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TIP60 功能失常与多种疾病有关，包括结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和阿尔茨海默病等神经系统疾病，研究人员利用高分辨率低温电镜深入分析蛋白复合物TIP60。 为了转录基因中包含的信息，或者修复 DNA 中每天发生的数十次断裂，我们的酶必须能够直接访问DNA 以执行其功能。然而，在细胞核中，这种访问是有限的，因为 DNA 链通常像线轴上的线一样紧紧盘绕在组蛋白周围。 在一项新的研究中，来自劳伦斯伯克利国家实验室、加州大学伯克利分校、西雅图系统生物学研究所和拉瓦尔大学的研究人员如今对能够访问已被包裹的DNA的蛋白复合物TIP60有了更好的了解。了解TIP60 的详细结构和行为，就能深入了解这种蛋白复合物在其中发挥作用的多种疾病，如阿尔茨海默病和多种癌症。相关研究结果于2024年8月1日在线发表在Science期刊上，论文标题为“Structural insights into the human NuA4/TIP60 acetyltransferase and chromatin remodeling complex”。 论文共同通讯作者、加州大学伯克利分校教授Eva Nogales说，“这项合作研究以一种强有力的方式将结构和功能测试结合在一起，让我们了解了这种复杂的大分子组装如何执行其调节对我们的基因组进行阅读的工作。人类 TIP60 的结构揭示了进化如何将两种不同的分子功能合并成单个复合物，重新调整结构模块的组合方式以适应其双重功能。” 研究者能够研究这种由 17 种蛋白组成的复合物的结构及其各组分之间的相互作用。他们采用了多种方法，包括在加州大学伯克利分校Nogales实验室进行的高分辨率低温电镜实验。这种技术能让科学家们观察到原子尺度的蛋白结构。 论文共同通讯作者、拉瓦尔大学医学院教授Jacques Côté解释说，“高分辨率低温电镜使得研究蛋白等复杂生物系统的分子结构成为可能，这是以前任何其他方法都无法实现的。” 为了揭示TIP60的结构，Nogales和她的研究团队对Côté团队制备的样本进行了纯化和研究。他说，“Nogales教授不仅拥有进行这类分析所需的专业设备，而且她在高分辨率低温电镜方面的专业知识也是世界公认的。” 图片来自Science, 2024, doi:10.1126/science.adl5816 TIP60 功能失常与多种癌症有关，包括结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和转移性黑色素瘤。它还与阿尔茨海默病等神经系统疾病有关。 Côté说，“当访问DNA的途径受到限制时，修复DNA断裂的酶就无法发挥作用，细胞就会受到严重损伤。肿瘤抑制基因也会出现同样的问题。TIP60必须能够在DNA上打开一个缺口，它们才能表达。如果我们希望针对与TIP60水平低有关的疾病（包括阿尔茨海默病）开发新的靶向疗法，那么充分了解TIP60的结构至关重要。对于这些疾病，我们可能能够开发与TIP60活性位点结合的分子，以激活TIP60。” 他补充说，对于癌症，向受影响的组织给送TIP60抑制剂或许可以局部减缓癌细胞的繁殖。他说，“目前，还没有很好的TIP60抑制剂。如今这种复合物的结构已经知道了，我们希望事情会有所进展。”（生物谷Bioon.com） 参考资料： Zhenlin Yang et al. Structural insights into the human NuA4/TIP60 acetyltransferase and chromatin remodeling complex. Science, 2024, doi:10.1126/science.adl5816.

*仅供医学专业人士阅读参考不知道你有没有想过这个问题。我们的大脑里有上百亿个神经元，每次形成一个记忆都只会使用其中极小一部分神经元；那么大脑选择承担记忆重任的神经元，究竟是随机的，还是自有一套标准？上周五，由瑞士洛桑联邦理工学院Johannes Gräff领衔的研究团队，在顶级期刊《科学》上发表一项重要研究成果，帮我们解开了上述谜团。Gräff团队发现，记忆的形成与神经元染色质的表观遗传学特征有关。那些优先被招募参与记忆形成的神经元，它们的染色质中有很多高乙酰化组蛋白，染色质处于开放状态。值得注意的是，促进神经元染色质打开，可以提升记忆；而让神经元染色质关闭，会阻碍记忆的形成。这一发现让我们对记忆的形成有了更深入的认知，为提升记忆药物的开发提供了潜在的靶点。