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感谢关注转发，欢迎学术交流 回复药渡Cyber，领取文献原文 请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程 快看版 炎症性肠病（IBD）的特点是免疫反应异常，包括胃肠道（GI）中促炎细胞因子升高，例如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）。本研究介绍了2,4,5-三甲基吡啶-3-醇类似物的合成和抗炎活性评估，该类化合物对TNF-α和IL-6诱导的炎症具有双重抑制作用。基于3D形状的靶点识别、建模和对接，确定了化合物6-26是G蛋白偶联雌激素受体1（GPER）最有效类似物，该类似物在改善炎症和恢复结肠粘膜完整性方面表现出显著功效。SPR测定结果进一步验证了这一点，该结果显示与GPER直接结合，并且发现GPER敲低消除了化合物6-26对TNF-α和IL-6作用的抑制作用。值得注意的是，化合物6-26无细胞毒性，与G1和G15（分别是众所周知的GPER激动剂和拮抗剂）不同，G1和G15分别诱导独立于GPER的坏死性凋亡。这些发现表明GPER选择性化合物6-26有希望作为IBD的候选治疗药物。 药渡CyberSAR系统在本研究中发挥了关键作用，提供了对GPER1靶点分子的深入解析。系统通过聚类结构视图和原始结构视图，展示了与靶点相关的活性分子，并以研发阶段时光轴的形式呈现了潜力Hit。此外，CyberSAR还提供了适应症和试验设计的可视化分析，帮助研发人员快速获取靶向结构信息，开拓研究思路。尽管CyberSAR在分子的初步开发中未被使用，但其在解析和优化药物分子方面显示出巨大的应用潜力。 图1.化合物6-26发现和分子优化过程 正文版 炎症性肠病（IBD）是胃肠道的慢性复发性炎症。根据病理特征，它大致分为两种主要类型：克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。IBD的确切病因尚不清楚，认为是多因素造成的。然而，固有免疫和适应性免疫的缺陷性免疫功能是IBD发病的主要因素。尽管不同类型的T细胞参与CD（Th1/Th17相关）和UC（Th2相关），是IBD中引发白细胞浸润和随后肠道损伤的关键因素，异常高水平的促炎细胞因子，尤其是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）。TNF-α和IL-6引起的肠上皮炎症反应具有与复发性炎症和上皮损伤相关的共同信号通路。该通路涉及NF-κB和STAT3的激活，诱导各种炎症相关基因表达，包括TNF-α和IL-6。用抗TNF-α抗体药物的靶向治疗策略已被证明对治疗IBD非常有效。这些成功的开发继续延伸到IL-6抑制剂，例如抗IL-6受体抗体（Sarilumab、Tocilizumab）和抗IL-6抗体（司妥昔单抗）。然而，一些IBD患者在最初或最初有反应后（初次和继发性无反应患者）对这些药物没有反应。此外，这些昂贵的抗体疗法可能导致不良反应，包括严重感染、免疫抑制和淋巴瘤。 越来越多的证据表明，雌激素受体有助于IBD的发病机制，与它们在其他慢性炎症性疾病（如关节炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮和结肠炎）中的作用类似。流行病学研究表明，与非HRT使用者相比，绝经后激素替代疗法（HRT）可减少IBD患者发生慢性复发性炎症活性。雌激素受体α（ERα）和β（ERβ）在IBD中发挥重要作用。IBD结肠中高表达的ERβ减少，导致其抗炎作用丧失，这是通过自噬促进和P2X7R下调介导的。此外，雌激素的抗炎作用还通过G蛋白偶联雌激素受体1（GPER，也称为GPR30）（快速调节的膜结合受体）介导信号分子。