CLEC7A

导读：随着对适应性免疫在细胞和分子水平上的认识，靶向免疫细胞的抗原因其可能提高疫苗效力和/或调节免疫反应质量，同时减少脱靶效应，被证明是开发创新、强效疫苗的成功策略。随着mRNA疫苗的发展，近几年已经探索了几种将包裹mRNA的纳米颗粒递送系统靶向免疫细胞（树突状细胞DC）的方法，DC是最有效的抗原呈递细胞，也是B细胞和T细胞免疫的关键介质，被认为是细胞特异性抗原递送的理想靶标。那么如何设计mRNA疫苗递送系统以靶向免疫细胞呢？2023年11月，GSK团队在Front Immunol期刊发表综述文章：《Straight to the point: targeted mRNA-delivery to immune cells for improved vaccine design》。文章汇总了mRNA定向递送免疫系统的潜在特异性靶点、靶向受体-配体类别以及递送系统的研究进展。一、免疫细胞靶向由于常规疫苗（抗原、灭活病原体）开发周期长（5-10年），针对新发和再发疾病的疫苗开发难度大，科学家们致力于探索新的疫苗平台，最近，mRNA疫苗在设计和疗效方面有较大突破，其之所以能脱颖而出，与以下特性有关：1、安全性：mRNA的非感染性和非整合性避免感染或插入诱变的潜在风险。2、稳定性：mRNA疫苗可通过纳米载体（如LNPs）实现体内递送，使其免于降解、快速摄取和细胞质递送，避免抗载体免疫。3、高产量：由于体外转录反应的高产量，mRNA疫苗具有经济高效、可扩展生产的潜力。4、可修饰性：可进行快速修饰调节半衰期和免疫原性特征，用于个性化治疗或紧急适应新出现的病原体。但同时mRNA疫苗具有以下不足：1、潜在的脱靶效应：肌肉注射后，会有少部分到达血流，最终主要进入肝脏和脾脏，出现脱靶效应。2、非特异性：mRNA-LNPs的给药会诱导中性粒细胞、单核细胞和DCs快速和局部浸润到给药部位及引流淋巴结（LNs），但主要是单核细胞和DCs翻译mRNA并上调关键的共刺激受体（CD80和CD86）和细胞因子产生。3、针对某些蛋白（如刺突蛋白）的抗体反应持久性较短，需要连续给予加强剂量以保持对感染的保护。mRNA选择性靶向免疫细胞因可增强免疫应答、减少疫苗使用剂量、增加保护时长、最大程度减少脱靶及副作用的特性，成为解决上述问题的关键技术。而抗原呈递细胞（APCs），尤其是DCs，因其通过启动幼稚T细胞来启动适应性免疫的独特能力成为mRNA靶向递送的候选细胞。研究表明，即使在低抗原剂量下，DC靶向也能增强和加速特异性抗体反应。使用与特定细胞表面的受体特异性相互作用的配体可实现靶向，不同受体的参与会影响所诱导免疫反应的类型，从而获得特定的结果。DCs可表达多种靶向递送疫苗的受体，包括C型凝集素受体（CLRs）、Toll样受体、清道夫受体、趋化因子受体、补体受体和Fc受体等。DC靶向不仅可提高mRNA疫苗的功效，还能扩大其作用的病原体范围。除DC亚群，参与免疫反应的其他细胞类型（如巨噬细胞）也可作为靶标。图1. APC靶向LNP-mRNA作用机制二、靶细胞下表从起源、分布、特征/功能等方面对多种抗原呈递细胞（APC）进行比较：每种APC都有优点和局限性：与pDCs相比，cDCs在抗原呈递和T细胞活化方面更有效；与巨噬细胞相比，DCs因其拥有卓越的抗原呈递及从外周组织迁移到淋巴结的能力而具有更强引发抗原特异性免疫反应的能力，使其在进行靶向递送方面更具优势。最终靶向何种APC还取决于要靶向的病原体或抗原的特征，多种APCs（如DCs和巨噬细胞）的组合可引发协同效应并产生更强大和多功能的免疫反应。三、靶受体免疫反应的类型和程度取决于捕获抗原的环境，包括用于内化的受体。因此，靶向递送平台的成功取决于配体-受体对的正确选择。