DCAF15

今天为大家介绍一篇工作，是二月份发表在Nature上的“分子内二价胶水”的文章。通讯作者是邓迪大学的Alessio Ciulli教授和奥地利科学院分子医学研究中心的Georg E. Winter教授。Ciulli课题组关注蛋白-蛋白相互作用（PPI）中的化学生物学、结构生物学问题，尤其关注小分子化合物对于PPI的调节。Winter课题组关注小分子调控蛋白质降解，尤其是不可成药靶点的降解。——正文——故事还要从Indisulam讲起。2017年，磺酰胺类化合物Indisulam登上Science1，它介导CUL4A/BDCAF15与RBM39的互作，导致RMB39被泛素化，最终被降解（图1）。图1. 磺胺类药物诱导RBM39与CUL4A/BDCAF15形成复合物E7820是Indisulam的类似物，它也可以诱导RBM39与CUL4A/BDCAF15形成复合物（图2）2。图2. A）Indisulam及E7820结构 B) BM39-E7820-DCAF15复合物结构一些将E7820作为E3连接酶底物受体binder进行PROTAC分子设计的尝试没有取得很好的结果，靶蛋白降解效率很低。但是， E7820与(+)-JQ1（JQ1是BRD4配体，在分子胶设计领域非常常用）通过刚性Linker连接的融合分子——IBG1，活性很强，降解BRD4的DC50达到0.15 nM(图3)。图3. IBG1结构及IBG1降解BRD4但该分子并不通过DCAF15发挥作用（图4）。图4. 敲除DCAF15并不影响IBG1发挥作用通过FACS-based CRISPR–Cas9 screens，作者发现CRL4DCAF16 复合物中的组分与IBG1给药后BRD4稳定性有较强相关性。图5. FACS-based CRISPR–Cas9 screens流程示意图作者进一步证明，敲除DCAF16、DDB1消除了IBG1降解BRD4的能力。按照一般的思路，那应该是形成了BRD4-IBG1-DCAF16三元复合物，导致BRD4泛素化，然后被降解。但是E7820衍生物1a,1b,1c,1d并没有拮抗IBG1诱导的BRD4降解（图6A），证明E7820片段不是扮演PROTAC中E3连接酶binder的角色；而JQ1的衍生物1e,1f,1g也没有降解BRD2/4的能力（图6B），说明完整的E7820结构是降解所必需的。综上所述，IBG1分子发挥功能的机制与PROTAC不同。图6. A）E7820衍生物结构 B）JQ1衍生物结构这篇文章最神奇的部分到了，在此之前先看BRD4的结构（图7）。BRD4有两个Bromodomain（BD1和BD2），而JQ1跟这两个结构域都有纳摩尔级的结合力3。以往研究Bromodomain抑制剂及其复合物结构的时候，通常只会用单个的BD 1domain或者BD2 domain。图7. 鼠BRD4结构（与人高度一致）4但这篇文章截取了BD1-NLS-BD2这一段进行研究，后文将该截短体称为BRD4Tandem。作者发现DCAF16与BRD4Tandem有着天然的亲和力，IBG1的加入增强了DCAF16-的结合，也改变了结合模式，结合由焓驱动转变为熵驱动（图8）。图8. d）DCAF16滴定BRD4Tandem a）DCAF16滴定BRD4Tandem-IBG1紧接着作者证明了BD1/2同时存在是IBG1发挥作用的基础，也解出了BRD4Tandem-IBG1-DCAF16-DDB1的复合物结构（图9）。尺寸排阻色谱证明IBG1将BRD4Tandem拉紧；电镜结构表明IBG1与BRD4Tandem互作后形成一个新的疏水界面，DCAF16主要通过疏水作用与该界面互作。这也解释了为什么在IBG1存在时，DCAF16与BRD4Tandem的互作由熵驱动。图9. 冷冻电镜结构PDB ID 8OV6同时，复合物结构也表明JQ1占据了BD2 domain，E7820片段占据了BD1 domain。在此之前也有过磺酰胺结构的Bromodomain抑制剂被报道，将以前结构中的抑制剂与E7820片段叠合，发现他们采取类似的构象(图10)。但磺胺片段与Bromodomain的结合力远弱于JQ1。图10. 其他磺胺类抑制剂晶体结构中的pose与本研究中的E7820叠合图，E7820为黄色作者猜想将两个强Bromodomain抑制剂通过类似的方式组装起来，可能会达到更好的效果（图11）。图11. 