GPER的抗炎作用已在研究中得到证实，其中小鼠中的GPER敲除导致血浆炎症细胞因子水平增加，对化学诱导的IBD小鼠用GPER激动剂G1可改善结肠炎。GPER已被广泛应用在许多细胞中表达，包括免疫细胞、大脑、心脏、肾脏和肠道。根据细胞类型，GPER通过不同的G蛋白发出信号，包括Gαs、Gαi、Gαq/11和Gβγ蛋白。除了cAMP和ERK的激活外，GPER信号还与其他信号分子相互作用，例如JAK/STAT3、YAP/TAZ、CREB、Elk1和NF-κB。NF-κB参与多种促炎细胞因子的基因表达，包括TNF-α和IL6，进而通过受体信号转导诱导磷酸化STAT3的核转位。对NF-κB和STAT3敲除或过度表达的细胞进行的研究也支持TNF-α或IL-6诱导NF-κB和STAT3的核转位。NF-κB 和STAT3彼此独立。总而言之，越来越多的证据表明，激活GPER可抑制TNF-α和IL-6信号传导，这对于难治性IBD患者来说是一种有效的治疗策略。 此前，采用基于表型的药物发现策略，在体外IBD模型中报道了6-烷基酰胺-2,4,5-三甲基吡啶-3-醇作为双重抑制剂，可对抗TNF-α和IL-6诱导的炎症活性。苯乙基类似物（6-29），连接到6-酰胺基的苄基和环己基侧链表现出高活性，可能是由于这些侧链提供了一定程度的平坦性。在本研究中，为了更好的双重抑制，扩大了侧链的范围以增加其平坦度并将其直接连接到酰胺基官能团上。在IBD药物发现的背景下，针对单个分子可能无法完全解决该疾病的多方面发病机制。为了克服这个问题，作者建立了基于细胞的筛选系统。该系统模拟由炎症细胞（如单核细胞和巨噬细胞）持续流入引起的结肠组织损伤，这些细胞被TNF-α或IL-6（IBD中主要的促炎细胞因子）激活。化合物对细胞因子诱导的单核U937巨噬细胞（TPA处理的U937细胞）-上皮细胞（HT-29）粘附的抑制活性通过测量附着细胞发出的荧光信号来确定。然后，使用CADD（例如基于3D形状的对齐、建模和对接）将GPER识别为有希望的分子靶标。通过SPR测定和一系列细胞功能分析，验证了该化合物与GPER的直接结合。 结构-活动构效关系研究 化合物（6-01~6-28）对TPA处理的单核U937细胞（U937巨噬细胞）与结肠上皮样HT-29细胞粘附的抑制活性在表1中以％抑制表示。黏附由TNF-α和IL-6诱导。一般来说，针对TNF-α诱导的粘附系统的活性与针对IL-6诱导的系统的活性高度相关。 在TNF-α诱导的测定中，在6-01的苯环（Ar=Ph）的邻位和对位引入甲基使活性增加2.5倍和3.5倍（分别为6-02和6-03），但在IL-6诱导的系统中则不然。而大的叔丁基取代基并没有增强活性（6-04）。苯环引入邻位F和间位F取代基使TNF-α诱导的粘附活性增加两倍和三倍（分别为6-05和6-06），而对位F取代该活性丧失。当氟和甲基取代基（6-08和6-09）活性增加。具有氟化物取代基的类似物（6-05~6-09）显示TNF-α诱导系统和IL-6诱导系统之间存在相当大的相关性。与邻-F相反，邻-Cl降低了活性，而邻位、对位双取代增加了活性（分别为6-10和6-11）。给电子甲氧基提供低活性，除非位于邻位（6-12 vs 6-13和 6-14）。在五元芳环中，含噻吩类似物的活性高度依赖于结构化学（6-17 vs 6-20），而呋喃则不依赖于结构化学（6-18 vs 6-21）。异恶唑表现出非常高的活性（6-22），而苯基取代基的引入降低了活性（6-23）。相反，呋喃环上的类似取代保持了非常高的活性（6-18vs 6-19）。联芳基的作用似乎相当复杂（6-19和6-23），这引发了对双环的探索。萘基团普遍表现出较高的活性（6-15和6-16）。未取代的3-氯苯并[b]噻吩的活性可忽略不计（6-24和6-25）。然而，6位的额外取代产生了广泛的活性。