HDAC11

引言 IIa类组蛋白去乙酰化酶（IIa类HDAC）在调节必需的细胞代谢和炎症途径中起着关键作用。然而，由于目前抑制剂的全抑制作用以及缺乏探测其表观遗传调控之外的功能的工具，因此很难剖析每种IIa类HDAC异构体的具体作用。 2024年7月25日，浙江大学朱成梁、蒋莉及曹戟共同通讯在Advanced Science 在线发表题为“PROTAC-Mediated HDAC7 Protein Degradation Unveils Its Deacetylase-Independent Proinflammatory Function in Macrophages”的研究论文，该研究中，开发了一种基于PROTAC的新型化合物B4，它选择性地靶向和降解HDAC7，从而有效减弱脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞和小鼠模型中的一组特定促炎细胞因子。 通过使用B4作为分子探针，发现了先前探索的HDAC7作用超越其去乙酰化酶功能的证据，表明其在炎症过程中具有更广泛的意义。机制研究表明，HDAC7通过直接与TNF受体相关因子6和TGFβ活化激酶1（TRAF6-TAK1）复合物相互作用，在Toll样受体4（TLR4）信号通路中发挥关键作用，从而启动下游丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB（MAPK/NF-κB）信号级联的激活以及随后的基因转录。这项研究拓展了对HDAC7在复杂炎症网络中的作用的洞察，并强调了其作为抗炎治疗新靶点的治疗潜力。     细胞因子是免疫细胞分泌的必需化学信使，可协调正常的免疫反应。通过与细胞受体相互作用，细胞因子激活下游信号级联，引发免疫反应，保护身体免受炎症或感染。因此，维持促炎和抗炎细胞因子的动态平衡对于免疫稳态至关重要。相反，失调的细胞因子产生会破坏这种平衡，导致免疫紊乱，例如自身免疫性疾病，其特征是免疫系统错误地攻击身体自身的组织。大量研究表明，自身免疫性疾病通常伴有过度的巨噬细胞活化和促炎细胞因子释放。因此，失调的细胞因子网络被认为是导致这些疾病的主要因素。 然而，由于复杂的免疫网络涉及多种难以解决的信号通路和蛋白质，因此了解自身免疫性疾病的发病机制仍然具有挑战性。此外，虽然针对细胞因子及其受体提供了一种治疗免疫介导炎症疾病的方法，但抑制这些靶标可能会导致不良的副作用，因为许多细胞因子和受体具有多效性。因此，迫切需要开发针对细胞因子信号网络中关键分子节点的新型治疗策略。一种有希望的方法是针对控制细胞因子基因表达的表观遗传调节剂。表观遗传修饰，如组蛋白乙酰化和去乙酰化，在调节基因转录方面至关重要。通过调节表观遗传酶的活性，可能可以微调细胞因子的产生并恢复免疫平衡。 组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是一种表观遗传酶，可催化组蛋白和非组蛋白上赖氨酸残基的N-ε-乙酰基修饰水解。通过这种去乙酰化活性，HDAC可以调节对免疫细胞分化、活化和代谢至关重要的基因转录。迄今为止，已鉴定出11种锌依赖性HDAC，并分为四个亚类：I类（HDAC1、2、3、8）、IIa类（HDAC4、5、7、9）、IIb类（HDAC6、10）和IV类（HDAC11）。文献和之前的研究表明，HDAC是炎症和免疫的重要调节剂。IIa类HDAC以其相当弱的脱乙酰酶活性而著称，这归因于其催化域内活性酪氨酸突变为组氨酸。与主要位于细胞核中的I类HDAC不同，IIa类HDAC在细胞核和细胞质之间穿梭，除了染色质修饰外，还参与各种细胞活动。     HDAC7敲低可显著减弱LPS刺激的巨噬细胞中的促炎细胞因子产生（Credit: Advanced Science）     具体而言，IIa类HDAC具有较大的非催化区域，可充当表观遗传读取器或伪酶，与多种细胞蛋白相互作用。IIa类HDAC的失调或过表达与许多疾病有关，包括代谢紊乱、炎症和癌症。尽管取得了重大进展，但由于当前抑制剂的全抑制作用以及用于研究其脱乙酰化以外的生物学功能的探针有限，对特定IIa类HDAC亚型的研究仍面临挑战。例如，IIa类HDAC的HDAC7在炎症巨噬细胞中上调，在细胞代谢和炎症中起关键作用。然而，其在调节炎症反应中的去乙酰化酶独立功能仍不清楚。 