PI4Kβ

2025年3月25日，中国科学院上海药物研究所陈小华课题组与谭敏佳、李佳课题组合作在Angew. Chem. Int. Ed.期刊发表题为“Cross-Linking Profiling of Molecular Glue Degrader-Induced E3 Ligase Interactome to Expand Target Space”的研究论文。团队基于基因密码子扩展技术、光交联非天然氨基酸和蛋白质组学分析，发展了一种在活细胞内直接捕捉“分子胶诱导的E3连接酶-底物”相互作用的新方法。该方法为分子胶降解剂及其可调控的靶标发现提供了新的化学生物学工具，为探索“难成药”靶标的降解和扩展靶标空间提供新视角。该论文被Angew. Chem. Int. Ed.期刊选为“Very Important Paper”。分子胶（Molecular Glue, MG）是一类通过诱导形成新的蛋白质-蛋白质相互作用（neoPPIs）来调控靶标蛋白功能的小分子化合物（图1a），已成为新药发现和疾病治疗新范式。发现分子胶诱导的底物，不仅对新分子胶降解剂的设计和发现具有重要科学意义，而且为扩展靶标空间提供新思路，从而发展疾病治疗新策略。分子胶诱导的泛素蛋白酶体系统的靶向蛋白降解涉及多个生物学过程，然而，现有研究方法主要依赖于底物降解终点或底物泛素化标记的检测，难以有效捕获分子胶诱导形成的E3连接酶与底物的动态相互作用，制约了其可调控底物包括可降解和非降解底物的系统性发现及其作用机制的深入研究。针对以上挑战，该研究提出了“光交联非天然氨基酸捕捉分子胶诱导的底物”的策略，开发了一种活细胞中分子胶诱导的底物发现新方法，实现了对分子胶诱导的E3连接酶底物及分子胶降解剂的发现（图1b）。本工作发展的活细胞内“光交联非天然氨基酸捕捉分子胶动态诱导的底物”新方法本研究基于基因密码子扩展技术，将具有光交联活性的非天然氨基酸（UAA）定点引入到E3连接酶CRBN的底物结合界面，光激活条件下实现活细胞内对分子胶诱导的CRBN-底物共价捕获。这一方法突破了现有技术在灵敏度和准确性上的限制，成功鉴定出分子胶CC-885诱导的内源性降解底物（如GSPT1、GSPT2、ETF1），并揭示了临床分子DKY709降解的新靶标FIZ1，拓展其潜在靶标空间。此外，基于分子胶与CRBN的结合特点，设计了两种新型分子胶降解剂CM-2和CM-3，这些分子胶在多发性骨髓瘤MM.1S细胞系中表现出显著的抗增殖活性；并利用该方法揭示了其诱导的新底物（如ZFP91，PI4KB等），为开发新一类分子胶及其可调控的靶标发现提供了新策略。同时，该研究发现了底物与CRBN结合的新模式，为“E3连接酶-分子胶-诱导底物”的识别机制提供了新见解。该项研究对分子胶发现的重要意义在于，更多不同结构类型分子胶底物互作组的系统性分析结果，能够为针对其中感兴趣的被招募底物的新分子胶设计提供源头信息，进而设计特异性分子胶降解该底物、扩展分子胶可调控的靶标空间。该方法不仅能够全面分析分子胶诱导的蛋白-蛋白相互作用，可扩展到更多分子胶诱导底物的发现，为新分子胶及其可调控靶标的发现提供了新策略；该方法还可拓展至更广泛的靶向蛋白降解(TPD)和化学分子诱导的蛋白质互作领域的研究，有助于推进针对"难成药"靶标的分子胶降解剂或蛋白质稳定剂的发现。上海药物所副研究员许亚莉、同济大学博士后赵雯思、上海药物所博士后聂辉军、助理工程师王家敏为本论文的共同第一作者。上海药物所陈小华研究员、谭敏佳研究员、李佳研究员为本论文的通讯作者。该工作得到国家自然科学基金委、上海市市科委扬帆项目和上海药物所自主部署项目等支持。全文链接https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.202505053声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

▎药明康德内容团队编辑（来源：清华大学） 细胞自噬是真核细胞中保守的降解性代谢通路，在维持细胞内稳态及生存起至关重要的作用，自噬的异常与诸多疾病的发生发展密切相关，例如癌症等。多年来，领域内的科学家一直在试图靶向自噬来治疗癌症。但目前尚未有特异性靶向自噬而治疗癌症的药物被成功开发，其重要原因是导致自噬失调的具体分子事件，特别是癌症相关自噬和生理性自噬（如饥饿诱导的自噬）之间的差异尚未阐明。 随着自噬在肿瘤发生发展过程中调控作用的研究，靶向自噬的肿瘤治疗逐渐变得重要，现在已经报道了通用靶向溶酶体（自噬）的药物氯喹作为肿瘤治疗的自噬通用药物，但是氯喹的非特异性会影响到很多生理过程，如会抑制机体基础自噬和机体的免疫系统，导致靶向自噬抑制肿瘤的临床应用遇到瓶颈。 近日，清华大学生命科学学院葛亮课题组、药学院张敏课题组与广州医科大学冯杜课题组携手合作，在《细胞研究》（Cell Research）杂志上上发表了题为“致癌性RAS通过P38-ULK1-PI4KB轴诱导一种独特形式的非经典自噬”（Oncogenic RAS Induces a Distinctive Form of Non-Canonical Autophagy Mediated by the P38-ULK1-PI4KB Axis）的研究论文。