GSDMD x GSDME

-01-引言肿瘤对凋亡的抵抗和免疫抑制的肿瘤微环境是肿瘤治疗反应差的两个主要原因。细胞焦亡是一种不同于细胞凋亡的溶解性和炎症性程序性细胞死亡途径，最新的证据表明，肿瘤细胞中的细胞焦亡诱导导致强烈的炎症反应和显著的肿瘤消退。作为其抗肿瘤作用的基础，细胞焦亡是由促进孔隙形成的gasdermin蛋白介导的，该蛋白通过释放促炎细胞因子和细胞破裂后的免疫原性物质促进免疫细胞活化和浸润。然而，考虑到其炎症性质，异常性的细胞焦亡也可能与肿瘤支持性微环境的形成有关。因此，深入了解细胞焦亡的分子途径，理清细胞焦亡与癌症之间复杂的联系，有助于我们充分利用细胞焦亡，并将其应用于现有的或新的抗癌策略。-02-一、细胞焦亡上世纪90年代，在感染鼠伤寒沙门氏菌（S.typhurium）和福氏沙门氏菌的巨噬细胞中首次描述了细胞焦亡。虽然最初被认为是一个凋亡过程，但进一步的研究表明，这种细菌诱导的细胞死亡严重依赖于caspase-1。焦亡细胞与凋亡细胞有一些共同特征，如染色质浓缩和DNA断裂，但可通过其完整的细胞核、孔隙形成、细胞肿胀和渗透溶解来区分。通常，焦亡细胞破裂是通过结合损伤相关分子模式（DAMP）或病原体相关分子模式（PAMP）后，通过半胱氨酸蛋白酶介导的成孔GSDM蛋白活化实现的。这些相同的半胱氨酸蛋白酶也可能直接或间接促进促炎细胞因子的成熟，这些促炎细胞因子与DAMP一起，在释放时启动或维持炎症反应。虽然细胞焦亡在病原体分解中起着重要的保护作用，但它已被认为是几种人类疾病的复杂因素，如心血管疾病、神经退行性疾病和艾滋病。糖尿病等代谢紊乱也可能通过慢性炎症和胰岛素干扰性细胞因子的产生而促进细胞焦亡。在癌症中，细胞焦亡的作用似乎是把双刃剑。一方面，细胞焦亡可迅速导致肿瘤消退，另一方面，它可促进肿瘤微环境的发展。因此，癌细胞可能抑制或刺激细胞焦亡，以支持其进展，具体取决于环境。-03- 二、细胞焦亡的分子机制尽管已知的细胞焦亡途径的数量在未来可能会增加，但目前已有两条主要途径和几种替代途径被阐明。在主要途径中，细胞焦亡是由GSDMD诱导的，涉及炎症性caspase-1（经典途径）或caspase-4/5（非经典途径）。在替代途径中，最受广泛关注的是GSDME通过caspase-3诱导的细胞焦亡。经典炎症小体途径在经典的炎性小体途径中，模式识别受体（PRR）识别DAMP（例如纤维蛋白原、热休克蛋白、DNA）和/或PAMP（例如鞭毛蛋白、聚糖、脂多糖）导致被称为炎性小体的相应胞质信号复合物的激活，通常由传感器蛋白、适配器和效应器半胱氨酸蛋白酶组成。尽管多种PRR，如NLR和TLR参与了这一过程，但已知其中只有部分能够直接组装炎症小体并激活半胱氨酸蛋白酶caspase-1。具体而言，该亚群中的PRRs/炎症小体传感器包括NLR家族的NLRP1、NLRP3、NLRP4、AIM2和pyrin。激活后，这些传感器中的大多数与适配蛋白ASC相互作用，后者通过前半胱氨酸蛋白酶-1的募集和切割激活caspase-1。除了释放和激活GSDMD的致死N端结构域（GSDMD-N），caspase-1还使前IL-1β和前IL-18成熟为IL-1β和IL-18，它们通过GSDMD-N形成的坏死膜孔释放。非经典炎症小体途径与标准炎症小体途径相反，非标准炎症小体途径不依赖caspase-1，而是依赖于caspase-4和caspase-5以及小鼠的caspase-11。这些半胱氨酸蛋白酶的激活是通过LPS与相应的前半胱氨酸蛋白酶的直接结合发生的，并且绕过了炎症小体传感器。尽管这些半胱氨酸蛋白酶不直接激活IL-1β和IL-18，但它们通过GSDMD裂解触发细胞焦亡导致钾离子外流，从而激活NLRP3炎症小体并上调caspase-1的作用。替代途径研究表明，在某些情况下，如化疗或靶向癌症治疗，可通过caspase-3诱导凋亡到焦亡的途径。尽管caspases-3主要与凋亡执行和形态学改变有关，但它可以通过切割GSDME介导细胞焦亡，这同样导致GSDME-N孔的形成和膜的通透性改变。当GSDME水平较高时，caspase-3激活后会迅速引发细胞焦亡，但当GSDME水平较低时，则会引发凋亡。然而，这一概念仍需要进一步的验证。此外，还有其他几种替代性细胞焦亡途径，包括caspase-8对GSDMD的切割；caspase-8或颗粒酶B（GzmB）对GSDME的切割；caspase-1或颗粒酶A（GzmA）对GSDMB的切割；通过caspase-8切割GSDMC，GSDMC通过缺氧激活的程序性死亡配体1（PD-L1）和pSTAT3转录上调以及其它未知机制形成的GSDMA孔。-04-三、癌症中的细胞焦亡及其成分细胞焦亡在癌症中的模糊作用似乎与细胞类型、遗传学和诱导持续时间有关。在异常表达和延长活性后，GSDM、炎症小体和/或促炎细胞因子可通过诱导免疫抑制细胞、促进上皮细胞向间质细胞转化以及上调基质金属蛋白酶以进行细胞外基质重塑来促进肿瘤病理学。另一方面，与这些效应并列，细胞焦亡也可以抑制肿瘤，例如，在肝细胞癌模型中，通过NLRP3炎性小体激活诱导的细胞焦亡显著抑制了肿瘤的转移和生长。鉴于细胞焦亡的双重作用，其分子成分在不同癌症中存在差异表达。GSDMs在乳腺癌、胃癌、宫颈癌和肺癌等肿瘤中，已被证明同时作为癌基因或肿瘤抑制因子控制增殖、转移、治疗抵抗和抗肿瘤免疫。在胃癌（GC）中，GSDMD表达显著降低，并导致体外和体内肿瘤增殖增强。相反，非小细胞肺癌（NSCLC）中的GSDMD蛋白水平显著升高，并且与肿瘤转移以及更差的预后相关。与GSDMD类似，GSDME在胃癌、乳腺癌和大肠癌中的表达也降低。GSDMC在大肠癌中表达明显上调，在大肠癌中，GSDMC在体外促进了癌变和增殖，在体内促进了肿瘤生长。GSDMB水平越高，乳腺癌患者的转移率越高，生存率越低。在其他细胞焦亡成分中，观察到大多数结直肠癌肿瘤中AIM2表达显著降低或缺失，且与患者预后不良有关。NLRP1水平在大肠癌肿瘤组织中同样降低，并与转移增加和生存率降低有关。乳腺癌患者组织中的caspase-1 mRNA水平显著降低，此外，caspase-1的缺失与前列腺癌和大肠癌的肿瘤发生有关。阐明细胞焦亡与癌症之间的关系需要更广泛的研究。一个面临的挑战将是识别每种细胞焦亡分子成分的肿瘤特异性作用。由于多条通路导致细胞焦亡，且多个成分重叠，因此，表征每条通路的整体肿瘤特异性效应，而不是每个成分的个体效应，可能是理解和/或预测肿瘤对细胞焦亡调节的更有效策略。-05-四、细胞焦亡与抗肿瘤免疫的关系细胞死亡引发适应性免疫反应的能力称为免疫原性细胞死亡（ICD）。与基本上是免疫耐受过程的凋亡不同，细胞焦亡具有诱导强烈炎症反应的分子机制，在某些情况下被认为是ICD的一种形式。虽然细胞焦亡与抗癌免疫之间的联系尚不清楚，但越来越多的研究表明，细胞焦亡介导的肿瘤清除是通过增强免疫激活和功能实现的。GSDMA研究发现，将GSDMA的小鼠亚型Gsdma3选择性地递送到人类HeLa、小鼠EMT6和小鼠4T1癌细胞，导致20-40%的细胞发生细胞焦亡。在体内模型中，通过静脉或瘤内注射NP–Gsdma3进行三轮治疗，导致肿瘤明显缩小。与PBS对照组相比，NP–Gsdma3治疗的肿瘤中CD4+、CD8+、自然杀伤（NK）和M1巨噬细胞数量增加，但单核细胞、中性粒细胞、髓源性抑制细胞和M2巨噬细胞的数量减少。此外，除了在血清和肿瘤水平IL-1β、IL-18和HMGB1水平增加外，还发现许多免疫刺激和抗肿瘤效应基因（如Cd69、Gzma、Gzmb）的上调，各种免疫抑制和肿瘤前体基因（如Csf1、Vegfa、Cd274）下调。GSDMD通过研究CTLs在肺鳞状细胞癌（LUSC）和黑色素瘤肿瘤样本中与CD8+T细胞标记物有关的GSDM基因的表达，发现在五个GSDM基因成员中，只有GSDMD表达与CTL中的CD8+T细胞标记基因（例如CD8A、CD8B、PRF1、GZMA、GZMB和IFNG）呈正相关。进一步研究表明，与原始T淋巴细胞相比，OT-1小鼠活化的CTL中GSDMD的表达显著增加。类似地，人CD8+T细胞在激活后上调GSDMD，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中可见高水平的GSDMD蛋白。此外，GSDMD敲除后，CTL对3LL-OVA细胞的细胞毒性降低。使用人CTL和H1299非小细胞肺癌细胞系记录了类似的结果。考虑到CTL杀死肿瘤细胞的一个关键途径是通过将细胞毒性分子释放到它们形成的免疫突触中，推测GSDMD和GzmB进入效应癌细胞可能是研究中发现的CTL细胞毒性的潜在机制。