PKR

导读：在真核生物中，环状RNA(circRNA) 是通过反向剪接产生的，当内含子 5' 端的供体剪切位点和上游内含子 3' 的受体剪切位点进入同一个剪接小体并发生加工处理时，就会发生反向剪接。 基于排列内含子-外显子（PIE）技术，体外转录(IVT)形成的常规线性mRNA可环化形成circRNA。CircRNA无游离末端，是改善mRNA稳定性的有效方案。目前，基于IVT和PIE环化制备circRNA正逐渐开发用于疫苗、蛋白替代疗法、CAR-T等领域。 环化效率是circRNA疫苗/药物的关键质量属性。本期文章菌菌将分享circRNA PIE成环效率的影响因素分析，主要参考内容为美国国立卫生研究院（NIH）国家癌症研究所Jason W. Rausch团队2021年发表在Nucleic Acids Res的文章：Characterizing and circumventing sequence restrictions for synthesis of circular RNA in vitro。 01 PIE法生成circRNA的机制 I型内含子具有自我剪接活性，通过两次连续的转酯反应会生成一个环化的内含子副产物。1992年，Michael D.Been将具有自我剪接活性的I型内含子-外显子序列重新排列（PIE）—E1/E2外显子端对端融合在一起，将内含子序列从中间打断。在体外剪接反应中，添加的外源鸟苷酸的3’OH会进攻内含子5’末端剪切位点的磷酸二酯键，使得E1末端核苷酸暴露出游离3’OH，从而进攻内含子3’末端剪切位点处的磷酸二酯键，最终使得E1-E2两个外显子序列环化。然而，这种最初的PIE环化策略只适合较短的RNA自我环化，例如，100nt外显子序列或者适配体。对于较长的RNA序列来说，两个剪接位点就会变得很难靠近，从而使得自我环化效率极大地减弱。 2018年，Daniel G. Aderson引入同源臂和间隔序列优化了基于T4噬菌体胸苷酸合成酶和鱼腥藻(Anabaena) pre-tRNA(亮氨酸) I型内含子的PIE环化方法，成功环化表达蛋白的长RNA。在前体RNA 5’和3’端安插同源臂，使得5‘/3’剪接位点彼此靠近，提升自剪接效率。加入间隔序列将3’剪接位点与IRES分离开来，使得I型内含子可完成正确折叠。在靠近间隔序列的位置引入同源臂还可促进剪接泡的形成，从而使得剪接效率得到更进一步的提升。自我环化反应在IVT反应进行中便可完成，但是，在某些情况下还是需要额外的重新环化反应（加入2mM GTP，55℃条件下反应15min）。值得关注的是，相比T4噬菌体胸苷酸合成酶内含子，基于鱼腥藻pre-tRNA(亮氨酸) I型内含子在环化反应中产生的nicked circRNA会减少37%。 02 E1/E2疤痕的天然免疫反应 PKR 是一种 IFN 诱导的 Ser/Thr 蛋白激酶，可被长 dsRNA 直接激活 （>33 bp，其中 79 bp 达到最大激活），并在对 dsRNA 的先天免疫反应中起核心作用，而长度为 16-33 bp 的短 dsRNA 可以结合 PKR 单体并在体外阻断激活。细胞中的许多 circRNA 倾向于形成 16-26 bp 的不完美 dsRNA 区域，这些区域作为一个基团会抑制先天免疫 dsRNA 受体 PKR 的激活。2022年，陈玲玲发现基于T4噬菌体胸苷酸合成酶和鱼腥藻pre-tRNA(亮氨酸) I型内含子产生的circRNA序列中会残存由E1+E2+间隔序列组成的74nt（T4噬菌体胸苷酸合成酶外显子序列）或者186nt（鱼腥藻pre-tRNA(亮氨酸) 外显子序列）无关序列。这些无关序列倾向于形成额外的、更长的茎环区域 ，扭曲原始circRNA的折叠状态，从而触发强烈的先天免疫反应。 E1、E2 和IG 之间的碱基配对是I型内含子的一个高度保守的结构特征，有助于建立和维持自剪接催化活性中心，决定3’/5’剪接位，同时促进酯交换反应之间的过渡。另外一方面，残留在circRNA序列上的E1/E2序列会跟临近的Loop环或者间隔序列发生相互作用，形成稳定的分子内双链结构，改变原有circRNA结构，触发不想要的天然免疫反应。 03 E1/E2序列影响cicrRNA环化反应 为解决PIE环化策略引入外显子残余序列的弊端，2021年，Stuart F. J. Le Grice等人在Nucleic Acids Research发表文章：Characterizing and circumventing sequence restrictions for synthesis of circular RNA in vitro，他们使用连续诱变和体外筛选来确定胸苷酸合酶 （td） I 型含子 PIE 转录模板构建体中 E1 和 E2 序列的变化如何影响 circRNA 合成产量，为设计定制PIE转录模板给出了指导性依据。 通常用于体外 circRNA 合成的 PIE 转录模板采用来自 T4 噬菌体胸苷酸合酶基因的或者鱼腥藻pre-tRNA （亮氨酸） 的 I 组内含子序列。T4 噬菌体胸苷酸合酶（td）mRNA 具有一些局部结构—一个富含 A：U 的短茎，两侧有一个 8-nt 内环，然而，类似所有tRNA，Anabaena tRNA （Leu）结构非常稳定，经常被作为末端支架来提升RNA转录本的稳定性。Anabaena tRNA （Leu）内含子剪接活性对于两侧外显子序列的强烈依赖性使其并不适合开发为作为广泛适用的PIE构建体，因此，研究人员选择T4 噬菌体胸苷酸合酶（td）内含子作为PIE构建体来研究E1 和 E2 序列的变化对于circRNA环化效率的影响。 04 无疤痕PIE序列的开发 circPVT1 是一种 410-nt 的人 circRNA，可隔离 let-7 miRNA，促进细胞增殖，同时抑制衰老 。circPVT1 在天然环境中是通过跨 PVT1 基因外显子的反向剪接产生的。如果将未修饰的PVT1 外显子序列直接插入T4 td PIE 构建体，这种模板产生的 circRNA 将包含无关的源自T4 td 的 E1-E2 序列，因此与天然 circPVT1 的序列将不是完美匹配的。如果从T4 td PIE 构建体中去除 E1 和 E2，用源自PVT1 的外显子序列去替换，那么PVT1 外显子的末端核苷酸将无法与 T4 td I 型内含子的 IG 序列正确杂交，对于环化反应造成严重的损害。 那么，如何构建T4 td PIE 才能使得其环化生成的circPVT1不残留源自T4 td的 E1 和 E2无关序列呢？研究人员搜索PVT1 外显子中与 T4 td E1-E2 相互匹配的序列，确定nt324-331 组成的 PVT1 外显子序列片段几乎完美地匹配 E1-E2，即 nt 324-329 与 E1 相同，而 nt 330-331 匹配 E2 的两个 5' 核苷酸。通过对PVT1 外显子序列的重排，研究人员成功构建了不含有T4 td E1-E2 残留序列的circPVT1。 05 E1/E2突变体对cicrRNA环化的影响 5.1 单点突变E1/E2序列 由于许多人类 circRNA 中并不包含与天然T4 td E1-E2序列紧密匹配的序列片段，因此重新排列环化RNA序列的方法无法普通应用。因此，研究人员想突变cSAA-PIE构建体中 E1 和 E2 序列，测试其对剪接活性的影响。cSAA（链霉素）适配体较小，并且二极结构是已知的，使我们能够更可靠地推断要环化的 RNA 的结构如何影响 PIE 的结构和功能。 当从 WT 构建体产生时，cSAA 以离散带的形式迁移，并领先于所有环化反应的前体和副产物。与WT 构建体生成的cSAA相比，分别突变天然T4 td E1序列中的6个核苷酸或者E2序列中的4个核苷酸，会对环化产量、主要产物组成及同质性产生极大的影响。有些核苷酸位点（E1：1C、E1：1G、E1：2A、E1：2G）的突变会降低产量，而有些核苷酸位点（E1：3 ）的突变可提升产量。 5.2 多点突变E1/E2序列 为更深入地表征环化反应对于 E1 和 E2 序列的依赖性需要对其序列中的核苷酸进行多点突变，由于E1序列和E2序列分别存在 4096 和256 种序列排列组合，因此，显然无法挨个单独构建所有的突变体。研究人员采用Ultramer 寡核苷酸 （IDT） 组装了一个转录模板文库，其中 E1 或 E2 的序列片段是随机的。在转录反应完成后，对于所有E1-E2 连接的 circRNA产物进行测序，分析E1-E2序列核苷酸组成和占比。从含有6nt E1的circRNA 25,777 个reads中鉴定出 717 个不同的功能性 E1 序列。这些变体不仅占所有可能的 E1 序列的 18%，而且它们之间的代表性呈现出高度的偏离分布。10 个最常观察到的 E1 变体集合占比超过读取总数的 17%，而超过一半的选定变体只观察到一次或两次。具体来说，'G' 在 E1 位置 4 和 5 受到高度青睐，功能变体之间的集体加权比例分别为 79% 和 99%。这些观察结果强烈表明，这些核苷酸与 IG 中的“CC”基序配对对于维持 E1-IG 相互作用和 PIE 功能至关重要。E2 变体的选择分布也是偏斜的，但未达到 E1 观察到的程度。具体来说，在源自circRNA 的 99355 个读数中鉴定出 256 种可能的 E2 变体中的 249 种。 06 代偿性突变IG序列降低circRNA产量 E1 和 E2 筛选实验中鉴定的 10 个最具代表性的变体中，没有一个与相应的 WT 序列完全匹配。研究人员选择了3个最具代表性的E1变体，并且突变IG序列，使E1变体/IG序列配对。令人大感意外的是，提升E1 变体与IG序列之间的配对反而使得circRNA产量显著减少。 单突变和体外选择实验都表明，E1 第 4 位和第 5 位的“G”与 IG 中的“C”之间的碱基配对对于内含子功能很重要。研究人员从E1体外筛选实验中（E1为随机片段，且以“GG” IG为背景）分析E1变体序列和核苷酸组成的占比，发现E1：4 和 E1：5 的强选择是针对“C”，而不是“G”。打断E1 第 4 位和第 5 位的“G”与 IG 中的“C”之间的碱基配对或者在IG序列引入代偿性突变以恢复E1变体与IG之间的完全配对均会使得circRNA产量持续性下降。 07 circRNA结构影响环化反应产量 由于 5' 和 3' 内含子的一半位于 PIE 构建体中的相对末端，因此功能性核酶的组装可能至少在某种程度上依赖于要环化的 RNA 的折叠。研究人员发现将基于T4噬菌体胸苷酸合成酶 I型内含子及天然E1/E2序列的PEI构建体产生的cSAA结构与T4噬菌体胸苷酸合成酶基因mRNA序列的天然结构尽可能匹配，这种序列上的改变会使得cSAA变体产量与野生型cSAA产量（circRNA产量仅达到5~10%，环化效率为25-50%）相比提升超过4.5倍，环化效率接近100%。这说明待环化的RNA结构也可能是circRNA产量的重要决定性因素。 08 总结 E1/E2序列与IGS引导序列之间会形成碱基互补配对，这对于维系内含子结构和剪接活性来说至关重要。尽管采用PIE环化策略可成功生成表达蛋白的circRNA，但是，circRNA中残存的E1/E2序列会引发强烈的天然免疫反应。 为解决此问题，研究人员采用T4噬菌体胸苷酸合成酶 I型内含子PIE构建体为模型，深度研究E1/E2序列对circRNA环化反应的影响。在待环化的RNA序列中搜寻与E1/E2序列完美匹配的片段，然后重新排列待环化的RNA序列，从而生成没有残存无关序列的circRNA。遗憾的是，并非所有的待环化的RNA序列均会出现与E1/E2序列完美匹配的片段，这就要求我们知道I型内含子的剪接活性对于E1/E2序列变化的耐受程度。采用单点突变和多点突变E1/E2序列，研究人员发现外显子序列核苷酸组成对于circRNA产量、产物类型、异质性存在非常显著的影响。此外，研究人员还发现代偿性突变ISG引导序列，恢复E1/E2序列与ISG之间的碱基互补配对并不会带来circRNA产量的增加。令人非常意外的是，待环化RNA折叠结构越接近I型内含子剪接而成的天然mRNA结构，circRNA产量会出现显著增加。 总结来说，I型内含子的E1/E2序列和待环化靶标RNA序列均会对剪接活性和环化反应造成显著影响。 参考文献  1.Group I permuted intron-exon (PIE) sequences self-splice to produce circular exons. 