关，与治疗抵抗性相关。传统的癌症治疗方法通常会导致获得性抵抗，强调了需要针对性、个性化的护理。在患有胰腺导管腺癌的患者中，最近使用辅助定制的mRNA新抗原疫苗autogene cevumeran的I期临床研究表明，疫苗刺激了T细胞活性，这可能与疾病的复发延迟有关。在临床试验中，19名患者中有16名在接受了Atezolizumab治疗后接受了cevumeran治疗；接受mRNA疫苗的16名患者中有8名产生了持续产生IFNγ的T细胞易位，证明了mRNA疫苗的免疫持久性。对疫苗有反应的受试者的中位无复发生存期（RFS）在中位随访时间为18个月时尚未达到。反应者的RFS明显高于非反应者。因此，可以得出结论，Atezolizumab（一种抗PD-L1单克隆抗体）与mRNA疫苗结合，诱导了广泛的T细胞活性，并延迟了胰腺癌的复发。Kang等人表明，在进行手术切除并有延迟复发风险的胰腺导管腺癌（PDAC）患者中，个性化的mRNA新抗原疫苗autogene cevumeran（BNT122）与Atezolizumab和mFOLFIRINOX（PDAC手术后的标准辅助化疗方案）结合使用，诱导了显著的T细胞活性。 结直肠癌。针对结直肠腺癌的mRNA疫苗有限。一个重大困难是从几种疫苗候选中筛选出可能适合特定类型癌症的mRNA疫苗。Liu等人确定的潜在mRNA疫苗候选物包括靶向抗原血栓蛋白2、卵泡抑素样3、肌钙蛋白T1、大囊泡、胶原蛋白三螺旋重复含1和NADPH氧化酶4。该研究还描述了CRC的异常基因表达模式和突变景观。结果可能有助于确定适合免疫治疗的CRC患者，并为创建mRNA癌症疫苗提供理论基础。 黑色素瘤。为了开发mRNA疫苗并确定合适的疫苗接种人群，Ping等人分析了黑色素瘤中的潜在肿瘤抗原。他们的分析揭示了蛋白酪氨酸磷酸酶受体类型C、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素11（SIGLEC11）、环状寡腺苷酸激活的单链核糖核酸酶和单链脱氧核糖核酸酶1、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员1和ADAM样解刀蛋白1可能是黑色素瘤mRNA疫苗的抗原靶标，为黑色素瘤mRNA疫苗的开发奠定了基础。根据Sittplangkoon等人的研究结果，在黑色素瘤模型中，未修饰的mRNA疫苗可能导致产生IFN-I或触发下游信号级联反应，这两者对于引发强效的抗肿瘤T细胞反应至关重要，这些反应调节肿瘤的发展和转移。最近的一项临床研究结果显示，实验性疫苗mRNA-4157/V940结合pembrolizumab可能作为高危黑色素瘤治疗的辅助治疗。与单独使用PD-1抑制剂治疗的患者相比，接受这种组合治疗的个体在手术后复发风险显著降低。 乳腺癌（BCa）。Li等人确定了可能适合mRNA疫苗接种的BCa患者群体以及用于创建抗BCa mRNA疫苗的潜在BCa相关抗原。总共鉴定出三种肿瘤相关抗原：CD74、干扰素调节因子1和蛋白酶体激活亚单位2。这些抗原经常出现突变、扩增或上调，并且与免疫细胞浸润和预后相关。具有B类免疫亚群的患者的肿瘤微环境（TME）可能对mRNA疫苗反应良好。在前列腺腺癌（PRAD）免疫亚型2和3组的患者更有可能从免疫接种中受益，PRAD mRNA疫苗的潜在抗原，包括Kelch样家族成员17、肉碱棕榈酰转移酶1B、IQ基序含有GTP酶激活蛋白3、Lck相互作用跨膜适配器1、YjeF N-末端结构域含有3、卷曲螺旋结构域含有180、MutS同源物5和钙粘蛋白EGF LAG七次跨膜G-型受体3。 