▲ 论文首页截图作为一名神经学家，Johannes Gräff对记忆的形成过程非常着迷。他很早就注意到，记忆的形成往往只需要很少的神经元，然而被选中的神经元与没被选中的神经元相比，看上去似乎也没啥差别。那么，肩负记忆重任的神经元究竟是如何被选中的呢？Gräff和他的团队打算从他们最关注的神经表观遗传学角度探索上述问题。他们的研究对象是小鼠外侧杏仁核（LA），它是巴甫洛夫恐惧学习过程中突触可塑性的关键部位。初步研究发现，杏仁核主要神经元的染色质压实存在异质性，而且恐惧学习会诱导染色质整体松弛。随后，他们分析了染色质组蛋白乙酰化（染色质可塑性的主要调节因子）的水平。果不其然，外侧杏仁核（LA）主要神经元的组蛋白乙酰化水平也存在异质性。尤其是在cFos阳性神经元（活跃的神经元）中，组蛋白第3亚基27号赖氨酸的乙酰化（H3K27Ac）水平显著更高。▲ H3K27Ac水平的比较既然H3K27Ac的水平与记忆有关，Gräff团队就尝试探索调节H3K27Ac的水平对记忆的影响。他们选择了两个组蛋白乙酰转移酶（HATs）——CBP和KAT5，以及一个对照蛋白eGFP，将它们分别构建到慢病毒载体中，分别注射到不同小鼠的外侧杏仁核中。随后，让小鼠开始恐惧学习。研究结果表明，过表达CBP或KAT5，会提升H3K27Ac水平，促进记忆路径的形成；而抑制CBP的表达，会抑制记忆路径的形成。▲ CBP或KAT5会提升H3K27Ac水平接下来，Gräff团队借助于单核（sn）多组测序同时评估染色质可及性（snATAC-seq）和基因表达（snRNA-seq）的变化。他们发现，CBP和KAT5的过表达引起的启动子可及性与转录上调，存在高度的功能重叠，尤其是与突触相关的基因。例如与突触功能相关的基因，以及神经元兴奋性和激活有关的基因等。这说明，CBP和KAT5的过表达，通过这些方式促进神经元向激活状态过渡。▲ 受CBP和KAT5过表达调控的基因（DA：可及性；DE：差异表达基因）从功能的角度来看，CBP和KAT5过表达会增加神经元的内在兴奋性，并诱导突触重塑。从小鼠的表型来看，CBP和KAT5过表达会有助于记忆的保持，而抑制这两个蛋白的表达则会破坏记忆保持。在研究的最后，Gräff团队基于单细胞分辨率的实时成像技术，证实组蛋白乙酰化确实与神经元的内在兴奋性相关联。▲ 机制示意图总的来说，Johannes Gräff团队这项研究成果证实，染色质开放性和可及性更高的神经元，更有可能被大脑招募去参与记忆的形成。值得注意的是，在这个研究中，Gräff和他的同事已经证明，通过干预染色质组蛋白的乙酰化水平，可以改善小鼠的记忆。因此，未来有望围绕研究发现的通路，开发出提升记忆力的药物，以改善痴呆症等患者的认知功能。还有一个可能性，是找到影响染色质表观遗传修饰的可调节因素，例如探索下睡眠等是不是会影响神经元染色质的可塑性，进而增强记忆。如果这些可调节因素被发现，改善记忆的方法或许会更便捷。参考文献：[1].Giulia Santoni et al. ,Chromatin plasticity predetermines neuronal eligibility for memory trace formation. Science 385, eadg9982(2024). DOI:10.1126/science.adg9982本文作者丨BioTalker

摘要：由于线性信使RNA（mRNA）新型冠状病毒病2019（COVID-19）疫苗的成功，全球的生物制药公司和研究团队已经开始尝试开发更稳定的环状RNA（circRNA）疫苗，并取得了一些初步成果。本综述旨在总结环状RNA研究的关键发现和重要进展，环状RNA在体内的代谢和生物学功能，以及环状RNA疫苗的研究进展和生产过程。此外，本文还强调了环状RNA疫苗质量控制的考虑因素，并概述了环状RNA疫苗开发和质量控制中的主要挑战和问题解决策略，以期为环状RNA疫苗相关研究提供参考。 1.引言 2019年新型冠状病毒病（COVID-19）疫苗是目前通过多种技术途径快速成功开发并应用的首批疫苗，这些疫苗包括灭活疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗和基于mRNA的疫苗，其中COVID-19 mRNA疫苗是首批获批的mRNA疫苗。目前，大约有40种mRNA疫苗正在进行临床试验，其中2种已经上市。全球已经接种了超过40亿剂mRNA疫苗，约占总接种量的三分之一。mRNA疫苗不仅能够诱导高水平的体液免疫，还能引发相对较强的细胞免疫反应。由于mRNA疫苗技术的快速性和可编辑性，它适合作为应对新出现传染病的疫苗平台。