2.Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. 3.Characterizing and circumventing sequence restrictions for synthesis of circular RNA in vitro. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：基于mRNA的疫苗概念出现在三十年前。过去20年的开创性发现和技术进步解决了最初阻碍这种新型疫苗模式应用的主要障碍。快速开发的含核苷修饰的COVID-19 mRNA疫苗表明，这种免疫平台易于开发，具有可接受的安全性，并可大规模生产。抗原设计的灵活性和简便性使得mRNA疫苗进入了针对多种病毒以及各种细菌和寄生虫的开发。然而，我们知识上的空白限制了下一代mRNA疫苗的开发，这些疫苗具有增强的效力和安全性。对mRNA疫苗作用机制的更深入了解，应用新技术以实现合理的抗原设计，以及创新的疫苗递送策略和接种方案，可能会产生针对广泛病原体的强大新疫苗。 1.引言 疫苗在减少由各种病原体引起的发病率和死亡率方面产生了显著影响。在二十世纪下半叶，许多国家引入了全面的疫苗计划，这标志着与致命病原体斗争的转折点，几乎完全根除了几种严重的儿童疾病，并减轻了许多其他危险的病毒或细菌疾病。然而，一些目前许可的疫苗无法诱导出强大、广泛保护、持久的免疫反应，生产耗时且困难，或安全性配置亚优，凸显了改进的需求。此外，目前缺乏针对多种相关难以靶向的病原体的人类疫苗，例如人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）或丙型肝炎病毒，以及许多其他病毒和人类致病细菌、真菌和寄生虫，这些病原体合计每年在全球造成数百万人死亡。 mRNA疫苗是疫苗学领域的新来者。数十年的工作现在已解决了体外转录（IVT）mRNA的基本障碍，包括其高度炎症的特性以及安全高效体内递送和大规模生产的困难。关键进展包括在mRNA中引入修饰核苷，利用可电离脂质纳米颗粒（LNPs）进行mRNA递送，以及优化IVT反应，允许无细胞、快速、可扩展的mRNA疫苗生产。值得注意的是，这种疫苗平台比其他模式有几个关键优势。首先，抗原设计的灵活性（mRNA序列可以快速修改）使mRNA疫苗成为针对快速进化病原体（如流感病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2））的理想选择。其次，mRNA生产的简便性允许快速迭代筛选过程，以识别针对病原体的优化免疫原。第三，可以制作多组分（组合）mRNA疫苗，以针对单一病原体的几种不同抗原。例如，预临床流感病毒疫苗中包括了同一抗原的不同版本，以及双价许可的2019年冠状病毒病（COVID-19）疫苗，以及其他疫苗则用单一疫苗配方针对多种病原体。第四，mRNA疫苗可以在短时间内大规模生产，这对于季节性（例如，流感）疫苗或大流行情况非常理想。第五，mRNA疫苗是设计针对具有多个跨膜域的复杂蛋白的疫苗的理想平台。这些mRNA疫苗的一些关键特性使它们成为对COVID-19大流行有效响应的理想选择。事实上，Moderna和辉瑞-BioNTech迅速开发了含核苷修饰的mRNA-LNP疫苗，并在短时间内生产了数十亿剂。最重要的是，这两种配方在预防死亡和严重COVID-19方面都非常有效，并在全球SARS-CoV-2大流行期间挽救了数百万人的生命（方框1）。 过去10-15年，在疫苗研究方面取得了巨大进展，产生了新的免疫平台，对多种病原体的生物学有了更深的理解，对人类免疫学有了新的见解，对登革热、呼吸道合胞病毒（RSV）和疟疾（除了COVID-19）等疾病的新疫苗，以及重要的是，开发了新技术，使合理的抗原设计能够诱导出最佳的免疫反应。本综述概述了基于mRNA的疫苗平台，包括mRNA设计和递送技术的原则，评估了对mRNA疫苗作用机制的当前理解，并强调了新的临床前和临床传染病疫苗配方。讨论了mRNA疫苗研究中最重要的挑战、限制和机会，以及将mRNA平台技术与反向疫苗学结合起来，实现针对多种病原体的新型、安全有效的人类疫苗的潜力。 2.mRNA疫苗技术概述 大多数临床前和所有直接注射的临床mRNA疫苗有两个主要组成部分：编码抗原的mRNA和保护它免受RNases快速降解并促进大型、负电荷RNA分子细胞摄取的递送平台。mRNA疫苗的两个组成部分影响引起的免疫反应的质量和大小。 2.1.RNA格式和RNA设计原理 在过去25年中，几种RNA格式已在临床前和临床研究中开发和评估（图1）。非复制性（线性）mRNA，无论是否含有修饰核苷，以及自扩增mRNA（saRNA）是经过最广泛研究和改进的主要平台。其他新兴的RNA平台包括跨扩增mRNA和环状RNA（方框2）。 图1 | RNA疫苗平台。该图展示了目前正在使用或探索的用于疫苗接种的RNA格式。值得注意的是，环状RNA由内部核糖体进入位点（IRES）和编码抗原的区域定义。未翻译区域（UTRs）可以改善环状RNA，因此在图中显示。(A)n，聚(A)尾；m7G，7-甲基鸟嘌呤帽；nsP，非结构蛋白。 非复制性mRNA疫苗。非复制性（线性）IVT mRNA已在疫苗研究中测试了数十年，可以含或不含修饰核苷。未修饰的格式主要由CureVac AG开创，它在临床前研究中被证明是一种有效的传染病mRNA疫苗格式。然而，该平台在COVID-19 mRNA疫苗临床试验中的表现不如其含修饰核苷（N1-甲基假尿嘧啶）的对应物。未修饰的CureVac COVID-19疫苗（CVnCoV）性能不佳的一个潜在原因是，即使在相对较低的剂量（12.5微克）下，其在人体内也具有高度炎症性。这种未修饰mRNA的更高反应原性阻止了测试高剂量CVnCoV mRNA（如辉瑞-BioNTech（BNT162b2）和Moderna（mRNA-1273）配方中使用的30微克和100微克）的可能性，而12.5微克剂量在IIb-III期试验中未能诱导出足够强大的保护性免疫反应。在开创性研究中，2023年诺贝尔奖得主Karikó和Weissman证明，将某些修饰核苷引入mRNA序列可以增加IVT mRNA的蛋白产量，重要的是，减少其先天免疫感应。修饰核苷mRNA的这一特性使得BNT162b2和mRNA-1273能够在足够高的剂量下用于诱导对COVID-19的保护，同时将疫苗诱导的不良事件保持在可接受的水平。 IVT mRNA的关键考虑因素包括其半衰期、稳定性、可翻译性和炎症能力；这些特征影响mRNA疫苗的效力和安全性，可以通过优化mRNA的结构元素（5'帽，5'-非翻译区（UTR），编码区，3'-UTR，聚（A）尾）和/或使用适当的mRNA化学和生产程序进行微调。5'帽和聚（A）尾都有助于mRNA的稳定性，并在翻译启动中起关键作用。目前，cap1（m7GpppNm）是最广泛使用的修饰，可以共转录使用cap1类似物或转录后使用病毒封顶酶添加到IVT mRNA上。使用cap1而不是cap0（m7GpppN）通过克服干扰素诱导的蛋白四聚体重复序列1（IFIT1）引起的翻译抑制，增加了蛋白产量。哺乳动物或病毒序列的UTR也已包含多年，以增加mRNA的稳定性和翻译。最近，高通量报告基因测定和计算机引导的方法使得选择优化的UTR和密码子组成以提高mRNA稳定性和翻译成为可能。增加基因中的鸟嘌呤和胞嘧啶含量通常与更高水平的表达相关，但最近的发现揭示mRNA二级结构也是mRNA稳定性和可翻译性的关键预测因子。有趣的是，最具结构化的mRNA通常（但并非总是）具有最高的鸟嘌呤和胞嘧啶含量，密码子使用和二级结构通过增强IVT mRNA的溶液稳定性来明显调节其翻译能力。将某些修饰核苷，如假尿嘧啶或N1-甲基假尿嘧啶，引入IVT mRNA可以通过抑制替代残基的mRNA水解来增加溶液稳定性。N1-甲基假尿嘧啶替代促进了真核生物翻译启动因子2A（eIF2a）的磷酸化减少，从而增加了来自mRNA的蛋白产量。这些发现至少部分解释了为什么在早期研究中发现含有假尿嘧啶的IVT mRNA与其未修饰的对应物相比，蛋白产量增加。 减轻IVT mRNA的免疫激活能力是开发安全传染病疫苗的关键。这可以通过至少四种方法实现。首先，在mRNA序列中用假尿嘧啶或其衍生物N1-甲基假尿嘧啶替代尿嘧啶，减少了IVT mRNA的尿嘧啶依赖性免疫感应。其次，RNA聚合酶生成的短中止转录本可以在IVT mRNA制剂中形成强烈的免疫刺激性双链RNA（dsRNA），通过被多种传感器（例如，TLR3, OAS, PKR, RIG-I和MDA5）在各种细胞区域识别，诱导炎症和翻译阻断。因此，通过纯化或RNase III处理从IVT mRNA制剂中去除dsRNA污染物，进一步提高其可翻译性并减少炎症能力。开发一种在转录过程中产生较少dsRNA的RNA聚合酶，可能允许在“单罐”反应中生成IVT mRNA，简化疫苗生产。第三，cap0被细胞内RNA传感器RIG-I识别，诱导炎症反应。因此，使用含有甲基基团在第一个帽近端核苷上的5' cap1（在高阶真核生物中的“自我”标志）是减少IVT mRNA诱导的免疫识别的关键。第四，某些密码子优化策略增加了IVT mRNA内的dsRNA形成，因此可能增加了其被细胞dsRNA传感器的识别。尽管许多上述关于最佳IVT mRNA生产的考虑因素已在一系列体外和体内实验中进行了检查，但关于它们对疫苗免疫原性的临床前模型的影响的细节不足。 自扩增mRNA疫苗。使用IVT mRNA的saRNA疫苗已经研究了十多年。这种模式通常使用来自α病毒的序列，其中非结构蛋白（编码RNA依赖性RNA聚合酶的复制酶基因）是完整的，而结构蛋白被感兴趣的抗原所取代。与非复制性mRNA疫苗相比，saRNA疫苗有可能以较低的剂量给人类接种，以诱导保护性免疫反应，减少疫苗诱导的不良事件和成本。与非复制性mRNA类似，saRNA也包含5′帽、5′-UTR、编码区、3′-UTR和聚(A)尾（图1）；因此，这些元素的病毒骨架特异性优化可以产生改进的疫苗设计。在saRNA摄取后，病毒复制酶产生多个编码抗原的RNA副本，导致持续的抗原生产。在RNA自扩增过程中，通常会生成dsRNA中间体，这些中间体通过激活各种细胞RNA传感器（例如TLR3、OAS、PKR、RIG-I和MDA5）来引发强烈的免疫激活，特别是通过激活I型干扰素反应15。这种强烈的炎症反应有利于免疫细胞的激活，但限制了来自saRNA的蛋白生产并降低了耐受性。saRNA疫苗在临床前模型中显示出早期的希望，即使在低疫苗剂量下也能诱导出强大的抗体和T细胞反应。相反，它们在早期COVID-19疫苗试验中在人类中的表现并不好。然而，最近的一项临床研究报告称，与用作加强剂量的BNT162b2核苷修饰mRNA配方相比，ARCT-154（Arcturus）COVID-19 saRNA-LNP疫苗的非劣性，用于以前接种过任何两种批准的COVID-19 mRNA疫苗的个体。ARCT-154和BNT162b2诱导的不良事件是可比的。值得注意的是，与BNT162b2（30微克）相比，ARCT-154的使用剂量要低得多（5微克）。由于这些有希望的发现，ARCT-154在日本获得许可，成为第三种获得批准的基于mRNA的药物。 saRNAs由于兼容性问题，通常使用传统的未修饰核苷酸生产，但最近的一项开创性出版物报告称，将某些未修饰核苷酸完全替换为修饰核苷酸，可以产生具有增加的翻译能力和显著降低的炎症能力的功能性saRNAs。具体来说，含有5-羟甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-甲基尿嘧啶修饰的saRNAs在体外细胞转染效率方面优于其N1-甲基假尿嘧啶修饰的线性mRNA对应物。最重要的是，当以低剂量（10纳克RNA）使用时，含有5-甲基胞嘧啶的SARS-CoV-2 saRNA-LNP疫苗在小鼠中诱导出比N1-甲基假尿嘧啶修饰的线性mRNA-LNP疫苗更高的刺突抗原特异性IgG滴度和更高水平的保护。如果这些发现可以转化为人类，这可能为saRNA疫苗领域开辟新的道路。最近对saRNA疫苗的研究工作产生了创新的双组分载体系统，其中感兴趣的抗原和复制酶分别编码在不同的mRNAs上（图1）。分割载体系统是有利的，因为saRNA的长度可以减少，减轻RNA不稳定的问题，简化疫苗生产，并允许对双组分平台的两个组成部分进行单独优化。