肝细胞癌（HCC）。北京协和医学院医院正在进行针对肿瘤抗原mRNA治疗疫苗ABOR2014（IPM511）的首次人体临床试验。该疫苗编码了在HCC患者中经常上调的近20种HCC抗原。该研究旨在评估IPM511单独使用以及与PD-1抑制剂治疗结合使用在经过一线标准治疗后病情进展的晚期HCC患者的安全性、耐受性和初步疗效。该研究目前正在进行中，尚未公布结果，主要研究者表示，IPM511在使用这种方法治疗的第一位患者中已经显示出安全性和临床可行性。 食管癌。最近报道了一项针对晚期食管鳞状细胞癌的个性化mRNA癌症疫苗结合PD-1抑制剂治疗的研究。参与研究的患者首先使用来自病变组织的全转录组测序进行新抗原筛选。开发了一种针对这些新抗原的个性化mRNA癌症疫苗。随后，患者接受了mRNA癌症疫苗与PD-1抑制剂的组合治疗，患者获得了部分缓解；治疗方案的安全性在可控范围内。因此，mRNA疫苗可能是晚期食管癌患者有效的治疗策略。 6.mRNA疫苗在肿瘤治疗中的功能性实现  mRNA疫苗的免疫治疗  癌症现在可以通过免疫治疗有效治疗，鉴于早期临床结果积极，FDA已经授权越来越多的免疫疗法。癌症免疫治疗的基础是免疫系统识别和消除癌细胞的能力。随着近年来针对增强对恶性肿瘤的免疫反应的多类药物的出现，这一研究领域迅速扩大。这些包括各种疫苗接种方法、采用T细胞治疗、免疫检查点抑制剂和细胞因子。 肿瘤抗原。肿瘤相关抗原（TAAs）和肿瘤特异性抗原（TSAs）是两类由mRNA编码的抗原，传统上一直是免疫治疗的靶标。鉴于免疫记忆，专门针对TAAs或TSAs的疫苗可能会针对并杀死表达抗原上调的癌细胞，并提供持久的治疗反应。 TAAs。TAA对肿瘤细胞并不独特。虽然它们也可能存在于健康组织和细胞中，特别是在胚胎组织中，这些抗原在肿瘤中的表达显著升高。Conry等人开发了第一种mRNA癌症疫苗；这种疫苗表明，用编码癌胚抗原（CEA）的mRNA免疫的小鼠在受到CEA表达肿瘤细胞挑战时显示出抗CEA抗体反应。自从这一初步发现以来，TAA研究受到了显著关注，并取得了积极的临床研究结果。Huang等人在胆管癌中鉴定了三种肿瘤抗原，包括CD247、Fcγ受体Ia和转录域相关蛋白，这些抗原与改善的预后和抗原呈递细胞的浸润有关。这些抗原可能作为针对胆管癌的mRNA疫苗的潜在候选物。然而，TAA免疫方法确实存在一些缺点。TAA通常不在恶性细胞中发现。此外，由于并非所有发现的TAA都能诱导抗肿瘤免疫反应，选择TAA可能具有挑战性，疫苗开发成本高昂。肿瘤本身可能会下调TAA，允许在专注于特定抗原时逃脱。最后，TAA也可能存在于正常组织中，针对它们的疫苗可能会引起外周和中枢耐受反应，这可能导致疫苗效力差或针对正常组织的自身免疫。 肿瘤特异性抗原（TSAs），也称为新抗原，是肿瘤细胞因体细胞随机变化而独有的抗原，因此不存在于正常组织和细胞中。肿瘤特异性突变是癌症免疫治疗的诱人靶点，这些突变可能导致新抗原的产生，从而允许开发定制疫苗，因为这些突变的抗原在健康组织中不表达，因此可以被T细胞识别。基于新抗原的疫苗接种相对于基于TAA的疫苗具有以下特点，突显了它们的优势。由于新抗原仅由肿瘤细胞产生，它们只能触发特定于肿瘤的T细胞反应，限制了对非恶性组织的伤害。新抗原提供了通过逃避T细胞对自身表位的中央耐受来引发针对肿瘤的免疫反应的潜力。此外，由于这些疫苗增强的新抗原特异性T细胞反应的持久性，可能提供长期防止疾病复发的保护，并提供超出治疗的免疫记忆。