TGF-β1 x Smad proteins

【导读】 肝细胞癌(HCC)的转移严重威胁着患者的生存。GPR56在恶性肿瘤研究中受到广泛关注，在细胞表面信号传递中起着至关重要的作用。然而，其在HCC中的确切功能仍不明确。 近日，华中科技大学黄文杰研究团队在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“GPR56 facilitates hepatocellular carcinoma metastasis by promoting the TGF-β signaling pathway”，本研究揭示了GPR56在人类肝癌病例中的表达水平显著升高，且升高的GPR56水平与不良预后相关。GPR56通过与TGFBR1相互作用调控TGF-β通路，从而促进HCC转移。同时，GPR56受TGF-β信号的典型级联调节，从而建立正反馈回路。此外，联合应用TGFBR1抑制剂GAL和GPR56抑制剂DHM显著抑制肝癌转移。 靶向该信号通路的干预有望有效阻止GPR56介导的肝癌转移。 https://www.nature.com/articles/s41419-024-07095-6#Sec25 背景介绍 01 HCC是一种常见的恶性肿瘤，在全球癌症相关死亡中排名第三。由于在疾病晚期发现延迟、肿瘤频繁转移和手术切除后肿瘤复发，死亡率升高。尽管近几十年来取得了显著进展，但晚期HCC患者的预后仍然不理想。因此，了解控制HCC发展和转移的复杂分子机制至关重要。 TGF-β通路在肝脏疾病和肝细胞癌(HCC)中发挥多重作用，既促进肝纤维化和炎症，又抑制肿瘤增殖和促进转移。TGF-β蛋白与受体激酶结合，启动磷酸化依赖的信号级联反应，主要包括SMAD蛋白的下游信号。在癌症进展晚期，TGF-β通过刺激肿瘤细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)促进肿瘤转移，发挥促癌作用。研究人员前期深入研究了TGF-β1/SMAD3经典信号机制，阐明了下游分子PTPRε和JunBP在促进肝癌迁移和转移中的作用。 GPR56在体内外均可促进肝癌的转移 02 为了研究GPR56对HCC的生物学效应，研究人员使用慢病毒在低表达水平的Hep3B细胞中稳定过表达GPR56，使用3种不同的shRNA在高表达水平的MHCC97H和HLF细胞中稳定敲低GPR56，选择shRNA-2进行了进一步实验。通过划痕实验和迁移实验，研究人员发现GPR56过表达增强了Hep3B细胞的迁移和侵袭能力，而在MHCC97H和HLF细胞中，GPR56敲低减弱了这些能力。这些结果共同证实了GPR56促进肝癌的迁移和侵袭。此外，通过蛋白质免疫印迹实验检测了EMT标志物，研究人员发现在肝癌细胞中上调GPR56促进波形蛋白和闭合蛋白的表达，同时抑制E-钙粘蛋白的表达，表明GPR56具有促进肝癌细胞EMT的能力。此外，研究人员还使用了一种小分子抑制剂DHM，它可以特异性地靶向GPR56，抑制其功能活性。在MHCC97H和Hep3B细胞中使用DHM后，划痕实验和迁移实验表明DHM显著降低肝癌细胞的迁移和侵袭能力。 GPR56在体内外均可促进肝癌的转移 研究人员进一步验证了GPR56在体内的致癌功能。研究人员建立了裸鼠尾静脉肺转移瘤模型和原位肝移植瘤模型。尾静脉肺转移实验显示，与SH-CON组相比，SH-GPR56组荧光强度和肺种植体数量明显减少。与LV-CON组相比，OE-GPR56组荧光强度和肺内种植体数量均升高。与SH-CON组相比，SH-GPR56组原位肝转移模型荧光强度明显降低，肿瘤数量明显减少，生存时间明显延长，肺转移明显减少。OE-GPR56组与LV-CON组相比，荧光强度更高，肿瘤数量更多，肺转移结节增多，生存时间更短。基于这些结果，研究人员得出结论，GPR56促进肝癌的进展和促进转移。 GPR56通过TGFBR1促进肝癌转移 03 研究人员进一步研究了TGFBR1在GPR56促进肝癌细胞转移中的作用。在Hep3B LV-GPR56细胞中，敲低TGFBR1可降低p-SMAD3的表达。同样，在荧光素酶报告基因检测中，研究人员发现TGFBR1的敲低抑制了GPR56过表达引起的SBE荧光素酶活性的增加。通过划痕实验和迁移实验，研究人员发现TGFBR1的敲低消除了GPR56对细胞迁移和侵袭的促进作用。在过表达GPR56的Hep3B细胞中，研究人员使用小分子抑制剂SB431542抑制TGFBR1的磷酸化。研究人员观察到，当TGFBR1磷酸化被抑制时，肝癌细胞的迁移和侵袭能力同样被抑制。这些发现表明GPR56对TGF-β信号通路的调节依赖于TGFBR1。此外，研究人员构建了在GPR56敲低背景下过表达TGFBR1-WT和TGFBR1-S165D的MHCC97H细胞。研究人员发现，当TGFBR1的第165位氨基酸发生突变时，肝癌细胞中的TGF-β通路受到抑制，其迁移和侵袭能力降低。研究人员通过蛋白质免疫印迹实验检测EMT标志物时发现，在肝癌细胞中重建TGFBR1增强了波形蛋白和闭合蛋白的表达，而抑制了E-钙粘蛋白的表达，表明GPR56通过TGFBR1调控肝癌细胞的EMT。 