值得注意的是，与这种模式的成功使用相关的挑战是，两个RNA组分应该在同一细胞中存在，否则载体系统将无法工作。到目前为止，这两个组分的saRNA模式只在小鼠中进行了测试；因此，有必要在更高阶物种中进行研究。 2.2.mRNA疫苗的递送材料 mRNA疫苗递送的主题最近已经回顾了；因此，下面只讨论最关键的考虑因素和最新的发现。由于mRNA是一个大的、带负电荷的分子，它通过细胞膜的被动转移是一个低效的过程。早期的mRNA疫苗研究使用了物理方法（例如，基因枪和电穿孔）、精氨酸或聚合物复合mRNA，或者给药载有RNA的树突细胞来诱导保护性免疫。尽管这些方法在临床前研究中显示出一些希望，但它们在更高级的临床前和人类试验中并未显示出足够的效力和/或被证明是不切实际的。几十年来，永久带正电荷的脂质已被用于体外mRNA递送，但由于与带负电荷的血清蛋白的广泛相互作用，它们主要用于体内用途的次优选择；然而，这主要是在静脉注射纳米颗粒递送的背景下进行的，对于肌肉内给药的传染病mRNA疫苗可能具有有限的相关性。2010年代通过开发含有“可电离”脂质的LNPs解决了递送问题，它们通常由四个组成部分：磷脂质（辅助脂质）、胆固醇、聚乙二醇（PEG）缀合脂质和阳离子可电离氨基脂质（pKa通常为6.0-6.8），与封装的核酸一起，可以形成通常为50-150纳米的稳定颗粒。可电离脂质在生理pH下不带电荷，这使它们比永久带正电荷的替代品更安全。它们促进mRNA的细胞摄取，并通过在内体酸化后变得带正电荷来破坏内体膜，从而将核酸货物从内体释放到细胞质中。此外，它们为mRNA疫苗提供了强大的佐剂活性。mRNA-LNP疫苗的这种固有免疫刺激性活动允许在不添加进一步佐剂的情况下诱导出强大的保护性免疫反应。将可电离LNPs作为有效的核酸载体和强大的免疫佐剂的发现是偶然的和开创性的创新，它允许开发成功的COVID-19 mRNA疫苗mRNA-1273和BNT162b2。核苷修饰的mRNA-LNP疫苗平台的成功在于使用最少的免疫原性mRNA来最大化蛋白（抗原）生产，结合LNPs有效递送货物和促进强烈抗原特异性免疫反应的能力。 可电离LNPs的高度炎症性质可以被认为是一把双刃剑：虽然它对于诱导强烈的免疫反应至关重要，但它也可以限制它们可以如何被管理。通过鼻内疫苗管理来诱导粘膜免疫反应特别具有挑战性。然而，Moderna的一项研究最近证明了通过鼻内给药的SARS-CoV-2 mRNA-LNP疫苗在仓鼠中的效力，这表明优化可能会克服鼻内给药LNPs的低耐受性和安全性。尽管可电离LNPs是最先进的配方，但其他材料也用于实验性RNA疫苗中，可能会为给药途径提供更多的灵活性。一种新型纳米载体，称为脂质无机纳米颗粒（LION，一种阳离子油包水乳液），被优化用于saRNA的递送，然后在临床前和临床研究中用于mRNA疫苗开发（NCT04844268，NCT05132907）。 阳离子聚合物与mRNA形成复合物，可以通过目标细胞的内吞作用被摄取。早期研究使用聚乙二烯亚胺-saRNA复合物在小鼠中诱导针对流感病毒的免疫反应。由于聚乙二烯亚胺可能显示出高水平的毒性，它不是广泛使用的RNA递送材料。树状分子（超支化聚合物树状结构）也在针对埃博拉病毒、流感病毒、寨卡病毒（ZIKV）和弓形虫的临床前saRNA疫苗研究中显示出效力，但尚未报告使用该平台在大型动物或人类中的研究。 最近的一项开创性研究表明，阳离子可生物降解聚合物纳米颗粒（聚（胺-共-酯）(PACE)）可用于通过鼻内途径在啮齿动物中进行粘膜（肺部）免疫接种，以接种针对SARS-CoV-2 mRNA疫苗，以引发保护性免疫。优化含胺端基增强了mRNA从内吞颗粒中的内质网逃逸，PEG含量的修改进一步提高了PACE颗粒的mRNA传递。该平台证明了其安全性，因为在将PACE-mRNA传递给小鼠后，未发现肝脏酶水平升高或肺部有任何损害。最重要的是，作者证明了通过气管内传递的PACE-mRNA复合物被小鼠肺部的上皮细胞和抗原呈递细胞吸收，并表明他们的SARS-CoV-2 spike编码疫苗能在仓鼠中诱导保护性免疫。总体而言，新颖的PACE-mRNA平台对于引发粘膜免疫反应非常有价值，这对于限制呼吸道病原体的传播至关重要。大型动物研究和临床试验将很重要，以确认在啮齿动物中PACE-mRNA的令人印象深刻的发现是否能转化为更高阶物种。 3.mRNA疫苗的作用机制 从高层次上看，传染病mRNA疫苗的作用机制相当简单：编码一个或多个外来抗原的mRNA-LNPs（在大多数情况下）通过肌肉注射，被表达编码抗原的各种细胞类型吸收，然后被免疫系统识别并触发免疫反应。然而，许多关键问题仍然没有答案。哪些细胞正在表达抗原？它如何到达淋巴器官？先天免疫受体是如何被触发的？LNPs在mRNA疫苗接种后诱导免疫反应中的作用是什么？这些主题已经在27中广泛讨论；因此，下面将简要总结最关键的发现。 3.1.抗原表达和运输的位置 在肌肉注射mRNA-LNPs后，可以在脾脏、淋巴结和血浆中发现编码抗原的mRNA，如在非人类灵长类动物（NHPs）和人类的临床前模型中所示。mRNA在体内持续数天或更长时间，这取决于剂量和LNP的类型。更重要的是，肌肉注射的mRNA-LNPs的蛋白表达发生在注射部位，但血浆（血液）、肝脏中也检测到一些蛋白，可能还有其他器官，包括二级淋巴器官。在NHPs中进行的研究发现，许多浸润的免疫细胞以及成纤维细胞和脂肪细胞在注射部位翻译蛋白。虽然一些研究报告了mRNA-LNP的摄取和蛋白在肌细胞中的表达，但其他研究显示肌细胞没有参与。早期使用saRNA的研究表明，肌细胞是表达和呈递抗原的主要细胞类型。观察到的差异可能是由于LNP配方、细胞分析协议或mRNA平台（非复制mRNA与saRNA）的差异（图2）。根据这些主要在NHPs中进行的研究，很可能是表达疫苗抗原的巨噬细胞和单核细胞迁移到引流淋巴结（dLN）以向适应性免疫细胞呈递抗原；然而，也有可能是其他情况。使用saRNA疫苗的小鼠研究报告称，来自骨髓的浸润性抗原呈递细胞，包括树突状细胞，可能从转染的肌细胞中获取抗原，然后将其呈递给适应性免疫细胞，包括CD8+ T细胞。同样非常可能的是，LNPs可以通过淋巴系统通过被动运输到达dLNs（图2）。在NHPs中，可以在巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞以及组织细胞、网状细胞和内皮细胞中检测到mRNA或抗原，无论是通过肌肉注射还是皮内免疫。在NHPs的dLN中的B细胞和T细胞中也观察到mRNA或抗原的存在，但水平较低。在人类中，mRNA和/或抗原有效地运输到淋巴结并启动长达数月的生发中心反应。 抗原表达的位置高度相关，因为它可能直接影响适应性免疫反应。例如，在SARS-CoV-2血清阳性的个体中，即使这种反应并不强烈，也在肌肉注射COVID-19 mRNA疫苗后观察到上呼吸道诱导粘膜分泌IgA87。人们认为，只有在粘膜表面局部存在抗原时，才能诱导这种反应。可能是少量的mRNA和/或抗原通过血液运输到上呼吸道表面，正如在血浆中存在编码抗原的mRNA的研究支持的那样。 图2 | 肌肉注射后mRNA-LNP疫苗的转运。a. mRNA和由mRNA表达的抗原被渗透的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、成纤维细胞和邻近的脂肪细胞以及内皮细胞吸收。肌肉注射mRNA疫苗后肌细胞吸收mRNA或表达抗原的程度尚不完全清楚。b. 抗原（可能通过迁移的巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞）和mRNA-脂质纳米颗粒（LNPs）随后被运输到淋巴结，在淋巴结中巨噬细胞、单核细胞、组织细胞、不同的树突状细胞亚群和与皮质窦、髓窦、副皮质窦和 trabeculae 相关的内皮细胞表达抗原。引流淋巴结中的B细胞和T细胞也表达低水平的抗原（未描绘）。尽管大多数疫苗抗原和/或mRNA在免疫后几天内变得不可检测，但在超过1个月的时间内可以在生发中心检测到疫苗mRNA，并且生发中心反应可以在人类中维持数月。暂时地，mRNA也可以在血浆、肝脏、脾脏中找到，并且根据LNP配方可能在其他地方找到。该图基于非人灵长类动物和人类的发现。 3.2.mRNA和LNP的先天感应 疫苗成分的先天免疫信号是启动强大的适应性免疫反应所必需的。然而，非常强大的免疫激活（特别是I型干扰素的产生）可能是有害的，因为它可以关闭mRNA的抗原表达并引起副作用。如上所述，未修饰和未纯化的IVT mRNA可以激活许多免疫传感器，但用N1-甲基假尿嘧啶修饰mRNA并纯化以去除dsRNA显著降低了mRNA感应。 除了编码抗原的mRNA外，LNP载体的组成部分，特别是离子化脂质，也触发先天免疫反应。研究表明，含有重组蛋白的空的、可电离的LNP比与重组蛋白一起使用的商业MF59样佐剂具有更强的佐剂活性，并且这种佐剂活性高度依赖于可电离的脂质。在另一项研究中，用含有可电离脂质SM-102和核苷修饰的mRNA处理的人外周血单核细胞产生了许多炎症细胞因子，包括IL-1β、IL-6、TNF、CCL5、VEGFA和G-CSF62。IL-1β特别值得关注，因为它是宿主防御反应对感染或损伤的关键介质，其释放意味着炎症体的形成。尽管还不完全了解LNP中的脂质如何触发先天免疫激活，但一个新兴的假设是内质网膜的破坏可能起作用。内质网逃逸是mRNA进入细胞质的重要步骤，并由LNP中的脂质促进。然而，最近，这种内质网损伤也被证明可以直接通过galectin识别和结合触发炎症。抑制galectins或使用更可生物降解的可电离脂质结构可能为未来减少免疫激活提供策略。 在小鼠中评估BNT162b2发现它通过激活dLN中的自然杀伤细胞和CD8+ T细胞触发干扰素反应，并且根据敲除小鼠研究，这种反应依赖于MDA5信号。由于RIG-I和MDA5都通过线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）信号传导，这一发现与报道的mRNA-LNPs的MAVS独立免疫激活形成对比。在人类中进行的一项开创性研究评估了对BNT162b2的先天免疫反应，发现先天免疫被强烈激活，包括强大的抗病毒签名，具体来说，是I型干扰素反应和RIG-I样信号的上调。在人类中诱导干扰素途径与这些疫苗的观察到的反应原性一致，认为这是由干扰素反应触发的。这些研究的部分不同发现可能反映了疫苗制剂（mRNA设计和生产，不同的LNPs）之间的差异以及小鼠模型和人类之间的免疫反应激活差异。 4.临床前和临床mRNA疫苗 由于COVID-19 mRNA疫苗的成功，近年来发表的关于mRNA疫苗的研究数量显著增加。不仅针对多种病毒，还针对某些细菌和寄生虫，包括蜱虫，其中一些已经进展到临床研究（表1）。下面总结了mRNA疫苗的最新临床前和临床工作。由于SARS-CoV-2 mRNA疫苗已经被广泛审查，这里将只突出COVID-19疫苗报告中具有高临床相关性的方面（方框1，下面讨论）。将集中讨论“主动”免疫工作，而mRNA编码单克隆抗体的最新发现总结在方框3和表2中。 4.1.流感病毒 季节性流感病毒疫苗通常显示出次优的保护水平；因此，基于mRNA的流感病毒疫苗受到了显著关注。与广泛使用的鸡蛋生产疫苗相比，mRNA-LNP平台技术有两个重要优势。首先，基于mRNA的季节性流感病毒疫苗可以快速设计和大规模生产。与基于鸡蛋的疫苗不同，在mRNA疫苗生产过程中没有引入不需要的突变的风险。此外，制造的便利性和大规模生产在大流行情景中可能是至关重要的。多价mRNA疫苗（针对多个抗原）可以诱导广泛的免疫。早期流感mRNA疫苗研究，通常使用单一抗原作为疫苗目标，展示了令人信服的临床前发现。在过去的5年中，下一代流感病毒mRNA疫苗已经使用了合理设计的抗原和/或多个抗原来增加保护性免疫反应的广度，并且，重要的是，临床试验的结果已经发表。Moderna在2015年开始了第一阶段的试验，使用单价核苷修饰的mRNA-LNP疫苗，编码H10N8和H7N9流感病毒的血凝素。当以50 µg或100 µg剂量肌肉注射时，这些疫苗具有适度的免疫原性和良好的耐受性，但抗体滴度相当快地下降。Moderna和其他公司在过去几年中也开始了临床试验——也使用了多价方法——一些发现最近已经公开。