MST2

-01-引言Treg细胞是CD4+T细胞的一个亚群，通过预防自身免疫、控制过度炎症和维持免疫耐受，对免疫稳态至关重要。Treg细胞的免疫调节特性在癌症中会促进肿瘤的进展。对TIL亚群的分析表明，免疫细胞浸润的组成与患者预后之间存在明确的关联。过表达细胞毒性T细胞的TIL通常与良好的预后相关，而TIL中Treg细胞的频率增加与不良预后相关。Treg细胞的分化和功能依赖于谱系特异性转录因子Foxp3的表达。FOXP3基因功能丧失改变的人类患有免疫失调、多内分泌疾病、肠病、X连锁（IPEX）综合征，表现为广泛的自身免疫和炎症损伤。Treg细胞在胸腺中由一组前体细胞发育而来，这是一个需要T细胞受体（TCR）和IL-2激活的两步过程。Treg细胞可以通过各种不同的机制抑制免疫反应。CD25是IL-2受体的一种高亲和力亚单位，在Treg细胞上组成性高表达，但在效应T细胞上也上调。Treg细胞上高水平表达的CD25竞争性地结合IL-2，从而剥夺效应T细胞的这种专性生长因子。Treg细胞还表达一系列抑制分子，如CTLA-4，与Treg介导的抑制有关。此外，Treg细胞还可以分泌抑制性细胞因子，如IL-10和TGF-β。基于这些有效的免疫抑制机制，Treg细胞通常被认为是最有效的抗肿瘤免疫抑制剂。因此，以Treg细胞为靶点的癌症治疗策略也是目前的研究热点。-02-一、Treg的分类和功能Tregs可分为两类：天然调节性T细胞（nTregs）和诱导调节性T细胞（iTregs）。两种类型的Tregs都普遍表达 Foxp3。nTregs在胸腺中自然发育，其抑制作用是通过细胞间接触实现的，它们的主要功能是维持正常的免疫耐受和控制炎症反应。iTregs来源于肿瘤微环境信号诱导的外周原始T细胞，包括肿瘤抗原、细胞因子（如TGF-β）和其他可溶性分子。iTregs通过多种促进肿瘤进展的机制抑制效应T细胞（Teff）、NK细 胞和DC的抗肿瘤免疫作用。Tregs主要有以下五种功能机制：①Tregs分泌抑制性细胞因子，包括 IL-10、TGF-β 和 IL-35。② Tregs 通过颗粒酶和穿孔素杀死效应细胞。③ Tregs 影响效应细胞的功能：Treg 与效应T细胞竞争消耗 IL-2，从而抑制效应T细胞的生长；Tregs通过产生胞外酶CD39和CD73 促进TME中腺苷的产生，诱效应细胞导的抑制和抗增殖作用；Tregs通过缝隙连接将大量 cAMP 转移到效应T细胞，干扰其代谢。④Tregs通过刺激性和抑制性受体（CTLA-4 或 LAG3）诱导DC耐受，后者通过IDO进一步抑制T细胞的能力。⑤MDSCs和Tregs 产生的因子形成正反馈环，促进增殖，增强抑制环境。         此外，一项研究使用一种新的策略来定义Tregs， Th1样Tregs（T- 234bet+IFNγ+Foxp3+），Th2 样Tregs（Gata3+IRF4+IL4+Foxp3+）和Th17样Tregs（IL-17+RORγt+Foxp3+），这为靶向 Tregs 治疗提供了新思路。 -03- 二、Treg抑制抗肿瘤免疫反应的机制Treg通过多种机制阻碍抗肿瘤免疫反应。在Tregs中，共抑制受体细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）通过与APCs中的CD80/B7-1和CD86/B7-2结合干扰共刺激信号，从而抑制效应T细胞中的共刺激受体CD28。                 IL-2是Treg和效应T细胞生存所必需的细胞因子。与效应T细胞相比，Treg主要通过由α（CD25）、β（CD122）和γ（CD132）亚单位组成的更高亲和力受体结合IL-2。此外，Tregs比效应T细胞具有更高的CD25表达，而CD25是IL-2的一种高亲和力受体。这使得Treg在利用TME中有限的IL-2方面具有竞争优势。因此，在TME中，Treg的累积量大于效应T细胞。同时，Treg还分泌免疫抑制分子（包括免疫抑制细胞因子）抑制抗肿瘤免疫。Treg产生TGF-β、IL-10和IL-35导致免疫抑制。表达在Tregs细胞表面的CD39和CD73作为外核苷酸酶，分别将ATP或ADP水解为AMP和AMP水解为腺苷。CD39和CD73产生的腺苷会抑制效应T细胞。