M2 protein

根据世界卫生组织(WHO)的数据，每年有数百万人受到流感的影响。流感是由流感病毒引起的疾病。为了预防这种情况，季节性流感疫苗被广泛认为是预防流感最有效的方法。迄今为止，没有一款“通用”的疫苗可以在世界各地有效地预防所有季节性或大流行性流感病毒类型。由于流感病毒改变了其遗传结构，它可能会出现新的免疫原性（抗原漂移），也可能出现新的病毒亚型（抗原漂移）引起流行病。因此，需要每年重新接种疫苗或开发新的亚型病毒疫苗。目前，三种类型的传统流感疫苗（灭活疫苗、减毒活疫苗和重组疫苗）在不同的国家得到批准，它们基于鸡胚或细胞培养生产。目前，正在努力开发新的流感疫苗，以获得更广泛和更长时间的保护。从这个意义上说，这些候选疫苗被称为“通用流感疫苗”。在本文中，我们首先介绍了流感的短暂历史，病毒的形态和感染，我们描述了流感病毒在人类中引起的疾病。随后，我们详细解释了现有流感疫苗的生产方法、基于细胞培养的生产中使用的生物反应器的类型、传统和新疫苗类型以及更好疫苗的开发策略。 1. 引言 流行性感冒，或通俗地称为流感，是一种传染性很强的呼吸道疾病。自古以来，流感就通过影响动物和人类引起了许多大流行病和流行病。根据迄今为止最古老的记录，希波克拉底在公元前412年首次描述了一种类似流感的疾病。当回顾更近的历史时，可以看到，可以确定的最古老的流感大流行于1890-1891年间首次发生在俄罗斯。当时间来到1918年，发生了世界上发生的最严重的流感大流“西班牙流感大流行”，因为它首先出现在西班牙，并从那里蔓延到全世界。据估计，这场大流行病在1918-1919年间导致近1亿人死亡，总共影响了5亿人。由于1918年西班牙流感大流行，自那以后科学界对流感的认识提高了，对生产预防流感疫苗的研究也逐年加快（图1）。 图1. 根据PubMed的数据在1918-2021年间通过“流感疫苗”关键词搜索的流感疫苗出版物数量 流感分为大流行和流行性（或季节性）。与新冠肺炎疫情类似，大流感疫情也是突发性的，对世界产生了巨大影响。另一方面，每年季节性流感爆发定期影响许多人。大流感爆发是由于出现新的流感病毒亚型而发生的。由于人们以前没有遇到过这些新病毒，群体对它们没有强烈的免疫反应。 另一方面，季节性流感每年都会出现，免疫原性变化很小。因此，由于人们对季节性流感病毒预先存在免疫力，季节性流感的影响不像流行病那样具有破坏性。引起季节性流感的病毒被称为“循环流感制剂”。这里的“循环”一词表示引起季节性流感的相关病毒在人类中继续传播。 来自WHO的数据显示，全球每年有300-500万人因季节性流感疫情住院，29万65万人死于流感。此外，当考虑到季节性流感病例时，据说全世界每年有5-10%的成年人和大约20-30%的儿童被感染。除此之外，住院期间的医疗费用和生病期间的无法工作，都会造成很大的经济损失。统计研究结果估计，美国每年季节性流感造成的经济损失在63亿至2530万美元之间。同时，由于流感病例发生在家畜（尤其是家禽）中，受感染的动物可以被扑杀。因此，大量宰杀这些动物也会在经济和食物供应方面造成问题。 2. 病毒结构形态 迄今为止发现的所有病毒都根据其病毒结构和遗传学进行了分类。流感病毒属于正粘病毒科。目前已鉴定的流感病毒有4种。这些是Alpha (A)，Beta (B)，Gamma (C)，和Delta (D)流感病毒。流感病毒的这种区别是基于两种主要结构蛋白的抗原性差异而做出的。这些是核蛋白(NP)和基质蛋白1(M1)，它们都属于糖蛋白。甲型和乙型流感病毒覆盖了全球所有季节性流感病例。然而，临床病毒鉴定研究表明，仅在全球范围内，甲型流感病毒就导致了大多数季节性流感病例。此外，为调查迄今发生的流感大流行而进行的鉴定测试表明，A型流感病毒是所有这些大流行的原因。此外，乙型流感病毒约占季节性流感病例总数的15%-30%。 图2. 流感病毒结构 甲型流感病毒通过表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原特性进行细分。到目前为止，已描述了18个HA亚型和11个NA亚型。然而，在引起季节性流感的人类流感病毒和历史上引起流行病的人类流感病毒中，只观察到三种HA(H1、H2和H3)和两种NA(N1和N2)亚型。根据历史进展，WHO确定了在人类中传播的甲型流感病毒亚型为H1N1、H2N2和H3N2。这些也被称为人类流感病毒。其中，H2N2不再循环，自1968年以来就没有出现过。根据目前的数据，目前只有H1N1（类似于导致2009年大流行的病毒）和H3N2病毒在传播。为此，抗病毒药物和疫苗开发研究只针对这些病毒类型进行。 乙型流感病毒不像甲型流感病毒那样分为亚型。他们只是分为两个谱系（“Yamagata”和“Victoria”）。此外，乙型流感病毒不会像甲型流感病毒那样引起流行病。因为它们的变异率比甲型流感病毒低得多，而且即使变异，抗原特性仍与甲型流感病毒的原系相似。这样，即使乙型流感病毒是通过变异新形成的，在社会上（尤其是在成年和老年个体中）对这种乙型流感病毒产生预先存在的免疫反应的可能性也相当高。因此，人群中对乙型流感病毒的这种预先存在的免疫反应提供了大量的保护。这使得乙型流感病毒引起大流行的概率非常低。根据到目前为止的一般假设，乙型流感病毒不会引起大流行，因为没有一种新的乙型流感病毒是由于突变而“突然”出现的。正因如此，全球也只有两种乙型流感病毒株多年来一直在人类中引起感染。这些菌株是Yamagata和Victoria Like菌株。除此之外，已经证明C型流感病毒只能感染人、狗、牛和猪。然而，这种感染在人类中非常轻微，不需要住院或特殊治疗。到目前为止还没有发现D型流感病毒会感染人类。由这种病毒类型引起的感染也只见于猪和牛。由于这个原因，整个科学界只致力于预防和治疗由甲型和乙型流感病毒在人类中引起的流感。 流感病毒是具有病毒包膜的单链RNA病毒。流感病毒的一般结构可分为衣壳和病毒包膜。衣壳基本由M1组成。在这种衣壳内有非结构蛋白2(NS2，也称为核出口蛋白，NEP)和非结构蛋白1(NS1)，以及分段的单链RNA分子（图2)，这是流感病毒的遗传物质。在病毒表面，形成包膜的双层脂质层上有病毒蛋白结构，这是流感病毒类型所特有的。 甲型流感病毒和乙型流感病毒都含有8个单链RNA分子，由NP包裹，并与单链RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)组成复合物。所有这些统称为病毒核糖核蛋白结构。在这些病毒体的双层脂膜层（病毒包膜）上，有糖蛋白HA、NA和基质蛋白2(M2)蛋白（一种作为离子通道的跨膜蛋白，对乙型流感病毒来说，这种蛋白是BM2)。与这些蛋白质不同的是，最近发现的NB蛋白被认为是乙型流感病毒特有的离子通道。然而，对于这两种流感病毒，在形成病毒包膜的双层膜层中，HA是最丰富的病毒蛋白，其次是NA（图2）。这些蛋白质结构在病毒上被视为10-14纳米长的突出的尖刺。尤其是哈的形状更像刺，在哈的旁边，纳被描绘成一个有盖的蘑菇。平均直径为120纳米(NM)的流感病毒在病毒表面含有约300-400个HAs和40-50个NAs。除此之外，流感病毒还存在3种不同的形态。它们是(i)丝状，(ii)椭圆形（也称为杆状）和(iii)球形。虽然关于流感病毒为什么具有不同的形态有不同的理论，但这其中的确切原因还没有完全理解。 3. 流感病毒感染 流感病毒会感染人体呼吸道的细胞。然而，人的呼吸道有一个高粘性的黏膜层，它有一个连续的流动来捕获空气中传播的微生物，防止潜在的感染。因此，流感病毒必须首先克服这种黏膜屏障，才能引起感染。在进化过程中，流感病毒形成了一种HA和NABASED机制，穿透这层粘液，感染这层粘液下的上皮细胞。根据这一机制，最初吸入的流感病毒与HA粘附在粘液表面含有唾液酸(SA)的粘液链上。接下来，连接位点的SA被NA切割，病毒连接到下一个SA延伸部分。就这样，病毒以滚动状的运动从粘蛋白链向上皮组织移动。当病毒到达细胞时，它会找到合适的受体，使病毒能够以类似的运动进入细胞，并与细胞结合。在这种结合之后，病毒被带进细胞。HA和NA在病毒上的平衡对于病毒的成功感染也是非常重要的。 人呼吸系统上部的上皮细胞表面主要存在着与α-2,3区半乳糖链结合的SA分子受体(α-2,3gal，简称SAα2,3gal)。流感病毒通过粘液层后，通过识别这些受体基序或模式，特异性地与细胞结合进入细胞。人类流感病毒通常识别α-2,3Gal模式，并与这些受体结合。因此，流感病毒主要感染上呼吸道的细胞。因此，感染通常局限于上呼吸道。然而，在人呼吸道的某些类型的细胞中，也表达大量的α-2,6gal基序和α-2,3gal。与α-2,3gal模式不同的是，SA在α2,6区与半乳糖链结合。特别是下呼吸道的肺泡上皮细胞就是这些细胞类型之一。因此，甲型流感病毒中的其它亚型，如禽流感病毒，主要在鸟类中传播，也可以通过识别该α-2，6gal基序感染人类。正因如此，人呼吸系统下部细胞具有α-2,6gal基序这一事实，是禽流感病毒引起人感染的主要原因。从迄今记录的病例来看，禽流感病毒（尤其是H5N1和H7N9)通常在人类中引起更严重的疾病，而且它们的致死率远高于人类流感病毒。 3.1. 抗原移位和抗原漂移 流感病毒是不断变化的病毒，有两个基本机制使病毒的抗原结构发生变化分别为：抗原漂移和抗原移位机制。抗原漂移（图3A)主要是由于病毒的快速进化和RDRP中缺乏校对（纠正复制过程中出现的不正确碱基配对）机制引起的。因此，点突变是由于RDRP的错误和持续进化过程的帮助而发生的，以更好地适应病毒感染的宿主有机体。这些点突变导致氨基酸序列的改变，尤其是在HA和NA表面糖蛋白中。当这些点突变累积发生在特定的基因区域时，病毒蛋白相应的抗原性状就会发生剧烈变化。同时，通过抗原漂移的变化率随着每个感染-复制周期而持续增加，在这个过程中发生得非常频繁。在这种情况下，如果新出现的突变病毒的表面糖蛋白在小点突变后形成，与突变前的第一种形式抗原性相似，一些先前形成的抗体也可以提供对这种新病毒的保护。