FLAP

关注并星标CPHI制药在线          脂氧合酶是一类非血红素含铁双加氧酶，存在于动、植物的组织和细胞中，可催化花生四烯（AA）、二十二碳六烯酸和各种多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的氧化反应。脂氧合酶主要分为1、3、5、8、12、15-脂氧合酶6种亚型。其中5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)是脂氧合酶同工酶中最常见的、研究较为深入的非血红素铁蛋白氧化代谢酶，是许多高活性氧化脂质生物合成中的关键酶。5-LOX作用于AA氧化通过两步完成：第一步使5-LOX氧化成5-羟过氧化二十碳四烯酸（5-HPETE）再转化为5-羟基二十碳四烯酸（5-HETE）。第二步催化5-HPETE生成白三烯A4(leukotriene A4，LTA 4 )。LTA 4既可转化为致炎物白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)，也可生成白三烯C4(leukotriene C4，LTC4)进而生成白三烯D4(leukotriene D4，LTD4)、白三烯E4(leukotrieneE4，LTE4)等导致过敏反应的反应物质。白三烯物质（LT）是哮喘、慢性阻塞性肺疾病、炎症性肠病、关节炎、动脉粥样硬化、皮炎和癌症等多种慢性炎症性疾病相关的促炎性脂质介质，通过进一步的双加氧作用和对外源化学物的协同氧化作用，在炎症、哮喘、脑缺血、部分恶性肿瘤及阿尔茨海默症等疾病的发生和发展中具有极其重要的作用。5-LOX抑制剂通过阻断LT的产生，抑制AA转变为LT，从而减少炎症的产生。因此，开发有效的5-LOX抑制剂对治疗上述疾病至关重要。       根据抑制剂的作用机制可将5-LOX抑制剂分为直接抑制剂和间接抑制剂。       直接抑制剂       直接抑制剂主要针对5-LOX分子结构特点进行研发，比如干扰5-LOX C-端催化结构域中Fe2+与Fe3+正常的转换，或者是与铁离子络合来抑制5-LOX的活性。直接抑制剂包括氧化还原抑制剂、非氧化还原抑制剂、铁离子配体抑制剂。间接抑制剂主要是围绕FLAP进行设计，在5-LOX途径中需要FLAP的参与，抑制了FLAP 就能阻断 5-LOX 途径。       1、氧化还原抑制剂       氧化还原抑制剂一般是亲脂性的小分子芳香族化合物，例如酚类化合物和醌类化合物。1,4-苯醌AA-861是第一批氧化还原型5-LOX抑制剂，经多项研究证实其在体内可产生抗炎作用，并已经通过了预防季节性过敏性鼻炎的临床试验。苯醌衍生物在人类单核细胞、中性粒细胞和整个人类血液中可作为5-LOX的有效活性抑制剂，对两种LT相关炎症标准化动物模型的实验研究表明，新型1,4-苯醌RF-Id能够通过抑制LT的产生，在体内抑制导致抗炎反应的5-LOX。此外，氧化还原抑制剂还包括去甲二氢愈创木酸 (NDGA)、香豆素、黄酮类化合物等几类物质，它们均在体外实验证实具有高效的5-LOX 抑制作用。氧化还原抑制剂能把Fe3+还原为Fe2+，从而干扰了铁离子的正常催化循环，阻止5-LOX 的激活，导致5-LOX途径不能正常进行。此外，黄酮类的某些化合物，例如槲皮素、芦丁由于B环上具有邻位的酚羟基，他们还能与Fe3+络合，从而加大了对 5-LOX 的抑制作用。另外，研究人员用荧光法测定了氧化还原抑制剂的氧化还原电势，并揭示了氧化还原抑制剂的作用机制，当氧化还原抑制剂存在时，它降低了Fe2+与Fe3+之间的转换，抑制了酶催化反应，从而需要更多的脂质过氧化物去氧化Fe2+转变成 Fe3+，因此，在酶催化反应过程中，真正参与催化反应的脂质过氧化物的量是很少的，酶催化反应即被抑制。       2、非氧化还原抑制剂       非氧化还原抑制剂属于竞争型抑制剂，它能与底物AA竞争结合到5-LOX 的活性中心， 导致5-LOX途径受阻，相对于其他抑制剂具有更高的选择性，但是磷酸化作用和Ca2+会干扰这些抑制剂。