PDL1 x TLR8 x TLR7

摘要:信使RNA（mRNA）癌症疫苗的研发已经通过应用个性化的癌症抗原、mRNA的结构优化，以及开发替代的RNA基表达载体和高效的靶向递送载体，逐渐克服了众多挑战。目前，编码肿瘤相关抗原（TAAs）、肿瘤特异性抗原（TSAs）或免疫调节剂的各种癌症疫苗正在进行临床试验。在本文中，我们总结了mRNA的优化以及RNA基表达载体在癌症疫苗中的出现。我们首先回顾了最先进的靶向脂质纳米颗粒（LNPs）的进步和应用，然后介绍了mRNA癌症疫苗的主要分类和临床应用。总的来说，mRNA疫苗正在成为癌症免疫治疗的中心焦点，提供解决癌症治疗中多个挑战的潜力，无论是作为单一疗法还是与当前癌症治疗的组合使用。 1.介绍 肿瘤学领域最近通过引入基于mRNA的肿瘤疫苗取得了重大进展，标志着癌症免疫治疗的新时代。这些疫苗利用mRNA的多功能性来激发针对癌症的强烈免疫反应，通过编码肿瘤抗原来实现。这种方法促使免疫系统识别并消除表达这些抗原的癌细胞。mRNA疫苗的一个关键优势是其卓越的安全特性。与基于DNA的治疗方法不同，mRNA疫苗不会整合到宿主基因组中，从而消除了插入突变的风险。此外，mRNA同时编码多个抗原的能力提高了疫苗的效力，并为个性化疫苗的开发铺平了道路。mRNA表达的短暂性质确保了抗原刺激是暂时的，有效地降低了慢性炎症或自身免疫反应的可能性。此外，mRNA疫苗的快速设计和合成能力使人们能够迅速应对不断演变的肿瘤学挑战，包括根据个体患者的特定肿瘤特征定制疫苗，标志着向个性化癌症治疗迈出了重要一步。尽管mRNA癌症疫苗显示出相当的前景，但其更广泛的应用受到几个挑战的阻碍。这些挑战包括mRNA固有的不稳定性、需要高效和有针对性的递送系统以及肿瘤细胞可能的免疫耐受和逃避。这些挑战是当前研究工作的重点。因此，优化mRNA序列以实现最大的蛋白质表达、确保mRNA稳定性以及增强递送方法以实现最佳的细胞摄取和抗原呈递是正在进行研究的关键领域。针对2019冠状病毒病（COVID-19）的mRNA疫苗的成功开发通过全面优化mRNA结构克服了技术瓶颈。这一成就是通过对mRNA的每个方面进行重新设计和增强，从而提高其稳定性和表达效率而实现的。此外，多种mRNA递送系统的进步促进了mRNA分子的高效和靶向递送。mRNA癌症疫苗也从所有这些进展中受益，随着临床试验的进展，mRNA癌症疫苗正在成为抗击癌症的有希望的工具。本综述深入探讨了mRNA疫苗在肿瘤学领域的开发和应用。我们全面总结了mRNA癌症疫苗的开发历史，突出了抗原表达载体的结构优化以增强mRNA稳定性和翻译效率。此外，我们还讨论了其他基于RNA的抗原表达载体在癌症疫苗开发中的应用和未来前景。我们介绍了用于mRNA疫苗的LNP递送系统，强调了靶向策略。我们还阐明了各种类型的mRNA癌症疫苗及其目前的发展状态。预计mRNA疫苗将克服癌症治疗中的各种挑战，并成为癌症免疫治疗的主要方式。 2.mRNA癌症疫苗作为一种创新治疗方法的概念 随着两种COVID-19疫苗的应用，mRNA疫苗的流行度显著上升，标志着它们的发展和公众认可的一个关键时刻。然而，mRNA疫苗的研究和开发早在COVID-19大流行之前就已经开始了。这一旅程始于体外合成mRNA及其在体内表达的成功（表1）。在20世纪90年代初，人们开始努力开发用于预防肿瘤的mRNA疫苗。Martinon F.等人的一项里程碑式研究表明，使用包裹在脂质体中的mRNA编码流感病毒核蛋白（NP），在小鼠中诱导产生抗流感细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），展示了首次使用mRNA刺激体内抗原特异性免疫反应。Boczkowski等人通过将编码肿瘤抗原的mRNA转染到树突细胞中，进一步推动了这项研究，导致在体外和体内产生CTLs。这项研究在展示mRNA诱导抗肿瘤免疫反应的潜力方面具有关键意义。然而，早期的mRNA分子由于不稳定性和低表达效率而面临限制。未修饰的mRNA最初因其高免疫原性而闻名，通过toll样受体（TLR3、TLR7、TLR8和TLR9）激活先天免疫反应。随后将修饰的核苷（如m5C、m6A、m5U、s2U和伪尿嘧啶）纳入mRNA配方中显著降低了它们的免疫原性，完全用伪尿嘧啶替代尿嘧啶提高了mRNA的稳定性和翻译效率。做出这些突破性发现的科学家Katalin Karikó博士和Drew Weissman博士因其关于核苷碱基修饰的发现，使COVID-19有效的mRNA疫苗的开发成为可能，被授予2023年诺贝尔生理学或医学奖。 表1. mRNA疫苗开发中的最新里程碑事件 对siRNA的脂质体传递的研究为LNP系统的进展提供了宝贵的见解。自那以后，LNPs已被验证为体内mRNA传递的有效载体，在各种预防性和治疗性疫苗策略中。COVID-19大流行凸显了mRNA技术的巨大潜力，为mRNA基础癌症疫苗的开发提供了宝贵的见解。此外，个性化新抗原疫苗的出现为患有各种恶性肿瘤的患者带来了实质性的临床益处。mRNA-4157与pembrolizumab联合进入黑色素瘤患者的III期临床试验，代表了个性化mRNA癌症疫苗领域的一个重大里程碑。当前对mRNA癌症疫苗的研究主要集中在消除mRNA的免疫原性和不稳定性、开发高效和有针对性的mRNA递送系统，以及推进个性化mRNA癌症疫苗的开发。本文的后续部分将对这些关键方面进行更全面的探讨。 3.用于抗原表达的RNA基载体 3.1.体外转录mRNA的设计策略 体外转录（IVT）mRNA的结构，反映真核mRNA，包括5'帽、编码蛋白质的开放阅读框（ORF）、5'和3'非翻译区（UTRs）以及3'聚（A）尾。每个mRNA片段的结构复杂性显著影响翻译效率、属性和免疫原性，使优化对mRNA技术的效力至关重要。对于IVT mRNA，5'帽结构（m7GpppN）对稳定性和翻译效率至关重要。形成帽的两种主要方法是天花病毒capping酶（VCE）介导的capping和共转录capping。VCE capping提供特异性，但成本更高，复杂性更大，而共转录capping更简单但效果较差。最近的进步包括使用VCE在5'端引入GTP类似物，创建修饰的mRNA。此外，将T7 RNA聚合酶与VCE整合简化了帽修饰mRNA合成，减少了对昂贵类似物的需求。持续的帽类似物优化显著提高了mRNA稳定性和转录，增强了其研究和应用潜力（表2）。此外，最近的一项研究表明，随着年龄的增长，mRNA帽中的cap1向cap2转变，减少了RIG-I受体激活并增加了mRNA稳定性。纳入cap2可能减少免疫原性并延长mRNA寿命。 表2. 不同代的 mRNA 帽类似物 mRNA的5'非翻译区（UTR），对基因表达调控至关重要，可以优化以提高翻译效率。例如，调整AUG密码子位置或纳入非结构化序列可以提高翻译效率。较短的5' UTR，大约17个核苷酸，也有助于减少变异性和翻译问题。与5' UTR类似，3' UTR也包含几个调控元件，在调节mRNA稳定性、亚细胞定位和翻译效率方面也起着关键作用。关键策略包括避免miRNA结合位点，消除腺嘌呤/尿嘧啶富集元件，并最小化其长度。尽管设计最佳UTRs存在挑战，但自然UTRs，如BNT162b2 COVID-19疫苗中使用的人类α-珠蛋白mRNA的5' UTR，通常因其证明的基因表达效率而更受青睐。然而，UTRs对不同类型的细胞影响不同，需要针对特定目标细胞进行定制优化。高通量筛选（HTS）技术和遗传算法的快速发展，有助于从细胞或病毒基因组中识别出潜在的优化序列，这些序列来自5' UTR和3' UTR的多样化库。 mRNA中编码序列（CDS）的优化对于有效的基因表达至关重要。常见的策略包括将宿主细胞中罕见的密码子替换为更普遍的同义密码子。2005年，Karikó等人通过纳入前文提到的修饰核苷，解决了mRNA高免疫原性和低蛋白表达的挑战。此外，GC含量和mRNA二级结构等因素显著影响mRNA翻译。然而，尽管这些优化策略有效，但在充分发挥mRNA序列潜力以达到最佳性能方面仍有局限性。在精准医学领域，开发mRNA设计算法是一个有前景的方法，以克服这些挑战。这些算法专注于识别具有稳定二级结构、增强翻译效率和优化密码子的mRNA序列，预计将大大促进基于mRNA的技术发展。我们在这里列出了一些，以及它们的特点和优缺点（表3）。 表3. mRNA设计算法。 聚腺苷酸尾，以长重复的聚腺苷酸序列为特征，在防御mRNA免受酶解乙酰化和降解方面发挥着关键作用，从而增强其稳定性和翻译效率。在聚腺苷酸序列之间加入短序列或硫代磷酸已被证明可以进一步提高稳定性。例如，BNT162b2的聚腺苷酸尾序列包括30A + 10GCAUAUGACU + 70A的结构。此外，最近的一项研究表明，含有20%胞嘧啶的聚腺苷酸尾可以保护mRNA免受去乙酰化酶活性的影响，并显著提高mRNA的翻译效率和半衰期。 mRNA结构的优化策略可以协同使用，以增强蛋白质生产。mRNA疫苗的进步强调了需要一个普遍标准化的mRNA设计和筛选协议。全面的筛选和精确定制的针对特定目标的序列有望在未来的mRNA设计中实现多样化的增强。这种方法使个性化适应特定细胞类型和独特的微环境，从而最大化每个mRNA转录本的蛋白质合成效率。 3.2.其他基于RNA的抗原表达载体 mRNA目前的不稳定性在其作为治疗剂的应用中提出了重大限制，促使最近的研究专注于探索替代的RNA载体。除了线性mRNA，其他几种类型的RNA载体迅速发展（图1）。其中一种有前景的载体是自我复制的RNA（saRNA），它来源于病毒并携带RNA聚合酶序列。这种saRNA表现出自我复制和翻译能力，使其能够以最小的量引发可检测的保护性免疫反应。这一特性表明saRNA可以有效地应用于癌症疫苗。几项探索这种潜力的临床前研究已经在进行中。例如，一项比较研究表明，针对人乳头瘤病毒（HPV）的saRNA与未修饰和修饰的非复制mRNA相比，显示出更强的抗肿瘤效果。然而，目前尚不清楚RNA聚合酶在体内是否会引发免疫反应。 图1. 在 mRNA 癌症疫苗中使用的不同类型的 RNA 表达载体 此外，saRNA的较大尺寸可能为现有递送系统带来新的挑战。解决这个问题的一个潜在策略是将编码RNA聚合酶的序列与目标蛋白的序列在空间上分离。 环状RNA（circRNA），由于其共价环状结构，由于其对RNase的抗性，提供了比mRNA更高的稳定性。这一特性为RNA疫苗提供了独特的优势。Qu等人开发的circRNA疫苗平台已显示出对多种COVID-19变体的保护效果，为基于circRNA的癌症疫苗的开发提供了宝贵的见解。研究表明，编码抗原或细胞因子的circRNA分子在抑制肿瘤方面比mRNA疫苗更有效。此外，Amaya等人强调了circRNA作为佐剂在增强抗肿瘤效果中的作用。然而，这些效果背后的确切机制尚未完全理解。在最近的一项研究中，Huang等人表明，肿瘤特异性circRNA circFAM53B通过表达特定肽段启动抗肿瘤免疫，强调了circRNA在免疫疗法中的潜力。 尽管取得了这些进展，circRNA合成仍然存在挑战，包括次优的环化效率和酶等试剂的高成本。尽管如此，circRNA作为一种有前景的基于RNA的治疗剂和疫苗类别，具有重要的未来潜力。 最近的一项进展涉及将短双链RNA（dsRNA）与单链mRNA杂交，形成树状、梳状结构，既作为抗原表达载体，又作为免疫佐剂。这种方法允许通过操纵dsRNA的长度、序列和数量，精确控制mRNA疫苗中的免疫刺激强度。这种梳状RNA设计适用于正在开发的多种mRNA疫苗，预计将显著提高其效力和安全性。 mRNA疗法的一个关键组成部分是递送系统。常见的递送系统包括精蛋白、脂质复合体（LPX）、脂多聚复合体（LPP）、病毒样颗粒（VLPs）、树突细胞和脂质纳米颗粒（LNPs）。由于LNP技术在当前应用中最先进的地位，本综述主要关注LNP技术的应用。 LNPs通常由阳离子或可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质组成。阳离子或可电离脂质在酸性条件下带正电荷，通过静电相互作用与带负电荷的mRNA结合。在内体中，这些脂质质子化，有助于mRNA逃逸以进行细胞质中的抗原表达。胆固醇提高LNP稳定性，帮助内吞作用和内体逃逸，而磷脂促进mRNA封装和稳定性，聚乙二醇化防止体内蛋白-LNP相互作用。 最初为递送siRNA而开发的LNP技术已经适应于mRNA封装和递送。虽然提供了高效的mRNA包装和生物相容性，但大多数LNPs在给药后在肝脏中积累，可能导致肝毒性。当前LNP-mRNA癌症疫苗的重点是针对选择性mRNA递送到特定器官或细胞的靶向策略。 LNP靶向的最新进展包括被动或主动方法到肿瘤。有效的抗肿瘤免疫取决于将编码抗原的mRNA递送到抗原呈递细胞（APCs），设计用于靶向免疫细胞的LNP预计将增强抗肿瘤反应并最小化全身副作用。作为被动靶向方法，靠近淋巴结的皮下注射在多项研究中证明是有效的。然而，皮下给药的LNPs也可以在肝脏和脾脏等器官中积累，可能影响疫苗的效力和安全性。 LNP脂质结构的修饰是另一种靶向策略，因为LNPs自然地在体内与血浆蛋白相互作用，形成“蛋白冠”，改变它们与细胞和器官的相互作用。临床前研究表明，这些修饰可以显著影响mRNA递送和LNP靶向。例如，脂质113-O12B特别靶向淋巴结，并被大量树突细胞和巨噬细胞摄取，诱导强大的免疫反应，并且当与抗PD1抗体结合时，实现了40%的完全肿瘤缓解率。然而，体内筛选有局限性，包括动物使用的伦理问题和体外筛选无法准确预测体内递送效率。 调节LNPs的内部和/或外部电荷对于靶向至关重要。为组织特异性mRNA递送和CRISPR/Cas基因编辑开发的SORT纳米颗粒与血清蛋白相互作用，这些血清蛋白结合到目标器官细胞上的受体，允许选择性器官靶向。然而，依赖于内源性患者蛋白进行靶向可能导致脱靶效应和个体间变异。 LNPs的被动靶向因其简单性和广泛适用性而受欢迎，但缺乏特异性。主动靶向虽然更具体和高效，但涉及更高的成本和潜在的免疫原性风险。因此，靶向LNPs在mRNA递送中代表了一个有前景的途径，未来的研究需要优化被动和主动策略，以提高LNP在mRNA和药物递送中的性能和安全性。 4.mRNA癌症疫苗的分类 4.1.