GSDMBGSDMB介导细胞焦亡与GzmA密切相关。在HEK-293F细胞中的五种人类颗粒酶中，发现只有GzmA以类似于NK细胞杀伤试验的模式快速切割GSDMB。当GzmA电穿孔到GSDMB重组的293T细胞中时，引起广泛的GSDMB裂解和细胞焦亡。同样，在生理条件下，GzmA介导的GSDMB切割在NK细胞杀伤293细胞时也是必需的。值得注意的是，其他GSDMB水平不明显的癌细胞系，如OE33（食管癌细胞）和HCC1954（乳腺癌细胞），可通过暴露于通常由活化的CTL释放的细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）来转录诱导GSDMB表达增加。反过来，IFN-γ启动显著增强了这些细胞系的细胞焦亡，这种效应最终取决于GzmA。总之，这些发现不仅表明GSDMB介导的细胞焦亡作用于GzmA下游，而且细胞毒性淋巴细胞可将GzmA传递到表达GSDMB的癌细胞中，以促进抗肿瘤免疫。GSDME研究发现，GSDME介导的细胞焦亡与GzmB相关。在小鼠4T1E乳腺癌细胞中异位表达小鼠GSDME（mGSDME），在体内模型中可显著抑制4T1E肿瘤生长，并导致NK细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）浸润增加。此外，当受到刺激时，肿瘤中表达GzmB和穿孔素的NK细胞和CD8+TIL增加。进一步研究表明，人NK细胞系YT可以激活表达GSDME的HeLa细胞中的细胞焦亡，这种诱导是通过GzmB实现的，它不仅在与caspase-3相同的位置切割GSDME，而且间接激活caspase-3。此外，CAR-T细胞可以通过穿孔素和GzmB释放，在B细胞白血病和实体瘤细胞中诱导GSDME介导的肿瘤细胞的细胞焦亡。用共同培养的CD19-CAR-T细胞和癌细胞（NALM-6、Raji或原发性B白血病细胞）的上清液处理人源性巨噬细胞，可促进巨噬细胞激活caspase-1，切割GSDMD，并释放IL-6和IL-1β。同时发现共培养上清液中的ATP和HMGB1分别足以促进巨噬细胞IL-1β分泌和IL-6上调。总的来说，这些发现表明CAR-T细胞治疗通过GSDME促进的细胞焦亡诱发CRS，对CD19-CART细胞治疗前患者的肿瘤细胞进行分析，显示GSDME水平升高与更严重的CRS相关。-06-五、细胞焦亡在抗癌治疗中的应用前景近年来，越来越多的研究表明，利用细胞焦亡通过不同的靶向和传递方法进行抗肿瘤免疫的可行性和治疗潜力。例如，利用肿瘤细胞衍生微粒（TMP）将甲氨蝶呤注入胆管癌（CCA）细胞，以诱导GSDME介导的细胞焦亡，从而激活患者衍生的巨噬细胞，并将中性粒细胞募集到肿瘤部位进行药物导向的肿瘤破坏。此外，当这种甲氨蝶呤TMP输送系统注入肝外CCA患者的胆管管腔时，25%的患者观察到中性粒细胞活化和胆道梗阻的缓解。此外，还发现GSDME介导的细胞焦亡通过BRAF和MEK抑制剂的组合在黑色素瘤中引起免疫细胞浸润/激活，并导致黑色素瘤消退。在另一种策略中，二甲双胍是治疗2型糖尿病最常用的药物，其可以通过caspase-3间接激活细胞焦亡来抑制癌细胞增殖。一系列针对KRAS、EGFR或ALK突变型肺癌的小分子抑制剂也被发现，在线粒体固有凋亡途径激活后，通过caspase-3介导的GSDME裂解诱导细胞焦亡。在乳腺癌细胞中，用RIG-1激动剂治疗可触发外源性凋亡途径和细胞焦亡，激活STAT1和NF-κB并上调淋巴细胞募集趋化因子。因此，在小鼠中RIG-1激活后，乳腺癌转移和肿瘤生长的减少伴随着肿瘤淋巴细胞的增加。几乎所有抗癌免疫治疗策略面临的另一个主要障碍是免疫抑制肿瘤微环境引起的失调。为了解决这个问题，Lu等人设计了含有嵌合共刺激转化受体（CCCR）的NK92细胞，该受体将抑制性PD-1信号转化为激活信号，有效地增强了抗肿瘤活性。在体外，CCCR-NK92细胞通过GSDME介导的细胞焦亡迅速杀死H1299细胞，在体内显著抑制肿瘤生长。此外，越来越多令人兴奋的研究报告表明，细胞焦亡诱导与PD-1抑制剂协同作用使肿瘤由“冷”变“热”，表明这种组合的巨大潜力。-07-结语作为一种炎性细胞死亡模式，细胞焦亡通过激发抗肿瘤免疫反应而在肿瘤抑制中发挥重要作用。在某些情况下，单纯的细胞焦亡诱导就可能足以阻碍肿瘤生长。然而，细胞焦亡治疗应用面临的最大挑战之一是细胞焦亡相关成分的表达和功能的不规则性，不仅在不同的癌症之间，而且还存在于同一类型的癌症中。尽管如此，分子、遗传和表观遗传靶向/递送系统的进步，以及精准和个性化的医学的发展，让我们有希望很快能够利用这些强大机制作为治疗癌症的工具。参考资料：1.Pyroptosis at the forefront of anticancerimmunity. J Exp Clin Cancer Res. 2021; 40: 264.公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

11月30日，广州医科大学与新疆石河子大学研究人员合作共同在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“GEFT inhibits the GSDM-mediated proptosis signalling pathway, promoting the progression and drug resistance of rhabdomyosarcoma”，在本研究中，研究人员发现NLRP3、caspase-1、caspase-3、GSDMD和GSDME在RMS中的表达明显低于骨骼肌组织。尼日菌素和放线菌素分别通过NLRP3/caspase-1/GSDMD通路和caspase-3/GSDME通路实现对RMS细胞焦亡的调控作用。MLKL药理抑制剂逆转尼日菌素诱导的细胞焦亡相关变化，siGSDME将放线菌素诱导的细胞焦亡转化为细胞凋亡。此外，GEFT抑制GSDMD和GSDME细胞焦亡通路，从而促进RMS的进展和耐药。小鼠异种移植和肿瘤分析证实，尼日菌素和放线菌素可通过激活细胞焦亡通路有效提高RMS的治疗效果。本研究是第一个聚焦于RMS细胞焦亡的研究。总之，本研究表明，尼日菌素和放线菌素通过促进RMS细胞焦亡在肿瘤中发挥治疗作用。干扰GEFT及联合用药对肿瘤有较好的抑制作用。 11月30日，广州医科大学与新疆石河子大学研究人员合作共同在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“GEFT inhibits the GSDM-mediated proptosis signalling pathway, promoting the progression and drug resistance of rhabdomyosarcoma”，在本研究中，研究人员发现NLRP3、caspase-1、caspase-3、GSDMD和GSDME在RMS中的表达明显低于骨骼肌组织。尼日菌素和放线菌素分别通过NLRP3/caspase-1/GSDMD通路和caspase-3/GSDME通路实现对RMS细胞焦亡的调控作用。MLKL药理抑制剂逆转尼日菌素诱导的细胞焦亡相关变化，siGSDME将放线菌素诱导的细胞焦亡转化为细胞凋亡。此外，GEFT抑制GSDMD和GSDME细胞焦亡通路，从而促进RMS的进展和耐药。小鼠异种移植和肿瘤分析证实，尼日菌素和放线菌素可通过激活细胞焦亡通路有效提高RMS的治疗效果。本研究是第一个聚焦于RMS细胞焦亡的研究。 总之，本研究表明，尼日菌素和放线菌素通过促进RMS细胞焦亡在肿瘤中发挥治疗作用。干扰GEFT及联合用药对肿瘤有较好的抑制作用。 https://www.nature.com/articles/s41419-024-07243-y https://www.nature.com/articles/s41419-024-07243-y 背景知识 背景知识 01 01 横纹肌肉瘤（RMS）是儿童最常见的软组织肉瘤。尽管采取了综合治疗，高危RMS患者的5年总生存率仍为20 ~ 30%，预后较差。ARMS、myod1突变型SRMS、PRMS和tfcp2相关基因融合的RMS往往预后不良。从遗传学角度来看，RMS可能是融合阳性（FP）或融合阴性（FN）亚型。