当Treg在TME中发生凋亡时，凋亡的Treg通过外核苷酸酶释放大量腺苷，从而产生更强的抗肿瘤免疫抑制。-04-三、TME中Treg浸润的机制趋化因子和细胞因子依赖性浸润Treg具有多种趋化因子受体。趋化因子梯度，如CCR4-CCL17/22，CCR5-CCL5, CCR8-CCL1,和CCR10-CCL28，可参与将Treg招募到TME中。           在炎症肿瘤中，炎症细胞产生Treg招募趋化因子，如CCL22。CCR8+Treg被CCR8配体（如CCL1和CCL18）招募到TME等炎症部位，CCL1不仅将CCR8+Treg招募到肿瘤中，还诱导对Treg抑制至关重要的FOXP3、CD39和IL-10的STAT3依赖性上调，从而增强Treg的免疫抑制活性。在一系列细胞因子和趋化因子受体中，与正常组织驻留的Tregs相比，CCR8仅在人类乳腺癌的肿瘤浸润性Tregs中显著上调，表明CCR8是TME中Tregs的一个有希望的治疗靶点，而不会引起系统性自身免疫。基于TME代谢适应的生存优势效应T细胞和Treg在正常和炎症条件下使用不同的代谢系统，Treg表现出更强的生存优势。TCR刺激通过磷酸肌醇3-激酶（PI3K）-雷帕霉素（mTOR）信号途径激发特定的代谢程序，导致氨基酸和葡萄糖的吸收增加，从而增强有氧糖酵解。活化的效应T细胞将其代谢程序从氧化磷酸化（OXPHOS）转变为有氧糖酵解，这是其生存和功能所必需的，从而导致效应T细胞和TME中的肿瘤细胞之间的葡萄糖竞争。肿瘤细胞中的代谢重编程将TME转变为营养受限，富含乳酸和低氧环境，不利于效应T细胞的存活和功能。然而，在TME中，Treg可以在如此恶劣的条件下存活并保持其免疫抑制功能。FOXP3通过抑制糖酵解和促进氧磷和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）氧化，因此，Treg可以利用乳酸作为能量来源。当肿瘤浸润性非Treg将丙酮酸转化为乳酸以产生NAD+以维持糖酵解时，TME中的Treg将丙酮酸转化为线粒体中的乙酰辅酶a以触发三羧酸循环，这为Treg提供了比其他T细胞更大的存活益处。此外，即使在低葡萄糖条件下，Treg还可以利用脂肪酸实现其增殖和免疫抑制功能。研究发现，胃癌中RHOA Y42突变通过上调脂肪酸合成酶（FASN）产生大量脂肪酸，导致TME中更多的Treg和更少的肿瘤浸润性CD8+T细胞。非炎症肿瘤的浸润机制虽然炎症肿瘤通常含有Treg，但有时在非炎症肿瘤中也检测到大量Treg，这表明炎症相关浸润以外的机制参与了Treg向TME的募集。研究发现，某些基因改变可以通过调节下游信号通路来修饰肿瘤细胞产生趋化因子。在肺腺癌中发现的EGFR突变通常与非炎症性肿瘤相关，在这些肿瘤中检测到大量的Treg，而不存在炎症细胞。EGFR突变通过抑制IFN调节因子1（IRF1）减少CXCL10的产生，这对CXCR3依赖的CD8+T细胞向TME的募集产生负面影响。此外，CCL22的产生通过EGFR下游信号中的JUN诱导而增加，导致CCR4依赖性Treg浸润到TME。在具有RHOA Y42突变的胃癌中也观察到类似的表型，RHOA Y42突变是一种功能缺失突变，通过抑制IRF1降低CXCL10/11水平。此外，粘着斑激酶的过度激活通过调节趋化因子的产生与Treg浸润和CD8+T细胞排斥相关。治疗相关的Treg积累放射治疗和CTLA-4阻断抗体等治疗可能促进肿瘤中Treg的积累，这被认为是一种适应性免疫抵抗机制。由于对辐射的敏感性低于其他淋巴细胞，因此即使在放射治疗后，Treg仍在TME中持续存在，可能导致某些类型癌症发生免疫抑制性TME。在临床前模型中，去除Treg可提高肿瘤对辐射的敏感性并抑制转移。在小鼠模型中，抗CTLA-4抗体通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）有效地去除Treg，而在患者中的作用机制仍存在争议。免疫组化分析显示，根据治疗前和治疗后活检样本的比较，抗CTLA-4抗体治疗后，Treg数量增加。因此，某些治疗干预可能会增强Treg浸润，从而影响后续治疗的疗效。-05-四、Treg作用的新机制新的代谢机制Tregs活化的核心是支持其生存和功能的脂质代谢的变化，这可由脂肪酸结合蛋白（FABPs）促进。