裸鼠原位移植实验显示，Hep3B-LV-GPR56组中TGFBR1表达下调后，肝脏肿瘤负荷降低，肺转移结节减少，生存时间延长。相反，在MHCC97H-SH-GPR56组中过表达TGFBR1-WT促进肿瘤生长和转移，而过表达TGFBR1-S165D无明显的促癌作用。研究表明TGFBR1参与了GPR56介导的肝癌转移。 研究发现 04 本研究中，研究人员观察到GAL对高表达GPR56的HCC没有表现出显著的疗效。结合GAL的作用机制，研究人员推测这可能与GPR56诱导的TGFBR1激活有关，表明GPR56和GAL之间存在潜在的竞争相互作用。因此，研究人员使用小分子抑制剂DHM选择性地靶向GPR56。动物实验中，在GPR56高表达的HCC中，DHM和GAL联合治疗确实显示出比单药治疗更好的疗效，显著抑制HCC的转移。这些发现揭示了一种靶向GPR56诱导的HCC转移的新策略。 【参考资料】 https://www.nature.com/articles/s41419-024-07095-6#Sec25 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会 点击对应文字 查看详情

作为自免领域的蓝海之一，炎症性肠病（IBD）治疗药物受到众多跨国药企的追捧和布局。 近期，礼来以32亿美元收购Morphic，获得其核心管线α4β7整合素抑制剂MORF-057，进一步扩大在胃肠病领域的影响力。 除了礼来外，包括艾伯维、阿斯利康、默沙东等制药巨头纷纷布局IBD治疗药物，进行相关并购交易。 动作频频背后，为何跨国药企如此青睐IBD治疗药物？ 传统治疗的困境 IBD是一种主要累及消化系统的慢性炎症性肠道疾病，其症状包括严重腹泻、频繁腹痛以及便血、体质量减轻，严重可致癌。IBD主要包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）两种类型，两种IBD在临床和病理特征上既有重叠又有区别：UC主要累及直肠和部分结肠，病变呈连续性，而CD主要累及回肠和结肠，病变呈节段性。 目前，IBD在国内并不多见，但患者规模正在快速增长。根据2014年中国疾病预防控制中心数据统计，中国2005-2014年间IBD累积病例约为35万，但到2025年，预计中国的IBD患者将达到150万例。 在过去，靶向药物问世之前，IBD没有很好的治疗手段。IBD的传统治疗药物主要包括氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂等（见下表）。虽然这些药物可为IBD患者的病情带来一定程度的缓解，但均各有局限，很难满足临床上IBD的治疗需求。 表1 IBD传统治疗药物 数据来源：公开资料整理 以美沙拉嗪为代表的5-氨基水杨酸制剂（5-ASA），由于几乎不入血、局部起效，安全性良好，过去一直是IBD的一线治疗首选；但由于疗效有限，一般只推荐用于轻中度IBD患者的活动期及缓解期治疗。 糖皮质激素以及免疫抑制剂虽然对中重度IBD有一定的缓解作用，但均有明显且严重的副作用，因此均只能用于5-ASA治疗无效的、中重度IBD活动期的短期治疗，不能用于长期维持治疗。 因此，在过去的很长一段时间，IBD治疗均缺乏对中重度患者有效却安全的针对性药物，存在着巨大的未满足临床需求。 单抗与小分子争芳斗艳 IBD靶向治疗的发展，要从其发病机制说起。IBD的本质就是胃肠道表现出异常的免疫反应，虽然发病机制目前仍不完全清楚，但目前IBD靶向治疗的核心仍是抑制胃肠道的免疫反应，从而抑制炎症的发生。而以T细胞为核心的免疫反应主要包括以下关键的过程，这些过程也是目前新药开发的关注焦点： 1）T细胞从淋巴结通过血液循环迁移至发出炎症信号的肠道部位，这个方向的靶点包括整合素（α4β7）及其配体MAdCAM-1蛋白，以及鞘氨醇-1-磷酸（S1P）受体，抑制或阻断这些靶点及其相关信号通路，可以阻止T细胞从淋巴结向肠道的迁移； 2）促炎症因子通过T细胞表面受体，启动T细胞内下游信号通路，诱发T细胞介导的炎症反应（见图2），这个方向的靶点包括促炎症因子TNF-α、IL、TGF-β1等，以及胞内下游信号通路相关的JAK酶、SMAD-7分子等，抑制这些靶点及其信号通路，可以抑制炎症的发生。 从这两个方向出发，诞生了众多疗效优异的IBD靶向新药。自从英夫利昔单抗及阿达木单抗于1998年相继首次获批用于IBD治疗开始，IBD便进入了靶向治疗的新时代，尤其是生物制剂的研发及上市，明显进入了快车道。 于20年间获批了近10款单抗药物，其中以TNF-α以及IL为靶点的单抗靶向制剂占据了主流，但这些单抗药物均获批了多个适应症，IBD或许并非其市场的重心。 因此，2014年获批上市的抗α4β1药物维得利珠单抗显得弥足珍贵，其为首个专属于IBD治疗的靶向药物、同时也是首个及唯一一个具有肠道选择性的IBD靶向药物。2023年，维得利珠单抗全球销售额高达54.1亿美元，成为超重磅炸弹，已经充分验证了其机制的优越性。 进入2018年，首个IBD靶向小分子托法替布获批用于IBD治疗，从此开启了小分子靶向治疗时代，小分子靶向新药的研发及上市也开始发力。 