这被称为“交叉保护”。然而，由于抗原漂移机制，当病毒表面抗原编码基因（如HA和NA编码病毒基因片段）的同一区域发生多个点突变时，表面糖蛋白抗原性的变化率可能相当高。这样，变异流感病毒在其病毒亚型方面保持不变，但其表面抗原在免疫学上与其原始抗原形式不同。因此，抗原性截然不同的新突变病毒可以从免疫系统中逃逸并引起感染，因为机体中现有抗体对这种新病毒株的特异性下降。因此，每年不断有季节性流感病例出现。 流感基因组的分段结构使得不同亚型流感病毒之间更容易进行遗传物质的交换。这个过程被称为抗原转移（图3b)，病毒的变化在这里发生在一个步骤中。因此，这种机制允许病毒进行不可预测的进化飞跃。 相反，这种情况是由于不同亚型的病毒同时感染单个有机体，在感染期间复制的病毒基因组在它们之间随机重配而发生的。这种交换也被称为“重配”，以这种方式形成的病毒被称为“重配病毒”。在这一机制中，猪扮演着“病毒混合罐”的角色，因为人类流感病毒识别并结合的α-2，3GAL和禽流感病毒识别并结合的α-2，6GAL在它们的细胞表面上几乎相同数量。这个定义也可以部分适用于人类。然而，由于α-2，6gal细胞表面基序只在人类某些类型的细胞上发现，这种情况在人体内发生的概率比在猪体内低得多。抗原转移机制使一些通常不感染人类或不在人与人之间传播的流感病毒有可能对人类产生感染。这样做的结果是，新的病毒亚型可以用这种机制形成。此外，由于它们是以前从未在人类中传播的新病毒，人们对它们预先存在免疫力的可能性相当低。因此，这些新病毒可以在公共卫生领域产生巨大的社会影响，就像流行病的定义一样，由于它们可以发生全球性的流感大流行。 图3. (a)抗原漂移：病毒抗原结构在免疫原性方面的改变。(B)抗原转移：由于两种不同病毒的基因片段发生改变，形成具有两种病毒特征的单一新病毒亚型。 3.2. 人类流感病毒感染引起的疾病 流感通常在流感病毒进入人体后潜伏期为1-2天，症状通常是全身性的，包括发烧，寒战，头痛，肌肉剧烈疼痛，虚弱和食欲不振，这些症状还伴有干咳、流鼻涕、咽痛等症状。尤其是在检查时，如果患者有干咳伴发热，同时考虑到当前的季节，疾病的诊断变得更加容易。此外，在发病时，患者可能会出现眼睛发炎、流泪或眼睛发红，以及畏光。在后期，最突出的症状为干咳和乏力。发病后一两周，患者几乎完全恢复到原来的状态。 然而，流感会在人类中引起更严重的并发症。这些并发症可分为肺部并发症和非肺部并发症，前者主要影响肺部，后者影响身体其他器官系统 肺源性肺炎可分为病毒源性肺炎（或原发性肺炎）和细菌源性肺炎（或继发性肺炎）。病毒性肺炎是由于流感病毒滞留在下呼吸道而发生的，尤其是在禽流感病例中。另一方面，细菌性肺炎的发生主要是由于与流感病毒斗争时免疫系统减弱，病原体在肺部生长所致。因此，免疫系统较弱的个体在患流感时极易继发肺炎。 非肺部并发症主要影响肌肉、心脏和神经系统。与成人相比，这些并发症在儿童中更常见。对于肌肉系统，流感很少会导致肌炎和横纹肌溶解。虽然流感的并发症在肌肉系统中很少发生，但它对心脏影响很大。流感的心脏并发症包括心肌炎、心包炎，并可使患者原有的心脏问题恶化。流感还与神经系统并发症有关，包括Reyes综合征、脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、格林-巴利综合征、无菌性脑膜炎和脑炎。 4. 人体对流感感染的免疫反应 任何病原体一进入细胞，人体免疫系统就开始与之对抗。人体也会产生这种对流感病毒的免疫反应。免疫反应表现为内在（或先天免疫）和随后的适应性免疫，这两者不能完全分开，因为它们在细胞和分子水平上高度联系合作地刺激免疫系统。 4.1. 先天免疫 先天性免疫是人类在进化过程中对各种病原体（细菌、病毒、真菌等）产生的免疫反应。由于这个原因，人体免疫系统也产生了对抗流感病毒的自然反应。另外，另一种自然防御机制是呼吸系统中的黏液层，它阻止病毒到达细胞进行感染。因此，作为一种呼吸道病毒，流感病毒必须首先穿透粘液层，然后到达并感染那里的细胞。这种感染，尤其是在肺上皮开始，随着时间的推移，也会发生在肺部的巨噬细胞和树突状细胞中。然而，由于这些细胞类型的特殊性，在这些细胞中发生的病毒感染是有限的，这要归功于它们增强的内部防御机制（如细胞内一氧化氮释放）。干扰素刺激是通过激活模式识别受体和Toll样受体(TLR)来实现的，这些受体在这些细胞中尤其丰富。虽然这些受体大多是巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞特异的，但所有这些细胞内受体结构也存在于人肺上皮细胞中。因此，免疫系统通过各种细胞因子被刺激，而无需等待病毒到达免疫细胞。 此外，树突状细胞在刺激固有免疫和适应性免疫以及在病毒感染的免疫反应中起着非常重要的作用。这些细胞通过吞噬（与MHC-II）或直接感染（与MHC-I）在感染部位的结果，开始在其表面呈现流感病毒抗原。这样，提呈抗原的树突状细胞随循环进入淋巴结，刺激B和T淋巴细胞，将使适应性免疫得以实现。 4.2. 适应性免疫 首先，先天免疫与流感病毒作战，流感病毒进入体内。然后，这个系统通过特殊的受体刺激许多级联。先天性免疫之后，适应性免疫反应被诱导为更特异性的反应。这其中一个最大的原因是自然免疫不能完全预防感染。适应性免疫分为两个途径分别为：通过T淋巴细胞产生的细胞免疫和通过B淋巴细胞分泌的抗体产生的体液免疫。 4.2.1. 细胞免疫 由于抗原提呈细胞的刺激，T淋巴细胞的产生受到免疫系统对抗相关感染的刺激。T淋巴细胞(CD4+和CD8+)在细胞水平上构成免疫的基础。这些T细胞只能在主要组织相容性复合物(MHC)上以短肽片段的形式呈现给它们时识别病毒抗原。因此，抗原提呈细胞必须将相关的流感抗原提呈给T细胞并激活它们。研究表明，当流感病毒感染时，T细胞（尤其是细胞毒T细胞，TC)对病毒内源性蛋白（如NP和M1)产生特异性反应，这些蛋白是流感病毒中较为保守的抗原结构。因此，TC细胞对病毒内源性蛋白的免疫应答比对病毒中更可变的HA和NA蛋白的免疫应答提供了更广谱的保护。 因为，在大多数亚型流感病毒中，病毒内源性蛋白的抗原结构比HA和NA更保守。当流感病毒感染的细胞在MHC-I上显示这些蛋白时，已经观察到TC迅速识别它们。经此识别后，与感染细胞结合的TC细胞分泌穿孔素和颗粒酶。这两种成分共同导致感染细胞凋亡。另一方面，T CD4+细胞（或一般称为T辅助细胞）提供了多功能的免疫应答。它们参与刺激吞噬巨噬细胞、激活TC细胞和细胞因子的表达以限制感染，同时促进B细胞激活以促进体液免疫。然而，T CD4+细胞只能通过抗原提呈细胞识别感染。当这些细胞在它们的MHC-II上显示病毒抗原时，T CD4+细胞与它们结合，并刺激不同的免疫反应，这是上文提到的。 4.2.2. 体液免疫 体液免疫是以B细胞为基础的。这些B细胞能产生对流感病毒不同抗原部位高度特异性的抗体。免疫优势的机制决定了B细胞产生的抗体主要针对病毒的哪个抗原区域。总之，免疫优势机制可以解释为流感病毒上的抗原区域中，人体免疫系统更偏好哪个区域形成抗体。因此，B细胞大多偏好HA的头部区域产生HA特异性抗体。因此，在流感感染后，会产生大量的抗体，这些抗体是针对HA头部区域的。然后分别是NA的头区、M2的外层区（外域，M2E)和HA的茎区。虽然人体内也会产生针对其他抗原区域的抗体，但已有研究表明，人体产生的针对流感病毒的总抗体中，大部分是针对HA头区域的特异性抗体。此外，还观察到针对病毒内部蛋白如NP和M1的抗体反应。然而，这些抗体反应的水平相当低。因为这些只有当受感染的细胞处于病毒复制周期时才可用。在这个周期中，当细胞机制合成一种新病毒时，在病毒组装的短时间内，这些蛋白质结构通过MHC-I呈现在细胞表面。 因此，对它们特异的抗体可以结合这些蛋白。 除了所有这些之外，疫苗的目标是诱导适应性和内在免疫反应都参与的免疫反应。它们可以显示出对相关疾病的长期保护活性，特别是由于在细胞和体液方面良好诱导的适应性免疫反应。在这方面，传统的和新的候选疫苗，试图通过模仿这些在体内发生的整个感染过程来引发良好的免疫反应。 5.2.4 流感病毒的内源蛋白 流感病毒的内源蛋白通常比其表面蛋白更为保守，因此在通用流感疫苗的研究路线中作为潜在的抗原靶点。然而，这些内源蛋白往往不出现在病毒表面，所以免疫系统无法轻易接触它们。另外，如前所述，这些内源蛋白可直接由流感感染的细胞表面MHC-I复合体递呈。尤其是，NP蛋白和M1蛋白可诱导强T细胞反应。因此，尤其是NP蛋白和M1蛋白或两者的组合可较强地刺激细胞免疫，也使得它们成为研制常见流感疫苗优秀的抗原靶点。 5.2.5 以HA为靶点的研究路线 根据显性免疫机制的原理，HA蛋白是流感疫苗开发研究中最为理想的抗原靶点，但是由于该蛋白复杂的结构，尤其是HA蛋白头部结构域抗原变异之快加大了研制疫苗的难度。因此也常常引发与抗体产生错配的现象。由于HA头部结构域不断变异，以HA为靶点设计的疫苗开发研究中不再以该结构域作为研究靶点，不同的研究路线尝试以HA蛋白的其他抗原结构域作为靶点设计疫苗的开发。通用流感疫苗开发研究中也包含这些研究路线。 5.2.5.1 嵌合血凝素（Chimeric hemagglutinins，cHA） 该研究路线目的是通过连续接种疫苗，以此来提高针对比HA头部结构域更保守的HA茎结构域抗体的含量。该研究路线中，HA其他亚型如H5、H6或H7（称为异头部结构域）这些在人类流感传播中不常出现的结构域取缔H1或H3亚型的顶部结构域成为疫苗研究的靶点。这类结构域称为cHA。在这过程中，通过不断改变头部结构域来获得不同的cHA。该研究路线的目的是利用免疫系统趋势来持续扩大已有的免疫记忆反应。当每次流感病毒的头部结构域更新，机体设法产生针对该结构域的新抗体时，就能分泌针对茎结构域的特异性抗体激发快速免疫反应。因此，在每次接种疫苗后，针对茎结构域的特异性抗体滴度有所提高。此外，免疫系统也会试图建立针对这些异头部结构域的免疫反应。