此外，糖酵解和氧化代谢都有助于Tregs的扩增，因为肿瘤内Tregs在葡萄糖摄取方面的相对优势可能促进FA合成。Tregs表现出另外一种独特的代谢特征是线粒体代谢的增加。线粒体转录因子A（Tfam）和线粒体复合体III是维持Tregs免疫抑制功能调节基因表达所必需的。此外，Foxp3缺乏会导致mTORC2信号转导的失调，并增强有氧糖酵解和氧化磷酸化。值得注意的是，CD36在肿瘤内的Tregs中被选择性上调，作为一种中枢代谢调节剂。CD36通过PPARβ信号精细调节线粒体适应性，重编程Tregs以适应富含乳酸的TME。在抗PD-1治疗过程中，CD36靶向诱导了额外的抗肿瘤反应。肝激酶B1（LKB1）调节Tregs的代谢和功能适应度，并作为DCs免疫原性的关键抑制剂发挥作用。在Tregs中，LKB1的特异性缺失可导致一种以Th2型显性反应过多为特征的致命性炎症性疾病，不仅破坏Tregs的生存、线粒体适应度和代谢，还可诱导免疫调节分子的异常表达，包括PD-1和TNF受体超家族蛋白的GITR和OX40。新的遗传机制Helios可以增强人类胎儿CD4+幼稚T细胞向Tregs的优先分化，作为在炎症反应期间稳定Tregs的关键转录因子。肿瘤中Helios缺陷的Tregs获得效应T细胞功能，并通过上调对自身抗原具有高度亲和力的效应细胞因子来促进对癌症的免疫反应，如GITR/PD-1表达增加和对自身抗原的反应性增强。Foxp1是一种forkhead转录因子，Foxp1的缺失会导致Tregs的功能受损，TSDR、CNS2、CNS3均为Foxp3相关的作用元件，调控着Foxp3的表达和功能。YAP是Hippo通路的辅活化因子，在Tregs中高度表达，并促进Foxp3的表达和功能。TAZ是一种诱导Hippo信号转导的TEAD转录因子的辅激活因子，它通过减少组蛋白乙酰转移酶Tip60介导的Foxp3的乙酰化而减弱Tregs的发育。核受体Nr4a是维持Treg基因程序的关键转录因子，参与Treg介导的TME抗肿瘤免疫抑制。促自噬蛋白AMBRA1也是T细胞的一个关键调节因子。此外，SUMO特异性蛋白酶3（SENP3）介导的BACH2去SUMO化阻止BACH2的核输出，从而抑制与CD4+T效应细胞分化相关的基因，并稳定Treg特异性基因特征。新的分子机制在Tregs的分子机制方面也取得了一些新的进展。Tregs具有丰富的IL-2受体（IL-2R）表达，依赖于活化T细胞产生的IL-2，提示Tregs对IL-2的消耗与其抑制功能有关。并且IL-2R依赖的转录因子STAT5的激活在Tregs的抑制功能中起着重要作用。丝氨酸-苏氨酸激酶Mst1被鉴定为Tregs中IL-2-STAT5活性的信号依赖性放大器，Tregs中Mst1和Mst2的高活性对于防止肿瘤抵抗和自身免疫是至关重要的。在T细胞活化过程中，Tregs中Foxp3的磷酸化可以通过TAK1 Nemo样激酶（NLK）信号通路进行调节。另外，Tregs激酶TAK1的特异性缺失可以减少外周淋巴器官中Tregs的数量，而E3泛素化连接酶TRAF6缺乏的Tregs在体内功能紊乱。ST2被认为是IL-33的唯一受体，表达ST2的Tregs对IL-33有反应，并且在IL-33刺激下Tregs的百分比增加，特别是Foxp3+GATA3+Tregs。在结直肠癌（CRC）的小鼠模型中，肿瘤浸润的Tregs优先上调ST2，IL-33/ST2信号与肿瘤负荷呈正相关。激活的Tregs表面表达糖蛋白-A为主的重复序列（GARP），它结合并激活潜伏的TGF-β。此外，整合素α4β1的激活也可增加Tregs的抑制能力。Tregs稳态通过Tregs内在和外在机制与黏膜相关淋巴组织1（Malt1）功能密切相关。相比之下，CARD11-BCL10-MALT1（CBM）信号对于以Malt1蛋白酶依赖的方式介导Tregs的抑制功能至关重要。-06-五、Treg靶向治疗策略抗CTLA-4单克隆抗体，如ipilimumab，通过Treg靶向改善TME的免疫特征。然而，在临床研究中的详细作用机制仍然存在争议。在小鼠模型中，抗CTLA-4单克隆抗体诱导的抗肿瘤免疫反应完全依赖于通过Fc介导的ADCC对Treg的消耗。