ZD2138 和ZM230487属于非氧化还原抑制剂中的两个代表。它们属于甲氧基四氢吡喃衍生物，临床研究表明，ZD2138 能够有效抑制关节炎和哮喘病。实验研究表明，一些天然产物和ZD2138 的杂交体 L-697198，以及通过对L-697198结构进行优化而得到的L-708780和L-739010，表现出良好的生物利用度。但后续动物实验发现，该种抑制剂有多种毒 性，限制了它的临床使用。此外，L-739,010、CJ-13,610和PF-419183也是非氧化还原型5-LOX抑制剂，在细胞测定中显示IC50的低纳摩尔范围。L-739,010可以减少LT介导的炎症反应，且其抗痛觉亢进活性与炎症大脑中LT水平降低有关，在急性卡拉胶模型和慢性炎症模型中表现出优异的药效和药代动力学，但难以形成共价蛋白结合代谢物。CJ-13,610在大鼠内侧半月板横切面模型上对骨关节炎疼痛有抑制作用，口服CJ-13,610可逆转该动物模型的两种疼痛模式，包括触觉异位痛和负重差异。通过大鼠气囊模型证明了PF-4191834对LTB4产生的抑制作用，PF-4191834也完成了哮喘的Ⅱ期临床试验，但其用于膝骨关节炎的Ⅱ期临床试验因出现晕厥、急性肝炎和胃溃疡出血等严重不良事件而被终止。       3、铁离子配体抑制剂       铁离子配体抑制剂大体包括两种，异羟基肟酸类和羟基脲类，羟肟酸衍生物BWA4C和羟基脲衍生物Zileuton是有效的口服5-LOX抑制剂。BWA4C是溃疡性结肠炎患结肠组织中LTB4合成的有效选择性抑制剂，以BWA4C为代表的乙酰异羟肟酸5-脂氧合酶抑制剂有助于评价LTB4在溃疡性结肠炎中的临床意义，并为该病的治疗提供新的途径。Zileuton使急性和慢性气道功能得到了改善，也减少了β受体激动剂或糖皮质激素的需求，并在美国被批准用于治疗哮喘，但是对于变应性鼻炎、类风湿关节炎和炎症性肠病的治疗潜力较低，并且它有许多缺点，如肝毒 性和不良药代动力学特征等。以Zileuton结构为基础设计出了一种新型抑制剂VIA-2291，可以在支气管痉挛动物模型中表现出比Zileuton高5倍的效力，口服半衰期16 h，对哮喘患者的运动性支气管收缩有一定的疗效。VIA-2291已成功完成动脉粥样硬化和心血管疾病的Ⅱ期临床试验，成为临床开发中领先的5-LOX抑制剂之一。RBX-7796是一种具有十二烷基链的尿素衍生物，可抑制大鼠血液中LTB4的体外合成，并对各种炎症和支气管收缩动物模型有活性。       间接抑制剂       间接抑制剂不直接抑制5-LOX的活性。FLAP是5-LOX 激活蛋白，它能结合底物 AA 并且把它转移给5-LOX。在细胞中，5-LOX 与 FLAP 是共同表达的。当给予足够的底物 AA，如果缺少FLAP，细胞也不能合成白三烯等物质。MK886 是研发出来的第一代间接抑制剂，同时也是第一个用于临床的间接抑制剂。它能与AA竞争FLAP 上的结合位点，导致5-LOX 无法与FLAP 相互结合，5-LOX 途径因此受阻。此外，抑制剂AM803正在进行临床实验，并已经完成了对哮喘病人的二期阶段试验，它的衍生物AM103也成功通过了一期临床实验。不过研发的某些抑制剂也存在问题，如NGDA和MK0591 等也存在两方面的缺陷，一是不能特异性针对5-LOX，对人体正常的代谢也有一定的干扰，从而限制了临床应用；二是稳定性不够，直接影响抑制剂的抑制效力。       参考资料       [1]李丹凤,范涛,鹿欣雨.5-脂氧合酶抑制剂的研究进展[J].生命的化学,2023,43(05):666-673.       [2]黄凯,蒋世云,陈柳军.5-脂氧合酶及其抑制剂[J].中国生物化学与分子生物学报,2014,30(12):1190-1196.       作者简介：小泥沙，食品科技工作者，食品科学硕士，现就职于国内某大型药物研发公司，从事营养食品的开发与研究。       智药研习社近期课程报名来源：CPHI制药在线声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文，进入智药研习社~