所有上述COVID-19 mRNA疫苗都具有线性结构。目前，改良的线性mRNA分子仍然稳定性较差，这限制了它们能够表达的蛋白质量。除了线性RNA，自然界中也存在环状RNA（circRNA）。这些RNA具有由共价键形成的单链闭环结构，与线性RNA相比，在体内具有更高的稳定性。circRNA也能够编码蛋白质并进行翻译，这为疫苗开发提供了潜力。COVID-19 mRNA疫苗的成功开发和应用促使研究人员探索使用circRNA开发更稳定的核酸基COVID-19疫苗。最近，几个研究团队成功开发了COVID-19 circRNA疫苗，这些疫苗不仅具有线性mRNA疫苗的优势，而且在一系列温度下具有更高的稳定性和比自配方线性mRNA疫苗更长的蛋白质表达持续时间。因此，circRNA疫苗的低剂量可能足以引发强烈的免疫反应。研究人员尝试利用circRNA的稳定性，通过将表达CAR的circRNA引入T细胞，直接合成嵌合抗原受体（CAR）T细胞，以避免通过T细胞分离后再进行工程改造的繁琐过程。因此，一些研究人员认为circRNA疫苗可能成为应对未来新出现的主要传染病或其他常见病毒疾病（如乙型肝炎病毒（HBV）、人类疱疹病毒（HHV）、埃博拉病毒（EBV）、流感A病毒（IAV）和人类乳头瘤病毒（HPV））的强大工具，并且可能被开发成肿瘤治疗疫苗。因此，全球的生物制药公司和研究团队已经将相当大的关注和研究努力投入到circRNA疫苗的开发中。在这篇综述中，我们旨在总结circRNA疫苗的研究进展和配方过程，并突出RNA疫苗质量控制中的考虑因素和突出问题，为未来的circRNA疫苗相关研究提供参考。 2.circRNA的发现 1971年，研究人员在研究马铃薯纺锤形块茎病时发现了可以侵入植物并导致植物死亡的类病毒分子，并将其命名为“viroids”。与病毒不同，viroids是单分子且没有蛋白质外壳。Sanger等人在1976年首次将viroids描述为单链共价闭合的circRNA分子。1979年，Hsu和Coca-Prados使用电子显微镜在HeLa细胞中发现了没有自由末端的circRNA分子的存在；这是在真核细胞中首次报道circRNA分子的观察。1985年聚合酶链反应（PCR）技术的发明导致了对线性RNA研究兴趣的激增。因此，对circRNA的关注很少，一些研究人员认为circRNA仅仅是线性RNA的副产品；这导致了circRNA相关研究的停滞。在1990年代初，零星的研究识别并表征了从内源性RNA产生的circRNA。发表的报告表明，非聚腺苷酸化的RNA具有混合外显子，由非典型剪接产生的（“混合外显子”）是共价闭合的环状RNA，如EST-1基因转录本的特定环化。在接下来的几年中，一些研究提出了这些分子可能产生的机制，例如倒置重复序列对于Sry环化的假设。还可以从大鼠细胞色素P450 2C24基因、人类细胞色素P450基因等产生额外的环状RNA。2006年，研究人员在黑腹果蝇中发现了环状转录本的存在。从2010年左右开始，随着RNA测序和生物信息学技术的快速发展，结合使用这些技术的研究揭示了不同生物体中存在多样且高度保守的circRNA，如人类、小鼠、植物、隐球菌、斑马鱼和原生动物，这导致了circRNA研究的爆炸性增长。2015年，首次报道了能够编码蛋白质并进行翻译的circRNA。从2017年开始，现代分子生物学实验技术的广泛应用使通过RNA测序和生物信息学研究先前发现的各种circRNA得到了验证。2018年，研究人员成功合成了能够表达蛋白质的circRNA，这可能被应用于疫苗开发。2022年，一些研究团队开始了COVID-19 circRNA疫苗和肿瘤或遗传疾病治疗疫苗的研究（图1）。随着circRNA研究深度的不断增加，circRNA被发现在某些生理和病理条件下发挥重要作用，并且能够表达蛋白质，这可能使它们被纳入疫苗。因此，circRNA逐渐成为分子生物学和其他相关研究领域中的重要研究领域。 图 1: 环状RNA研究的关键发现和进展 3. 体内自然circRNA的代谢和功能 3.1.circRNA的合成 迄今为止，RNA通过反向剪接和外显子跳跃在体内被认识到是环化的，其中反向剪接可能更为普遍，因为它比外显子跳跃更频繁地被观察到。反向剪接的RNA环化是指在RNA出现断裂点后，下游5'剪接供体位点与上游3'剪接受体位点的反向连接。此后，某些内含子序列经历选择性剪接，最终导致circRNA的生成。目前存在两种广泛接受的RNA环化模型：套索驱动的环化和直接反向剪接环化。套索驱动的环化涉及外显子跳跃事件和内含子从去分支过程中逃逸，而直接反向剪接环化涉及顺式元件介导和反式因子介导的事件。