而在人类中，Treg的消耗与伊普利单抗抗肿瘤的主要疗效无关。此外，靶向肿瘤内Tregs高表达分子的双特异性抗体，如CTLA-4和OX-40或CTLA-4和GITR，它们可能通过有效地消耗体内的Treg来提高抗肿瘤疗效。由于肿瘤内Treg比其他效应T细胞表达更高水平的CD25，CD25可能是Treg耗竭的关键靶点。一些针对CD25的治疗策略已经被FDA批准。例如，IL-2与白喉毒素的融合蛋白denileukin diftitox用于皮肤T细胞淋巴瘤。denileukin diftitox可与表达CD25的细胞结合，并通过白喉毒素的细胞毒性作用杀死它们。新的抗CD25抗体RG6292被开发用于选择性地清除Tregs，而不会干扰效应T细胞中的IL-2信号，目前正在进行临床评估（NCT04158583）。靶向CD25的近红外光免疫治疗（NIR）也可能是肿瘤局部Treg去除的一种有希望的方法。此外，还开发了ADCT-301，一种抗CD25的抗体偶联药物，用于靶向表达CD25的淋巴瘤。它业可作为另一种在肿瘤中去除Tregs的选择，目前正在进行临床试验（NCT03621982）。     通过Tregs表达的外核苷酸酶CD39和CD73靶向腺苷途径也可能是增强抗肿瘤免疫的一个有希望的靶点。阻断外核苷酸酶活性的抗CD39和抗CD73抗体，如TTX-30、MEDI9447和BMS-986179，目前正在进行临床试验（NCT03884556、NCT03742102和NCT02754141）。除了抑制腺苷的产生外，腺苷受体A2AR的小分子抑制剂也可防止腺苷依赖性T细胞抑制。这些抑制剂的临床试验正在进行中（NCT02655822、NCT04089553和NCT02403193）。此外，靶向VEGFA-VEGFR2轴可能通过减少TME中的Treg增殖和浸润来激活抗肿瘤反应。已经证明，抗VEGFR2抗体ramucirumab可以减少胃癌患者eTreg的增殖。以FOXP3为靶点的疗法也有开发。AZD8701是FOXP3的反义寡核苷酸，在体外实验和人源化小鼠模型中部分降低了FOXP3及其下游转录分子的表达。AZD8701的临床试验正在进行中（NCT04504669）。抗CCR4抗体mogamulizumab可减少实体瘤患者中CCR4+Treg的数量。在一项临床试验中，mogamulizumab联合抗PD-1抗体（nivolumab）治疗的患者中证实了Treg的缺失，这表明该组合是癌症免疫治疗组合中一个有希望的选择。由Treg高度表达的免疫检查点分子，如OX40、GITR和ICOS，也可能成为治疗靶点。一些研究表明，这些受体的刺激降低了Treg的免疫抑制功能，导致效应T细胞的激活。作为OX40激动剂的抗体，如MEDI6469134（NCT02274155），GITR，如MK-4166135（NCT02132754），以及ICOS，如KY1044136（NCT03829501），目前正在开展临床研究。-07-结语在炎症和非炎症肿瘤中，TME中Treg浸润、激活和存活的多种机制都已被揭示，影响TME中Treg浸润、激活和存活的机制可能因患者而异。肿瘤细胞中的基因改变不仅决定免疫原性和炎症状态，而且也有助于调节TME中的免疫细胞浸润和生存，例如基于趋化因子的Treg浸润和基于代谢变化的Treg激活，这些都可以被特异性激酶抑制剂靶向。因此，TME中主要导致Treg浸润的机制需要通过基于基因改变的免疫学和代谢谱来表征，并以精准免疫治疗为目标。基于机制的Treg靶向治疗有望改善目前的免疫治疗。参考资料：1.Development of Bispecific Antibody for CancerImmunotherapy: Focus on T Cell Engaging Antibody. Immune Netw. 2022 Feb; 22(1): e4.2. A pivotal decade for bispecific antibodies?. MAbs. 2024 Jan-Dec;16(1):2321635.公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