最强的吸电子氟在TNF-α和IL-6诱导的测定中产生最好的活性（6-26），分别达到90.3%和79.2%。IC50值揭示了有趣的结果。化合物6-26的IC50值分别为0.23μM（TNF-α诱导测定）和0.35μM（IL-6诱导测定），而对照药物托法替布的IC50值分别为0.70μM和0.48μM。与另一种对照药物美沙拉嗪进行比较，发现了更显著的差异。临床实践中，美沙拉嗪通常用于治疗以轻至中度疾病活动为特征的UC。每天服用4g剂量，美沙拉嗪对肠上皮细胞发挥局部作用，主要是局部作用而不是全身吸收。化合物6-26所产生的IC50比美沙拉嗪高出几乎六个数量级。从F>Cl>Me（6-26、6-27、6-28），吸电子性降低，活性降低。还比较了最好的类似物（6-26）。与化合物6-29，6-烷基酰胺类似物我们之前报道为针对TNF-α和IL-6的最佳双抑制剂。在TNFα和IL-6诱导的测定中，化合物6-26的抑制活性均优于化合物6-29。 表1中的化合物显示，对TNF-α诱导的粘附的抑制活性与对IL-6诱导的粘附的抑制活性之间存在正相关性（图2A）。包括所有化合物的简单线性回归表明，x的1单位增加（对TNF-α诱导的粘附的抑制百分比）平均与y值增加0.76（IL-6诱导粘附的抑制百分比）（P<0.0001）。在亚组分析中，活性较高的化合物（对TNF-α诱导的抑制活性大于40%）表明两个变量之间的相关性较强。x的A1单位增加平均与y值增加0.98相关（图2C，P<0.0001，R2=0.9618）。在另一组活性较低的化合物中（TNF-α诱导的粘附抑制活性≤40%），虽然x和y之间的关系具有统计学意义（β=1.48，P=0.01），但回归模型的解释力相当弱（R2=0.4670），表明两个变量之间的相关性较弱（图2B）。 化合物6-26的体内药效 6-26在IBD大鼠和小鼠模型中改善结肠炎。测量了最佳双抑制剂6-26在IBD动物模型中的体内疗效。在2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的大鼠结肠炎模型中，口服6-26（1mg/kg）显著逆转了TNBS诱导的体重下降以及结肠组织重量/长度的增加（3A）。6-26（1mg/kg）的恢复效果强于较高剂量的柳氮磺胺吡啶（300mg/kg），柳氮磺胺吡啶是一种抑制NF-κB的IBD药物，但药效非常弱。TNBS诱导的髓过氧化物酶（MPO）水平（图3B），中性粒细胞浸润的指标，和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）水平（图3C）在结肠组织中通过口服给药6-26得到显著抑制，优于300倍高剂量的柳氮磺胺吡啶（SSZ）。同样，TNBS诱导的结肠组织中炎性细胞因子、TNFα、IL-6、IL-1β和ICAM-1的表达显著减少了6-26。相反，TNBS诱导的E-钙粘蛋白（稳定上皮连接的分子）表达的减少又恢复了6-26（图3D）。 此外，还研究了化合物6-26非慢性和复发性IBD模型的剂量依赖性改善活性，对小鼠使用两个周期的葡聚糖硫酸钠（DSS）治疗6天，随后14天给水。每天口服化合物6-26，持续5周，每周6天，显著阻断DSS引起的体重下降（图4A）和结肠炎症、出血性损伤和长度缩短（图4B）。化合物6-26的体重（图4A、D）和结肠重量（图4C、D）的恢复是剂量依赖性的，并且比使用托法替布（30mg/kg）和SSZ（300mg/kg）一致。化合物6-26以剂量依赖性方式抑制DSS诱导的结肠MPO水平，其效果强于托法替布和SSZ（图4E）。 化合物6-26对DSS引起的结肠粘膜损伤的功能性愈合作用 通过评估肠渗透性的变化来进一步评估化合物6-26在IBD模型中的剂量依赖性粘膜愈合效果。肠粘膜渗透性是肠屏障功能的一个关键方面，对于保护身体免受病原体和毒素的侵袭以及促进营养吸收至关重要。