报道了RAS突变肿瘤过程中异常自噬的调控机制 (图1)，并发现异常自噬的特有细胞器，揭示了靶向PI4KB磷酸化可以特异性抑制RAS突变肿瘤的发生发展。与传统自噬通用药物氯喹作用不同，Tat-Pep.1促进CD8+T细胞的浸润。 ▲图1. RINCAA调控机制（图片来源：原始论文[1]） 在该项研究中，研究者以RAS突变的癌症模型探索自噬在肿瘤中的详细分子机制。研究者发现了一种由RAS突变表达诱导的非经典自噬，命名为RINCAA (RAS-Induced non-canonical autophagy via ATG8ylation)。与饥饿诱导的自噬相比较，RINCAA受不同的自噬因子调控，形成ATG8家族蛋白（如LC3和GABARAP）标记的多膜泡和多层结构的非经典自噬体结构，将其命名为RIMMBA (RAS-induced multivesicular/multilaminar bodies of ATG8ylation) (图2) 。 ▲图2.自噬体与RAS诱导的RIMMBA（图片来源：原始论文[1]） RINCAA的一个显著特征是经典自噬通路中的PI3K被替换为PI4KB。研究者鉴定了P38-ULK1-PI4KB-WIPI2级联信号控制这一过程，KRAS激活下游P38通路，进一步促进ULK1的激活。激活的ULK1促进PI4KB在S256和T263位点磷酸化并促进PI4P的产生,WIPI2作为PI4P效应器招募ATG16L1/ATG12-ATG5酯化复合体促进ATG8ylation和非经典自噬体的形成。 在RAS突变的肿瘤细胞系与结直肠癌病人中，PI4KB在S256与T263位点的磷酸化水平均显著上调，表明PI4KB在S256与T263位点的磷酸化可能作为RAS突变肿瘤治疗的一个非经典自噬的特异性靶点。研究者设计并合成的Tat-Pep1底物肽可以靶向抑制PI4KB在S256与T263位点的磷酸化进而抑制RINCAA活性，最终抑制KPC胰腺癌模型的肿瘤生长，延长KPC胰腺癌模型生存期，效果比自噬通用药物氯喹更好。 Tat-Pep1底物肽靶向RINCAA的高特异性同时保持机体的免疫活性，奠定了PI4KB磷酸化可作为一种非常有潜力的靶向自噬的肿瘤治疗靶点。未来基于靶向PI4KB在S256和T263磷酸化的小分子药物也将为临床RAS突变肿瘤病人带来新的希望。 通讯作者为清华大学生命科学学院葛亮副教授、药学院张敏副教授和广州医科大学冯杜教授。清华大学生命科学学院博士后王晓娟、博士后李树林和广州医科大学2021级博士生林士茵（现为广州医科大学附属第二医院博士后）为论文第一作者。清华大学生命科学学院邓海腾教授为该研究提供了宝贵意见，清华大学生命科学学院蛋白质中心冷冻电镜平台工程师李英、博士后韩亚平、2018级博士生王娟娟（已毕业）、2021级博士生黄智颖以及2019级本科生詹童（已毕业）为该研究提供了诸多帮助；该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、新基石科学基金、中国博士后科学基金、清华大学笃实基金和清华大学水木学者项目的支持。 原始论文： [1] Lung-Specific mRNA Delivery by Ionizable Lipids with Defined Structure-Function Relationship and Unique Protein Corona Feature. Advanced Science (2025). https://doi.org/10.1002/advs.202416525 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 更多推荐 点个“在看”再走吧~

醉茄内酯（Withanolides）是一类植物来源的甾体内酯，其衍生物被报道通过调节NF-κB、MAPK和WNT等通路发挥抗炎和抗肿瘤作用，且有报道称withanolide D通过调节神经酰胺的产生诱导白血病细胞凋亡，寻找新的更有效的醉茄内酯衍生物用于治疗白血病并阐明其作用机制至关重要。 2024年6月21日，奥地利CeMM分子医学研究中心Georg Winter团队在Nature Chemical Biology（IF=12.9）发表题为“Orpinolide disrupts a leukemic dependency on cholesterol transport by inhibiting OSBP”的研究文章，从天然产物母核出发，设计和合成了一系列结构多样化的withanolide类似物，并通过表型筛选发现了活性最强的orpinolide。机制上，orpinolide直接靶向OSBP，干扰PI4P信号传导，破坏高尔基体稳态和白血病细胞胆固醇转运依赖性，抑制白血病细胞生长。 1、表型筛选确定Orpinolide对白血病细胞的抑制作用 作者从52个withanolide类似物的化合物库中，通过表型筛选鉴定出orpinolide在多种白血病细胞系中具有最强的抑制细胞生长活性，而对正常的外周血单核细胞毒性明显较低，表明其对肿瘤细胞有选择性（图1）。 