作者设计的分子胶（IBG2,IBG3）IBG3的活性确实强于原始分子IBG1，降解BRD4的EC50达到了6.7 pM，三元复合物形成的ΔG绝对值更大。但以往也有人做过类似的二价Bromodomain抑制剂（图12），抑制效果很强，但并没有降解BRD4的能力。他们与IBG3的区别主要有三点：1）连接链为柔性，2）连接链与JQ1连接的位置不同，3）连接链长度不同。具体是哪个因素更重要，还需要后续深入地探讨。图12. 二价Bromodomain抑制剂作者在专利中还发现类似的结构——IBG4（图13），该化合物也能降解BRD4，机制与IBG1类似，但是IBG4降解BRD4依赖DCAF11,而不是DCAF16，且DCAF11和16在结构上相似性较小。图13. IBG4结构——小结——这篇文章无疑是成功的，他们首次发现分子内二价胶水，拓宽了分子胶类型，并成功理性设计出皮摩尔级的分子内二价胶（IBG1→IBG3）。更难能可贵的是它也带给我们启示和思考，除了VHL/CRBN配体外，慎重选择新出现的binder，如E7820。双功能分子设计看似简单，实则不然。本篇内容就是从DCAF15→DCAF16→DCAF11，过程曲折。关于合理设计分子胶/双功能分子，有人认为蛋白与E3底物受体间的弱结合或许是分子胶必须的，有人则不这么认为，该工作的结果是倾向于前者的。最近分子胶领域的工作喜欢展示自己的分子设计策略5，但这篇文章提醒我们，要严谨的验证自己设想的机制。分子胶理性设计还是一片蓝海！参考文献：1 Han, T. et al. Anticancer sulfonamides target splicing by inducing RBM39 degradation via recruitment to DCAF15. Science 356 (2017). https://doi.org/10.1126/science.aal37552 Du, X. et al. Structural Basis and Kinetic Pathway of RBM39 Recruitment to DCAF15 by a Sulfonamide Molecular Glue E7820. Structure 27, 1625-1633.e1623 (2019). https://doi.org/10.1016/j.str.2019.10.0053 Filippakopoulos, P. et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature 468, 1067-1073 (2010). https://doi.org/10.1038/nature095044 Weissman, J. D. et al. The intrinsic kinase activity of BRD4 spans its BD2-B-BID domains. J. Biol. Chem. 297 (2021). https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.1013265 Gourisankar, S. et al. Rewiring cancer drivers to activate apoptosis. Nature 620, 417-425 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06348-2本文介绍的工作：Hsia, O., Hinterndorfer, M., Cowan, A.D. et al. Targeted protein degradation via intramolecular bivalent glues. Nature 627, 204–211 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07089-6作者：任宇浩审稿：程北溟编辑：黄志贤声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