最近，蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）已成为一种利用细胞内源性蛋白酶体降解机制来破坏蛋白质功能的新方法。与传统的酶抑制相比，PROTAC介导的蛋白质降解具有几个吸引人的特性，包括持久的功效、增强的选择性以及针对酶和非酶活性的能力。因此，PROTAC方法在研究这些以前具有挑战性的目标方面显示出了巨大的前景。Fischer及其同事通过使用化学蛋白质组学方法探索HDAC的可降解性，进一步推进了这一领域，为开发针对IIa类HDAC的PROTAC提供了富有洞察力的指导。 在这项研究中，发现了HDAC7以前未被探索的、不依赖去乙酰化酶的促炎作用，并报道了第一个体内有效的HDAC7特异性降解剂B4。PROTAC化合物B4可有效诱导HDAC7降解，并显著减少脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞和小鼠模型中多种促炎细胞因子的分泌。使用B4作为分子探针，剖析了HDAC7在维持TNF受体相关因子6和TGFβ激活激酶1（TRAF6-TAK1）复合物和调节细胞因子基因转录中的非酶功能。研究强调了HDAC7在Toll样受体4（TLR4）信号通路中的重要作用，并提出使用异构体选择性降解剂靶向HDAC7作为治疗细胞因子介导的自身炎症疾病的潜在治疗方法。 参考文献 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202309459 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“iNature” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

咨询合作     药物筛选中心（暨南大学），隶属于暨南大学药学院公共科研平台。中心拥有Echo550微量液体超声转移工作站等先进的自动化药物筛选仪器，前期支撑的多个激酶抑制剂已经产业转化及发表JMC等高水平论文。目前，筛选中心建有激酶、蛋白酶、HDAC、COX、GPCR、报告基因、病毒、细菌等筛选模型，能够开展肿瘤、神经系统疾病、心脑血管病、糖尿病、病毒和细菌感染性疾病等领域相关靶标、细胞、机制的筛选和研究，每天能够完成数万次的新药筛选反应。已建立的药物筛选模型1）蛋白水平：激酶：Abl, ABL(M351T), ABL(H396P), ABL(Y253F), ABL1 (E255K), ABL1 (G250E), ABL(Q252H), AKT1, AKT2, AKT3, ALK, ALK5, AuroraA, AuroraB, AXL, BRAF, BRAF(V599E), BTK, DDR1, DDR2, EGFR, EGFR (T790M), EGFR(L858R), EGFR(L861Q), EGFR(T790ML858R), EGFR(D746-750), EGFR(D746-750/T790M), Flt3, FLT3(D835Y), FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, Her2, Her4, KIT, MET, IGF-1R, FGFR1, JAK1, JAK2, JAK3, MAPK10, MAPK14, mTOR, TrkA, TrkB, TrkC,TYK2, KDR, SRC, PDGFRa, PDGFRA(D842V), PDGFRb, RET, ZAK。蛋白酶：MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-13, MMP-14, ADAM5, ADAM10, ADAMTS13, TACE/ADAM17, Furin, Cathepsin E, Cathepsin D, BACE-1, DDP4, DDP8, DDP9, HIV protease-1, PMVII，PMVIV。HDACs：HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, Sirt1, Sirt2, Sirt3, Sirt4, Sirt5, Sirt6。2）肿瘤细胞活性：近500种肿瘤细胞系；基于Ba/F3的耐药模型3）抗病毒/菌药物筛选：EV71和HSV病毒活性筛选模型；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏杆菌等4）体内药效：移植瘤模型对外服务1）体外活性筛选（单剂量抑制率；多剂量IC50）；2）体内药效；3）机制研究；4）药代动力学研究；5）化合物工艺优化、大量订制。  咨询合作