例如，在一项I-II期试验中，肌肉注射单剂量的mRNA-1010，一种四价季节性mRNA-LNP疫苗候选物，编码四种全长血凝素（世卫组织推荐用于2020-2021年流感季节的流感疫苗），在所有测试剂量（20 µg、50 µg和100 µg）下，针对疫苗匹配的流感A型病毒株诱导了更高的血凝素抑制（HAI）滴度，与灭活的季节性流感疫苗相比，针对流感B型病毒株的滴度相当。有趣的是，mRNA-1010的III期试验的中期结果不那么令人鼓舞；mRNA疫苗比季节性流感病毒疫苗诱导了更多的不良事件（分别为70%和48%），并且针对流感A型病毒显示出类似的免疫原性，针对流感B型病毒株的免疫原性较差。这些结果表明，可能需要改进的mRNA平台技术或合理设计的免疫原，以诱导优于当前许可的流感病毒疫苗所诱导的免疫。此外，添加其他抗原，如神经氨酸酶，可能有助于增加所诱导免疫的效力和广度。神经氨酸酶免疫原包含在mRNA-1020和mRNA-1030（Moderna）中，以及正在人类试验中测试的其他几种mRNA疫苗中（表1）。最后，值得一提的是，mRNA-LNP疫苗试验（例如，NCT05375838、NCT05596734、NCT05585632），使用联合配方，不仅针对流感病毒，还针对SARS-CoV-2和RSV，正在进行中，并且在人类中显示出前景（表1）。 4.2.呼吸道合胞病毒 RSV在婴儿、幼儿、老年人和免疫受损个体中引起严重的呼吸道疾病。RSV疫苗开发面临的一个主要障碍是未能诱导针对RSV融合（F）糖蛋白的强大中和抗体（nAbs），该蛋白介导病毒和目标细胞膜的融合。随着对RSV F的原子结构、构象变化和免疫原性的更好理解，可以合理设计针对F的预融合构象的抗原，并诱导强大的nAb反应。基于预融合F蛋白的疫苗针对老年人和孕妇（以保护新生儿）已于2023年获得FDA批准。Moderna在临床开发中有几种RSV mRNA-LNP疫苗候选物，并且一些结果已经发表。在成功地对mRNA-1777（参考文献103）进行临床前评估后，这是一种预融合稳定的RSV F编码的核苷修饰的mRNA-LNP疫苗，它在I期临床研究中进行了评估。疫苗在所有疫苗剂量（18-49岁成人25-200 µg和60-79岁成人25-300 µg）后单次肌肉注射耐受性良好，并以剂量依赖性方式诱导针对RSV A型和B型nAbs。此外，mRNA-1777诱发了可测量的抗原特异性CD4+ T细胞反应。一种改进版本称为mRNA-1345在一项大型III期试验中进行了测试，有35,541名60岁及以上的参与者。总体而言，疫苗在单剂量50 µg mRNA-LNP后耐受性良好，并对至少有两个症状的RSV相关下呼吸道疾病显示出83.7%的效力，对至少有三个症状的疾病显示出82.4%的效力。其对RSV相关急性呼吸道疾病的效力为68.4%。重要的是，mRNA-1345（以mRESVIA的名义）最近获得了FDA的批准，成为Moderna第二个获批的产品。该疫苗目前正在5-24个月大的儿童（NCT05743881）和12-59个月大的RSV血清阳性儿童（NCT04528719）中进行I期试验。 4.3.其他呼吸道病毒 人类偏肺病毒（hMPV）和副流感病毒（PIV）都会引起呼吸道疾病，主要影响婴儿、幼儿、老年人和免疫受损个体，目前没有获得许可的疫苗。Moderna开发了一种双价疫苗候选物mRNA-1653，编码hMPV和PIV3的全长膜结合融合蛋白。在I期研究（NCT03392389）中，两次肌肉免疫接种（间隔4周）使用相对较高的疫苗剂量（75 µg、150 µg和300 µg）针对两种疫苗目标诱导了强大的中和抗体（nAb）反应107。有趣的是，在给予更高疫苗剂量后检测到类似的nAb滴度，但不良事件是剂量依赖性的。在大多数初次加强剂量组中，针对hMPV A和B的nAb滴度在首次疫苗剂量给药后13个月仍高于基线，而针对PIV3的这种情况仅在300 µg组中观察到。还进行了另一项试验mRNA-1653（NCT04144348），包括12-59个月大的成人和儿童，但结果尚未发表。 总体而言，mRNA-LNP平台可以成功用于针对呼吸道病毒，因为这样的疫苗可以快速开发和生产，并且基于显著的临床经验（表1）——它们通常耐受性良好，可以诱导强大的nAb反应，并且可以根据需要调整以针对快速变化的病毒。然而，需要克服一些限制，例如人类中缺乏足够的抗体持久性或保护性粘膜免疫。 4.4.人类免疫缺陷病毒1 HIV-1感染影响着数千万人口，每年约有150万新感染者登记。HIV-1是最具有挑战性的疫苗目标之一，因为它的遗传多样性、复杂的免疫逃避机制和包膜（Env）糖蛋白的免疫原性差，这是抗HIV-1 nAbs的唯一靶标。因此，即使在40年的积极研究之后，也没有HIV-1疫苗可供人类使用。最近使用mRNA-LNP编码的合理设计的免疫原在各种动物模型中发表的研究显示出一些希望。这些报告证明了在小鼠中使用镶嵌免疫原诱导针对HIV-1蛋白质组保守区域的多功能T细胞反应，在使用saRNA编码的纳米粒子免疫原的转基因小鼠中诱导体细胞超突变到广泛中和抗体谱系，以及在NHPs中使用各种工程Env mRNA-LNPs产生多功能抗体。此外，在转基因小鼠模型中的研究表明，铁蛋白纳米粒子mRNA-LNP疫苗可以诱导具有中和异质HIV-1分离株能力的抗体，并且针对mRNA-LNP编码免疫原的种系抗体成功地启动了广泛中和抗体前体。一项开创性的NHP研究表明，一种共同表达膜结合Env和猴免疫缺陷病毒gag蛋白、产生类似病毒颗粒的mRNA-LNP疫苗，刺激了针对二级异质猴-人类免疫缺陷病毒的nAbs。 总体而言，使用合理设计的免疫原的有前景的临床前发现为临床发展铺平了道路。事实上，Moderna正在进行的I期临床研究（NCT05001373）评估上述纳米粒子免疫原（mRNA-1644）编码为mRNA-LNP以及第二个纳米粒子构建物mRNA-1644v2-Core。第二项试验（NCT05217641）使用mRNA编码（mRNA-1574）合理设计的Env三聚体在健康个体中（表1），美国国立卫生研究院还开始了一项I期研究（NCT05903339）利用mRNA编码的基于铁蛋白纳米粒子的免疫原。 4.5.黄病毒 黄病毒代表了一个多样的家族，主要是通过节肢动物传播的病原体，具有显著的流行潜力。已经开发了针对某些类型的黄病毒的许可疫苗，如日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、黄热病毒和登革热病毒（DENV），使用的是活减毒病毒、化学灭活病毒或病毒载体。人类还需要开发针对其他可能在人类群体中迅速传播的黄病毒成员的疫苗。新疫苗需要解决现有疫苗的一些缺点，如保护性免疫的广度不足（DENV）或可能引起不良事件的潜力，如抗体依赖性增强。能够诱导针对多种黄病毒的保护性免疫的多组分疫苗也将非常理想。疫苗的持久性也很关键，因为nAb水平的下降可能会增强疾病。有趣的是，2017年发表的首次突破性研究（使用核苷修饰的mRNA-LNP疫苗）证明了该平台能够诱导小鼠和NHPs对ZIKV的保护性免疫反应。在随后的几年中，针对黄病毒抗原的mRNA或saRNA平台在针对一系列目标的临床前研究中显示出希望，如ZIKV、DENV、波瓦桑病毒和黄热病毒。Moderna开发了第一代和第二代ZIKV mRNA-LNP疫苗，分别称为mRNA-1325和mRNA-1893。两种疫苗都编码ZIKV的前膜和Env糖蛋白，它们只在编码序列中相差五个氨基酸，并使用不同的前导序列。mRNA-1893在1/20的剂量下诱发了与mRNA-1325相当的nAb滴度，可能由于mRNA-1893能够形成类似病毒颗粒，并且在NHPs中提供了完整的针对ZIKV挑战的保护。两种疫苗都在I期临床试验（NCT03014089和NCT04064905）中以引导增强设置（两次注射之间4周）在黄病毒血清阴性或血清阳性的健康个体中进行了测试。总的来说，这些试验的发现与其他I期安全性和免疫原性mRNA疫苗试验相似；疫苗在广泛的剂量范围（10-250 µg）内耐受性良好，并且在更高剂量和第二次免疫后发现更多的不良事件。虽然mRNA-1325诱导了较差的nAb反应，但mRNA-1893表现良好，所有剂量在黄病毒血清阴性和血清阳性个体中都诱导了长期存活的（>13个月的初次免疫后）nAb反应。 4.6.其他病毒 针对多种其他相关的人类致病病毒开发了mRNA疫苗候选物。几个RNA病毒家族的成员可以引起人类的病毒性出血热，如沙粒病毒、布尼亚病毒、丝状病毒和黄病毒，大多数这些病原体没有疫苗可用。虽然大多数出血热病毒（HFVs）被认为是被忽视的热带疾病，但所有这些病原体的公共卫生影响是显著的。像2014-2016年西非埃博拉病毒这样的大规模爆发，以及潜在的大流行，是主要关注的问题。由于这些病毒组中的一些潜在疫苗抗原（例如，布尼亚病毒糖蛋白）具有复杂的折叠，并且使用标准方法难以表达，mRNA平台非常适合针对这些病原体的疫苗开发。尽管针对最相关的埃博拉病毒之一，扎伊尔埃博拉病毒，有两种病毒载体疫苗可用，但对载体平台的安全性的担忧证明了使用替代技术开发新的埃博拉病毒疫苗的合理性。针对埃博拉病毒糖蛋白的自复制和非复制mRNA疫苗在啮齿动物中诱导了保护性免疫，这为将来在大型动物中，可能在人类中进行研究提供了理由。同样有希望的结果也在使用mRNA疫苗针对其他HFVs，如拉沙病毒、克里米亚-刚果HFV和严重发热伴血小板减少综合征病毒，在啮齿动物疫苗研究中获得。 针对具有大流行潜力的其他病毒，如尼帕病毒和猴痘病毒（MPXV），已开发了mRNA疫苗候选物。两项针对尼帕病毒的临床前研究——一项针对可溶性亨德拉病毒糖蛋白，另一项针对与尼帕病毒糖蛋白单体共价连接的预融合稳定融合蛋白——分别在叙利亚仓鼠和 mice 中证明了保护性免疫。后者的疫苗候选物（mRNA-1215）正在由Moderna在I期临床试验（NCT05398796）中进行测试。针对2022年病毒爆发，迅速生成并测试了针对MPXV的mRNA疫苗。Moderna开发了一种针对四种高度保守的MPXV表面蛋白（M1, A29, A35 和 B6）的疫苗候选物，这些蛋白参与病毒附着，并在 mice 中证明了对相关牛痘病毒（VACV）的感染保护。该公司已开始对其MPXV mRNA疫苗候选物mRNA-1769进行I期试验（NCT05995275）。采用类似方法——针对病毒融合蛋白——在 mice 中证明了对VACV挑战的保护性免疫。BioNTech还开发了MPXV疫苗候选物，四价BNT166a针对M1, A35, B6 和 H3，以及不含H3组分的三价疫苗BNT166c。这两种疫苗都保护了 mice 免受VACV、MPXV I型和IIb型感染，BNT166a保护了NHPs免受致命的I型MPXV感染。BNT166a已进入临床试验（NCT05988203）。 针对狂犬病病毒的许可疫苗，使用灭活病原体，已经挽救了过去几十年中无数的生命。然而，现有配方的限制包括生产成本相对较高以及在流行区域需要多次剂量。多个针对病毒糖蛋白的mRNA疫苗候选物在小型和大型动物中显示出希望。CureVac在其I期试验（NCT03713086）中测试了其未修饰的mRNA-LNP疫苗候选物CV7202，发现疫苗在人类中诱导了nAbs，但只有低疫苗剂量（1 µg和2 µg）在引导增强计划中被良好耐受。转向这种疫苗的核苷修饰版本可能会允许使用更高的疫苗剂量来增加诱导的免疫反应，而不会诱发更多的不良事件。 人巨细胞病毒（HCMV）会导致常见的先天性感染，在免疫受损个体中尤其危险。已经投入了大量精力开发针对HCMV的安全有效的疫苗。几个临床前mRNA疫苗候选物使用核苷修饰的mRNA-LNP来针对病毒融合糖蛋白B和/或五聚体复合物，这些复合物对于进入是必要的，并在 mice、兔子和NHPs 中诱导了nAbs和细胞免疫反应。Moderna在I期试验中测试了mRNA-1647（一种多价HCMV mRNA-LNP疫苗，针对糖蛋白B和五聚体复合物），在0、2和6个月时肌肉注射180 µg剂量，发现在两种血清阴性和血清阳性试验参与者中，HCMV特异性抗体反应多功能且持久，与对照组相比，糖蛋白B特异性IgG反应较低，但总体nAb和抗体依赖性细胞毒性反应更高，后者是MF59佐剂糖蛋白B蛋白疫苗。 针对生殖器疱疹——一种由单纯疱疹病毒类型1（HSV-1）和HSV-2引起的非常常见的性传播疾病——的核苷修饰的mRNA-LNP疫苗开发也已有报道。理想的抗HSV疫苗将预防痛苦的生殖器病变，并减少或消除病毒脱落，这会危及传播给伴侣和新生儿。