-01-引言RAF激酶家族是促肿瘤有丝分裂原活化蛋白激酶途径的关键激活剂。RAF激酶家族中的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶（ARAF、BRAF和CRAF）通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径向下游传递信号，以调节参与控制各种细胞机制的基因转录。RAF蛋白，特别是BRAF和CRAF的过度激活，在许多类型的癌症中驱动肿瘤进展和耐药性。BRAF突变导致组成型激酶激活，可在多种癌症中检测到，最显著的是甲状腺癌、黑色素瘤和结直肠癌。目前，有许多获批的针对BRAF突变肿瘤的BRAF靶向疗法，通常与MEK抑制剂联合使用，以最大限度地抑制MAPK通路并延缓耐药性。此外，KRAS抑制剂的发现和批准，也在临床试验中显示了极具前景的结果。然而，尽管已经有了BRAF V600和KRAS G12C突变癌症的治疗策略，但仍有许多MAPK活化癌症患者没有明确的靶向治疗策略。最近，人们越来越关注癌症中的RAF1的突变，其编码CRAF。在MAPK通路改变的肿瘤中，CRAF正在成为对MAPK靶向治疗耐药的关键分子。随着下一代测序在临床上的应用越来越广泛，致癌的RAF1改变在患者肿瘤中越来越多地被发现，专门针对这类致癌突变的药物正在出现，有望在临床上得到应用。-02-CRAF的结构和活化CRAF是一种75kDa的蛋白激酶，在哺乳动物组织中广泛表达。RAF蛋白家族共有三个保守区：CR1、CR2和CR3。CR1包含RAS结合结构域（RBD）和富含半胱氨酸的结构域（CRD），它们结合RAS。CR2结构域包含14-3-3蛋白相互作用结构域和一个重要的抑制性磷酸化位点（S259），该位点将CRAF维持在自动抑制状态。CR1和CR2位于CRAF的N-末端调控区。C末端CR3包含激酶结构域和14-3-3的额外结合位点（S621）。CR3中含有几个激活磷酸化位点，并被不同的激酶靶向以激活CRAF。CRAF激酶活性的调节是一个复杂的过程，涉及几种蛋白-蛋白相互作用及其细胞定位和磷酸化状态的变化。在失活状态下，CRAF在细胞质中以单体、自动抑制状态存在。抑制状态由CRAF上的几个抑制性磷酸化位点维持：S43的磷酸化通过空间位阻阻断CRAF与RAS的结合，S233和S259的磷酸化将蛋白复合物14-3-3募集到CR2，阻止CRAF与质膜的结合。在有丝分裂信号的下游，当RAS被激活时，它触发CRAF向质膜的募集，随后激活。RAS对RBD具有高亲和力，但CRAF激活需要RAS与CRD的额外相互作用。此外，CRD与质膜中的磷脂相互作用，有助于从抑制状态释放，并稳定与RAS的相互作用。在这个过程中，RAS从pS259置换14-3-3，使其可接近蛋白磷酸酶1（PP1）和/或蛋白磷酸酶2A（PP2A），介导其去磷酸化。RAS结合还诱导CRAF的构象变化，释放N-端和C-端结构域之间的内部自抑制相互作用，促进CRAF的“开放”构象，并通过多种激酶促进C-端催化结构域中激活位点的磷酸化，包括S338、Y341、T491和S494。此外，CRAF活化还涉及二聚化。目前的证据表明，野生型RAF蛋白需要RAS和募集到质膜进行二聚化，一些致癌BRAF突变体在细胞质中以RAS独立和组成的方式与CRAF异二聚化。-03- CRAF的致癌作用RAF1已被表征为人类致癌基因，CRAF蛋白的过度激活是上游信号蛋白（如RAS和生长因子受体）致癌激活肿瘤的常见特征。CRAF的典型致癌作用是由MAPK通路信号传导介导的，这通常与其激酶活性和激活周期有关。许多研究已经证明CRAF在多种癌症背景下调节ERK磷酸化的能力。在这些情况下，CRAF最终通过下游激活pERK的许多促肿瘤靶点来促进癌症的发生和发展。除了这种典型途径外，CRAF还可以以不涉及其激酶活性的MAPK独立方式促进癌细胞的存活、增殖和迁移。CRAF的激酶非依赖性作用首次在对Raf1敲除小鼠的研究中得到证实。CRAF在胚胎发生、血管形成和细胞存活过程中具有重要的激酶非依赖性作用。试验表明，CRAF在调节细胞凋亡中具有与MAPK通路无关的功能。CRAF可以转移到线粒体，在那里它磷酸化并失活促凋亡蛋白BAD。此外，CRAF可以直接结合并抑制促凋亡蛋白ASK-1和MST-2。CRAF还可以通过不同的机制调节细胞周期的进展。CRAF与肿瘤抑制因子RB相互作用并促进E2F的释放。