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这篇文章于2025年发表在Stem Cells，本文全面概述了当前肿瘤类器官整个工作流程（从采样和培养到药物筛选）的高通量解决方案。此外还探索了可以控制和优化单细胞制备、类器官培养和药物筛选的各种技术，最终目标是确保培养系统的自动化和高效率，并确定更有效的肿瘤治疗药物。摘要：肿瘤类器官已成为患者来源组织的理想体外模型，因为它们在一定程度上概括了源肿瘤组织的特征，为个性化肿瘤治疗提供了潜力，并在药物研发中显示出巨大的前景。然而，建立和应用该模型涉及多个劳动密集型和耗时的实验步骤，并且缺乏标准化的协议和统一的识别标准。因此，高通量解决方案对于肿瘤类器官模型的广泛采用至关重要。本综述全面概述了当前肿瘤类器官整个工作流程（从采样和培养到药物筛选）的高通量解决方案。此外，我们探索了可以控制和优化单细胞制备、类器官培养和药物筛选的各种技术，最终目标是确保培养系统的自动化和高效率，并确定更有效的肿瘤治疗药物。1.背景介绍合适的体外疾病模型对于未来的研究至关重要。基于三维（3D）细胞培养技术的肿瘤类器官培养系统已成为一种很有前途的肿瘤模型，能够模拟人体内肿瘤的生长和发展。该系统利用体内基质类似物形成的3D支架来概括体内肿瘤微环境（TME）;这是通过向从患者来源的手术、穿刺组织或体液样本中获得的肿瘤细胞中添加各种生长因子和小分子抑制剂来实现的。这种方法能够诱导和培养具有肿瘤特性的类器官。肿瘤类器官培养系统表现出源组织的高可复制性和稳定性，使其成为迄今为止最好的体外 3D模型。患者来源的类器官形成异质微结构。异质性有助于研究人员研究肿瘤发展的机制并进行药物筛选和疗效评估。 然而，肿瘤类器官培养系统的建立和应用受到实验作复杂、时间和人力成本昂贵以及缺乏标准化流程和统一鉴定规则的阻碍。这些限制强调了对高通量解决方案的需求，以促进肿瘤类器官模型的广泛采用。与其他肿瘤模型相比，类器官具有快速培养和有效模拟器官发生及其生理和病理状态的优势。为了最大限度地发挥这些优势，在培养过程中需要一系列高通量解决方案，以提高准确性和效率。肿瘤类器官作涉及几个可以高通量方式解决的关键步骤，包括生物样本处理、图像采集、药物筛选和细胞活力评估。本综述旨在全面概述用于肿瘤类器官培养的高通量解决方案，并讨论其应用、局限性和未来前景。这些关键步骤的高通量解决方案可以更精确地控制和优化类器官培养过程的关键方面，例如单细胞制备、细胞培养和药物筛选。这种方法提高了培养系统的效率，对发现更有效的肿瘤疗法具有重要意义。2.肿瘤类器官培养技术及应用类器官培养技术是体外3D培养技术的延伸，其关键区别在于提供了自我更新的条件，支持干细胞的自我维持和分化，从而更好地模拟人体的生理环境。值得注意的是，类器官可以维持细胞的生理功能，包括增殖、凋亡和分化。相比之下，传统的2D培养仅限于形成细胞单层，无法复制人体组织的3D结构，细胞在传代过程中往往会失去原有的生理功能。不同物种和品系的动物模型表现出不同的生理特征和反应，但受到高异质性和高成本的阻碍。相反，肿瘤类器官来源于患者来源的肿瘤组织。培养这些类器官涉及添加对相应癌症类型具有特异性的生长因子，从而建立一个概括体外微环境的体外肿瘤模型。这种方法不仅可以直接再现肿瘤的生长过程，还可以单独再现源肿瘤组织的特征，使肿瘤类器官模型能够更准确地捕捉个体间差异，为个性化肿瘤治疗提供基础。肿瘤类器官培养系统包括基质凝胶和维持类器官生长和活力的生长因子混合物。基质凝胶主要由胶原蛋白、巢蛋白、层粘连蛋白和其他成分组成，用作肿瘤细胞的3D支架，概括了天然细胞外基质（ECM）的关键特性，例如纤维组成、渗透性、空隙大小和机械稳定性。这种仿生环境能够在体外复制复杂的细胞-细胞和细胞-ECM相互作用，为支架上的细胞聚集、增殖和迁移提供理想条件，从而准确模拟人体的内部环境。除了使用基质凝胶外，肿瘤类器官模型的成功构建还依赖于补充特异性生长因子和小分子抑制剂（图1）。例如，肺癌类器官需要在培养基中添加表皮生长因子（EGF）以促进类器官增殖，而R-Spondin-1、Noggin和其他因子是维持干性所必需的。此外，成纤维细胞生长因子7（FGF7） 和FGF10是促进干细胞向细胞谱系远端分化所必需的。培养系统的另一个重要组成部分是小分子抑制剂，例如抑制上皮-间充质转化的A83-01和SB202190，它通过靶向丝裂原活化蛋白激酶信号通路来抑制细胞分化。值得注意的是，添加这些因子比使用血清更费力，而且由不同组织来源构建的类器官所需的特定因子并不相同，需要根据每个组织的特性进行调整。图1：类器官培养系统。根据肿瘤细胞的来源，需要向肿瘤类器官培养基中添加不同的细胞因子组合（例如，R-Spondin-1、Noggin、FGF7、FGF10、EGF、Wnt-3a、Y-27632、烟酰胺、N-乙酰-L-半胱氨酸、A83-01 和 SB202190）以促进或抑制参与类器官形成的信号通路以获得所需的类器官。建立类器官涉及一系列步骤，包括采样、培养和后续评估。肿瘤组织通常从手术标本、穿刺活检和内窥镜活检中获得，突出了构建类器官模型只需要最少数量的细胞的优势。值得注意的是，在组织采样和运输过程中存在污染风险，因此需要在样品管中添加抗生素，例如青霉素-链霉素。加工的初始步骤包括将肿瘤组织酶消化成单细胞，通常通过包括胶原酶、DNAase和透明质酸酶的方案。随后将消化的悬浮液离心以获得细胞沉淀，然后用红细胞裂解物处理以产生肿瘤的单细胞悬浮液。接下来，将单细胞悬液与基质凝胶混合并接种到孔板中，然后加入肿瘤类器官培养基。然后通过多种方法鉴定培养的类器官。首先，在细胞水平上评估细胞形态、排列和结构，以确定肿瘤类器官和源组织之间的一致性。其次，使用特异性抗体进行免疫组织化学染色来识别蛋白质水平肿瘤标志物的表达。第三，利用高通量测序技术在基因水平上分析基因表达谱和基因突变。最后，通过比较肿瘤组织和类器官对化疗药物的反应，评估肿瘤类器官在药物筛选和治疗策略开发中的效用（图2）。图2：类器官培养过程。将患者来源的肿瘤组织（手术、组织活检）或液体活检标本经过一系列处理后制成单细胞悬液，并根据一定数量的细胞制作种子板。当类器官形成时，可以进行药物敏感测试以观察细胞活力，并且可以进行数据收集和分析。类器官培养方案的标准化对于确保实验结果的可靠性至关重要。在肿瘤类器官培养系统的背景下，从单细胞采集到类器官培养、药物筛选和验证，每一步都必须遵守标准化作程序（SOP）。这种方法包括实验室前准备、实验室方案和实验室后处理。肿瘤类器官模型的构建大致可分为以下阶段：肿瘤组织消化和解离、分离的肿瘤干细胞与基质凝胶混合、将它们接种在孔板中，以及添加富含细胞因子的培养基以促进类器官生长。这个过程需要大量的劳动力和时间成本，从而限制了类器官的适用性。肿瘤类器官培养的第一步涉及确定合适的细胞来源。肿瘤细胞可以来自患者样本、细胞系或干细胞。纯化的肿瘤细胞通过消化、分离和培养获得。然而，这个过程充满了挑战。不同癌症类型的消化时间差异很大，例如，乳腺肿瘤组织由于其纤维含量高，需要4-6小时，而胃肠道肿瘤可以在1-2小时内消化。此外，不同的癌症类型需要不同的消化酶系统。这些因素给研究人员带来了障碍，包括消化组织的等待时间延长、过度消化导致的细胞活力低以及消化不足，这会阻碍单细胞悬液的产生，从而影响下游实验。这些挑战的出现凸显了对一种能够产生单细胞悬液的简化、高效和可靠的消化方法的需求。细胞培养需要精确控制细胞密度和分布，以确保肿瘤细胞的增殖。细胞计数和活力评估对于确定生成单细胞悬液后的活细胞数量是必要的。然后将相应的培养系统基质凝胶与单细胞悬液混合并接种在孔板中。虽然这个过程相对简单，但仅通过体力劳动在短时间内产生大量类器官，同时保持对每个类器官球体质量的控制是具有挑战性的。这种限制在高通量药物敏感性检测中尤为明显，其中在384孔板或更高通量规格中接种类器官需要自动化机器。随后，建立了类器官培养系统，其中细胞悬液接种在3D基质中，以模拟肿瘤的体内生长环境并诱导类器官形成。评估药物对肿瘤类器官的影响需要多方面的方法，包括药物制备、药物筛选和数据分析。药物制备过程包括选择、溶解和稀释药物，以确保其质量和浓度满足实验要求。药物筛选包括用药物治疗肿瘤细胞并观察其疗效和毒性等参数。数据分析涉及组织和分析实验数据，以阐明药物的潜在机制及其治疗效果。培养和标准化的困难困扰着传统的类器官培养。此外，大小和形状可变的类器官生产通常既耗时又昂贵，这使得大规模生产成为一项重大挑战。因此，高通量和自动化作是在标准化、减少劳动力和降低成本方面实施类器官培养进步的关键解决方案。为了确保类器官培养的整个过程以高精度和高效率进行，必须设计高通量解决方案，同时考虑自动化、高通量和可重复性等因素。此类解决方案的示例包括使用微流体技术进行类器官植入，用于药物治疗和检测的自动化机器人，用于细胞状态分析的高分辨率成像，以及用于结果处理的数据分析软件。通过实施高通量SOP，可以最大限度地减少实验误差和不确定性，并提高实验的可信度和可重复性。3.当前离体类器官培养涉及的底物技术和适用于各种应用的高通量解决方案目前正在研究高通量解决方案，以减轻类器官培养过程中的劳动密集型和关键步骤。这些解决方案大致可分为分离和培养、药物筛选和活性评估。这些解决方案的形式包括集成高通量功能的设备、方法和软件。高通量设备和方法包括自动化样品处理设备、微流体、器官芯片、3D打印技术和高内涵成像系统。High-throughput软件可以快速准确地获取和分析大量的实验数据，从而提高数据处理的效率和准确性。特别是成像系统，可以同时获取各种类型的生物信息，如细胞形态、荧光强度和细胞活性，从而更全面地了解药物对肿瘤细胞的作用机制和疗效。微流体是指在数十到数百微米的通道中处理微量流体（10-9-10-18 l）的系统技术。该技术有四个主要应用：分子分析、生物传感、分子生物学和微电子学。