一种针对进入分子糖蛋白gD2和两种免疫逃避分子，糖蛋白gC2和gE2的三价HSV-2 mRNA-LNP疫苗，保护了 mice 和豚鼠免于发展成生殖器病变，并减少了病毒脱落。在后续研究中，该疫苗保护了 mice 免受HSV-1生殖器病变和潜伏感染，并为新生 mice 提供了保护。该配方，名为BNT163，目前正在由BioNTech在I期剂量递增、免疫原性和安全性试验中进行测试（NCT05432583）。Moderna还在进行I期试验（NCT06033261），使用HSV-2 mRNA-LNP候选物mRNA-1608，作为肌肉注射的引导增强疫苗。其他几个针对重要人类病毒病原体的有前景的mRNA疫苗候选物正处于临床前或临床开发中，数据有限或没有公开发表，如针对乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、Epstein–Barr病毒（EBV）、水痘-带状疱疹病毒和诺如病毒的候选物。Moderna正在研究临床EBV疫苗候选物mRNA-1189（针对gp42、gp220、gH和gL糖蛋白，NCT05164094）和mRNA-1195（NCT05831111），以预防传染性单核细胞增多症和EBV感染罕见但有时危及生命的后果或长期后遗症，如多发性硬化症。Moderna还在I期试验（NCT05992935）中研究针对诺如病毒感染的mRNA疫苗mRNA-1403（三价）和mRNA-1405（五价）。最后，Moderna（mRNA-1468，针对糖蛋白E）和BioNTech–Pfizer（BNT167，针对糖蛋白E）都有针对水痘-带状疱疹病毒的临床候选疫苗，处于I期（NCT05701800和NCT05703607）。 4.7.细菌 鉴于许多人类病原细菌中抗微生物耐药性的上升，开发安全有效的细菌疫苗是有必要的。然而，与病毒相比，针对细菌的疫苗开发通常更具挑战性，因为潜在的疫苗目标数量众多（细菌基因组通常比病毒基因组大得多），非蛋白质疫苗目标（糖；mRNA疫苗不能用于针对碳水化合物）和高度抗原变异。此外，与病毒疫苗相比，细菌疫苗所需的疫苗诱导免疫反应通常在质量上有所不同。诱导nAbs通常足以保护免受病毒侵害，但细胞外细菌（例如，肺炎链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等）通过补体介导的杀伤和抗体介导的吞噬作用等免疫机制有效靶向。此外，虽然大多数病毒目标并非绝对需要，但诱导强大的CD8+ T细胞反应通常对于有效靶向细胞内细菌至关重要。 研究表明，mRNA疫苗可能适合针对细菌。通过鼻内递送的未修饰裸mRNA已用于诱导针对结核分枝杆菌（结核病）的免疫反应，该感染影响全球超过十亿人。目前可用的结核病疫苗，卡介苗，效果低，持久性差，经常引起不良事件；因此，生成更安全、更有效的结核病疫苗是一个未得到满足的临床需求。编码四种结核病抗原（esxV、RpfD、PPE60和Ag85B）融合蛋白的saRNA-脂质无机纳米颗粒平台在 mice 中展示了一定程度的针对M. tuberculosis感染的保护。saRNA平台也被用于开发针对A组和B组链球菌的临床前疫苗。 最近，一种核苷修饰的mRNA-LNP疫苗，编码经过工程改造的环状置换F1（cp-caf1）耶尔森氏菌抗原，被证明在小鼠中单剂量接种后能诱导强烈的体液反应和对致命瘟疫感染的保护。一种优雅的基于免疫肽组学的方法被应用于识别理想的疫苗靶点，并为单核细胞增生李斯特菌——一种食源性细胞内细菌开发mRNA疫苗。通过在mRNA-LNPs中编码高度呈现的抗原（从多种细菌蛋白中选择），在小鼠挑战研究中实现了对李斯特菌感染的强大CD8+ T细胞反应和保护性免疫。铜绿假单胞菌，一种具有多重耐药菌株的关键人类病原体，也是通气相关肺炎的重要原因，也已成为研究目标。一种包含融合蛋白膜孔F（OprF）-脂蛋白I（OprI）和V抗原（PcrV；铜绿假单胞菌类型I分泌系统的一部分）的mRNA-LNP疫苗，在系统感染小鼠模型中诱导了保护性免疫反应。此外，一种针对莱姆病（美国最常见的媒介传播疾病）的mRNA-LNP疫苗，使用伯氏疏螺旋体的外表面蛋白（OspA）作为疫苗靶点，证明了在小鼠中诱导强烈的细胞和体液免疫反应，并对细菌挑战提供保护。针对蜱唾液蛋白的mRNA-LNP疫苗，用于预防莱姆病等媒介传播疾病，也在啮齿动物中进行了研究。Moderna和BioNTech正在进行针对莱姆病和结核病的mRNA疫苗的临床试验。Moderna的mRNA-1975（七价配方）和mRNA-1982（单价疫苗），都针对OspA，正处于I-II期开发（NCT05975099）。BioNTech的BNT164a1和BNT164b1是处于I期试验（NCT05547464）的结核病疫苗候选物。 4.8.寄生虫 致病寄生虫是影响数亿人、每年造成超过100万人死亡的多样化的真核生物群体。然而，针对这些病原体的疫苗开发极其困难，主要是因为真核细胞作为疫苗靶点的复杂性，以及它们逃避先天和适应性灭菌免疫反应的能力。越来越多的临床前研究表明，mRNA疫苗能够提供针对寄生虫病的保护。例如，针对弓形虫——弓形虫病的致病因子，以及利什曼原虫——利什曼病的原生动物致病因子，开发了具有保护性的临床前mRNA疫苗。针对疟疾的mRNA疫苗候选物也已经产生并进入临床开发。 疟疾感染是世界主要的健康问题之一，每年造成数亿例临床病例和数十万人死亡。疟疾疫苗可以分为三类：针对孢子体或肝期寄生虫的红前期疫苗，针对滋养体或感染红细胞的血液期疫苗，以及针对配子体和蚊子期寄生虫的阻断传播疫苗。一种针对恶性疟原虫（PfCSP）的环孢子体蛋白（CSP）的佐剂蛋白基础红前期疟疾疫苗已被批准用于人类，尽管它显然提供了公共卫生利益，但仍有改进其有效性的余地。近年来，多项临床前研究为核苷修饰的mRNA疫苗能够引发对由P. falciparum和P. vivax引起的疟疾的保护提供了概念验证。疫苗抗原包括PfCSP、P. falciparum的谷氨酸富含蛋白（PfGARP），以及针对P. falciparum的P. falciparum ookinete表面（Pfs）25和230D1蛋白，分别针对红前期、血液期和传播期的P. falciparum病原体。重要的是，BioNTech在2022年开始了一种编码PfCSP的mRNA疫苗候选物BNT165b1的临床开发（NCT05581641）。 一种编码疟原虫巨噬细胞迁移抑制因子（PMIF）的saRNA疫苗，该因子调节宿主对疟疾的炎症反应，改善了对肝期和血液期疟原虫感染的控制，并在致命的小鼠模型中提供了对再感染的完全保护。在一项机制研究中，静脉注射α-半乳糖神经酰胺-佐剂脂质复合物基mRNA疫苗，编码核糖体蛋白L6（RPL6）疟疾抗原，诱导了肝驻留记忆T细胞，并在小鼠中提供了保护。 虽然P. falciparum疟疾比P. vivax疟疾造成更多死亡，但后者影响更多人（超过30亿人）在全球范围内，并且目前没有批准的疫苗。P. vivax疟疾也更难控制和消除，因为它的休眠肝期可以潜伏数月至数年，然后重新激活。最近的一项小鼠研究开发了使用Pvs25作为疫苗抗原的阻断传播疫苗，并证明了一种优化的全长Pvs25编码核苷修饰的mRNA-LNP疫苗候选物优于对照佐剂Pvs25蛋白疫苗，并激发了更强大和持久的功能性免疫。 总的来说，mRNA基础的疟疾疫苗领域取得了显著的进展，为这类疫苗在可预见的未来将可用于人类提供了希望。 5.挑战、限制和机遇 尽管核苷修饰的mRNA-LNP平台技术在COVID-19大流行期间被证明非常有效，并且是我们大流行病准备的重要部分，但当前一代mRNA疫苗的局限性需要克服，以进一步提高这种疫苗方式的价值。值得注意的是，这些挑战中的许多并不特定于mRNA疫苗，也适用于其他疫苗平台。 5.1.临床前模型的局限性 免疫原性。包括mRNA-LNP疫苗在内的疫苗开发的一个普遍问题是，临床前模型对人类免疫原性的预测价值次优。一个明显的例子是Moderna开发的H10流感病毒疫苗候选物。基于血凝素的H10疫苗在雪貂中诱导了非常高的HAI滴度，达到约1:3,000，这通常很难用传统疫苗平台诱导。同样的疫苗在人类中诱导了短暂的，大约1:100的HAI滴度，在6个月内消退。同样，基于mRNA-LNP的季节性流感病毒疫苗在不同的动物模型中诱导了非常高的中和抗体滴度，但似乎与常规季节性流感病毒疫苗（具有更好的耐受性）在人类中相当——在某些情况下甚至不如——在人类中。对COVID-19 mRNA-LNP疫苗的类似发现；它们在小鼠中诱导强烈和持久的免疫反应，但在人类中免疫反应和动力学较差。NHP模型似乎更能反映人类中的疫苗诱导免疫反应；然而，它们昂贵，其使用引发伦理关注，并且在某些情况下，由于NHPs对某些感染（包括季节性流感病毒）有抵抗力，无法评估疫苗诱导的保护。 安全性和反应原性。在人类中，mRNA-LNP疫苗触发了系统性炎症反应，这在小鼠和其他动物模型的研究中并未预测到。这一发现至少部分是由于不同物种间IL-1受体信号传导的差异62所造成的。这些不良事件（称为反应原性）有时相对较强，包括发热、不适、头痛、身体疼痛等。反应原性在年轻人中更普遍，并且在第二次接种mRNA疫苗后通常更强，这表明不仅先天免疫反应，适应性免疫也有所贡献。有趣的是，有报道称mRNA-1273比BNT162b2引起更强的反应原性，可能由于剂量、mRNA生产程序和LNP配方的差异。疫苗诱导的不良事件可能严重到导致工作小时数的损失，这不仅可能对个人未来接种疫苗的意愿产生负面影响，还会造成经济负担。一些非常罕见的副作用，包括过敏性反应（也见于其他疫苗）和心肌炎，主要见于12至24岁的男性，更为麻烦。mRNA-1273也观察到延迟的大局部反应，最近在HIV-1 mRNA-LNP疫苗（Moderna）的临床试验中报告了皮疹。为了使mRNA-LNP疫苗在常规、非大流行环境中更易被接受，应提高这种疫苗方式的安全性和反应原性。修改LNP配方和改进mRNA设计及生产可能减少先天免疫对mRNA的识别。然而，必须指出反应原性和免疫原性通常相伴出现，具有改进安全性概况的疫苗可能诱导较弱的免疫反应。 一个关键挑战是缺乏评估疫苗诱导副作用的相关动物模型。不同物种间先天免疫受体的微妙差异使得很难基于动物模型中获得的数据来预测人类的反应原性。此外，人类对许多病原体的预先存在的免疫和各种免疫激活状态可能影响反应原性，而在动物中模拟这些条件是具有挑战性的。识别和调查非常罕见的副作用，如心肌炎或过敏性反应，更是复杂，因为它们的流行率通常非常低（每100,000剂接种疫苗的事件数很少）。因此，即使是III期临床试验，也不太可能足以在这方面获得相关信息。 5.2.诱导期望的免疫反应 粘膜免疫。肌肉注射或皮内注射的疫苗通常在上呼吸道（URT）中诱导粘膜免疫的能力较差。然而，URT中的局部免疫对于抵抗呼吸道病毒感染很重要，因为这是这些病原体的入口以及传播的场所（图3）。在COVID-19疫苗开发的早期就已注意到，注射的mRNA疫苗可能会很好地保护人类免受有症状疾病的侵害，但可能不会有力地保护免受感染本身，这在这些疫苗的临床前开发中已在动物模型中观察到。现在已清楚，这一预测是准确的。尽管COVID-19 mRNA疫苗可以在以前感染过SARS-CoV-2的个体中引起一定程度的粘膜免疫，但与SARS-CoV-2感染相比，它们通常不会在URT中诱导强大的抗体反应。这是有问题的，因为URT中的粘膜免疫与免受SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒的感染有关。一个关键挑战是制定mRNA疫苗的配方，通过诱导分泌型IgA和驻留记忆T细胞（图3），安全地在URT中引起强烈的粘膜免疫反应。解决这个问题的一个策略是开发可以通过鼻内或口服给药安全有效地递送到粘膜表面的mRNA配方。大多数当前基于LNP的mRNA配方对这种递送途径来说并不理想，因为吸收差和毒性。其他类型的mRNA递送分子，如聚合物，可能更适合此目的。事实上，通过各种递送方式的改变，已经取得了粘膜mRNA疫苗配方的首次成功尝试，这些有希望的研究将为这一重要的疫苗途径提供前进的道路。第二种策略可能是使用注射的mRNA疫苗，除了编码抗原外，还编码驱动B细胞和T细胞反应到粘膜部位的因素或甚至是归巢分子。然而，这种方法首先需要阐明URT的归巢机制200。