CRAF还通过在G2/M转变期间在中心体和有丝分裂纺锤极与极光激酶a和极样激酶1（PLK1）的相互作用促进小鼠胚胎成纤维细胞和人类结直肠癌细胞系HCT116中的有丝分裂进展。RAS原癌基因家族（主要是KRAS、NRAS和HRAS）内的激活突变发生在约30%的所有癌症患者中，并导致MAPK和PI3K信号通路的组成性激活。尽管BRAF是野生型RAS下游的主要RAF亚型，但多项研究表明，RAS突变癌症将这种依赖性转变为CRAF。此外，体外研究表明，不同的RAS亚型具有不同的激活CRAF的能力。KRAS G12V比HRAS G12V106更有效地诱导CRAF向质膜的募集和下游MAPK途径的激活。CRAF结合亲和力和下游ERK磷酸化在不同的RAS突变体中具有广泛的可变性，这表明RAS突变可以通过MAPK依赖性和MAPK非依赖性的方式诱导肿瘤的发生和转移。即使在具有野生型RAS的肿瘤中，CRAF也是肿瘤进展所必需的。在缺乏RAS突变的人类肾细胞癌（RCCs）中，在55%的病例中观察到CRAF的过度磷酸化，表明CRAF在这种癌症类型中的主要致癌作用。类似地，RAF1过表达还发生在50%的人肝细胞癌（HCC）中，并与CRAF活性增加有关。-04-CRAF的致癌改变目前，已在癌症患者中鉴定出肿瘤原性RAF1改变（扩增、融合和突变）。这些改变发生的频率低于致癌的BRAF改变，但在患者的肿瘤中越来越多地被发现。因此，有必要表征RAF1的各种变化，以进一步了解致癌CRAF的生物学效应和潜在的治疗意义。RAF1的扩增在膀胱癌中最常见，在黑色素瘤、乳腺癌、胃食管癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肝细胞癌和嗜铬细胞瘤中也观察到一定频率。RAF1融合最常见于毛细胞星形细胞瘤亚群和0.5-1%的前列腺癌、黑色素瘤和胰腺癌。在毛细胞星形细胞瘤中，SRGAP3–RAF1融合最常见；在前列腺癌中，常见ESRP1–RAF1融合。所有的RAF1融合都失去了CRAF的N末端自身抑制结构域，并将致癌C末端结构域与由高表达启动子调控的基因偶联，导致融合蛋白的过表达。RAF1的激活突变发生频率（~0.7%）远低于激活BRAF突变（~8%）。这种差异可能归因于CRAF的基础激酶活性低于BRAF。最常见的致癌RAF1突变是S257L，其次是密码子S259和P261的突变。这三个突变体聚集在CR2中，导致关键的自身抑制位点S259的磷酸化显著降低。此外，CRAF的蛋白激酶结构域内还有多个额外的复发致癌突变，包括R391、G361和E478。除了CR2和蛋白激酶结构域的突变外，在人类肿瘤中还发现了其他RAF1突变，如K106R和L613V。-05-CRAF在治疗反应中的作用新出现的证据表明，CRAF代表了对许多MAPK靶向疗法的治疗耐药性的关键节点。事实上，BRAF依赖性肿瘤可以转变为CRAF依赖性，作为对BRAF靶向治疗的抵抗机制。多个致癌RAF1突变（G361A、S257P、P261T和R391W）已被证明对BRAF V600E抑制剂vemurafenib具有耐药性。截短的RAF1通过与RAF1融合相同的机制，在体外显示出在癌症细胞中赋予对MET靶向治疗和EGFR靶向治疗的耐药性。这可能是由于截短的RAF1介导的MAPK通路的过度激活。RAF1融合和突变也与对新型KRAS G12C抑制剂的耐药性有关。通过多种机制维持CRAF激活是所有KRAS G12C抑制剂抗性细胞系的共同特征。KRAS G12C抑制剂已被批准用于治疗KRAS G12C-突变型肺癌，随着KRAS抑制剂在临床开发中的进展以及BRAF和MEK抑制剂越来越多地用于更广泛的癌症类型，CRAF介导的对MAPK抑制剂的耐药性将在临床实践中变得越来越普遍。需要进一步的研究来测试和开发治疗策略，最大限度地减少CRAF介导的MAPK抑制剂耐药性，并为新发或获得性CRAF依赖性肿瘤开发最佳疗法。-06-CRAF突变肿瘤的潜在治疗策略直接抑制致癌驱动因素的改变通常是癌基因驱动肿瘤最有效的靶向治疗策略。泛RAF抑制剂是一类新的MAPK抑制剂，可以抑制野生型和突变型BRAF以及野生型CRAF。因此，这些泛RAF抑制剂代表了靶向RAF1改变肿瘤的有前景的新疗法。