外显子跳跃的RNA环化是指在内含子与外显子一起剪接后发生环化的过程。发表的研究表明，不同的断裂点位置有助于circRNA的多样性，不同类型的circRNA通过外显子、内含子、基因间区或非转录区的随机组合通过反向剪接生成。根据序列组合的差异，circRNA通常被分为四种主要类型：(1) 外显子circRNA只包含外显子，占所有已鉴定circRNA的80%以上，可以通过套索驱动的环化或直接反向剪接环化生成。两个相邻内含子之间的碱基配对，这些内含子包含反向互补序列，将下游5'ss和上游3'ss聚集在一起，促进反向剪接反应产生环状RNA。（图2A）；(2) 外显子-内含子circRNA，由外显子跳跃环化生成，包含核心外显子的非侧翼内含子序列，这些序列通常应该被剪接掉；因此，外显子-内含子circRNA被称为eiciRNA或保留内含子circRNA（图2B）；(3) 内含子circRNA也是由内含子从套索衍生的去分支机制中逃逸产生的，依赖于前mRNA的5'剪接位点附近的共识鸟嘌呤（G）和尿嘧啶（U）富集域以及断裂点附近的胞嘧啶（C）富集域。有趣的是，GU富集域可以保护C富集域免于分支或降解，从而生成稳定的circRNA或所谓的内含子衍生circRNA（图2C）；以及(4) tRNA内含子circRNA。对于tRNA内含子circRNA，前tRNA被tRNA剪接内切核酸酶（TSEN）复合体切割，切割产生的外显子和内含子被连接形成tRNA内含子circRNA（图2D）。 图 2: 体内和体外（人工）RNA环化方法。(A–D) 体内RNA环化方法：(A) 外显子环状RNA；(B) 外显子-内含子环状RNA；(C) 内含子环状RNA；(D) tRNA内含子环状RNA；(E, F) 体外（人工）RNA环化方法：(E) 化学合成；(F) T4 RNA连接酶连接；(G) 内含子自剪接。BrCN，溴化氰；EDC，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺；GOI，感兴趣的基因。 根据发表的研究，序列特征、蛋白质调节因子和转录阶段等因素可能影响反向剪接环化的效率。实际上，除了顺式元件，许多RNA结合蛋白（RBPs）被发现可以积极调节环状RNA的生物生成。较长的侧翼内含子元素包含几个互补或重复序列可能有助于提高环化效率。不同的剪接相关蛋白也对环化效率产生不同的影响。例如，作用于RNA的腺苷脱氨酶1（ADAR1）抑制RNA环化。 3.2.circRNA的生物学功能 根据几项研究，circRNA存在于不同物种的各种组织类型中，并具有多种生物学功能，如调节基因转录和蛋白质编码。circRNA还在调节生理学以及各种疾病的发生、进展和结果中发挥重要作用。 3.2.1.基因转录的调节 研究人员报告称，circRNA可以与宿主基因的DNA结合，形成称为R-环的DNA:RNA杂合体，影响DNA复制、转录和后损伤修复。例如，circSEP3（来自SEPALLATA3的外显子6）通过与cSMARCA5（来自SMARCA5的外显子15）形成R-环导致转录终止。circRHOT1招募Tat相互作用蛋白60 kDa（TIP60）到核受体亚家族2组F成员6（NR2F6）启动子，从而通过诱导原癌基因表达促进肝细胞癌的细胞增殖、迁移和侵袭。 3.2.2.“海绵”效应 自然circRNA对微小RNA（miRNAs）表现出“海绵”效应。例如，circHIPK3（来自homeodomain interacting protein kinase 3 (HIPK3)的外显子2）可以结合miR-124并抑制其活性，从而阻止miR-124抑制人类细胞增殖；circHIPK2通过靶向miR124-2HG调节星形胶质细胞的激活。研究表明，circRNA可能对蛋白质表现出海绵效应。Y-box结合蛋白-1（Ybx1）是许多基因的转录因子，其显著的过度表达与各种常见肿瘤的不良预后和复发有关。据研究人员称，circNfix可以结合Ybx1和E3泛素连接酶Nedd4l，促进它们的相互作用并诱导Ybx1降解。 3.2.3.通过复合物形成激活蛋白 许多类型的分子参与宿主生物体内的宿主-病毒相互作用的生物过程。先前的研究发现，在感染宿主细胞后，Epstein-Barr病毒（EBV）产生circRNA circBART2.2，该RNA可以被细胞的RIG-I受体识别。此后，发生RIG-I受体激活，通过随后激活下游的干扰素信号通路实现抗病毒效果。另一项研究发现，在N6-甲基腺苷（m6A）甲基化后，circRNA不被RIG-I受体识别，这是病毒逃避宿主免疫反应的机制之一。 