编码病毒抗原的mRNA基础癌症疫苗 针对病毒抗原的mRNA基础癌症疫苗的开发是一个新兴领域。这些疫苗特别适用于与病毒相关的恶性肿瘤，如人乳头瘤病毒（HPV）、乙型肝炎（HBV）、Epstein-Barr（EBV）和HIV，它们与宫颈癌、肝癌和鼻咽癌等有关。传统的针对这些病毒的疫苗主要是预防性的。然而，基于mRNA的疫苗提供了一种治疗性方法，通过刺激身体的免疫系统识别和攻击表达这些病毒抗原的细胞。例如，最近的一项研究表明，一种信使RNA-HPV治疗性疫苗（mHTV）在小鼠和非人灵长类动物中显示出强大的免疫原性和抗肿瘤效果，使mHTV成为HPV有希望的治疗性和预防性疫苗。 mRNA疫苗平台的灵活性在个性化医学中特别有价值。根据个体患者的病毒抗原档案定制疫苗可以解决病毒癌基因不断演变带来的挑战，提供更有效的治疗方法。HIV以其快速变异和多样性而闻名，在疫苗开发中提出了重大挑战。基于mRNA的HIV疫苗在小鼠和灵长类动物中诱导了体液和细胞免疫反应，恒河猴在接受初免和加强疫苗后SHIV暴露减少了79%。最近针对HIV的mRNA疫苗eOD-GT8 60mer的I期临床试验显示良好的安全性，并在97%的参与者（35/36）中诱导了广泛的中和抗体（bnAbs），证明了mRNA疫苗在HIV预防中的潜力。此外，mRNA疫苗为慢性病毒感染如HBV提供了一种新方法。目前正在进行针对乙型肝炎病毒相关肝细胞癌（HCC）的治疗性mRNA疫苗（NCT05738447）的临床试验。 EBV与多种癌症有关，包括鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤和胃癌。EBV的复杂性质及其与宿主免疫系统的相互作用为疫苗开发带来了重大挑战。特别是，EBV在宿主细胞内的潜伏使免疫系统难以检测和根除。迄今为止，尚未有针对EBV感染的疫苗获批，针对EBV的mRNA疫苗的开发仍处于临床前阶段，尽管它们显示出了有希望的潜力。 尽管mRNA疫苗有潜力预防与癌症相关的病毒感染，但针对癌症相关病毒的疫苗主要仍处于临床前阶段。这是由于病毒突变、免疫逃逸和长期感染引起的免疫耐受等挑战。未来的研究需要集中克服这些障碍，开发更有效的针对这些病毒的mRNA疫苗。 4.2.编码肿瘤抗原的mRNA疫苗 4.2.1.肿瘤相关抗原（TAAs） TAAs是一类在肿瘤中比正常组织表达水平显著更高的抗原。这种过度表达使它们成为癌症疫苗的主要靶点。这些疫苗可以根据个体TAAs定制，与传统疗法如化疗或放疗相比，提供增强的效力和减少的副作用。这种个性化方法标志着肿瘤学的重大进步，呈现出更有针对性的、针对特定患者的治疗策略。一些已知的TAAs列在表4中。 表4. 不同癌症类型研究充分的肿瘤相关抗原(TAA)列表。 尽管TAAs有潜力，但针对TAAs的mRNA疫苗也有局限性。作为非突变自身抗原，TAAs可能导致临床免疫治疗中T细胞反应差和免疫耐受。此外，TAA在正常细胞中的表达可能导致附带损伤。这些疫苗在TAAs表达水平低或发生突变的癌症中也可能效果较差。克服这些局限性的策略包括将癌症抗原与免疫刺激性分子共递送，增强肿瘤微环境中的免疫激活，并将疫苗与传统治疗如化疗或放疗结合使用。BNT111针对四种常见的TAAs（NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶、TPTE），在超过90%的皮肤黑色素瘤患者中，BNT111诱导了对这些抗原的新的和增强的免疫反应（I期临床试验，NCT02410733）。正在进行的II期试验（BNT111-01，NCT04526899）将BNT111与Cemiplimab（由Regeneron Inc.制造的抗PD1抗体）结合使用，用于对抗PD-1疗法无反应的晚期不可切除III期或IV期黑色素瘤患者。 在编码TAAs的mRNA疫苗中，应优先考虑仅在肿瘤细胞中表达的TAAs，最小化在正常细胞中的表达。全面研究TAAs在肿瘤和正常组织中的表达模式对于确定更安全、更有效的靶点至关重要。 4.2.2.肿瘤特异性抗原（TSAs） 肿瘤特异性抗原（TSAs）是与正常细胞相比，在癌细胞中独特表达或显著过度表达的蛋白质或肽片段。这些抗原来源于各种致癌过程，包括突变、异常基因表达和翻译后修饰。新抗原通过主要组织相容性复合体（MHC）分子呈现在癌细胞表面。这些新抗原在正常组织中不存在，使它们成为免疫治疗策略的理想靶点。它们对个体肿瘤的独特性避免了与靶向共享肿瘤抗原时常伴随的耐受性和自身免疫问题。2014年，Tran等人成功地使用针对ERBB2IP特异性的CD4+细胞治疗了一名胆管癌患者，实现了完全肿瘤消退，展示了TSAs在诱导抗肿瘤反应中的潜力。他们还在10名胃肠道肿瘤患者中的9名中发现了基因突变，这表明肿瘤异质性的广泛存在，即使在同一肿瘤类型中，不同患者之间的TSAs也各不相同。开发个性化的mRNA疫苗涉及通过先进的测序和生物信息学方法识别和选择新抗原。下一代测序（NGS）、高通量筛选和机器学习算法通过识别个体肿瘤基因外显子中的突变和异常转录/翻译事件，促进了TSA预测。 个性化mRNA新抗原疫苗的临床潜力得到了其诱导强大和特异性免疫反应的能力的支持。早期临床试验已经显示出有希望的结果，有证据表明疫苗诱导的T细胞反应和潜在的临床益处（表5）。Ugur Sahin等人确定了13名黑色素瘤患者最有可能引发免疫反应的突变，并开发了编码多达10种新抗原的mRNA。临床试验表明，在13名患者中，有8名在接种疫苗后一年内没有复发，剩下的5名中有2名经历了肿瘤缩小，其中1名在接受PD-1抗体治疗时实现了完全缓解。mRNA-4157和BNT122是正在进行临床试验的两种典型的个性化mRNA疫苗。mRNA-4157编码34种针对个体患者肿瘤DNA中独特突变的抗原，正在进行黑色素瘤、非小细胞肺癌和其他实体瘤的临床试验。测试mRNA-4157与帕博利珠单抗（默克公司制造的抗PD1）联合用于头颈鳞状细胞癌患者的临床试验显示，总响应率为50%，疾病控制率为90%。两项IIb期临床试验结合mRNA-4157和帕博利珠单抗用于高危黑色素瘤患者，分别降低了44%和49%的复发或死亡风险，表明治疗时间更长时效益更明显。mRNA-4157和帕博利珠单抗的联合疗法已进入III期临床试验（NCT05933577），标志着它是第一个达到这一阶段的mRNA癌症疫苗。 表5. 已发布结果的代表性 mRNA 疫苗临床试验 个性化的mRNA疫苗为目前免疫疗法抵抗的癌症提供了有希望的治疗方法，如胰腺导管腺癌（PDAC），它对免疫检查点抑制剂（ICIs）表现出抵抗性。胰腺癌中新抗原的丰富使基于新抗原的mRNA疫苗成为一种可行的治疗策略。BNT122利用mRNA在PDAC患者中表达20种新抗原。当与化疗和免疫检查点疗法结合使用时，BNT122显示出在减缓PDAC患者复发方面的潜力，随后将进行一项随访的全球随机试验（IMCODE 003，BNT122）。 TSA mRNA疫苗代表了一种高度个性化的方法，为每个人的肿瘤抗原量身定制每种疫苗。结合免疫检查点抑制剂，这些疫苗为长期以来对医学科学具有挑战性的疾病治疗提供了新的途径。 4.3.编码免疫调节因子的mRNA 肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特征包括T细胞浸润有限或存在大量免疫抑制细胞，这有助于对抗目前的治疗方法。细胞因子对调节免疫细胞间的细胞间通信至关重要，能够有效地转导免疫信号，并协调针对目标抗原的强大免疫反应。通过mRNA传递细胞因子、共刺激配体或其他免疫调节因子可以有效重塑TME并增强肿瘤对各种免疫疗法的敏感性。 创新方法包括使用纳米粒子将编码肿瘤抑制因子p53的mRNA传递到肝癌细胞，并结合抗PD-1单克隆抗体。这一策略已显示出在调节TME和实现抗肿瘤效果方面的有效性。此外，以前的研究利用编码caTLR4和共刺激配体CD70和CD40L的mRNA来刺激APCs中的免疫反应。随后在T细胞功能上的增强已被证明可以有效对抗肿瘤，并抑制小鼠早期可切除乳腺癌的病变。mRNA-2752是一种编码三种免疫调节因子的mRNA疫苗，目前正在进行I期和II期临床试验，以评估其安全性和耐受性，无论是作为单独治疗还是与固定剂量的durvalumab（由AstraZeneca Inc.制造的抗PDL1抗体）联合用于晚期恶性肿瘤患者。 5.结论和未来展望 COVID-19疫苗的成功部署显著加快了mRNA技术在肿瘤学中的进展。利用创新的RNA基载体和靶向策略，正在开发新的mRNA疫苗平台以针对广泛的肿瘤抗原。值得注意的是，个性化mRNA疫苗在癌症治疗中取得了显著的突破。这些疫苗在临床试验中显示出增强的潜力，特别是与传统治疗，包括ICI和传统治疗方法结合使用时。 尽管发展全面，mRNA癌症疫苗仍面临多重挑战。进一步的研究对于完善这些疫苗的开发和应用至关重要。疫苗设计、递送技术和快速识别肿瘤新抗原的持续改进是关键，使mRNA疫苗成为个性化癌症治疗中的有希望的工具。

摘要：抗体药物偶联物（ADC）通常由单克隆抗体（mAbs）通过化学连接臂共价连接到细胞毒素药物。它结合了高度特异性靶向能力和高效杀伤效果的优势，实现对癌细胞的精准和高效清除，已成为抗癌药物研发的热点之一。自第一个ADC药物Mylotarg®（吉妥珠单抗奥佐加霉素）在2000年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准以来，全球迄今已有14种ADC药物获得市场批准。此外，目前有100多个ADC候选药物正在临床阶段进行研究。这种被称为“生物导弹”的新型抗癌药物，正在引领靶向癌症治疗的新时代。在这里，我们对ADC的历史和作用机制进行了回顾，并简要讨论了ADC关键组成部分的分子方面以及这些关键因素如何影响ADCs的活性。此外，我们还回顾了已批准的ADCs和在III期临床试验中其他有前景的候选药物，并讨论了下一代开发当前的挑战和未来的展望，为使用ADCs研发新型癌症治疗方法提供了见解。 1.  引言 癌症已成为全球第二大健康威胁，2020年约有1000万人死于癌症。几十年来，基于细胞毒素剂的化疗一直是治疗广泛癌症的主要方法。这些细胞毒素剂包括DNA碱基类似物（5-氟尿嘧啶和8-氮鸟嘌呤）、DNA作用剂（顺铂和放线菌素D）、抗代谢物（氨基蝶呤和甲氨蝶呤）和微管抑制剂（紫杉醇和长春新碱衍生物）等。然而，这些化疗药物大多表现出较低的治疗指数，严重的副作用通常归因于非特异性药物暴露于非靶组织。为了解决这个问题，科学家一直在开发具有更高靶向能力的新型癌症治疗方法。 早在20世纪初，保罗·埃尔利希首次提出了“魔法子弹”的概念，并假设某些化合物可以直接作用于细胞中的某些期望靶标以治疗疾病。理论上，这些化合物应该能有效杀死癌细胞，但对正常细胞无害。一种可行的方法是识别一些在癌细胞上特异性高表达的抗原，以区分癌细胞和健康细胞，如乳腺癌上的HER2（人类表皮生长因子受体2）和B细胞淋巴瘤上的CD20（分化簇20）。这些抗原的特异性表达为通过单克隆抗体（mAbs）精确靶向肿瘤提供了可能性，自1975年杂交瘤技术发展以来，这一领域取得了巨大进步。近几十年来，越来越多的mAbs，如阿瓦斯汀、曲妥珠单抗、利妥昔单抗和小细胞肺癌，已在全球范围内获得批准，用于治疗各种实体瘤和血液癌症。 mAbs的出现通过精确靶向肿瘤表面抗原改变了癌症治疗的范式，然而，单独使用mAbs治疗通常是不够的，可能由于与化疗相比对癌细胞的致死性不够满意。因此，提出了一种新概念，即抗体-药物偶联物（ADC），以弥合mAb和细胞毒素药物之间的差距，提高治疗窗口。ADC由肿瘤靶向mAbs通过精心设计的化学连接臂与细胞毒素有效载荷共轭，实现了精确靶向和强大效果的双重能力。此外，由于连接到一个大的亲水性抗体，细胞毒素有效载荷在抗原阴性细胞中的非特异性摄取受到限制，有助于扩大治疗指数。 2000年，美国食品药品监督管理局（FDA）首次批准了ADC药物Mylotarg®（吉妥珠单抗奥佐加霉素），用于治疗成人急性髓细胞性白血病（AML），这标志着癌症靶向治疗ADC时代的开始。截至2021年12月，全球已有14种ADC药物获得批准，用于血液系统恶性肿瘤和实体瘤。此外，目前有100多个ADC候选药物处于不同的临床试验阶段。ADC药物从其起步阶段到成熟发展阶段在过去一百年中的里程碑事件如图1所示。随着靶标和适应症的不断扩大，ADC正在引领靶向癌症治疗的新时代，预计未来将取代传统的化疗。在这篇综述文章中，我们讨论了ADC的关键组成部分的分子方面和作用机制，并简要总结了ADC发展的进展。我们还回顾了已批准的ADCs和III期临床试验中的其他有前景的候选药物，并讨论了下一代ADC开发的当前挑战和未来展望。 图1 展示了自1910年Paul Ehrlich提出“魔法子弹”概念以来，过去一个世纪ADC药物开发和批准的重要事件时间线。ADC代表抗体药物偶联物；CEA代表癌胚抗原；ALL代表急性淋巴细胞性白血病；BR96是一种结合Lewis Y的抗体；DOX代表多柔比星；FDA代表美国食品药品监督管理局。 2.  ADC的关键组成部分 如图2所示，ADC由抗体、细胞毒素有效载荷和化学连接臂组成。一个理想的ADC药物在血液循环中保持稳定，准确到达治疗目标，并最终在目标附近（例如癌细胞）释放细胞毒素有效载荷。每个元素都可能影响ADC的最终疗效和安全性，通常ADC开发需要考虑所有这些关键组成部分，包括选择目标抗原、抗体、细胞毒素有效载荷、连接臂以及偶联方法。 图2 展示了ADC药物的结构和特点。核心组成部分包括目标抗原、抗体、连接体、细胞毒素药物以及它们的关键功能。 2.1.  目标抗原选择 肿瘤细胞上表达的目标抗原是ADC药物识别肿瘤细胞的导航方向，它还决定了将细胞毒素有效载荷输送到癌细胞的机制（例如内吞作用）。因此，适当的选择目标抗原是ADC设计的首要考虑因素。为了减少非靶组织的毒性，目标抗原首先应该在肿瘤细胞中特异性表达或占主导地位，在正常组织中很少或很低表达。理想情况下，抗原是表面（或细胞外）抗原，而不是细胞内抗原，以便被循环中的ADC识别。例如，某些肿瘤中HER2受体的表达量比正常细胞大约100倍，这为阿多珠单抗艾美曲辛、法姆珠单抗德鲁替康和迪司他珠单抗的发展成为坚实的基础。其次，目标抗原应该是非分泌性的，因为循环中的分泌性抗原会导致不希望的ADC在肿瘤外部位点的结合，导致肿瘤靶向性降低和安全性问题增加。