在生物学和医学中，微流体技术在细胞培养、单细胞分析和临床诊断中发挥着越来越重要的作用。微流体技术在生物学研究中的应用可以显著减少样本量，从而降低实验成本，实现生物样本的快速和高通量检测，最大限度地从少量样本中收集更多信息，创建更好的人体生理病理环境模拟，并促进更深入和全面的研究。例如，循环肿瘤细胞（CTC）的数量可以表明肿瘤的恶性程度和转移风险;然而，外周血中CTC的稀缺阻碍了它们的应用。尽管如此，随着微流控技术的不断发展，已经出现了几种基于微流控的CTC捕获技术。值得注意的是，Jinho Kim等人构建了一种微流控装置（SIM-Chip），它可以从全血中富集CTC并识别和分离它们。类器官微流控技术将类器官和微流体技术集成在一起，通过在微流控芯片上设计微通道和反应单元来实现类器官的体外培养和模拟。该技术利用微流体设备和计算软件精确控制微环境，模仿 TME来研究肿瘤间充质相互作用。微流体技术有助于将细胞、药物和营养物质精确、及时地输送到癌细胞。此外，微流体技术允许自动控制液体输送速度、浓度和持续时间，从而能够使用药物混合物和营养物质进行动态筛选。类器官微阵列是一种基于微流控的类器官培养平台，可模拟体内TME，从而能够研究肿瘤生长和转移。这项技术需要在后续实验和分析之前构建微流体通道和细胞培养室。此外，3D打印技术可以与微流体相结合，创造创新的解决方案。3D打印技术是一种增材制造方法，通过堆叠层从计算机模型数据制造 3D物理对象。3D打印技术的出现为微流体提供了新的可能性。首先，3D打印技术为微流控芯片制备的标准化和大规模生产提供了广阔的前景。其次，3D生物打印技术能够精确控制细胞和生物材料的分布，更好地模拟生物组织的复杂微观结构。3D生物打印技术可以创建高分辨率的微结构，以准确再现TME的复杂特征。此外，这些3D打印模型可用作肿瘤生物学中多功能研究和应用的临床前模型。通过将3D打印技术与微流控相结合，可以快速构建许多稳定的肿瘤类器官模型，最大限度地发挥类器官模型的优势。高内涵筛选（HCS）是一种基于成像的分析方法，它利用自动成像和数据分析在单细胞水平上提供具有高分辨率、高通量和高信息含量的无偏倚多参数数据。HCS能够在各个水平（包括细胞和分子水平）捕获图像和提取信息，从而可以检测基因表达、蛋白质定位和形态的变化。类器官培养完成后，可以采用高内涵成像技术，包括通过自动高通量摄影（例如高速显微镜成像）获取类器官数据。HCS的主要功能是以更少的单元、更短的时间和更高的吞吐量快速获取大量数据，同时减少劳动力消耗。该技术可以收集多通道数据，包括细胞形态、状态、数量和功能信息。此外，HCS可以与药物输送装置集成，以实时观察细胞对药物的即时反应。近年来，人工智能（AI）技术大幅发展。在医疗领域，人工智能可以促进药物的设计并有助于癌症检测、诊断和治疗优化等应用。高通量实验和AI技术在医学中的整合越来越受到关注。AI可以在生成肿瘤类器官的整个过程中得到利用，从构建到应用。基于AI的自动化可以帮助形成稳定的类器官球体。结合图像识别和数据分析的智能算法可以快速分析实验结果并得出结论。各种基于AI的图像识别算法也可以实现类器官的高通量应用。配备AI模块的智能分析系统可以根据收集的数据类型和分析目的选择合适的数据分析方法。表1总结了高通量底物技术的特点、优点和缺点。表1. 肿瘤类器官培养系统中的高通量底物技术4.类器官培养过程的高通量解决方案高通量技术在组织解离中的应用将患者来源的肿瘤组织团解离成单细胞是肿瘤类器官培养的关键初始步骤。此步骤可确保收获的单细胞的数量和活力，并为后续实验提供稳定的数据源。已经开发了全自动组织处理器和单细胞悬液制备仪器等仪器，以促进单细胞的高通量自动收获。这些仪器可以通过机器研磨和酶促反应将人类肿瘤组织制备为单细胞。组织解离剂结合了机械研磨和酶消化，可以从组织中分离单细胞悬液，并将组织块制备为匀浆。这些仪器利用自动化系统来定制应用，例如温度、时间和速度，以实现标准化过程作和更轻松的样品处理。这些仪器的优点包括提高精度和效率以及减少细胞损伤。该仪器可同时处理多达8种不同的组织和样品，样品量从20毫克到4000 毫克不等，并且易于作。例如，只需将组织样品放入分离管中，通过隔膜封闭的孔添加酶和其他溶液，并设置所需的程序，即可使机器通过研磨过程自动处理组织样品，从而获得高质量的单细胞悬液或亚细胞材料。例如，Jungblut等人使用仪器成功地将小鼠肺组织加工成高质量的单细胞悬液。自动化组织样本采集是肿瘤类器官培养的另一个重要方面。使用机器人辅助技术或自动采样设备可以有效地收集和处理大量样品。实施自动化组织采集系统和机械臂辅助作可以提高样本采集的速度和准确性。此阶段用于组织处理的仪器可以满足其中的大部分需求。随着人工智能技术的飞速发展，组织的自动化处理也将越来越智能化和个性化。未来，该过程可能不只涉及简单的消化，还涉及消化过程中的自动传感装置，以实时自动调节温度、酶浓度和其他条件，这是一个值得的未来研究方向。高通量技术在类器官植入中的应用类器官培养是模拟肿瘤发展过程的关键步骤。然而，类器官培养过程中的手动作会导致单个类器官液滴的组成、形态和功能发生显着变化，这可能会影响最终的实验结果。此外，手动培养的效率有限，因此在短时间内制备大量类器官具有挑战性。相比之下，将自动化和标准化引入高通量培养系统，例如基于微流体技术的自动化类器官培养平台，可以标准化和均质化每个类器官，从而实现类器官的单分散和高通量培养。这种方法可以更好地模拟肿瘤的恶性表型和转移能力。自动化细胞培养和监测可以显著提高肿瘤类器官培养的效率和准确性。例如，使用微量滴定板和自动化设备进行类器官培养和检测可以简化流程，确保一致性和可重复性。Jiang etal.开发了一个自动化类器官平台，集成了微流体连接的3D打印技术，能够通过自动化作快速制造和培养正常组织和肿瘤类器官。在这项研究中，将原代组织来源的细胞与基质凝胶混合，并将所得细胞悬液注入微流控系统中，通过微流控液滴打印机产生均匀的细胞负载基质凝胶液滴。液滴在微流体管道内糊化，以高通量产生均质的类器官前体。然后将这些前体打印到96孔板中，这种设计有助于在培养过程中对类器官进行高通量成像表征。值得注意的是，这些类器官前体在1周内以更低的成本和更短的时间成功培养，并已准备好进行药物测试。结果表明，通过这种方法制备的肿瘤类器官表现出81%的预测准确性，表明在模拟患者肿瘤对抗癌药物的反应方面具有高度的可重复性。Du etal.利用基因工程人类结肠类器官建立了一个小型化3D类器官培养平台，实现了高通量筛选。研究人员采用了多点组合分液器（也称为液体分液器），将细胞-凝胶混合物或药物试剂自动分液到384/1536孔板中，并确保准确和一致的分液。这种方法产生了快速和高质量的检测数据。3D类器官培养平台已被证明可用于大规模初级化合物筛选，通过促进细胞中化合物活性的高通量筛选和在 384 孔板中小型化类器官，在 1536孔板中实现超高通量测序。此外，结合配备冷却台和移液臂的液体处理机器人，可以在常规分析开发中测试多种浓度的基质凝胶，从而快速优化类器官生长条件。带有液体处理机器人的全自动工作站可用于类器官的自动接种。还开发了一种微流体装置来图案化水凝胶，利用层流在两侧形成疏水通道，同时在中间产生亲水通道。当液体水凝胶注入亲水区域时，它被周围的疏水区域限制在这条路径上。该设备为培养的细胞和组织提供了受控的 3D微环境，克服了与微柱和小压力屏障相关的昂贵且复杂的作挑战，从而提高了微流体细胞培养分析的效率。通过在设备内培养人脐静脉内皮细胞来证明该方案的可行性。光刻技术是制造器官芯片中广泛采用的技术，其中利用光刻胶在光的影响下将光掩模的图案转移到芯片上，从而能够生产具有任意图案的器官芯片。值得注意的是，胡 等人开发了一种用于肺癌类器官培养的集成超疏水微孔阵列芯片（InSMAR-chip），能够同时培养数百个类器官并促进高通量培养和分析。随着高通量技术的不断进步和改进，未来将开发越来越复杂和精细的类器官模型，并且也有可能模拟完整的人体系统并从这个角度考虑肿瘤的治疗。因此，作品的精细化将增加。由于在此过程中人为错误是不可接受的，因此有必要开发机器来执行这项工作。然而，与此同时，用机器取代体力劳动也有其自身的问题，例如，类器官中可能存在细胞团块或微小组织，导致植入不均匀。将来，可能需要开发更多的技术，例如流体动力学，以使他的分布更加均匀。高通量技术在药物筛选中的应用药物警戒筛选和验证是高通量解决方案的重要组成部分。培养的类器官为药物筛选提供了一种很有前途的工具，因为它们可以概括体内TME，从而能够更准确地预测药物疗效。与机器学习算法集成的自动化药物筛选平台可以快速准确地检测药物对肿瘤类器官的影响。通过比较不同药物治疗下肿瘤类器官的生理参数，可以初步确定具有潜在治疗效果的药物。类器官建模在肽药物筛选中的现有应用和前景已在以前的综述中进行了系统描述。我们在这里没有讨论传统的类器官药物筛选方法，只关注应用高通量类器官药物筛选。Schuster等人开发了一种可以自动化的微流体3D类器官培养平台，利用微流体技术和编程软件实现动态的、时间依赖性的类器官药物输送和联合治疗。此外，该平台还与图像分析仪相结合，可实时监测类器官形态和活力。通过对患者来源的胰腺肿瘤类器官进行药物筛选来验证微流控平台的可行性，这表明联合和动态治疗在治疗肿瘤类器官方面比恒定的单药方案更有效。现有研究主要集中在药物梯度或两种药物的组合上。然而，Li等人开发了一种高通量、开放空间、可重复使用的多层微流体芯片，用于基于类器官的组合药物筛选，以识别日益复杂的药物组合。该微流控芯片具有连接到数据收集工具的可编程流量控制系统。该芯片由一个入口层和多个分散层组成，能够同时从入口层加载不同的样品，然后样品溶液流入下面的分散层。单个微泵控制每个通道中的液体流动，最大限度地减少细胞稀释，并有助于通过显微镜技术进行组织学分析。