所以，这条研究路线不仅可产生针对异HA亚型的免疫反应，有研究表明，利用H5和H7研制的疫苗还可以提供对抗禽类流感病毒的免疫保护。 5.2.5.2 嵌血凝素（Mosaic hemagglutinins，mHA） 这条研究路线与cHA的方法非常相似。主要区别在于该路线中每一个流感周期中只有抗原表位发生改变，而非整个HA的头部结构域发生改变。异型HA中的抗原表位代替人类流感病毒传播的头部结构域抗原表位作为研制疫苗的靶点。这种抗原表位称为mHA。与cHA同理，该研究路线的目标是通过连续疫苗接种来提高针对HA茎结构域的抗体响应。 5.2.5.3 计算优化HA的广泛反应性抗原（COBRA） COBRA是另一个基于HA的疫苗研发策略。该研究路线是想通过筛选出所有流感病毒的HA的一致序列，来设计出新的通用HA蛋白。根据这一研究路线，如果个体接种了含有通用HA蛋白的基于COBRA技术的流感疫苗，那么免疫系统也因此产生相应的通用抗体。由此认为这些通用抗体能产生针对所有流感病毒HA亚型的免疫保护。此外，在一些研究中通过计算机模拟已表明该路线的可行性。 5.2.5.4 无头部结构域的HA 另一条可选择的研究路线是完全剔除HA的头部结构域。在这一背景下，高度保守的HA茎结构域变为可见并可与免疫系统接触。然而，没有了头部结构域，这些结构变得不稳定且容易错误折叠，这种错误折叠会形成不同的结构域，而这些结构域实际并不存在于HA的茎结构域中。这就引起没有必要的抗体产生。在一些研究中指出，这种无头HA结构可以通过不同方法来增加其稳定性。已经有研究报道利用这些无头HA来研制疫苗并成功产生针对茎结构域的特异性抗体。 5.3 新型候选流感疫苗 虽然目前的流感疫苗可提供良好的免疫保护力，但因为一些问题，流感疫苗的开发研究从未停止。出现的问题分别是：每年更新流感疫苗的需求，有些流感疫苗的低保护力，当前生产体系的缺陷，安全问题，无法产生有效的强细胞免疫反应，以及仅能提供较短的免疫保护期。疫苗研发主要着重于的减少疫苗生产成本和周期，可同时有效激发体液免疫和细胞免疫并能持续较长时间，以及鉴别一些流感病毒的保守抗原结构域。为了研制符合上述要求的更好的流感疫苗，目前已经出现了不同研发策略，各种不同的研究已经在进行中，也由此研制出了很多不同的新型候选疫苗。有些候选疫苗已经在实验室阶段获得较大成功，有些疫苗已经进入临床试验（表2）。除了这些新型疫苗，研究流感疫苗的理想是研发通用的流感疫苗。通用流感疫苗是为了结束根据每年要求的毒株不同生产疫苗的情况，并且能通过一针接种产生抵抗所有不同流感血清型或亚型的免疫力。 表2. 进入临床试验的新型候选流感疫苗 HA：血凝素；NA：神经酰胺酶；NP：核蛋白；NPA：甲型流感病毒核蛋白；NPB：乙型流感病毒核蛋白；M1：基质蛋白1；M2：基质蛋白2；M2e：基质蛋白2 胞外域；PB1和PB2：病毒RNA聚合酶组分（聚合酶1和聚合酶2）；Sf9：黑夜蛾昆虫细胞；WHO：世界卫生组织 5.3.1 VLP VLP含有与病毒相似的形态结构但缺少病毒基因组。因此它们不能引起感染或重组等问题。另外，由于它们具有完整病毒的形态结构，免疫系统可将其识别为病毒。有研究指出，只含有病毒外壳组分（HA、NA和M2）的VLP具有强免疫原性。与其他重组产品相似，VLP的获得可通过构建含有组装成VLP的结构蛋白的表达载体转染至细胞中，并通过细胞表达蛋白。 5.3.2 基于核酸平台疫苗 核酸平台基本包括DNA和RNA疫苗。在这技术平台上，对编码目的流感疫苗抗原区的序列进行测序，转化合成为DNA或RNA序列，形成疫苗。尤其是对于RNA疫苗来说，只有mRNA用于这个目的。因为mRNA是细胞内蛋白表达机制中的基础分子，所以mRNA是最适合的分子形式，引发表达机制产生具有诱导免疫系统能力的抗原蛋白。在这一背景下，疫苗中含有编码目标抗原蛋白的mRNA进入人体后，这些mRNA进入人体细胞中并表达目标病毒抗原蛋白。随后，免疫系统受到合成的病毒抗原蛋白激活。含有DNA（以质粒的形式存在）的核酸疫苗也具有相似的机制，唯一的区别是DNA进入细胞后再合成携带有病毒抗原蛋白基因的mRNA。另外，用于疫苗生产用的DNA或mRNA分子的生产迅速，它们不依赖于细胞培养或鸡胚的生产，而是通过特殊的核酸测序和扩增设备/技术来获得。对于快速疫苗研制，尤其是发生重大的流行病时，这种生产系统具有最大的优势。 5.3.3 病毒载体疫苗 病毒载体疫苗是一种通过在另一种对人类病原性的病毒中表达目的病毒的抗原性组分的疫苗。这一领域已有一些喜人的研究成果。其中一些是利用改良的痘病毒安卡拉株（MVA）并在其中合成HA、M1和NP等流感病毒蛋白。而在另一个研究中，他们利用腺病毒表达病毒表面的HA抗原。这两项研究都对利用病毒载体作为疫苗的潜力进行评估，发现两种病毒载体疫苗均对流感病毒具有高免疫力。这是因为这些载体疫苗同时激活体液免疫和细胞免疫，模拟人体自然感染过程。此外，大多数的病毒载体缺少在哺乳细胞中复制的能力，因此它们的使用是安全的。然而，针对病毒载体本身所产生的免疫力可能会引起一些问题。因为当这些载体进入体内，免疫系统迅速识别载体病毒具有抗原性的部位而忽略了在病毒载体上表达的流感病毒抗原。导致免疫系统引发大多数仅针对载体病毒本身抗原部位的免疫反应，而非针对流感病毒抗原的免疫反应。 5.3.4. 基于蛋白或多肽平台的疫苗 蛋白或多肽疫苗中主要利用具有重要抗原性的多肽或蛋白结构。尤其是利用一些蛋白的保守区，嵌合蛋白如cHA和一些非折叠的全长蛋白。这些蛋白或多肽结构通过化学合成或通过宿主生物合成。当宿主生物用于生产这些蛋白或多肽时，在这过程中重组技术尤为重要。因此这些疫苗也称为重组蛋白疫苗。特别是，有研究指出，融合表达合成的NP和M1蛋白加入佐剂免疫或者通过嵌合在纳米颗粒或VLP表面或内部来运输至体内，能产生良好的免疫应答，诱导CD8细胞毒性T细胞参与该免疫反应中。 5.3.5. 基于纳米颗粒平台的疫苗 纳米颗粒疫苗技术与VLP平台相似，但是它不是通过组装病毒蛋白结构，而是利用不同的纳米级组分（如金、银和壳聚糖等）。另外，不同于VLP技术，大部分的纳米颗粒本身不能触发免疫反应，纳米颗粒实际上作为一个载体，并且加强抗原性病毒蛋白的免疫原性。这些纳米颗粒疫苗的生产主要用这些病毒靶蛋白（如HA、NA、NP、M2等）作为原材料。然后这些蛋白吸附于纳米颗粒表面或嵌合于颗粒内。通过表面结合方法，形成类病毒结构，含有病毒蛋白的纳米颗粒进入细胞内并模拟病毒感染过程。 5.4. 市售流感疫苗的生产方法 对抗包括流感病毒在内的病毒的最有效方法是疫苗，可以在疾病发生前直接预防疾病。此外，考虑到抗病毒药物治疗、住院和医护人员服务费的成本，疫苗是对抗流感的最便宜的方法。 由于这个原因，疫苗生产是一个多年来一直并继续被强调的领域。 传统的流感疫苗被设计成只包含当前循环的病毒类型。因此，就病毒含量而言，基本上产生了两种不同的疫苗配方。这些是三价和四价疫苗。三价疫苗是为预防H1N1、H3N2甲型流感亚型和乙型流感维多利亚谱系而设计的。除了三价疫苗之外，四价疫苗组合物中只添加了乙型流感Yamagata谱系。过去许多流感疫苗是作为三联疫苗生产的。然而，由于四价疫苗提供了更广泛的保护范围，近年来，大多数流感疫苗都是以四价形式生产的。 在今天生产的所有流感疫苗中，流感病毒的靶向抗原部分是HA。因为，根据免疫优势机制，免疫系统对HA头部区域的反应比病毒的其他抗原部位最强。然而，虽然HA的头部区域是免疫系统的一个很好的靶点，但这个区域的抗原变化非常快。所以，这种情况使得每年准备疫苗成为必要。同时，大多数常规疫苗并不是只含有HA。许多市售疫苗也含有大量的NA和流感病毒的不同抗原区域。然而，在确定疫苗制剂的适当剂量时，仍在根据疫苗中HA的数量进行计算。 病毒的主要抗原部位是HA，其次是NA。这些是糖基化的蛋白质。宿主细胞中的翻译后机制对于这些蛋白质通过糖基化过程获得功能非常重要。因此，这种情况使得流感病毒具有种特异性，它们只能感染发达的真核脊椎动物。另一方面，由于病毒的寄生性，无法自行繁殖。因此，它们需要能够感染的活的有机体或细胞。由于这个原因，在所有的生产中，必须选择合适的宿主有机体或细胞。因此，病毒可以感染或适当表达其抗原结构的免疫原性。在这种情况下，目前生产的所有常规疫苗基本上都使用了3种生产方法。它们是：（1）在无特定病原体(SPF)胚胎卵中生产（简而言之，基于卵），(2)基于细胞培养的生产，(3)在重组表达平台上生产（图6）。所有这些生产平台都是从能够执行HA和NA所需的翻译后修饰并允许流感病毒感染的细胞中选择的。 以鸡蛋为基础的生产用于流感疫苗已有近70年的历史。在这种方法中，由于用于疫苗生产的病毒是人类流感病毒，它们一般需要在鸡蛋中进行适应性生产。因为，人类病毒习惯于人类哺乳动物细胞。特别是，H3N2病毒在鸡蛋中繁殖很少。由于用于鸡胚生产的SPF鸡蛋含有属于鸟类物种的细胞，必须创建一种新的接种菌株来有效地感染病毒。由于这个原因，鸡蛋同时被世卫组织选定的候选疫苗病毒和在鸡蛋中表现出良好复制的流感毒株（这被称为高产毒株）感染。这种共感染过程的目的是创造与候选疫苗病毒抗原相似的新病毒，同时它们能够在鸡蛋中大量繁殖。一株在鸡蛋中复制效率很高的高产病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)（简称PR8)被长期用于这种混合感染。 这种共同感染过程的结果是，许多新的病毒出现。然而，在这些病毒中，必须选择一种特殊的2+6重配病毒。“2+6重配病毒”的表达意味着这种特殊病毒必须具有来自候选疫苗病毒的HA和NA基因片段，以及来自高产毒株的其余6个基因片段。这种特殊的重配病毒是经过精心筛选选出的。这种被选中的病毒被称为“接种毒株”。接种菌株确定后，进行实际生产。为了这种生产，许多SPF蛋感染了接种菌株。这一过程始于将接种菌株接种到SPF卵的尿囊液中。病毒在这里大量复制。 然后，为了获得在这里产生的病毒，收集所有感染了接种菌株的鸡蛋的尿囊液。