第三，目标抗原理想情况下在与相应抗体结合后能够被内吞，以便ADC-抗原复合物进入癌细胞，随后通过适当的细胞内运输途径和有效释放细胞毒素有效载荷。 目前，如图3所示，已批准的ADC药物的目标抗原通常是癌细胞中特异性高表达的特定蛋白质，包括实体瘤中的HER2、Trop2、Nectin4和EGFR，以及血液系统恶性肿瘤中的CD19、CD22、CD33、CD30、BCMA和CD79b。在肿瘤学和免疫学基础研究的推动下，ADC目标抗原的选择已逐渐从传统的肿瘤细胞抗原扩展到肿瘤微环境中的目标，例如基质和血管。越来越多的证据表明，新血管系统的组成部分、亚内皮细胞外基质和肿瘤基质可能是ADC药物开发中有价值的目标抗原。例如，基质靶向ADC药物有潜力通过降低基质细胞产生的生长因子浓度来引起癌细胞死亡。由于癌细胞的生存依赖于血管生成和基质因子，ADCs可能通过靶向这些组织具有更广泛的疗效。此外，这些细胞的基因组比癌细胞更稳定，这可能为降低突变诱导的药物抗性提供了有希望的手段。 图3 展示了用于开发ADC的重要肿瘤细胞靶点抗原（过度表达和驱动基因）以及肿瘤微环境（血管和基质）。这些图像是使用BioRender.com创建的。 2.2.  抗体质点 肿瘤靶向抗体对于ADC与目标抗原之间的特异性结合至关重要。理想的抗体质点除了对目标抗原具有高亲和力外，还应促进有效的内吞作用，展示低免疫原性，并保持长的血浆半衰期。在ADC药物开发的早期阶段，主要使用小鼠来源的抗体，但由于严重的免疫原性相关的副作用，导致高失败率。随着重组技术的出现，小鼠抗体大多被嵌合抗体和人源化抗体所取代。目前，ADC越来越采用完全人源化的抗体，显著降低了免疫原性。在14种批准的ADC药物中，只有brentuximab vedotin使用嵌合抗体。 作为血清中免疫球蛋白的主要组成部分，目前ADC药物中使用的抗体大多是免疫球蛋白G（IgG）抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四个亚型。IgG1是ADC常用的亚型，因为IgG1在血清中含量最丰富，并且能够通过与Fc受体的高亲和力诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）等强效应器功能。这些Fc介导的效应功能在抗体药物的抗癌活性中起着至关重要的作用。IgG3很少用于ADC，因为其清除速率很快。与其他三种亚型的半衰期大约21天不同，IgG3在血清中的半衰期仅为大约7天。IgG2在体内通常倾向于形成二聚体和聚集体，导致ADC药物的浓度降低。IgG4可以诱导ADCP，然而，IgG4是一种具有Fab臂交换的异常动态抗体，导致效力降低和靶向效果不佳。 关于抗体-抗原复合物的内吞作用，效率主要取决于抗体与肿瘤细胞表面抗原之间的结合亲和力，其中更高的亲和力通常导致更快的内吞作用。然而，具有高抗原亲和力的抗体可能会减少进入实体瘤的渗透。实体瘤的治疗比血液瘤更复杂，因为实体瘤存在“结合位点屏障（BSB）”，极其强烈的抗体与抗原结合导致ADCs在从血管渗出后被困在血管附近，而较少渗透到远离血管的肿瘤细胞。因此，抗原与抗体之间的合理亲和力应该被优化，以平衡在目标细胞中的快速吸收和抗癌效力。除了结合亲和力外，影响肿瘤渗透的另一个因素是抗体的大小。IgG抗体（约150 kDa）的分子量大通常对通过血浆毛细血管和肿瘤基质的渗透构成挑战。因此，早期ADC主要针对血液系统恶性肿瘤。为了使ADC更好地适用于实体瘤治疗，研究人员尝试通过去除FC段来缩小抗体的大小。缩小的抗体不仅保持了高亲和力和特异性，而且还更容易通过血管渗透到实体瘤中，从而大大提高了对实体瘤的杀伤效果。然而，这样的变化也被发现会导致体内半衰期的减少。因此，在设计使用缩小抗体的ADC时，应考虑多种因素。 2.3.  连接臂 ADC中的连接臂连接抗体与细胞毒素药物。它是与ADC稳定性和有效载荷释放特性相关的关键因素之一，因此对ADC的最终治疗指数至关重要。理想的连接臂不应引起ADC聚集，预期限制血浆中有效载荷的过早释放，并促进在期望的目标部位释放活性药物。根据细胞内的代谢命运，可裂解和不可裂解连接臂在大多数ADC药物中得到应用。 可裂解连接臂利用系统循环和肿瘤细胞之间的环境差异来准确释放游离细胞毒素药物，它们可以进一步细分为化学裂解连接臂（腙键和二硫键）和酶裂解连接臂（葡萄糖苷酸键和肽键）。腙是一种典型的酸敏感（pH敏感）连接臂。腙连接的ADC通常在血液循环中稳定，但在内吞进入目标癌细胞后，在溶酶体（pH 4.8）和内质体（pH5.5–6.2）中水解，释放细胞毒素有效载荷。然而，腙键的水解并不完全局限于溶酶体，偶尔也会在血浆中发生，导致靶向效率降低和非靶向效应。迄今为止，含腙连接臂的ADC主要用于血液系统恶性肿瘤。例如，gemtuzumab ozogamicin和inotuzumab ozogamicin分别使用腙连接卡利奇霉素与mAbs治疗AML和急性淋巴细胞性白血病（ALL）。基于二硫键的连接臂是另一种化学敏感的可裂解连接臂，对还原性谷胱甘肽（GSH）敏感。GSH在维持细胞存活、增殖和分化以及维持细胞内氧化还原平衡方面发挥着至关重要的作用。血液中的GSH浓度远低于癌细胞内的浓度。因此，这种类型的连接臂可以保持在血液系统中稳定，同时在GSH水平升高的癌细胞中特异性释放活性有效载荷。 在酶敏感连接臂方面，基于肽的连接臂对溶酶体蛋白酶敏感，已在许多ADC中得到应用。溶酶体蛋白酶，如卡他蛋白B，在癌细胞中通常过度表达，使药物能够在肿瘤附近准确释放。此外，由于血液中存在蛋白酶抑制剂，连接臂通常在系统循环中稳定，降低了副作用的风险。在批准的ADC药物中，有9种使用基于肽的连接臂。例如，brentuximab vedotin使用缬氨酸-瓜氨酸连接臂。此外，β-葡萄糖苷酸连接臂是ADC中常用的另一种酶敏感连接臂。它可以通过β-葡萄糖苷酸酶在细胞内裂解，释放有效载荷，该酶在肿瘤区域的水平通常较高。 相比之下，不可裂解连接臂（例如硫醚或马来酰亚胺己酰基团）对体内的常见化学和酶环境无反应。不可裂解连接臂的最大优势是其低非靶向毒性，得益于血浆稳定性的提高。不可裂解连接臂依赖于ADC的抗体部分的酶促水解，最终释放与抗体降解产物中的氨基酸残基连接的“复合体”有效载荷。只有能够耐受化学修饰的小分子（例如，药效团远离偶联位点时）才适合基于硫醚的连接臂。ado-trastuzumab emtansine（T-DM1）展示了硫醚连接臂的成功应用。该偶联物是抗HER2单克隆抗体与DM1（美登木素）通过琥珀酰亚胺-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸盐（SMCC）连接臂链接的产物。连接臂使偶联物在血液中更稳定，并在癌细胞内经蛋白酶消化抗体部分后释放活性代谢物赖氨酸-MCC-DM1。 2.4.  细胞毒素有效载荷 细胞毒素有效载荷是ADC进入癌细胞后发挥细胞毒性的弹头。由于静脉注射后只有大约2%的ADC能够到达目标肿瘤部位，因此作为ADC中的有效载荷，化合物需要具有很高的效力（IC50在纳摩尔和皮摩尔范围内）。此外，这些化合物应在生理条件下保持稳定，并具有可用于与抗体偶联的官能团。目前，ADC中使用的主要细胞毒素有效载荷包括强效的微管抑制剂、DNA损伤剂和免疫调节剂（表1）。 微管是细胞骨架的主要成分，在细胞分裂中发挥重要作用，尤其是在肿瘤细胞的快速增殖中。微管抑制剂包括促进微管聚合和抑制微管聚合的药物，它们已成为抗癌药物研发的热点之一。微管聚合促进剂靶向微管二聚体的β亚基，干扰微管依赖的有丝分裂，其代表药物有auristatin衍生物单甲基auristatin E（MMAE）和单甲基auristatin F（MMAF）。在14种批准的ADC药物中，有5种使用MMAE/MMAF作为有效载荷。相比之下，微管聚合抑制剂阻断微管二聚体形成成熟的微管。典型的抑制剂包括maytansinoid衍生物DM1和DM4（ravtansine）。Ado-trastuzumab emtansine是2013年获得FDA批准的首个使用maytansinoid衍生物的ADC药物。此外，tubulysins（从粘细菌中分离出的四肽）是另一类微管聚合抑制剂，显示出有希望的抗癌活性。例如，EC1169是一种针对前列腺特异性膜抗原（PSMA）的tubulysin B hydrazide偶联物，目前正在进行临床试验（NCT02202447）。 与微管抑制剂的纳摩尔级 IC50（半最大抑制浓度）相比，DNA损伤剂的IC50值能够达到皮摩尔级别，因此与DNA损伤剂结合的抗体药物偶联物（ADCs）有时更有效，并且可能独立于细胞周期工作（与主要在有丝分裂阶段工作的微管蛋白抑制剂相比），它们甚至可能对那些抗原表达较低的细胞也有效。DNA损伤剂所涉及的详细机制主要包括：（i）DNA双链断裂，如卡利切阿米辛；（ii）DNA烷基化，如二卡霉素；（iii）DNA插入，如拓扑异构酶I抑制剂；（iv）DNA交联，如吡咯并苯并二氮卓（PBD）。卡利切阿米辛是一种天然烯二炔抗生素，对DNA损伤极为有效。与DNA的小沟结合后，卡利切阿米辛产生自由基并引起链断裂，从而诱导细胞死亡。在卡利切阿米辛衍生物中，卡利切阿米辛γ1是最显著的，用于吉妥珠单抗奥佐加米辛和伊诺珠单抗奥佐加米辛。二卡霉素是另一类极为有效的抗肿瘤抗生素，它与DNA的小沟结合并烷基化核苷酸腺嘌呤。SN-38（7-乙基-10-羟基喜树碱）和DXd（exatecan衍生物）是两种主要的喜树碱衍生物，作为ADC药物的有效载荷，通过抑制DNA拓扑异构酶I。例如，萨西图珠单抗戈维特坎是一种针对Trop-2的首创ADC，将SN-38与萨西图珠单抗偶联，而泛曲妥珠单抗德鲁斯特坎由一个针对HER2的抗体与DXd通过肽链偶联组成。PBD是在1960年代早期发现的一类抗肿瘤抗生素。PBD作为二聚体与DNA的小沟结合。结合后，二聚体促进与DNA上的鸟嘌呤在N2位置的氨基交联，从而阻止DNA与转录因子的结合，导致细胞增殖停滞，最终导致细胞死亡。这种机制不依赖于特定的细胞复制周期，DNA损伤难以修复，导致强大的细胞毒性。隆卡替珠单抗特西林是目前唯一在临床上使用，采用PBD作为有效载荷的ADC。除了传统的细胞毒素，越来越多的具有新机制的有效载荷被纳入ADC设计。例如，最近开始应用于新型ADC药物开发的小分子免疫调节剂，也被称为免疫刺激抗体偶联物（ISACs）。ISACs结合了抗体导航靶向的精确性和基于小分子的先天和适应性免疫系统调节的力量。在多种肿瘤模型中记录了有希望的肿瘤退缩和长期抗肿瘤免疫。目前，新型有效载荷主要包括Toll样受体（TLR）激动剂和干扰素基因刺激剂（STING）激动剂。TLRs是先天免疫中一组关键的模式识别受体，在免疫-肿瘤界面中发挥重要作用。例如，TLR7和/或TLR8的激活可以诱导依赖于MyD88的信号通路，激活NF-κB以分泌细胞因子和趋化因子，允许抗肿瘤淋巴细胞的渗透。BDC-1001是一种Boltbody ISAC，目前正在临床开发中（第1/2阶段，NCT04278144）。它由一个针对HER2的抗体与TLR7/8激动剂链接，用于治疗HER2阳性实体瘤患者。Silverback Therapeutics还开发了ImmunoTAC平台，并设计了几种使用TLR8激动剂作为有效载荷的ISACs，如SBT6050、SBT6290和SBT8230。至于STING，它也是一个研究充分的先天免疫途径，STING激动剂能够诱导抗肿瘤免疫活性。武田的CRD5500和Mersana的XMT-2056是两个正在进行临床开发的领先的STING激动剂ADC项目。ISACs是一个相对较新的领域，但一些候选药物已经相继进入临床开发，其后续进展值得期待。 2.5.  偶联方法 除了选择抗体、连接体和有效载荷外，小分子部分（即连接体加有效载荷）与抗体连接的方法对于成功构建ADC也很重要。通常，抗体上的赖氨酸和半胱氨酸残基提供了可接近的反应位点用于偶联，早期的ADC药物通常利用预先存在的赖氨酸或半胱氨酸残基上的随机偶联通过适当的偶联反应。酰胺偶联可以说是最常用的方法，其中活性羧酸酯（当连接体中存在时）用于将有效载荷连接到抗体上的赖氨酸残基，如在吉妥珠单抗奥佐加米辛、T-DM1和伊诺珠单抗奥佐加米辛中所见。然而，一个抗体通常包含大约80-90个赖氨酸残基，其中40个赖氨酸残基通常是可修饰的。通过与赖氨酸残基的随机偶联，可能将不同数量（0-8）的小分子毒素附加到一个抗体上，导致广泛的药物-抗体比（DAR）分布。此外，由于赖氨酸残基分布在抗体的轻链和重链上，靠近抗体-抗原识别位点的偶联反应可能会降低ADC与目标的结合。基于半胱氨酸的反应提供了另一种偶联方式。还原后，二硫键可以转化为可接近偶联反应的半胱氨酸残基。通常，IgG1抗体既有链间二硫键也有链内二硫键。链间二硫键暴露在抗体的外部，容易被还原以暴露自由的半胱氨酸残基，为连接体-有效载荷与抗体的偶联提供了可用的位点。由于结合位点数量有限以及巯基团的独特反应性，使用半胱氨酸作为连接位点有助于减少ADC的异质性。根据还原比例，可以生成DAR为2、4、6和8的产品，与赖氨酸残基偶联的产品相比具有更好的均匀性。这是迄今为止商业产品中最常用的偶联方法。然而，值得注意的是，打开链间二硫键可能会破坏抗体的完整性。通常与基于赖氨酸和半胱氨酸残基的随机偶联相关的一些缺点。这种偶联的稳定性有时不足，导致过早的有效载荷释放，从而产生非靶向毒性。此外，很难保证有效载荷连接到抗体上的一致位点，也很难实现质量控制和临床使用所青睐的均匀DAR。为了减少ADCs的异质性，已经在新的ADCs中开发了几种位点特异性偶联策略（表2）。首先，引入工程化反应性半胱氨酸残基已成为位点特异性偶联的常用方法。由Genentech开发的ThioMab技术利用基因工程技术在曲妥珠单抗的轻链V110A和重链A114C的特定位置插入半胱氨酸残基，然后与半胱氨酸上的硫醇基团偶联MMAE，合成位点特异性抗MUC16 ADC。产生的ADC中DAR为2的比例高达92.1%。此外，ThioMab技术没有影响免疫球蛋白的折叠和组装或抗体与抗原的结合。另一方面，ThioMab技术的一个主要限制是硫醇基团引入步骤可能会导致两个Fab之间的错误二硫键形成，这仍然是一个需要解决的挑战。