图1 醉茄内酯衍生物的功能分析 2、多组学确定orpinolide破坏高尔基体稳态并抑制胆固醇合成 为探究orpinolide的作用机制，作者系统开展了蛋白组学和转录组学的多组学分析。蛋白质结果显示下调蛋白主要定位于高尔基体，参与糖蛋白生物合成等过程，提示orpinolide破坏了高尔基体的正常功能。接着通过RNA测序发现胆固醇生物合成基因大幅下调。多组学分析表明，orpinolide治疗会破坏胆固醇的生物合成，并影响一系列高尔基体相关蛋白的细胞丰度，表明高尔基体稳态的功能受损，这可能是其发挥抗肿瘤活性的主要机制（图2）。 图2 orpinolide破坏高尔基体稳态并抑制胆固醇合成 3、基因组CRISPR/Cas9筛选确定orpinolide抗肿瘤活性依赖于PI4P信号通路 作者在KBM7细胞中进行了全基因组 CRISPR-Cas9 敲除的功能丢失筛选，发现敲除内质网-高尔基体膜接触点磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）转运相关基因PITPNB、ARMH3可显著降低KBM7细胞对orpinolide的敏感性，靶向敲除实验进一步确证了PITPNB、ARMH3敲除细胞系对orpinolide的抗性。此外，PI4KB抑制剂可拮抗orpinolide的细胞毒性,而PI4K2A抑制剂PI-273无此效应。结果表明orpinolide发挥抗白血病活性依赖于由PI4KB介导的高尔基体PI4P信号通路（图3）。 图3 orpinolide在功能上依赖于PI4P信号传导 4、化学蛋白质组学揭示orpinolide直接结合并抑制OSBP介导的胆固醇转运 鉴于orpinolide影响高尔基体稳态发挥作用，作者推测其直接蛋白质靶标将参与高尔基体相关过程。随后作者通过TPP实验来确定orpinolide的细胞靶标，将31和候选靶标与高尔基体定位（UniProtKB SL-0266）和固醇结合（GO：0032934）蛋白叠加，该交集显示OSBP是orpinolide的推定靶标。有研究报道OSBP作为内质网-高尔基体接触位点的主要脂质转运蛋白，利用PI4P的代谢能量在膜之间交换胆固醇和PI4P。随后作者通过CETSA、体外荧光偏振实验证实了OSBP是orpinolide的直接蛋白质靶标。FRET实验进一步证实orpinolide抑制了OSBP介导的胆固醇在供体和受体膜泡间的转运（图4）。 图4 Orpinolide靶向氧固醇结合蛋白OSBP 5、基因敲除与化学抑制实验证实OSBP抑制是orpinolide的关键抗肿瘤机制 作者最后开展了一系列的基因敲除和化学抑制实验验证了OSBP抑制在orpinolide抗肿瘤活性中的作用。免疫荧光结果显示orpinolide处理导致OSBP在高尔基体上聚集，破坏了高尔基体的完整性。II型前胶原蛋白（type 2 procollagen，PC2）实验发现orpinolide影响ER和高尔基体之间的货物顺向运输，即orpinolide治疗显著延缓了PC2的运输。结果表明orpinolide诱导的OSBP抑制对 Golgi 正常功能的功能性影响。此外，过表达OSBP及其P191R突变体均可降低KBM7细胞对orpinolide的敏感性，且单独敲除OSBP即可模拟orpinolide的增殖抑制效应，表明OSBP是其主要药效靶点（图5）。 图5 OSBP抑制是orpinolide的关键抗肿瘤机制 总结 该研究通过表型筛选发现醉茄内酯衍生物orpinolide具有选择性抗白血病活性，并通过整合多组学分析揭示其通过破坏高尔基体稳态和胆固醇转运发挥抗肿瘤效应，进一步通过基因组CRISPR/Cas9筛选确定了PI4P-PITPNB-ARMH3信号通路在orpinolide作用中的必要性，接着通过化学蛋白质组学方法鉴定出胆固醇转运蛋白OSBP是其直接作用靶点。最后通过基因敲除和化学抑制实验确定OSBP抑制是orpinolide发挥抗白血病活性的主要作用机制（图6）。 图6 orpinolide靶向OSBP干扰PI4P信号传导破坏高尔基体稳态治疗白血病 参考文献 Cigler M, Imrichova H, Frommelt F, Caramelle L, Depta L, Rukavina A, Kagiou C, Hannich JT, Mayor-Ruiz C, Superti-Furga G, Sievers S, Forrester A, Laraia L, Waldmann H, Winter GE. Orpinolide disrupts a leukemic dependency on cholesterol transport by inhibiting OSBP. Nat Chem Biol. 2024 Jun 21. doi: 10.1038/s41589-024-01614-4. Epub ahead of print. PMID: 38907113. 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