3.1  C型凝集素（CLRs）受体3.1.1 CLRs的通性CLRs是由1,000多种蛋白质组成的超家族，因其在各种免疫细胞（包括DCs、巨噬细胞和中性粒细胞等）表面大量表达，并在识别自身和非自身抗原、内化、抗原加工、启动免疫反应、调节免疫细胞间相互作用中发挥作用，被作为靶向抗原和mRNA递送的靶标：CLRs具有一个保守的结构基序-碳水化合物识别结构域（CRD），通过与保守的钙螯合结合位点的相互作用来识别病原体（病毒、细菌和真菌）相关的碳水化合物结构，促进识别和吞噬作用；CLRs信号转导可分为两组：第一组通过基于整合免疫受体酪氨酸的激活（ITAM）样基序（Clec-2、Dectin-1）转导细胞内信号，或通过与携带ITAM的FcRγ接头分子（Dectin-2、Mincle、BDCA-2）结合转导细胞内信号。磷酸化后，ITAM 基序募集并激活 Syk，Syk通过激活转录因子NF-kB复合体的亚基来诱导促炎细胞因子的转录。第二组CLRs在其胞浆末端具有基于免疫受体酪氨酸的抑制（ITIM）基序（例如 MICL）。3.1.2 甘露糖受体甘露糖受体（CD206， MR）为巨噬细胞和DCs表达的内吞受体，介导甘露糖苷（从简单甘露糖到高级甘露聚糖结构）以及岩藻糖和硫酸化LacdiNAc的可溶性配体的交叉呈递，上述特性使基于甘露糖的靶向成为最常见的CLR靶向策略之一。2006年White等人在体外模型中使用甘露糖基化脂质体来增加单核细胞来源的DCs（moDCs）对OVA的摄取。大量报告表明，基于甘露糖的策略通过受体介导的机制增加了免疫细胞中mRNA疫苗的内化和转染。2011年首次报道了MR靶向癌症疫苗的临床试验，但MR靶向mRNA疫苗的临床活性尚不清楚。3.1.3 其他C型凝集素1、DC-SIGN：钙依赖型，存在于人的DCs和巨噬细胞亚群上，可结合高甘露糖基化糖缀合物和含岩藻糖的抗原，通过促进T细胞粘附到DC表面以查找肽抗原的存在来介导DC-T细胞相互作用。DC-SIGN会诱导细胞内信号转导，从而调节其他病原体识别受体PRRs（如TLRs）的信号转导。2、DEC-205（CD205）：在DCs、单核细胞和LCs上表达，也在B细胞、T细胞和NK细胞上低水平表达，具有识别凋亡和坏死信号、参与内吞作用并增加MHC II呈递的功能。大多数DC205靶向依赖于抗体或抗体片段的使用，从而产生有效的DC靶向和增强的抗原交叉呈递，2011年进行了针对抗HIV DEC-205靶向疫苗的临床试验。3、Dectin-1：由DCs、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和T细胞亚群表达，能特异性识别具有不同亲和力的可溶性和颗粒性β（1-3）和/或β（1-6）连接葡聚糖，通过肌动蛋白依赖性吞噬作用促进颗粒摄取并通过ITAM样基序参与细胞活化，因可以与CD4+和CD8+T细胞结合并促进增殖被认为是一种共刺激分子。4、Langerin（CD207）：由LCs、真皮DCs和其他DCs亚型表达，已成功使用抗体或小分子糖作为靶向配体在体外进行LC靶向，Wamhoff等人发现了一种Langerin拟糖配体，并使用功能化脂质体证明了其对Langerin+细胞的选择性。Schulze等人用这种Langerin配体在体外选择性地将纳米颗粒（脂质体）靶向人LCs，该配体可用于功能化封装药物、抗原或毒素的纳米颗粒以递送至LCs中。5、DNGR-1（Clec9a）和MGL（Clec10a）：DNGR-1/Clec9a在人cDC1上选择性表达。与该受体的特异性相互作用可促进非人灵长类动物的体液免疫，最近研究发现DNGR-1特异性肽可将纳米颗粒靶向Clec9a+ DC。MGL在人cDC2（CD1c+ DCs）上特异性表达，选择性地结合GalNAc末端和具有不同糖基化谱的粘蛋白-1肽。Heger等人发现，使用Clec10a结合糖肽，可以选择性靶向PBMCs中的CD1c+细胞（cDC2），但未观察到单独的Clec10的配体可诱导CD1c+ DCs的激活或细胞因子分泌。6、hDCIR（Clec4a）：存在于外周血中的CD14+单核细胞、CD15+粒细胞、所有DC亚群（包括pDCs）和B细胞上，T细胞中未发现，使用抗体将抗原靶向DCIR可增加LCs、血液mDCs和pDCs的交叉呈递，并增强体外人细胞中CD8+ T细胞触发。3.2 用于mRNA靶向递送的其他受体1、Toll样受体（TLRs）：由先天免疫系统细胞（如巨噬细胞和DCs）、适应性免疫细胞亚群表达，通过识别病原体相关分子模式PAMPs在先天免疫系统中发挥关键作用，研究使用Pam3CSK4（一种TLR-2激动剂）作为靶向配体将纳米颗粒靶向DCs。