在粘膜表面针对细菌感染的免疫方面，共表达驱动Th17 T细胞反应的细胞因子或转录因子也可能有益。 图3 | 粘膜免疫、呼吸道病毒和mRNA疫苗接种。a. 上呼吸道的表面是呼吸道病毒的主要入口点，而下呼吸道的病毒复制通常与严重疾病相关。人们认为，局部产生的分泌型IgA1（sIgA1）是保护上呼吸道的主要抗体类型，而血清IgG1被认为是保护下呼吸道的主要抗体类型。b. 通过肌肉注射接种mRNA-脂质纳米颗粒疫苗可以诱导强烈的系统性IgG反应；这些IgG的一部分也会短暂地出现在上呼吸道。然而，局部sIgA1反应并未被强烈诱导，因此病毒传播未被有效阻断。c. 开发粘膜mRNA疫苗，例如，使用新的传递载体，如聚合物或较少炎症的脂质纳米颗粒，可能允许安全地在上呼吸道诱导局部抗体和细胞免疫反应。d. 共同传递编码在B细胞和T细胞中表达的上呼吸道归巢分子的mRNA，可能即使在肌肉注射mRNA疫苗后也能激发有效的粘膜免疫反应。c和d部分中的免疫反应也可能在突破性感染的情况下阻断进一步传播。 预先存在的免疫和印记。COVID-19 mRNA-LNP疫苗在大多数接种个体中引起了强大的保护性免疫反应。对一个完全未接触过的群体进行疫苗接种是一个罕见的场景，主要涉及新出现的大流行病原体。人类通常对病原体有广泛和复杂的预先存在的免疫，包括流感病毒、RSV，现在还有SARS-CoV-2，这种预先存在的免疫将以积极和消极的方式影响疫苗接种的免疫反应。在对SARS-CoV-2 spike蛋白有广泛预先存在的免疫的个体中，额外的mRNA疫苗加强剂量的增强效果要小得多（预先存在的抗体对疫苗接种的免疫反应的抑制作用也已描述过流感）。此外，预先存在的免疫可能影响免疫反应的质量和特征。由于病毒发生了抗原变化，因此在2022年引入了基于SARS-CoV-2变体的mRNA疫苗。当更新后的疫苗用于以前接触过原始SARS-CoV-2 spike的个体时，大多数反应是与原始SARS-CoV-2 spike蛋白交叉反应的，并且几乎未诱导针对变体的特定新生免疫。这让人想起背boost或原始抗原罪行型现象，描述了流感病毒，其中暴露于新变体病毒引起一个交叉反应反应，针对新毒株和生命早期遇到的毒株，以牺牲对新毒株的新生株特异性反应为代价。虽然这些与预先存在的免疫和缺乏强大的新生反应的问题是一个普遍现象，也是所有疫苗平台的问题，但测试mRNA疫苗在具有预先存在免疫的动物模型中将是有益的，以促进它们的成功部署。此外，由于mRNA配方也可以设计为共表达细胞因子和趋化因子，该平台可能特别适合开发专门针对原始B细胞而非记忆B细胞的疫苗，以驱动更好的新生变体特异性反应。这不仅对SARS-CoV-2很重要，对流感病毒疫苗也很重要。 疫苗诱导的免疫反应的持久性。mRNA-LNP疫苗诱导的免疫反应的持久性一直是讨论的重要问题。针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗在SARS-CoV-2未接触过的个体中引起了强烈的浆细胞反应，导致针对SARS-CoV-2的抗体滴度显著增加。浆细胞是短期存活的B细胞，它们在外围循环并产生抗体，但只活跃约2周。然后抗体水平开始下降，IgG的半衰期约为30天。由于mRNA疫苗最初诱导的针对SARS-CoV-2的高抗体水平，这种下降看起来很戏剧性，通常在免疫后6个月内抗体滴度减少10-20倍。与此相比，腺病毒载体疫苗平台观察到的抗体衰减速度较慢；然而，这些疫苗并没有诱导最初的高抗体峰值。实际上，尽管由COVID-19 mRNA疫苗诱导的针对SARS-CoV-2的特异性抗体滴度最初开始下降，但最终会变得稳定。这些稳定的长期滴度由骨髓中不同的B细胞亚群产生，称为长期存活的浆细胞，它们通常可以持续一生。还观察到mRNA-LNP疫苗在接种疫苗的人类的淋巴结中引发惊人的长期（数月）生发中心反应。这些可能有助于增加长期存活的浆细胞的频率，但这些持久的生发中心反应的重要性仍然不清楚。总体而言，尽管mRNA疫苗诱导的抗体反应有显著的初始下降，但这可能更多是最初诱导的高抗体峰值的效果，而不是mRNA疫苗实际上无法诱导持久免疫。然而，保持mRNA疫苗接种后的高抗体水平以保证长期保护是可取的。通过优化疫苗配方，将更多的B细胞从生发中心反应引导到骨髓，这可能是可行的。例如，下一代合理设计的LNP可能允许精确靶向关键的免疫细胞类型，并最终诱导所需的免疫反应。其他可能性包括在LNP中加入具有额外佐剂活性的分子，以进一步增强其效力，或共表达转录激活因子、细胞因子或归巢分子，引导B细胞成为长期存活的骨髓浆细胞。 CD8+ T细胞反应。虽然中和和结合抗体作为许多病毒疫苗的保护相关因素，细胞毒性T细胞反应也可能与保护相关（例如，对于流感病毒）。人们认为，当抗体反应未能中和病毒时，CD8+ T细胞反应可以保护免受SARS-CoV-2引起的严重COVID-19进展（通常在抗原漂移变体中看到）。因此，核苷修饰的mRNA疫苗的另一个重要目标是在人类中诱导强大的CD8+ T细胞反应。流感病毒核苷修饰的mRNA疫苗在小鼠中诱导了强大的CD4+ T细胞（和抗体）反应，但CD8+ T细胞反应中等。这些观察在一定程度上适用于人类中的基于mRNA的COVID-19疫苗，其中通常比强大的CD4+ T细胞诱导引起较弱的针对Spike蛋白的CD8+ T细胞反应（尽管CD8+ T细胞似乎足够初始化，可以通过突破性感染被强烈激活）。这与未修饰的非复制mRNA和saRNA疫苗形成对比，这些疫苗已知可以驱动强大的CD8+ T细胞反应，可能由于它们能诱导更高水平的I型干扰素，这有助于诱导更强大的细胞免疫反应。目前尚需探索如何通过核苷修饰的mRNA疫苗更好地激活CD8+ T细胞，以及共表达特定细胞因子或改变mRNA设计和生产或LNP化学是否是解决这一限制的关键。 针对递送载体的抗体产生。mRNA-1273和BNT162b2不仅针对编码的疫苗抗原，而且有些令人惊讶地也针对LNP载体引起了适应性免疫反应。LNP表面的PEG成分被确定为主要的非目标抗体反应的原因。与BNT162b2配方相比，mRNA-1273配方诱导了更高水平的抗PEG抗体，可能由于疫苗配方的不同组成。尽管尚不清楚这些反应是否总是有害的，但重要的是进一步监测这一现象并探索潜在后果。对LNP的抗体可能会影响LNP的摄取，通过移除它们或将它们导向不同的Fc受体承载细胞类型；这可能导致使用相同基于LNP的平台进行重复剂量的效率问题。此外，抗PEG抗体水平的增加可能会导致某些患者群体中使用的其他聚乙二醇化药物的更快清除（因此效果较低）。总的来说，LNP不是免疫学上无活性的分子，并且可以成为适应性免疫反应的目标。然而，存在可能具有较低免疫原性的PEG替代品。 5.3.疫苗配方和选择 多组分疫苗配方。多价mRNA-LNP疫苗的一个有趣但尚未充分研究的方面是mRNA编码的抗原异源多聚体化（hetero-multimerization）的潜在问题。例如，当两种（或更多）不同的SARS-CoV-2变异株刺突蛋白在同一细胞中由mRNA疫苗表达时，可能形成由不同变体单体组成的三聚体。类似的问题可能也出现在含有四种不同类型的血凝素（H1、H3和两种B型血凝素）的基于mRNA-LNP的流感病毒疫苗中。异源三聚体的形成可能导致结果蛋白的错误折叠，从而可能不准确地反映糖蛋白表面的中和或保护性表位。这种理论上的担忧尚未通过实验验证，但可能是原始株-BA.5二价COVID-19 mRNA疫苗相比XBB.1.5单价疫苗表现较差的原因之一，也可能在临床测试的基于mRNA的流感疫苗中流感B病毒组分的较低免疫原性中发挥作用。此外，多价或多组分疫苗的一个组分可能对其他组分产生免疫优势。这在其他疫苗类型中已有描述，并且可能通过调整疫苗中各种mRNA的比例来克服，例如，减少编码优势组分的mRNA量和/或增加亚优势组分的量。 剂量选择。mRNA疫苗临床开发的一个重要方面是剂量选择。最初的SARS-CoV-2 mRNA疫苗临床试验包括100微克或更高剂量的mRNA。mRNA-1273的第一个版本剂量为100微克mRNA，但后来用于加强剂量的版本将剂量减少到50微克，可能是为了减少不良反应。50微克mRNA剂量似乎是当前人类预防性疫苗的耐受性上限（改变mRNA和LNP化学可能有助于改善这一点），这限制了多价mRNA-LNP疫苗中包含的抗原组分的最大数量。例如，目前正在开发的八价mRNA-LNP流感病毒疫苗候选物，包括四种血凝素和四种神经氨酸酶构建物，假设不同组分以相同量使用，为了不超过50微克总疫苗剂量，每个构建物只能使用6.25微克mRNA。目前尚不清楚这些低剂量是否能在人类中诱导足够强大和持久的免疫反应。在未经免疫的人群中，10微克SARS-CoV-2 mRNA剂量比30微克剂量诱导的免疫反应明显较低，这表明mRNA疫苗在临床使用中至少对当前配方存在价数限制。克服这些障碍对于包含流感病毒、RSV、SARS-CoV-2、hMPV和不同副流感病毒以及季节性冠状病毒抗原的泛呼吸道病毒疫苗的开发至关重要。更简单的多价配方，例如包含流感病毒和SARS-CoV-2（甚至RSV）抗原的mRNA-LNP疫苗，已经在开发中（表1）。 对抗原变化的响应。mRNA疫苗的一个关键优势是它们的灵活性，特别是对于那些需要频繁更新的疫苗，如流感病毒疫苗和SARS-CoV-2疫苗。基于灭活病毒的流感疫苗每年更新一次，以反映流通的毒株。为即将到来的北半球季节选择疫苗配方的组分，这一过程每年二月进行，基于监测和预测（南半球疫苗的生产也有类似的过程）。更新疫苗的生产大约需要6个月的时间，在这段时间里，有时变得清楚的是，选择的疫苗株不是最优的，可能与流通的毒株不匹配，对疫苗的有效性产生重大负面影响。SARS-CoV-2 mRNA疫苗在大约2个月内进行了更新和生产。因此，使用mRNA平台进行季节性流感病毒疫苗的潜在可能允许更晚的毒株选择，并且能够开发出比使用传统平台生产的疫苗更匹配流通毒株的疫苗。 反向疫苗学3.0。当新疫苗进入临床开发时，通常只测试一种疫苗抗原，因为Good Manufacturing Practice生产过程的高成本和复杂性通常需要为所选抗原专门设计（框4）。这种抗原可能在不同剂量下进行测试，或与不同的佐剂结合使用，但包含额外版本的抗原通常成本过高。mRNA疫苗克服了这一限制，因为即使抗原序列不同，也可以使用相同的流程进行制造（框4）。mRNA疫苗技术还允许针对大型多亚基抗原或病毒表面抗原，这些抗原由于存在多个跨膜域而难以作为重组蛋白生产（例如，布尼亚病毒GnGc蛋白）。与临床测试几种候选疫苗同时进行的预临床试验中测试许多不同版本的抗原或许多不同的病原体抗原也是现实的。然后可以根据人类试验中获得的数据选择最佳疫苗候选物。这一过程在辉瑞-BioNTech COVID-19疫苗的选择过程中被利用，其中BNT162b2在临床测试几种不同版本后被选为领先候选物。未来，mRNA疫苗的这一重大优势可能导致对表达许多不同蛋白质且最佳疫苗靶标未知的病原体的疫苗开发取得突破，包括结核病、不同的单细胞和多细胞寄生虫，包括疟原虫和锥虫种类，甚至DNA病毒具有大基因组和未知保护性抗原，如非洲猪瘟病毒。这一“反向疫苗学3.0”过程（图4）可以类似于用于开发B型脑膜炎奈瑟菌疫苗的“反向疫苗学”过程，但将显著更快，并且具有更高的吞吐量（“反向疫苗学2.0”被定义为基于免疫系统与抗原之间相互作用的结构分析的合理疫苗设计）。重要的是，最终的疫苗配方可能在确定正确的保护性靶标抗原后基于另一种疫苗平台（例如，重组蛋白疫苗）。 图4 | mRNA疫苗生产的简单和速度：反向疫苗学3.0。a. 对于大多数传统疫苗平台，需要为每个单独的抗原分别开发包括上游处理、下游处理以及放行标准和测试的流程，并且不同流程之间通常存在显著差异。mRNA生产主要是序列独立的；相同的生产程序可以用来生产任何编码蛋白质抗原的mRNA。这使得Good Manufacturing Practice生产非常灵活，成本效益更高。b. 生产编码许多不同抗原的mRNA疫苗的简便性和灵活性使得“反向疫苗学3.0”成为可能。例如，一个复杂病原体的所有开放阅读框（ORFs），其保护性抗原未知，可以作为mRNA疫苗生产并在动物挑战模型中进行测试，然后可以快速鉴定出具有保护性的抗原，这些抗原随后可以作为疫苗候选物进行更详细的临床前研究，甚至可能进行临床研究。 5.4.疫苗公平和全球获取 mRNA疫苗的一个重要挑战是全球疫苗公平。在COVID-19大流行期间，低收入和中等收入国家（LMICs）获得mRNA疫苗的机会不佳且被延迟。