为了使患者对转移性胃癌产生免疫，Cafri等人最近将经过验证和表征的新抗原和预测的新表位以及驱动基因突变结合到一个单一的mRNA构建中。开发的疫苗证明是安全的，并且产生了针对预期新表位的T细胞反应，这些新表位在免疫之前尚未被发现。尽管取得了进展，使用新抗原仍然面临几个挑战；这些障碍源于生物学和技术因素，包括潜在抗原和HLA分子的多态性，对我们对不常见HLA等位基因的HLA结合基序的理解存在差距，以及肿瘤的异质性。 mRNA疫苗的肿瘤抗原递送方法 mRNA转染的DC疫苗。DC可以转染表达肿瘤抗原的mRNA和总肿瘤mRNA，然后可以将其传递给宿主并启动免疫反应。将转染TAA mRNA或总mRNA的DC皮下应用于带瘤小鼠已被证明可以诱导T细胞免疫并抑制已建立肿瘤的生长，这也支持了这两种不同转染方法的可行性。接受顺铂治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的患者，当Kongsted等人转染表达多种TAA的DC时，没有出现不良反应；约50%的研究参与者表现出免疫反应。现在正在进行一项针对肺癌患者的1期临床试验，评估MIDRIXNEO，这是一种针对肿瘤新抗原的定制mRNA加载的树突状细胞疫苗。 直接注射。有几种方法可以直接将编码肿瘤抗原的mRNA注入宿主体内。局部细胞，如APC，吸收mRNA并将其转移到细胞质中进行翻译。通过淋巴结内注射是传递肿瘤抗原的最常见方法之一。2012年对29名晚期黑色素瘤患者的1期研究开始了；这项试验的未发布数据显示，淋巴结内mRNA注射是安全和可行的（NCT01684241）。编码酪氨酸酶、前黑素体蛋白、MAGE家族成员A3（MAGE-A3）、MAGE-C2和肿瘤中优先表达的黑色素瘤抗原以及TriMix mRNA在静脉内注射时耐受性良好。在另一项1期临床研究中，研究了针对III期和IV期黑色素瘤患者的新抗原特异性mRNA疫苗的淋巴结内递送，该疫苗由针对患者的20种突变组成（NCT02035956），这表明可以利用个体突变。 通过皮肤给药。通过皮肤可能实现由mRNA表达的肿瘤抗原的给药。小鼠通过基因枪将编码增强型绿色荧光蛋白和黑素细胞自身抗原TRP2的IVT mRNA注射到皮肤上。这成功地引发了针对抗原的细胞免疫，对B16肺转移和诱导类似白癜风的毛发脱色起到了保护作用。在一项涉及21名转移性黑色素瘤患者的1/2期临床试验中，将编码六种与黑色素瘤相关抗原的mRNA通过皮内注射，使用精蛋白凝聚的裸mRNA，安全且成功地注射到4名可评估患者中的2名。此外，在7名可测量疾病的患者中，有1名对疫苗表现出完全反应。 通过鼻内给药。通过mRNA编码肿瘤抗原的粘膜途径可以有效地引发全身免疫反应和局部粘膜免疫。通过鼻内递送可以达到鼻相关淋巴组织，这是一个有利的位置，可以促进抗原内化，以促进对癌细胞的保护反应。在侵袭性刘易斯肺癌模型中，Mai等人通过腹腔内免疫小鼠，使用阳离子脂质/精蛋白复合物携带编码角蛋白19的mRNA，这减缓了肿瘤的发展并引发了强大的细胞免疫反应。 通过静脉内给药。Sahin等人研究了编码四种非突变肿瘤相关抗原的黑色素瘤fixvac（bnt111）静脉内脂质体RNA（rna-lpx）疫苗。rna-lpx疫苗是一种成功的免疫治疗方法；针对疫苗抗原实现了强大的CD4+和CD8+ T细胞免疫，伴随着有利的临床反应。在某些反应者中，抗原特异性细胞毒性T细胞反应是持久的，并且常常记录采用T细胞治疗。 mRNA编码的免疫调节剂。肿瘤免疫疗法，也称为主动非特异性免疫疗法，是最早使用免疫系统调节剂的医学领域之一。