之后，根据要生产的疫苗类型（无活性或减毒）执行其他分离/纯化工艺和制剂工艺（图6）。所有这些过程都是对疫苗中包括的所有病毒类型和亚型单独执行的。最后，所有产生的病毒都按照疫苗确定的配方进行组合。此外，几乎所有流感疫苗都含有等量的所有病毒类型和亚型。 图6. 流感疫苗生产方法流程图。1）蛋基疫苗生产（蓝线）；2）以细胞培养为基础的疫苗生产（紫线）；3）重组疫苗生产（绿线） WHO：世界卫生组织，SPF：特异性无致病性，HA：血凝素。 尽管使用鸡蛋生产疫苗是有效的，且应用时间较长，但这一方法存在以下缺点：(i)需连续使用无特定病原体（SPF）鸡蛋（每剂疫苗至少需要1-2个鸡蛋），(ii)对鸡蛋过敏的个体（对疫苗过敏），(iii)禽流感大流行中怀疑鸡蛋是否清洁，(iv)清洁鸡蛋供应困难。尽管如此，使用鸡蛋生产流感疫苗仍然是全球最常用的方法，主要原因是企业已经建立并满足GMP标准，不想改变这种生产模式。企业与SPF鸡蛋供应商达成的协议，也可能导致企业继续沿用现有的生产模式。另一方面，为避免基于鸡蛋的流感疫苗生产平台的劣势，全球制造商和研究人员也在探索其他生产平台，其中最适用的是基于细胞培养的疫苗生产。全球第一款基于细胞培养的流感疫苗由诺华生产，商品名为Optaflu®，最早于2007年被欧洲药品管理局（EMA）获批上市；2012年被美国食品药品管理局（FDA）获批上市，商品名为Flucelvax®，目前其生产权属于Seqirus公司。 为获得高产量生产，基于细胞培养的疫苗生产需建立接种菌株，或直接以世界卫生组织筛选的候选疫苗病毒进行生产。基于细胞培养的疫苗生产过程中，通常直接将病毒加入培养基，将接种过病毒的细胞进行培养，一段时间后病毒达到足够多的数量，结束生产，然后根据疫苗制剂和类型选择合适的下游工艺。在流感疫苗生产中，最常用的细胞系是犬肾细胞系（MDCK）。近期研究表明，人细胞系如人胚胎视网膜细胞系（PER.C6）和人胚胎肾细胞系（HEK-293）也可用于流感病毒的生产。由于细胞培养系统在生物反应器中进行，需要更少的人力，环境更为可控且无菌，因此相比基于鸡蛋的疫苗生产在质量标准方面具有优势，尤其是细胞培养系统大幅减少了生产面积，因此是首先方案。一项研究表明，为生产一定量的疫苗，细胞培养系统需1,000 L的搅拌釜生物反应器（STR）或12,000个摇瓶，而鸡蛋生产系统需30,800个鸡蛋。 重组表达系统是一种新的疫苗生产方法，Flu Blok®于2013年获FDA批准上市，是最早且唯一获批的一款重组流感疫苗。Flu Blok®的生产基于昆虫细胞系Sf9（绿腹夜蛾细胞衍生细胞系），将携带HA基因的杆状病毒转染Sf9细胞，将重组细胞株在生物反应器中培养，然后纯化得到HA（图6）。虽然重组产品的生产通常选择大肠杆菌等更容易和更廉价的表达平台，但流感病毒的生产需要真核表达平台，以合成具有正确抗原结构的病毒蛋白。 5.5 流感疫苗生产用细胞培养生物反应器的类型和案例研究 使用鸡胚生产疫苗存在严重的问题，例如筛选SPF鸡蛋的困难、工艺繁琐，以及易感人群的过敏反应。另一方面，由于在生物反应器中进行，细胞培养系统比鸡蛋生产系统在质量标准化方面具体优势，人力需求更低，可提供更可控的无菌环境。同时节省生产时间和生产成本，这也是疫苗生产的关键指标。对于传统的基于细胞培养的流感疫苗生产及其他基于细胞培养的疫苗生产研究，使用不同类型的生物反应器，包括STR、波浪式生物反应器、轨道振荡生物反应器、一次性生物反应器，一次性反应器已发展为一种创新的(后接下页) 表3 基于小规模生物反应器生产不同流感病毒的文献回顾 STR：搅拌罐式生物反应器；ATF：交替切向流，TFF：切向流过滤；MDCK：犬肾细胞；Vero：非洲绿猴肾上皮细胞；AGE1.CR.pIX：改良鸭视网膜细胞；MDCK.SUS2：用于悬浮生长的改良MDCK细胞；PBG.PK2.1：猪肾细胞；CAP：人羊膜细胞；DuckCelt-T17：鸭胚胎细胞来源；HEK-293：人胚肽肾细胞；PER.C6：人胚胎视网膜细胞；TCID50: 50%组织细胞感染剂量；PFU：噬菌斑形成单位。 5.5.1. STR（Stirred tank bioreactor搅拌罐式生物反应器） MDCK(Madin-Darby canine kidney cells)细胞是S.H.MADIN于1958年9月建成，来源于马丁·达比犬肾细胞，该肾脏细胞原代培养时其形态类Chemical book<化学书名称>似于成纤维细胞，经过胰蛋白酶和EDTA混合消化液的连续6次消化法纯化而上皮样细胞，每次纯化间隔时间为7D；Vero细胞系是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的。这个细胞系由日本千叶大学的Yasumura 和 Kawakita于1962年3月27日扩增出来。该细胞系取“Verda Reno”（世界语意为‘绿色的肾脏’）的简写而命名为“Vero”。非洲绿猴肾细胞(Vero细胞）是非洲绿猴肾细胞，是一种异倍体细胞，经猕猴肾细胞培养衍化后产生的，和著名的Hela赫尔细胞系、犬肾细胞(MDCK细胞)一样是常用的细胞系)。 细胞培养操作在具有明确流体动力学参数的各种STR中进行；这些生物反应器也可用于工业规模。在该系统中，应用了各种研究和修改，可以保持低剪切力并提高氧转移速率，以在大范围内保持最佳培养条件。如果我们看看STR为生产流感疫苗而进行的研究；在Genzel等人的一项研究中，对T形烧瓶、圆筒瓶和不同实验室规模的生物反应器（搅拌罐和波浪的生物反应器）中粘附的MDCK和Vero细胞产生流感病毒进行了直接比较。通过用MDCK和Vero细胞感染A/Wisconsin/67/2005 HGR（H3N2）病毒株，以分批模式和5L STR进行生产。作为这种生产的结果，MDCK细胞显示10000个病毒粒子/细胞，Vero细胞显示4976个病毒粒子-细胞病毒生产效率。结果表明，MDCK细胞比Vero细胞更能生产流感病毒。MDCK。使用工作体积为1L的微载体系统培养的SUS2悬浮细胞感染流感毒株B/Malaysia/2506/2004，在生产结束时建立了2.75 log HA单位/100μL滴度的高病毒浓度。在本研究中，发现MDCK细胞系是流感病毒产生的优秀模型细胞系。 Gränicher等人进行了研究，以确定源自永生猪肾细胞的PBG.PK2.1细胞系是否可以成为700 mL工作体积生产流感疫苗的新候选细胞系，使用各种生产模式（分批、补料、灌注）和a/PR/8/34病毒株。获得的结果达到了3.93 log HA单位/100μL的最大HA滴度，细胞存活率为95%。他们在分批、补料和灌注系统中分别以5375个病毒粒子/细胞、5006个病毒粒子／细胞和3929个病毒粒子的浓度产生了病毒。对表达的病毒HA抗原的糖基化模式与MDCK和Vero细胞系中产生的糖基性模式进行了比较，发现存在显著差异。最终，他们证明PBG.PK2.1细胞可能是开发下一代流感病毒疫苗的一个好选择。在另一项有希望的研究中，一种源自人羊膜细胞的新开发的CAP细胞系在STR中用a/PR/8/34（CAP适应型）病毒株在1L工作体积和批量生产模式下培养，以其在流感病毒生产中的潜力。获得的结果导致HA滴度高达3.2 log HA单位/100μ。他们表明，CAP细胞可以为几种流感毒株产生高病毒产量，并且可以提供符合工业标准的特征良好的人类细胞系，作为流感病毒疫苗生产的替代品。 另一项研究是通过比较流感疫苗生产中粘附和悬浮适应性MDCK细胞的生产效率进行的。在此背景下，粘附的MDCK细胞适应悬浮培养，并将其生产效率与MDCK进行比较。SUS2细胞系。生产研究采用1L工作体积和分批模式STR进行。结果是MDCK。SUS2悬浮细胞和MDCK粘附细胞显示出相似的HA滴度，分别为2.94和3.15 log HA单位/100μL，TCID50分别为1×109和2.37×109病毒粒子/mL。 悬浮DuckCelt-T17细胞系（由Transgene公司开发的一种新的禽细胞系，由具有鸭端粒酶逆转录酶组成性表达的原代胚胎鸭细胞生产）通过与a/California/07/2009（H1N1）病毒株在400 mL工作体积中培养并批量生产，获得了5.7×109病毒粒/mL的病毒滴度。根据研究结果，DuckCelt-T17细胞系表明，流感病毒，特别是禽病毒株的工业生产是一种合适的替代模型。HEK293SF细胞最近被用于有效地制造流感病毒，提供了有记录以来最高的HA和传染性病毒颗粒滴度。在一项研究中，用批培养模式评估了灌注培养模式，以提高高细胞密度下的病毒滴度。从这个意义上讲，用A/PR/8/34（H1N1）病毒株在3L工作体积中培养的HEK-293细胞在分批模式下达到5.3×1010 TCID50单位/mL的滴度，在灌流模式下达到3.3×1011 TCID50单元/mL。根据这些发现，HEK293 SF细胞是高通量流感病毒产生的良好平台。 在Wu等人的另一项研究中，比较了间歇模式下STR系统和灌流模式下ATF/STR系统中A/PR/8/34（H1N1）感染的MDCK细胞的生产效率，在ATF/STR系统中获得了11690个病毒粒子/细胞的病毒滴度。此外，在Coronel等人进行的一项研究中，AGE1.CR.pIX细胞用于生产甲型流感病毒。为此，使用带有倾斜沉降器的STR系统，该系统以灌流模式运行。本研究的结果是获得3474个病毒粒子/细胞。此外，还有其他利用STR高效生产流感病毒的有前景的研究。在这些研究中，不同的细胞系和不同的流感病毒（包括禽流感病毒）用于病毒生产。 5.5.2.波浪生物反应器 在过去几年中，用于培养和培养基制备的一次性生物处理系统在动物细胞生物处理工程方面取得了迅速的进展。波浪生物反应器的最大工作容积为500升，在各种应用中都有很高的需求，从植物细胞到感染杆状病毒的昆虫细胞。当在一次性细胞培养袋中进行培养时，这允许更快的反应器准备，同时消除了生物反应器系统的投资支出。