Komen等人设计了一个由药物层和细胞层组成的微流控平台。两层由膜隔开，两个通道以交叉形状相交，允许细胞从交叉处接种。完成后，底部通道关闭，两个独立的注射泵调节药物层中的药物浓度，然后通过膜扩散到下部空间，从而提供动态药物给药。Zhai等人报道了一种具有创新控制结构和芯片设计的数字微流控系统。他们的药物分配器将所需的药物剂量预加载到芯片上，将其与细胞悬液滴混合，形成具有不同药物浓度的药物筛模型，最后将混合物输送到培养细胞的位置。该技术使用两种化疗药物进行了验证。与传统的96孔板相比，该系统具有多项优势，包括减少细胞和药物消耗以及最小的空间要求。在器官芯片方法中，Ryuji Morizane 的团队通过开发类器官模型来提高类器官质量和疾病模型保真度，为肾脏疾病研究做出了重大贡献。Ryuji Morizane的团队报告了一种可以在微流控芯片上流动培养的肾类器官，他们使用内源性内皮祖细胞为与组织工程血管构建相关的研究提供了新思路。Ryuji Morizane的团队在类器官芯片中增加了流体流动，并使用该模型测试了两种新药，突出了类器官模型在阐明治疗测试和发现的复杂疾病机制方面的巨大潜力。值得注意的是，药物筛选是一个备受关注的领域，一个关键问题是添加药物后细胞活力状态的评估。药物筛选的最终评价是细胞对药物的反应，我们经常评估细胞的状态。经典方法是基于细胞毒性的MTT和CCK-8 测定。随着技术的发展，检测灵敏度也提高了，可以使用基于ATP酶活性的方法。可用于这些方法的商业化试剂盒;然而，一个缺点是这些方法不是实时进行的，并且不能反映给药早期细胞的状态;因此，需要新的解决方案，例如C3蛋白和ATP比率。随着研究技术的进步，研究人员可用的工具也在进步。现在可以将CFP-Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）-YFP 融合蛋白转染到细胞中以确定caspase-3表达水平，然后使用多光子显微成像进行数据采集，以获得有关肿瘤对药物敏感性的定时或延迟数据。此外，Ryuji Morizane的团队利用基因编码的荧光生物传感器PercevalHR，该传感器可以感应ATP：ADP比率，从而反映细胞能量代谢的状态，用于类器官中的高通量药物筛选。该技术在肾脏类器官中的应用，其中药物的肾毒性评估，表明它可能适用于未来的高通量药物筛选。值得注意的是，拉曼光谱也可用于研究癌细胞中的药物代谢。由于自然界中存在或由人类合成的化合物数量庞大，因此有必要进行大规模的实验以选择最好的药物。由此可见，近年来药物筛选的高通量应用发展迅速，许多制药企业已经拥有了进行高通量药物筛选的全套设备和方法。未来的高通量技术发展可能侧重于降低成本和精细化模型，以解决药物分子的复杂结构，并使数据能够与人工智能、大数据分析和其他技术相结合，全面研究药物的机制、疗效和安全性。对于靶向药物，需要一种更复杂的方法来评估药物的活性，以评估其疗效，同时还要观察对人类的毒副作用。还有一些药物需要与其他药物或其他疗法联合才能有效，并且可能需要开发一个更全面的系统来观察治疗过程中或特定阶段的疗效。这可能是未来的趋势，但与此同时，它将需要更高水平的自动化和经济性。类器官培养中的数据采集和数据分析数据采集类器官成像和数据分析过程比2D细胞培养更复杂，增加了对所用成像工具和分析技术的要求。为了客观地呈现类器官的表型和结构并实现高通量类器官药物筛选过程，我们需要将自动化与3D成像和机器学习方法相结合。Ryuji Morizane的团队现在可以通过自动3D成像来绘制肾脏类器官的结构图，从而克服了类器官的复杂结构给高通量药物筛选带来的困难。细胞成像是了解肿瘤类器官培养状态和评估药物疗效的重要工具。高分辨率显微镜和图像分析技术可在培养和药物筛选过程中实现快速准确的细胞形态、数量和活力检测。在我们的实验方案中，采用活细胞荧光显微镜来获取类器官数据。使用在平移台上配备类器官平台的倒置显微镜进行观察，并设置了一个外壳来控制类器官的细胞环境并保持类器官培养所需的温度、湿度和CO2气体成分。ImageXpress 软件用于采集图像。显微镜连接软件支持在不同位置、z堆栈和多个颜色通道进行自动图像采集。此外，光片显微镜已被用于通过融合多视图图像来评估肿瘤类器官的药物疗效，从而实现完整的3D断层扫描。这种方法补偿了在3D结构样品最深处获得的图像质量低下，并使荧光分子能够到达直径达1mm的类器官的核心，从而能够从不同区域收集相关数据。数据分析在培养过程中会产生大量数据，包括有关细胞活力和生理指标的数据。数据可视化技术将复杂数据转换为直观的图表，便于理解和分析。这些数据为后续的临床试验和药物开发提供了有价值的参考。已使用连接到配备MATLAB脚本的计算机的显微镜来分析荧光图像以量化细胞凋亡，从而为每个类器官提供所需荧光标记物的平均荧光强度和相应的图像。AI分析是类器官培养中数据分析的重要工具。通过利用机器学习算法，AI分析可以分析和预测用于药物筛选的实验数据，使我们能够了解药物对肿瘤类器官的作用机制，预测药物疗效和副作用，并优化药物筛选策略。AI图像分析软件（Aivia）为从2D到5D的图像可视化、分析和数据组合提供了一个全面的平台，能够在几分钟内快速处理和重建高度复杂的高质量图像。AI图像分析同时集成了传统的图像分析和深度学习算法，通过专用软件从数字显微镜图像中提取特定数据，为图像分析技术开辟了新的途径。下图（图3）说明了如何将上述高通量技术用于组织解离、类器官生长、药物筛选、数据分析和数据采集。图3：通过高通量技术进行组织解离、类器官植入、药物筛选、数据分析和数据收集的整个过程。（A） 在初始样品制备步骤中，通过组织解离器处理患者来源的肿瘤组织以获得单细胞悬液。（B） 使用微流体技术进行3D打印，并将所得类器官植入96孔板或微流体芯片中。（C） 在药物筛选过程中，药物可以通过药物打印机自动给药或微流体输送。（D） 然后通过高内涵成像系统获取图像数据，并通过AI分析进行数据分析。在类器官培养过程中，我们发现细胞的异质性显著，包括活体和死亡的测定可能显示受到多种因素的干扰。因此，可能需要开发排除组织和个体患者之间类器官形成的复杂因素和差异的算法。随着成像技术的发展，用于评估细胞活动的图像处理算法存在困难，未来的图像处理可能需要更高的计算量，因此需要大型服务器提供更强大的算法。此外，可以使用基于数据优化的计算模型来解决能耗相对较小的数据分析问题。5.总结与展望肿瘤类器官培养系统在体外概括TME具有广泛的应用。通过在体内模拟TME，该技术可以更准确地预测药物对肿瘤的影响。引入高通量解决方案有助于实现从培养到药物筛选的加工过程的自动化和放大，从而提高培养效率和筛选准确性。目前，类器官技术无法完全概括TME。此外，缺乏相关行业的支持阻碍了微流控技术的广泛应用，微流控技术无法取代传统的类器官培养平台。天然衍生基质的化学性质，例如温度敏感性和室温下的聚合反应，会导致微流体通道堵塞，这也是当前微流体和高通量技术面临的挑战。此外，缺乏对微流体中负载的Matrigel的低温控制是3D打印技术的一项重大挑战。患者来源的肿瘤样本的有限可用性也阻碍了浓度依赖性评估和联合疗法的评估，突出了提高患者样本细胞提取效率和标准化培养技术的需求。类器官目前正在快速发展，未来将开发越来越多的复杂模型，例如Ryuji Morizane团队制作的类器官芯片模型，以解决疾病发展的真实情况。此外，高通量解决方案应该相对较快地开发。高通量实验也将变得更加快速、准确、自动化，并且能够处理大规模实验数据。未来，加强肿瘤类器官培养系统与高通量实验（如药物筛选）的整合，对于确定更有效的肿瘤治疗和药物至关重要。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

“ 点击蓝字 关注我们 钱程根 博士，中国药科大学药学院副教授，博士生导师。江苏省优秀青年基金、江苏省双创博士、江苏省优秀博士论文和南京大学优秀博士论文获得者。从事药物制剂、生物功能材料及化学生物学等交叉领域的研究，近年主要关注肿瘤免疫治疗和阿尔茨海默病早期诊断和治疗研究。近年来在 Natl Sci Rev, PNAS, Sci Adv, Adv Mater, Adv Funct Mater, Angew Chem Int Ed Engl, ACS Nano, Nano Lett 等国际权威杂志共发表同行评议论文 43 篇，其中（共同）第一或通讯作者发表论文 14 篇（8 篇 IF ＞ 10），总被引 3 670 余次，单篇最高引用 450 次，H-index 为 31，申请中国发明专利 5 项。其中，发表在 Adv Mater, Angew Chem Int Ed Engl, Chem-A Eur J 的文章分别被选为封面文章或热点文章；目前有 3 篇文章入选 ESI 高被引论文。 肿瘤光动力治疗纳米制剂的研究进展PPS  李倪博文，汤迎琦，侯仁杰，高子然，钱程根 * （中国药科大学药学院药剂系 多靶标天然药物全国重点实验室，江苏 南京 210009） [摘要] 光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）是一种非侵入性光化学疗法，它依赖于光敏剂在光照射下将光子能量转化为化学能，产生诱导细胞毒性的活性氧（reactive oxygen species，ROS），特别是用于肿瘤治疗。目前肿瘤 PDT 的临床应用受到肿瘤乏氧、还原性物质浓度高、免疫抑制、光穿透深度有限和肿瘤自救体系等肿瘤微环境因素的限制。随着纳米技术的发展，现在可以在纳米尺度上对 PDT 药物制剂进行精细化设计。以纳米技术增强 PDT 疗效为主题，对目前在增强氧气供应、改变肿瘤代谢和其他抗肿瘤疗法联用领域 PDT 纳米制剂的研究进展进行综述，为之后进一步开发符合临床需求的 PDT 纳米制剂提供参考。 