体外靶细胞转染，或静脉内或肿瘤内递送，是体内通过mRNA产生免疫调节剂的主要方法。由于细胞因子，免疫系统的细胞可以在短距离内进行通信，细胞因子是先天和适应性免疫的重要调节剂。为了刺激癌症患者的免疫系统，细胞因子疗法已成为一种重要的治疗手段，并且是当前临床癌症研究的主要课题。mRNA编码细胞因子基免疫疗法的目标是以最少的毒性和系统暴露从递送重组蛋白中增加TME中的细胞因子数量。 鉴于其强烈的促炎特性，IL-12是癌症免疫疗法的一个有希望的选择。IL-12信号诱导1型T辅助细胞（Th1）分化、CD8+细胞获得细胞毒性活性以及激活IFN-γ的产生，所有这些都改善了吞噬功能和局部炎症。T细胞转染mRNA产生由p35和p40亚基组成的单链IL-12（scIL-12）是研究的主题之一。在同源和异种移植小鼠模型中，scIL-12表达T细胞的肿瘤内注射导致注射和远处肿瘤病变的完全排斥。通过与4-1BB配体（4-1BBL）mRNA共电穿孔，进一步增强了T细胞的抗肿瘤效果。已经显示，新型肿瘤内IL-12 mRNA治疗可以刺激Th1 TME转化和强大的抗肿瘤免疫。此外，在对检查点抑制剂有抵抗力的小鼠肿瘤模型中，将免疫检查点抑制剂与IL-12 mRNA结合使用，增加了抗癌反应，增强了总生存期（OS）和肿瘤退缩。 已经验证了多种mRNA编码不同细胞因子的免疫治疗效果。Hotz等人在肿瘤内给药后检查了编码四种细胞因子的mRNA，IL-12、IFN-α、IL-15 sushi和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。这些细胞因子可能促进免疫记忆的发展，并具有强大的抗癌作用。Hewitt等人表明，在各种TME中，直接肿瘤内给药编码这些细胞因子的mRNA产生了强烈的抗癌反应。 肿瘤免疫疗法除了细胞因子外，还涉及mRNA编码的刺激配体和受体。免疫系统从刺激配体和受体接收炎症信号，这些信号可用于癌症免疫治疗。通过暂时为细胞提供刺激受体，mRNA可用于暂时激活强大的炎症信号。虽然这些免疫刺激剂不被视为癌症疫苗，但它们通常与其他免疫治疗方法（如检查点阻断调节剂）联合使用，以增强体液和细胞反应。一些研究表明，使用编码共刺激分子的mRNA电穿孔后，DC的免疫刺激活性显著增加，包括CD83、肿瘤坏死因子受体超家族成员4（也称为OX40）和4-1BBL。Trimix mRNA是一种由三个mRNA分子组成的mRNA基佐剂，编码CATLR4、激活刺激因子CD40L和共刺激分子CD70，该佐剂于2016年创建。Loomis等人表明，通过肌肉注射连接的体外转录mRNA-TLR7激动剂，可以在体内增强抗原特异性的细胞介导和体液反应。TriMix mRNA单独使用（TriMix mRNA加TAA mRNA，或自体单核细胞衍生的mRNA共电穿孔的树突状细胞与编码CD40配体、CD70和组成性激活的TLR4的mRNA，称为TriMixDC-MEL）以及与ipilimumab检查点抑制剂（一种阻断CTLA的单克隆抗体）联合使用，都能引发强大的免疫反应，从而带来有希望的临床反应和延长无病生存率（NCT01676779和NCT01302496）。这些II期研究是针对III/IV期黑色素瘤患者进行的治疗。 mRNA编码的抗体。自从首个抗体被批准用于癌症治疗以来，肿瘤学领域以越来越快的速度开发了基于抗体的治疗方法。因此，现在有几种获批的抗体和正在进行临床审查的其他候选物。Thran等人展示了mRNA在体外产生各种抗体和抗体类型的能力。