其中，以JAK酶抑制剂及S1P受体拮抗剂为其中杰出的代表，尤其是JAK酶抑制剂，其FIC药物托法替布，已在包括IBD在内的自免领域斩获超20亿美元的辉煌战绩；而其第二代药物的代表乌帕替尼，则更是一骑绝尘，上市短短数年，销售额便几乎突破40亿美元，颇具“百亿药王”的气魄。 表2 IBD靶向治疗已上市药物及其全球销售额（亿美元） 注：为整体销售额，不区分适应症 数据来源：Na SY等，2019；公开资料整理 值得注意的是，乌帕替尼的成功并非偶然，也并非仅仅是商业化层面的因素；相反，其成功完全是建立在优异的临床疗效数据之上的。当然，本文仅以IBD的临床数据抛砖引玉。虽然目前并没有乌帕替尼与“老大哥”托法替布在IBD治疗的III期头对头研究，但从目前已披露的UC适应症的III期临床数据来看，乌帕替尼的临床疗效可谓惊艳，其急性期的临床缓解率达到26%-33%，相比安慰剂的差值达到22%-29%，维持期的临床缓解率则达到42%，相比安慰剂差值达到31%，相比之下，托法替布临床急性期的临床缓解率仅为17%-18%，相比安慰剂差值为10%-13%，维持期临床缓解率为34%，相比安慰剂差值为23%；可见，两项首要终点数据，无论是数据绝对值还是相比安慰剂的差值，乌帕替尼均远大于托法替布。 类似的结论，也同样适用于维得利珠单抗，其在UC急性期的临床缓解率，相比安慰剂的差值达到22%（47%vs 26%，P＜0.001），也是远胜抗TNF-α制剂阿达木单抗，后者在UC急性期的临床缓解率相比安慰剂的差者仅9.3%（18.5%vs 9.2%，P＜0.05）。可见，维得利珠单抗在IBD的治疗上，同样也是革命性药物的存在。 从阿达木单抗到维得利珠单抗，从托法替布到乌帕替尼，IBD的靶向治疗正在取得一个又一个的突破，这是创新的胜利，也是患者的福音。 靶向治疗的联合， 或是大势所趋 在过去20年，IBD的治疗涌现了大量的先进药物，推动IBD的临床缓解率不断取得新突破。但Silvio Danese等在2022年的一篇报道中指出，现大多数先进的治疗方法报告1年的临床缓解率在30%到50%之间，这表明我们可能通过使用单一药物达到了治疗上限。 IBD是多种途径驱动免疫介导的炎症过程，对肠道疾病有效的药物可能对肠外表现或伴随的免疫介导疾病(IMID)无效，因此需要使用其他药物。考虑到这一点，基于至少使用两种生物制剂，或同时使用一种生物制剂和一种小分子药物的高级联合治疗(ACT)的概念，可能是难治性IBD患者、发生并发症风险高的患者或伴有不受控制的IMID患者的一种有希望的策略。 目前这种策略已经被应用到实际治疗中，并取得了不错的效果。美国一项回顾性研究报道了50名对现有药物治疗不佳的顽固性IBD患者（有10名并发IMID），接受ACT治疗的情况，治疗方案包括维得利珠单抗+乌司奴单抗（47%）、托法替布+生物制剂（40%）以及维得利珠单抗+抗TNF-α单抗，结果显示接受ACT治疗的患者临床缓解率（50%vs 14%,p=0.0018）及内镜缓解率（34%vs 6%,p=0.0039）均显著高于基线值。 另外，Waseem Ahmed等在2022年发表了一项关于ACT治疗的系统性综述与meta分析，这项研究共纳入了30项研究276名患者，其中包括81%的难治性IBD患者以及12%的并发肠外表现或风湿病的IBD患者，最常用的组合包括抗整合素单抗+抗TNF-α单抗（48%）以及抗整合素单抗+乌司奴单抗（19%），临床缓解率及内镜缓解率分别达到59%及34%。 最后，虽然科学的进步持续不断地给IBD的治疗带来希望的曙光，但由于IBD的难治性与反复性，这项事业注定任重而道远。展望未来，相信会有更多靶向治疗的新药被开发出来，用于IBD的治疗；同时也有理由相信，靶向药物之间的联合疗法，也必将在IBD的治疗中大放异彩。 参考文献： 1.吴开春,梁洁,冉志华,等.炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2018年.北京)[J].中国实用内科杂志,2018,38(09):796-813 2.何琼,李建栋.炎症性肠病流行病学研究进展[J].实用医学杂志,2019,35(18):2962-2966. 3.Kaplan GG.The global burden of IBD:from 2015 to 2025.Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2015;12(12):720-727. 4.Na SY,Moon W.Perspectives on Current and Novel Treatments for Inflammatory Bowel Disease.Gut Liver.2019;13(6):604-616. 5.Danese S,Solitano V,Jairath V,Peyrin-Biroulet L.The future of drug development for inflammatory bowel disease:the need to ACT(advanced combination treatment).Gut.2022 Dec;71(12):2380-2387. 