FP RMS与PAX3/7-FOXO1或EWSR1/FUS::TFCP2融合基因相关，FN RMS涉及信号通路，包括hedgehog、Notch和Wnt信号通路。表观遗传机制调控基因表达并促进RMS的发生发展。全基因组DNA甲基化研究报告了FP和FN RMS中DNA甲基化与突变变化和转录组织之间关系的证据。因此，RMS的发病机制涉及许多基因、信号通路和表观遗传学的改变，导致治疗效果不佳。 横纹肌肉瘤（RMS）是儿童最常见的软组织肉瘤。尽管采取了综合治疗，高危RMS患者的5年总生存率仍为20 ~ 30%，预后较差。ARMS、myod1突变型SRMS、PRMS和tfcp2相关基因融合的RMS往往预后不良。从遗传学角度来看，RMS可能是融合阳性（FP）或融合阴性（FN）亚型。FP RMS与PAX3/7-FOXO1或EWSR1/FUS::TFCP2融合基因相关，FN RMS涉及信号通路，包括hedgehog、Notch和Wnt信号通路。表观遗传机制调控基因表达并促进RMS的发生发展。全基因组DNA甲基化研究报告了FP和FN RMS中DNA甲基化与突变变化和转录组织之间关系的证据。因此，RMS的发病机制涉及许多基因、信号通路和表观遗传学的改变，导致治疗效果不佳。 细胞焦亡是由GSDM家族成员介导的一种新的程序性细胞死亡，在人类中包括GSDMA、 GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME（也称为DFNA5）和PJVK（也称为DFNB59）。GSDMD和GSDME是两种最重要的细胞焦亡蛋白。GSDMD主要参与经典和非经典炎性小体焦亡通路。在前者中，病原体相关或损伤相关的分子模式刺激炎症小体，随后炎症小体激活caspase-1，参与IL-18前体和IL-1β前体的成熟。随后发生炎症反应和GSDMD裂解。GSDMD-N片段在细胞质膜上释放并形成孔隙，诱导细胞肿胀和渗透性溶解。在后者中，来自细菌的脂多糖识别并激活caspase-4/5/11，通过GSDMD裂解诱导细胞焦亡。细胞焦亡、坏死性凋亡和铁死亡被认为是影响癌症疗效的关键因素。然而，细胞焦亡在RMS进展中的作用尚不清楚。 细胞焦亡是由GSDM家族成员介导的一种新的程序性细胞死亡，在人类中包括GSDMA、 GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME（也称为DFNA5）和PJVK（也称为DFNB59）。GSDMD和GSDME是两种最重要的细胞焦亡蛋白。GSDMD主要参与经典和非经典炎性小体焦亡通路。在前者中，病原体相关或损伤相关的分子模式刺激炎症小体，随后炎症小体激活caspase-1，参与IL-18前体和IL-1β前体的成熟。随后发生炎症反应和GSDMD裂解。GSDMD-N片段在细胞质膜上释放并形成孔隙，诱导细胞肿胀和渗透性溶解。在后者中，来自细菌的脂多糖识别并激活caspase-4/5/11，通过GSDMD裂解诱导细胞焦亡。细胞焦亡、坏死性凋亡和铁死亡被认为是影响癌症疗效的关键因素。然而，细胞焦亡在RMS进展中的作用尚不清楚。 NSA可部分逆转尼日菌素引起的细胞焦亡 NSA可部分逆转尼日菌素引起的细胞焦亡 02 02 为了探索潜在的机制，研究人员使用了GSDMD抑制剂NSA。NSA可直接与GSDMD结合而不影响GSDME，从而抑制p30-GSDMD孔形成和细胞焦亡。此外，NSA可通过抑制细胞焦亡和程序性坏死途径减轻肠道炎症，从而治疗炎症性肠病。研究人员分析了其对RMS细胞焦亡和生物学行为的影响。与尼日菌素单独处理相比，NSA+尼日菌素处理后RMS细胞GSDMD mRNA表达下调。GSDMD-N蛋白表达降低，NLRP3和cleaved caspase-1蛋白表达无变化。这些结果表明，抑制GSDMD后，细胞焦亡被部分抑制。 为了探索潜在的机制，研究人员使用了GSDMD抑制剂NSA。NSA可直接与GSDMD结合而不影响GSDME，从而抑制p30-GSDMD孔形成和细胞焦亡。此外，NSA可通过抑制细胞焦亡和程序性坏死途径减轻肠道炎症，从而治疗炎症性肠病。研究人员分析了其对RMS细胞焦亡和生物学行为的影响。与尼日菌素单独处理相比，NSA+尼日菌素处理后RMS细胞GSDMD mRNA表达下调。GSDMD-N蛋白表达降低，NLRP3和cleaved caspase-1蛋白表达无变化。这些结果表明，抑制GSDMD后，细胞焦亡被部分抑制。 NSA逆转尼日菌素引起的NLRP3/caspase-1/GSDMD经典细胞焦亡通路 NSA逆转尼日菌素引起的NLRP3/caspase-1/GSDMD经典细胞焦亡通路 研究人员进行了一系列细胞功能实验，以进一步了解GSDMD抑制是否影响RMS的生物学行为。研究表明抑制GSDMD可逆转尼日菌素诱导的RMS细胞焦亡相关变化，从而促进RMS细胞的增殖、侵袭和迁移能力。 研究人员进行了一系列细胞功能实验，以进一步了解GSDMD抑制是否影响RMS的生物学行为。研究表明抑制GSDMD可逆转尼日菌素诱导的RMS细胞焦亡相关变化，从而促进RMS细胞的增殖、侵袭和迁移能力。 GEFT-Rac1/Cdc42参与调控GSDMD和GSDME细胞焦亡信号通路 GEFT-Rac1/Cdc42参与调控GSDMD和GSDME细胞焦亡信号通路 03 03 研究人员对GEFT进行了筛选，发现GEFT与RMS的发生密切相关。分别用尼日菌素、放线菌素和siGEFT处理RD和RH30细胞，用GEFT稳定过表达，进一步明确GEFT与GSDMs信号通路的关系。过表达GEFT+尼日菌素组NLRP3、cleaved-caspase-1和GSDMD的mRNA和蛋白表达水平显著降低。此外，尼日菌素可抑制RMS细胞活力和增殖，GEFT可部分恢复这一现象，siGEFT与尼日菌素联合应用可显著抑制RMS细胞活力和增殖，促进RMS细胞死亡，具有较强的抑制作用。这些结果表明GEFT可以抑制尼日菌素诱导的细胞焦亡和细胞生物学行为的改变。初步研究表明GEFT可以直接结合Rac1和Cdc42抑制RMS的自噬和凋亡。研究人员进一步研究GEFT是否也通过Rac1/Cdc42影响细胞焦亡通路。用Rac1抑制剂NSC23766或Cdc42抑制剂ZCL278抑制Rac1/Cdc42后，GSDMD表达增加。以上结果提示GEFT-Rac1/Cdc42可通过调控GSDMD信号通路抑制RMS细胞焦亡及其生物学行为。GEFT可逆转药物诱导的细胞焦亡，干扰GEFT可增加药物敏感性。 研究人员对GEFT进行了筛选，发现GEFT与RMS的发生密切相关。分别用尼日菌素、放线菌素和siGEFT处理RD和RH30细胞，用GEFT稳定过表达，进一步明确GEFT与GSDMs信号通路的关系。过表达GEFT+尼日菌素组NLRP3、cleaved-caspase-1和GSDMD的mRNA和蛋白表达水平显著降低。此外，尼日菌素可抑制RMS细胞活力和增殖，GEFT可部分恢复这一现象，siGEFT与尼日菌素联合应用可显著抑制RMS细胞活力和增殖，促进RMS细胞死亡，具有较强的抑制作用。这些结果表明GEFT可以抑制尼日菌素诱导的细胞焦亡和细胞生物学行为的改变。初步研究表明GEFT可以直接结合Rac1和Cdc42抑制RMS的自噬和凋亡。研究人员进一步研究GEFT是否也通过Rac1/Cdc42影响细胞焦亡通路。用Rac1抑制剂NSC23766或Cdc42抑制剂ZCL278抑制Rac1/Cdc42后，GSDMD表达增加。以上结果提示GEFT-Rac1/Cdc42可通过调控GSDMD信号通路抑制RMS细胞焦亡及其生物学行为。GEFT可逆转药物诱导的细胞焦亡，干扰GEFT可增加药物敏感性。 过表达GEFT+放线菌素组Caspase-3 mRNA和蛋白表达及GSDME表达显著降低。放线菌素可以抑制RMS细胞的活力和增殖，GEFT可以部分恢复这一现象，siGEFT和放线菌素联合应用对细胞活力和增殖的抑制作用最显著，比单独应用放线菌素的作用更强。GEFT通过激活Rac1/Cdc42通路抑制GSDME焦亡通路。抑制GSDME不影响GEFT、Rac1和Cdc42的表达。以上结果提示GEFT- rac1 /Cdc42通过调控GSDME信号通路抑制RMS细胞焦亡，干扰GEFT可增加化疗药物的敏感性。 过表达GEFT+放线菌素组Caspase-3 mRNA和蛋白表达及GSDME表达显著降低。放线菌素可以抑制RMS细胞的活力和增殖，GEFT可以部分恢复这一现象，siGEFT和放线菌素联合应用对细胞活力和增殖的抑制作用最显著，比单独应用放线菌素的作用更强。