为了混合培养物，可以以不同的角度和速度摇动微载体上带有悬浮细胞或粘附细胞的细胞袋。顶空通风提供氧气输送。对于不同的制造工艺，不同的细胞袋现在有不同的尺寸和材料（例如，分批、补料分批、灌注等）。这些柔性袋中的传感器需要使用特定的细胞袋，这些细胞袋现在可供使用，允许更简单的pH和pO2控制以及灌注培养。如果我们看一下用波浪生物反应器进行的研究，在Genzel等人的一项研究中，MDCK和Vero细胞在分批模式和无血清培养基中，在2L的工作体积中感染a/PR/8/34（H1N1）病毒株。MDCK细胞的病毒滴度为33255个病毒粒子/细胞，Vero细胞为3990个病毒粒子／细胞。将这些结果与STR中的产量进行比较，发现了3倍的滴度差异，尤其是在MDCK细胞中。波浪生物反应器中的A/PR/8/34感染诱导了活力的快速下降和HA的早期增加，在细胞感染后48小时，该菌株的最大HA值为2.90。将波浪生物反应器与STR进行比较，结果表明波浪生物反应每个细胞产生7000个病毒颗粒，而STR每个细胞产生5000个病毒颗粒。考虑到这些结果，可以看出波浪生物反应器是流感疫苗生产中的一个重要的模型生物反应器。 5.5.3.轨道振动生物反应器（摇床） 灌流培养比允许高细胞浓度（107-108个细胞/mL）和体积输出的其他生长系统更有效和适应性更强。此外，在灌流培养中，可以通过降低产品异质性或限制生长抑制剂和代谢废物的积累来提高产品质量。旋转过滤器、切向流过滤（TFF）或替代切向流过滤器（ATF）用于病毒疫苗生产的实验室规模生物反应器的大多数灌流研究。在为此目的进行的一项研究中，在3种不同的生物反应器系统中培养了感染a/PR/8/34（H1N1）的AGE1.CR.pIX细胞，并研究了这些系统对效率的影响。在获得的结果中；虽然在轨道振动生物反应器中以分批模式获得1286个病毒粒子/细胞，但在具有ATF和TFF的轨道振动生物生物反应器（摇床）系统中，以灌流模式分别获得3059个病毒粒子／细胞和3487个病毒粒子/m细胞的病毒滴度。 5.5.4.一次性固定床生物反应器 一次性生物反应器的初始成本更低，操作更容易，周转时间更短，清洁验证需求更少。台湾Cesco生物工程公司最近创造了两种新型生物反应器：Belloc ell（实验室规模）和TideCell002（工业规模）。Belloc ell生物反应器已成功地用于培养哺乳动物细胞，以获得HDV（乙型肝炎病毒）样颗粒、日本脑炎病毒和昆虫细胞，以合成杆状病毒。当我们研究这些研究时，生物反应器在研究中表现出了高效的特性，它提供了收集具有以下特征的细胞和组分的能力，例如，由于其表面积大，生物量高，移动环境液体而不会因低剪切应力而产生气泡，并且在生产前可以随时使用和消毒。 一项研究使用了在MDCK和Vero细胞中培养的H5N1分支II和H7N9候选疫苗病毒。BelloCellA®固定床生物反应器中的MDCK细胞；获得了RG6（源自A/ Anhui /01/2005（H5N1））、RG30（源自A/ Hubei /1/2010（H5N2））、RG268（源自A/ Anhui /01/2013（H7N9））和H5N1分支II（源自A/Anhui/01/2005的RG6M13C4（H5N1））病毒株，其滴度分别为1519 TCID50单位病毒粒子/细胞、2 TCID50单元病毒粒子/电池、4 TCID50单价病毒粒子/电路和12 TCID50单病毒粒子/芯片。在BelloCellP®固定床生物反应器中，将MDCK细胞感染H5N1分支II（RG6M13C4，来源于A/Anhui/01/2005（H5N1））病毒株，并获得33 TCID50单位病毒/细胞病毒滴度。在TideCell002®固定床生物反应器中，MDCK细胞被RG268（源自A/ Anhui /01/2013（H7N9））和RG6（源自A/ Anhui /01/2005（H5N1））感染，分别获得51和16个TCID50单位病毒/细胞滴度。BelloCell是一种新型生物反应器，具有高细胞密度和生产病毒的能力。BelloCell可以很容易地扩展到TideCell系统的大小，同时保持相同的操作条件。这种创新的生物反应器在流感病毒的产生中对粘附细胞起到了很好的作用，这项研究表明了一次性生物反应器如何快速高效地产生疫苗。 5.5.5.高通量反应器 长期以来，HFBR被认为能够产生高浓度的单克隆抗体和重组蛋白。HFBR最近刚刚作为一种新的一次性平台出现，用于生产高滴度甲型流感病毒。许多中空纤维毛细管将生物反应器分隔在这些生物反应器的毛细管内和毛细管外空间中。细胞经常在毛细血管外培养，在那里它们可以达到极高的细胞浓度。在一项研究中，研究MDCK细胞和MDCK细胞的病毒产生活性。在HFBR中以再循环模式对SUS2细胞进行比较，根据获得的结果，SUS2细胞产生19138个病毒粒子/细胞滴度，而MDCK则提供8110个病毒粒子/细胞病毒滴度。允许悬浮培养物在该系统中生长，表明它们是最有效的。 6.结论 流感是一种高度传染性的呼吸道疾病，流感病例全年持续。特别是，季节性流感病例通常在10月至3月下旬或4月初达到最高点。世界各地的许多人一生中至少患过一次流感。此外，许多人在几周内完全从流感中康复。然而，尤其是在老年人、幼儿、孕妇和慢性病患者中，风险很大。在这些人中，流感感染可能导致住院甚至死亡。世界各地的科学研究表明，接种疫苗是预防流感最有效的策略。因此，建议高危人群应该接种季节性流感疫苗。 目前生产的所有流感疫苗的靶向抗原性病毒部分是HA（hem-agglutination，红血球凝聚）。多年来，这种抗原一直是常规疫苗生产的目标。因此，在常规疫苗中，生产仍基于HA。疫苗生产是通过使用基于鸡蛋的、基于细胞培养的和重组表达方法进行的。基于卵（鸡蛋）的方法生产的疫苗有主要缺点，包括很难找到SPF卵（鸡蛋），以及易感人群可能出现不良过敏反应。与基于鸡蛋的生产相比，基于细胞培养的方法可以提供。由于生产是在具有更可控环境的生物反应器中进行的，因此生产更标准。此外，在基于细胞培养的方法中，疫苗生产需要更少的劳动力和处理时间。因此，使用这种方法可以减少疫苗生产时间和总体成本。使用基于细胞培养的生产生物反应器，流感疫苗生产中最常用的生物反应器类型为STR、Wave、摇床、一次性固定床和HFBRs。 获得许可并可在商业上获得的流感疫苗类型包括灭活疫苗、减毒活疫苗和重组疫苗。这些是通过适当的生产工艺生产的，如上所述，根据其类型。尽管目前的流感疫苗提供了良好的免疫力，但它们也有缺点。这些都是每年病毒毒株更新的必要性、由于抗原错配导致的低保护性、仅针对某些病毒亚型的保护性、常规生产系统的缺陷、难以开发足够的适应性细胞免疫反应以及短期保护性。因此，正在大力开发更好的流感疫苗。为此，正在实施和制定不同的战略，重点是提高保护的效力和持续时间。在这方面，各种研究尝试了非常不同的方法。虽然这些研究包括在目前生产的疫苗中添加佐剂等更传统的方法，但也在尝试新的策略。这些新策略主要是病毒表面抗原（NA、M2和HA）和病毒内在抗原（NP和M1）靶向方法。尽管HA是诱导免疫反应的最理想靶点，但这种抗原结构不断变化的性质使这种情况复杂化。因此，在基于HA的研究中，试图通过聚焦HA的保守区域来诱导免疫系统。由于这些不同的策略，新的候选疫苗已经问世。这些新的候选疫苗是VLP、基于核酸的疫苗、病毒载体疫苗、基于肽或蛋白质的疫苗以及基于纳米颗粒的疫苗。尽管其中大多数仍处于实验阶段，但其临床前结果非常有希望。然而，这些新的候选疫苗中的一些已经开始临床试验，真正接近商业阶段的很少。 基本上，目前所有的方法都有一个共同点，这就是开发一种疫苗，可以提供广泛和持久的保护，防止流感病毒感染。因此，创建一种长期预防季节性、人畜共患（如禽流感病毒）和大流行性流感病毒感染的通用流感病毒疫苗是所有这些努力的目标。 原文来源：Influenza Vaccine: An Engineering Vision from Virological Importance to Production 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:疫苗接种是预防流感的关键工具，但由于流感病毒不断变化的特性，疫苗成分需要每年更新。虽然医疗保健和经济负担有所减轻，但病毒仍然是一个挑战。过去十年的研究揭示了通过基础和临床研究改进的途径。病毒监测在更好地选择疫苗候选病毒和早期检测耐药菌株方面发挥着至关重要的作用。本页提供了未来疫苗发展的描述和当前疫苗选择的概述。在未来几年，我们预计疫苗生产将发生重大变化，从传统的基于鸡蛋的方法转向DNA和RNA疫苗等创新技术。这些新方法比传统的基于鸡蛋和基于细胞培养的流感疫苗生产提供了显著的优势。 流感病毒是一种急性呼吸道疾病，严重影响人类福祉。通常被称为季节性流感，它对疫苗开发构成了持续的挑战。制造流感疫苗主要有三种方法：灭活流感疫苗、减毒活流感疫苗和重组血凝素（HA）流感疫苗。流感具有高变异率，这需要每年两次生产新的重组疫苗以减少其传播。全球卫生组织如世界卫生组织（WHO）和其他利益相关者每年两次召开会议，评估病毒的流行情况，并推荐适合全球使用的疫苗。 疫苗开发通常涉及两类：三价和四价疫苗。三价疫苗包括两种流感A型病毒株和一种流感B型病毒株。它们主要是在鸡蛋中生产的。相比之下，四价疫苗包含两种流感A型病毒株和两种流感B型病毒株，并在实验室中使用重组技术开发。目前正在努力开发一种更有效和全面的疫苗，称为通用流感疫苗。 背景 引起大流行流感的病毒被认为起源于野生水禽，是流感病毒的主要自然来源。基因重配是人感染病毒株与禽病毒株的遗传物质定期交换的过程。 第一种灭活流感疫苗是由密歇根大学的托马斯·弗朗西斯和乔纳斯·索尔克在美国军队的协助下开发的。在1945年被批准广泛使用之前，该疫苗在美国军队成员身上进行了安全性和有效性测试。本文的目标是防止季节性疫苗重新配制的需求，并探索全球可用的各种类型的疫苗。 