近 20 年来，恶性肿瘤一直是我国人口的重要死亡诱因，改善肿瘤疗法顺应性，提高恶性肿瘤治愈率对提高全民生命健康水平具有重要意义 [1]。当前，我国肿瘤治疗的核心策略依旧聚焦于手术治疗，并辅以放射治疗与化学治疗，但这一系列疗法伴随的手术并发症、放化疗的不良反应以及肿瘤细胞的耐药性等问题，极大地削弱了肿瘤患者的生存质量 [2]。光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）作为一种非侵入性治疗手段，正日益受到肿瘤治疗研究领域的青睐，相较于传统疗法，PDT 凭借其低毒性、微创性、经济性以及较低的耐药性等显著优势，展现了广阔的应用前景 [3]。PDT 主要通过产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）引起肿瘤细胞DNA 突变、蛋白失活、氧化应激等反应最终诱导细胞凋亡 [4]。PDT 通过 2 种途径产生 ROS，光激发的光敏剂（Ⅰ型）直接与周围分子发生电子转移产生过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（• OH）等 ROS，或是激发态光敏剂（Ⅱ型）和基态氧分子（3O2）发生能量交换产生反应性更强的激发单线态氧分子（1O2）。然而，PDT 产生 ROS 效果受到肿瘤微环境的制约，如肿瘤快速增殖耗氧阻碍 ROS 产生、肿瘤高浓度还原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）还原ROS、及高间质压肿瘤抵抗 PDT 制剂递送等 [5]。纳米剂型以生物利用度高、比表面积大、体循环时间延长等特性，相较于传统剂型展现出显著优势。以纳米剂型为平台巧妙搭配药物并辅以合适的制剂设计可以设计大量新型 PDT 制剂来提高 PDT 抗肿瘤疗效（见图 1），这一策略不仅为克服 PDT 面临的微环境挑战提供了新思路，也为肿瘤治疗领域带来了革命性的进步。 1 改善肿瘤乏氧微环境增强光动力治疗 ROS 的浓度对 PDT 的抗肿瘤效果至关重要，但肿瘤的乏氧环境限制了 ROS 产生。目前的研究展示的有效改善肿瘤乏氧的策略主要从原位产氧、载体递氧、前药反应产生 ROS 等手段来提升 PDT 的ROS 生成效率；此外，研究还致力于开发新型Ⅰ型光敏剂，这类光敏剂在光激发下能够不依赖于高氧环境即可有效产生 ROS，从而降低了 PDT 对氧气的需求。本文涉及的光敏剂汇总于表 1。 1.1 分解过氧化氢增氧 1.1.1 递送 H2O2 酶  代肿瘤微环境中的 ROS 主要以H2O2 的形式存在，H2O2 酶（catalase，CAT）作为一种高效的催化剂，能降低 H2O2 分解的活化能，从而加速 H2O2 分解，CAT 和光敏剂的联合递送可解决小区域内 PDT 供氧不足问题。Xu 等 [6] 直接将 CAT 作为药物载体，用酰胺键偶联孟加拉玫瑰红（rose bengal，RB），通过控制 RB、CAT 比例可将 CATRB NPs 粒径保持在 100 nm 以下，该尺寸拥有对线粒体的高效渗透性，起到增氧 PDT 的作用，并直接损伤细胞“动力工厂”——线粒体。然而，CAT 的膜的不透过性和其相对较大的尺寸显著限制了 CAT 的效果，为此，Sim 等 [7] 通过超分子相互作用直接进行颗粒-酶偶联。即将 CAT 整合到未修饰的金属有机框架（metal organic framework，MOF）的表面，在 MOF 辅助下进入细胞，随后 CAT 与 MOF 缓慢脱离，释放出 CAT 以缓解细胞内的乏氧状态，从而增强 PDT 的疗效。为了增强靶向性，Zhang 等 [8]合成了可靶向膀胱癌细胞的纳米 DNA 适配体，将适配体和光敏剂二氢卟吩 e6（chlorin e6，Ce6）以及 CAT 连接，构建出 NT-CAT-Ce6 复合制剂。这种复合制剂能够在膀胱肿瘤病灶部位进行选择性增氧PDT，为膀胱癌的治疗提供了一种新的、更具针对性的策略。 1.1.2 纳米酶仿生 H2O2 酶  CAT 作为一种天然酶，对其稍剧烈处理可能导致失活，因此，开发模仿CAT 活性的非生物材料作为纳米酶，成为了实现高效催化能力的一条可行路径。Liang 等 [9] 以三氰基呋喃（tricyanofuran，TCF）为受体，以苯并噻唑（benzothiazole，BTH）/吲哚（indole，IND）为供体，同时合成了近红外七甲菁（heptamethine cyanines，Cy7），由于 BTH 相比 IND 氢键较少，氢键和分子间 π-π 相互作用的微调形成了松散的分子堆，聚集态的 BTH-Cy7-TCF 表现出更高的单线态氧产生量和竞争性光热转换效率，同时这种独特的分子堆积结构为 H2O2 提供了一个结合位点和催化中心，使其具有类似催化酶的活性，从而进一步提高了 PDT 的效率。 1.1.3 生物酶的联合作用 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，Gox）可专一性地氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和 H2O2，为了进一步优化这一过程分解产氧效果，Jiang 等 [10] 以球形二氧化锰（manganese dioxide，MnO2）为基础合成介孔空心纳米粒 H-MnO2, 在其中装入 Gox 和 Ce6。这种 H-MnO2 纳米颗粒具有 pH 和 H2O2 响应性，能够控制封装在其内部的 Ce6 和Gox的释放，有效避免了它们在体液中的提前暴露。此外，Gox 与具有 CAT 样活性的 H-MnO2 之间发生的互催化反应，显著增强了氧依赖性 Ce6 介导的 PDT 效果，并协同 Gox 诱导的饥饿疗法，共同提升了治疗效果。为了加速 ROS 的生成效率，Yang 等 [11] 设计了一种自供氢离子和加速氧气生成效率的仿生杂化纳米酶，这一创新设计不仅实现了光激活下 ROS 信号的显著放大，还有效增强了乏氧肿瘤的治疗效果。 1.2 构建携氧载体 1.2.1 血红蛋白作为氧载体  人体中红细胞依靠血红蛋白（hemoglobin，Hb）和氧气的可逆结合运载氧气。Ding 等 [12] 受此启发合成了一种具有近红外荧光活性的半导体聚合物纳米颗粒（semiconducting polymer nanoparticle，SPN），并将 SPN 与 Hb 连接，同时包覆红细胞膜（red blood cell membrane，RBCM）。这层 RBCM 涂层赋予了 SPN-Hb 出色的生物相容性和长期血液循环能力，显著促进了 SPN 在肿瘤区域的富集。该 SPN 不仅可以用作 PDT 也可以用于荧光成像，实现了诊疗一体化，同时，通过与 Hb 的结合可作为氧载体缓解肿瘤缺氧，增强 PDT 疗效。基于 Hb 的研究有很多报道，但由于其载氧能力的局限性和结构的不稳定性，其实际应用仍面临一定挑战。 1.2.2 全氟化碳作为氧载体 全氟化碳（perfluocarbon，PFC）能够在给定的氧分压下保持相对较高的氧含量。凭借弱范德华相互作用，PFC 具有较好的水溶性。人体中 PFC 能够通过皮肤毛孔或呼吸作用排出体外，这赋予了它高度的生物相容性特质。Yang等[13] 开发了一种基于模块化设计和共组装纳米技术的无载体氧纳米罐，该纳米罐由新型氧化还原敏感前药（FSSP）和耗氧量抑制剂阿托伐醌（atovaquone，ATO）共同组装形成，其中 FSSP 结合了全氟己胺和焦磷烷 a，集成了氟化、响应和光动力功能。这种纳米罐能够在实现充分富氧的同时降低肿瘤内的耗氧量，从而彻底缓解肿瘤缺氧，并显示出卓越的携氧能力、良好的药代动力学以及可按需释放 ATO 的特性。Zhang 等 [14] 设计了一种可以光热控制的“氧蛋”，即将全氟化物内核封装在功能化双层聚合物外壳中。通过改良两步原位生长工艺，在聚合物外壳表面连接具有优异光热能量转换能力的近红外光热剂，实现热触发氧气释放，提供了一条可控和有效氧气释放的新途径。Yan 等 [15] 对 PFC 递氧的多模式应用进行了深入的探索，即将具有核磁成像性能的四氧化三铁加载到聚苯乙烯微球中，并用 PFC 填充剩余空间，在外部包裹聚多巴胺以防止 PFC 泄露，最后装载聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）改性的 Ce6。整个纳米体系可用于超声成像、核磁共振成像和荧光成像从而引导增强 PDT。 1.2.3 生物气囊泡作为氧载体 生物气囊泡（gas vesicle，GV）作为一种新型氧气载体具有缓解肿瘤缺氧的潜力。GV 是来源于藻类的，自然形成的充满气体的蛋白质壳隔室。Song 等 [16] 从小球藻中提取 GV 并在表面修饰一层脂质，形成 GV 脂质体。实验表明，GV 脂质体在缺氧溶液、缺氧细胞以及皮下肿瘤内均显著改善氧浓度，皮下肿瘤注射 GV并配合 PDT 可以观察到肿瘤细胞凋亡和坏死显著增强。此外，Yang 等 [17] 将光敏剂吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）加载到载氧纳米气泡膜上，使得 ICG治疗效果稳定提升。尽管利用 GV 直接递氧仍可在一定程度上改善肿瘤乏氧，但存在半衰期短、载氧量低甚至可能发生溶血风险等问题。 1.3 反应产氧 除了通过分解肿瘤 H2O2 和开发氧气载体远程运送氧气外，直接在肿瘤部位反应产氧也是 PDT 供氧的选择之一。过氧化钙（calcium peroxide，CaO2）是一种遇水反应可生成氧气和氢氧化钙的金属过氧化物，Shen 等 [18] 把 CaO2 装在酸响应沸石咪唑骨架 -90（zeolitic imidazolate framework-90，ZIF-90）中覆以 Ce6-PEG 形成 CaO2@ZIF-Fe/Ce6@PEG，酸响应 ZIF-90 在肿瘤中分解，CaO2 反应产生氧气同时 CaO2 的酸性水解还产生副产物 H2O2，可补充肿瘤中 H2O2 不足。