GEFT通过激活Rac1/Cdc42通路抑制GSDME焦亡通路。抑制GSDME不影响GEFT、Rac1和Cdc42的表达。以上结果提示GEFT- rac1 /Cdc42通过调控GSDME信号通路抑制RMS细胞焦亡，干扰GEFT可增加化疗药物的敏感性。 结论 结论 04 04 综上所述，研究人员首次研究了RMS细胞焦亡的水平。研究人员证实，尼日菌素和放线菌素促进RMS细胞焦亡。 此外，与尼日菌素或放线菌素联合干扰GEFT可有效提高药物敏感性。（转化医学网360zhyx.com） 综上所述，研究人员首次研究了RMS细胞焦亡的水平。研究人员证实，尼日菌素和放线菌素促进RMS细胞焦亡。 此外，与尼日菌素或放线菌素联合干扰GEFT可有效提高药物敏感性。（转化医学网360zhyx.com） 【参考资料】 【参考资料】 https://www.nature.com/articles/s41419-024-07243-y https://www.nature.com/articles/s41419-024-07243-y 【关于投稿】 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 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摘要：嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤治疗中表现出显著的疗效，目前已有9种CAR-T细胞产品上市。此外，CAR-T细胞在将治疗应用扩展到实体瘤、心肌纤维化以及自身免疫和传染性疾病等不同领域展现出了有希望的潜力。尽管因此，目前的研究工作集中在解决这些问题上，以提高CAR-T细胞的安全性和有效性，并降低复发率。取得了这些进展，但与治疗相关的毒性反应和复发方面的重大挑战仍然存在。本文提供了CAR-T细胞疗法当前状态的全面概述，包括它们的成就、现有挑战和潜在的未来发展方向。 1. 引言  嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法是一种绕过主要组织相容性复合体依赖的免疫耐受和肿瘤逃逸的过继细胞疗法；它针对广泛的抗原（蛋白质、碳水化合物和糖脂），并且比常规化疗具有更高的持久性，呈现出一种有希望的免疫疗法形式。它通过基因修饰来自患者或健康供者的T细胞来靶向癌细胞，满足当前精准和个性化医疗的趋势。CAR-T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤方面显示出有希望的结果，目前已有9种针对B细胞恶性肿瘤或骨髓瘤的CAR-T细胞产品上市。CAR-T细胞具有不可忽视的毒性副作用，其中细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）最为常见。CAR-T细胞毒性的管理是CAR-T细胞疗法的一个重要方面。当前CAR-T细胞的发展继续减少毒性并提高疗效。 2. 现状  2.1 CAR-T细胞的结构和功能  CAR基本上由不同的部分构成：胞外、铰链、跨膜和胞内结构域。具体来说，胞外结构域，被称为抗原结合域，来源于单克隆抗体的可变重链（VH）和可变轻链（VL）。这些链通过柔性连接，形成一个单链可变片段（scFv），主要用于促进对肿瘤细胞表面的相关抗原的识别。VH和VL链之间的相互作用以及决定互补性的区域的相对位置可以影响CAR对目标抗原的亲和力和特异性。铰链或间隔区域是胞外结构的一部分，从跨膜域延伸到结合单元。其作用与CAR-T细胞的功能有关，除了连接胞外和跨膜结构域之外。Okuno等人发现，铰链区域长度的修改有助于区分正常细胞和肿瘤细胞。此外，降低铰链区域的灵活性可以减轻CAR-T细胞的过度激活，并在高肿瘤负荷下提高存活率。跨膜结构域作为胞内间隔的信号通道，通常来源于CD3-ζ、CD4、CD8或CD28分子。其主要功能是将CAR分子锚定到T细胞膜上，研究表明它通过控制CAR表达的水平和稳定性来调节CAR信号，这在信号或突触形成中起作用，并与内源性信号分子的二聚体形成相关。胞内结构域主要由共刺激域和信号转导区域组成。在CAR工程中，CAR共刺激的含义是一个重要的焦点，最终目标是制造优化胞内结构域功能的CAR架构（图1）。 图1. CAR的五代。第一代CAR-T细胞结构仅包含1个抗原识别域，scFv，一个铰链区，一个跨膜域和细胞内激活域，而第二代CAR-T细胞有额外的共刺激域，第三代CAR-T细胞有2种不同的共刺激域。第四代CAR-T细胞通过修改分泌细胞因子。第五代CAR-T细胞是CAR-T细胞的最新一代，具有更高的安全性和可控性。CAR = 嵌合抗原受体，IL = 干扰素。 2.2 CAR-T细胞的发展  不同代的CAR-T细胞具有相同的基本结构。它们主要在胞内结构域以及引入的细胞因子和配体方面有所不同。第一代CAR-T细胞具有最简单的结构，仅包含抗原识别域、scFv、铰链区、跨膜域和胞内CD3-ζ激活域。缺乏共刺激域导致在临床试验中存活时间显著缩短，限制了细胞毒性潜力。将诸如CD28或4-1BB等共刺激域整合到第一代CAR-T细胞中，构成了第二代CAR-T细胞的出现，增强了增殖能力和细胞因子分泌。目前，所有商业化的CAR-T细胞产品都是第二代的。第三代CAR-T细胞设计包含一个双重共刺激框架，结合了不同的分子，即CD28和4-1BB。理论上，这种配置与第二代相比具有更高的细胞毒性和更长的治疗有效性。然而，目前的证据并不支持它们与第二代产品相比在临床上的优越性能。第四代CAR-T细胞，通常被称为TRUCK或装甲CAR-T细胞，通过细胞因子分泌如白介素（IL）-12，或表达抗-PD-1抗体或自杀基因来增强治疗潜力。这种增强通过绕过抑制因素提高了CAR-T细胞的疗效。与其第二代对应物相比，第四代CAR-T细胞表现出增强的扩张动力学、提高的效力和对抑制影响的增加抵抗力。超越第四代，第五代CAR-T细胞在第二代CARs的基础上增加了IL-2受体β（IL-2Rβ）链在CD3-ζ和CD28或4-1BB之间，提供了一个STAT3结合位点，激活JAK-STAT信号传导。通用CAR-T（UCAR-T）细胞，来自健康供体，通过生物素结合免疫受体或分裂、通用、可编程CARs基因编辑来破坏T细胞受体（TCR）和人类白细胞抗原I类基因，能够识别广泛的抗原。新兴技术，如逻辑门控，越来越多地被应用于CAR-T细胞的设计，以克服传统CAR-T（C-CAR-T）细胞的缺陷并提高其安全性和有效性。 2.3 CAR-T细胞的制造  CAR-T细胞的生成涉及一系列的过程。最初步骤中，T细胞是从患者或供体的外周血中获取的。与造血干细胞移植（HSCT）中的外周血干细胞收集一样，自体CAR-T细胞的获取由于患者同时存在的细胞减少症和受损的T细胞功能而面临独特的障碍。这阻碍了T细胞的有效回收，并为CAR-T细胞的高效获取带来了重大挑战。孤立的单克隆经过基因修饰以表达CAR，然后进行扩增。随后，修饰后的产品被冷冻保存并运输到医院进行给药。患者通常接受淋巴细胞耗竭化疗，也称为调节化疗，这增强了有利的细胞因子环境，同时减少了免疫抑制细胞。调节化疗对淋巴细胞计数的影响与CAR-T细胞的最佳疗效相关且必要。然后重新输注CAR-T细胞，它们专门识别目标抗原并在体内迅速增殖以发挥抗肿瘤作用。在重新输注期间以及随后的2至3周内，必须对患者的生命体征进行持续监测，以便及时检测和干预任何潜在的毒性不良反应，包括CRS和ICANS。此外，应对CAR-T治疗的疗效进行全面的长期随访评估。 2.4 CAR-T细胞治疗的临床应用  目前，CAR-T细胞治疗主要用于国内外市场上的血液肿瘤。其中，6种产品使用抗CD19 CAR-T细胞，针对复发或难治性（R/R）B细胞淋巴瘤和B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL），其余三种产品采用抗B细胞成熟抗原（BCMA）CAR-T细胞治疗R/R多发性骨髓瘤（MM）（表1）。 2.4.1 弥漫性大B细胞淋巴瘤 （DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）中最常见的侵袭性类型，其一线治疗方案为R-CHOP（利妥昔单抗联合环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松的免疫化疗），实现了70%至80%的缓解率。