2、X-C基序趋化因子受体1（XCR1）：可识别XCL1的趋化因子受体，在cDC1上选择性表达。Fossum等人研究Clec9a、DEC-205和XCR-1作为靶标，使用编码与抗原融合的单链可变片段（scVf）的DNA疫苗注射到小鼠体内，发现靶向XCR-1导致脾脏和肺中IFN-γ+CD8+ T细胞反应增强，细胞毒性更强，尽管Clec9a和XCR1都是cDC1特异性的，但导致不同的结果，因此不仅细胞亚型，受体本身也决定了靶向的结果和疗效。表1 免疫细胞靶向案例、靶向策略和结果四、纳米颗粒作为靶向mRNA递送载体将mRNA与载体结合以保护其免于降解并实现胞内递送。目前输送系统简单分为病毒和非病毒载体。病毒载体利用其自然进化的能力将遗传物质有效地转移到细胞中，实现高效率翻译，但其自身的趋向性并不总是满足治疗需求，且诱导的免疫反应可转化为反应原性损害治疗效果。目前纳米颗粒（特别是脂质纳米颗粒LNP）为首选的非病毒载体，提供了定制其特性以优化其作为转染剂性能的可能性。脂质纳米颗粒（LNPs）已从脂质体和脂质复合体进化为更有效的mRNA载体，出现了可电离脂质，其优势在于：1、可电离脂质在酸性pH值下带正电，在生理pH值下带中性电，该特性大大改善了永久性阳离子脂质的固有缺点，如耐受性差和细胞毒性；2、可电离脂质在内体中酸化后，胺基团被质子化并促进氯离子转运以平衡膜电荷和渗透压，直到膜被破坏并将遗传物质递送到胞质溶胶中；3、通过增加可电离脂质疏水尾部的不饱和度以及调整其pKa，可增加内体逃逸，增强疫苗效力；4、可电离脂质能实现高速率mRNA包封，由于生产过程中水相的pH值较低，可电离脂质带正电，从而促进了与带负电荷的mRNA骨架的相互作用。LNPs另一个成分是聚乙二醇化脂质，由亲水性PEG聚合物与疏水脂质偶联而成。聚乙二醇化脂质可阻止调理素结合，增加LNP循环时间并防止颗粒融合。通过改变PEG脂质锚定长度，可调整其从LNP表面的脱落速率，对促进细胞摄取和内体逃逸至关重要。另外LNPs中的磷脂和胆固醇有助于mRNA包封及增强稳定性。对LNPs脂质成分和/或比例进行多种修饰，实现其优先在特定器官中积累的特性，Goswami等人表明，甘露糖化胆固醇可改善抗RSV自扩增mRNA疫苗（SAM）的内化和效力，一些MR靶向siRNA的例子（配体直接连接到siRNA 或siRNA包封颗粒）也被报道。图2 LNP 结构、组成和靶向配体加入策略五、结论靶向先天免疫相关细胞上的特异性受体可以产生针对疫苗量身定制的更强大、更持久的免疫反应，不同先天免疫细胞亚群的联合靶向策略更令人期待，因为它们在免疫反应中起着独特而核心的作用。如巨噬细胞驱动炎症反应，而树突状细胞在抗原呈递给T细胞中起关键作用，若同时靶向两种细胞类型可能有助于启动改善的抗原特异性免疫反应。需要进一步的研究来识别不同细胞类型中潜在的共同关键受体，或配制具有多种靶向配体组合的LNPs。对于开发RNA递送载体，应在载体配方步骤中考虑组分的相容性，以及保持有效的内体逃逸和充分的多价配体展示的必要性。eGFP mRNA和mCherry mRNA在293T细胞中实现高表达参考文献[1] Clemente B, Denis M, Silveira CP, Schiavetti F, Brazzoli M, Stranges D. Straight to the point: targeted mRNA-delivery to immune cells for improved vaccine design. Front Immunol. 2023 Nov 27;14:1294929. doi: 10.3389/fimmu.2023.1294929.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