6.Glassner K,Oglat A,Duran A,Koduru P,Perry C,Wilhite A,Abraham BP.The use of combination biological or small molecule therapy in inflammatory bowel disease:A retrospective cohort study.J Dig Dis.2020 May;21(5):264-271. 7.Ahmed W,Galati J,Kumar A,Christos PJ,Longman R,Lukin DJ,Scherl E,Battat R.Dual Biologic or Small Molecule Therapy for Treatment of Inflammatory Bowel Disease:A Systematic Review and Meta-analysis.Clin Gastroenterol Hepatol.2022 Mar;20(3):e361-e379. 声明：本内容仅用作医药行业信息传播，为作者独立观点，不代表药智网立场。如需转载，请务必注明文章作者和来源。对本文有异议或投诉，请联系maxuelian@yaozh.com。 责任编辑 | 史蒂文 转载开白 | 马老师 18996384680（同微信） 商务合作 | 王存星 19922864877（同微信）  阅读原文，是受欢迎的文章哦

中文摘要 间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）源性外泌体（MSC derived exosome，MSC-Exo）是由MSC通过旁分泌作用产生的携带大量生物信息传播介质和活性物质的脂质双分子层包裹纳米级囊泡，可实现有选择性、定向性的细胞间信号转导，抑制炎症反应，促进受损组织的修复与再生。此文就MSC-Exo的生物学特性、作用机制及其在常见疾病治疗中的潜在应用与发展进行综述。 正文 干细胞是能够实现自我更新、自主增殖的原始细胞，在体内可分化产生某种特定组织类型的功能细胞。近年来，干细胞引起了研究者的广泛关注，且研究发展迅速，其中被研究最多的为间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）。按来源划分，MSC属成体干细胞，来源广泛，可从骨髓、脂肪组织、胎盘、脐带和脐带血等不同组织中获取，能够参与组织器官的修复与再生。 外泌体（exosome，Exo）是非常重要的细胞外囊泡，直径30~100 nm，广泛存在于机体几乎所有细胞及多种体液中。MSC源性Exo（MSC derived Exo，MSC-Exo）携带大量生物信息传播介质和活性物质，可实现选择性、定向性细胞间信号转导，抑制炎症反应，促进受损组织的修复与再生。本文就MSC-Exo的生物学特性、作用机制及其在常见多发疾病中的研究进展进行综述，以期为MSC-Exo在各种难治疾病中的规范有序应用提供借鉴。 1 MSC-Exo的生物学特性与作用机制 MSC-Exo是由磷脂双分子层包被且腔内充满多种蛋白质、核酸、脂质和可溶性因子的纳米级囊泡，通过细胞膜内陷方式从MSC中释放。如图1所示，MSC-Exo的特殊“脂筏”结构使其表面含有特异蛋白（如CD9、CD63、CD81等），能够直接与靶细胞的质膜融合，还可通过细胞内吞实现信息传递，参与信号转导、炎症因子释放调控、细胞增殖分化调控等过程。 相较于MSC，无细胞结构的MSC-Exo易于存储管理，且稳定性更好、免疫原性更低，可有效减少医源性肿瘤的形成和生长，进而降低细胞治疗过程中存在的风险。研究者认为，MSC-Exo可成为替代MSC的无细胞治疗新手段并具有光明前景，目前已在恶性肿瘤、肝脏疾病、心血管及神经退行性疾病、糖尿病等常见疾病的动物模型中对其进行了广泛探究。 MSC-Exo主要通过与靶细胞进行融合，向靶细胞释放神经因子、微RNA（microRNA，miRNA或miR）及多种蛋白质等活性物质，或直接与靶细胞的表面受体结合进行基因调控以发挥其免疫调节和促进组织再生和修复的作用。然而MSC-Exo在不同疾病中的作用机制复杂，更为具体的调控机制仍是研究者攻克的难点。 2 MSC-Exo在常见疾病中的研究进展 2.1 恶性肿瘤 MSC-Exo可通过释放活性物质参与调控肿瘤细胞的血管生成能力和上皮间质转化过程，同时在大多肿瘤细胞内可实现自由扩散和定植，对肿瘤微环境产生一定影响，进而实现对肿瘤细胞生物学功能的调节。 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）即肝癌，是常见的恶性肿瘤，死亡率居全球第4位。研究显示，MSC-Exo可通过不同机制保护肝脏，抑制HCC的发展、转移和耐药。Ding等发现，由骨髓源的MSC-Exo——BMSC-Exo转移的miR-374c-5p对HCC患者的细胞增殖和转移具有抑制作用。Lou等证明，源于脂肪组织的MSC-Exo可通过携带miRNA-199a调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，进而提高HCC的化学治疗敏感性。此外，研究显示，MSC-Exo也可作为载体靶向递送抗肝癌物质（药物或基因），以实现疾病治疗。