Sun 等 [19] 以 MOF 为基体封装光敏剂四苯基卟啉 [5，10，15，20-tetrakis(4-carboxyphenyl) porphyrin，H2TCPP]，随后在 MOF 表面沉积了纳米过氧化镁（magnesium peroxide，MgO2），并通过连接靶向肿瘤的 DNA 适配体，最终制成了 HfMOF-MgO2/DNA 纳米结构。DNA 适配体的介入很容易解决了 MgO2 在体内提前反应的问题，使 HfMOF-MgO2/DNA 在接近肿瘤部位再发挥作用。  细菌具备独特的肿瘤靶向能力，其中具有光合自养能力的光合细菌还可以利用类囊体膜上的叶绿素分子进行放氧光合作用。蓝藻，作为自然界中一类重要的光合细菌，为地球上生命的出现和进化过程提供重要的氧分子。基于蓝藻的析氧特性，联合光合细菌进行治疗是缓解肿瘤缺氧和促进 PDT 的有前途的方法。Qi 等 [20] 把黑磷纳米片（black phosphorus nanosheet，BP NS）和蓝藻细胞连接，利用蓝藻的光合作用产氧活性生产 ROS。Zhang 等 [21] 通过采用特制的 CP@ICG 系统，也实现了类似的效果。该系统不仅为光敏剂 ICG 提供了必要的氧气支持，而且 CP 在非光照条件下需要摄取肿瘤部位的葡萄糖等营养物质，以维持自身能量供应，从而有效抑制肿瘤生长，实现了长期的抗肿瘤效果。此外，Teng 等 [22] 将光合细菌与 Ce6 光敏剂和金纳米颗粒（Au NPs）光热剂相结合，得到的 Bac@Au-Ce6 可以有效靶向肿瘤组织，进一步增强 Au-Ce6 的肿瘤积累，其中光合细菌在光照射下持续产生氧气，显著改善肿瘤缺氧状态。 1.4 非氧依赖 PDT 肿瘤内部的缺氧环境对 ROS 的产生构成了直接限制，特别是对依赖于氧气的Ⅱ型光敏剂而言，其 ROS 产生效率受到了显著影响。相比之下，Ⅰ型光敏剂在产生 ROS 的过程中无需氧气，能够直接与水分子等底物发生反应，因此对氧气的需求相对较低。鉴于此，开发适宜的Ⅰ型 PDT 制剂，有望弥补当前以Ⅱ型光敏剂为主导的 PDT 制剂在面对肿瘤缺氧挑战时的不足，为 PDT 领域带来新的突破和发展机遇。  鉴于电荷转移是Ⅰ型 PDT 产生 ROS 的重要步骤，提高光敏剂周围电子丰度于提升Ⅰ型光敏剂效果而言至关重要。Chen 等 [23] 将碘离子引入 BODIPY 得到了激发态寿命更长的Ⅰ型光敏剂IBAB（iodine substituted butoxy-aza-BODIPY），同时将 IBAB 包裹在甲氧基-聚（乙二醇）[methoxypoly(ethyleneglycol)，mPEG]-b-聚 [2-（二异丙基氨基）乙基甲基丙烯酸酯 ][poly(2-(diisopropylamino) ethyl methacrylate，PPDA)] 中，mPEG-b-PPDA 不仅是 IBAB 的载体，其富电子环境在 IBAB 激发时可以提供电子给激发态的 IBAB 促进电荷分离，极大地提升了 IBAB 产生 ROS 效果。Hu 等 [24] 将芴取代的 BODIPY（D）和苝二酰亚胺（A）通过四氢键超分子相互作用组装成超分子光敏剂（DA），在光照射下 D 将电子转移到 A，导致电荷分离形成自由基离子对。该体系通过 2 种途径产生羟基自由基（• OH）：一方面，D 的阳离子自由基通过非氧依赖性方法直接氧化水生成羟基自由基（• OH）；另一方面，A 的阴离子自由基将电子转移到丙酮酸上以实现催化循环，利用丙酮酸氧化水分子产生 • OH。Hu 等 [24] 进一步提出了一种电子受体触发的光诱导电子转移（acceptor-triggered photoinduced electron transfer，a-PET）策略，侧重介绍了长波长激光对电子-空穴对的精细调控，通过结合基于非富勒烯支架的光敏剂和 A 这 2 个有机半导体分子来促进电子-空穴对的分离，显著促进Ⅰ型 PDT 途径产生丰富的 ROS。 2 调控肿瘤代谢增强光动力治疗 除上文提及的乏氧环境外，肿瘤还通过一系列特殊代谢机制来对抗 PDT 的效果。具体而言，肿瘤内部高浓度的 GSH 能够还原 ROS，从而降低 PDT 的杀伤力；同时，自噬途径也被肿瘤利用来拯救受损的细胞，进一步削弱 PDT 的疗效。此外，肿瘤乏氧环境还会促进异常血管的增生，这不仅加剧了肿瘤的恶性进展，还引发了高间质压，进而阻碍了 PDT 治疗制剂的有效吸收。因此，阻断乃至逆转这些代谢机制，对于提升 PDT 的治疗效果具有至关重要的意义。 2.1 阻断有氧呼吸 ATO 是呼吸链复合物Ⅲ抑制剂，Zhao 等 [25] 将 ATO 和 Ce6 通过疏水相互作用结合成纳米粒，显著提高了 ATO 和 Ce6 的溶解度和稳定性，还极大地增强了它们的细胞内摄取能力和肿瘤内部的渗透性。受益于 ATO 和 Ce6 协同机制，抑制有氧呼吸，从而减少耗氧，ATO-Ce6 纳米粒展现出更为强劲的抑制肿瘤生长的 PDT 效果。Ren 等 [26] 将阻断耗氧与供氧策略相结合，在脂质体中同时包埋 MnO2、ATO 以及光敏剂金丝桃素，为在不利环境中发展 PDT 提供了新策略。此外，二甲双胍（metformin，Met），这一常用于 2 型糖尿病治疗的药物，近年来被发现具有抑制呼吸链复合物 Ι 的作用，Sun等[27] 结合了减少耗氧与供氧的双重策略，制备了5'-鸟苷一磷酸（5'-guanosine monophosphate，5'GMP）水凝胶负载 Met 的体系，该系统在近红外光照射下能够局部释放 Met，同时通过将有 CAT 样活性的Hemin@mil88 和 Met 联合，有效提高了 ICG 发挥 PDT 作用时的局部氧气浓度。 2.2 下调谷胱甘肽  为维持细胞氧化还原平衡，肿瘤的高 ROS 必然带来高 GSH 的伴生。GSH 的还原性使其可以断裂二硫键、硫醚等化学键。Wang 等 [28] 联合 PEG和甲基丙烯酸吡啶基二硫化乙酯（pyridyl disulfide ethyl methacrylate，PyDSMA）合成两亲性嵌合物PEG-p，该嵌合物的亲脂 PyDSMA 端不仅用于缀合光敏剂，其独特的吡啶基二硫键更是成为消耗肿瘤内部过剩 GSH 的有力工具。Zhou 等 [29] 设计了一种包括上转换纳米晶体和负载 Ce6 的二硫键介孔有机硅的纳米复合材料 UCN/MON（upconverting nanocrystal/mesoporous organosilicon）。UCN/MON 内部的二硫键可以通过 GSH 的氧化还原反应降解。该纳米晶体不仅通过氧化还原触发的 Ce6 释放提高光敏剂的肿瘤选择性，还有效降低癌细胞中 GSH 的浓度，从而减少 ROS 的消耗。此外，GSH 消耗亦可通过高价金属离子还原实现，Zou 等 [30] 合成了可以在酸性肿瘤微环境中特异性释放铜离子（Cu2+）的 Cu/ZIF-8 纳米颗粒。这些纳米颗粒在GSH 的还原作用下会生成亚铜离子（Cu+），而 Cu+又能与过量的 H2O2 反应生成丰富的 • OH，为肿瘤治疗提供了新的 ROS 来源。 2.3 重塑肿瘤外基质 肿瘤部位脉管异常（如血管流速慢、血管渗漏、迂曲度高、结构不规则），细胞外基质致密和间质压力大，这些特征显著增加了 PDT 制剂和氧气通过血管进入肿瘤的难度。因此，降低间质压力和疏松基质是提升 PDT 疗效的重要途径。Liu 等 [31] 在胰腺肿瘤模型中使用基于纳米颗粒的 PDT，成功扰乱了肿瘤-基质串扰，抑制这种串扰可以持续松弛肿瘤外基质。松弛的基质不仅促进了后续治疗的肿瘤根除，还提高了药物的治疗效率。因此，PDT 可能成为结缔组织增生性癌症的有价值的个体辅助治疗手段。Deng 等 [32] 将一氧化氮（nitric oxide，NO）前药 S 亚硝基硫醇与α-环糊精/PEG 偶联合成了 GSH 敏感的 NO 输送剂，旨在实现多重治疗效果：首先 NO 前药的释放过程需要 GSH 的参与，确保了 NO 在肿瘤微环境中的特异性释放；同时，NO 本身具有氧化 GSH 的能力，进一步耗尽肿瘤细胞中的 GSH，增强 ROS 的杀伤效果；此外，NO 可以引起肿瘤血管的松弛，降低间质压力，从而提高肿瘤部位的氧气和药物蓄积；最后 NO 可以和 ROS 反应产生新的含氮自由基，进一步攻击肿瘤。 2.4 阻断肿瘤细胞自噬 自噬是细胞通过溶酶体清除自身成分的过程，根据溶酶体行为不同可分为以下 3 种类型：1）巨自噬，细胞募集蛋白形成大型自噬体，介导损伤成分进入溶酶体；2）微自噬，受损的细胞器自动和溶酶体结合，期间无大自噬体形成；3）分子伴侣介导自噬，用于水解错误折叠蛋白 [33]。自噬在 PDT 中是一把双刃剑：一方面，ROS 导致的细胞死亡需要自噬的参与；另一方面，肿瘤细胞可以通过自噬，特别是巨自噬，清除 ROS 造成的损伤成分，进而保护自身免受伤害。Xue 等 [34] 在测试新型光敏剂时发现，PDT 处理后细胞内的巨自噬蛋白表达明显增强，使用自噬抑制剂后，PDT 效果得到了显著增强。自噬保护在特定类型的肿瘤 PDT 耐受中起重要作用，阻断自噬往往可消除耐受。  氯喹（chloroquine，CQ）是一种成熟的疟疾治疗药物，作为一种弱碱，CQ 进入溶酶体后可以提升溶酶体的pH值，从而抑制了溶酶体水解自噬体过程。Dai 等 [35] 开发了仿生纳米材料 PCN-CQ@CCM，该材料以具有 PDT 作用的金属有机骨架材料 PCN-224 为载体，搭载自噬抑制剂 CQ，并在表面包被分离的口腔鳞状细胞癌细胞膜（carcinoma cell membrane，CCM）。