低收入国家通常获得病毒载体和基于灭活病毒的SARS-CoV-2疫苗（或根本没有疫苗）；这是由于定价、获取、超冷存储分销网络的可用性、疫苗民族主义和疫苗外交。mRNA疫苗需要冷冻长期储存的要求即使在高收入国家也可能对疫苗推广造成问题。目前正在开发在4°C甚至室温下稳定的mRNA疫苗，这些热稳定的mRNA疫苗可能会进一步增加mRNA疫苗技术的全球影响。为了让mRNA疫苗技术在全球范围内可用，建立全球各区域的开发和生产能力也很重要。许多传统疫苗生产商和LMICs的初创公司已经开始开发自己的mRNA疫苗配方和设施，这是有希望的。已经开始了一些加强这一努力的倡议，但一些mRNA疫苗制造商已经在缩减他们向LMICs转移技术的努力。同样还有待观察的是，mRNA和LNP技术的潜在知识产权问题是否可以解决，以促进LMIC疫苗生产商的获取。全球分布的mRNA疫苗开发商和生产商将无疑增加大流行病的准备，并允许LMICs依赖自己的疫苗，而不是依赖高收入国家及其疫苗外交。 6.结论和展望 尽管基于RNA的疫苗，特别是核苷修饰的mRNA-LNP配方，多年来显示出巨大的希望，但正是COVID-19大流行使它们成为焦点，并导致了首批获得许可的mRNA疫苗。然而，我们远未实现基于RNA的疫苗的全部潜力，需要进一步的优化来解决当前的限制。在这方面，有机会开发具有增强免疫原性和降低反应原性、更大的稳定性以及能够诱导粘膜免疫反应的新型RNA疫苗配方。除了病毒，还需要针对人类致病细菌、真菌和寄生虫的mRNA疫苗，以及能够同时保护免受几种不同病原体侵害的疫苗。mRNA疫苗设计和制造的灵活性和简便性可能会彻底改变抗原选择和疫苗开发，并可能使得为以前难以捉摸的病原体设计疫苗成为可能。对mRNA疫苗作用机制的更深入理解将指导下一代mRNA疫苗的设计。mRNA疫苗技术为疫苗开发、免疫接种和大流行病准备的未来持有巨大希望，并已经为疫苗学的新的黄金时代做出了贡献。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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摘要：目前针对COVID-19的mRNA疫苗的使用首次展示了mRNA疫苗在传染病领域的潜力。在这里，我们将总结有关改进型mRNA疫苗，即自身扩增mRNA（saRNA）疫苗的当前知识。这种方法可能通过扩增编码抗原的RNA来增强抗原表达。将回顾RNA设计、RNA递送以及RNA诱导的先天免疫反应。 1.RNA疫苗 传统疫苗主要基于灭活或减毒病原体，并且需要长时间的开发，这使得对新出现的病原体的快速反应变得困难。然而，基于核酸的疫苗可以克服这一缺点，RNA作为疫苗候选物的建议早在30多年前就已提出。在当前COVID-19大流行期间使用mRNA疫苗已经证明了它们在对抗新兴传染病方面的可行性和明显优势。 mRNA疫苗的生产在技术上简单、快速、成本效益高，且无需细胞和动物材料，易于适应。mRNA疫苗可以从线性化的质粒DNA模板或基于聚合酶链反应的模板通过体外转录使用噬菌体RNA聚合酶如T7、T3或SP6聚合酶来生产。在体外转录过程中或转录后酶促添加帽子结构。所有组件都是无动物材料的；然而，制造必须使用无RNase的材料进行。通过DNase处理去除残留的DNA，并通过基于珠子的方法、色谱法或沉淀进一步纯化所得的mRNA。这些无细胞生产步骤可以轻松标准化并扩大规模，以获得临床级材料。RNA疫苗候选物的生产速度快，有报道称流感疫苗候选物仅在8天内就已生产出来。 与基于DNA的疫苗相比，mRNA没有整合到宿主基因组的风险。mRNA是非感染性的，并且由于宿主细胞RNases的降解而在细胞中短暂存在。这些安全特性也已通过COVID-19 mRNA疫苗得到证明，它们主要只显示轻微的不良反应事件。与载体疫苗相比，没有预先存在的抗载体免疫，并且可以重复进行mRNA免疫。最后，COVID-19 mRNA疫苗已被证明是有效的，并能诱导强大的体液和细胞免疫反应。 mRNA疫苗由编码免疫原性抗原的开放阅读框（ORF）、5'-和3'-非翻译区（UTR）、5'-帽子结构和3'-聚腺苷酸尾（poly-A）组成（图1）。像细胞mRNA一样，mRNA疫苗直接在位翻译成相应的抗原。将mRNA转移到抗原呈递细胞允许宿主细胞蛋白酶体处理表达的抗原，并随后装载到主要组织相容性复合体（MHC）I类分子上。此外，在吞噬分泌的抗原并在内体内降解后，肽可以由MHC II类分子呈递。从而分别刺激CD8+和CD4+ T细胞。T细胞激活还需要共刺激分子和细胞因子分泌，这可能来自mRNA疫苗的先天免疫感应（见下文）。除了细胞免疫反应外，通过分泌抗原激活B细胞也可以刺激体液免疫反应。因此，mRNA疫苗接种诱导了抗原特异性的体液和细胞免疫反应。 图1. mRNA疫苗的结构元素 为了有效，mRNA疫苗需要进行几项改进，以增强mRNA的稳定性、调节RNA对先天免疫反应的调节，并使mRNA在体内有效递送。几个元素被优化：1.1.提高mRNA稳定性和翻译效率 病毒或真核基因的5'-和3'-UTR序列调节mRNA的半衰期和翻译，因此UTR序列被优化用于mRNA疫苗接种。 5'-UTR主要涉及RNA被核糖体识别和下游基因的翻译。通常添加Kozak序列以提高翻译效率。3'-UTR主要调节mRNA的稳定性。例如，高表达的β-珠蛋白基因的3'-UTR增加mRNA的稳定性。也可以通过细胞库筛选识别新的3'-UTR元素。 此外，3'-聚腺苷酸尾的长度调节mRNA的稳定性并增强翻译。聚腺苷酸尾通常由大约200个单元组成，但在树突细胞(DCs)中平均大小为120-150个核苷酸。此外，聚腺苷酸尾通过聚腺苷酸结合蛋白和翻译启动因子与帽子结构相互作用，形成环。发现高表达基因具有短的聚腺苷酸序列并有效地形成环。聚腺苷酸尾对真核基因表达的影响已在中进行了综述；然而，聚腺苷酸长度在RNA疫苗中的确切作用仍需要进一步研究。在mRNA疫苗中，已证明100个核苷酸的聚腺苷酸尾足以有效表达抗原并诱导免疫反应。 真核细胞区分自身和非自身mRNA的一种机制是帽子结构。真核帽子是一个7-甲基鸟苷(m7G)帽子，通过5'-5'-三磷酸桥(ppp)(m7GpppN结构)与mRNA相连。Cap-0结构只包含m7G帽子。对第一核糖体部分的2'-羟基进行进一步甲基化产生cap-1，对第二核糖体进行额外甲基化产生cap-2结构。病毒RNA通常包含cap-0结构，含有cap-0结构的RNA被先天免疫系统识别（见下文）；因此，cap-1/2结构对疫苗开发更优越。例如，具有抗反向帽子类似物(ARCAs; m27,3'-OGpppG)的体外转录mRNA已证明增强了翻译。可以通过2'-O-甲基转移酶酶促添加Cap-1结构，或通过CleanCap技术共转录。 此外，抗原序列可以通过密码子优化来增加抗原表达。为此，目的在于消除可能减慢翻译效率的稀有密码子，将同义突变引入基因中。密码子优化还影响GC含量和RNA二级结构，这两者都影响翻译效率，因此可以进行优化。 1.2.mRNA疫苗候选物的体内递送 对于体内应用，基于RNA的疫苗需要被细胞吸收。由于它们的大分子量、负电荷和快速被核酸酶降解，通过细胞膜的磷脂双层传递是具有挑战性的。不同的方法可以用于mRNA的体内递送。 最简单的递送方法是裸mRNA。它可以通过清道夫受体介导的内吞作用被细胞吸收；然而，只有少量的mRNA被释放到细胞质中。因此，大多数细胞类型的mRNA吸收效率不高，不成熟的树突细胞除外，它们作为正常生物学功能的一部分通过微囊泡吞噬作用吸收mRNA。通过裸mRNA的皮内或淋巴结内接种后，mRNA被淋巴结树突细胞吸收，抑制微囊泡吞噬作用会消除内部化。 然而，为了在细胞中获得高水平的mRNA并递送到大量细胞，需要改进的递送方法。通过电穿孔，例如使用基因枪，可以增加细胞内吸收。通过电穿孔将mRNA转移到树突细胞作为癌症疫苗已被证明在癌症患者中是安全的。已经开发了用于体内递送的mRNA配方，这些配方增加了mRNA的稳定性和细胞吸收。其中最广泛使用的是与脂质纳米颗粒(LNP)配方的mRNA。LNP是胆固醇、可离子化脂质、磷脂、PEG脂质和辅助脂质的混合物，最初用于癌症免疫疗法。脂质的类型和它们之间的比例决定了配方的效率，mRNA疫苗的最佳比例与siRNA递送的不同。在当前COVID-19大流行中的使用表明，LNP配方的COVID-19疫苗在人类中具有高效性和安全性。在随机对照试验中，与安慰剂相比，COVID-19 mRNA疫苗减少了参与者确诊有症状的COVID-19的比例，并减轻了疾病的严重程度。疫苗和安慰剂治疗组之间在严重不良事件方面几乎没有或没有差异。 1.3.调节先天免疫反应以增强mRNA疫苗的蛋白表达 外来RNA在细胞内被先天免疫系统识别，这通常会导致抗原表达的抑制。然而，这种先天免疫反应也可以对疫苗产生佐剂效应。已经使用了几种策略来优化免疫原性。在体外转录过程中，T7 RNA聚合酶的RNA依赖性RNA聚合酶活性和RNA的重新结合允许在3'端自我引物化，以进行互补RNA合成，从而产生双链RNA(dsRNA)。dsRNA可以强烈激活先天免疫反应。在病毒感染期间，dsRNA可以被Toll样受体(TLRs)、视黄酸诱导基因I(RIG-I)样受体、蛋白激酶R(PKR)、寡腺苷酸合成酶(OAS)和NOD-, LRR-, 和pyrin结构域包含1(NLRP1)感知，这导致激活多种信号级联，导致炎症、细胞生长抑制或细胞死亡。可以通过RNA的纯化来去除dsRNA，例如，通过高性能液相色谱或基于纤维素的纯化。或者，可以通过优化核苷酸三磷酸比例或构建突变聚合酶进行RNA合成来减少体外转录过程中dsRNA的产生。此外，修饰核苷的掺入可以减少单链mRNA的免疫原性。例如，伪尿嘧啶和1-甲基伪尿嘧啶防止先天免疫系统的感知，并实现更高的抗原表达率。DNA模板也可能影响mRNA疫苗的先天感知，尽管大部分DNA应该已经通过纯化步骤或DNase处理被去除。外来的细胞质DNA被几种DNA传感器如cGAS和IFI16识别，它们主要通过适配蛋白STING发挥作用。然而，残留DNA对mRNA疫苗的影响尚未详细研究。体外转录的残留蛋白也可能刺激先天免疫反应，但这些蛋白通常通过纯化被去除。 1.4.mRNA疫苗的储存温度 当前的COVID-19 mRNA疫苗需要在-60或-80°C的温度下储存Comirnaty，或在-50°C的温度下储存Spikevax。这些低温储存要求影响mRNA疫苗的全球分布，特别是在低收入和中等收入国家。不正确的储存可能导致RNA的氧化和水解，并可能改变其功能。冻干可能是另一种储存方法，因为它可能在更高的温度下实现长期稳定性。 2.作为自身扩增疫苗候选物的阿尔法病毒复制子  抗原表达与传递给抗原呈递细胞的mRNA量相关；然而，mRNA也被RNases降解。因此，为了刺激强大的免疫反应，需要大量的mRNA和重复的免疫接种。当前的COVID-19疫苗每剂含有30-100微克mRNA。自身扩增(sa)RNA疫苗需要较少的初始RNA量，因为mRNA在细胞内扩增。例如，只有10纳克saRNA的剂量就能在小鼠中诱导SARS-CoV-2特异性免疫反应，5微克saRNA已成功用于临床试验。基于这一原理的疫苗利用单链正义或负义RNA病毒的基因组。负义病毒需要通过它们自己的RNA依赖性RNA聚合酶介导的新蛋白合成来启动转录，并需要技术上要求高的反向遗传学来构建。因此，大多数saRNA疫苗基于正义感的阿尔法病毒委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、辛德比斯病毒(SINV)或森德堡森林病毒(SFV)的基因组。正义感阿尔法病毒的基因组RNA被直接翻译。阿尔法病毒是包膜的、单链的、正义感RNA病毒，属于Togaviridae家族。阿尔法病毒基因组包含11-12 kb，具有50-甲基鸟苷帽子和30-聚腺苷酸尾(图2A)。它由两个ORF组成：第一个编码四个非结构蛋白(nsP1-nsP4)，第二个编码五个结构蛋白(衣壳和包膜蛋白E3-E2-6K-E1)。nsPs直接作为多蛋白从基因组RNA的第一个ORF翻译，并构建复制复合体(replicase)，它履行病毒复制的基本功能。nsP1是加帽酶，具有鸟嘌呤-7-甲基转移酶和鸟苷转移酶活性。nsP2是一种蛋白酶，需要处理非结构多蛋白。此外，nsP2具有RNA解旋酶和RNA三磷酸酶活性，并且它诱导宿主细胞蛋白表达的关闭。