DSS诱导的肠道炎症会破坏紧密连接相关蛋白的表达，损害上皮屏障的完整性，这是在人类 IBD中观察到的一个标志。这种最初的破坏随后会加剧症状，包括通透性增加、出血和死亡。在评估化合物6-26治疗效果的急性结肠炎模型中（图5A），DSS诱导的结肠炎以糜烂、溃疡、隐窝丢失和苏木精和伊红（H&E）染色组织的组织病理学检查显示明显的中性粒细胞浸润为特征（图5B）。然而，这些病理学改变是严重的。通过化合物6-26依赖性改善（图5B、C）。来自DSS治疗组的血液样本表现出口服给予的异硫氰酸荧光素（FITC）右旋糖酐（4kDa）的水平显着升高（图5D），而在给予化合物6-26后该水平显著降低（图5D）。重要的是，化合物6-26的粘膜愈合效果超过了托法替尼和SSZ治疗组。 体外安全性评估 化合物6-26在10μM浓度下对五种主要的人肝细胞色素P450（CYP）酶（包括CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP2C19和CYP3A4）的抑制作用进行了测试。如表2所示，通过这些主要CYP亚型潜在的药物相互作用，化合物6-26似乎可以忽略不计。此外，浓度为10μM时，6-26对hERG通道表现出非常弱的抑制作用（表2），表明心脏毒性（例如心律失常）的风险较低。 体内急性毒性研究 为了评估化合物6-26的安全性，通过以30和300mg/kg的剂量单次口服给予6-26，对ICR小鼠进行了急性毒性研究。给药后，在14天的过程中，与对照组（载体）相比，实验组中没有观察到体重减轻或不良反应情况，例如异常行为、食物和水摄入以及消化紊乱（图6A）。随后，对小鼠实施安乐死，并收集组织样本进行分析。通过H&Estaining进行的组织病理学检查显示，化合物6-26组没有明显的组织损伤或炎症反应（图 6B、C）。这些发现有力地支持了化合物6-26的良好安全性，值得考虑在药物开发工作中进一步推进。 药代动力学研究 在静脉内（IV，1mg/kg）和口服（PO，1mg/kg和5mg/kg）给药后，在大鼠中评估化合物6-26的药代动力学（PK）曲线。如表3所示，口服6-26（5mg/kg）显示AUC(0-t)为1849±714h·ng/mL，MRT(0-t)为5.0±0.7h，半衰期为3.3±0.4h，血浆中Cmax为760±684ng/mL，静脉注射6-26（1mg/kg）分别为1006±417h·ng/mL、1.2±0.1h、2.0±0.6h和1880ng/mL。5mg/kg口服给药显示生物利用度（F）为36.7%。AUC显示口服给药1和5mg/kg之间存在显著的剂量依赖性。综上所述，表明6-26具有良好的口服给药PK特性。 化合物6-26抑制TNF-α和IL-6诱导的NF-κB和STAT3核转位 研究了化合物6-26的细胞水平作用机制。由于化合物6-26抑制TNF-α和IL-6诱导的细胞反应，继续研究6-26的抑制作用是否与核NF-κB和p-STAT3水平的改变相关，它们是TNFR1信号通路的下游靶点和IL-6受体。虽然已知TNF-α和 IL-6可以增加核NF-κB和p-STAT3，但每种刺激激活这些转录因子的时间顺序仍然未知。本研究首先比较了TNF-α和IL-6在HT-29细胞中诱导NF-κB和p-STAT3核转位的程度。在治疗后TNF-α分别在5min NF-κB和在1h后诱导p-STAT3核转位，而IL-6在5min诱导p-STAT3和30min诱导NF-κB核转位。治疗后1小时，TNF-α和IL-6使核NF-κB增加的倍数分别为7倍和4倍，而TNF-α和IL-6使核p-STAT3增加的倍数几乎相似，均为5倍。这些结果通过免疫染色得到进一步证实。用6-26预处理HT-29细胞显着抑制TNF-α和IL-6诱导的NF-κB和p-STAT3核转位（图7A，B）。