1.引言 季节性流感病毒是由流感病毒引起的严重呼吸道病毒疾病，这些病毒在全球范围内分布。流感病毒分为四种类型：A型、B型、C型和D型。最致命的类型是流感A型，它可以引起死亡和各种呼吸道疾病。流感B型病毒也会导致人类的季节性流感大流行。季节性流感疫苗，如B/Victoria和流感B/Yamagata，针对目前正在流行的两个谱系。流感C型病毒不会引起流行病，通常引起较轻的流感症状。流感D型病毒被发现可以感染猪、牛和羊等动物，但不感染人类。 近几十年来，发生了几次大流行和年度流行病，对全球经济和公共卫生产生了重大负面影响。流感病毒属于Orthomyxoviridae科，包括包膜RNA病毒。这些病毒具有八段单链负义RNA基因组，可以分为七段（C型和D型亚型）或八段（A型和B型亚型）不同的片段。这些片段编码各种蛋白质，包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）、基质蛋白1（M1）和（M2）、聚合酶亚基（PA、PB1和PB2）、非结构蛋白、核输出蛋白，以及最近识别的蛋白质，如PBI、M42、PB1-F2和PA-X。 流感每年在全球范围内引起重大疾病和死亡。疫苗对于预防未来的流行病和管理当前的流行病至关重要。疫苗已经使用了60多年，因为它们有助于增强生物体的免疫系统。随着时间的推移，对病毒的免疫力自然下降，这就是为什么建议每年接种流感疫苗。季节性疫苗的有效性取决于疫苗株与人群中流行株的匹配程度。病毒改变其基因构成的能力使其能够逃避免疫并再次感染宿主。大流行流感通常由抗原转变触发，这是由于两种共感染亚型株的基因重排导致病毒抗原特性发生显著变化。 几个挑战可能使疫苗计划的效果降低，包括需要预测每个季节常见的菌株、病毒的不可预测性以及人群中可能缺乏对新菌株的先天免疫力。当疫苗病毒与流行病毒株非常匹配时，流感疫苗最有效。为了应对流感病毒的持续演变，世界卫生组织（WHO）及其委员会成员每年两次举行会议，确定流感疫苗的成分。 传统疫苗有局限性，强调了多样化疫苗平台的重要性。分子工程工具加速创新疫苗开发，最终增强疾病保护。基因和蛋白质工程，以及病毒载体疫苗，是增强免疫策略的有希望的方法。探索更有效的递送方法有可能在疫苗开发中取得进一步的突破。防范流感病毒感染的最少侵入性、最具成本效益的策略是疫苗接种。目前，有三种季节性流感疫苗可用：来自鸡蛋和细胞的灭活流感疫苗、减毒活流感疫苗，以及在昆虫细胞中生产的杆状病毒重组HA疫苗（如表1所示）。然而，在疫苗可用性和有效性方面仍然存在各种限制。因此，流感疫苗配方和生产领域的创新技术可能掌握着解决当前流感疫苗限制的关键。本文概述了当前疫苗接种状况和下一代疫苗开发中的有希望的研究。 2.目标 主要目标是提高人们对流感病毒性质以及可用于对抗它的疫苗数量的认识，因为这是一个普遍存在的问题。包括重组HA疫苗、灭活疫苗和减毒活疫苗在内的众多疫苗已经在全世界开发并上市。世界卫生组织（WHO）和其他相关方对这些疫苗进行了认证。其他被称为下一代疫苗的疫苗旨在通过使用颗粒疫苗技术，提高持久性、增强对变异的抵抗力，并预防流感病毒感染。目前提高疫苗效力的发展包括通用流感疫苗和基于纳米颗粒的疫苗；所有这些疫苗都需要每年更新。 3.当前针对流感的疫苗 全球每年预计会有29万到65万例因季节性流感引起的呼吸道死亡，以及3到5百万例严重疾病病例。通常被称为季节性流感的流感病毒，可能会受到环境和天气因素的影响。由于表面糖蛋白HA和NA内的独特突变，该病毒可以逃避人类免疫系统。无论是自然感染还是疫苗接种都不能提供对病毒的终生保护。流感病毒抗原性的微小变化，即抗原漂移，是流感流行病的常见原因。 目前，全球采用了三种疫苗开发平台：灭活流感疫苗、减毒活流感疫苗和重组HA疫苗。这些疫苗各有优缺点。疫苗可以激活细胞和免疫效应物，包括B淋巴细胞产生的能特异性结合病毒抗原的抗体，以及破坏感染细胞并防止其在体内传播的细胞毒性CD8+ T淋巴细胞。由于对流感的保护只是暂时的，所有疫苗都必须定期更新以匹配目前正在流行的病毒株。 为了选择最合适的流感疫苗，每年举行两次会议，期间WHO和其他利益相关者推荐适合全球使用的流感疫苗。这些建议基于不同国家提供的遗传和抗原特性，以及流行病学数据，并与全球流行的病毒进行比较。 目前，各种制造商在市场上提供三价疫苗和最新的四价疫苗。多年来，三价疫苗的开发旨在提供对三种不同流感病毒的保护。这些配方包括一种流感B型病毒株和两种流感A型（H1N1和H3N2）病毒株。此外，还有两种不同的B型病毒株在流行，因此四价流感疫苗的配方中使用了第二种B型病毒株，可以提供对当前病毒突变的保护。目前，官方批准的流感疫苗在HA含量和免疫原性方面有显著的标准化（表1）。 3.1.灭活流感疫苗 基于灭活病毒的疫苗接种是最常用的技术，因为其生产成本低且安全性高。在这种疫苗接种方法中，病毒通常在培养的哺乳动物细胞和鸡胚中生产。虽然可能需要加强注射以维持抗体滴度，但已有证据表明灭活流感疫苗可以产生系统性免疫。有三种不同类型的灭活流感疫苗：分裂病毒灭活疫苗、全病毒灭活疫苗和亚单位灭活疫苗。 在分裂病毒疫苗接种中，通过二乙醚或洗涤剂处理破坏整个病毒的病毒包膜。全病毒疫苗可以通过使用甲醛或-丙内酯化学灭活病毒来生产。亚单位疫苗由进一步提纯的HA和NA组成，去除了所有的包膜。由于A型（H3N2）病毒的初始分离株在鸡蛋中复制不佳，灭活疫苗需要在鸡蛋中适应以实现显著的细胞毒性。在鸡蛋中过多的传代可能导致HA和流行分离株之间的抗原漂移不匹配。为了防止HA的鸡蛋适应性变化，可以使用培养的细胞系，如Madin-Darby犬肾和Vero细胞来实现病毒的适应和复制。然而，这些悬浮生长的细胞系在发酵罐中的疫苗种子病毒滴度通常低于鸡蛋滴度，导致成本增加和产量减少。 3.2. 减毒活流感疫苗 免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白G（IgG）在免疫系统中扮演着重要角色。IgA是主要在粘膜分泌液中发现的同种型，主要在上皮细胞表面发挥作用。另一方面，IgG是细胞外液和血液中的主要同种型，主要在人体组织内发挥作用。减毒活疫苗可以刺激在上呼吸道产生IgA和IgG，这是病毒最初复制的地方。这种免疫反应可以导致交叉反应。然而，有特定潜在疾病或免疫系统受损的个体不建议接种减毒活疫苗。在这些情况下，病毒可能会在个体内部复制并引起更大的感染，可能导致不良后果。 3.3. 重组-血凝素（HA）疫苗 重组HA疫苗显示出经济可行性，并取得了令人印象深刻的结果。一些制造商已经采用了基于昆虫细胞和杆状病毒的重组蛋白表达平台来生产这些疫苗。与基于鸡蛋的流感疫苗不同，重组HA疫苗不表现出不希望的突变，提供了一个显著的优势。此外，HA重组疫苗可以在不到两个月的时间内配制完成，使它们非常适合预防大流行流感病毒。尽管灭活疫苗和HA疫苗具有相同的作用机制，但市面上的重组HA疫苗含有的HA是灭活流感疫苗的三倍，同时产生的抗体与传统灭活疫苗相当。然而，需要注意的是，HA重组疫苗仅限于18岁及以上的个体。赛诺菲巴斯德的Flublok四价疫苗是首个可用的HA重组疫苗。 4. 疫苗平台：代表下一代疫苗 4.1. 病毒样颗粒疫苗 “病毒样颗粒”一词指的是模仿病毒的非复制性颗粒，由表面病毒糖蛋白组成。这些VLPs缺乏病毒遗传物质，但它们模仿病毒的原始形状，并且不能引发感染。已有报告称VLPs是有效的疫苗候选物，并已用于开发针对许多病毒的有效疫苗，如乙型肝炎病毒，包括Heptavax-B、Engerix-B（由GlaxoSmithKline Biologicals在比利时里克森生产）和Hepavax-Gene（由韩国仁川的Janssen Vaccines Corp.生产）。它们也已被用于人类乳头瘤病毒疫苗，如Gardasil、Cecolin、Gardasil-9和Cervarix（均由GlaxoSmithKline Biologicals生产），以及针对戊型肝炎病毒（HEV）的疫苗。因此，已经证明VLP平台是生产疫苗的一种有希望的技术，特别是对于流感。树突状细胞和抗原呈递巨噬细胞可以激活先天免疫，导致病毒特异性T细胞和B细胞反应的有序产生。基于VLP平台的流感疫苗可以将多种病毒蛋白如神经氨酸酶（NA）、血凝素（HA）、M2e或M1结合到一个VLP中，为疫苗配制提供更大的灵活性和更广泛的保护范围。 通过向常规流感疫苗中添加病毒神经氨酸酶，可以诱导全面而平衡的免疫反应。另一方面，M2e可能是未来通用疫苗的重点。由M1和NA组成的VLP触发了具有显著免疫性和交叉反应性的免疫反应，特别是对流感A型。目前正在对某些基于VLP平台的流感疫苗候选物进行临床前或临床试验。2012年，对Novavax的重组VLP疫苗进行了评估安全性和免疫原性的第二阶段临床研究。这种流感VLP疫苗在一次注射后产生了强大的免疫反应，引发了针对植物基VLP流感疫苗的强烈抗原特异性CD4+ T细胞和抗体反应。2019年，Medicago完成了基于植物的VLP（HA）疫苗的第二阶段临床研究。这些VLP疫苗候选物产生了细胞和体液免疫反应，导致产生了针对四种不同流感毒株（两种流感A型和两种流感B型）的抗体，以及交叉保护。 4.2. 纳米颗粒基流感疫苗 传统的流感疫苗可以提供对流感病毒的完全保护。然而，对呼吸道粘膜系统的流感保护也是有益的。纳米颗粒由于其溶解性和稳定性，适合增强粘膜免疫，这有助于防御呼吸道感染。这些纳米颗粒作为抗原的载体，可以由有机或合成材料制成。 以前，番木瓜花叶病病毒纳米颗粒被用作三价灭活流感疫苗的佐剂，结合使用以研究其在小鼠中的有效性。该研究基于抗体滴度，如支气管肺泡灌洗样本和血液中的IgG、IgA和IgG2，表明这种纳米颗粒疫苗在诱导抗流感免疫方面更为优越，尤其是在鼻内免疫后。此外，一种与流感A（H1N1）保守肽结合的聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒被用于鼻内免疫，显示出可以保护猪的肺部。