激活T细胞的免疫疗法不管用怎么办？或许可以试试看激活髓细胞。近期，来自宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的一个研究团队认为：激活髓细胞的两种治疗方法的组合可能有效地治疗抵抗传统免疫疗法的难治性胰腺癌。相关成果发表于《Science Immunology》上。目前这种策略的研究正在动物模型研究和早期人类临床试验中进行。这种治疗方案的核心理念在于，结合两种激活髓样细胞的治疗方法，可能会成功对抗传统T细胞免疫疗法失败的肿瘤。由髓样细胞群受体的双管齐下胰腺导管腺癌（PDAC）作为“癌王”，是一种典型的“冷肿瘤”，是由成纤维细胞、癌症细胞和免疫细胞之间的相互作用产生了具有免疫抑制作用的肿瘤微环境（TME）。最显著的特征之一是缺乏细胞毒性CD8 T细胞的浸润。而该TME中的其他T细胞群都具有促肿瘤作用，包括Th17、Th22、CD4和γδT细胞。这使得T细胞免疫疗法在PDAC中很难起到作用。髓样细胞群是胰腺肿瘤中最大的免疫细胞群，一些髓样细胞如巨噬细胞和树突状细胞会在肿瘤微环境中聚集，极化，从而抑制CD8 T细胞，还有骨髓源性抑制性细胞（MDSCs）被极化后也会抑制细胞毒性CD8 T细胞，因此导致整个环境缺乏CD8 T细胞浸润。而在髓样细胞表达的受体中，模式识别受体dectin-1和TNF受体超家族成员CD40引起了研究人员的关注。早先的研究试图通过CD40激动剂将巨噬细胞重新编程为免疫抑制较低的状态，因为CD40是巨噬细胞等抗原提呈细胞上表达的TNF受体家族成员，当与活化的辅助性T淋巴细胞表面表达的特异性配体CD40L结合时，会触发TNF、ROS和活性氮物质的产生。这些因子可以介导巨噬细胞的杀菌和杀瘤活性，从而影响PDAC的发展。而由于巨噬细胞介导的免疫抑制降低，就会促进CD8 T细胞的浸润，实现从“冷肿瘤”向“热肿瘤”的转化。早先的研究也确实证明，虽然影响有限，CD40激动剂确实增强了PDAC的T细胞浸润。“免疫黄金”的衍生而在该研究中，在CD40激动剂的基础上，研究人员将目光放在了模式识别受体dectin-1上，Dectin-1是一种C型凝集素受体，主要表达于巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞表面，在PDAC肿瘤细胞上也有表达，能够识别真菌细胞壁上的β-葡聚糖。β-葡聚糖是一种天然的免疫调节剂，广泛存在于菌菇，酵母，藻类等植物和真菌中，被称为“免疫黄金”，广泛应用于医药、保健品、食品等领域。早先，宾大的研究人员就试图利用全身性β-葡聚糖治疗来实现训练免疫（trained immunity）这种训练能够改善化疗后的免疫恢复。而在对检查点抑制剂耐药的胰腺癌小鼠模型中，通过全身性β-葡聚糖治疗共激活Dectin-1和CD40，并用激动剂抗体治疗，根除了已形成的肿瘤并诱导了免疫记忆。这种抗肿瘤活性依赖于cDC1s（1型常规树突状细胞）和T细胞，但不需要经典的T细胞介导的细胞毒性或检查点的阻断。总结主要作者Max M. Wattenberg博士和他的同事认为，他们的研究证明了不需要靶向T细胞相关的检查点通路，只需要靶向骨髓细胞活化途径也可以产生针对对常规免疫疗法有抗性的肿瘤的强抗肿瘤免疫反应。目前他们已经有一项PDAC患者接受联合免疫疗法的临床试验正在进行中。参考来源：Max M. Wattenberg et al, Cancer immunotherapy via synergistic coactivation of myeloid receptors CD40 and Dectin-1, Science Immunology (2023). DOI: 10.1126/sciimmunol.adj5097Halbrook CJ, Lyssiotis CA, Pasca di Magliano M, Maitra A. Pancreatic cancer: Advances and challenges. Cell. 2023 Apr 13;186(8):1729-1754. doi: 10.1016/j.cell.2023.02.014. PMID: 37059070; PMCID: PMC10182830.