与BRAF抑制剂（如vemurafenib）不同，泛RAF抑制剂不会在BRAF野生型或RAS突变细胞中引起MAPK途径的异常激活。此外，与前几代激酶抑制剂如索拉非尼和瑞戈非尼相比，泛RAF抑制剂是CRAF和BRAF的更特异性抑制剂。目前，许多新型泛RAF抑制剂正处于早期临床开发阶段，用于治疗RAS或BRAF突变肿瘤。这些泛RAF抑制剂中的大多数目前也在评估是否与其他靶向疗法，如MEK、ERK、EGFR和CDK4/6抑制剂或免疫疗法（抗PD1单克隆抗体）联合使用。最近报道了泛RAF抑制剂纳波拉非尼和MEK抑制剂曲美替尼联合应用的I期试验结果，该试验在NRAS突变黑色素瘤患者中具有良好的抗肿瘤活性。-07-结语CRAF是一种蛋白激酶，它的突变和过度激活驱动癌症的进展和治疗耐药性。临床实践中越来越多地发现癌症患者中的RAF1改变，但目前，对于RAF1改变的肿瘤，还没有标准的治疗方法。然而，幸运的是，有大量新的临床前和临床证据表明，多种新的靶向治疗方法与MAPK通路抑制剂的新组合对RAF1改变的肿瘤具有疗效。这些新抑制剂的可用性和有效性突出了CRAF作为癌症治疗靶点的潜力。参考资料：1.  The role of CRAF in cancer progression: from molecular mechanisms to precision therapies. Nat Rev Cancer. 2024 Jan 9.公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

引言 真核生物的细胞核是一个高度有序的场所，首先染色质在细胞核内并非杂乱无章的排列，而是存在于相对特定的区域；其次染色质通常来说可以分为异染色质和常染色质，常染色质因其开放的状态允许转录因子的结合使得基因得以表达，而异染色质由于紧密的核小体组装和相关蛋白的结合阻止了基因的表达。常染色质和兼性异染色质在不同的细胞和发育阶段是可以相互转换的，染色质状态的转换依赖于特定的染色质结合因子的调控，例如Polycomb家族蛋白、组蛋白去乙酰化酶（HDACs）、组蛋白乙酰基转移酶（HATs）和组蛋白甲基转移酶等。Clr3是一种II类HDACs，在酵母的异染色质转录沉默中发挥关键作用。Clr3通过与Snf2形成SHREC复合物，通过HP1依赖和非依赖的机制被导向异染色质，从而选择性地去乙酰化H3K14【1-3】。高水平的Clr3与异染色质结合，防止组蛋白周转（turnover），有助于维持H3K9me3密度阈值，支持异染色质表观遗传抑制的形成【4】。尽管Clr3去乙酰化功能在稳定核小体、引发异染色质转录沉默以及传递表观遗传信息中的重要性已被广泛研究，但是其抑制组蛋白周转的具体机制仍不明确。 近日，来自美国国立卫生研究院的Shiv I.S. Grewal在Molecular Cell上发表了论文Nucleosome remodeler exclusion by histone deacetylation enforces heterochromatic silencing and epigenetic inheritance。在本研究中，作者细致的探讨了组蛋白去乙酰化酶、染色质重塑因子、组蛋白甲基转移酶等在调控异染色质稳定性和核小体周转中的作用，其中异染色质区域的高水平HDACs可维持组蛋白低乙酰化，从而确保稳定的基因沉默和表观遗传，但当HDAC功能出现缺陷后，SWI/SNF等重塑因子通过抑制组蛋白甲基转移酶的功能来破坏异染色质的稳定性，改写基因沉默的状态。 前期研究发现缺乏Clr3的HDAC活性导致组蛋白周转增加，进而降低H3K9me3水平并影响异染色质的延伸。由于染色质重塑复合物参与核小体的去组装，因此作者推测这些因子可能介导了Clr3缺失导致的异染色质不稳定。为了验证这一推测，作者在clr3D232N缺陷酵母中分别突变了几种重要的染色质重塑因子。研究发现，RSC和SWI/SNF的亚基被突变后，可以恢复由Clr3缺陷导致的基因表达变化，基因沉默得到明显增强，H3K9me3的结合和延伸均恢复至正常状态。这些结果表明，在缺失Clr3去乙酰化酶功能的情况下，RSC和SWI/SNF重塑因子会破坏异染色质的稳定性。 接下来，作者研究了Clr3存在的情况下是如何阻止RSC和SWI/SNF重塑因子对异染色质稳定性的破坏。