今天为大家介绍一篇工作，是二月份发表在Nature上的“分子内二价胶水”的文章。通讯作者是邓迪大学的Alessio Ciulli教授和奥地利科学院分子医学研究中心的Georg E. Winter教授。Ciulli课题组关注蛋白-蛋白相互作用（PPI）中的化学生物学、结构生物学问题，尤其关注小分子化合物对于PPI的调节。Winter课题组关注小分子调控蛋白质降解，尤其是不可成药靶点的降解。——正文——故事还要从Indisulam讲起。2017年，磺酰胺类化合物Indisulam登上Science1，它介导CUL4A/BDCAF15与RBM39的互作，导致RMB39被泛素化，最终被降解（图1）。图1. 磺胺类药物诱导RBM39与CUL4A/BDCAF15形成复合物E7820是Indisulam的类似物，它也可以诱导RBM39与CUL4A/BDCAF15形成复合物（图2）2。图2. A）Indisulam及E7820结构 B) BM39-E7820-DCAF15复合物结构一些将E7820作为E3连接酶底物受体binder进行PROTAC分子设计的尝试没有取得很好的结果，靶蛋白降解效率很低。但是， E7820与(+)-JQ1（JQ1是BRD4配体，在分子胶设计领域非常常用）通过刚性Linker连接的融合分子——IBG1，活性很强，降解BRD4的DC50达到0.15 nM(图3)。图3. IBG1结构及IBG1降解BRD4但该分子并不通过DCAF15发挥作用（图4）。图4. 敲除DCAF15并不影响IBG1发挥作用通过FACS-based CRISPR–Cas9 screens，作者发现CRL4DCAF16 复合物中的组分与IBG1给药后BRD4稳定性有较强相关性。图5. FACS-based CRISPR–Cas9 screens流程示意图作者进一步证明，敲除DCAF16、DDB1消除了IBG1降解BRD4的能力。按照一般的思路，那应该是形成了BRD4-IBG1-DCAF16三元复合物，导致BRD4泛素化，然后被降解。但是E7820衍生物1a,1b,1c,1d并没有拮抗IBG1诱导的BRD4降解（图6A），证明E7820片段不是扮演PROTAC中E3连接酶binder的角色；而JQ1的衍生物1e,1f,1g也没有降解BRD2/4的能力（图6B），说明完整的E7820结构是降解所必需的。综上所述，IBG1分子发挥功能的机制与PROTAC不同。图6. A）E7820衍生物结构 B）JQ1衍生物结构这篇文章最神奇的部分到了，在此之前先看BRD4的结构（图7）。BRD4有两个Bromodomain（BD1和BD2），而JQ1跟这两个结构域都有纳摩尔级的结合力3。以往研究Bromodomain抑制剂及其复合物结构的时候，通常只会用单个的BD 1domain或者BD2 domain。图7. 鼠BRD4结构（与人高度一致）4但这篇文章截取了BD1-NLS-BD2这一段进行研究，后文将该截短体称为BRD4Tandem。作者发现DCAF16与BRD4Tandem有着天然的亲和力，IBG1的加入增强了DCAF16-的结合，也改变了结合模式，结合由焓驱动转变为熵驱动（图8）。图8. d）DCAF16滴定BRD4Tandem a）DCAF16滴定BRD4Tandem-IBG1紧接着作者证明了BD1/2同时存在是IBG1发挥作用的基础，也解出了BRD4Tandem-IBG1-DCAF16-DDB1的复合物结构（图9）。尺寸排阻色谱证明IBG1将BRD4Tandem拉紧；电镜结构表明IBG1与BRD4Tandem互作后形成一个新的疏水界面，DCAF16主要通过疏水作用与该界面互作。这也解释了为什么在IBG1存在时，DCAF16与BRD4Tandem的互作由熵驱动。图9. 冷冻电镜结构PDB ID 8OV6同时，复合物结构也表明JQ1占据了BD2 domain，E7820片段占据了BD1 domain。在此之前也有过磺酰胺结构的Bromodomain抑制剂被报道，将以前结构中的抑制剂与E7820片段叠合，发现他们采取类似的构象(图10)。但磺胺片段与Bromodomain的结合力远弱于JQ1。图10. 其他磺胺类抑制剂晶体结构中的pose与本研究中的E7820叠合图，E7820为黄色作者猜想将两个强Bromodomain抑制剂通过类似的方式组装起来，可能会达到更好的效果（图11）。图11. 作者设计的分子胶（IBG2,IBG3）IBG3的活性确实强于原始分子IBG1，降解BRD4的EC50达到了6.7 pM，三元复合物形成的ΔG绝对值更大。但以往也有人做过类似的二价Bromodomain抑制剂（图12），抑制效果很强，但并没有降解BRD4的能力。他们与IBG3的区别主要有三点：1）连接链为柔性，2）连接链与JQ1连接的位置不同，3）连接链长度不同。具体是哪个因素更重要，还需要后续深入地探讨。图12. 