3.2.4.蛋白质翻译 2015年，在果蝇中首次发现了circRNA编码和翻译蛋白质的能力。这一关键发现为后续circRNA疫苗的开发提供了理论基础。一些研究报告称，circRNA通过内部核糖体进入位点（IRES）介导或m6A诱导的核糖体结合位点（MIRES）介导的翻译启动，而不是5'帽子依赖的翻译启动，来翻译其编码的蛋白质。IRES是RNA元素，它们将核糖体招募到mRNA的内部区域以启动翻译，并且可以通过招募不同的反式作用因子来促进核糖体组装并启动翻译。IRES被许多类型的circRNA用于翻译，包括circMbl和circFGFR1。MIRES介导的翻译启动涉及RNA中一个或多个位点发生m6A甲基化，这使得eIF4G2的招募以启动翻译。例如，由人乳头瘤病毒（HPVs）编码并定位于细胞质中的circE7含有m6A修饰并执行E7致癌蛋白的翻译。另一项研究报告称，m6A修饰增强了IRES介导的circZNF609翻译效率。 3.3.circRNA降解 circRNA的稳定闭环结构使它们免受外切核酸酶的切割。因此，circRNA不容易通过常规RNA降解途径降解，并且短期内抵抗外切核酸酶RNase R的切割。它比线性RNA更稳定，这是circRNA疫苗开发的自然优势。然而，circRNA仍然可以通过某些方式降解，包括内切核酸酶。在先前的研究中，双链RNA（dsRNA）或多肌苷酸：多胞苷酸（poly (I:C)）被发现在体内激活内切核酸酶RNase L，导致circRNA的全局降解。ATP依赖的RNA解旋酶，上游框移1（UPF1），和内切核酸酶G3BP1可以识别具有复杂二级结构的circRNA并诱导其降解。circRNA可能经历m6A修饰，被m6A阅读蛋白HRSP12识别。因此，HRSP12可能与RNase P/MRP内切核酸酶复合体相互作用以诱导circRNA降解。值得注意的是，circRNA可以通过内切核酸酶RNase H通过特定引物和探针靶向降解。miR-671与circRNA CDR1as序列的互补结合也诱导AGO2介导的circRNA降解。 4.circRNA疫苗的研究进展 2015年之前，研究人员仅在生物体中观察到非编码蛋白质的circRNA的存在。2015年在果蝇中发现能够编码和翻译蛋白质的circRNA，为circRNA疫苗的研究和开发提供了理论基础。随着circRNA相关研究深度的不断增加，出现了三种人工制备circRNA的方法：(1) 化学合成：溴化氰（BrCN）或1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）诱导线性RNA的5'末端磷酸和3'末端羟基形成共价键以产生circRNA。在环化反应过程中发生副反应，如形成2'-5'磷酸二酯键，是这种方法的限制。此外，RNA寡核苷酸中的化学键通常不如DNA类似物中的化学键有效（图2E）；(2) T4 RNA连接酶连接：线性RNA分子可以通过T4 RNA连接酶的作用，将5'末端单磷酸与3'末端羟基形成共价键而环化。然而，环化反应只能在5'末端有一个磷酸的条件下发生。使用T7 RNA聚合酶体外合成的RNA含有5'三磷酸末端，因此在合成的线性RNA环化之前必须去除两个磷酸基团。目前，RNA 5'焦磷酸水解酶（RppH）用于直接去除b和g磷酸（图2F）；(3) 内含子自我剪接：I组和II组内含子可以执行RNase功能，使线性RNA分子自我剪接形成circRNA，无需其他酶的帮助（图2G）。 2015年，研究人员构建了一个包含分裂GFP的单外显子小基因，并发现前mRNA确实通过在人类和果蝇细胞中有效的反向剪接产生可翻译的circRNA。2018年，研究人员使用I组内含子剪接环化方法和IRES介导的翻译启动，合成了编码增强绿色荧光蛋白（EGFP）的circRNA。这种合成在293T细胞中成功表达了EGFP。令人惊讶的是，circRNA可以连续表达长达168小时，而自配方mRNA的表达仅持续48小时。目前报道的人工合成的表达蛋白质的circRNA主要通过内含子剪接或T4 RNA连接酶连接产生，两种环化方法的组成元素不同（图3）。 图3: 目前用于配制环状RNA疫苗的方法。(A) 通过内含子剪接环化；(B) T4 RNA连接酶连接。GOI，感兴趣的基因。 魏等人最近采用I组内含子剪接RNA环化方法和IRES介导的翻译启动，以及使用脂质纳米颗粒（LNPs）作为递送系统，开发了一种针对原始COVID-19毒株的circRNA疫苗。在分别用10 mg/动物和50 mg/动物剂量免疫的小鼠中，加强后5周的血清中和抗体滴度分别约为103和105，两种剂量均引发了相对较强的Th1免疫反应。