2024年3月8日，杭州师范大学叶向阳/谢恬团队在Journal of Medicinal Chemistry在线发表了题为“Design, Synthesis, and Structure–Activity Relationship of Novel Pyridazinone-Based PARP7/HDACs Dual Inhibitors for Elucidating the Relationship between Antitumor Immunity and HDACs Inhibition”的文章。该团队开发了一系列基于哒嗪酮的PARP7/HDACs双重抑制剂，其中化合物9l具有强效的PARP7/HDACs双重抑制活性，在体内外均表现出优异的抗肿瘤能力。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）在染色体结构和基因表达调控中发挥着重要作用，对肿瘤细胞分化、增殖和免疫调节等过程具有许多影响，已被验证为抗肿瘤的重要靶点，目前已有五种药物（1-5）获得上市批准（图1）。聚[二磷酸腺苷（ADP）-核糖]聚合酶7（PARP7）是PARPs家族中单PARP亚家族的成员之一，能使自身和其他底物蛋白发生MARylate反应，即催化单个ADP-核糖（MAR）从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）共价转移到其底物上。PARP7被证实通过抑制IFN-I信号转导参与细胞膜NA感应和多种病毒RNA感染。抑制PARP7能以免疫细胞依赖的方式诱导肿瘤细胞的IFN-I信号转导，从而导致肿瘤细胞死亡，使得PARP7成为一个极具吸引力的治疗靶点。Atamparib（RBN-2397，图1）是一种口服可用的PARP7选择性抑制剂（IC50< 3 nM），目前正在进行2期临床试验。BN-2397通过激活IFN-I信号通路抑制肿瘤免疫逃逸，从而抑制胰腺癌、卵巢癌、非小细胞肺等多种实体瘤的肿瘤生长。开发同时靶向HDACs和PARP7实现协同抗肿瘤作用具有重要意义。图1 HDACs抑制剂和PARP7抑制剂RBN-2397的结构。基于RBN-2397的双重抑制剂设计作者对临床候选药物RBN-2397与PARP7蛋白的共晶结构进行分析，发现其嘧啶环上的氮与ASP580形成氢键作用；哒嗪酮基团在NAD亚口袋中充当NAD模拟结合，并与PARP7蛋白的残基GLY565、GLN576和SER604形成氢键；哌嗪上的羰基和TYR596形成重要的氢键（图2A）。此外，嘧啶环上的CF3与GLY573形成额外的氢键作用，但其对PARP7活性并不重要。为了能容纳HDACs抑制剂的药效团（异羟肟酸），设计将异羟肟酸取代RBN-2397嘧啶环上的可修饰基团CF3，合成了化合物7具有HDAC1（IC50 = 34.0 nM）、HDAC6（IC50 = 83.7 nM）和PARP7（IC50 = 2.7 nM）的抑制作用（图2B）。图2 （A）RBN-2397与PARP7蛋白共晶结构中的相互作用；（B）第一种PARP7/HDACs双重抑制剂化合物7的结构；（C）化合物7与PARP7蛋白的相互作用；（D）化合物7与PARP7催化结构域结合的表面图；（E）BN-2397（绿色）和化合物7（蓝色）在PARP7中的叠加。随后，作者在此基础上进行异羟肟酸和哒嗪酮支架之间的片段Y和R1的结构改造（图3A），以进一步提升对PARP7、HDAC1和HDAC6的抑制活性。但化合物8a-8g的效力并没有显著提升。接着，作者保留了化合物7的Y和R1区域，在嘧啶环和异羟肟酸之间插入不同长度和类型的linker以提高对HDACs的抑制活性（图3B）。在将linker从具有酰胺官能团的直烷基链、吡唑基烷基链和苄氧基替换为烯丙基苄基后，得到活性最好的化合物9l（对PARP7、HDAC1和HDAC6的IC50分别为3.1 nM、35.0 nM和6.4 nM）。图3 PARP7/HDACs双重抑制剂8和9的设计。