在TNF-α和IL-6处理的HT-29细胞中，6-26（1.5μM）对NF-κB和pSTAT3核转位的抑制作用大于美沙拉嗪（20mM）和托法替布（5μM）（图7C，D）。此外，化合物6-26的这种抑制作用超过了先前报道的化合物6-29（图7C、D）。 化合物6-26的靶标识别 目前已经使用相似性分析、机器学习和对接等多种方法来预测小分子的大分子靶点。这些方法是药物发现（包括药物重新定位）的宝贵工具。Kirchmair小组根据3D分子形状与非复杂分子的相似性，应用基于比对的方法来识别结构复杂小分子的靶标。他们证明了这种基于形状的靶标预测方法非常稳健且成功。受这项工作的启发，作者采用ROCS，一种领先的基于形状的分子比对软件查询分子与生物活性化合物进行匹配。IUPHAR/BPS药理学指南提供了专家驱动的药物靶点及其配体知识库，而ChEMBL提供了具有药物样特性的生物活性分子数据库。因此，作者从IUPHAR/BPS中检索了一系列药物靶点，并从ChEMBL中提取了每个靶点的生物活性分子的数据记录。活性和非活性之间的阈值pChEMBL值设置为5.0，对应10μM的IC50，EC50以及其他相关测量指标。通过去除盐和电荷中和来标准化化合物，然后滤除分子量小于250或大于600的分子。如果分子不具有明确的立体化学，则列举立体异构体。最后，使用 OMEGA.62为每个分子生成了多达50个构象异构体，总共活性化合物生成了大约2600万个构象异构体。 随后，使用OMEGA生成了化合物6-26的单一3D构象。然后将化合物6-26的形状和颜色特性与先前生成的活性化合物的构象异构体进行比对。这些命中化合物的靶标包括caspase-3、NPC1、Sentrin特异性蛋白酶、MAOB和COX-1、碳酸酐酶、menin、CCR6、PDE7A、HSP90a、S1PR4、GPER1和S6K-alpha-2。在这些靶标中，与观察到的表型结果最相关的是caspase-3、MAOB、COX-1和GPER1（表4）。随后进行了实验来评估6-26是否抑制MAOB和COX-1，但它们没有表现出抑制作用。命中化合物CHEMBL3233622得分最高，为1.575，具有caspase-3抑制活性，IC50为38.15nM。CHEMBL3233622属于1,2-苯并异噻唑-3-酮衍生物类，其中酮基的存在对于caspase-3的结合至关重要。6-26苯并噻吩环中缺乏酮基；因此，预计caspase-3活性不会很强。最后，6-26还具有与GPER激动剂CHEMBL4204670的高比对得分（Tanimoto组合得分＝1.411），其具有480nM的EC50值。使用ROCS计算的6-26和CHEMBL4204670的3D比对如图8A所示，显示了6-26的苯并噻吩环和CHEMBL4204670的吲哚环之间的大致对应关系。这些化合物之间的重叠可以进一步区分为形状和颜色成分（图8B），表明形状成分的贡献大于颜色的贡献。 化合物6-26与GPER对接实验 研究了6-26是否可以通过蛋白质-配体对接与GPER结合。从 AlphaFold蛋白质结构数据库中获得了由AlphaFold（AF-Q99527-F1-model_v4）生成的人类GPER 3D模型。利用CAVIAR来识别结合位点，并设置结合盒来包围该空腔。使用Flare6.0将6-26对接到该结合腔中。最佳结合姿势的ΔG为-9.9kcal/mol，表明6-26与GPER具有很强的结合相互作用。在图9所示的结合姿势中，主要相互作用似乎是Phe208和苯并噻吩之间的π−π相互作用。这种结合姿势与Arnatt小组提出的结合姿势一致。 化合物6-26直接结合在GPER 针对6-26的分子靶标，利用SPR研究了6-26与人GPER蛋白的直接结合。描述结合动力学的传感图如图10所示。数据分析显示6-26对GPER具有结合亲和力，KD值为2.37×10−8M。SPR数据的可靠性经过Chi2和U值。在实验中，获得了令人满意的Chi2（