「产品未动，专利先行」是大部分新药研发活动中的通用专利布局策略，因此对目标机构的专利进行及时、科学的监测与分析，有助于有效地把握其最新的研发策略与动向。初步检索发现，罗氏及其关联公司（Genetech 与 Chugai）近年的肿瘤相关专利（CPC 或 IPC 中含有 A61P31）申请量领先于大部分 MNC。由于 PCT 途径是大部分申请人进行国际申请的首选途径，而且大部分 PCT 申请的公开日均早于其同族专利申请，故本文以 2023 年公开的罗氏及其关联公司申请的肿瘤相关 PCT 专利为线索，简要分析这家 MNC 的最新研发动态与方向。小分子化合物写在前面：文中列出的示例化合物结构中，对于各专利大部分示例化合物所共有的部分以红色标识，共有部分中仍然可变的原子则以蓝色标识。   基础化合物专利1、TEAD 抑制剂WO2023097195 公开了一系列以化合物 1.1.1-1 为代表的 1H-吲唑、吡唑并嘧啶、吡唑并吡嗪等稠合吡唑类 TEAD1~4 抑制剂，所述抑制剂对 TEAD1~4 中的任意一种的 IC50 值可在 nM 水平或更低。WO2023097194 公开了一系列以化合物 1.1.1-2 为代表的双环类 TEAD1~4 抑制剂，其中 A 环可以是其他六元芳杂环，B 环在环原子数量、类别与环不饱和度均有一定的可变性。所述抑制剂对 TEAD1~4 中的任意一种的 IC50 值可在 nM 水平或更低。化合物 1.1.1-1（左）和化合物 1.1.1-2（右）2、BRM 降解剂WO2023096987 与 WO2023097031 公开了一系列以化合物 1.1.2-1 为代表的苯酚类 BRM 降解剂，除了苯酚以外的其他环类别均有一定的可变性。各降解剂对 BRM 的 DC50 最低可达<2.5nM。化合物 1.1.2-1WO2023018648 亦公开了一系列苯酚类 BRM 降解剂（以化合物 1.1.2-2）为代表，其化合物体积小于前两篇专利。各降解剂对 BRM 的 DC50 值最低可达<10nM。化合物 1.1.2-23、NLRP3 抑制剂WO2023088856 公开了一系列以化合物 1.1.3-1 为代表的杂环类 NLRP3 抑制剂，制备例中的化合物结构除了 A 环以外的其他环均有一定的可变性。各抑制剂对 NLRP3 的 IC50（THP-1 pyroptosis Assay）最低可达 nM 级别。化合物 1.1.3-1WO2023004257 公开了一系列以化合物 1.1.3-2 所示的磺酰亚胺类 NLRP3 抑制剂，各稠环系均有一定的可变性。各抑制剂对 NLRP3 的 IC50 值最低可达 10-1nM 水平。化合物 1.1.3-24、CBL-B 抑制剂WO2023081853 公开了一系列以化合物 1.1.4 为代表的内酰类 CBL-B 抑制剂，其中与内酰胺环稠合的苯环还可以是吡啶环。各抑制剂对 CBL-B 的 IC50 最低可达 nM 水平，且显著低于对 C-CBL 的 IC50 值。 化合物 1.1.45、CDK2 抑制剂WO2023060057 公开了一系列以化合物 1.1.5 为代表的氨基甲酸酯类 CDK2 抑制剂，各抑制剂均含有结构中的环戊烷基吡唑胺模块，且对 CDK2 的酶 Ki 最低可达<0.1nM，并大部分低于对 CDK1 及 4 的 Ki。 化合物 1.1.56、磷酸果糖激酶 1 肝型抑制剂WO2023287793 公开了一系列以化合物 1.1.6 为代表的 4 H,10 H-苯并 [f] 吡唑并 [5,1-c][1,4] 氧杂氮卓类磷酸果糖激酶 1 肝型抑制剂，各抑制剂对该酶的 IC50 值最低可达 nM 水平。 化合物 1.1.67、KRAS G12C 抑制剂WO2023025832 公开了一系列以化合物 1.1.7 为代表的大环类 KRAS G12C 抑制剂。化合物 1.1.5 结构中的环内六氢哒嗪羧酸酯、吲哚及与之相连的吡啶构成各示例化合物的共有部分。