nsP3介导病毒-宿主和蛋白-蛋白相互作用，这对病毒复制至关重要，nsP4是病毒RNA依赖性RNA聚合酶。复制复合体首先合成全长的负义RNA，它作为合成全长基因组RNA或亚基因组RNA的模板(图2B)。与nsPs相反，结构蛋白是从亚基因组RNA翻译为多蛋白，(图2B)。 基因组包含几个对RNA复制、转录和包装成病毒颗粒重要的序列。这些元素被称为顺式作用元件或保守序列元件(CSEs)（图2A）。5'-UTR包含负链和正义链合成的核心启动子元件。在nsP1编码序列内的一个51个核苷酸长的序列元素对RNA扩增很重要。类似地，30-CSE序列在负链RNA合成中充当启动子，从而实现RNA扩增。因此，5'和3'-CSEs的存在确保了由阿尔法病毒复制酶特异性RNA扩增。对于亚基因组RNA合成的启动，需要亚基因组启动子(SGP)作为一个CSE（图2B）。这个序列通常位于nsP4编码序列中，包括转录起始位点上游的19个核苷酸和下游的2-5个核苷酸。此外，nsP1或nsP2编码序列中的包装信号确保基因组RNA被特异性地包装进病毒颗粒。 图2. 阿尔法病毒基因组和复制：(A) 阿尔法病毒基因组的图解。(B) nsPs 直接从基因组RNA翻译并促进病毒复制。负链中间体作为基因组和亚基因组RNA合成的模板。结构蛋白从后者翻译并形成传染性病毒。3.自身扩增RNA疫苗候选物 对于构建saRNA疫苗，阿尔法病毒的结构蛋白被抗原基因替换，该基因插入在SGP的控制之下（图3A,B）。与传统的mRNA疫苗相比，添加7-8 kb的阿尔法病毒复制酶基因显著增加了RNA的长度。此外，病毒CSEs被用作saRNA疫苗中的5'-和3'-UTR。因此，就像在阿尔法病毒复制中一样，复制酶可以扩增saRNA并转录亚基因组RNA。然后从亚基因组RNA翻译抗原。由于复制酶有效扩增编码抗原的RNA，与从mRNA获得的相比，将表达更高量的抗原。因此，可以使用较少的RNA实现类似的免疫反应。 图3. RNA疫苗方法：(A) 常规mRNA由50-帽子、50-UTR、抗原序列、30-UTR和聚(A)尾组成。抗原直接从mRNA在位翻译。(B) 自身扩增RNA还包含病毒50-和30-CSEs以及阿尔法病毒nsP1-nsP4基因。抗原被置于亚基因组启动子(SGP)的控制之下。复制酶(nsP1-nsP4)直接在位翻译并由于CSEs特异性扩增saRNA。(C) 跨扩增RNA疫苗由两个RNA组成。一个是编码阿尔法病毒复制酶的常规mRNA。第二个是编码抗原的跨复制子(TR) RNA，它由复制酶在转录后扩增。 多项使用saRNA疫苗候选物的临床前试验已被报道，主要目的是预防传染病。在这里，saRNA编码病毒糖蛋白作为中和抗体和细胞免疫反应的目标。基于阿尔法病毒的saRNA在动物模型中作为SARS-CoV-2感染的疫苗候选物成功进行了测试。最近，针对多种蝙蝠和人类冠状病毒刺突抗原表达的跨沙贝科病毒saRNA疫苗候选物的临床前数据显示，它能够保护动物免受致命异源感染。此外，还对针对流感病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒、VEEV和HIV-1的saRNA疫苗进行了临床前测试。这些疫苗候选物主要与LNPs配方，并诱导了高特异性的抗体和T细胞反应，显示出对小鼠挑战感染的保护。saRNA疫苗也被适应用于对抗细菌感染、寄生虫如弓形虫和癌症。 saRNA疫苗的临床前开发导致了针对SAR-CoV-2和流感的saRNA疫苗的首次临床试验。目前，在clinicaltrials.gov上列出了十项saRNA疫苗的临床试验，其中九项针对SARS-CoV-2（表1）。saRNA的应用不仅限于疫苗开发；还开发了使用saRNA的被动免疫策略。通过saRNA传递的寨卡病毒特异性单克隆抗体保护小鼠免受寨卡病毒感染。此外，正在开发使用mRNA或saRNA进行基因替代治疗的新基因疗法方法。 对于临床开发，仍然需要阐明RNA扩增和抗原表达持续多长时间。在给予荧光素酶saRNA后，表达在一个月后恢复到基线水平。此外，从理论上讲，如果saRNA表达具有出芽能力的病毒糖蛋白，它可能被包裹在囊泡中，导致saRNA转移到其他细胞。在saRNA疫苗的安全评估中应考虑这一点。 4.跨扩增（ta）RNA疫苗候选物  最近，通过建立taRNA疫苗的原理，进一步开发了saRNA疫苗[115]。对于taRNA疫苗，使用两种RNA。第一种是体外转录的mRNA，编码阿尔法病毒复制酶，可以直接在体内翻译。第二种RNA，即跨复制子（TR）RNA，编码相应的抗原，置于SGP的控制之下（图3C）。由于含有阿尔法病毒50'和30'-CSEs，TR-RNA通过阿尔法病毒复制酶进行跨扩增。最初，为VEEV建立了一个称为“splitzicon”的分裂复制子系统。借助荧光报告基因作为抗原，确定了自扩增taRNA所需的成分。最近，使用编码复制酶基因的非复制mRNA和表达流感病毒血凝素的TR-RNA构建了流感病毒taRNA疫苗候选物。与saRNA疫苗候选物相比，taRNA能够以较少的抗原RNA诱导保护性免疫反应。这可能是因为只扩增了短的TR-RNA而不是长的saRNA。重要的是，研究表明，与短RNA相比，阿尔法病毒复制酶对RNA的扩增更快、更有效。 此外，使用编码阿尔法病毒复制酶的密码子优化mRNA诱导了更强的免疫反应。基于另一种阿尔法病毒——基孔肯雅病毒（CHIKV）的taRNA疫苗候选物诱导了强大的体液和细胞免疫反应，并能够保护小鼠免受CHIKV挑战感染。此外，还描述了一种新型双价taRNA疫苗候选物，涉及传递三种RNA：一种编码复制酶和两种编码抗原的TR-RNA。与saRNA疫苗相比，taRNA疫苗在安全性、可制造性和优化潜力方面有所改进。使用两种RNA最小化了RNA转移到更多宿主细胞的风险。taRNAs的RNA比saRNAs短，因此扩大生产更容易。然而，需要生产两种RNA，并且尚未证明有效的体内传递配方。 5.saRNA疫苗的生产和传递  saRNA和taRNA像mRNA一样，通过体外转录从DNA模板生产，并添加帽结构。除了已建立的帽试剂外，最近还开发了CleanCap试剂AU，用于阿尔法病毒saRNA的加帽，以允许共转录加帽具有天然Cap-1结构。saRNA疫苗可以作为体外转录的RNA传递，也可以包装成病毒颗粒（VP）。当包装在VPs中时，原则上可以被视为减毒病毒。它们应该在人类中显示有限的复制，但仍然能够诱导良好的免疫反应，而没有疾病迹象。已经描述了使用这种传递方法的疫苗候选物用于CHIKV。已经报道了CHIKV基因中的几种缺失，例如nsP3中的大缺失（∆5nsP3）或在衣壳中，一些这些减毒病毒已经进入了临床开发。然而，基于VP的传递有几个缺点；它们通常具有次优的安全概况，并且总是保留恢复为致病病毒的潜力。此外，载体是免疫原性的，这使得加强免疫变得困难。通过体外转录生产saRNA疫苗，像传统的mRNA疫苗一样，绕过了这些障碍。 在临床前模型中，taRNA的免疫接种主要通过皮内注射稀释在无RNase PBS中的RNA进行。同样，裸露的saRNA能够诱导针对HIV 1和寨卡病毒的特异性免疫反应。然而，RNA剂量很高，与mRNA疫苗相当。已经证明有多种配方可以改善mRNA的体内传递。由于存在阿尔法病毒复制酶基因，saRNA疫苗比mRNA长，需要新的传递配方。探索了多种saRNA配方方法。在将saRNA配方与脂质体、固体脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒和乳液进行比较时，使用1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷聚合物纳米颗粒诱导了最强大的免疫反应。还根据先前为siRNA和mRNA优化的LNP配方开发了优化的saRNA LNPs。将saRNA与LNPs配方作为COVID-19疫苗候选物，将小鼠诱导强大免疫反应所需的剂量减少到仅为10 ng。LNP配方也可以类似地适应taRNA系统。从而，RNA稳定性和传递可能会得到改善，并且通过肌肉内应用以较低的RNA剂量刺激强大的免疫反应。 6.saRNA疫苗候选物及诱导先天免疫反应  作为非自身分子，RNA疫苗被细胞途径感知，并有效地激活先天免疫系统。如上文所述，可以采用几种方法来规避先天免疫激活；然而，对于sa/taRNA疫苗，核苷修饰在扩增步骤中会丢失，因此益处较小。在taRNA疫苗中，复制酶mRNA可以进行核苷修饰；然而，其效果仍有待评估。此外，RNA可以初步纯化以减少先天感应。 与mRNA疫苗相比，细胞内RNA扩增产生dsRNA，从而更强烈地激活先天免疫反应。RNA可以被多种模式识别受体识别，包括TLR3、TLR7、RIG-I样受体、黑素瘤分化相关蛋白5（MDA5）、PKR和OAS。由此产生的信号级联导致产生I型干扰素（IFN）和促炎细胞因子。尽管先天反应具有辅助作用，可以促进特异性免疫反应，但它也可以诱导RNA降解，从而减少抗原表达。 已经为saRNA疫苗描述了减少IFN激活的策略。例如，表达来自避免免疫感应的病毒的蛋白质可以抑制先天反应。在单独的mRNA上编码牛痘病毒的E3、K3和B18R蛋白以及流感A病毒的非结构蛋白1，在体外和体内增加了抗原表达。同样，saRNA上顺式编码的抑制先天反应的蛋白能够增加刺激的免疫反应。阿尔法病毒通过关闭宿主细胞转录和翻译来对抗先天免疫反应。因此，IFN的产生也减少了。此外，阿尔法病毒感染和复制酶表达是细胞毒性的，并诱导宿主细胞凋亡。复制酶nsPs包含影响RNA扩增和宿主细胞反应的元素。nsP2诱导宿主细胞关闭导致细胞死亡。这对疫苗应用的确切影响还有待阐明。有趣的是，已经描述了CHIKV nsP2中的突变，这些突变减少了细胞病变效应。此外，在体外方法中，已经鉴定出VEEV nsPs中的突变，这些突变增强了原位亚基因组RNA的合成。在CHIKV适应A549细胞过程中，复制酶基因中发生了两个突变，增加了病毒复制。因此，sa/taRNA疫苗候选物的复制酶可以进一步优化，以提高抗原表达和免疫。 除了减少IFN激活的策略外，还探索了通过使用佐剂来调节saRNA疫苗接种后的免疫反应。例如，已经评估了与基于佐剂MF59的阳离子纳米乳液配方的saRNA或与TLR激动剂配方的saRNA。尽管诱导了强大的免疫反应，直接益处仍有待证明，且缺乏临床数据。此外，LNP配方具有佐剂效应。比较皮内电穿孔与LNP传递的研究表明，LNPs强烈诱导先天免疫反应，减少了小鼠皮肤中saRNA的抗原表达。 7.saRNA疫苗用于人类 saRNA疫苗的临床前开发导致了针对SAR-CoV-2和流感的saRNA疫苗的首次临床试验。已完成的基于saRNA的COVID-19疫苗候选物的临床试验数据看起来令人鼓舞，最近进行了第一阶段I试验。基于VEEV的saRNA疫苗（LNP-nCoVsaRNA），表达SARS-CoV-2的前融合稳定化刺突糖蛋白，耐受性良好，没有与疫苗接种相关的严重不良事件。尽管血清转化率没有达到100%，但血清阳性参与者中特异性抗体浓度与来自康复期血清的值相似。然而，人类对SARS-CoV-2的反应明显低于小动物模型预测的反应。另一种基于VEEV的saRNA疫苗候选物（ARTC-021），表达SARS-CoV-2刺突糖蛋白，也被发现是安全的，并且有100%的血清转化率。抗刺突IgG滴度等于COVID-19康复期血浆中的那些。目前正在进行一项更大的临床试验，使用ARTC-021作为加强疫苗（NCT05012943）。这些例子表明，saRNA技术正在进入临床开发，但需要进一步改进以产生有效的疫苗。 8.结论 在COVID-19大流行期间使用mRNA疫苗已经证明了它们在预防传染病方面的可行性。saRNA疫苗候选物将进一步完善这一策略，它们有望以更少的RNA实现有效性。然而，仍然需要进一步的研究，特别是提高RNA传递的效率和研究先天感应的作用。目前还不确定使用更少的RNA（在体内扩增）在临床上是否比标准mRNA疫苗有利。在小鼠模型中进行了比较saRNA与mRNA优势的临床前研究，这些模型不能适当地重现人类的先天免疫反应。saRNA疫苗的第一阶段临床试验刚刚完成，mRNA与saRNA的直接比较仍有待进行。像RNA疫苗一样，saRNA疫苗可能不仅限于传染病，还可能用于基因治疗、抗癌或输送基于蛋白质的治疗剂。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。