二价Bromodomain抑制剂作者在专利中还发现类似的结构——IBG4（图13），该化合物也能降解BRD4，机制与IBG1类似，但是IBG4降解BRD4依赖DCAF11,而不是DCAF16，且DCAF11和16在结构上相似性较小。图13. IBG4结构——小结——这篇文章无疑是成功的，他们首次发现分子内二价胶水，拓宽了分子胶类型，并成功理性设计出皮摩尔级的分子内二价胶（IBG1→IBG3）。更难能可贵的是它也带给我们启示和思考，除了VHL/CRBN配体外，慎重选择新出现的binder，如E7820。双功能分子设计看似简单，实则不然。本篇内容就是从DCAF15→DCAF16→DCAF11，过程曲折。关于合理设计分子胶/双功能分子，有人认为蛋白与E3底物受体间的弱结合或许是分子胶必须的，有人则不这么认为，该工作的结果是倾向于前者的。最近分子胶领域的工作喜欢展示自己的分子设计策略5，但这篇文章提醒我们，要严谨的验证自己设想的机制。分子胶理性设计还是一片蓝海！参考文献：1 Han, T. et al. Anticancer sulfonamides target splicing by inducing RBM39 degradation via recruitment to DCAF15. Science 356 (2017). https://doi.org/10.1126/science.aal37552 Du, X. et al. Structural Basis and Kinetic Pathway of RBM39 Recruitment to DCAF15 by a Sulfonamide Molecular Glue E7820. Structure 27, 1625-1633.e1623 (2019). https://doi.org/10.1016/j.str.2019.10.0053 Filippakopoulos, P. et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature 468, 1067-1073 (2010). https://doi.org/10.1038/nature095044 Weissman, J. D. et al. The intrinsic kinase activity of BRD4 spans its BD2-B-BID domains. J. Biol. Chem. 297 (2021). https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.1013265 Gourisankar, S. et al. Rewiring cancer drivers to activate apoptosis. Nature 620, 417-425 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06348-2本文介绍的工作：Hsia, O., Hinterndorfer, M., Cowan, A.D. et al. Targeted protein degradation via intramolecular bivalent glues. Nature 627, 204–211 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07089-6作者：任宇浩审稿：程北溟编辑：黄志贤GoDesignID：Molecular_Design_Lab（ 扫描下方二维码可以订阅哦！）

来源：药渡撰文：balabala     编辑：维他命靶向蛋白降解技术利用真核细胞内固有的两大蛋白降解系统——泛素-蛋白酶体系统（UPS）和溶酶体途径，实现了多种疾病相关蛋白的靶向降解，正引领着下一代小分子药物的发展方向。近年来，研究人员围绕上述问题积极探索，开发了多维度的靶向蛋白降解技术。本文将盘点从2023年至今的靶向蛋白降解的新型策略，以供读者参考。1基于纳米平台的靶向蛋白降解迄今为止，许多基于邻近效应的双功能分子已经被开发用于靶向调控生物大分子中，如靶向蛋白质泛素化/磷酸化、靶向RNA降解等等。它们在分别接近两个目标分子后将其拉近，从而形成复合物而发挥下游功能。但这些双功能分子往往是一价的，需要经过复杂耗时的筛选和优化。