由于癌细胞膜具有免疫逃避和同源靶向能力，PCN-CQ@CCM 可以逃避巨噬细胞吞噬作用并同源黏附在肿瘤细胞上，增强纳米材料在肿瘤微环境中的保留和吸收。CQ 通过有效抑制保护性自噬通量，进一步加剧了 ROS 致死途径。Xiao 等 [36] 开 发 了 一 种 共 封 装 盐 酸 多 西 环 素（doxycycline hydrochloride，doxy）和Ce6的脂质体纳米药物，其中，Doxy 可以诱导线粒体功能障碍，增加 ROS 生成，从而增强 PDT 的杀伤作用和免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）。同时，Doxy 通过有效的自噬抑制增加肿瘤细胞表面的主要组织相容性复合体 Ⅰ（major histocompatibility complexⅠ，MHC-Ⅰ）表达，从而提高抗原呈递和细胞毒性淋巴细胞的识别效率，增加肿瘤免疫原性。 3 光动力治疗的联合疗法 PDT 和其他疗法的联用具有很好的优势，例如可以重塑肿瘤免疫抑制环境以放大治疗效果，利用PDT 调控其他疗法协同作用，以及运用成熟技术增强 PDT 治疗等。 3.1 光动力治疗和免疫疗法 近年来，免疫检查点阻断疗法因其在多种肿瘤治疗中的广泛应用而备受关注。PDT 被认为可以通过诱导局部 ICD 来引发全身抗肿瘤反应。PDT 通过杀伤肿瘤细胞，暴露出肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen，TSA）和损伤相关分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP）。DAMP 和 TSA 的暴露可以激活肿瘤浸润免疫细胞，诱导这些细胞发生全身免疫反应 [37]。然而，有研究表明，ICD 本身可能进一步恶化肿瘤的免疫抑制环境。具体来说，机体的免疫负反馈机制使得 DAMP 在诱导正向免疫反应的同时，增加了肿瘤免疫检查点的密度 [38]；而 TSA 本身也可能诱导免疫抑制性细胞的产生 [39]。因此，PDT 与免疫检查点阻断剂的联合使用可以逆转 ICD 引起的免疫抑制，有助于实现更有效和持久的抗肿瘤作用。 免疫细胞的抗癌活性受到细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）和 PD-1/PD-L1 等免疫检查点的限制，近年来针对这些检查点开发的单抗对多种恶性肿瘤展现出治疗潜力。Zheng 等 [40] 引入了一种可引发 ICD 的光敏剂，该光敏剂会启动强烈的免疫级联反应，促进了肿瘤微环境中细胞毒性 T 淋巴细胞浸润的增加。Yu 等 [41] 通过 PDT 与光热疗法的自动切换，实现 ICD 期间损伤相关分子模式的顺序生成和释放。Yang 等 [42] 制备了含有小分子光敏剂的黏膜黏附性纳米颗粒，并与灭活悬浮肿瘤细胞直接共孵育。该制剂可以诱导癌细胞的强效免疫原性细胞死亡。随着药物的释放，可以激活安全而强大的肿瘤特异性免疫反应，从而有效抑制术后肿瘤复发和转移。  此外，PDT 可以触发巨噬细胞极化增强免疫效果。Liu 等 [43] 设计了一种嵌合肽工程自递送纳米药物，由光敏剂 Ce6，米喹莫特（R837）和 Toll 样受体激动剂组成，既可以作为光敏剂进行 PDT，还可以将 M2 型肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）极化为 M1 型 TAM，与 ICD 联合激活 T 细胞抗肿瘤免疫。  分化决定簇抗原 47（duster of differentiation 47，CD47）作为细胞表面的“不要吃我”信号，可与巨噬细胞表面受体结合，使机体细胞免于被自体免疫攻击，肿瘤细胞通过高表达 CD47 来实现免疫逃逸。Xiao 等 [44] 制作了一种 pH 双响应胶束，这种胶束本身带负电，在肿瘤外层降解后释放 CD47 单抗并完成电荷翻转，正电部分促进制剂吸收并在溶酶体酸解释放 Ce6，这种双响应逐步释药的方式保护了 CD47 抗体不被降解 ，同时使 Ce6 和 CD47 抗体均在其最合适位置发挥作用。 3.2 光动力治疗和化疗联用   PDT 与化疗的联合使用，提高了治疗效果，尤其是在处理缺氧肿瘤时表现出显著的优势。化疗药物能够提高肿瘤细胞对 ROS 的敏感度，而在 PDT过程中产生的 ROS 不仅可以抑制细胞的药物外排活动，还能增强细胞对药物的摄取 [45]，从而提高了 PDT 在缺氧肿瘤中的疗效，减少了耐药性的发生，加强了癌症根除的效果。  部分化疗药物本身是没有生物毒性的药物前体，而在缺氧条件下它们的细胞毒性可被激活，这一特性使它们可以专一性地治疗缺氧肿瘤。替拉帕嗪（tirapazamine，TPZ）是一种可在低氧条件活化的化疗药，Ma 等 [46] 将 TPZ 连接二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DSPE）-PEG形成 DSPE-PEG-TPZ，然后装载光敏剂 Ce6，最后封装进可溶性微针中进行递送。PDT 过程中产生的 ROS 会消耗肿瘤区域原本就稀缺的氧气，加速 TPZ 的活化，从而增强治疗效果。除了利用 PDT 加重缺氧条件来激活化疗前药外，PDT 产生的 ROS 本身也可以作为一种信号，触发化疗药物的释放。Wang 等[47] 合成了 GSH 反应性前药（BP），其中以 GSH 激活的 BODIPY 作为药物载体，抗肿瘤药物 7-乙基-10-羟基喜树碱（7-ethyl-10-hydroxycamptothecin，SN38）作为离去 基 团。BP 分 子 在 水 中 自 组 装 形 成 纳 米 前药，BODIPY 部分经 PDT 照射后产生 ROS 触发细胞氧化还原机制产生更高浓度 GSH，高浓度 GSH 亲核取代 BP 的 SN38 部分导致 SN38 的释放，同时使 BP 解聚，停止 ROS 的产生。缺氧肿瘤内含有丰富的硝基还原酶（nitrate reductase，NTR），这种酶在缺氧环境下活性更强。Yang 等 [48] 使用偶氮苯接头连接喜树碱（camptothecin，CPT）和 BODIPY 形成乏氧响应前药 CPT-BODIPY，前药继续组装成纳米粒用于肿瘤治疗，在光照条件下，纳米粒发挥 PDT 治疗，同时前药在乏氧条件下释放 CPT，用于杀伤肿瘤细胞，这种设计不仅提高了治疗效果，还能减少不良反应的发生。 3.3 光动力治疗和放射疗法的结合 PDT 依赖于光穿透皮肤来激活光敏剂，其常用的治疗波长主要集中在近红外至可见光范围内。然而，即便是在深层皮肤穿透方面表现优异的近红外光，其穿透能力也远不及放射疗法（radiation therapy，RT）中使用的高频电离辐射，如 X 射线。一些物质，如闪烁晶体，其具备吸收高频电磁波后发出较长波长可见荧光的能力 [49]。这一特性为将闪烁晶体纳米颗粒与 PDT 光敏剂结合使用提供了可能，利用 RT 产生的强大穿透力的高频辐射来激活深层组织中的 PDT，即所谓的 RT-PDT 疗法。Jiang 等 [50] 组建了一种双核树枝状 RT-PDT 平台，该平台以纳米闪烁体氟化钙（calcium fluoride，CaF2）为核心，外层覆盖由 PEG 修饰的聚酰胺（polyamidoamine，PAMAM）树枝状大分子。通过将光敏剂 RB 与 PAMAM 分子表面的官能团形成共价键连接，实现了药物在树枝状大分子表面和内部的有序装载。考虑到 PDT 可以激活肿瘤的血管生成机制，PAMAM 的剩余空间装载了抗血管生成药物舒尼替尼，旨在阻断肿瘤的新血管形成。实验结果显示，采用多次低剂量的 RT 辐照策略比单次大剂量辐照更为有效，这不仅提高了治疗效果，而且对于减轻患者的不良反应至关重要。 4 结语与展望 PDT 作为一种非侵入性疗法，凭借其具有低毒性、与化疗药物联合使用时无重叠毒性以及没有显著的不良反应（如纤维化）的优点，展现了在疾病联合治疗中的巨大潜力。基于 PDT 的精确疗法主要集中在发展新光敏剂、探究和理解新的光动力学机制、发展新纳米技术和成像工具以及肿瘤模型的集成和发现。随着肿瘤学研究的深入，肿瘤乏氧、高还原性物质和免疫抑制的环境限制了 PDT 的实际效果，然而，新型纳米光敏剂的出现对 PDT 过程更深层次的理解以及各种新纳米材料和技术的融合应用，极大地突破了肿瘤 PDT 临床前研究的障碍。这些进展不仅提升了 PDT的效果，还使得单一制剂能够同时达到增氧、改善免疫环境、逆转肿瘤代谢、实现药物的精准释放以及多种治疗方法的联合使用等多重目标。  自 PDT 首次被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于膀胱癌的治疗以来，该疗法已扩展到眼科、皮肤科及肿瘤学等多个领域 [4]。尽管 PDT 在临床上已被证实对于局部肿瘤（如前列腺癌、脑癌和膀胱癌）的微创治疗具有高度的时间和空间控制能力，并且不良反应较小，但在广泛癌症尤其是转移性疾病中的应用仍面临挑战。随着免疫疗法的兴起，PDT 结合纳米制剂为深层肿瘤的免疫治疗提供了新的可能性。例如，免疫疗法并不适用于所有类型的癌症，原因之一是免疫相关的剂量限制毒性和免疫细胞无法到达肿瘤，特别是富含基质的肿瘤，如胰腺癌。而纳米光敏药物可以穿透肿瘤的基质、细胞和血管，促进 T 细胞向肿瘤区域输送。此外，PDT 通过调节肿瘤及其血管的渗透性，有助于优化药物剂量控制和免疫检查点抑制剂及细胞治疗的时机选择，从而实现肿瘤免疫治疗的精准管理。综上所述，PDT 的应用前景将不局限于疾病局部治疗，更在于其在临床肿瘤联合治疗中有重要的发展潜力。、 参考文献： [1]  国家统计局 . 中国统计年鉴 2023 [EB/OL]. 