在猴子接受两次剂量为100 mg/动物的疫苗后，使用原始病毒株进行挑战实验，发现免疫组在肺部病毒载量、肺损伤程度和肺部浸润性炎症细胞数量上显著减少。随后利用该技术平台生成了针对COVID-19 Delta变种的circRNA疫苗，该疫苗以10 mg/动物的剂量用于小鼠免疫。加强后7周，针对Delta变种的血清中和抗体滴度约为104，针对Omicron BA1变种的滴度约为103.5，从而证明了疫苗的广谱活性。配制的circRNA疫苗在4°C、25°C和37°C下也比线性mRNA疫苗更稳定。另一种使用T4 RNA连接酶方法制备的COVID-19 circRNA疫苗在小鼠中也显示出一定水平的免疫原性。 Seephetdee等人采用I组内含子剪接方法进行RNA环化，以原始COVID-19毒株的刺突（S）蛋白作为抗原结合构建，并包含多个突变（包括K417N、L452R、T478K、E484K、N501Y和D614G），配制了COVID-19 circRNA疫苗。在用5 mg/动物剂量接种两次疫苗的小鼠中，对Alpha、Beta、Delta和Omicron变种和假病毒表现出一定的中和活性，并在T细胞中引发了IFN-g反应。 王等人采用II组内含子剪接方法进行RNA环化，配制了COVID-19 circRNA疫苗。用于小鼠免疫时，该疫苗引发了强烈的RBD特异性记忆B细胞反应和平衡的Th1/Th2细胞免疫反应。用circRNA疫苗免疫的小鼠血清IgG滴度是线性mRNA疫苗免疫小鼠的10倍。此外，circRNA疫苗对假SARS-CoV-2表现出良好的中和活性，并有效阻断了三种受体结合域（RBD）突变体（野生型、Delta、Omicron）与293T细胞上的hACE2受体的结合。COVID-19 circRNA疫苗可以在细胞中连续表达6天，而自配方mRNA疫苗的表达仅持续2天。 使用T4 dt内含子剪接方法进行RNA环化会导致“剪接疤痕”序列的产生，不同序列长度导致不同的拓扑结构。研究发现，circRNA的组成元素和组成对翻译效率有影响，其中载体拓扑结构、非翻译区（UTR）和IRES起着最关键的作用。通过对不同剪接疤痕、5'UTR、3'UTR和IRES序列的实验比较，使用50 nt长的剪接疤痕序列和eIF4G招募适配体Apt-eIF4G序列作为5'UTR，全长HBA1序列作为3'UTR，以及野生型iCVB3序列作为IRES构建的circRNA在翻译效率上显著提高，并能在293T细胞中连续蛋白表达长达7天。相比之下，线性mRNA疫苗仅实现了3天的连续蛋白表达，且表达量低于circRNA疫苗。上述研究表明，circRNA疫苗不仅具有更强的免疫原性，而且比自配方线性mRNA疫苗的蛋白表达时间更长。因此，在低剂量下，circRNA疫苗可能引发更强的免疫反应。 circRNA疫苗通过IRES介导的翻译途径翻译成蛋白。与线性mRNA疫苗类似，circRNA疫苗也在体内翻译成蛋白以诱导强大的体液免疫和有效的细胞免疫，其中脂质体等可能在疫苗佐剂中发挥作用。一些研究表明，circRNA疫苗可以比线性mRNA疫苗更长时间地翻译成蛋白，甚至长达约7天。机制可能是circRNA的封闭特性理论上可以防止它们被通常从5'或3'端降解线性RNA的外切核酸酶降解。然而，目前还没有关于circRNA疫苗在体内如何降解的研究，它也可能通过microRNA介导的、m6A介导的、RNase L介导的或其他生物合成circRNA的降解途径进行降解。 与肽疫苗、灭活病毒疫苗和重组蛋白疫苗相比，circRNA疫苗可以有效诱导T细胞免疫。DNA疫苗必须进入细胞核才能转录成mRNA，这给身体带来一些风险，而circRNA疫苗则不需要。发表的研究表明，与线性mRNA疫苗相比，circRNA疫苗可以更长时间地翻译成蛋白，表明它具有更好的稳定性。 circRNA和线性mRNA疫苗之间有一些明显的区别。例如，circRNA和线性RNA在体内的降解方式不同。此外，circRNA疫苗主要使用IRES介导的翻译途径，而线性mRNA疫苗使用5'帽子（m7GpppN）结构介导的翻译途径。因此，circRNA和线性mRNA疫苗通过不同的转录启动复合体翻译成蛋白，涉及不同的启动因子。明显的不同是，circRNA疫苗不需要任何修饰，因为环形结构不易被外切核酸酶降解，而线性mRNA疫苗需要伪尿苷修饰、5'帽子结构和3'聚（A）结构。 5.circRNA疫苗生产工艺概述 目前，circRNA疫苗的工业化生产尚未成熟，大多数处于小规模研究阶段。可以参考线性mRNA疫苗的生产工艺。主要区别在于环化过程和相关杂质的去除。