此外，尽管偶联效率低和链内错误桥接，二硫键重新桥接偶联也引起了关注。与传统的半胱氨酸偶联类似，偶联位点也是通过还原链间二硫键获得的。而不是随机偶联，二硫键重新桥接涉及与半胱氨酸选择性交联试剂的反应，如双磺酰基试剂，下一代马来酰亚胺（NGMs），和吡啶嗪二酮（PDs）。双反应试剂使抗体的多肽链重新连接以及在抗体上的有效载荷偶联成为可能。根据每个连接体上附加的有效载荷数量，可以产生DAR为4、8或16的ADCs。 位点特异性偶联的另一种方法是通过引入非天然氨基酸，包括N-乙酰-L苯丙氨酸、叠氮甲基-L苯丙氨酸和叠氮赖氨酸。这些非天然氨基酸中的特殊功能基团使位点特异性偶联成为可能。此外，偶联是可控的和定量的，以产生具有均匀DAR、高效率、良好稳定性和高安全性的ADCs。然而，有时很难生产修饰过的抗体，含有非天然氨基酸的抗体可能会引起免疫原性。 非天然氨基酸的疏水性也增加了抗体聚集的风险。酶辅助连接也是一种有效的位点特异性偶联策略。通过基因工程，人工诱导特定的氨基酸序列在抗体中表达，这些序列可以被某些酶识别，随后特定的氨基酸残基被酶修饰，从而实现位点特异性偶联。目前，常用的有甲酰甘氨酸生成酶（FGE）和转谷氨酰胺酶（TG）。然而，值得注意的是，氨基酸序列的修饰可能会诱导免疫原性。位点特异性ADCs也可以通过糖链重塑和糖基偶联来生成。在抗体的Fc片段中，每个重链CH2域的N297位置的N-糖链存在，使得通过糖基化与有效载荷偶联的反应位点成为可能。多糖与Fab区域之间的远距离定位可以最小化对抗原结合亲和力的损害。这可能是通过赖氨酸基础化学偶联构建ADC的一个缺陷。此外，最近开发了一种名为pClick技术的位点特异性偶联技术用于ADC。通过引入一种近距离激活的交联剂，带有叠氮基团的肽可以自发地与抗体上最近的赖氨酸残基反应。而叠氮基团为带有生物正交手柄修饰的有效载荷提供了点击化学的可用位点。由于不需要抗体工程和后反应处理，产量和抗体稳定性因此显著提高。pClick技术为ADC开发提供了一种更便捷、更有效的方式进行位点特异性偶联。 3.  ADC的作用机制 ADC协同发挥“特异性”靶向作用和对癌细胞的“高效”杀伤效果。这些药物就像是一个精确制导的“生物导弹”，能够准确摧毁癌细胞，提高治疗窗口，减少非靶向的副作用。ADC的主要作用机制如图4右上角所示。一旦ADC的mAb与癌细胞特异性表达的目标抗原结合，ADC就被细胞内吞/内化形成早期内体，随后成熟为晚期内体，并最终与溶酶体融合。细胞毒性有效载荷最终通过化学或酶介导在溶酶体中释放，导致细胞通过靶向DNA或微管凋亡或死亡。当释放的有效载荷是可渗透或跨膜的，它也可能诱导旁观者效应以增强ADC的疗效。此外，这些药物的旁观者效应还可能改变肿瘤微环境，进而进一步增强ADCs的杀伤效果。此外，ADC的抗癌活性还涉及ADCC、ADCP和CDC效应。一些ADC的Fab片段可以与病毒感染细胞或肿瘤细胞的抗原表位结合，而FC片段与杀伤细胞（NK细胞、巨噬细胞等）表面的FCR结合，从而介导直接杀伤效果（图4左下角）。此外，ADC的抗体部分可以特异性地结合到癌细胞的表位抗原，并抑制抗原受体的下游信号转导（图4右下角）。例如，T-DM1的曲妥珠单抗可以与癌细胞的HER2受体结合，阻断HER2与HER1、HER3或HER4形成异二聚体，抑制细胞存活和增殖的信号转导途径（如PI3K或MAPK），诱导细胞凋亡。 图4 概述了ADC通过不同途径杀死癌细胞的机制。右上角：ADC的主要核心作用机制；左下角：ADC的抗体部分与免疫效应细胞结合，引发包括CDC、ADCC和ADCP效应在内的抗肿瘤免疫；右下角：ADC的抗体部分保持其活性特征，因此可以干扰目标功能，减弱下游信号以抑制肿瘤生长。使用BioRender.com创建。 4.  ADC开发的进展 从药物组成和技术特点的角度来看，ADC药物的开发通常可以细分为三代（表3）。 4.1.  第一代ADCs 在早期，如BR96-doxorubincin等ADC，主要由常规化疗药物通过不可切割的连接体与小鼠来源的抗体偶联而成。这些ADC的效力并不优于游离的细胞毒素药物，而且免疫原性经常是一个问题。后来，使用更有效的细胞毒素药物与人类化mAbs结合，大大提高了疗效和安全性，从而获得了第一代ADCs的市场批准，包括吉妥珠单抗奥佐加米辛和伊诺珠单抗奥佐加米辛。在这两种产品中，使用了IgG4亚型的人类化mAbs，并通过酸敏感的连接体与强效的卡利切阿米辛偶联。然而，这个系统并不完美。例如，酸性条件可能在身体的其他部位出现，第一代ADC中的连接体也可以在系统循环中缓慢水解（pH 7.4，37°C），导致无法控制的有毒有效载荷释放和意外的非靶向毒性。其次，卡利切阿米辛是疏水性的，容易引发抗体聚集，这解释了一些缺陷的出现，如半衰期短、清除速度快和免疫原性。此外，第一代ADC的偶联是基于赖氨酸和半胱氨酸残基的随机偶联，导致高度异质的混合物，具有可变的DARs。DAR对ADC的效力至关重要。不一致的DAR影响ADC药物的药代动力学和药效学（PK/PD）参数和治疗指数。因此，第一代ADC展示了次优的治疗窗口，需要进一步改进。 4.2.  第二代ADCs 以brentuximab vedotin和ado-trastuzumab emtansine为代表的第二代ADC随后推出，对mAbs亚型、细胞毒素有效载荷以及连接体进行了优化。这两种ADC都基于IgG1亚型mAbs，与IgG4相比，更适合与小分子有效载荷进行生物偶联，并且具有更高的癌细胞靶向能力。第二代ADC的另一个重大突破是使用更有效的细胞毒素药物，如auristatins和mytansinoids，提高了水溶性和偶联效率。因此，可以在每个mAb上装载更多的有效载荷分子，而不会引起抗体聚集。除了与抗体载体和细胞毒素有效载荷相关的改进外，第二代ADC中的连接体也得到了改进，以实现更好的血浆稳定性和均匀的DAR分布。总的来说，这三个要素的改进使第二代ADC的临床疗效和安全性得到了提高。然而，仍存在一些未满足的需求，例如由于非靶向毒性导致的治疗窗口不足，以及在高DAR的ADC中聚集或快速清除。当DAR超过6时，ADC表现出高疏水性，并且由于体内更快的分布和清除，倾向于降低ADC的效力。在这种情况下，通过位点特异性偶联优化DAR，以及持续优化mAbs、连接体和有效载荷，成为第三代ADC成功开发的关键。 4.3.  第三代ADCs 以polatuzumab vedotin、enfortumab vedotin、fam-trastuzumab deruxtecan和后来批准的ADC为代表的第三代ADC。得益于位点特异性偶联技术的引入，生产出了具有良好特征DARs（2或4）和期望的细胞毒性的均匀ADCs。 具有一致DAR的ADCs表现出较少的非靶向毒性和更好的药代动力学效率。此外，第三代中使用完全人源化抗体而非嵌合抗体以减少免疫原性。此外，正在开发抗原结合片段（Fabs）以取代一些ADC候选中的完整mAbs，因为Fabs在系统循环中更稳定，可能更容易被癌细胞内化。此外，还开发了更有效的载荷，如PBD、tubulysin和具有新颖机制的免疫调节剂，与抗体偶联。尽管第三代中的连接体类型没有显示任何更新，但已经开发并使用了像Fleximer平台这样的一些新实体来偶联不同的载荷。为了避免干扰免疫系统并提高在血液循环中的保留时间，第三代ADC中采用了更多亲水性连接体调节，如PEGylation。亲水性连接体也在平衡某些细胞毒性载荷（如PBD）的高疏水性方面提供效用，考虑到含疏水性载荷的ADCs通常容易聚集。总的来说，第三代ADC具有更低的毒性、更高的抗癌活性以及更高的稳定性，允许患者接受更好的抗癌治疗。 5.  ADCs的临床开发 5.1.  获批的ADC药物 经过数十年的努力优化关键组成部分，目前有超过100个ADCs处于临床开发中，截至2021年12月，共有14种ADC药物在全球不同国家获得了市场批准。巧合的是，获批的ADC药物中有一半主要用于血液恶性肿瘤，其余的主要用于实体瘤。这些ADCs的概述，包括它们的分子设计、初步批准年份、市场公司、批准国家和批准适应症，如表4所示。 5.2.  血液恶性肿瘤 吉妥珠单抗奥佐加米辛（Mylotarg®，辉瑞）：吉妥珠单抗奥佐加米辛是世界上第一种获批用于临床的ADC治疗药物。它由一个工程化的人源化单克隆IgG4抗体组成，靶向CD33，并通过一个可切割的腙连接体连接一个细胞毒性的N-乙酰-γ-卡利切阿米辛。吉妥珠单抗奥佐加米辛的平均DAR为2-3。以26%的响应率，它最初被FDA批准用于治疗复发或难治性（r/r）CD33阳性AML患者，这些患者年龄超过60岁，不适合其他常规化疗。成人和儿童AML中大约85-90%为CD33阳性。在与CD33抗原结合并被癌细胞内化后，随后腙键水解释放卡利切阿米辛。卡利切阿米辛还可以扩散到附近的其他癌细胞，诱导那些抗原阴性癌细胞的旁观者杀伤效应。然而，吉妥珠单抗奥佐加米辛中的腙基连接体并不完全稳定，导致卡利切阿米辛在血浆中提前释放，增加非靶向毒性。来自SWOG S0106A研究的结果显示，与单独接受化疗（多柔比星和阿糖胞苷）的患者相比，接受联合治疗（吉妥珠单抗奥佐加米辛与标准多柔比星和阿糖胞苷化疗）的患者观察到更高的严重致命毒性发生率，但没有显著的临床益处反应。因此，辉瑞公司在2010年10月自愿将该产品撤出市场。之后，使用比2000年批准的（9 mg/m2）更低的推荐剂量（3 mg/m2）重新评估了吉妥珠单抗奥佐加米辛的疗效和安全性。吉妥珠单抗奥佐加米辛联合化疗在临床试验ALFA-0701中进行了研究，这是一项多中心、随机、开放标签的3期研究。共有271名（50-70岁）新诊断的AML患者随机分配接受包含（n = 135）或不包含（n = 136）吉妥珠单抗奥佐加米辛的诱导治疗，包括多柔比星（60 mg/m2）和阿糖胞苷（200 mg/m2）。无事件生存期（EFS）被用作主要终点，接受吉妥珠单抗奥佐加米辛联合化疗的患者比仅接受化疗的患者显示出更长的EFS，中位EFS分别为17.3个月和9.5个月（HR = 0.56 [95% CI：0.42–0.76]）。两组中发生的3级及以上不良事件（AEs）包括感染（47% vs 39%）、出血（18% vs 9%）和肝静脉闭塞性疾病（2% vs 0%）。此外，吉妥珠单抗奥佐加米辛作为单药治疗的安全性和有效性在AML-19和MyloFrance-1研究中进行了评估。在AML-19中，总生存期（OS）被用作评估疗效的指标。结果表明，接受吉妥珠单抗奥佐加米辛治疗的患者的中位OS为4.9个月，而接受最佳支持治疗的患者为3.6个月（HR = 0.69 [95% CI：0.53–0.90]）。3级以上不良事件在超过5%的患者中包括感染（35%）、发热性中性粒细胞减少症（18%）、出血（13%）、疲劳（12%）、肝脏（7%）和心脏（6%）。在MyloFrance-1中，观察到26%的完全缓解（CR）率。超过5%的患者中发生的3级及以上不良事件包括败血症（32%）、发热（16%）、皮疹（11%）、肺炎（7%）、出血（7%）。基于以上三项研究者主导的临床试验中取得的整体积极结果，Mylotarg®于2017年被FDA重新批准。最近，吉妥珠单抗奥佐加米辛获得了FDA的新适应症批准，用于治疗新诊断的CD33阳性AML，包括1个月及以上的儿童患者。从吉妥珠单抗奥佐加米辛的撤回和重新批准中获得的罕见上市经验为ADCs的开发和临床试验设计提供了重要的参考。 布伦图珠单抗维多汀（Adcetris®，Seagen）：布伦图珠单抗维多汀也称为SGN-35，是FDA于2011年批准的第二种ADC药物，用于治疗复发或难治性（r/r）CD30阳性霍奇金淋巴瘤（HL）和系统性间变性大细胞淋巴瘤（sALCL）。它由一个针对CD30的嵌合IgG1单克隆抗体brentuximab组成，一个马来酰亚胺连接基团，一个可切割的二肽连接体（马来酰亚胺-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲酰氧羰基或mc-VC-PABC），以及抗有丝分裂剂MMAE。布伦图珠单抗维多汀的平均DAR为4。通过选择性靶向HL和ALCL的特征性抗原CD30，布伦图珠单抗维多汀通过依赖于clathrin的机制内化，并转移到内体和溶酶体中，其中连接体被半胱氨酸蛋白酶（如B）水解。释放出的游离MMAE随后靶向微管蛋白，以抑制其聚合，导致细胞周期停滞和细胞凋亡。由于旁观者效应，布伦图珠单抗维多汀对那些抗原阴性的癌细胞也有效。与吉妥珠单抗奥佐加米辛中的肼连接体相比，布伦图珠单抗维多汀中的基于二肽的连接体在生理条件下显示出更好的稳定性，因此血浆中细胞毒性载荷的过早释放最小。此外，连接体对半胱氨酸蛋白酶敏感，可以促进有效载荷在癌细胞内的高效释放，以确保杀伤效果。布伦图珠单抗维多汀的另一个改进是使用了更强效的细胞毒性载荷，MMAE。它是天然产物Dolastatin 10的合成衍生物，作为一种超有效的抗有丝分裂剂，通过阻断微管蛋白聚合来诱导细胞周期停滞。155 它被广泛用作几种ADCs的有效载荷，如polatuzumab vedotin、enfortumab vedotin和disitamab vedotin。布伦图珠单抗维多汀对HL和sALCL的疗效在两项单臂2期试验中进行了研究，分别有73%和86%的患者实现了客观反应，因此FDA在2013年加速批准了Adcetris®用于r/r HL和sALCL。在一项关键的2期、单臂、多中心研究中，对102名接受过自体干细胞移植（SCT）的r/r HL患者进行了布伦图珠单抗维多汀对HL的疗效评估。 目标反应率（ORR）被用作主要终点。结果表明，在接受了brentuximab vedotin（1.8 mg/kg）治疗的患者中，有73%出现了完全反应（CR）或部分反应（PR），患者对治疗的平均反应时间为6.7个月。在至少5%的患者中出现的3级及以上不良事件（AEs）包括中性粒细胞减少症（20%）、周围感觉神经病变（8%）、血小板减少症（8%）和贫血（6%）。对于sALCL，它在58名复发或难治性sALCL（r/r sALCL）患者的2期、单臂、多中心研究中进行了评估。