在体外细胞活性测试中，化合物9l对NCI-H1373和MV-4-11两种细胞系均显示出优异的抑制活性（≥ 99% at 10 μM，图4），比RBN-2397和SAHA效力更强。且与RBN-2397相比，化合物9l对MV-4-11和U937两种血液肿瘤细胞株显示出更强的抑制活性，与SAHA相比，活性略好。在对PARP7缺乏敏感性的NCI-2066细胞系中，化合物9l显示出比RBN-2397更强的抗细胞增殖活性。图4 PARP7/HDACs双重抑制剂的抗增殖活性测试。化合物9l可恢复IFN-β的产生和组蛋白H3的乙酰化研究表明，HDACs抑制剂，尤其是在用SAHA处理的细胞中，会降低磷酸化STAT1的水平和干扰素刺激基因的表达。作者以RBN-2397作为对照，在用固定浓度为1 μM的RBN-2397处理的NCI-H1373细胞中，加入不同浓度的SAHA显示，SAHA的增加会降低STAT1的磷酸化水平（在SAHA的最高浓度下，磷酸化可完全被抑制），而H3的乙酰化水平则不受影响（图5A）。化合物9l能显著提高p-STAT1和乙酰化H3的水平，而9h对p-STAT1水平没有影响（图 5B）。图5 （A）HDACi对PARP7i（RBN-2397）诱导p-STAT1水平的影响；（B）RBN-2397和SAHA组合以及不同浓度的9h和9l对Ac-H3和p-STAT1水平的影响。进一步的实验发现，随着9l浓度的增加，STAT1磷酸化水平、H3乙酰化水平和微管蛋白乙酰化水平逐渐升高（图6）。化合物9l通过同时抑制PARP7和HDACs可导致H3乙酰化水平升高，IFN-β和CXCL10的mRNA表达水平升高。这些发现意味着化合物9h只抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，而化合物9l则具有同时抑制PARP7和HDAC的能力。图6 化合物对IFN-β和CXCL10表达水平的影响以及化合物对p-STAT1水平、Ac-H3和Ac-Tubulin的影响。化合物9l对PARPs和HDACs的选择性探究化合物9l具有强效的PARP7和HDAC6抑制活性，并且相比HDAC1，对HDAC6具有一定程度的选择性。化合物9l具有与SAHA相似的选择性，它对HDAC6的抑制活性（IC50 = 6.4 nM）略好于HDAC1-3（IC50 = 30~35 nM）；对HDAC8的活性较低，对HDAC11的活性最差（图7）。在对PARP同工酶的抑制活性中，化合物9l与RBN-2397具有相似的选择性。它对PARP7和PARP2的活性水平相同，但对PARP1、PARP5A和PARP5B的活性略高。图7 化合物9l对HDACs和PARPs的抑制活性。化合物9l的体内活性探究化合物9l以5 mg/kg的剂量通过静脉注射（iv）途径给药。结果显示，该化合物的清除率高达94.2 mL/min/kg，半衰期（t1/2）为13.3 h（表 8A）。口服10 mg/kg剂量的9l表现出极低的血浆暴露量，导致口服生物利用度较低（%F低至2.4%）。初步的PK评估表明，在异种移植小鼠模式的体内抗癌疗效概念验证（POC）研究中，口服给药是首选的给药途径。在BALB/c裸鼠CT26异种移植模型中，腹腔给药治疗17天，能明显减少肿瘤的生长（图8B、C）。当给药剂量为75 mg/kg时，9l的抗肿瘤效果最好，对肿瘤生长的抑制作用高于SAHA（50 mg/kg）和RBN-2397（50 mg/kg）。此外，实验小鼠均未出现体重明显减轻等副作用。图8 （A）化合物9l的PK表征；（B、C）在CT26荷瘤小鼠体内的抗肿瘤作用。总结在本研究中，作者首次设计并合成了一系列新型PARP7/HDACs双重抑制剂。在这些新化合物中，化合物9l对PARP7和HDACs在酶水平上都有很强的抑制活性。为了揭示同时在分子水平上靶向PARP7和HDACs能否产生协同药理作用，研究人员对化合物9l进行了一系列体外和体内实验。结果表明，同时靶向PARP7和HDACs可能无法实现协同抗癌效果，因为这两种途径的作用会相互抵消。不过，先导物9l是有史以来首次报道的PARP7/HDACs双重抑制剂，可作为进一步生物学研究的分子工具。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c00090声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