circRNA疫苗的工业化生产可能通过以下过程实现：(1) 以质粒为模板，通过体外转录合成线性RNA分子；(2) RNA环化；(3) 使用递送系统如脂质纳米颗粒（LNPs）进行疫苗封装。因此，获取高质量的质粒至关重要。质粒的工业化生产过程目前已接近成熟阶段，包括发酵、细菌收获、裂解、澄清、超滤和浓缩以及色谱纯化等步骤。在色谱纯化步骤中，添加不同类型的填料材料可以去除RNA、微量杂质和内毒素，以获得高纯度的超螺旋质粒。获得的质粒随后经过单一限制性内切核酸酶切割以实现线性化，并进行色谱以去除酶和盐。通过体外转录合成线性RNA分子。然后，使用DNase I去除反应产物中的DNA模板，并通过超滤纯化RNA产品。线性RNA分子随后进行环化，这是circRNA疫苗制备过程中的关键步骤。目前，内含子剪接法在工业化circRNA疫苗生产中作为环化方法最具前景，因为不需要添加酶。T4 RNA连接酶的连接也可以在工业化circRNA生产中使用；然而，在环化长度大于2000 bp的RNA分子时，其RNA环化效率显著降低。此外，还需要额外的步骤来去除T4 RNA连接酶。综合考虑各种因素，T4 RNA连接酶连接被认为在工业化生产中不适合RNA环化，而内含子剪接更为合适。环化反应的产物包括杂质，如线性RNA前体和剪接后的RNA序列。去除未成功环化的线性RNA前体分子是circRNA疫苗生产面临的难题，因为线性RNA前体和相应的circRNA分子之间的分子量相似。研究人员已报告使用色谱法从环化产物中去除线性RNA前体分子和其他杂质。在实验室规模生产阶段，可以尝试使用高效液相色谱（HPLC）或RNase R消化来去除线性RNA前体和其他杂质。然而，由于成本高昂，RNase R目前不适合用于大规模生产。随着RNA环化效率的提高，杂质含量减少，提高环化效率可能是简化纯化过程的可行方法。先前的研究表明，在最终浓度为50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2和1 mM DTT的缓冲溶液中进行环化时，可以有效地提高RNA环化效率，pH值为7.5。最后，circRNA被封装在递送系统中，如脂质纳米颗粒（LNPs），然后进行填充和封盖，形成最终的疫苗产品（图4）。值得注意的是，circRNA疫苗配方过程不需要添加5'帽子和3'聚（A）尾，或从反应产物中去除酶。 图 4: 环状RNA疫苗生产的流程图 6.circRNA疫苗质量控制的考虑 目前，已有两款COVID-19线性mRNA疫苗上市；然而，这些疫苗的质量控制过程相对成熟。世界卫生组织（WHO）发布了关于评估用于预防传染病的信使RNA疫苗质量、安全性和有效性的监管考虑的指导文件。此外，美国药典会议（USP）开发了mRNA疫苗质量分析程序，中国国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）发布了预防COVID-19 mRNA疫苗的药物研究技术指导原则（试行）。考虑到circRNA疫苗的特性，现有的mRNA疫苗、其他类型疫苗和核酸治疗剂的指导文件可能作为制定circRNA疫苗质量控制过程的参考（补充材料表1）。 circRNA依赖于IRES或m6A修饰进行翻译启动。由于其独特的闭环结构，circRNA对常规途径的降解有抵抗力，这消除了在circRNA疫苗配方中使用的RNA分子中5'帽子和3'聚（A）尾结构的需求。因此，circRNA疫苗不需要5'帽子和3'聚（A）尾相关的质量控制。 从环状RNA疫苗（circRNA vaccines）的独特特性中衍生出的核心质量属性（CQAs）相关的质量控制项目必须得到强调。环化率是环状RNA疫苗最重要的CQA，以往的研究中通过毛细管电泳（CE）和高效液相色谱（HPLC）进行测量。环状RNA序列的准确性也应该基于测序方法进行测量。然而，环状RNA疫苗的过程与线性mRNA疫苗不同，因为环状RNA在测序前需要内切酶切割以打开环。在RNA环化过程中，单链RNA（内含子序列）可能会脱落，一部分线性RNA前体最终可能保持未环化状态。研究人员已经报告了使用CE和HPLC来确定环状RNA疫苗纯度。如果采用T4 RNA连接酶进行环状RNA的制备，还必须对疫苗产品中残留的T4 RNA连接酶含量进行质量控制，这可以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行测量。当使用RNase R去除线性RNA前体分子时，也需要对残留的RNase R含量进行质量控制，这也可以通过ELISA进行测量。目前，特定的抗原-抗体结合方法，如ELISA，被采用来测量mRNA疫苗中残留的双链RNA（dsRNA）含量，主要使用的是抗dsRNA J2抗体。