SM-PROTAC纳米平台2023年3月，北京大学深圳研究生院李子刚/尹丰团队开发了一种基于“分裂-混合”的纳米平台，并将其命名为split-and-mixPROTAC(SM-PROTAC)（图1），他们将能够自组装的核心单体分别与PROTAC中的两个组件（靶蛋白招募模块和E3连接酶招募模块）融合，以不同的比例将二者结合，再通过一些表征方法筛选二者的最佳比例，同时该纳米平台的多价性质也保证了目的蛋白的降解效果。之后，研究人员通过对一系列靶点的成功降解，证明了SM-PROTAC可以通过连接目标蛋白配体和E3连接酶配体实现快速的靶标蛋白降解以及配方优化。同时，该平台还具有极强的应用潜力，可以扩展到任何生物分子，包括DNA、RNA、蛋白质和其他生物分子的功能调控，如磷酸化/去磷酸化、泛素化、靶向降解、表观遗传学等。图1. 基于“分裂和混合”的SM-PROTAC模型示意图[1]LipoSM-PROTAC纳米自调节平台但是基于肽的SM-PROTAC的低药效，限制了其在生物医学领域的进一步发展。因此，迫切需要开发一种更有效的用于生物医学应用的PROTAC纳米平台。由于脂质体具有易于配制、自动组装和高负载运输的特性。研究人员将SM-PROTAC与脂质体结合，从而提出了一种基于脂质体的分合（Split-and-Mix）纳米自调节平台(LipoSM-PROTAC)（图2C），并对其进行了生物学表征和验证。研究发现，LipoSM-PROTAC系统具有叶酸选择性降解靶标蛋白的功能。且研究人员以雌激素受体蛋白（ERɑ）为模型，通过体外实验验证发现该体系具有显著降解ERɑ蛋白的效果。与基于肽的SM-PROTAC相比，LipoSM-PROTAC系统可以以更低的浓度达到治疗效果，并为临床转化提供了机会。总体而言，基于LipoSM的平台显示出更高的药物功效，这为PROTAC和其他生物分子调控提供了潜在的应用前景。图2. 基于脂质体的分合(Split-and-Mix)纳米自调节平台(LipoSM-PROTAC)模型示意图[2]2针对特定细胞器内蛋白的靶向蛋白降解目前，真核细胞中所有的靶向蛋白质稳定（TPD）都依赖于泛素蛋白酶体或溶酶体系统，因此对缺乏蛋白酶体和溶酶体的膜细胞器中的靶蛋白（如线粒体）无能为力。杭州医学研究所的方晓红团队设计并开发了一种线粒体蛋白酶靶向嵌合体（MtPTAC），用于实现线粒体基质中蛋白的靶向降解（图3）。MtPTAC是一种双功能小分子，一端与线粒体酪蛋白水解蛋白酶P（ClpP）结合，另一端与靶蛋白结合，MtPTAC激活了ClpP的水解酶活性，同时使目标蛋白与ClpP靠近，进而水解掉靶蛋白。研究人员以线粒体RNA聚合酶（POLRMT）为靶蛋白，在体内和体外均展示了MtPTAC强大的蛋白水解能力和抗肿瘤应用前景。这是第一个模块化设计的能够特异性水解线粒体内靶蛋白的TPD。图3. 线粒体蛋白酶靶向嵌合体(MtPTAC)模型示意图[3]3可逆的蛋白靶向降解嵌合体对于传统的PROTAC分子而言，其使用的过程中往往会表现出钩状效应，即当PROTAC分子的浓度达到某一特定值后，进一步增加其浓度反而会降低靶蛋白的降解效率，而这一效应也在一定程度上限制了PROTAC分子在活体和临床研究中的应用。基于这一背景，佛罗里达大学的Thomas Kodadek教授和来自康奈尔大学的Francis Barany教授团队提出了一种自组装蛋白降解靶向嵌合体（SAPTAC）的设计策略（图4），将PROTAC分子拆分为与靶蛋白和E3泛素连接酶结合的两部分（用于实现可逆耦合的“X和Y”），如果在平衡状态下，存在大量未连接的目标蛋白和E3连接酶配体，这些低分子量分子可以比稳定连接的PROTAC更有效地渗透细胞/组织。在渗透细胞后，目标蛋白和E3连接酶之间将形成共价可逆结构，引向关键的三元复合物，触发目标蛋白的多泛素化和随后的蛋白酶体介导的破坏，从而实现消除钩状效应。图4. 自组装蛋白降解靶向嵌合体(SAPTAC)模型示意图[4]4基于非传统降解途径的靶向蛋白质降解在哺乳动物受到多种刺激后，可激活早期基因（IEG），IEG介导生长因子、神经元和免疫刺激的转录反应，编码Fos、EGR和NR4A家族的转录因子，促进迟发反应基因（LRG）的转表达，介导细胞对刺激作出响应。而LRG具有细胞反应特异性，在对首次刺激的适应性反应中至关重要，IEG mRNA在首次刺激后的几分钟内积累，一旦翻译，它们的蛋白质会迅速降解，从而出现蛋白质瞬时爆发式表达，促使细胞对各种刺激产生适当的反应。尽管IEG的转录机制得到了很好的研究，但IEG蛋白的降解机制仍然是个谜。