在接受brentuximab vedotin（1.8 mg/kg）治疗的患者中，有86%经历了完全或部分反应，并且平均反应时间为12.6个月。在sALCL患者中观察到的严重不良事件与接受干细胞治疗（SCT）的患者相似。2017年11月，基于3期研究（ALCANZA）的积极数据，brentuximab vedotin获得了额外的批准，用于治疗先前接受过系统治疗的原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤（pcALCL）或表达CD30的蕈状真菌病（MF）。在该研究中，brentuximab vedotin显示出至少持续四个月的ORR。此外，在2018年，brentuximab vedotin获得了另外两个临床适应症的批准，与化疗联合使用，包括治疗某些类型的外周T细胞淋巴瘤（PTCL）和先前未经治疗的III期或IV期经典霍奇金淋巴瘤（cHL）。伊诺珠单抗奥佐加米辛（Besponsa®，辉瑞）：伊诺珠单抗奥佐加米辛，也称CMC-544，由一个针对CD22的人源化mAb组成，连接到细胞毒性的N-乙酰-γ-卡利切阿米辛，平均DAR为5-7。CD22是大多数（60-90%）B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）中发现的细胞表面抗原。与CD22结合激活了ADC的一系列下游过程，包括内化、连接体水解和有效载荷释放，类似于吉妥珠单抗奥佐加米辛中所见。通过一项开放标签、随机、国际多中心3期研究（INO-VATE 1022），评估了伊诺珠单抗奥佐加米辛的安全性和有效性，与研究者选择的化疗方案进行了比较，研究对象为326名接受过一种或两种先前治疗的成人r/r B-ALL患者。所有入选的患者被随机分配接受伊诺珠单抗奥佐加米辛治疗或替代化疗方案，包括FLAG（氟达拉滨、阿糖胞苷和G-CSF）、HIDAC（高剂量阿糖胞苷）、阿糖胞苷和米托蒽醌的混合物。该研究中使用的主要指标是治疗后无疾病证据和血细胞计数完全恢复的患者百分比。结果显示，35.8%接受伊诺珠单抗奥佐加米辛治疗的患者实现了CR，而替代化疗组观察到17.4%。伊诺珠单抗奥佐加米辛组中出现的3级及以上不良事件包括中性粒细胞减少症（47%）、血小板减少症（41%）、白细胞减少症（27%）和发热性中性粒细胞减少症（27%）。基于这些积极结果，2017年8月，FDA批准Besponsa®上市，这是第一个也是迄今为止唯一一个针对CD22的ADC，用于治疗成人r/r B细胞前体ALL。 毛细胞白血病（HCL）是一种罕见的血液恶性肿瘤，其特征是脾肿大、出血和异常B淋巴细胞的积累。除了B-ALL，CD22也在HCL的B细胞中表达，因此被用作治疗靶点。moxetumomab pasudotox不是使用小分子有效载荷，而是由针对CD22的moxetumomab与假单胞菌外毒素A（PE38）的38kD片段偶联而成。171 CD22在成熟B细胞上表达，在100%的毛细胞上表达更为强烈，为HCL治疗提供了理想的治疗靶点。与CD22结合后，moxetumomab pasudotox被内化，裂解并释放外毒素的催化域进入癌细胞内，抑制蛋白质的翻译导致凋亡。moxetumomab pasudotox的3期临床研究（Study 1053）招募了80名组织学证实的HCL或HCL变异型患者，这些患者需要治疗，基于存在细胞减少症或脾肿大，并且之前接受过至少两种系统疗法（包括一种嘌呤核苷类似物）。患者接受moxetumomab pasudotox治疗（0.04 mg/kg），直到观察到CR、疾病进展或不可接受的毒性。在研究中，moxetumomab pasudotox单药治疗的ORR和CR率分别为75%（95% CI，64-84）和41%（95% CI，30-53）。此外，持久的CR率为30%（95% CI，20-41）。最常见的3-4级事件包括淋巴细胞减少（20%）、贫血（10%）和无症状低磷血症（10%）。2018年9月，FDA批准了AstraZeneca的Lumoxiti®用于治疗先前至少接受过两种系统疗法（包括嘌呤核苷类似物）失败的成人r/r HCL患者。这使得moxetumomab pasudotox成为过去20年来首个获批用于治疗HCL的新药，是HCL临床治疗中的一个重要里程碑。 Polatuzumab vedotin（Polivy®，罗氏）：Polatuzumab vedotin，也称DCDS4501，包含一个针对CD79b的人源化抗体，通过可被蛋白酶切割的二肽连接体（mc-VC-PABC）连接到微管破坏剂MMAE，平均DAR为3.5。CD79b是B细胞受体（BCR）的一个组成部分，超过90%的B细胞非霍奇金淋巴瘤（nHL）恶性肿瘤表达，并被视为一个有前景的抗体靶点。与brentuximab vedotin类似，给药后，polatuzumab vedotin选择性地结合到CD79b，随后内吞和蛋白水解裂解，释放MMAE，诱导细胞周期停滞和细胞死亡。2019年7月，Polivy®获得FDA批准，与苯达莫司汀加利妥昔单抗联合用于治疗至少接受过两种先前治疗的复发或难治性弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。这是首个获批用于治疗DLBCL的ADC，DLBCL是最常见的nHL类型。批准基于全球、随机的2期GO29365研究的积极结果，该研究包括80名至少接受过一种先前方案治疗的r/r DLBCL患者。入选的患者被随机分配接受polatuzumab vedotin（Pola，1.8 mg/kg，静脉注射）与苯达莫司汀（B，90 mg/m2静脉注射）和利妥昔单抗（R，375 mg/m2静脉注射）联合治疗，或单独BR，共6个21天周期。CR率和反应持续时间被确定为研究终点。结果显示，接受Pola+BR治疗的患者中有40%观察到CR，而单独接受BR治疗的患者中有18%。在接受Pola+BR治疗并有PR或CR的患者中，反应持续时间超过6个月和12个月的比例分别为64%和48%。Pola+BR组中出现的3-4级不良事件包括中性粒细胞减少症（46%）、血小板减少症（41%）、贫血（28%）、淋巴细胞减少症（12.8%）和发热性中性粒细胞减少症（10.3%）。 Belantamab mafodotin（Blenrep®，GSK）：Belantamab mafodotin，也称GSK2857916，是一种新型ADC，由一个针对BCMA的人源化FC修饰抗BCMA mAb组成，通过不可切割的马来酰亚胺缬氨酸（mc）连接体与细胞毒素MMAF偶联。Belantamab mafodotin的平均DAR为4。BCMA是一种跨膜糖蛋白，在多发性骨髓瘤（MM）细胞表面特异性过度表达。 与BCMA结合后，belantamab mafodotin被迅速内化，在溶酶体内降解，释放不渗透的MMAF进入多发性骨髓瘤（MM）细胞内。MMAF与MMAE类似，也是一种有丝分裂抑制剂。它可以通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂，导致细胞周期停滞并诱导依赖于caspase-3的凋亡。总的来说，belantamab mafodotin能够有效地引起过度表达BCMA的癌细胞死亡。2020年8月，FDA批准了Blenrep®用于治疗复发或难治性多发性骨髓瘤（r/r MM）。这是首个基于DREAMM-2临床试验结果获批的BCMA靶向治疗药物，DREAMM-2是一项双臂、开放标签、多中心的2期研究。 在这项研究中，共有221名（年龄≥18岁）接受过三线或以上治疗并且对免疫调节药物和蛋白酶抑制剂耐药，以及对CD38单抗抗药性或不耐受（或两者都有）的复发或难治性多发性骨髓瘤患者，且其东部肿瘤协作组（ECOG）的表现状态为0-2，被纳入并随机分配（1:1）接受两种不同剂量的belantamab mafodotin（分别为2.5 mg/kg和3.4 mg/kg）治疗，直至疾病进展或不可接受的毒性。有效性基于ORR和反应持续时间。结果显示，单独使用belantamab mafodotin治疗，2.5 mg/kg组和3.4 mg/kg组的ORR分别为32%和35%。在2.5 mg/kg组和3.4 mg/kg组中，分别有58%和66%的患者观察到有希望的部分反应（VGPR）。最常见的3-4级不良事件包括角膜炎（2.5 mg/kg组为27%，3.4 mg/kg组为21%）、血小板减少症（分别为20%和33%）和贫血（分别为20%和25%）。 Loncastuximab tesirine（Zynlonta®，ADC Therapeutics）：Loncastuximab tesirine，也称ADCT-402，由一个针对CD19的人源化mAb组成，通过可切割的（缬氨酸-丙氨酸二肽）马来酰亚胺型连接体与PBD二聚体偶联。Loncastuximab tesirine的平均DAR约为2.3。PBD二聚体是ADC开发中新一代的细胞毒性有效载荷。它与DNA不可逆地结合并引起强烈的链间交联，阻止DNA链分离，从而破坏必要的DNA代谢过程，最终导致细胞死亡。它不依赖于细胞分裂周期，损伤不易恢复，显示出更好的细胞毒性。2021年4月，Zynlonta®获得FDA加速批准，用于治疗接受过两线或以上系统治疗的成人复发或难治性大B细胞淋巴瘤，包括弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）未另行指明（NOS）、由低级别淋巴瘤发展而来的DLBCL和高级别B细胞淋巴瘤。Loncastuximab tesirine是首个也是目前唯一一个获批用于治疗复发或难治性DLBCL的CD19靶向ADC，作为单一药物。 Zynlonta®的批准基于LOTIS-2研究的数据，LOTIS-2是一项多中心、开放标签、单臂、2期试验。共有145名接受过至少两线系统治疗方案的成人复发或难治性DLBCL或高级别B细胞淋巴瘤患者被纳入并接受loncastuximab tesirine（0.15 mg/kg）治疗。总的ORR被用来评估loncastuximab tesirine的主要疗效。结果显示，接受loncastuximab tesirine治疗的患者，ORR达到了48.3%（95% CI：39.9–56.7），CR为24.1%（95% CI：17.4–31.9）。在平均7.3个月的随访后，中位反应持续时间为10.3个月（95% CI：6.9，NE）。在70名实现客观反应的患者中，36%在3个月前就被审查了反应持续时间。最常见的3级及以上不良事件包括中性粒细胞减少症（26%）、血小板减少症（18%）和γ-谷氨酰转移酶增加（17%）。 5.3.  实体瘤 Ado-trastuzumab emtansine（Kadcyla®，罗氏）：约15%-20%的乳腺癌患者表现出人类表皮生长因子受体2（HER2）阳性过度表达，具有更高的侵袭性。Ado-trastuzumab emtansine，也称T-DM1，是一种靶向HER2的ADC药物，也是首个获准用于实体瘤的ADC。它由一个针对HER2的人源化mAb组成，通过一个不可切割的连接体（丁二酰亚胺-4-（N-马来酰亚甲基）环己烷-1-羧酸酯，SMCC）连接到DM1，平均DAR为3.5。该连接体可以使偶联物在血浆循环中更稳定，但在HER2阳性癌细胞内吞后释放有效载荷。曲妥珠单抗在溶酶体中被蛋白酶完全消化，允许释放含有DM1的代谢产物，赖氨酸-MCC-DM1，其显示出与游离DM1相似的细胞毒性。此外，赖氨酸-MCC-DM1在生理pH下带电，不适用于发挥旁观者效应。因此，T-DM1只针对并导致抗原阳性癌细胞死亡。此外，T-DM1显示出与曲妥珠单抗类似的机制，它可以抑制HER2信号通路，诱导ADCC和CDC效应。 2013年，Kadcyla®获得FDA市场批准，作为单一药物用于治疗先前接受过Herceptin®（曲妥珠单抗）和紫杉醇化疗的HER2阳性转移性乳腺癌患者。批准基于3期研究（EMILIA）的积极结果。共有991名接受过曲妥珠单抗和紫杉醇治疗的HER2阳性不可切除、局部晚期或转移性乳腺癌成人患者被纳入并随机分配接受T-DM1（3.6 mg/kg）或拉帕替尼加卡培他滨。PFS和OS被用作主要终点。在最终描述性分析中，T-DM1组的中位PFS为9.6个月，而拉帕替尼加卡培他滨组为6.4个月（p < 0001）。T-DM1组和拉帕替尼加卡培他滨组的中位OS分别为30.9个月和25.1个月。T-DM1组中最常见的3级及以上不良事件包括：血小板减少症（12.9%）、AST增加（4.3%）和ALT增加（2.9%）。值得注意的是，由于观察到左心室射血分数（LVEF）降低，T-DM1有心脏毒性的警告标签。 此外，基于3期研究（KATHERINE）的积极结果，FDA在2019年5月扩大了Kadcyla®的批准，用于治疗接受过新辅助紫杉醇和基于曲妥珠单抗治疗后仍有残留浸润性疾病的HER2阳性早期乳腺癌（EBC）患者的辅助治疗。共有1486名符合标准的患者被纳入研究，并随机分配接受T-DM1或曲妥珠单抗治疗。作为该研究的主要终点，接受T-DM1治疗的组与接受曲妥珠单抗治疗的组相比，无浸润性疾病生存期（IDFS）显著提高了50%。在三年时，接受T-DM1治疗的患者中有88.3%没有复发，而接受曲妥珠单抗治疗的患者中有77.0%。 恩福妥昔单抗（Padcev®，Seagen）：恩福妥昔单抗也被称为ASG-22ME，已获FDA批准用于治疗局部晚期或转移性尿路上皮癌的成年患者。它由一个全人源抗nectin-4 IgG1 kappa单克隆抗体（AGS-22C3）组成，通过可被蛋白酶切割的连接体（MC-VC-PABC）与MMAE相连，平均DAR约为3.8。Nectin-4是一种跨膜蛋白，属于nectin家族，对细胞增殖、迁移和粘附起着至关重要的作用。已发现它在多种恶性肿瘤中高度表达，尤其是在尿路上皮癌中。通过免疫组化分析，60%的膀胱肿瘤标本观察到强烈的染色，而正常组织中染色有限。因此，它已成为ADC新分子设计的一个引人注目的靶点。恩福妥昔单抗是目前唯一获得FDA批准的靶向nectin-4的ADC。2019年12月，FDA首次授予加速批准，随后在2021年9月基于一项开放标签、随机、多中心3期研究（EV-301）的结果进一步授予常规批准。