研究表明，这种免疫可以激活特定于抗原的CD4+和CD8+ T淋巴细胞。 为了提高对流感病毒的防御并产生针对多个感染相关途径的交叉保护抗体，螺旋C和基质蛋白2的外域被结合起来创建一个自组装纳米颗粒。然后，这种纳米颗粒被用来结合两个独立的保守流感抗原，成功地在小鼠模型中引发中和抗体。 5. 限制 疫苗中某些纳米颗粒的细胞毒性带来了几个限制。此外，基于纳米颗粒的疫苗递送系统也有缺点。例如，当讨论病毒样颗粒时，多分散颗粒的大小可能不同，生产VLPs缺乏可重复性。在基于脂质体纳米颗粒的疫苗系统中，它们比聚合物颗粒稳定性差，装载抗原的能力有限，并且表现出较差的胃肠道稳定性。基于免疫刺激复合物的纳米颗粒疫苗含有水溶性抗原，这些抗原难以结合。抗原没有得到聚合物的充分保护，由于聚合物过早释放抗原，它们提供的抗原保护较少。基于无机纳米颗粒的疫苗递送技术不是生物可降解的，在水中的溶解度低。基于脂质纳米颗粒的疫苗递送技术装载效率低，在储存过程中会出现药物泄漏。外泌体也可以量化；然而，这个过程昂贵且不够敏感。 6. 纳米药物作为疫苗的挑战 来自世界各地的研究人员一直在关注与纳米药物和疫苗相关的问题，特别是纳米药物的生产成本比常规药物更高。此外，医院经常发现采购这些药物的费用过高，导致医疗保健部门不愿使用它们。纳米药物的监管方面是最大的障碍，需要解决。疫苗的特性变化，由于纳米技术，改变了它们在纳米尺度的生物安全概况。当涉及医疗设备时，监管变得更加具有挑战性，因为在纳米尺度上将它们与药品区分开来是一个更复杂的任务。 7. 通用流感疫苗 预防流感感染的最有效方法是接种疫苗。然而，在管理流感爆发时，还有其他具有挑战性的问题，通常是由于病毒基因组中的抗原漂移和抗原转变造成的。这些流感病毒的意外基因组变化使它们能够逃避抗体中和。开发一种提供全面和持久保护的通用流感疫苗是非常理想的，以解决当前疫苗的局限性和挑战。理想的流感疫苗将提供对所有流感病毒亚型（A型和B型）、各种抗原变异以及HA和NA亚型的保护。为了实现这一点，疫苗必须诱导交叉保护抗体。这可以通过专注于HA、NA和M2等蛋白质中的保守表位，以及M1和NP等内部蛋白来实现。 由于HA的茎或柄区域在预防各种流感病毒株中的感染中起着重要作用，因此通用流感疫苗被认为是一个有希望的候选疫苗。此外，从人类中分离出的针对病毒捕获区域的一些抗体能够中和所有流感A型病毒亚型，表明它们在开发通用流感疫苗中的潜在用途。例如，可以使用逐步嵌合HA疫苗技术将免疫反应从头部区域域重定向到捕获域（表2）。 嵌合HA是通过将1组或2组流感病毒的茎域与禽流感病毒亚型的头部域结合起来创建的。这种通用流感疫苗候选物被发现是安全的，并且能够引发广泛、强大、持久和有效的免疫反应，针对通常被忽视的血凝素的茎部，在2020年完成的I期临床试验后。此外，还开发了一种基于广泛反应性抗原（COBRA）的通用流感疫苗，针对H1（表2）。为了评估B细胞反应的广度，研究人员比较了以前H1N1疫苗株诱导的抗体分泌细胞与COBRA血凝素（也称为P1）诱导的细胞。对P1 HA的反应产生的单克隆抗体（mAbs）显示出广泛的HA识别范围，从狭窄反应到广泛反应的mAbs。Multimeric-001是一种新型疫苗，含有来自流感A和B型株的HA、NP和M1蛋白的保守线性表位，也旨在保护免受季节性和大流行流感病毒类型（表2）。在2020年，这种疫苗进行了III期临床试验，以评估其安全性、可接受性和体液和细胞免疫反应。该疫苗耐受性良好，未观察到显著不良反应。 细胞和体液反应表明，疫苗提供了针对无突变的流感病毒株的交叉免疫。与仅接受季节性疫苗的个体相比，在接受季节性疫苗之前接受一剂Multimeric-001的个体对H1N1和H3N2株的抗体反应更强。此外，接受Multimeric-001疫苗接种的个体对H1N1、H3N2和流感B的CD4+和CD8+ T细胞反应高于基线。 7.1. 当前和未来疫苗的经济利益 在评估新型mRNA和组合流感/COVID-19疫苗在低收入和中等收入国家的价值时，检查其成本效益至关重要。当前的模型研究，如水洛等的研究，存在局限性：它们侧重于医学上关注的流感病例，但没有考虑流感影响的全谱。这包括非呼吸道和非医疗关注的病例，这对于婴儿和老年人尤其重要。此外，这些模型没有考虑到流感疫苗的更广泛好处，例如减少严重疾病，预防心脏病发作等非呼吸道并发症，或减少抗生素的使用。为了更全面地了解流感疫苗的优势，我们应该改进未来模型评估中使用的数据。 7.2. 临床试验 国家过敏和传染病研究所（NIAID）的一部分疫苗研究中心，已经开发了一种基于纳米颗粒的流感疫苗。这种疫苗由弗雷德里克国家实验室制造，用于第一阶段临床试验，已被证明是安全、耐受良好且对各种流感亚型有效。与传统的每年注射的流感疫苗相比，它有可能提供更持久和更广泛的保护，可能导致通用流感疫苗。与传统的在鸡蛋中生产的基于蛋白质的流感疫苗不同，后者制作耗时且由于病毒突变需要每年更新，这种纳米颗粒疫苗生产更快，并且可以快速适应新的流感菌株，使其对大流行响应具有价值。研究团队使用了一种自组装成支架的铁蛋白蛋白，允许他们附加触发针对流感H2亚型的免疫反应的病毒蛋白。 第一阶段临床试验涉及50名18至70岁的健康志愿者。研究包括有和没有H2流感亚型暴露史的个体，以评估疫苗在两种情况下的有效性。结果表明，疫苗在两组中都是安全且耐受良好的，参与者产生了抗体，包括针对病毒稳定区域的抗体。这表明与标准季节性流感疫苗相比，纳米颗粒疫苗可能提供更广泛和更持久的保护。总之，第一阶段试验展示了使用有序抗原阵列的新一代疫苗的潜力。结果表明，这种基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗平台可能对大流行准备和通用流感疫苗的开发有益。 7.3. 疫苗设计 生产 疫苗生产包括几个不同的阶段。疫苗制造过程可以分解为以下关键步骤： 抗原生成：最初，抗原是从病毒或微生物中产生的。这涉及在各种介质中培养微生物，如流感的鸡蛋、甲型肝炎的细胞系、乙型流感嗜血杆菌的培养人类细胞或生物反应器。也可以在酵母、细菌或细胞培养中生成该生物体的蛋白质或组分。在某些情况下，细菌或病毒可能使用化学物质或热能被削弱以创建疫苗。 抗原分离：在生成抗原后，将其与用于生产它的细胞或介质中分离。对于减弱或减毒的病毒，这可能不需要进一步纯化。然而，重组蛋白通常在适合使用之前经历多个纯化步骤，如超滤和柱色谱。 配方：一旦获得抗原，就通过添加佐剂、稳定剂和防腐剂将其配制成最终疫苗产品。佐剂增强对抗原的免疫反应，稳定剂延长产品的保质期，防腐剂使多剂量瓶的使用成为可能。开发组合疫苗可能具有挑战性，因为抗原和其他疫苗组分之间可能存在不相容性和相互作用。 为确保疫苗生产符合质量标准，产品必须避免暴露于空气、水和人类潜在污染。此外，生产环境应防止抗原泄漏。 应用 疫苗设计在预防和管理传染病方面有广泛的实际用途。显著的应用包括： 疾病预防：疫苗主要是为了通过训练免疫系统识别和防御有害病原体来预防传染病。它们在控制甚至根除如脊髓灰质炎、天花和麻疹等疾病中发挥了关键作用。 大流行准备：疫苗设计在为潜在的大流行做准备中至关重要。科学家可以致力于为新的和新兴的传染病开发疫苗，如针对SARS-CoV-2病毒迅速开发的COVID-19疫苗。 癌症治疗：一些疫苗旨在刺激免疫系统靶向癌细胞。例如，HPV疫苗有助于预防某些癌症。 过敏管理：特异性免疫疗法，如过敏疫苗或注射，通过使个体对花粉或尘螨等过敏原脱敏来减少过敏症状。 通过媒介传播的疾病：研究继续进行设计针对由媒介传播的疾病，如疟疾或登革热的疫苗。 新兴疾病的疫苗：鉴于可能出现的新传染病，疫苗设计对于快速响应疫情并防止其成为全球健康威胁至关重要。 疫苗设计的局限性 抗原识别：对于某些病原体来说，识别能够刺激保护性免疫反应的合适抗原可能具有挑战性。 抗原变异：一些病原体表现出高度的抗原变异性，使得设计能够提供持久免疫力的有效疫苗变得困难。 递送和稳定性：开发在资源有限的环境中易于管理且稳定的疫苗可能是一个挑战。 伦理和监管障碍：疫苗的开发和测试涉及伦理和监管挑战，包括知情同意和临床试验标准。 新兴病原体：对新出现或新兴病原体的快速疫苗开发可能因知识有限和缺乏现有平台而受到阻碍。 • 用于靶向实体瘤和携带成纤维细胞激活蛋白的细胞的Teranostic CAR-T细胞疗法，以及流感疫苗的开发。它暗示了一种独特的策略，以改善癌症治疗和疫苗效果。肿瘤微环境（TME）在癌症进展中起着关键作用，特别是癌症相关成纤维细胞（CAFs）表达成纤维细胞激活蛋白（FAP）的存在。在肿瘤学中，检测和靶向FAP是一个重要兴趣点，使用各种成像方式如SPECT、PET、CT、荧光成像和MRI来达到这个目的。嵌合抗原受体（CAR）-T细胞在治疗某些癌症方面已经显示出效果。然而，它们在血液癌症中的成功并没有很好地转化为实体瘤，需要改进方法。通过分子成像和细胞追踪将CAR-T细胞递送到实体瘤也存在一些挑战。这种CAR-T细胞疗法在治疗实体和非实体瘤中突出了当前的进展，并讨论了克服治疗障碍的策略。虽然这些信息与优化癌症治疗有关，但并没有直接与流感疫苗联系起来。 8.结论 流感由于广泛的病毒抗原漂移和转变，给全球公共卫生带来了重大挑战。宿主的免疫系统能够防御流感，这需要每年更新疫苗接种。目前，有三种类型的流感疫苗可用：灭活流感疫苗、减毒活流感疫苗和重组血凝素（HA）疫苗。流感疫苗的配方复杂，通常包括病毒抗原、佐剂、防腐剂和稳定剂，以确保稳定性和有效性。为了满足监管标准并确保安全性，这些疫苗在生产过程和完成后都经过严格的质量测试。然而，仍需要进一步的研究来解决当前流感疫苗的局限性，例如它们有限的有效性、漫长的生产过程和缺乏广泛的交叉保护。研究人员正在努力开发新的流感疫苗，以提高效果，并可能提供针对多种菌株的交叉保护，最终目标是创建一种通用的流感疫苗，消除每年更新的需求。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