此外，编码肿瘤抗体的mRNA可能引发强大的抗肿瘤免疫。 抗体在肿瘤治疗中的参与可以通过以下方法分类：i) 抗体在结合目标受体后，可能通过诱导凋亡信号或去除关键的生长信号，促进肿瘤细胞的直接死亡。ii) 通过附着于癌细胞特异性抗原，激活免疫介导的细胞死亡，诱导补体依赖性细胞毒性（CDC）或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。iii) 阻断免疫检查点，涉及阻止PD1或CTLA4抗体，重新激活针对癌细胞抗原的T细胞反应，并触发免疫介导的细胞死亡。iv) 直接与癌细胞结合的T细胞，启动免疫介导的细胞死亡。 单克隆抗体（mAb）、mAb片段和工程变体（如二价抗体、三价抗体、小抗体和单域抗体）是参与肿瘤免疫治疗的抗体类别。单克隆抗体和双特异性抗体都经过了广泛的研究和使用。 首个获得癌症治疗许可的mAb，利妥昔单抗，靶向CD20并诱导CDC，以及较小程度的ADCC。它用于治疗慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金淋巴瘤。在体外前B细胞淋巴瘤模型中，编码这种mAb的mRNA是有益的。由于曲妥珠单抗抑制激酶活性、下游信号和人表皮生长因子受体2（HER2）/Erb-B2受体酪氨酸激酶2受体二聚体化，癌细胞饿死并最终死亡。通过与癌细胞上的诱导凋亡受体结合的拮抗性抗体，如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体和抗体-药物偶联物，尤其是向癌细胞传递有毒有效载荷，也可能诱导直接肿瘤细胞死亡。当使用靶向肝脏的LNP配方鞘内给药时，从血清中检索到编码mRNA的曲妥珠单抗，并表现出ADCC。在HER2/neu阳性乳腺癌异种移植模型中，这种方法增加了存活率。通过将抗程序性细胞死亡配体1（PD-L1）mAb表达的自放大RNA注入小鼠肿瘤，可以促进转染细胞中PD-L1 mAb的翻译和CD8+ T细胞向肿瘤的浸润。尽管mAbs在癌症方面有多个积极的例子，但较差的组织穿透限制了完整抗体在肿瘤质量上均匀分布的能力。因此，已经努力修改抗体的结构，产生了具有改善的组织穿透性的新型抗体片段。抗体片段的发现在双特异性抗体（BsAbs）的研究中极大地帮助了，并被用作创建这些抗体的构建块。世界上第一个同时结合两种抗原的抗体是在1960年代由Nisonoff等人通过使用适度的再氧化方法将两个兔多克隆抗体血清的抗原结合片段结合起来创建的。 BsAbs相对于常规mAbs的一个可能好处是它们能够同时靶向两个不同的位点，并在一定程度上绕过肿瘤药物抗性。然而，由于BsAbs的血清半衰期很短（仅几个小时），它们必须不断使用输液泵给患者施用。克服这个限制的一个可能方法是使用mRNA直接在患者中产生治疗性抗体。 最近的一项研究强调了一种成功的双特异性靶向方法；一种临床上批准的LNP封装mRNA表达C-C基序趋化因子配体2（CCL2）和CCL5（bisccl2/5I），可以双特异性结合和中和。这显著促进了TAM向抗肿瘤M1表型的极化，并降低了TME中的免疫抑制。BisCCL2/5i与PD-1L抑制剂联合使用已被证明在小鼠模型中，原发性肝癌的胰腺、结直肠和肝脏转移中实现长期存活。Wu等人描述了使用mRNA编码具有消融Fc免疫学效应功能的BsAb。该抗体，也称为XA-1，靶向人PD-L1和PD-1。与直接用于癌症的抗体治疗不同，这项工作表明，使用XA-1 mRNA LNPs治疗可以有效地通过肝细胞产生内源性治疗性BsAbs。 