然而，30%至40%的患者对治疗无反应或复发，导致预后不佳，2年总生存率（OS）仅为20%至40%。CAR-T细胞疗法的开发和应用为R/R DLBCL的治疗提供了新的希望。 抗CD19 CAR-T细胞疗法是第三线治疗的金标准，并且作为R-CHOP治疗后难治性或早期复发的第二线治疗正在迅速发展。目前，有3种CAR-T产品上市用于DLBCL治疗：axicabtagene ciloleucel（axi-cel）、tisagenlecleucel（tisa-cel）和lisocabtagene maraleucel（liso-cel）。美国食品药品监督管理局（FDA）分别在2017年和2018年批准了axi-cel和tisa-cel用于治疗高级别B细胞淋巴瘤或DLBCL，这些患者复发或之前已经接受过2种或更多化疗方案的治疗。Liso-cel在2021年获得批准。一系列临床试验和现实世界证据已经证明了CAR-T细胞疗法在治疗R/R DLBCL中的有效性。ZUMA-1试验显示，axi-cel的客观缓解率（ORR）为83%，完全缓解（CR）率为53%，在大量预处理的大B细胞淋巴瘤（LBCL）患者中，中位OS超过2年。5年随访结果显示，中位OS为25.8个月，5年OS率为42.6%。ZUMA-7试验使用axi-cel与标准护理（SOC）作为R/R LBCL患者的二线治疗，并显示axi-cel和SOC组的中位无事件生存期（EFS）分别为8.3个月和2.0个月，ORR分别为83%和50%，CR率分别为65%和32%。ZUMA-12是第一个评估axi-cel作为高风险LBCL一线方案的研究，ORR为89%，CR率为78%。美国淋巴瘤CAR-T联盟的研究报告了axi-cel在批准适应症的标准护理环境中的ORR为82%，CR率为64%。在美国，一项关于axi-cel治疗LBCL的研究报告显示，ORR为73%，CR率为56%。中位OS和无进展生存期（PFS）分别为21.8个月和8.6个月。 2.4.2 急性淋巴细胞白血病 （ALL）在儿童中表现出高治愈率，5年总生存（OS）率超过90%，但成人的长期生存率仅为35%至45%，大多数复发是由于化疗耐药性。对于复发/难治性（R/R）ALL亚型，预后比原发性ALL要差得多，长期OS率为15%至50%。近年来，CAR-T细胞疗法在治疗R/R ALL方面取得了良好进展，研究最多的靶点是CD19。2017年8月，FDA批准了首个CD19-CAR-T细胞产品，即tisa-cel，用于儿童和青少年ALL的治疗。在一项tisa-cel的单中心I-IIa期研究中，3个月时的总缓解率为81%，6个月时的无事件和OS率分别为73%和90%。 与CD19一样，CD22也是ALL中研究得非常充分的靶点。在患有B-ALL的成人和儿童中，90%表达CD22。一项CD22+ CAR-T细胞的I期研究显示了剂量依赖性的完全缓解（CR）率，接受较高剂量的患者中有73%达到了CR。一项更大型的研究表明，使用抗CD22 CAR-T细胞的安全性和可行性。CRS的发生率是86.2%，90%为1-2级CRS，轻度短暂的神经毒性症状，CR率为70%。中位OS率为13.4个月。 管理与CAR-T细胞治疗R/R B-ALL相关的毒性反应和复发仍然是一个挑战。此外，需要更长时间的随访以获取更多临床数据，以确认其长期疗效。 2.4.3 多发性骨髓瘤 MM在很大程度上是不治之症，几乎所有患者最终都会复发，随着治疗选择的使用，缓解时间缩短。CAR-T细胞治疗是针对R/R骨髓瘤患者的有希望的新治疗选择。最广泛研究的MM CAR-T细胞靶点是BCMA，肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF17)的成员，其在浆细胞中而非造血干细胞中的优先表达使其成为理想的抗原靶点。2021年3月和2022年2月，FDA批准了2种抗BCMA CAR-T细胞产品用于MM治疗：ide-cel/Abecma和cilta-cel。2023年6月，国家药品监督管理局批准了第三种CAR-T细胞产品CT103A用于MM治疗。II期研究显示，接受ide-cel治疗的患者中有73%的反应率，33%的CR率，中位PFS为8.8个月。在最新的III期试验中，中位PFS分别为13.3和4.4个月，反应率分别为71%和42%，在ide-cel和标准方案组中。 设计用于评估cilta-cel安全性和临床活性的Ib/II期试验显示，总反应率为97%，CR率为67%，常见不良事件，CRS的发生率为95%；仅有9%的严重CRS，大约60%的患者在2年内没有疾病进展。FUMANBA-1试验的CT103A显示，ORR为95%，部分反应为4%，具有良好的安全性。在2023年ASCO年会上提出的更新数据显示治疗疗效显著提高。总反应率飙升至96.0%，显著的严格CR（sCR）率为74.3%。令人印象深刻的是，之前接受过CAR-T细胞治疗的12名受试者中有9人实现了缓解，其中5人实现了sCR，其中4人维持sCR超过18个月。 需要进一步的研究来验证这些发现。除了BCMA，还发现了其他靶点，包括CD138、CD38、CD19、GPRC5D、SLAMF7(CS1)、APRIL、TACI、CD229、CD56、MUC1、NKG2D配体、整合素b7、κ轻链、FcRH5、CCR10和CD44v6。POLARIS是第一个针对GPRC5D靶向CAR-T细胞(OriCAR-017)的人类、单中心、单臂、第一臂试验，专门招募中国患者，结果显示总反应率为100%，CR率为60%，没有严重的不良反应。 O’Neal等人开发了针对CS1(SLAMF7)的CAR-T细胞，尽管CD8+ CS1表达的CAR-T细胞杀死了CD8+ CS1细胞，但在高肿瘤负荷的骨髓瘤模型中显示出疗效。一项针对BCMA和CD38的人类化双特异性BM38 CAR-T细胞的I期试验显示，反应率为87%，CR率为52%，中位PFS为17.2个月。 表1 九种CAR-T细胞产品 CAR-T生产 靶标 应用Kymriah（tisagenlecleucel，tisa-cel）CD19复发/难治性B-ALL，复发/难治性DLBCL Yescarta（axicabtagene ciloleucel，axi-cel）CD19复发/难治性DLBCL Tecartus（brexucabtagene autoleucel）CD19复发/难治性MCL，复发/难治性B-ALL Abecma（idecabtagene vicleucel，ide-cel）BCMA复发/难治性MM Breyanzi（lisocabtagene maraleucel，liso-cel）CD19复发/难治性DLBCL Axicabtagene ciloleucel CD19复发/难治性DLBCL Relmacabtagene autoleucel CD19复发/难治性DLBCL；Carvykti（ciltacabtagene autoleucel，cilta-cel）BCMA复发/难治性MM CT103A，IBI326 BCMA复发/难治性MM CAR = 嵌合抗原受体，R/R B-ALL = 复发/难治性B细胞急性淋巴细胞性白血病，R/R DLBCL = 复发/难治性弥漫大B细胞淋巴瘤，R/R MCL = 复发/难治性套细胞淋巴瘤，R/R MM = 复发/难治性多发性骨髓瘤。 目前CAR-T细胞治疗通常用于MM治疗的后期；制备过程缓慢且成本高，一些患者不可避免地会复发。探索新靶标以减少CAR-T细胞毒性并提高其安全性是未来发展的方向。 2.4.4 套细胞淋巴瘤 除了一些接受异体骨髓（BM）移植的患者外，套细胞淋巴瘤（MCL）的治愈性是不确定的。标准化疗后的预后较差，中位生存期约为3年，长期无病生存罕见。CAR-T细胞治疗是一种新的有价值的治疗方式。目前市场上针对R/R MCL的CAR-T细胞产品是brexucabtagene autoleucel。ZUMA-2，一项II期多中心临床研究，在所有68名接受治疗的患者中，客观反应率为91%，完全反应为68%，中位随访时间为35.6个月。TRANSCEND研究报告称，接受liso-cel治疗的R/R MCL患者中，ORR为84%，CR为59%。 2.5 不良反应和毒性  2.5.1 细胞因子释放综合征  CRS是CAR-T细胞治疗中最常见的不良反应，是由CAR-T细胞在结合相应靶抗原时释放的炎症细胞因子和趋化因子触发的炎症状态。 在接受CAR-T细胞治疗的血液系统恶性肿瘤患者中，CRS的发生率是55.3%。