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The United States Food and Drug Administration (FDA) has awarded orphan drug designation (ODD) to NM5072 for the treatment of anemia in PNH patients. The ODD provides NM5072 with a range of benefits, including financial incentives, regulatory support, extended market exclusivity, and extended patent life, ensuring that this groundbreaking treatment can reach those who need it. NM5072 is an anti-Properdin antibody that selectively blocks the alternative pathway (AP) while maintaining the integrity of the classical pathway required for fending off infections. The drug has completed phase I trial in 48 healthy volunteers with a clean safety profile and was well-tolerated across all doses tested up to 20 mg/kg. Total AP inhibition was achieved, with its duration exhibiting a dose-dependent response. NM5072 is being positioned to enter Phase II trial for the treatment of naïve PNH patients as the first clinical indication. The drug is expected to be useful in other complement-mediated and complement-associated disorders, further expanding the patient population for multiple clinical trials. April 15, 2024 -- NovelMed today announced that the Food and Drug Administration (FDA) has awarded Orphan Drug Designation (ODD) to NM5072, an Alternative Pathway (AP) blocker anti-Properdin antibody, for the treatment of patients with Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH). NM5072 is being developed for PNH patients in the United States and globally. The FDA grants ODD status to new medication intended for the treatment, diagnosis or prevention of rare diseases or disorders that affect fewer than 200,000 people in the United States. PNH is a rare, chronic, inflammatory, and hemolytic disease that occurs when PNH Red Blood Cells (RBCs) breakdown within and outside the blood vessel, causing anemia, which can be fatal. In addition to PNH RBCs, other cells, including Neutrophils, Monocytes, and Platelets, also drive cellular destruction and inflammation, leading to long-term effects on the patient’s health. If the disease remains untreated or partially treated, patients will continue to have anemia and inflammation, potentially leading to chronic pain, fatigue, and other common symptoms of PNH. Dr. Rekha Bansal, Chief Executive Officer said, “PNH is a rare disease which involves a range of blood cells that contribute to debilitating symptoms for patients, including anemia, fatigue, and severe pain with shorter life span if remains untreated. The current standard of care requires further improvements. We are hopeful that NM5072, with its unique mechanism of action that targets the top of the complement cascade, could become a promising treatment to improve outcomes in these patients.” NM5072 is under regulatory review for multiple indications in the USA and globally. “We are thrilled by the FDA’s decision, which highlights the demand for groundbreaking therapies for individuals grappling with PNH,” comments Robert Bard, VP Regulatory Affairs. This Orphan Drug Designation approval represents a remarkable stride in therapeutic innovation, showcasing NM5072’s distinct capability to selectively inhibit the alternative pathway (AP) while safeguarding the classical pathway essential for combating infections in PNH patients. NM5072 is another drug in our pipeline that has received Orphan Drug Designation in the United States. The ODD from the FDA is a special designation granted to facilitate the development and assessment of new medicines. The FDA’s Office of Orphan Products Development has granted ODD for NM5072 which is in development for the treatment and prevention of rare diseases or conditions affecting fewer than 200,000 people in the US. This designation offers various advantages which include the potential for market exclusivity lasting seven years upon FDA approval, eligibility for tax credits related to qualified clinical trials, waiver of application fees, reduced annual product fees, clinical protocol assistance, and the potential qualification for expedited development programs. NM5072 (Anti-Properdin Monoclonal Antibody) NM5072 is being developed