中文摘要甲型流感病毒基质蛋白2胞外功能区（matrix protein 2 ectodomam，M2e）通用疫苗的确切保护机制尚未明确，但其能减轻流感症状，抑制病毒的复制、存活和传播。通过使用M2e四聚体通用疫苗、M2e病毒样颗粒疫苗以及M2e多表位通用疫苗联合佐剂等，可提高保护效果，未来具有较大的应用价值。此文通过收集相关文献资料、结合临床实践以及相关动物实验等，综述甲型流感病毒M2e通用疫苗的研究现状、免疫机制及其特点，以期为相关研究提供理论基础。正文甲型流感病毒是比较常见的流感病毒，感染人体后，可引发高热、流涕、咳嗽等症状[1]，有时也会诱发肺炎等并发症，严重者甚至会出现多脏器衰竭，病死率相对较高[2]。甲型流感病毒的感染部位较多，包括呼吸道、消化道和眼结膜等[3]；传染周期较长，通常为7 d左右，在发病初期的2~3 d传染性最强[4]。接种疫苗是目前预防甲型流感病毒传播的主要手段。在临床实践中，通过接种流感灭活疫苗或减毒疫苗避免甲型流感病毒的传播和感染已被证明具有良好的效果[5-6]。流感病毒的主要抗原成分是糖蛋白，由血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）组成，由于这两种蛋白易发生抗原漂移和转换，因此需要每年预测流行株，跟进流感疫苗生产[7]。基质蛋白2 (matrix protein 2，M2）是甲型流感病毒特有的蛋白质，由甲型流感病毒基因组RNA节段中的1个编码区负责编码。甲型流感病毒M2的胞外功能区（M2 ectodomain，M2e）包括24个氨基酸[8]，研究表明，M2e在所有甲型流感病毒亚型中几乎完全保守[9]，可作为广谱甲型流感疫苗的抗原，即利用M2e研发通用疫苗能够预防所有亚型的甲型流感病毒感染。本文针对甲型流感病毒M2e通用疫苗的保护效果进行综述，为相关研究提供理论基础。1甲型流感病毒通用疫苗的研究现状1.1甲型流感病毒通用疫苗概述虽然现有的甲型流感病毒疫苗针对常见的季节性流感能起到良好的预防作用，但针对H5等亚型的疫苗研发相对较少。理想的甲型流感病毒通用疫苗，应当对所有亚型的甲型流感病毒产生免疫作用[10]，即要求甲型流感病毒通用疫苗的免疫原上存在能引起交叉免疫应答的B细胞和T细胞抗原表位[11]。现有甲型流感病毒通用疫苗的免疫原主要有甲型流感病毒的M2e、HA茎部区、核蛋白（nucleoprotein，NP）等，以上均可诱导交叉免疫应答[12]。然而，由于HA经常发生抗原漂移和抗原转换，很容易出现疫苗毒株的抗原与流行毒株不匹配的情况[7，13]，因此HA相关疫苗难以预防季节性和大流行性的甲型流感。甲型流感病毒的NP虽然可针对不同亚型的甲型流感病毒诱导交叉免疫应答[14-18]，但Robinson等[19]也发现了 NP相关疫苗在免疫人体后，未能起到保护作用的案例。M2e在甲型流感病毒株中具有高度保守性[10]，在研发甲型流感病毒通用疫苗的过程中，可利用M2e作为免疫原，对机体诱导产生交叉免疫保护作用，进而预防和控制甲型流感病毒传播。1.2甲型流感病毒M2e通用疫苗概述M2e存在于甲型流感病毒M2暴露的外膜上，并可镶嵌到甲型流感病毒囊膜部位，从而形成相应的质子通道，参与到新生病毒粒子装配和释放环节中[20-21]。在研究初期，研究者主要是将M2作为通用疫苗的免疫原，但膜蛋白的相对分子质量较大，难以实现分离纯化；而M2e相对分子质量较小，并且易溶于水、易纯化[10，22]，因此研究者选择将M2e作为免疫原，并将M2e氨基酸残基暴露在病毒囊膜、感染细胞等表面，从而阻碍新生病毒粒子装配，诱导产生抗甲型流感病毒抗体。相关研究还发现，利用人源流感病毒M2e免疫血清能够比较准确地识别禽源流感病毒M2e序列[23-24]，这说明M2e可针对多种亚型甲型流感病毒诱导产生相应的抗体，可作为研发甲型流感病毒通用疫苗的免疫原。2甲型流感病毒M2e通用疫苗的免疫机制及特点2.1M2e通用疫苗的免疫机制近年来，国内外针对M2e通用疫苗的研究已取得较大的进步，但对于M2e诱导免疫保护的机制研究，尚未有统一结论。研究者普遍认为抗M2e抗体虽无法直接对流感病毒产生中和效果，但在很大程度上可提供交叉免疫保护作用，促使流感症状有所减轻[25]。基于该观点，为进一步抑制不同亚型的甲型流感病毒在机体细胞内的复制过程，可结合使用M2e和载体分子，或者是联合运用适当的佐剂，改善人体肺组织中的甲型流感病毒滴度及排毒量，使免疫效果大幅提升。2.2M2e通用疫苗的特点虽然对于M2e诱导的免疫保护机制尚未完全明确，但在甲型流感病毒通用疫苗研发中，M2e因以下特点仍具有较大的潜力。(1) 在大部分甲型流感病毒中，M2e氨基酸序列均具有较高的保守性。将流感病毒分离后，M2e氨基酸序列无变化，可作为广谱甲型流感疫苗的抗原[10]。(2) M2e疫苗可诱导机体产生交叉免疫应答[26]，在疫苗研发生产中，可改善需要预测流感病毒流行株的环节，降低对预测结果的依赖性，便于提前对大规模的流感病毒传播进行预防。(3) M2e位于感染细胞表面，可镶嵌于甲型流感病毒囊膜部位，从而阻碍新生病毒粒子装配[20]。(4) M2e的相对分子质量小，便于在体外进行表达、制备、纯化等处理[22]。(5) 将M2e与载体分子结合，有利于提高疫苗的免疫原性和稳定性，使疫苗效果更佳[27]。3甲型流感病毒M2e通用疫苗的研究进展3.1M2e四聚体通用疫苗根据现阶段的研究成果，M2e短肽仍存在免疫原性弱的问题，为进一步提高M2e通用疫苗的免疫效果，可将不同的载体分子与M2e进行结合，形成重组原核表达载体，以此增强通用疫苗的免疫力[27-28]。常见的载体分子包括HPV结构蛋白L1、钥孔血蓝蛋白、脂质体、鞭毛蛋白等[29]。另外，由于M2e在甲型流感病毒感染细胞表面是以四聚体形式存在，因此可将酵母转录激活蛋白GCN4四聚体与M2e融合，通过形成新的四聚融合体提升M2e免疫原性[10]。同时，新四聚融合体在通用甲型流感病毒疫苗中可产生抗M2e特异性抗体，对甲型流感病毒起到抵抗作用[10]。3.2 M2e病毒样颗粒疫苗病毒样颗粒通常是由病毒结构蛋白通过自行装配的方式形成的，呈现出不可复制和无感染性等显著特点。利用病毒样颗粒表达的M2e能够保证其天然构象和活性，体现出多价以及免疫原性较强的特征，并促使大量相同的M2e在病毒样颗粒表面有序排列，提升免疫原性和稳定性。除此之外，病毒样颗粒中HA以及NA等主要蛋白缺乏遮蔽，这也使得M2e以天然膜蛋白的形式存在于表面，从而被抗M2e抗体识别。在此机制下，将M2e病毒样颗粒与Toll样受体配体佐剂组合，可获得更好的交叉免疫保护效果[30]，有利于对不同亚型甲型流感病毒的攻击起到保护作用，从而提高机体抵抗能力和疫苗免疫原性。3.3M2e多表位通用疫苗联合佐剂为进一步提升M2e通用疫苗的保护效果，可以将佐剂与M2e多表位通用疫苗进行联合使用。在甲型流感病毒M2e通用疫苗研发中，常见的佐剂有免疫刺激复合物、革兰阴性菌外膜鞭毛蛋白等[10]。添加佐剂可显著减少疫苗使用量，并延长机体接种疫苗后的免疫保护时间。研究显示，将M2e-HBV核心蛋白与黏膜佐剂进行联合使用可发挥良好的免疫效果[31]。另外，将M2e与HA、NP等蛋白中保守抗原表位进行共同表达，有助于提升M2e通用疫苗的保护效果[32]。4甲型流感病毒M2e通用疫苗的动物模型选择为验证M2e通用疫苗的免疫效果，可选择小鼠、猪、雪貂和恒河猴等动物建立模型开展实验。经研究，M2e通用疫苗对小鼠、猪、雪貂和恒河猴等动物均有一定保护效果，但免疫水平存在差异。Bodewes等[33]发现，小鼠并非是甲型流感病毒的天然宿主，本身具有不易感性。因此，建立小鼠动物实验模型时，需要选择适应小鼠组织的流感病毒株。猪作为甲型流感病毒的天然宿主，可被多种亚型的甲型流感病毒感染，能客观地反映M2e通用疫苗的免疫效果[10]。雪貂是研发M2e通用疫苗的常用模型，Smith等[34]发现雪貂对流感病毒存在易感性，在症状表现方面也与人类具有相似性，实验结果显示，雪貂接种M2e通用疫苗后，对甲型流感病毒的抵抗能力有所增强。除此以外，流感疫苗研究中以恒河猴作为动物模型亦较为广泛，原因是其与人类的免疫系统相近，实验结果与临床试验结果具有一致性[10]。在现代医学研究中，针对M2e通用疫苗的研发，主要选择恒河猴作为动物模型，确认其流感症状与人相似后，再逐步进行临床试验，最终确定M2e通用疫苗的制备、使用规范及指南。5结语甲型流感病毒对人体的危害较大，对部分易感人群和高危人群的健康会造成极大的威胁，需要及时接种疫苗、提高疫苗免疫效果、预防甲型流感病毒的传播。结合当前研究现状，应注重针对多种病毒亚型的甲型流感病毒M2e通用疫苗的研发，因其有利于在人体内产生交叉免疫保护效果，从而抵抗不同亚型的甲型流感病毒感染，还能减少不良反应。同时，M2e通用疫苗可有效刺激机体产生体液和细胞免疫应答，具有良好的保护效果，还可延长免疫时间，预防甲型流感病毒的传播。作者张豫宁1  杨雪2  杨娅春1  杨海涛31昆明医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，昆明 650500；2昆明医科大学公共卫生学院毒理学系，昆明 650500；3云南省疾病预防控制中心疫苗临床研究中心，昆明 650034张豫宁和杨雪对本文有同等贡献通信作者：杨海涛，Email：yhtoto@126.com引用本文：张豫宁, 杨雪, 杨娅春, 等. 甲型流感病毒基质蛋白2胞外功能区通用疫苗的研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(3): 171-174.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220721-00041识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。