Li等利用葡萄糖调节蛋白78特异性干扰小RNA修饰的BMSC-Exo联合索拉非尼后，能够靶向HCC细胞中的葡萄糖调节蛋白78，使耐药肿瘤细胞对索拉非尼增敏，逆转耐药性，提高疗效。 结肠癌在我国的发病率逐年升高。研究显示，除手术切除和常规用药外，携带miRNA的MSC-Exo被认为是新型的生物标志物，可用于结肠癌的诊断和预测。李晓辉等证实了高表达miR-196b-5p的MSC-Exo可降低结肠癌CT26.WT细胞对5-氟尿嘧啶的耐受性，从而促进细胞凋亡。其作用的潜在机制被认为与抑制PI3K/Akt信号通路的激活有关。Chen等研究发现，BMSC-Exos中miR-4461可以通过下调包被体蛋白复合物亚基β的表达，进一步抑制结直肠癌细胞HCT116和SW480的细胞迁移和侵袭，是潜在的结肠癌治疗靶点。 胃癌早期通常无症状，这是导致患者因确诊延时而错过最佳手术时机的最主要因素，进而造成多数胃癌发现即晚期的现象；虽然可采取手术联合用药的策略进行治疗，但预后效果仍不理想。杜雄等研究发现，在缺氧条件下，BMSC-Exo能够促进Wnt/β联蛋白信号通路的激活，实现胃癌细胞的快速增长和转移。同时，董俊刚等研究发现，胃癌细胞的生长和转移与BMSC-Exo的分泌呈正相关，即BMSC-Exo促进胃癌细胞的增殖。这为研究靶向BMSC- Exo治疗胃癌奠定了理论基础。 近年来，肺癌患者的新增率和死亡率均居高不下。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）作为肺癌的一大种类，传统治疗手段为手术切除和药物治疗，治疗效果不理想。MSC-Exo作为远程信号效应物，可远距离进行细胞间信息交流，进而调控肿瘤的生物学功能、生长状态和耐药性等。Liang等阐述了BMSC-Exo中的miR-144通过下调细胞周期蛋白E1和E2从而抑制NSCLC细胞的增殖，以此间接阻断肿瘤生长。 乳腺癌是世界范围内女性群体高发的浸润性恶性肿瘤，如今除常规化学治疗和手术切除外，MSC-Exo也可作为载体联合化学药物对其进行治疗。如BMSC-Exo装载阿霉素（doxorubicin，DOX）是目前研究较为集中的一个载药系统，实验表明，BMSC-Exo@DOX的药物载体可靶向结合乳腺癌细胞，同时不会削弱和降低药物本身对癌细胞的杀伤作用。MSC-Exo装载和厚朴酚（Honokiol）也是重要的载药系统，Kanchanapally等将乳腺癌细胞系与Honokiol、MSC-Exo@Honokiol共培养72 h后发现，MSC-Exo@Honokiol组对癌细胞的杀伤力远高于Honokiol组，是Honokiol组的4~5倍，潜在机制是缩短细胞周期和加快细胞凋亡从而遏制癌细胞的生长。 MSC-Exo在其他肿瘤治疗中的应用也有所报道，如通过对肾癌细胞内胆固醇代谢关键酶的表达量进行调控，进而影响肾癌细胞的生物学功能和行为；高浓度MSC-Exo可抑制口腔鳞状细胞癌的生长，这可能是由于MSC-Exo结合PI3K/Akt信号通路靶点，通过直接或间接接触的方式抑制癌细胞增长和定植；MSC-Exo作为旁分泌的一种重要活性物质，可通过向前列腺癌细胞递送miR-126-3p进而遏抑癌细胞的增殖和迁移。 2.2 肝脏疾病 肝功能受损导致肝细胞的自我调节与再生功能异常，从而诱发各种肝脏疾病，如肝硬化、肝炎等。目前，肝移植仍是治疗肝脏疾病的主流治疗措施，但供体器官短缺及移植后产生的终身免疫等问题阻碍了肝移植技术的发展。随着MSC-Exo的发现，肝脏疾病治疗有了新的方向。国内外均有开展利用MSC-Exo治疗肝脏疾病的实验研究（表1）。 Watanabe等用非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatiti，NASH）模型评估MSC-Exo的治疗效果发现，MSC-Exo可减轻NASH的炎症反应并抑制纤维化。宋晓静分别构建大鼠肝切除模型及大鼠缺血再灌注损伤模型，并进行体内注射人脐带来源的MSC-Exo（human umbilical MSC-Exo，hUCMSC- Exo），验证了其发挥促进肝再生、减轻肝脏缺血再灌注损伤的作用。急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）也是一种常见的肝脏疾病，Wu等利用C57BL/6小鼠和LO2细胞ALF模型，进一步探究hUCMSC-Exo的治疗机制，结果证明其可通过上调胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2和PI3K/Akt信号通路，抑制氧化应激诱导的细胞凋亡，减少氧化应激，从而达到保护肝脏的目的。除此之外，hUCMSC-Exo也被证实可以延缓和减轻小鼠模型的肝损伤程度。 Psaraki等通过建立的急性肝病或慢性肝病动物模型，确定了不同来源的MSC-Exo可有效发挥抗凋亡、抗炎和抗纤维化等作用，同时证明了MSC-Exo的靶向能力可通过膜修饰来提高。这意味着MSC-Exo的修饰可能是肝病治疗的有前途的替代方法。除直接注射进行治疗外，有研究人员利用MSC-Exo设计药物递送系统，用于装载激素药物地塞米松（dexamethasone，DEX），即构建装载有地塞米松的MSC-Exo@DEX。