美国移植和细胞治疗学会（ASTCT）将CRS定义为“任何免疫治疗后，由于内源性或输注的T细胞和其他免疫效应细胞的激活或参与，而产生的超生理反应。”CRS的发病机制目前尚不清楚。IL-6和IL-1，由单核细胞、巨噬细胞和树突细胞产生，在其中起关键作用。研究发现CAR-T细胞激活了gasmdermin E（GSDME）来介导细胞焦化，并通过大量释放穿孔素和颗粒酶B，随后引发CRS。动物实验表明，敲除GSDME、破坏巨噬细胞或阻断GSDMD的激活可以防止CRS的发展。症状可能是渐进的，首先是发烧，这可能发生在细胞输注后的几小时或几天内， 以及低血压、毛细血管渗漏（缺氧）和终末器官功能障碍。 其他症状类似于流感，包括肌肉痛、头痛、僵硬、不适和食欲不振。低级别的CRS是自限性的，而其他患者可能会出现低血压、败血症和毛细血管渗漏综合征，这些症状会因休克、播散性血管内凝血（DIC）和多器官衰竭而进一步恶化。 其进展和严重程度通常被认为与疾病负担、CAR结构和剂量、淋巴耗竭调节方案等因素有关。CRS的持续时间不同，取决于干预措施，通常在CAR-T细胞输注后2至3周完全解决。 管理CRS最重要的一步是仅在能够忍受CRS的患者中使用CAR-T细胞治疗，并提供适当的支持性护理和干预措施，包括直接靶向和非特异性免疫抑制策略，基于患者和CAR-T细胞产品。托珠单抗，一种IL-6受体拮抗剂，是FDA批准的用于CAR-T细胞相关CRS的唯一治疗方法。一些研究表明，早期使用托珠单抗和/或皮质类固醇治疗可降低3级或更高级别 2.5.2 免疫效应细胞相关神经毒性综合征 （ICANS）是CAR-T细胞疗法中另一种常见的不良反应，它可以与CRS同时发生、在CRS之后发生或独立于CRS发生。在血液系统恶性肿瘤患者中，有37.2%在接受CAR-T细胞治疗后会发生神经毒性。ICANS被ASTCT定义为“一种疾病，其病理过程涉及中枢神经系统，导致内源性或输注的T细胞和其他免疫效应细胞在任何免疫疗法后的激活或参与。”早期表现可能包括表达性失语和书写变化，随后进展为意识水平改变、昏迷、癫痫发作、虚弱和脑水肿。这一发生的机制尚不清楚。研究表明，脑壁细胞中CD19的表达是CAR-T细胞治疗中发生的神经毒性的原因，这表明了针对CD19导向治疗中的神经毒性的靶向机制。ICANS的治疗选择包括禁食、保持水化、营养支持疗法和改进的神经系统检查。糖皮质激素被认为是ICANS快速缓解的首选一线治疗。对于类固醇难治性ICANS，可以使用阿那白介素。这在统计上显著且迅速减少了发热、炎症细胞因子和与ICANS/CRS相关的生物标志物。对于有癫痫发作或中枢神经系统（CNS）疾病史的患者，可以使用左乙拉西坦预防。苯二氮卓类药物和额外的抗癫痫药物（左乙拉西坦和苯巴比妥）被推荐用于治疗活动性癫痫发作。ICANS是CAR-T细胞疗法的常见并发症，症状逐渐进展，早期诊断和预防是其管理的重要工具。不断改进控制不良反应的措施可以进一步突出CAR-T细胞疗法的优势。 2.5.3 其他相关毒性  严重的靶向肿瘤外毒性（OTOT）经常发生在CAR-T细胞治疗实体瘤的临床试验中，其主要机制是CAR-T细胞介导的正常细胞的识别和裂解，这些细胞表达目标抗原。尽管CAR-T细胞目前针对实体瘤的主要靶标是肿瘤相关抗原（TAAs），但它们也在非恶性组织中表达。当前减轻OTOT的策略包括：（1）修改CAR组分，提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的特异性识别；（2）通过逻辑门控开关减少CAR-T细胞的毒性，提高细胞死亡的特异性；（3）使用药物通过调节其信号通路或CAR表达水平来限制CAR-T细胞的功能。由于针对正常细胞的抗CD19 CAR-T细胞的靶向非肿瘤效应，经常发生B细胞发育异常，导致低丙种球蛋白血症和随后的频繁感染表现。在接受针对B-ALL的抗CD19 CAR-T细胞治疗后，有报道称B细胞发育异常可长达5年。感染在接受CAR-T细胞治疗后非常常见，大多数发生在1至2年内，感染发生率约为55%。在CRS反应期间，合并感染的死亡率很高；因此，感染预防和控制是CAR-T细胞治疗的最高优先事项。血细胞减少症包括贫血、血小板减少症、白细胞减少症和中性粒细胞减少症。此外，CAR-T细胞治疗还会引起不良反应，包括播散性血管内凝血（DIC）、噬血细胞综合征、肿瘤溶解综合征和移植物抗宿主病（GVHD）。 2.6 复发  在接受CAR-T细胞治疗的B细胞恶性肿瘤患者中，复发被定义为通过T细胞输注实现CR后肿瘤细胞的持续存在。大约40%至60%的患者会发生复发；在R/R ALL中，30%至60%的患者在接受CAR-T细胞治疗后复发，其中10%至20%是CD19阴性复发。CAR-T细胞治疗失败最常归因于抗原逃逸，即抗原阴性复发；然而，抗原阳性复发也经常发生，这可能与CAR-T细胞的内在因素有关。因此，肿瘤细胞本身、肿瘤微环境（TME）和CAR-T细胞可能会影响复发。肿瘤细胞的固有异质性为肿瘤的克隆进化和恶性进展奠定了基础。在CAR-T细胞输注之前，表达低或阴性抗原的肿瘤细胞可能会逃逸并发生二次克隆扩张。输注后CAR-T细胞在体内的功能受损和持久性减少也可能导致复发。CD19外显子3中的点突变可以影响CD19 FMC63 CAR-T细胞识别的表位，并在患有高级别B细胞淋巴瘤的患者中诱导CD19阳性复发。大多数CAR中的单链可变片段（scFv）来源于小鼠，具有高抗原性、低持久性和高复发率。 3. 未来发展方向 3.1 应用扩展  针对血液恶性肿瘤，包括霍奇金淋巴瘤（HL）、T细胞淋巴瘤和急性髓系白血病（AML）的CAR-T细胞治疗仍处于探索阶段。尽管CAR-T细胞治疗的适用范围几乎涵盖所有肿瘤类型，但其临床应用仍受到肿瘤抗原多样性和TME异质性的挑战的制约。因此，将CAR-T细胞治疗转化为这些疾病的临床实践尚未实现。此外，CAR-T细胞的应用已经扩展到非肿瘤性疾病，如自身免疫性疾病、HIV等感染性疾病和心肌纤维化。 3.1.1 霍奇金淋巴瘤  HL是一种B细胞淋巴瘤，其特点是TME中恶性细胞数量少，免疫效应细胞数量多。HL的发病率较低，在英美两国大约为每10万人中有2.7到2.8例，男性发病率高于女性，最高发病率在年轻人和60岁以上的个体中。大多数经典HL患者可以通过一线治疗治愈；然而，大约15%的患者会在初次治疗反应后发展为原发性难治性疾病或复发。 对于一线治疗失败的患者，SOC是大剂量化疗后进行自体HSCT；大约50%的患者会在移植后复发，预后较差。针对HL的抗CD30 CAR-T细胞已进入临床试验，并且在一项I期研究中，7名复发HL患者中没有观察到任何毒性。一位患者在接受第二次输注后发展为完全反应（>2年）。Ramos等人进行了两项平行的I/II期临床试验，总体ORR为62%，没有剂量限制毒性，轻度血液学毒性，CRS发生率为24%。 3.1.2 T细胞恶性肿瘤 T细胞恶性肿瘤是一类异质性肿瘤的广泛谱系，包括前体T细胞恶性肿瘤，如T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤（T-ALL/LBL），以及成熟的T细胞恶性肿瘤，如T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病/淋巴瘤、T细胞前淋巴细胞白血病和许多外周T细胞淋巴瘤（PTCLs）。T-ALL是一种淋巴系统的恶性肿瘤，占儿童ALL病例的10%至15%，成人病例的大约25%。T淋巴细胞性淋巴瘤（T细胞淋巴瘤）是一种NHL，其生物学特征与T-ALL相似，被归类为皮肤T细胞淋巴瘤或PTCL。在T细胞淋巴瘤中，预后较差，通常是由于药物抗性和患者对化疗方案的不耐受。与B细胞恶性肿瘤的情况不同，CAR-T细胞治疗在对抗恶性T细胞自我破坏、T细胞再生和产品污染方面面临挑战。 针对T细胞恶性肿瘤，有许多CAR-T细胞靶标，包括CD7、CD7、CD99和Vβ8，所有这些都目前处于研究阶段。CD7是一种跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，在T-ALL和T细胞淋巴瘤中高度表达。Lu等人报告了一项开放式、单臂I期临床试验，使用自然选择的CD7 CAR-T（NS7CAR）。在20名患有R/R T-ALL和T细胞淋巴瘤的患者中，19名在第28天的骨髓中实现了MRD阴性CR，14名在接受NS7CAR输注后接受了异体HSCT，并且至今没有复发。只有1名患者发生了3级CRS。