为了表征IEG蛋白的降解机制，Michael E. Greenberg和Stephen J. Elledge团队通过全局蛋白质稳定性分析（GPS）系统来测定IEG蛋白质的稳定性，并进行全基因组CRISPR-Cas9筛选，以寻找那些调节IEG蛋白稳定性的基因（图2）。他们发现，midnolin蛋白是哺乳动物中一种未被充分表征的蛋白质，它的过表达促进c-Fos、FosB、EGR1和NR4A1等多种IEG蛋白的蛋白酶体降解，抑制蛋白酶体的活性而不是抑制泛素化酶的活性可抑制IEG蛋白降解，表明IEG蛋白降解依赖于midnolin和蛋白酶体，而不是泛素化降解途径。midnolin-蛋白酶体途径可能代表了蛋白酶体绕过经典泛素化途径，以实现核蛋白选择性降解的一般机制。图5. midnolin-蛋白酶体途径独立于泛素化降解许多核蛋白[5]O-糖基化是真核生物中最普遍的糖基化形式。在多种类型的O-糖基化蛋白中，最突出的是黏蛋白（mucins），它主要由上皮细胞分泌，在一系列类型的肿瘤细胞中表达，并通过调节蛋白稳定性诱导各种致癌信号分子促进肿瘤进展。黏蛋白酶StcE是一种选择性切割黏蛋白的蛋白酶。StcE可以选择性地从生物样品中去除黏液结构域糖蛋白，并将其切割成片段，便于分析。StcE对黏蛋白表现出基于肽和聚糖的选择性。斯坦福大学的Carolyn R. Bertozzi教授团队通过纳米抗体将StcE酶靶向到癌细胞表面，并通过酶工程化改造降低StcE酶的酶活性，从而仅在癌细胞表面富集的情况下完成降解过程，避免误伤健康细胞的黏蛋白，具有肿瘤治疗的前景（图6）。图6. ColabFold (Methods)62预测的纳米体-黏液酶偶联物的结构[6]5通过分子内二价胶进行靶向降解IBG1是专利报道的一个类PROTAC的降解剂，其是由BET抑制剂JQ1和DCAF15的芳基磺酰胺配体E7820连接而成，能够在多个细胞系中诱导BRD4的高效降解。实验结果表明，IBG1诱导的BRD4降解依赖于蛋白酶体途径，但与DCAF15无关。英国邓迪大学的Ciulli团队与奥地利科学院CeMM分子医学研究中心的Winter团队通过研究IBG1分子对BRD4的靶向降解机制，揭示了IBG1是一种分子内二价胶水，并发现了一种新型的靶蛋白降解模式，即小分子同时顺式（cis）结合靶蛋白的两个相邻结构域，靶蛋白构象的变化使其粘连到E3连接酶上，与一般的PROTAC等反式（trans）蛋白-连接酶结合有着本质的区别。这种两个结构域的分子内二聚化修饰蛋白质表面并调节蛋白-蛋白相互作用的方法，是一种高效靶向蛋白质降解的新策略（图7），为药理学的发展提供了新的设计方向。图7. 传统的一价胶和二价PROTACs与分子内二价胶分子识别模式的示意图模型[7]参考文献：1.Targeted Biomolecule Regulation Platform: A Split-and-Mix PROTAC Approach2.Selective Protein of Interest Degradation through the Split-and-Mix Liposome Proteolysis Targeting Chimera Approach3.Mitochondrial Protease Targeting Chimeras for Mitochondrial Matrix Protein Degradation4.Reversible Assembly of Proteolysis Targeting Chimeras5.The midnolin-proteasome pathway catches proteins for ubiquitination-independent degradation6.Design of a mucin-selective protease for targeted degradation of cancer-associated mucins7.Targeted protein degradation via intramolecular bivalent glues*声明：本文仅是介绍医药疾病领域研究进展或简述研究概况或分享医药相关讯息，并非也不会进行治疗或诊断方案推荐，也不对相关投资构成任何建议。内容如有疏漏，欢迎沟通指出！利润飙升408.11%！微芯生物“两驾马车”驱动，研发之路高歌猛进这十款药物，今年有望获FDA批准！舒沃哲上市四个月卖9128 万，迪哲医药做对了什么？