所述抑制剂对 KRAS G12C 的 IC50 最低可达<0.6nM（细胞分析），且大部分低于 G12D 与 G12V 的 IC50 值。 化合物 1.1.7   外周专利生物大分子   基础专利   外周专利总 结2023 年上半年，WIPO 共公开了 38 件罗氏或其关联公司申请的 PCT 专利，其中生物大分子专利数量略多于小分子化合物类专利。小分子化合物类专利中的基础化合物专利涉及 TEAD 抑制剂（N=2）、BRM 降解剂（N=3）、NLRP3 抑制剂（N=2）、CBL-B 抑制剂（N=1）、CDK2 抑制剂（N=1）、磷酸果糖激酶 1 肝型抑制剂（N=1）、KRAS G12C 抑制剂（N=1），大部分作用机制类别均未披露于罗氏最新公示的 Pipeline 信息中。小分子化合物类专利中的外周专利涉及 BRAF 抑制剂、阿来替尼与 MEK 抑制剂，其中，阿来替尼已获 FDA 批准，根据专利布局的一般原则，罗氏很可能外周专利所涉及的 BRAF 与 MEK 抑制剂进行了进一步的开发。生物大分子类专利中的基础专利涉及的靶点 IL-18、CD3/FLAP、IL-1、IL-7/PD-1、CCR8 与 LTBR，包括了一定数量的双抗专利。而外周专利所涉及的靶点则更多，包括：TIGIT、PD-1/ LAG3、CD20/CD3、TYRP1/CD3、TYRP1、HLA-A2/WT1 X CD3、4-1BB (CD137)、CD38、DLL3、CLDN6、CD25、CD79b。生物大分子类外周专利大部分为新适应证和/或新给药方案（尤其是联合用药）专利，这一新适应证与联合用药在新药开发中的地位相一致。值得一提的是，中国专利法将疾病的诊断与治疗方法排除在了专利保护客体之外，因此上述外周专利需改成制药用途专利方可在中国获得授权。题图来源：企业 Logo免责声明：本文仅作信息分享，不代表 Insight 立场和观点，也不作治疗方案推荐和介绍。如有需求，请咨询和联系正规医疗机构。编辑：加一PR 稿对接：微信 insightxb投稿：微信 insightxb；邮箱 insight@dxy.cn点击卡片进入 Insight 小程序国内审评进度、全球新药开发…随时随地查！多样化功能、可溯源数据……Insight 数据库网页版等你体验点击阅读原文，立刻解锁！

本文转载自“小桔灯网”自2012年CRISPR-Cas9技术问世以来，基因编辑便驶入了快车道，取得了一系列新突破。如果将CRISPR-Cas9比作能够破坏目标基因的分子剪刀，那么base editor（碱基编辑器）可以称为分子铅笔，因其能对单个核苷酸进行替换。2019年开发的prime editor则具有更强大的功能，能够对基因组进行搜索和替换，堪称分子世界的“文字处理器”。开发这些技术的最终目标是修复人类基因中的有害突变。16,000多个小的缺失变异与人类疾病存在因果关系，理论上可以通过插入缺失的序列来修复。囊性纤维化就是一个很好的例子，70%的病例由三核苷酸缺失而引起。为了实现临床应用，人们需要一种技术来准确、高效且安全地插入序列，避免出现意外的结果。prime editing系统虽然在治疗囊性纤维化等遗传病上表现出巨大潜力，但目前仍不清楚哪些因素决定了编辑效率。英国Wellcome Sanger研究院和爱沙尼亚塔尔图大学的研究人员近日在Nature Biotechnology杂志上发文称，他们开发出一种新工具，可预测将基因编辑的DNA序列成功插入基因组的几率。影响插入效率的多个因素 在这项研究中，研究人员试图系统评估插入序列的长度和组成、细胞系、目标位点以及prime editor的不同版本如何影响插入效率。为此，他们共设计了3,604条pegRNA，编码切口位点上游的插入物，这些插入物的长度从1nt到69nt不等，且GC含量不同。他们将序列插入两个细胞系（HEK293T和HAP1细胞）中，靶向四个目标位点（HEK3、EMX1、FANCF和CLYBL）。一周后，他们对这些细胞进行基因组测序，观察编辑是否成功。评估插入效率的整体策略详见图1。