89 2022年9月，Hu等人报告了一项使用CD7通用CAR-T细胞治疗T细胞恶性肿瘤的I期临床试验，11名可评估患者的总体反应率为81.8%，完全反应率为63.6%，没有剂量限制毒性、GVHD、ICANS或严重的CRS（≥3级）。Shi等人报告了在T-ALL中使用抗CD99 CAR-T细胞，并显示出体外和体内对肿瘤细胞的有效抑制增殖和诱导凋亡，同时对正常细胞没有细胞毒性。Li等人报告说，抗Vβ8 CAR-T细胞能够识别并杀死所有由克隆扩增产生的Vβ8+恶性T细胞，同时保留恶性或健康的Vβ8-T细胞，从而实现足够的T细胞介导的细胞免疫。 3.1.3 急性髓系白血病  AML是一种异质性的血液系统恶性肿瘤，是成人最常见的急性白血病形式。它的特点是髓母细胞在外周血、骨髓和/或其他组织中的克隆性扩张。93 在美国，AML的年发病率为每10万人中有4.3例，男性略高于女性。AML占所有亚型白血病死亡的高达62%。94 常规化疗后，年轻成人的复发率为10%至60%，老年人AML的复发率在年轻成人中为10%至60%，在60岁以上人群中为40%至60%，5年患者生存率约为27.4%。Jetani等人开发了一种针对Siglec-6的CAR-T细胞，在临床前模型研究中显示出对白血病有反应，并能在异种AML模型中诱导完全肿瘤缓解。Hebbar等人报告了一种GRP78-CAR-T细胞，在体内对AML有显著的抗白血病活性，且对造血祖细胞无毒性。CLL-1 CAR-T细胞的I期研究显示，完全缓解(CR)/不完全血液学恢复的完全缓解(CRi)率为70%，总生存(OS)率为60%。所有患者都经历了CRS，但没有神经毒性。Sugita等人评估了异基因基因编辑的CAR-T细胞对AML治疗的潜力。UCART123在体内外均有效消除AML，对正常细胞没有显著影响。一项针对自体抗CLL-1 CAR-T细胞的I/II期临床试验显示，在8名复发/难治性AML儿童中，有4人达到了无白血病的形态学状态，没有最小残留疾病，1人达到了CR。Wu等人报告了一项针对AML的抗CD70 CAR-T细胞的临床前研究，显示出与CD70+ AML细胞系共培养时的强细胞毒性和在小鼠模型中的强抗白血病活性。然而，这并没有在体内完全消除白血病。目前，尚未确定AML的理想CAR-T细胞靶标。最近的研究提出了使用单细胞转录组分析来预测在恶性细胞而非健康细胞（包括T细胞）上表达的靶抗原，以开发新的AML治疗CAR-T细胞。利用公开的RNA测序数据，包括来自15名AML患者的超过50万个单细胞和9名健康患者的组织，研究人员计算鉴定了2个潜在的新靶标，CSF1R和CD86。CSF1R-CAR-T和CD86-CAR-T细胞在AML细胞系和人源AML模型中的功能验证试验中显示出强大的疗效。 3.1.4 实体瘤  CAR-T细胞治疗的适应症多样，几乎涵盖了每种肿瘤类型。主要挑战可以概括为三个主要组成部分：识别、迁移和存活。实体瘤抗原异质性阻碍了肿瘤细胞特异性抗原的识别。相比之下，免疫抑制性TME干扰了T细胞的活性，包括分化和耗竭。之前的一项研究表明，抗GPC3-CAR-T细胞在原发性人类肝细胞异种移植模型中有效地抑制并消除了肿瘤。Cao等人开发了一种新型双特异性GPC3-BiTE CAR，与单靶点CAR-T细胞相比，在体外功能分析中显示出更好的抗肿瘤活性，并克服了由抗原异质性引起的肿瘤逃逸。Moghimi等人开发了一种GD2/B7H3 CAR-T细胞模型，证明了在抑制神经母细胞瘤生长和增加体内持久性方面的高特异性。CLDN18.2靶向CAR-T细胞（CT041）在胃肠道癌症中的I期中期试验显示，总响应率和疾病控制率分别为48.6%和73.0%。所有患者都经历了≥3级血液学毒性，没有观察到≥3级CRS或神经毒性。Meister等人开发了一种多功能mRNA基础的CAR-T细胞，显示出对胶质瘤的强烈抗肿瘤活性，在体内外试验中没有显示出毒性。Li等人开发了一种合成锌指转录调节因子，synZiFTR，通过编程药物依赖的、交付后控制体内T细胞抗肿瘤活性，调节CAR-T细胞在异种移植血液肿瘤模型中的体内疗效。他莫昔芬诱导的synZiFTR在体外以剂量和时间依赖性方式调节细胞因子的表达，包括IL-2和IL-12，安全且可控地增强了CAR-T的疗效。随后，Allen等人设计了一种增强型Notch受体包含CAR-T细胞，并表明工程化的synNotch诱导的IL-2电路在局部产生IL-2，推动CAR或TCR T细胞有效地渗透到胰腺癌和黑色素瘤的免疫排斥肿瘤模型中，增强免疫细胞渗透并减少系统毒性。一项临床前研究发现，局部注射靶向间皮素的CAR-T细胞在小鼠中清除了残留的肿瘤组织，没有显著的毒副作用。 3.1.5 心肌纤维化  心血管疾病约占全球所有死亡的31%，几乎所有与心力衰竭相关的心脏病都涉及心肌纤维化。以过量的细胞外基质蛋白沉积为特征的纤维化，是对慢性炎症的基本病理反应，在心血管疾病发展中具有重要的病理生理学意义。心肌纤维化的治疗策略仍处于研究阶段，CAR-T细胞治疗已取得显著进展。Rurik等人开发了一种在体内生成瞬时工程化CAR-T细胞的方法，该方法逆转了纤维化并在体外显著改善了心力衰竭。这不仅为心肌纤维化，也为其他纤维性疾病提供了可能性。然而，需要进一步的研究来验证安全性和有效性。 3.1.6 自身免疫疾病 自身免疫疾病源于免疫系统攻击身体自身的组织，通常被分类为器官特异性或系统性。目前的常规治疗包括非甾体抗炎药、糖皮质激素和疾病修饰性抗风湿药物；然而，彻底消除疾病已被证明是难以捉摸的。CAR修饰的T细胞可以杀死自身免疫疾病中的异常免疫细胞，如B细胞或分泌抗体的浆细胞，提供了潜在的治愈方法。Mougiakakos等人报告了使用自体CD19 CAR-T细胞成功治疗了一名患有严重难治性系统性红斑狼疮（SLE）的患者，该患者出现了活动性狼疮性肾炎，实现了血清学和临床缓解以及SLE疾病活动指数（DAI）评分从基线的16降至随访时的0，没有不良事件。随后，Mackensen等人报告了5名患有难治性SLE的患者接受了CAR-T细胞治疗。所有患者在3个月时实现了SLE缓解，中位SLE DAI评分为0，并实现了无药物缓解，在随访时没有观察到复发；他们也很好地耐受了CAR-T细胞治疗，没有或只有轻微的不良效应。这些数据表明，CD19+ CAR-T细胞移植是可行的、可容忍的，并有效治疗SLE。Müller等人报告了第二种自身免疫疾病通过CAR-T抗合成酶抗体综合征得到了治愈。经过6个月的CART细胞治疗，磁共振成像显示肌炎病变完全消退，肺炎消失，并实现了无药物缓解。目前，缺乏关于CAR-T细胞治疗在自身免疫疾病背景下有效性的全面长期数据。临床应用主要仍处于调查阶段，有限的病例正在进行临床试验，因此需要继续评估安全性和长期结果。尽管如此，这些有希望的结果突出了CAR-T细胞治疗作为自身免疫疾病治愈措施的潜力。 3.1.7 传染病  在传染病中，艾滋病是CAR-T细胞治疗研究的主要焦点。这种疾病没有治愈方法，患者需要终身服药。尽管抗逆转录病毒疗法的出现大大减少了与HIV感染相关的发病率和死亡率，但在潜伏感染的细胞中需要终身坚持治疗的稳定的HIV储库，中断抗逆转录病毒疗法可能导致病毒的快速重新激活。Liu等人开发了一种源自广泛中和抗体的CAR-T细胞治疗，产生针对HIV-1感染细胞的特异性细胞毒性活性，并有效地去除了HIV重新激活的感染CD4+ T淋巴细胞。最近的研究显示，通过外周静脉注射抗HIV duoCAR-T细胞可以定位到人源化小鼠脾脏中的活跃HIV感染部位，并消除了原发性HIV感染的细胞。 3.2 新靶标  目前，CAR-T细胞治疗在AML、HL、T细胞恶性肿瘤和实体瘤方面仍处于研究阶段，除了在B细胞恶性肿瘤方面的成功之外。人们希望新靶标的开发将有助于推进CAR-T细胞治疗在这些疾病治疗中的发展。例如，CD5+ CAR在针对各种T细胞癌症的临床前研究中已经显示出有效性。Feng等人开发了CD5-IL15/IL15sushi CAR-T细胞，这些细胞足以在几周内消除中枢神经系统淋巴细胞，并且患者只经历了短暂的T细胞发育不良事件。这些结果表明，这可能是T细胞恶性肿瘤的安全有效治疗方法，特别是那些涉及中枢神经系统的癌症。表皮生长因子受体（EGFR）在三阴性乳腺癌（TNBC）中高度表达，可能是相关的免疫治疗靶标；针对EGFR的CAR-T细胞在体内外对TNBC显示出强大且特异性的抗肿瘤活性。另一项研究表明，第二代针对EGFR的CAR-T细胞在小鼠中有效地根除了TNBC脑转移并提高了它们的生存率，进一步突出了EGFR作为TNBC治疗的有希望的靶标。