然而，旨在确定环状RNA是否可以直接结合抗dsRNA J2抗体或干扰抗dsRNA J2抗体与dsRNA结合的研究尚未报告。因此，在采用ELISA测量环状RNA疫苗中残留的dsRNA含量之前，必须进行样本适用性研究。 7. 环状RNA疫苗的展望 环状RNA疫苗可能成为应对未来新出现的大流行传染病或常见病毒疾病的有力工具，并可能发展成为肿瘤治疗疫苗。因此，全球的生物制药公司和研究团队已经将相当大的关注和研究努力转移到环状RNA疫苗的开发上。目前，由于研发、生产、质量控制和安全等方面的问题，环状RNA的研究仍处于临床前阶段。最近，研究人员提出了一个数字设计（QbDD）的质量蓝图，以支持快速的RNA疫苗工艺开发、制造和供应。因此，QbDD概念应该被纳入环状RNA疫苗的开发、生产和质量控制中。新环状RNA疫苗相关方法的开发和验证应该基于美国药典（USP）最近发布的《分析程序生命周期》第<1220>章和国际药品技术要求协调会（ICH）发布的《分析程序验证》Q2和《分析程序开发》Q14草案指南中规定的特定要求，目前公众正在对此进行评论。此外，还需要分析目标概况（ATP）、风险分析和识别、CQAs的确认、实验设计、过程控制和使用中监测。 环状RNA疫苗各个方面的未来方向如下： 研发：线性mRNA疫苗表现出“自我佐剂”效应。这种效应的过量或不足都不利于诱导高水平的体液免疫和有效的细胞免疫。环状RNA可以激活RIG-I和PKR细胞信号传导途径，这也提供了一种自我佐剂效应。因此，设计和优化环状RNA疫苗以适当激活自我佐剂效应对于增强疫苗效果至关重要。RNA环化是环状RNA疫苗配方过程中的关键阶段，环化效率是疫苗生产能力的主要决定因素，高环化效率有利于后续的纯化过程。环状RNA疫苗的组成元素和组成的设计和优化，或开发新的RNA环化方法，是提高环化效率的有效途径。根据已发表的研究，过量的RNA序列长度会影响环化效率。因此，在设计和优化目标片段长度时，必须注意不要影响目标蛋白或RNA环化效率的免疫原性。环状RNA疫苗与mRNA疫苗不同，因为它们具有环状结构，不同的目标序列可能表现出不同的构象。环状RNA的这些特性可能影响RNA环化效率，需要在研发阶段进行充分探索。内含子序列在RNA环化反应中起着关键作用。因此，内含子序列的优化是疫苗开发阶段的必要步骤。外显子长度影响I型内含子自剪接的环化效率，这也需要在疫苗开发过程中优化外显子序列长度。选择有效的IRES结构元件非常重要，因为它是环状RNA疫苗蛋白质翻译的主要决定因素。最近，据报道，DeepCIP作为世界上第一个环状RNA IRES预测工具，可以预测更适合环状RNA的IRES，以便环状RNA能够适应不同的场景，如疫苗和抗癌治疗。环状RNA需要传递系统进行封装以形成疫苗。LNP目前是环状RNA的主要传递系统。开发靶向LNP可能有助于增强疫苗保护效果。或者，研究工作可以致力于开发新的、更有效的传递系统以替代LNP。例如，一些早期研究已经探索了使用外泌体和铁蛋白作为传递系统。 生产：可以尝试优化反应条件以实现增强的环化效率。在实验室条件下，使用环化的RNA重新执行环化步骤有助于提高环化效率。因此，可以尝试开发再环化过程，并将该过程纳入疫苗生产。环状RNA与相应的线性RNA前体分子在分子量上的相似性为从疫苗产品中清除线性RNA前体带来了困难。目前，主要采用色谱法进行纯化；然而，缺乏报告说明其纯化效果是否足以满足生产需求。 质量控制：如前所述，环状RNA与相应的线性RNA前体分子的分子量相似。因此，在CE或HPLC确定RNA环化率时，这两种类型的RNA分子表现出接近的峰出现时间。因此，很难有效地区分两者。应进一步优化实验条件以满足测量要求。未来可能还需要国家和区域性的dsRNA参考标准，参考标准制备过程中应综合考虑dsRNA碱基序列、序列长度、5'-末端的磷酸基团数量和碱基修饰等因素。 安全性：生物体内含有大量的环状RNA，它们在调节基因转录、表达和细胞信号传导途径中发挥重要作用，某些环状RNA能够表达蛋白质。外源性环状RNA是否干扰体内自然发生的环状RNA的生物学功能尚不清楚。残留的线性RNA前体分子可能会因激活过度的先天免疫反应而引起更强的不良反应。环状RNA疫苗含有残留的dsRNA含量。由于接种mRNA疫苗后发生的心肌炎与疫苗中的dsRNA残留有关，需要进一步研究以确定环状RNA疫苗是否可能引起心肌炎。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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