研究结果表明，组蛋白乙酰化可以作为重塑因子的结合信号，促进RSC和SWI/SNF接近异染色质区域，但是当Clr3存在时，它的HDAC活性有效的去除了异染色质区域的组蛋白乙酰化水平，因此阻止了染色质重塑因子对异染色质区域的结合。此外，作者还发现SWI/SNF和RSC对于Clr3缺陷介导的组蛋白周转增加也至关重要。 组蛋白乙酰化水平是由HATs和HDACs的活性动态调控的，因此作者进一步研究了HATs在上述发现中的作用。研究发现，将组蛋白乙酰基转移酶Mst2与chromodomain融合表达靶向结合在异染色质区域，可以增强染色质重塑因子对异染色质区域的结合，并且抑制异染色质修饰H3K9me3在Mst2结合区域的延伸。这些结果表明HATs增加了组蛋白乙酰化的水平，从而促进了染色质重塑因子诱导的异染色质不稳定性。为了更加证实SWI/SNF重塑因子的作用，研究人员利用同样的方法将SWI/SNF重塑因子的两个亚基靶向结合在异染色质区域。结果表明，虽然HATs有助于靶向重塑因子以破坏异染色质的稳定性，但这种作用可以通过直接将SWI/SNF靶向结合在异染色质区域而被绕过，SWI/SNF可以破坏核小体的稳定性，从而导致H3K9me3水平和基因沉默的缺失。 文章的最后，作者探究了染色质重塑因子是如何影响异染色质的表观遗传和延伸的。通过引入TetR-Clr4（组蛋白甲基转移酶）和CAS序列在异位建立异染色质区域，然后使用Cre-lox系统表达不同形式的SWI/SNF亚基Snf5。研究结果表明，表达靶向异染色质的Snf5会阻碍异染色质的表观遗传信息传播，而这是通过抑制Clr4的读写机制影响了H3K9me3修饰的延伸。 模式图（Credit: Molecular Cell） 参考文献 1. Sugiyama, T., Cam, H.P., Sugiyama, R., Noma, K., Zofall, M., Kobayashi, R., and Grewal, S.I.S. (2007). SHREC, an effector complex for heterochromatic transcriptional silencing. Cell 128, 491–504. 2. Bjerling, P., Silverstein, R.A., Thon, G., Caudy, A., Grewal, S., and Ekwall, K. (2002). Functional divergence between histone deacetylases in fission yeast by distinct cellular localization and in vivo specificity. Mol. Cell. Biol. 22, 2170–2181. 3. Wire ́ n, M., Silverstein, R.A., Sinha, I., Walfridsson, J., Lee, H.M., Laurenson, P., Pillus, L., Robyr, D., Grunstein, M., and Ekwall, K. (2005). Genomewide analysis of nucleosome density histone acetylation and HDAC function in fission yeast. EMBO J. 24, 2906–2918. 4. Ayg€ un, O., Mehta, S., and Grewal, S.I.S. (2013). HDAC-mediated suppression of histone turnover promotes epigenetic stability of heterochromatin. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 547–554. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.07.006 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述