在EV-301研究中，共有608名接受过PD-1或PD-L1抑制剂和基于铂的化疗的局部晚期或转移性尿路上皮癌患者被纳入并随机平均分配，接受恩福妥昔单抗（1.25 mg/kg）或替代化疗（多西他赛、紫杉醇或长春瑞滨）治疗。OS和PFS分别用作评估疗效的主要终点和次要终点。与替代化疗相比，恩福妥昔单抗取得了显著的疗效，中位OS（12.9个月对9.0个月）和中位PFS（5.6个月对3.7个月）均显著延长。199,204 至少5%的患者中发生的3级及以上不良事件包括斑丘疹（7.4%）、疲劳（6.4%）和中性粒细胞计数下降（6.1%）。 Fam-trastuzumab deruxtecan（Enhertu®，第一三共）：Enhertu，也称DS-8201或T-DXd，是针对不可切除或转移性HER2阳性乳腺癌成年患者的HER2靶向ADC，这些患者在接受转移性治疗时已接受过两种或以上的抗HER2方案。它由一个人源化HER2抗体（曲妥珠单抗）组成，通过一种酶可切割的四肽连接体与一种新型拓扑异构酶I抑制剂（DXd）作为有效载荷偶联，平均DAR为7-8。DXd被报道比SN-38（伊立替康的活性形式）更强效，DXd的更高效力确保了其在ADC中作为有效载荷时的疗效。DS-8201的另一个改进是采用了新型四肽连接体技术，该连接体在血浆中更稳定，降低了系统毒性的风险。2019年12月，基于单臂、多中心、2期DESTINY-Breast01研究的积极结果，FDA批准了Enhertu®。共有184名接受过两种或以上抗HER2治疗的HER2阳性、不可切除和/或转移性乳腺癌（mBC）女性患者被纳入研究。主要终点是ORR和反应持续时间。结果显示，接受DS-8201（5.4 mg/kg）治疗的患者ORR为60.3%（95% CI：52.9, 67.4），CR率为4.3%，PR率为56%。中位反应持续时间为14.8个月，中位PFS持续时间为16.4个月。至少5%的患者中发生的3级及以上不良事件包括中性粒细胞计数下降（20.7%）、贫血（8.7%）、恶心（7.6%）、白细胞计数下降（6.5%）、淋巴细胞计数下降（6.5%）和疲劳（6.0%）。此外，DESTINY-Breast03的最新数据，这是一项全球性、头对头、随机、开放标签、关键3期试验，证明了DS-8201相比T-DM1具有显著优势。具体来说，共有524名接受过曲妥珠单抗和紫杉醇治疗的HER2+ mBC患者被纳入并随机分配（1:1）。主要终点是PFS，包括OS、ORR和反应持续时间的次要终点也被使用。结果显示，DS-8201的中位PFS未达到，而T-DM1为6.8个月。而且，接受DS-8201治疗的患者的中位反应持续时间为14.3个月，而接受T-DM1治疗的患者为6.9个月。此外，另一项头对头研究（DESTINY-Breast09）正在进行，比较DS-8201和曲妥珠单抗。DESTINY-Lung01研究还评估了DS-8201在携带HER2突变的转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者中的疗效和安全性。在91名入选患者中，55%在平均随访时间为13.1个月时确认有客观反应。中位PFS持续时间为8.2个月，中位OS持续时间为17.8个月。观察到46%的患者出现3级及以上不良事件，包括中性粒细胞减少症（19%）和贫血（10%）。该临床观察也对DS-8201潜在的肺部毒性提出了关注。值得注意的是，间质性肺病（ILD）在26%（91名患者中有23名）的患者中观察到，两名患者死于治疗相关的ILD。ILD是一组影响肺部间质的呼吸系统疾病，这将破坏我们身体的修复损伤过程，并阻止氧气参与血液循环。因此，在后续的临床试验中，需要更加谨慎地关注ILD，并适当培训临床医生识别和管理这种毒性效应。自从DS-8201推出以来，其临床潜力仍在不断扩大和深化。DS-8201用于胃癌的新适应症也已获得批准。乳腺癌的治疗线也在向前推进，不断为患者提供更好的治疗选择。 Sacituzumab govitecan（Trodelvy®，Immnomedics）：Sacituzumab govitecan，也称IMMU-132，是一种ADC，由一个针对Trop-2的人源化单克隆抗体组成，通过一个可水解的连接体（CL2A）与拓扑异构酶I抑制剂（SN-38）偶联，平均DAR约为7.6。Trop-2是一种40-kDa糖蛋白，作为细胞内钙信号传导的转导体。在大多数实体瘤中观察到Trop-2的过度表达，包括三阴性乳腺癌（TNBC）。从理论上讲，Trop-2蛋白的过度表达与强烈的侵袭性和不良预后有关，这使得Trop-2成为一个理想的广谱治疗靶点。在sacituzumab govitecan中，SN-38是伊立替康的活性形式，通过抑制DNA拓扑异构酶I引起频繁的DNA单链断裂，最终导致细胞死亡。73 就CL2A而言，它连接SN-38和Trop-2抗体，是sacituzumab govitecan作为第三代ADC的最突破性设计。这个设计良好的连接器提高了Trop-2抗体与SN-38的结合比率，在肿瘤中具有更高的毒性浓度，但在非靶标中的浓度更低，半衰期更短。通过优化连接体的稳定性，它不仅可以在目标肿瘤细胞中释放SN-38，而且还能实现旁观者效应，杀死难以靶向的邻近癌细胞。2020年4月，sacituzumab govitecan获得FDA加速批准，用于治疗接受过两种或以上系统治疗的不可切除局部晚期或转移性TNBC患者，至少一种用于转移性疾病。这是FDA批准用于转移性TNBC的第一个抗Trop-2 ADC。sacituzumab govitecan的临床益处在随后的多中心、开放标签、随机试验（ASCENT）中得到进一步确认，该试验促进了FDA的常规批准。ASCENT研究在529名接受过至少两种化疗后复发的不可切除局部晚期或mTNBC患者中进行，其中一种可能是在新辅助或辅助环境中，如果进展发生在12个月内。入选的患者被随机分为两组，分别接受sacituzumab govitecan（n = 267，10 mg/kg）和单一药物化疗（n = 262，卡培他滨、艾瑞布林、长春瑞滨或吉西他滨）。主要疗效终点是无脑转移患者的PFS。结果显示，接受sacituzumab govitecan治疗的患者的中位PFS为4.8个月，而接受化疗的患者为1.7个月。而且，中位OS分别为11.8个月（sacituzumab govitecan）和6.9个月（化疗）。 sacituzumab govitecan的3级及以上严重不良事件的发生率包括中性粒细胞减少症（51%）、白细胞减少症（10%）、腹泻（10%）、贫血（8%）和发热性中性粒细胞减少症（6%）。 Cetuximab sarotalocan（Akalux®，Rakuten Medical）：Cetuximab sarotalocan也被称为RM-1929，是一种新型ADC，由一个抗EGFR嵌合单克隆抗体cetuximab与近红外光敏染料IRDye® 700DX偶联而成。cetuximab sarotalocan的平均DAR在1.3-3.8范围内。EGFR在多种实体瘤表面高度表达，包括头颈鳞状细胞癌（HNSCC）、食管癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和其他实体瘤。Cetuximab sarotalocan能够靶向EGFR，并在与癌细胞结合后由光纤释放的红激光局部激活，导致细胞死亡。它不仅利用抗体介导的靶向输送实现高肿瘤特异性，还采用激光激活的生物物理机制精确诱导癌细胞的快速死亡，而不损伤周围正常组织。 2019年9月，cetuximab sarotalocan获得日本药品和医疗器械管理局（PMDA）批准，用于治疗不可切除的局部晚期或复发性头颈鳞状细胞癌。批准是基于一项多中心、开放标签2a期试验的积极数据。共有30名无法通过手术、放疗或含铂化疗满意治疗的局部区域性头颈鳞状细胞癌患者被纳入研究。在给予RM1929 24小时后，使用非热红光照射肿瘤区域。结果显示，cetuximab sarotalocan治疗的ORR为28%，其中包括14%的CR，中位PFS和中位OS分别为5.7个月和9.1个月。最常见的3级及以上不良事件包括皮肤反应（18%）、甲沟炎（12%）和过敏反应（3.5%）。迄今为止，cetuximab sarotalocan尚未在日本以外获得批准，目前正在进行全球3期试验。 Disitamab vedotin（Aidixi®，RemeGen）：Disitamab vedotin也被称为RC48，是第三种上市的HER2靶向ADC，由一种新型人源化HER2抗体、可被组织蛋白酶切割的连接体（mc-VC-PABC）和细胞毒素MMAE组成。RC48的平均DAR约为4。Disitamab vedotin中使用的抗体对HER2具有更高的亲和力，在动物模型中显示出更强的抗肿瘤活性。2021年6月15日，disitamab vedotin获得中国国家药品监督管理局（NMPA）的有条件批准，用于治疗至少接受过2种系统化疗的局部晚期或转移性胃癌（包括胃食管结合部腺癌）患者。这是中国开发的首个获批上市的ADC药物。批准是基于RC48-C008研究的结果，该研究表明接受RC48治疗的患者具有临床意义的反应和生存益处。 RC48-C008研究是一项单臂、多中心、开放标签、2期临床试验，共有127名组织学证实的胃或胃食管结合部癌、HER2过度表达、接受过至少2种系统治疗的患者被纳入。在试验中，参与的患者接受disitamab vedotin（2.5 mg/kg）治疗，直到研究者评估的临床获益丧失或不可接受的毒性。ORR被用作主要结果，PFS和OS作为次要结果。数据显示，所有患者的ORR为18.1%（95% CI：11.8–25.9%）。亚组ORR分别为接受2线和≥3线治疗的患者的19.4%和16.9%。总体而言，接受至少2个周期治疗的111名患者的ORR为20.7%。对于所有127名患者，中位PFS为3.8个月，中位OS为7.6个月。3级或更高不良事件在40名患者（32.0%）中观察到，其中最常见的是中性粒细胞计数下降（14.4%）、WBC计数下降（14.4%）和贫血（5.6%）。 此外，disitamab vedotin还于2021年12月获得NMPA的有条件批准，用于接受过含铂化疗治疗失败的HER2阳性局部晚期或转移性尿路上皮癌患者的二线治疗。这得益于RC48-C005研究的结果，这是一项开放标签、多中心、单臂、非随机2期研究。64名HER2过度表达和局部晚期或转移性尿路上皮癌患者在接受顺铂、吉西他滨和紫杉醇治疗失败后被纳入并接受RC48（2 mg/kg）治疗。ORR被用作主要终点。截至2020年11月30日，接受1线、2线和≥3线治疗的患者的ORR分别为55.6%（5/9）、50.0%（21/20）和30.8%（4/13）。 Tisotumab vedotin（Tivdak®，Genmab/Seagen）：Tisotumab vedotin是最近获批的ADC药物，平均DAR为4，包含一个完全人源化的mAb，结合组织因子（TF），一个可切割的mc-VC-PABC连接体，和一个抗有丝分裂剂MMAE。TF在肿瘤生长、血管生成和转移中起着重要作用，并且在几种实体瘤中特异性过度表达。Tisotumab vedotin旨在靶向癌细胞上的TF抗原，并将细胞毒素MMAE直接输送到癌细胞内。此外，旁观者效应、ADCC和ADCP也被证明参与了tisotumab vedotin的作用机制。2021年9月，Tivdak®获得FDA批准，用于治疗复发或转移性宫颈癌的成年患者，这些患者在化疗后或化疗期间疾病进展，这是首个且唯一获批的TF靶向ADC治疗。 批准是基于innovaTV 204研究的发现，这是一项多中心、开放标签、单臂、2期试验。共有101名符合标准（复发或转移性宫颈癌患者，之前接受过不超过两种系统治疗方案，包括至少一种复发或转移性环境中的基于顺铂的化疗方案）的患者被纳入研究，接受每21天2 mg/kg的tisotumab vedotin治疗，直至疾病进展或不可接受的毒性发生。确认的ORR被用作主要疗效结果。结果显示，ORR为24%（95% CI：15.9%-33.3%），中位反应持续时间为8.3个月（95% CI：4.2，未达到）。3级或更高不良事件在28%的患者中观察到，包括中性粒细胞减少症（3%）、疲劳（2%）、溃疡性角膜炎（2%）和周围神经病变（2%）。 5.4.  晚期ADC候选药物 除了上述14种获批的ADC药物外，目前还有数百种采用更新技术和新颖靶点的ADC正在进行临床试验。本综述中讨论了三个代表的3期ADC候选药物，以提供概念性的快照。 Mirvetuximab soravtansine（ImmunoGen）。Mirvetuximab soravtansine（IMGN853）由一个针对叶酸受体α（FRα）的人源化mAb组成，通过一个可切割的连接体（sulfo-SPDB）与强效细胞毒素DM4偶联。它已获得FDA授予治疗卵巢癌的孤儿药指定。通过在二硫键的α位引入两个甲基基团以及一个磺酰基，提高了连接体的亲水性，克服了药物在血浆循环中过早释放的缺点。2015年12月，进行了一项开放标签、随机3期试验（NCT02631876），以研究IMGN853与选定的单一药物化疗在治疗对铂类药物耐药的FRα阳性晚期上皮性卵巢癌、原发性腹膜癌和/或输卵管癌的女性中的安全性和有效性。这是首个进入人体临床试验的FRα靶向ADC候选药物。共有366名患者随机（2:1）接受IMGN853（6 mg/kg）或单一药物化疗（聚乙二醇化脂质体多柔比星、拓扑替康或紫杉醇）。本研究的主要终点是PFS。 2019年初公布的结果显示，在主要终点PFS方面没有显著差异[HR, 0.98; 95% CI, 0.73–1.31; p = 0.897]，IMGN853组和化疗组的中位PFS分别为4.1个月和4.4个月。240 尽管没有达到主要终点，但在次要终点中观察到IMGN853在FRα过度表达的患者中表现更好，包括更好的ORR（24%对10%）和CA-125反应（53%对25%）。因此，FDA推荐进行额外的3期试验。