mRNA编码的抗原受体。通过产生转基因T细胞受体（TCRs）或CARs，由于mRNAs的短暂性质，已经有可能为naïve T细胞提供肿瘤选择性。编码CARs或TCRs的mRNA已被证明具有价值；生成CARs或TCRs的短暂表达可以防止细胞因子释放综合征的发展，这是慢性T细胞激活的负面后果。CAR-T细胞作为最有前途的癌症过继免疫治疗方法引起了相当大的兴趣。 CAR-T治疗中，从患者体内提取免疫T细胞，通过体外基因改造，赋予其识别癌细胞表面的“嵌合抗原受体”（CAR）。这些改造后的细胞在实验室中扩增后，再输回患者体内。通常，细胞外的TAA特异性抗体结合域与细胞内的T细胞信号区域融合，形成嵌合受体。几乎每种肿瘤相关抗原都可能成为CAR-T细胞的靶标。然而，CAR-T治疗中也存在一些风险，包括针对非肿瘤组织的毒性。体外转录的mRNA CAR-T细胞作为一种安全的治疗方案正在兴起，因为它们可以避免针对性的抗肿瘤毒性。大多数研究使用mRNA电穿孔的CARs，这是一种实用且可扩展的方法，能够在不损害细胞产品活性的情况下实现淋巴细胞转染率超过90%。CAR表达在T细胞表面大约持续7天，并且在遇到目标细胞后内化的CARs不会恢复。然而，体外转录mRNA方法也有其缺点。包括较差的肿瘤浸润、当T细胞数量有限时制造困难、重复注射CAR-T细胞时副作用的风险，以及mRNA重定向T细胞的短寿命，导致编码蛋白的表达持续数天。最重要的是，电穿孔有各种缺点，可能严重影响生成的CAR-T细胞的质量。实际上，脉冲电场的应用可能会不可逆转地破坏细胞质膜的完整性。在存活的转染细胞中，可能会观察到转基因表达减少、异常的基因表达谱和较差的活性。实际上，研究表明，与未修饰和未纯化的mRNA相比，使用化学修饰的1mΨ mRNA和/或进一步纯化以去除dsRNA的mRNA，小鼠T细胞电穿孔的CAR编码mRNA显示出显著降低的检查点分子（PD-1和淋巴细胞激活基因3）上调。这赋予了免疫沉默的mRNA转染T细胞更大的杀伤力，即使在细胞的CAR表达消失后也能持续。当前结果必须在mRNA CAR-T细胞的生产中考虑，以满足临床试验的目标，目前正在进行mRNA CAR研究，针对血液和实体肿瘤恶性肿瘤。 目前，mRNA CAR-T细胞受到极大关注，并在肿瘤治疗研究中显示出有希望的结果。使用mRNA CAR-T细胞治疗血液恶性肿瘤已经看到了有利的临床前和临床结果。主要靶标包括CD19、CD37、CD33和CD123。已经进行了针对淋巴瘤和白血病的mRNA CAR-T细胞治疗的临床前研究。针对霍奇金淋巴瘤的CD19方法和针对复发/难治性急性髓系白血病的CD123方法都在临床研究中进行了测试。这两项研究表明mRNA CAR-T治疗是安全的。Jetani等人最近提出了一种新的mRNA CAR-T细胞治疗方法，他们确定了siglec-6作为AML中CAR-T细胞的新靶标。Lin等人创建了一种新的CD8+ CAR-T细胞产品Descartes-08，用于治疗多发性骨髓瘤；该产品初步显示出持续的反应和强大的治疗指数。间皮瘤、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤是已经研究了mRNA CAR-T治疗的实体恶性肿瘤。 组合疗法-免疫疗法和mRNA疫苗。mRNA治疗与另一种治疗方式的结合可能在肿瘤治疗中显示出巨大潜力。肿瘤抗原与免疫调节剂之间的相互作用是当前研究的主要焦点。 早期研究表明，将TAA和IL-12 mRNA转染到成熟的DC中可以增强TAA特异性CTLs，这可能被用来触发由NK效应细胞和CTLs介导的针对肿瘤的免疫反应。