澳大利亚国立大学（ANU）的一项最新研究表明，免疫系统中的一种抗真菌蛋白质也会加剧部分自身免疫性疾病的严重程度，例如肠易激病（IBS）、1型糖尿病、湿疹和其他慢性疾病。这一发现有望为新的、更有效的药物铺平道路，而且不会产生现有治疗方法带来的一系列副作用。除了帮助治疗严重的自身免疫性疾病外，这一突破还可以帮助治疗所有类型的癌症。该研究于近期发表在《科学进展》上，项目由澳大利亚国立大学、昆士兰大学和Francis Crick研究所合作开展。科学家们发现了DECTIN-1蛋白质此前未被发现的一种功能，它在突变状态下限制了免疫系统中T调节细胞的产生。T细胞对预防自身免疫性疾病至关重要，因为它们会抑制过度活跃的免疫系统所产生的影响，如果调节不当，免疫系统就可能陷入极度危险之中。免疫系统的目的是保护身体免受感染，但在严重的情况下，它会变得过度活跃，并使身体的自然防御能力转向自身。“当这种情况发生时，免疫系统错误地将健康细胞视为威胁，导致其转而攻击自身并促进自身免疫性疾病的发作，”来自澳大利亚国立大学的主要作者Cynthia Turnbull博士说。自身免疫性疾病又可分为系统性和器官特异性两类，系统性自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征等，器官特异性自身免疫性疾病包括慢性自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性溶血性贫血、肝出血肾炎综合征等。“虽然DECTIN-1蛋白有助于对抗真菌感染，但在突变状态下，它也会加剧严重的自身免疫性疾病。”DECTIN-1蛋白质结构的3D打印（图源：Tracey Nearmy/ANU）“了解这种蛋白质的突变版本如何以及为何会导致患者产生自身免疫性疾病，令我们离开发更有效的药物更近了一步，并为澳洲超过100患有自身免疫性疾病的患者带来了新的希望，” Cynthia Turnbull博士表示道。科学家们相信，他们可以通过打开和关闭DECTIN-1蛋白来控制免疫系统，就像电灯开关一样。Francis Crick研究所的Carola Vinuesa教授说：“开启这种蛋白质会降低免疫系统防御反应的强度，这将有助于治疗自身免疫性疾病；另一方面，关闭这种蛋白质可以增强免疫系统，使防御机制超速运转，让身体能够治疗一组完全不同的疾病。”“这些发现令人兴奋，因为目前还没有发现很多如DECTIN-1一样的修饰蛋白，可以改变免疫系统的行为模式，达到引起或预防疾病的程度。”Turnbull博士表示，这意味着DECTIN-1可以在癌症治疗中发挥关键作用。她说：“癌细胞可以通过向体内释放某些蛋白质和化学物质来伪装自己，从而使它们在免疫系统的自然防御中变得‘隐形’。”“通过使用药物关闭DECTIN-1蛋白，结合现有疗法，我们可以激活免疫系统并帮助其识别并攻击癌细胞。”目前，针对自身免疫性疾病的治疗方法大多并非很有效，还伴有许多破坏性的副作用。这是因为现有的大部分治疗方法都会抑制整个免疫系统，而不是只针对特定区域。“这意味着目前常见的治疗手段可能无法从根源上解决疾病，还会无意中使患者更易受到感染。事实证明，许多接受治疗的患者也会受到细菌、真菌和病毒的感染，这可能会导致自身免疫力恶化，”Vinuesa教授说。通过检测一个西班牙家庭的DNA，研究人员发现DECTIN-1突变导致该家庭唯一的孩子患有慢性自身免疫性疾病。“我们发现这个家族还携带另一种免疫系统蛋白CTLA-4的突变版本。CTLA-4突变会阻止T细胞正常工作，并且已知会导致约60%-70% DNA携带该突变的人患上严重的自身免疫性疾病，”昆士兰大学的Pablo Canete博士说：“奇怪的是，携带这种突变蛋白的剩余30%-40%的人并没有患病。”“我们发现这个西班牙家庭唯一的孩子同时患有DECTIN-1突变和CTLA4突变，而他的父母只有CTLA4突变。这帮助我们确定了为什么这个孩子是家里唯一出现严重自身免疫疾病的人，从而结束了他长达20年的病因之谜。”“通过发现DECTIN-1修饰蛋白突变的存在，我们终于解释了为什么有些人会患上严重的自身免疫性疾病，而另一些人则不会，即使他们都继承了家族遗传的基因突变。”参考文献：Turnbull, C et al, DECTIN-1: A modifier protein in CTLA-4 haploinsufficiency, Science Advances (2023). 10.1126/sciadv.adi9566责编|探索君排版|探索君End往期精选围观王晓红教授团队：绘制单次冷冻囊胚移植成功的女性植入期外周血microRNA动态表达谱，开拓领域创新研究热文维生素B12在细胞重编程与组织再生中发挥关键作用！热文语言胎教是否有效？研究人员以脑电图监测揭示答案热文Let-7家族miRNA或为癌症潜在免疫治疗靶点热文一项最新发现或可用于阿尔茨海默病药物开发点击“阅读原文”，了解更多~