图1 prime插入效率的高通量测定由于插入率的变化跨越了三个数量级，于是研究人员试图了解相关的特征，首先是插入物的长度。他们在HEK293T细胞中发现了两个特点：3和4nt序列的插入率高于其他序列；15-21nt序列的插入率高于周围的序列。不过在HAP1细胞中，1-4 nt短序列的插入率并没有高于较长序列。他们将其归因于错配修复（MMR）系统，因为HEK293T细胞在MMR上存在部分缺陷。敲除错配修复基因MLH1的HAP1细胞也证明了这一点，表明MMR系统阻碍了短序列的插入。之后，他们分析了prime editing的不同步骤如何影响序列的插入率。他们发现，若pegRNA中带有四个或更多的连续腺嘌呤，则插入率会大大下降。此外，prime editing中的另一个重要步骤是带有5’ flap（包含野生型序列）和3’ flap（包含插入物）的中间产物之间达到平衡，而5’ flap核酸酶FEN1及3’ flap核酸酶TREX1和TREX2介导了这种平衡。他们发现，3’ flap核酸酶TREX1和TREX2抑制了较长序列的插入。同时，插入序列的核苷酸组成和二级结构也会影响插入率。研究人员发现，prime editing系统对胞嘧啶有着明显的偏好。插入序列中每增加1%的胞嘧啶，则插入率平均增加2.2%。相反，腺嘌呤和胸腺嘧啶的百分比则降低了各个位点的插入率。此外，他们还发现，结构强度更高的序列能够被更有效地插入。在此过程中，他们使用了Twist Bioscience提供的寡核苷酸池。据Twist介绍，他们独特的硅基DNA合成平台能够在单次运行中生成超过一百万条寡核苷酸，对数量几乎没有限制，而且寡核苷酸池精准均一，让人们对实验结果充满信心。此外，实验中使用的多个载体和基因片段也是由Twist Bioscience提供的。预测不同序列的插入率 在了解影响插入率的多个因素后，研究人员接下来想预测不同序列在同一位点的插入效率。他们采用了机器学习的方法，挑选出10个特征来训练数据，包括插入序列的长度、组成、pegRNA二级结构和MMR等。这种称为MinsePIE的方法能够很好地预测测试数据的插入效率，相关性达到0.68（图2）。在现有数据上进行训练后，他们在新数据上测试MinsePIE模型，发现它能够准确预测多个插入序列的成功率。之后，他们还对预测的序列进行实验测试。与预测插入率较低的变体相比，预测插入率较高的密码子变体确实表现出较高的插入率，这凸显了MinsePIE模型在密码子优化方面的优势。研究人员认为，这种计算模型可以帮助人们选择出最有效的序列写入基因组中。图2 预测prime插入效率最后，对于如何提高prime editing系统的插入效率，研究人员提出了几点建议。他们建议选择胞嘧啶含量高且容易形成二级结构的序列。对于使用U6启动子的pegRNA，尽量避免腺嘌呤的插入。对于小于14nt的序列，暂时抑制MMR或敲除MLH1将极大提高插入效率。总的来说，这项工作增加了人们对短序列插入效率的理解，有望实现复杂的基因组工程和纠正各种致病突变。责编|文竞择校对|文竞择End参考资料：[1]Koeppel, J., Weller, J., Peets, E.M. et al. Prediction of prime editing insertion efficiencies using sequence features and DNA repair determinants. Nat Biotechnol (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-023-01678-y  往期精选 围观历史性突破！不需卵子和精子就可以合成人类胚胎 热文 富豪用儿子血浆“回春”科学吗？Science：血液牛磺酸缺乏驱动衰老 热文 世界首例！35岁的她，通过机器人操刀移植的子宫，成功诞下宝宝 热文‍为了避免心脏骤停，53岁的他成为“第一个”植入开创性除颤器的心脏病患者 热文 首次披露！175家生物制药公司的薪资数据：薪资中位数达20万美元 点击“阅读原文”，了解更多~