通过测试编码HLA-II类靶向信号（DC-LAMP）、黑色素瘤相关抗原、CD40配体、CATLR4和CD70融合蛋白的mRNA，证明了使用trimixdc Mel的细胞免疫疗法的安全性和免疫原性。在研究的IV剂量水平下，看到了具有持久疾病控制的抗肿瘤效果。 最近，在转移性肾细胞癌的3期研究中使用了Sunitinib和rocapuldencel-T。通过电穿孔自体免疫，使用成熟的单核细胞衍生的DCs制备的放大肿瘤RNA和CD40L RNA，并没有提高接受组合治疗的患者的总生存期。然而，与总生存期相关的免疫反应得到了增强。 mRNA疫苗的蛋白质疗法 诱导癌细胞死亡的方法。通过使用mRNA疗法，可以使得癌细胞产生一种致命的细胞内蛋白，导致细胞自我毁灭。Van Hoecke等人通过宫内传递编码混合谱系激酶结构域样蛋白的mRNA，导致肿瘤生长停滞和诱导坏死性肿瘤细胞死亡。 蛋白质替代疗法。IVT mRNA在蛋白质替代疗法中的使用是基于产生可以激活或抑制细胞途径的外来蛋白，以及补充缺失或表达不足的蛋白质。自1992年首次用于蛋白质替代的临床前评估以来，IVT mRNA注射已被用于针对几种蛋白质。 鉴于它们的可及性，肝脏、肺和心脏是IVT mRNA基于蛋白质替代治疗的主要靶标。然而，其他组织和器官，如皮肤、眼睛的背面或鼻腔，也被视为潜在的靶标。罕见和遗传性疾病是这种治疗方式的主要目标。疾病引起的下调蛋白与遗传异常有关，并由治疗性IVT mRNA编码。 IVT mRNA作为蛋白质替代疗法正在作为癌症治疗的一种方式进行研究。然而，这是非常困难的，因为它需要反复给药，有时甚至是全身分布，以及靶向mRNA表达。据我们所知，目前在蛋白质替代领域还没有开始使用IVT mRNA的临床试验。 在96%的高级别浆液性卵巢癌患者中存在肿瘤蛋白（TP53）的突变。由TP53基因表达的p53蛋白识别并修复细胞中的DNA损伤，并在损伤无法修复时诱导细胞死亡，从而避免异常细胞的增殖，防止癌症的发生。当TP53基因突变时，表达的突变p53蛋白失去了其致癌效应。在最近的一项研究中，一个团队合成了编码正确p53蛋白的mRNA，并将其装载到脂质体中进行传递，从而允许mRNA在癌细胞中表达功能性p53蛋白。经过上述mRNA治疗后，来自患者的卵巢类器官开始萎缩和死亡，小鼠模型中的原发性肿瘤和转移瘤几乎完全消失。这些发现表明，基于IVT-mRNA的蛋白质替代疗法可能重新激活癌细胞中的致癌蛋白，因此可能成为癌症治疗的宝贵治疗选择。 基因编辑的mRNA疫苗。mRNA技术表达可编程核酸酶，如锌指核酸酶、转录激活因子效应物核酸酶和成簇的规则间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关内切酶（Cas）9系统，允许基因编辑作为一种潜在的治疗手段。通过向细胞基因组提供特定部位的变异，例如纠正有害突变或引入保护性变化，这些基因组工程技术允许替换或修改基因表达。CRISPR-Cas9由Cas9核酸内切酶和单导向RNA（sgRNA）组成，是一种广泛使用的基因编辑工具。CRISPR-Cas9治疗可用于永久性地消除癌细胞存活基因，避免了重复给药的需要，从而提高治疗效果。癌细胞或T细胞被转染了封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中的Cas9 mRNA和sgRNA。