单靶点CAR-T细胞通常会遇到诸如抗原逃逸和克隆阴性复发等问题。针对两个或更多肿瘤相关分子的靶向不仅可以防止肿瘤细胞的免疫逃逸，还可以克服实体瘤中的抗原异质性。针对CD19和CD22的双价CD19/CD22-4-1BB CAR-T细胞在20名R/R B-ALL患者的I期剂量递增试验中显示出60%的CR率和80%的骨髓CR率 双特异性CAR-T细胞，靶向BCMA和CD38，在临床试验中显示出87.5%的响应率和81.3%的严格完全缓解率，复发率低且CRS可控。田等人开发了一种BiCisCAR-T细胞系，同时靶向GPC2和CD276，能够通过靶向多种肿瘤相关抗原（TAAs）和实体肿瘤中的抗原异质性来克服神经母细胞瘤中的神经抗原异质性。戴等人表明，CD5/CD7双特异性CAR-T细胞在体外展现出良好的肿瘤杀伤能力和在持续抗原刺激下的增殖。此外，串联双靶向CAR比并行双靶向CAR在活性和防止肿瘤逃逸方面更有效（见图2）。 3.3 新的CAR设计 自杀基因切换可以消除体内的CAR-T细胞并防止潜在的危及生命的不良事件。基因组编辑技术是推动CAR-T细胞治疗进展的重要驱动力。诱导型半胱氨酸蛋白酶9（iC9）是一种自杀基因，可被一种惰性小生物分子AP1903激活。在CAR构建设计中包含iC9可以作为一个有效的安全开关来控制恶性CAR+ B细胞。布尔逻辑门控开关是数学运算符“如果/那么”，“和”，“或”和“非”。在CAR-T细胞设计中使用逻辑门控开关可以进一步控制它们的激活，提高细胞杀伤的特异性，并减少毒性副作用。针对癌胚抗原和间皮素的逻辑门控CAR-T细胞显示出对同时表达两种抗原的肿瘤细胞的特异性毒性，而不会影响单一抗原阳性肿瘤细胞的生长。 图2. CAR-T领域的发展方向（A）B细胞白血病/淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、AML、HL、MM和实体瘤的CAR-T细胞治疗的新靶标；（B）利用自杀或逻辑门控开关改进CAR-T细胞设计，提高其安全性和可控性；（C）CAR-T细胞与免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒或放疗的联合应用；（D）下一代CAR-T细胞，包括通用CAR-T、CAR-NK、CAR-MΦ和CAR-γδ T。AML = 急性髓系白血病，CAR = 嵌合抗原受体，CAR-MΦ = CAR巨噬细胞，HL = 霍奇金淋巴瘤，MM = 多发性骨髓瘤，NK = 自然杀伤细胞，UCAR-T = 通用CAR-T。 3.4 下一代CAR  3.4.1 通用CAR-T  自体CAR-T细胞生产成本高且生产周期长，患者淋巴细胞数量少且功能差；来自健康供体的通用CAR-T（UCAR-T）细胞似乎克服了这些限制，但可能引发移植物抗宿主病（GVHD），并且它们的持久性会被宿主免疫系统干扰。多重基因组CRISPR/Cas9编辑的UCAR-T细胞在体外和动物模型中展现出强大的抗肿瘤活性，与非基因编辑CAR-T细胞相似。CRISPR/Cas9设计的通用CD19/CD22 CAR-T细胞展现出可控的安全特性和卓越的无血细胞减少活性。通用双靶标CAR-T细胞治疗可能为R/R ALL患者提供替代治疗。通过TALEN介导的基因编辑产生的产品可以避免自然杀伤细胞和异体反应T细胞的攻击，并在体外和体内在NK细胞中延长它们的持久性和抗肿瘤活性。 3.4.2 其他可替代细胞  由于以下因素——它们的天然杀伤功能；丰富的来源，如NK92细胞系、脐带血、外周血和诱导多能干细胞；以及不引发GVHD——CAR-NK细胞目前正在被探索。刘等人在11名复发或难治性CD19阳性癌症患者中使用抗CD19 CAR-NK细胞，显示出73%的缓解率和64%的CR率。对于不适合单细胞分离的患者，使用原始人类造血干/祖细胞在体外产生功能性CAR巨噬细胞（CAR-MΦs），具有与CAR-T细胞相同的靶向激活。陈等人随后使用靶向胶质瘤干细胞的CAR-MΦs的局部注射有效地消除肿瘤细胞并抑制术后胶质母细胞瘤复发。γδ T细胞缺乏同种型，可以安全地用于半相合移植，并介导天然的抗肿瘤反应。Rozenbaum等人发现，γδ T细胞的CAR转导效率与标准CAR-T细胞在生产中一样高；在抗肿瘤效果方面，CD19导向的γδ T细胞对CD19阳性和阴性的白血病细胞都有效。 3.5 改变CAR-T细胞的给药计划 3.5.1 优化药物递送  增加单次或多次CAR-T细胞输注的作用持续时间是提高它们持久性的有效方法。李等人开发了一种具有可回收能力的CAR（CARKR-T），并显示出显著抑制CAR下调和增强内化CAR循环至细胞表面，促进长期杀伤能力。CD19 CAR-T细胞治疗在R/R B细胞恶性肿瘤中非常有效，但大多数情况下未能诱导持久反应。第二次输注（CART2）可能会改善结果。与第一次输注相比，第二次输注观察到更高的总响应率、更长的PFS和更低的严重毒性发生率。在R/R B-ALL患者中第二次CAR-T细胞输注对一些患者有益，而在其他患者中，CAR-T细胞扩张减少和抗原下调阻碍了对CART2的有力反应。静脉注射是CAR-T细胞给药的主要方式；然而，这对于治疗实体瘤并不理想。鞘内注射CAR-T细胞可以局部治疗复发性髓母细胞瘤和脑室内脑膜瘤，绕过血脑屏障，在小鼠模型中显示出优越的抗肿瘤效果。Grosskopf等人制造了一种可注射的水凝胶，控制了CAR-T细胞和刺激性细胞因子的共同递送，有效地消除了肿瘤，达到了100%的响应率；它没有引起不良的炎症反应，并且在几周内完全在体内降解。 3.5.2 联合疗法  CAR-T联合疗法将CAR-T细胞治疗与其他选项结合起来，如放疗、化疗、免疫检查点抑制剂和溶瘤病毒，这可以提高其安全性和有效性。放疗和化疗是传统的肿瘤治疗方式。周等人发现，将针对EGFR的CAR-T细胞与放疗相结合，在免疫缺陷的原位TNBC小鼠中有效地增强了免疫功能和抗肿瘤效果。有效的化疗减少改善了高肿瘤负荷的R/R DLBCL患者CAR-T细胞治疗的短期ORR和长期OS，使结果与低肿瘤负荷患者相当。PD-1抑制T细胞在TME中的功能通过PD-1抗体检查点阻断、细胞内PD-1 shRNA阻断或PD-1显性负性受体恢复了CD28 CAR-T细胞的效应功能。同时下调3个抑制性免疫检查点受体——PD-1、Tim-3和Lag-3——在CAR-T细胞中增强了肿瘤浸润和抑制肿瘤生长。地西他滨处理的CAR-T细胞在体内外都表现出增强的抗肿瘤活性和更持久的抗肿瘤潜力。布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是B细胞受体依赖性细胞生长的关键介导因子，在多种B细胞恶性肿瘤中上调。BTK抑制剂（BTKis）在治疗MCL和慢性淋巴细胞性白血病中非常有效。伊布替尼是市场上第一种BKTi产品，与抗CD19 CAR-T细胞联合使用增强了疗效。同时给予CAR-T细胞治疗和伊布替尼导致了比单独CAR-T细胞治疗更高的ORR（83%对56%）。在小鼠实验中，伊布替尼与CD19 CAR-T细胞联合使用有协同效应；小鼠中的CAR-T细胞显著扩张，扩张比例高于单独CAR-T细胞治疗，显著减少了肿瘤负荷。溶瘤病毒疗法是一种新型的癌症治疗方式，使用裂解病毒直接攻击或在感染的癌细胞中表达病毒抗原，导致细胞毒性T细胞的识别和破坏。Evgin等人将CAR-T细胞装载了囊泡性口炎或真兽病毒，用于治疗小鼠模型中的实体瘤。系统递送大大增强了CAR-T细胞治疗黑色素瘤和胶质瘤肿瘤的疗效，并提高了生存率。 4. 结论  总之，CAR-T细胞治疗在血液系统恶性肿瘤中的成功已有充分记录，其在其他疾病领域的潜力也很明显。然而，与治疗相关的毒性反应和复发所带来的挑战需要进一步研究。旨在识别新靶标、改进或设计新的CAR结构、改变给药方法以及探索联合疗法的策略有潜力提高CAR-T细胞的安全性和有效性，同时减少毒性和降低复发率。此外，正在开展对其他免疫细胞疗法的调查，如CAR-NK细胞。未来有望开发出可定制的CAR细胞疗法，用于精确和个性化治疗一系列疾病。 识别微信二维码，添加细胞基因研究圈小编 请注明：姓名+研究方向！ 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(wibplib@126.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。