2019年12月，Immunogen宣布了一项3期单臂试验，包括两项研究：SORAYA研究（NCT04296890）和MIRASOL研究（NCT04209855）。此外，另一项1b/2期临床试验（NCT02606305）调查了IMGN853（6 mg/kg）联合贝伐珠单抗（15 mg/kg）在对铂类药物耐药的晚期上皮性卵巢癌、原发性腹膜癌或输卵管癌患者中的应用。Immunogen在2021年ASCO年会上最近宣布了结果。在接受联合治疗的60名患者中，有28名观察到客观反应，确认的ORR为47%（95% CI, 34–60），在高FRα表达的患者中（n = 33），确认的ORR为64%（95% CI 45–80），这表明IMGN853与贝伐珠单抗联合治疗对高FRα复发性卵巢癌患者具有显著的治疗效果。最常见的不良事件包括腹泻、视力模糊、疲劳和恶心。 Datopotamab deruxtecan（DS-1062, Daiichi Sankyo/AstraZeneca）。DS-1062或Dato-DXd是第二种靶向Trop2的ADC，由一个拓扑异构酶I抑制剂（DXd）通过一个可切割的四肽连接体与人源化抗Trop2 IgG1 mAb偶联。平均DAR为4。目前，DS-1062正在进行临床试验，以单独或联合治疗的方式评估对乳腺癌和NSCLC等实体瘤的疗效。TROPION-PanTumor01的更新结果，这是一项正在进行的1期研究，研究对象为晚期/转移性NSCLC患者（NCT03401385），显示DS-1062（6 mg/kg）在接受治疗的患者中显示出有希望的安全性和有效性。在125名可评估反应的患者中，1%（1/125）有确认的CR，26%（32/125）有PR，并且有4个PR正在等待确认。在6个月时持续反应的概率超过80%，疾病控制率（CR + PR + SD）为79%。它目前也在一项随机、开放标签的3期研究（TROPION-Lung01）中进行研究，比较DS-1062与多西他赛治疗晚期/转移性NSCLC患者的效果，这些患者没有EGFR、ALK或其他可操作的基因变异。设计计划是将590名患者随机1:1分配接受DS-1062（6 mg/kg）或多西他赛（75 mg/m2）。双重主要终点PFS和OS被用作双重主要终点。 Tusamitamab ravtansine（SAR-408701, Sanofi）。SAR-408701是一种新型抗CEACAM5 ADC。它由一个人源化抗体组成，靶向CEACAM5，通过一个可切割的连接体N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) butyrate (SPDB)与细胞毒素maytansinoid DM4偶联。CEACAM5是一种在正常成人组织中很少表达，但在包括NSCLC在内的多种实体瘤中过度表达的糖蛋白。SAR-408701的前临床活性被研究，结果显示其为CEACAM5阳性癌症的有前途的治疗候选药物。SAR-408701的安全性和有效性在一项开放标签、剂量递增、剂量扩展的1期研究（NCT02187848）中进行了检查。在研究中，92名患者（28名CEACAM5中等表达者和64名高表达者）接受了SAR-408701（100 mg/m2），截至2020年1月，在接受SAR-408701治疗的中等表达者队列中观察到2个确认的PR（ORR 7.1%），而在接受治疗的高表达者队列中有13名患者确认PRs（ORR 20.3%）。27名（42.2%）患者病情稳定；在接受过抗PD1/PD-L1治疗的患者中观察到17.8%的ORR。目前，有几项SAR-408701的2期或3期临床试验正在进行中，采用单一药物或联合治疗NSCLC和其他实体瘤适应症（NCT04154956, NCT04659603, NCT04394624, NCT05071053, NCT04524689）。 6. ADCs的当前挑战和下一代 从前面部分列出的获批药物和在研候选药物中可以看出，与早期代相比，新一代ADCs正在展现出越来越优化的特异性和细胞毒性特征。然而，在开发和使用抗癌ADCs方面仍然存在许多挑战，包括药代动力学的复杂性、不足的肿瘤靶向和有效载荷释放，以及药物抗性。本节提供了这些挑战的概述，随后讨论了在新兴一代ADCs中可能的解决方案。 6.1.  主要挑战 复杂的药代动力学特征。在ADC（大多数通过静脉注射）给药后，系统循环中可能存在三种主要形式，即完整的ADC、裸抗体和游离的细胞毒素。由于目标结合、消除和解偶联，这三种形式的比例将动态变化。在ADC的典型药代动力学特征中，随着ADC的内吞作用和抗体清除，结合的ADC和裸抗体的浓度持续下降。影响抗体清除的因素包括单核吞噬细胞系统和新生儿Fc受体（FcRn）介导的循环。通过与内吞体空泡中的ADC结合，FcRn将ADC导出到细胞外部分进行循环。因此，包括结合的ADC和裸抗体在内的抗体通常比传统的小分子药物具有更长的半衰期。关于游离的细胞毒素，它主要在肝脏代谢，并通过肾脏（尿液）或粪便从体内排泄，这可能受到药物-药物相互作用和肝肾功能损害的影响。所有这些因素，再加上患者间变异性高，使得建立PK和PD模型来描述ADC的临床特征并协助设计新的ADCs变得具有挑战性。 不可避免的副作用。在获批的14种ADCs中，最常见的严重副作用（3级或更高）是血液毒性，包括中性粒细胞减少症、血小板减少症、白细胞减少症和贫血。血液毒性以及肝毒性和胃肠道反应可能与细胞毒素过早释放到血液循环中有关。这与主要影响快速增殖的健康细胞的传统化疗药物一致。此外，ADC的抗体部分引起的免疫反应可能导致二次损伤，导致肾毒性。根据最近的临床观察，ADC治疗期间潜在的肺部毒性效应，如间质性肺病（ILD），应引起注意，特别是在抗HER2 ADCs中。T-DM1和DS-8201的临床试验中报告了几例与ILD相关的死亡案例。然而，ILD的作用机制的详细情况仍不清楚。有猜测可能的原因之一可能与ADC在健康肺细胞中的不希望摄取和从ADC释放的游离有效载荷有关。由于血液流动最丰富且在肺部保留时间最长，不希望的ADC摄取和血液中的游离有效载荷最常发生的是在肺部，从而诱发ILD。因此，需要对下一代ADC进行相应的优化，以最小化副作用。在用药期间，应密切监测、预防或给予不良反应的支持性治疗。 肿瘤靶向和有效载荷释放。与传统的细胞毒素药物相比，ADC的分子量要大得多，药物穿透肿瘤的效率受到限制。当前研究表明，只有一小部分输入患者体内的ADC能够到达肿瘤细胞，因此在设计ADC时需要考虑有效载荷的效力。对于ADC药物，有效载荷的传递依赖于通过抗原依赖性内吞作用或抗原非依赖性胞饮作用内吞形成的ADC-抗原复合物。内吞后，ADC抗原复合物将被运输到内体或溶酶体释放有效载荷。当有效载荷通过酸可切割的连接体连接时，对于需要特定蛋白酶的ADCs，有效载荷可能在早期内体中释放。对于需要特定蛋白酶的ADCs，有效载荷的释放将发生在晚期内体或溶酶体中。无论有效载荷释放途径如何，一些ADCs具有“旁观者效应”，可以影响不表达目标抗原的周围癌细胞。对于内吞的ADC，它被认为是具有高异质性目标抗原表达的肿瘤活性ADC的一个重要因素。旁观者效应需要有效载荷穿过细胞膜，因此，通过可切割连接体释放的非极性有效载荷是首选，因为极性分子更有可能留在细胞内。 药物抗性。ADC开发的另一个挑战是药物抗性。酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的药物抗性通常涉及药物靶标的逃逸突变。然而，ADCs的药物抗性机制尚未得到充分阐明。由于ADCs的基本作用机制，它们可能更加复杂和多样化。目前的证据表明，肿瘤可以通过多种方式逃避ADC的活性，例如减少抗原表达水平、改变细胞内运输途径、对有效载荷的药物抗性。这些潜在机制已在体外和动物模型的临床前研究中得到验证，而确认这些机制的临床证据仍然有限。例如，长期暴露于靶向HER2的ADC，乳腺癌细胞系将减少HER2受体的表达，并减少溶酶体酸化以减慢蛋白质降解和代谢。一些ATP结合盒（ABC）转运蛋白被发现在抗癌药物的出口中很重要，使肿瘤产生抗性。在ADC中常用的有效载荷，如MMAE、MMAF和卡利奇霉素，可以被ABC转运蛋白从癌细胞中输出，这使得这些ADCs表现出药物抗性。 6.2.  未来一代ADCs ADC由单克隆抗体、连接体和有效载荷组成，因此替换这三个组件中的任何一个都可能影响ADC的效果。针对同一抗原的不同抗体可能具有不同的结合能力，并对受体二聚体化和抗原内吞作用产生不同的影响。当前研究表明，ADC的内吞作用和细胞内运输途径对ADC的细胞毒性活性有关键影响。与野生型蛋白相比，突变蛋白通常具有更高的泛素化水平，更容易被内吞和降解。这意味着，如果ADC用于靶向突变蛋白，它可能会带来显著的临床反应。可以想象，靶向携带致癌突变蛋白的ADCs（如某些EGFR突变体）可能最大化治疗的肿瘤特异性，并达到选择性TKI的水平。此外，双特异性抗体技术的进步为ADC创新带来了更多可能性。这些ADC设计可能提高抗体内吞作用并改善肿瘤特异性。目前正在开发的治疗方法一直在探索这些可能性。例如，靶向同一抗原上不同位点的双特异性ADC可以改善受体聚集并导致目标的快速内吞作用。此外，在临床前实验中，一种双靶向HER2和LAMP-3的双特异性ADC显示出更好的溶酶体聚集和载荷传递。类似地，可以开发使用两种不同细胞毒素药物作为有效载荷的双载荷ADC，以减少药物抗性。通过准确控制两种药物的比例，可以通过将两种协同有效载荷传递到癌细胞中来实现更强的疗效。并且随着两种具有不同机制的有效载荷的应用，药物抗性的发生率将显著降低。例如，一种含有MMAE和MMAF的均匀抗HER2 ADC被设计出来，在异种移植小鼠模型中比相应的单载荷ADCs的联合给药表现出更显著的抗肿瘤活性。 ADC开发的另一种策略是放弃传统mAb的结构，选择将有效载荷与分子量较小的多肽片段或单链可变区片段偶联。这些策略的主要目的是减少ADCs的分子量，从而提高穿透效率和有效载荷传递到肿瘤组织。例如，PEN-221是一种由DM-1与靶向生长抑素受体2的多肽链偶联而成的ADC。它的分子量仅为2 kDa，远低于传统ADC中150 kDa的IgG分子。这种ADCs的当前技术挑战是它们可能在血浆中被迅速清除。然而，如果我们能够克服这个障碍，它可能在治疗难以接触的肿瘤方面具有潜力，包括血管化不良和中枢神经系统肿瘤。传统上，需要高内吞能力的mAb来将有效载荷传递到癌细胞中。然而，由于抗原屏障，mAb通常很难扩散到实体肿瘤块中。因此，可以为ADC开发非内吞性抗体。它基于这样一个原理：有效载荷直接在肿瘤微环境中的还原条件下在细胞外释放，然后扩散到癌细胞内导致细胞死亡。 最后，在有效载荷选择方面仍然存在许多创新机会。目前，载荷的选择不再局限于标准细胞毒素药物，而是开始发现更多针对性药物和免疫药物。例如，mirzotamab clezutoclax是一种靶向B7-H3的ADC，它采用促进细胞凋亡的新型BCL-XL抑制剂作为有效载荷。目前正在早期临床试验中进行评估。 7.  结论 来自学术界和工业界的数十年努力已经成功地开发了多种ADC疗法，使成千上万的癌症患者受益。14种ADC药物的推出和其他ADC候选药物的激动人心的临床表现也吸引了更多人关注这个领域，这对于这个相对年轻但高度复杂的领域非常重要。幸运的是，大量研究为决定ADC最终行为的关键要素提供了见解。建立适当的方法对ADC的每个组分进行体外和体内评估至关重要。识别和验证新的抗原/抗体、开发具有最佳毒性的新有效载荷，以及设计新的连接体以平衡稳定性和有效载荷释放，对下一代ADCs至关重要。随着这些领域的研究人员的持续努力，不难想象未来的ADCs将在癌症的靶向治疗中带来更多惊喜。

2024医美与器械创新前沿华西论坛，与您共探药企转型之道，解锁消费医疗市场新机遇。10月12日，成都等您来！ 肿瘤免疫治疗旨在激活宿主的抗肿瘤免疫，形成肿瘤抑制微环境，最终实现消除肿瘤，提高患者的整体生存率。肿瘤疫苗是一种很有前途的抗肿瘤免疫治疗手段。针对肿瘤相关抗原（TAAs）或肿瘤特异性抗原（TSAs）的疫苗可以特异性攻击和摧毁这些抗原高水平表达的恶性肿瘤细胞，并通过免疫记忆实现持续的肿瘤杀伤。因此，与其他类型的免疫治疗相比，癌症疫苗理论上可以提供特异、安全和耐受性良好的治疗效果。 基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的，mRNA疫苗比传统疫苗有许多优点：与某些病毒疫苗不同，mRNA不会整合到基因组中，从而避免了对插入突变的担忧；mRNA疫苗可以以无细胞的方式制造，从而实现快速、经济、高效的生产。此外，单个mRNA疫苗可以编码多种抗原，增强针对适应性病原体的免疫反应，并能够以单一配方针对多种微生物或病毒变体。 mRNA疫苗是一类重要的癌症疫苗，能够编码和表达TAA、TSA及其相关细胞因子。mRNA癌症疫苗可以刺激体液免疫和细胞免疫，提高这些疫苗对不同疾病和患者的适应性。目前，多种mRNA癌症疫苗正在临床中进行开发，为癌症免疫治疗带来新的曙光。 1 mRNA疫苗制备策略 体外转录（IVT）mRNA模拟内源性mRNA的结构，有五个部分，从5ʹ到3ʹ包括：5ʹcap，5ʹ非翻译区（UTR），一个编码抗原的开放阅读框，3ʹUTR和一个PolyA尾。 与天然真核mRNAs一样，5′端帽结构包含一个7-甲基鸟苷核苷，5′端结构会在空间上保护mRNA不被核酸外切酶降解，并与翻译起始因子蛋白协同工作，招募核糖体以启动翻译。PolyA尾的长度间接调节mRNA翻译和半衰期。 编码区两侧的5′和3′UTR调节mRNA翻译、半衰期和亚细胞定位，来自高表达基因（如α-和β-珠蛋白基因）的天然UTR是合成mRNAs的首选。此外，UTR可根据细胞类型进行优化，如通过去除3′UTR中的miRNA结合位点和富含AU的区域，将mRNA降解降至最低。 mRNA疫苗的开放阅读框是最关键的组成部分，尽管开放阅读框不像非编码区那样具有可塑性，但可以通过优化密码子，从而在不改变蛋白质序列的情况下增加翻译。例如，CureVac AG公司发现人类mRNA密码子很少在第三位有A或U，从而用G或C替换开放阅读框第三位的A或U。