该载药系统可降低肝脏转氨酶和炎症因子的表达水平，进而有效减小激素药物对肝脏的损伤。这也给肝脏疾病的无细胞治疗和药物递送载体的构建提供了新的思路。 2.3 心血管及中枢神经系统疾病 近年来，全球范围内的心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）和中枢神经系统疾病（central nervous system disease，CNSD）发病率均呈上升趋势。通常CVD和CNSD被认为是不可逆的损伤，目前的治疗手段仍存在一定的局限性。已有大量研究证实，MSC-Exo在CVD和CNSD相关疾病模型中具有极大的治疗潜力。 CVD在我国是常见高发疾病，同时具有全球高发病率和高病死率。研究发现，体内和体外进行MSC-Exo移植均可通过增强血管生成能力、减轻心脏纤维化，达到修复损伤心肌细胞和保持心脏功能的目的。Zhao等发现，MSC-Exo可通过miR-182信号通路改变M1巨噬细胞向M2巨噬细胞的极化来减轻心肌I/R损伤，为MSC-Exo作为心肌I/R损伤的潜在治疗工具提供了新的思路。Liu等探索了过表达巨噬细胞移动抑制因子的BMSC-Exo的外显子在心肌梗死大鼠模型中的心脏保护作用。结果发现，其可通过减少心脏重塑及心肌细胞线粒体断裂，避免活性氧生成和细胞凋亡，进而实现心脏功能的增强。该研究阐述了以巨噬细胞移动抑制因子-MSC-Exo为基础的心肌梗死治疗的新机制，并为心血管疾病的诊治提供了崭新的方式。 CNSD主要包括阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）、帕金森病（Parkinson disease，PD）、脊髓损伤(spinal cord injury，SCI) 等，其特点是神经元结构和功能丧失，进而阻碍神经元间的信息转导。MSC-Exo内含抗炎RNA和多种神经保护蛋白，可对神经细胞发挥保护作用。Perets等使用以金纳米颗粒作为标记剂的计算机体层成像技术追踪鼻腔内给药的MSC-Exo在不同脑病中的迁移和归巢模式，发现MSC-Exo能够特异性靶向不同病理小鼠模型的大脑区域并进行累积；而在对照组中则呈现弥漫性迁移模式，这和神经免疫应答的趋化能力存在紧密联系。黄荣等对AD小鼠模型进行静脉输注BMSC-Exo，连续给药21 d后发现，与未处理组相比，BMSC-Exo组小鼠逃避潜伏期显著缩短，Toll样受体2、诱生型一氧化氮合酶及含NACHT、LRR和PYD结构域蛋白3等因子表达显著减少，三结构域蛋白31的表达显著增加。这意味着BMSC-Exo可能通过促进三结构域蛋白31表达和抑制炎症小体的产生来改善AD小鼠的认知功能障碍。另有研究表明，在SCI模型大鼠中，接受注射MSC-Exo组别的病变处神经和血管内皮的细胞数量均有所增加，表现出良好的神经及血管再生能力。Yang等利用MSC-Exo包被反义寡核苷酸4（Exo-ASO4）进行药物递送，结果表明 Exo-ASO4可到达PD模型小鼠的脑实质并明显降低α突触核蛋白的表达量进而减弱其在病灶内的聚集程度，减轻PD模型小鼠的多巴胺神经元退化，改善运动功能障碍。 2.4 炎症类疾病 炎症反应是指当机体受到病原微生物感染、创伤、变态反应等刺激时，自身产生一系列组织细胞的反应。通过MSC标志物（如CD29、CD44、CD90和CD73）标记发现，MSC-Exo可驻留在受伤和发炎的组织中，将活性物质转移至受体细胞，从而介导细胞间通讯，改变受体细胞的基因表达并影响其生理和病理状态。MSC-Exo可通过对免疫细胞和炎症细胞的极化反应进行调控，达到减轻炎症反应、抑制氧化应激和修复的目的，具体机制如表2所示。 MSC-Exo治疗的炎症类疾病主要涉及骨科疾病、泌尿系统疾病、免疫系统疾病、消化系统疾病以及呼吸系统疾病等5大类。 骨科相关炎症疾病中最为常见的是骨关节炎（osteroarthritis，OA），以关节软骨病变为主。已有研究表明，MSC-Exo促进软骨损伤修复的重要作用机制之一是抑制炎症因子表达，从而为软骨修复提供良好的微环境。Zhou等采用负载miRNA-126-3p的滑膜MSC-Exo处理OA大鼠，处理后的大鼠软骨组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达量均降低，进而抑制骨赘形成，防止软骨退变，并对关节软骨发挥抗凋亡和抗炎作用。Jin等在OA大鼠模型的膝关节上进行前交叉韧带横切和内侧半月板-胫骨韧带切除手术，然后在关节内注射BMSC-Exo，发现其能减轻大鼠模型的软骨破坏程度、促进软骨下骨重塑。结果说明BMSC-Exo通过减少软骨细胞的衰老和凋亡对OA起到治疗作用，这表明BMSC-Exo可能为OA治疗提供候选治疗方法。 膀胱炎和肾脏疾病均是常见的泌尿系统疾病。Wen等建立了动物模型发现，MSC-Exo可减轻胶原纤维累积并促进组织再生，从而保护组织免受损伤，有助于治疗间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征且无致瘤性。Lu等发现BMSC-Exo可通过激活前列腺素E2受体2遏抑促炎因子分泌，改善M1和M2型细胞的极化状态，减少肌成纤维细胞的形成，进而降低细胞外基质沉积和肾纤维化的程度。 