by NovelMed as a potential first-in-class monoclonal antibody that selectively blocks parts of the immune system responsible for the disease, thus inhibiting alternative pathway cascades. Blocking Properdin function is expected to block the lysis of PNH RBCs, which are implicated in the pathophysiology of anemia in PNH. NM5072 is currently an investigational drug that selectively binds to Properdin, a protein of the AP. This monoclonal antibody serves as an efficacious blocker of the AP without affecting the part of the immune system required for fighting infections. NM5072 has successfully completed a phase I trial in healthy volunteers with an expected safety profile. This potent drug is in various regulatory phases of development. With its much longer half-life, the Anti-Properdin molecule is a pioneering biologic. “While the drug is currently in the form of an IV formulation, subcutaneous formulations are being planned for future trials,” said Dr. Bansal. Regulatory preparations and review of Phase II trials for multiple indications, including PNH, C3 Glomerulopathy (C3G) and Atypical Hemolytic Uremic Syndrome (aHUS) are underway. Complement-Mediated Disorders The dysregulation of the Alternative Pathway (AP) is a pivotal factor influencing the trajectory of numerous acute and chronic rare diseases, spanning disciplines such as hematology, ophthalmology, nephrology, dermatology, and neurology. Among these, Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH) emerges as a prominent indication for complement blockers heading towards FDA approval. In the context of PNH, the current armamentarium of treatment options remains limited and imperfect, often compromising pathogenic clearance or inducing hyperlipidemia. PNH manifests with a spectrum of clinical features, including low PNH-RBC clone size, hemolysis, hemoglobinuria, reduced hemoglobin levels, elevated lactate dehydrogenase (LDH), and a plethora of other symptoms that can precipitate chronic complications, potentially leading to premature mortality if left untreated. Chronic symptoms and multisystem organ damage are recurrent in PNH patients. While FDA-approved anti-C3, C5, and Factor B drugs provide potential for symptom management in PNH treatment, they should be approached with caution due to their significant side effects and broader limitations on labels. The imperative to develop additional treatment modalities for PNH, characterized by both efficacy and safety, remains unequivocally recognized, holding the promise of enhancing disease outcomes and improving the quality of life for affected individuals. Dedicated to pioneering innovative biologics for a range of complement-mediated diseases, NovelMed stands at the forefront of conceptualizing and validating an anti-Properdin antibody for chronic complement-mediated and complement-associated disorders. Progressing its leading product candidate through clinical trials, the company primarily focuses on addressing hemolytic and renal disorders initially. “Driven by a commitment to ingenuity and compassion, NovelMed is committed to delivering groundbreaking diagnostics and therapies that redefine the treatment landscape for patients with rare diseases,” said Dr. Rekha Bansal, Chief Executive Officer. Positioned as a frontrunner in the development of therapies targeting the Alternative Pathway (AP), NovelMed is devoted to addressing debilitating diseases across hematology, ophthalmology, Nephrology, dermatology, and neurology. Our R&D team is currently engaged in the development of a new diagnostic marker aimed at identifying complement-mediated diseases. This synergistic strategy is geared towards broadening the spectrum of diseases that can be effectively and confidently treated using NM5072. NovelMed is actively seeking licensing, investment, partnership, and acquisition opportunities to propel NM5072 through further development and approval across multiple rare disease indications in the US and globally. For more information about NM5072, please visit www.NovelMed.com/news. The content above comes from the network. if any infringement, please contact us to modify.