并将此优化策略用于其SARS-CoV-2疫苗CVnCoV，目前正处于III期试验阶段。 为了最大化翻译，mRNA序列通常包含修饰的核苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷类似物。修饰核苷的使用，特别是修饰尿苷，阻止了模式识别受体的识别，保证了翻译过程产生足够水平的蛋白质。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS-CoV-2疫苗都含有核苷修饰。另一种避免模式识别受体检测的策略，由CureVac首创，使用序列工程化和密码子优化，通过提高疫苗mRNA的GC含量来消耗尿苷。 除了mRNA序列的改进外，在简化mRNA生产方面也取得了重大进展。临床上使用的合成mRNA通过使用噬菌体RNA聚合酶T7（也可以使用T3和SP6聚合酶）从DNA质粒在体外转录。另外，使用CleanCap的共转录封盖技术，简化了纯化步骤。 2 mRNA递送系统 由于mRNA较大（104–106Da）且带负电，因此无法通过细胞膜的阴离子脂质双层。此外，在体内，它会被先天免疫系统的细胞吞噬，并被核酸酶降解。因此，体内应用需要使用mRNA递送载体，该载体转染免疫细胞而不会引起毒性或不必要的免疫原性。目前，已经为此开发了许多基于创新材料的解决方案。 01 脂质纳米颗粒（LNP） 脂质纳米颗粒是临床上最先进的mRNA载体。截至2021年6月，所有正在研制或批准临床使用的SARS-CoV-2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP为mRNA递送提供了许多好处，包括制剂简单、模块化、生物相容性和较大的mRNA有效载荷容量。除RNA药物外，LNP通常包括四种成分，可电离脂质、胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇化脂质，它们共同封装和保护脆弱的mRNA。 可电离脂质与mRNA在酸性缓冲液中形成纳米颗粒，使脂质带正电荷并吸引RNA。此外，它们在内涵体的酸性环境中带正电荷，这促进了它们与内涵体膜的融合，将其释放到细胞质中。 DODAP和DODMA是第一种用于RNA输送的可电离脂质。通过设计提高DODMA的功效，产生了DLin-MC3-DMA。这是第一个FDA批准的药物制剂中使用的可电离脂质：siRNA药物patisiran（Onpattro）。除了有效且安全地递送siRNA外，DLin-MC3-DMA还用于mRNA的递送。 目前，学术界和工业界的许多团体使用组合反应方案来合成潜在的传递材料，这种方法产生了许多有效的脂质，包括C12-200、503O13、306Oi10、OF-02、TT3、5A2-SC8、SM-102（用于抗SARS-CoV-2的Moderna疫苗mRNA-1273）和ALC-0315（用于辉瑞疫苗BNT162b2）。 除了寻求提高疗效外，人们越来越关注提高药物的特异性，特别是对疫苗和免疫疗法的特异性。含有多环金刚烷尾的脂质11-A-M58，和含有环咪唑头的脂质93-O17S59，已被设计用于体内靶向T细胞。尽管机制尚不清楚，但这些脂质的环状基团对于靶向T细胞至关重要。 尽管电离脂质可以说是LNP最重要的成分，但其他三种脂质成分（胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质）也促进了纳米粒子的形成和功能。胆固醇是一种天然存在的脂质，它通过填充脂质之间的空隙来增强纳米颗粒的稳定性，并有助于在摄取到细胞的过程中与内涵体膜融合。 辅助脂质通过促进有助于膜与内涵体融合的脂质相变来调节纳米颗粒的流动性并增强功效。最佳辅助脂质的选择取决于可电离脂质材料和RNA载体。例如，对于类脂质材料，饱和辅助脂质（如DSPC）最适合传递短RNA（如siRNA），而不饱和脂质（如DOPE）最适合传递mRNA 。DSPC已被用于FDA批准的SARS-CoV-2疫苗mRNA-1273和BNT162b2中。 LNPs的聚乙二醇化脂质成分由聚乙二醇（PEG）与锚定脂质（如DMPE或DMG）结合而成。亲水性PEG可以稳定LNP，通过限制脂质融合调节纳米颗粒大小，并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用增加纳米颗粒半衰期。mRNA-1273和BNT162b2 SARS-CoV-2疫苗均含有聚乙二醇化脂质。 02 聚合物和聚合物纳米颗粒 尽管临床进展不如LNP，但聚合物具有与脂质相似的优势，能够有效传递mRNA。阳离子聚合物将核酸浓缩成具有不同形状和大小的复合物，可通过内吞作用进入细胞。 聚乙烯亚胺是研究最广泛的核酸传递聚合物。尽管其功效卓越，但由于其高电荷密度，其毒性限制了应用。此外，已经开发出几种毒性较小的可生物降解聚合物。例如，聚（β-氨基酯）在mRNA传递方面表现出色，尤其是对肺。 最近开发出了一种新型的含脂聚合物，称为电荷改变可释放转运体（CARTs），它能有效地靶向T细胞，操纵T细胞是非常困难的，因此，CART 是一种极具吸引力的传递材料，在mRNA疫苗和基因治疗领域具有巨大潜力。 03 其他递送系统 除了脂质和聚合物载体外，肽也可以将mRNA传递到细胞中，这要归功于其主链和侧链中的阳离子或两亲胺基（例如精氨酸），这些阳离子或两亲胺基与mRNA静电结合并形成纳米复合物。例如，含有重复的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（RALA）基序的膜融合细胞穿透肽。 富含精氨酸的鱼精蛋白肽在中性pH下带正电荷，也可以浓缩mRNA并促进其传递。鱼精蛋白与mRNA复合物激活识别单链mRNA的Toll样受体（TLR7，TLR8）通路，因此，它还可以作为疫苗或免疫治疗应用的佐剂。CureVac AG正在评估一种含有鱼精蛋白的递送平台RNActive，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小细胞肺癌的临床试验。 最后，基于角鲨烯阳离子纳米乳液也可以传递mRNA，这些纳米乳剂由油性角鲨烯核组成。一些角鲨烯制剂，如诺华的MF59，在FDA批准的流感疫苗中用作佐剂。MF59使注射部位的细胞分泌趋化因子，从而招募抗原呈递细胞，诱导单核细胞分化为树突状细胞，并增强抗原呈递细胞对抗原的摄取。角鲨烯基阳离子纳米乳剂从内涵体逃逸并将mRNA输送到细胞质中的机制尚不清楚。 3 mRNA疫苗的免疫作用 在注射mRNA癌症疫苗后，mRNA编码的蛋白质由核糖体合成，然后翻译后修饰以产生正确折叠的功能蛋白质，并呈现给免疫系统。该过程类似于RNA病毒感染和连续诱导保护性免疫反应的自然过程。外源mRNA进入细胞质导致与内源性mRNA类似的反应。 01 诱导先天免疫反应 宿主免疫系统通过PRRs检测病原体相关分子模式（PAMP）激活固有免疫反应。注射疫苗后，mRNA和传递系统成分将通过一系列PRR识别为外源性物质，导致Toll样受体（TLR）的激活，例如主要在抗原呈递细胞（APC）上表达的TLR3、TLR7和TLR8。外源性IVT mRNA可被细胞膜、内体以及细胞质中的各种PRR识别，并在刺激内源性免疫反应中发挥作用。 IVT mRNA的免疫原性主要由TLR7和TLR8介导。TLR7由B细胞、巨噬细胞和树突状细胞表达，并介导识别单链RNA（ssRNA）的过程。在细胞质中，其他一些PRR可以感应不同类型的RNA，例如dsRNA和ssRNA。 在非免疫细胞中，细胞质维甲酸诱导基因I样受体（RLR）和黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）感应外源mRNA并调节细胞因子和趋化因子的产生，导致天然免疫细胞募集到mRNA注射部位。 02 诱导适应性免疫反应 mRNA疫苗接种后，编码的蛋白质将被翻译并呈递给免疫系统，并刺激适应性免疫。mRNA编码的蛋白质通过内吞或吞噬作用被APC吸收，它们可能形成吞噬小泡或含有抗原蛋白的内体，抗原蛋白通过树突状细胞上的主要组织相容性复合体呈递。 mRNA癌症疫苗通常编码在癌细胞上表达的TAA。这些TAA可进一步分为组织分化抗原（如MART-1）、肿瘤生殖系抗原（如NY-ESO-1或MAGE-3）、肿瘤细胞过表达的正常蛋白（如EGFR、MUC1、Her2/neu）、病毒蛋白（如EBV、HPV）和肿瘤特异性突变抗原（如MUM-1、β-catenin或CDK4）。此外，体细胞突变可能产生新抗原表位，码新抗原的mRNA疫苗被认为是最佳的候选癌症疫苗。 除了诱导T细胞免疫外，mRNA疫苗还诱导中和抗体。滤泡辅助性T细胞（Tfh）不仅对生发中心的发育至关重要，而且还驱动免疫球蛋白样转化、亲和力成熟和持久的B细胞记忆反应。这些细胞可以被mRNA疫苗激活，产生足够数量有效和持久的中和抗体。 4 mRNA癌症疫苗的临床开发 基于IVT mRNA的疫苗正在逐步开发，用于多种肿瘤治疗。目前，mRNA癌症疫苗根据最终产品类型可以分为编码TAA、TSA、细胞因子和抗体的癌症疫苗。 01 编码TAAs 的mRNA疫苗 在多项临床试验中，NY-ESO-1、酪氨酸酶、MAGE-A3、MAGE-C2和TPTE已被用作黑色素瘤mRNA疫苗的TAA。 BNT111是一种BioNTech FixVac平台开发癌症疫苗，该平台利用TAA的固定组合，旨在触发针对癌症的强大而精确的免疫反应。2021年底，FDA批准了BNT111快速通道资格，这是一种治疗晚期黑色素瘤的新型癌症免疫疗法，目前BNT111正在两项临床试验中进行研究。一项I期试验（NCT02410733）的中期分析报告表明，BNT111是有效的免疫疗法。随后的II期试验（NCT04526899）研究BNT111单独或与抗PD-1抗体cemiplimab联合的安全性和有效性。 CV9201和CV9202是两种针对非小细胞肺癌中表达的靶抗原的mRNA疫苗。临床试验（NCT00923312、NCT01915524、NCT03164772）表明，这两种疫苗耐受性良好，治疗后可以检测到免疫反应，从而支持在非小细胞肺癌中的进一步临床研究。 02 编码TSA的mRNA疫苗 编码多种突变抗原的mRNA疫苗是治疗突变诱发的恶性肿瘤的理想疫苗，这种类型的癌症疫苗进行的临床试验最多。随着下一代测序技术的发展，可以生产编码突变抗原的个性化mRNA癌症疫苗，这种个性化的癌症疫苗具有非常诱人的前景。 两种个性化mRNA癌症疫苗目前正在进行二期临床试验，即Moderna的mRNA-4157和BioNTech的BNT122（RO7198457）。mRNA-4157在单个mRNA分子上特异性筛选和编码20-34个新抗原，这取决于患者的癌症突变。一期试验（NCT03313778）的中期数据表明，mRNA-4157单药治疗或与PD-1抑制剂Keytruda联合治疗在所有测试剂量下都具有良好的耐受性，并引发新抗原特异性T细胞反应。该疫苗目前正在黑色素瘤患者进行二期临床试验（NCT03897881）。 BioNTech 的BNT122已经探索了与PD-L1抗体联合治疗的有效性和安全性，在黑色素瘤、非小细胞肺癌和大肠癌的II期临床试验已于2021上半年启动。 03 mRNA编码免疫刺激剂 理论上，mRNA癌症疫苗可以编码任何蛋白质，包括免疫刺激剂，其可以重塑肿瘤免疫微环境（TIME），克服肿瘤免疫耐受，这已成为mRNA肿瘤疫苗研究的一个重要方向。 在过去几年中，已经进行了编码细胞因子的mRNAs癌症疫苗的临床试验。目前，临床试验中只有七种候选产品，它们属于Moderna和BioNTech。2017年，Moderna开发了第一个表达mRNA编码的免疫刺激剂（mRNA-2416），其编码OX40L，一项1期临床试验（NCT03323398）评估了mRNA-2416单独和与durvalumab联合的安全性和耐受性。 已有的数据表明，mRNA-2416单药在所有剂量水平下都是可耐受的，没有报告剂量限制毒性，大多数相关不良事件为1级或2级。更重要的是，在PD-L1上调的时间内观察到广泛的促炎活性和有益的变化。目前，mRNA-2416瘤内注射已进入晚期卵巢癌的临床II期试验。 另一种mRNA疫苗mRNA-2752编码OX40L/IL23/IL36γ，早期的临床结果表明，mRNA-2752与抗PD-L1抗体durvalumab联合使用，在所有剂量下都具有良好的耐受性，并显示出抗肿瘤活性的迹象。 此外，BioNTech还开发了编码IL-12sc、IL-15sushi、GM-CSF和IFNα的BNT131，其作为单一疗法或与cemiplimab联合用于晚期实体瘤患者。 — 小结 — 几十年来，mRNA设计和核酸递送技术的进步，加上新抗原靶点的发现，使得mRNA疫苗成为对抗癌症的有力工具。mRNA疫苗的优势体现在mRNA癌症疫苗具有同时编码多种抗原的能力，以及非整合、高度降解和无插入突变潜力。IVT产生的mRNA不含细胞和致病性病毒成分，没有感染的可能性；在正在进行的临床试验中测试的大多数mRNA疫苗通常耐受性良好，注射部位特异性免疫反应很少。 快速生产是mRNA癌症疫苗的另一个优势，并且mRNA制造技术的成熟允许在短时间内生产新型疫苗。最近新抗原的发现和鉴定促进了个性化疫苗治疗的发展。BioNTech和Moderna进行的几项临床研究表明，在一些治疗多发性实体瘤的临床试验中，使用个性化疫苗具有强大的抗肿瘤免疫，开创了治疗性肿瘤疫苗的新时代。我们有理由认为，mRNA疗法将可能改变现代医学的疫苗接种方法以及癌症免疫疗法。 参考文献： 1. mRNA Vaccines: The Dawn of a New Era of Cancer Immunotherapy. Front Immunol.2022; 13: 887125. 2. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat RevDrug Discov. 2021 Aug 25 : 1–22. 3. Recent advances in mRNA vaccine technology. Curr Opin Immunol. 2020 Aug;65:14-20. 同写意媒体矩阵，欢迎关注↓↓↓