常见的免疫系统疾病包括类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）和系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）等。目前临床应用较多的RA治疗药物为生物制剂和小分子激酶抑制剂，但药物自身的毒性极大限制了RA的治疗效果。赵相卓等利用 BMSC-Exo对RA-成纤维型滑膜细胞模型进行处理，结果证明，BMSC-Exo可通过抑制p38丝裂原激活的蛋白激酶活化进而抑制RA-成纤维型滑膜细胞的生长和转移，减少炎症因子分泌。王喆等通过构建负载双氯芬酸钠（diclofenac sodium，DS）的MSC-Exo（DS@EX），利用激光共聚焦成像观察发现，与普通药物递送载体相比，DS@EX可以更多地累积于发炎的关节中；同时，DS@EX减弱了关节表面的骨侵蚀，其骨密度值由921 mg/cm3升高至1 195 mg/cm3。这表明DS@EX可以减弱RA小鼠的炎性反应并缓解骨质的侵蚀。SLE也是多因素介导的自身免疫疾病。最近的研究证实，在动物模型中，BMSC-Exo可以提高miR-10a-5p的表达，进而靶向下调紫外线抵抗相关基因的表达水平，达到抑制SLE外周血单个核细胞增殖并促进细胞凋亡的目的。 慢性肝炎和炎性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是较为常见的消化系统疾病。自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一种高发慢性肝炎疾病，MSC-Exo通过特定的miRNA调节肝脏Treg和Th17的比例对AIH起治疗作用。Lu等建立AIH小鼠模型，应用携带miR-223-3p的MSC-Exo进行处理。结果显示，MSC-Exo可通过miR-223-3p调控信号转导及转录激活蛋白3、IL-1β以及IL-6的表达，同时提高Treg/Th17比值，进而减轻肝损伤，利于AIH的炎症修复。IBD是一种非特异性的慢性肠道炎症疾病，分为溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn disease，CD）。随着其发病率的逐年上升，目前IBD已成为全球性疾病。通过构建IBD的动物模型发现，MSC-Exo治疗IBD的潜在机制可能是参与调节相关转录因子的表达，进而发挥炎症抑制作用。Pak等应用源于人胎盘（human placenta，hp）的MSC-Exo（hPMSC-Exo）治疗CD具有良好的安全性和治疗效果。Duan等采用三硝基苯磺酸诱导构建UC小鼠模型，并采用原位注射hPMSC-Exo的方式进行治疗。结果显示，注射hPMSC-Exo可调节结肠细胞中促炎和抗炎细胞因子的平衡；同时，hPMSC-Exo还可通过降低髓过氧化物酶MPO和活性氧类的活性来抑制氧化应激。 常见的呼吸系统疾病包括哮喘、急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）和COVID-19等。因为过敏性鼻炎是导致哮喘病发的主要因素之一，所以治疗过敏性鼻炎也是从根本上治疗哮喘的有效途径。吴杰应用低氧处理的hUCMSC-Exo治疗过敏性鼻炎小鼠模型，结果发现，实验小鼠的IL-4和IL-10的表达量明显下降，存在更低分化程度的树突状细胞，进而证明MSC-Exo的注入可以增强对过敏性鼻炎的疗效。ARDS属于弥漫性肺损伤，是全球性普发疾病。胡松采用ARDS小鼠模型，通过尾静脉注入BMSC-Exo观察发现，实验组小鼠的生存率得到提高，同时肺组织炎症得到缓解。COVID-19具有高传播性和强变异性的特点，目前尚无有效治疗方法。MSC-Exo对病灶的免疫调节和组织修复能力可视作 COVID-19创新性疗法的重要基础，具有强大的医治潜力。Sengupta等在患有ARDS的COVID-19受试者中进行了第1阶段临床试验，结果显示，采用BMSC-Exo治疗的患者肺部的血氧饱和度以及氧合指数均显著升高，且体内炎症因子水平降低，患者存活率高达83%，肺部损伤情况也有所改善。 2.5 骨科疾病 骨骼是人体重要的器官，参与运动系统的组成，同时发挥支持和保护作用。骨科疾病除上述炎症疾病外，常见疾病还包括软骨损伤、骨折和骨质疏松（osteoporosis，OP）等。 MSC-Exo可促进软骨细胞增殖和基质生成，维持微环境“稳态”，还可激活软骨的修复和再生能力。Zhang等利用大鼠模型证实BMSC-Exo通过调控CD73的表达参与PI3K/Akt和ERK信号传导过程，进而促进细胞快速生长和浸润，实现软骨修复。此外，MSC-Exo携带的遗传分子也可以促进软骨修复。王宪峰等构建稳定过表达LncRNA H19的MSC并提取外泌体（H19-Exo），将其用于大鼠骨关节炎模型的治疗，证实高表达LncRNA H19的MSC-Exo通过靶向miR-29b-3p/转化生长因子β1/Smad3通路，促进软骨细胞的增长与再生，修复软骨损伤。 骨折修复是包括血管生成、细胞分化、成软骨合成的再生过程，愈合延迟或不愈合的现象会导致患者需要反复治疗，严重影响患者的生活质量。