mRNA在细胞质中翻译以产生Cas9蛋白，然后与sgRNA复合形成对特定DNA序列有亲和力的核糖核蛋白。接下来，核糖体复合物转移到细胞核以破坏肿瘤存活基因。当这种情况发生在T细胞中时，PD-1和内源性TCR基因被敲除以在肿瘤细胞中诱导凋亡。Ling等人使用针对E6或E7致癌基因的Cas9 mRNA和gRNA治疗宫颈癌。结果表明，这种方法不仅有效地敲除了致癌基因，还逆转了免疫抑制微环境以实现抗肿瘤效果。 再生医学 再生医学的目标是通过重新建立或恢复其正常功能来替代、再生或恢复受损或被破坏的组织、器官或细胞。调节细胞生物活性的蛋白质，如细胞分裂、迁移和分化以及生长因子、细胞因子和转录因子，对再生过程至关重要。将体外转录mRNA转染到体细胞中表达转录因子，是传统的体细胞重编程和转分化的有吸引力的替代方法。在再生医学中使用体外转录mRNA的主要目标是增加1型糖尿病患者分泌胰岛素的能力。使用细胞和间充质干细胞工程进行肿瘤治疗尚未得到广泛关注。已经证明，使用前列腺素E2受体拮抗剂从干细胞中诱导出具有转移干细胞特性的干细胞外泌体，并用于癌症治疗和再生医学。干细胞外泌体可以降低肿瘤抗性。是否可以使用mRNA疫苗表达具有转移干细胞特性的干细胞外泌体用于癌症治疗，这是一个考虑点。 7.结论和未来展望  由于新型抗肿瘤药物和疗法的不断发展，癌症患者的生存几率有所提高；然而，包括肿瘤药物抗性、剂量毒性等问题在内的一些问题，不断带来新的困难。与标准治疗方法相比，大多数恶性肿瘤的生物治疗旨在通过刺激自身免疫和阻断关键信号转导来预防肿瘤生长和发生。人们对于mRNA基技术的长期效果缺乏一些担忧；研究人员正试图使用mRNA治疗挑战目前的疾病治疗方法。 自从Wolff等人证明体外转录的mRNA可以在活细胞中产生蛋白质以来，mRNA疫苗在几个应用中已显示出成功。作为一种有前途的新型平台，基于mRNA的疫苗需要克服冷链保存的限制，并提供更好的适应性、有效性、简便性和可扩展性，以及降低成本。mRNA疫苗在传染病方面已显示出益处，癌症是mRNA技术的预定目标。在未来2-4年内，使用定制癌症疫苗的几项积极的临床研究应该完成。 在肿瘤治疗中使用组合mRNA治疗似乎有着有希望的前景。包括手术、放疗和化疗在内的目前肿瘤治疗方法效果很好。作为一种新型生物治疗，mRNA治疗需要额外的临床试验，以提供一个更好的整合计划，然后才能有效地纳入当前程序。此外，mRNA技术可以与免疫疗法结合使用；目前，大多数研究集中在免疫调节剂上。由于其独特的优势，mRNA也预计将取代ILs、IFNs和细胞集落因子等重组蛋白药物。由于体外转录mRNA在基因编辑技术中减少误差的能力，肿瘤基因治疗可能会取得进展。假设通过将目标基因引入载体来完成肿瘤基因治疗，mRNA治疗最终可能会降低遗传家族性肿瘤的流行率。因此，更广泛的癌症患者可能会从这些新解决方案中受益。 未来对癌症mRNA疫苗的研究应该集中在治疗性和预防性疫苗的开发上。个性化mRNA疫苗为对当前治疗无反应的肿瘤，如胰腺癌，提供了新的治疗策略。此外，mRNA技术可以用来开发针对癌症重要原因的病毒的疫苗，如HPV和HBV。研究表明，在动物研究中，HPV mRNA疫苗比HPV重组蛋白疫苗和HPV DNA疫苗对肿瘤更有效，支持使用mRNA技术开发预防肿瘤的预防性疫苗的未来，这将在临床试验中进一步评估。 此外，mRNA疫苗的灵活性、适应性和快速生产能力将为未来预防和治疗传染病和癌症提供激动人心的可能性，这将有助于减少全球疾病负担。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。