研究证实，促使MSC对骨骼组织进行再生修复的重要物质之一就是MSC-Exo。李畅等发现BMSC-Exo可以促进愈伤组织中骨形态发生蛋白2、Smad1和Runt相关转录因子2的表达，同时在骨折大鼠模型中，用BMSC-Exo治疗的组别愈伤组织体积明显增大，骨体积分数也显著提高。这表明BMSC-Exo可有效增强成骨作用。Furuta等通过尾静脉输注方式将MSC-Exo分别用于愈合能力障碍的CD9型小鼠和野生型小鼠。结果发现，MSC-Exo在成骨细胞内富集并积累，进而促进成骨细胞的增长，并极大缩减骨修复时间。 OP是常见、多发的骨代谢疾病，主要病征包括骨密度下降和骨组织微结构损伤。研究发现，MSC-Exo可通过介导骨代谢相关信号通路而实现对相关疾病的治疗。田荣华的研究显示，hUCMSC-Exo能促进骨质疏松大鼠成骨细胞的增殖，并呈浓度依赖性。其主要通过hUCMSC-Exo调控骨代谢循环，促进血管生成和成骨转化实现，进而对OP大鼠模型发挥修复作用。研究发现，MSC-Exo富含的多种microRNA能恢复继发性损伤，促进神经元细胞的修复和再生。张美玲等研究发现，注射MSC-Exo的大鼠模型组比注射PBS组的神经元光密度更高，而且信号转导及转录激活蛋白3与生长相关蛋白43的表达量更多，表明MSC-Exo可通过调控该通路促进轴突生长，进而发挥对神经元细胞的修复和再生作用，最终改善损伤大鼠的感觉功能。 2.6 其他疾病 除上述代表性疾病外，MSC-Exo的应用研究还有很多，如可用于创面愈合。皮肤通过对机体形成保护屏障以避免外界有害物质进入体内，当皮肤组织遭受外伤或糖尿病带来的并发症时，皮肤组织会产生不同程度的创伤。研究发现，MSC-Exo可控制胶原纤维在伤口愈合中的分布，减少瘢痕形成的同时加快创面愈合。此外，MSC-Exo包含的miRNA参与调控转化生长因子β信号通路，可诱导肌成纤维细胞分化，同时抑制促炎因子分泌，促进抗炎因子表达，利于创伤修复。 MSC-Exo在糖尿病及其并发症中同样发挥作用，Hu等发现经吡格列酮预处理后的MSC-Exo在高糖环境中可通过调控PI3K/Akt/内皮型一氧化氮合酶信号通路进而增强血管再生能力，促进糖尿病足溃疡的创口愈合。还有研究证实，MSC-Exo中的miR-17-5p可激活PTEN/Akt/低氧诱导因子1/血管内皮生长因子信号通路，提高血管内皮生长因子的表达水平进而加快血管生成，修复糖尿病产生的慢性伤口。 除此之外，MSC-Exo还可用于子宫内膜损伤和卵巢相关疾病。Zhang等构建子宫腔粘连（intrauterine adhesion，IUA）模型动物以评估MSC-Exo对IUA的治疗效果。结果发现， MSC-Exo能够阻遏TGF-β-Smad信号通路的转录与表达，促进血管生成，从而逆转子宫内膜纤维化。杜小倩等采用卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）大鼠模型腹腔注射hUCMSC-Exo，结果发现，hUCMSC-Exo可依靠改善POF小鼠的3种激素水平来修复大鼠卵巢功能，为POF的无细胞疗法奠定实验基础。 3 展望 MSC-Exo通过MSC旁分泌途径作用于靶细胞，释放内容物将信息传递给靶细胞，调控细胞生物学行为。而其无细胞的“脂筏”结构更赋予了MSC-Exo更高的信息转导效率、稳定性和安全性，同时也更利于储存，这显示出无细胞疗法的巨大发展潜能。目前大量基础研究已证实MSC-Exo能够减轻炎症反应，实现细胞损伤的修复与再生，同时可作为药物载体进行联合治疗，提高药物局部浓度进而增强疗效。而且经过修饰的MSC-Exo载药系统具备更高的靶向能力和更好的生物相容性。因而通过开发设计MSC-Exo载药系统以及对MSC-Exo进行靶向修饰来提高治疗精准性均具有广阔的应用前景。 从Clinicaltrials披露的研究数据可以发现，当前采用无细胞疗法治疗疾病的临床研究仍是空白，缺乏相关的临床试验，MSC-Exo对于各种疾病的治疗研究多处于动物模型试验阶段。这意味着MSC-Exo还未达到商业化制备的条件，相关高效、标准化的制备方法亟待探究，同时缺少合理化、规范化的临床应用标准。选择合适的剂量和最佳给药途径，也是推进MSC-Exo临床治疗应用的难点之一。此外，MSC-Exo在不同疾病治疗中的相关分子机制尚未阐述清晰，治疗过程中的药代动力学和不良反应等问题仍未被解答，未来仍需对MSC-Exo展开深入探索，以便评估其在无细胞疗法中的价值。 作者 孙馨  黄玉香 青岛奥克生物开发有限公司研发部，青岛 266000 通信作者：黄玉香， Email：abmd2003@163.com 引用本文：孙馨, 黄玉香. 间充质干细胞源性外泌体在疾病治疗中的潜在应用研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(4): 260-268.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20231115-00018 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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