GSDME

【导读】 在许多肿瘤中，泛素连接酶MDM2的高表达是p53失活的主要原因，使其成为一个有希望的治疗靶点。然而，MDM2抑制剂在临床试验中失败，因为p53诱导的反馈增强了MDM2的表达。因此迫切需要找到一种有效的适应性基因型或靶标组合。 8月30日，中山大学李轩教授团队在期刊《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上发表了研究论文，题为“Synthetic lethality of combined ULK1 defection and p53 restoration induce pyroptosis by directly upregulating GSDME transcription and cleavage activation through ROS/NLRP3 signaling”，本研究中，研究人员通过高通量筛选，确定ULK1是MDM2抑制剂APG115的合成致死基因。结果表明，ULK1的缺失显著增加了敏感性，细胞发生典型的焦亡。在机制上，p53通过直接介导GSDME转录诱导基础水平的焦亡，从而促进焦亡的发生。此外，ULK1缺失减少了线粒体自噬，导致受损线粒体的积累和随后活性氧(ROS)的增加。这反过来又通过NLRP3-Caspase炎症信号轴切割和激活GSDME。另外，铂耐药肿瘤中线粒体自噬增强，ULK1耗竭/p53激活对这些肿瘤具有协同致死作用，直接通过GSDME诱导细胞焦亡。 https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-024-03168-8#Sec24 背景知识 01 肿瘤蛋白p53 (TP53)是细胞命运的核心决定因素，通过直接转录激活调控细胞周期阻滞和程序性细胞死亡途径的激活等细胞过程。在绝大多数肿瘤中P53是无活性的。虽然野生型p53基因在肿瘤中的比例高达50%，但泛素连接酶MDM2通过蛋白酶体途径介导其泛素化及随后的降解，最终导致p53蛋白的功能缺陷。抑制MDM2活性以恢复p53功能被高度期待作为这一野生型肿瘤亚群的临床治疗策略。然而，由于MDM2的反馈激活等机制，现有的MDM2抑制剂的临床应用时间有限，且不良反应较大。临床试验的结果并不令人满意，这凸显了确定辅助治疗靶点以优化治疗策略的迫切需要。 细胞焦亡是一种新发现的不同于细胞凋亡的程序性细胞死亡方式，其发生需要炎症性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)裂解和激活一类GSDM家族蛋白。GSDM裂解释放该蛋白的N末端结构域，导致细胞的裂解性死亡。GSDM家族蛋白的表达是细胞焦亡激活的关键决定因素。以往的研究从多个阶段和多个角度探讨了细胞内GSDM家族基因表达的调控，包括DNA甲基化、转录调控和蛋白质稳定性控制。这些研究结果表明，肿瘤中GSDM家族成员的失活或低表达是促进肿瘤进展和治疗抵抗的关键因素。炎症小体通路的激活是细胞焦亡的重要触发因素。然而，既往的研究主要集中在炎症小体通路在单核巨噬细胞中的作用，其是否参与上皮源性细胞的焦亡尚不清楚。 P53激活联合ULK1缺乏可启动细胞焦亡 02 研究人员进一步研究了为什么MDM2i治疗和ULK1缺乏能有效杀死癌细胞。研究人员先用APG-115预处理ULK1敲除细胞24小时，发现死亡的细胞显示出明显的细胞焦亡形态，有类似囊泡的结构从细胞膜和胞质中向细胞一极聚集。此外，通过流式细胞术检测Annexin V/碘化丙啶(PI)双阳性细胞的比例，发现在用MDM2i处理的ULK1敲除细胞中，双阳性细胞的比例显著快速增加；这种效应与在最初仅Annexin V阳性、然后逐渐变为PI阳性的凋亡细胞中观察到的效应显著不同，这表明在此条件下细胞膜的通透性发生了快速变化。此外，研究人员进行了乳酸脱氢酶(LDH)检测，观察到在用APG-115处理的ULK1敲除细胞中，LDH迅速释放到细胞外。这些结果表明，MDM2抑制剂与ULK1缺乏相结合可导致癌细胞发生强效的细胞焦亡，表现为细胞膜孔形成和细胞肿胀。为了阐明p53激活和ULK1缺乏在诱导细胞焦亡中的不同作用，研究人员在癌细胞中过表达p53或敲除ULK1，并用TNFα+cycloheximide（CHX）处理以诱导经典的细胞焦亡。为了揭示合成致死的潜在机制，研究人员检测了细胞在MDM2i/ULK1耗竭后GSDMs的mRNA表达。研究结果表明，APG-115诱导的p53激活仅显著增加了GSDME的表达水平，而对其他任何GSDM均未观察到类似效应。另外，蛋白质免疫印迹实验分析显示，ULK1敲除增强了GSDME的切割，而GSDMD的切割未显示出显著激活。总之，这些结果表明，p53和ULK1可通过不同的机制调节细胞焦亡，其中p53可能促进GSDME mRNA的转录，而ULK1缺乏则可增强GSDME蛋白的切割和激活，从而分别诱导细胞焦亡。 P53激活与ULK1缺乏相结合可引发细胞焦亡 线粒体自噬功能缺陷与p53激活相结合可用于逆转铂类药物耐药性 03 铂类药物通常被用作治疗实体肿瘤的主要药物，而对这种药物的耐药性是肿瘤复发和转移的主要诱因之一。研究人员已经发现，线粒体自噬在这一过程中扮演着关键角色。为了研究铂类药物耐药的机制并探索可能的治疗策略，研究人员将两个野生型p53细胞系（A549和A2780）用亚致死浓度的铂类药物处理较长时间，从而产生了对铂类药物耐药的细胞系（A549/DDP和A2780/DDP）。随后通过MTT实验确认了耐药程度。随后，通过蛋白质免疫印迹实验分析发现，耐顺铂细胞株中与自噬相关的关键基因表达水平升高，而与细胞焦亡相关的关键基因GSMDE表达水平显著降低。此外，在TNFα + CHX处理24小时后，与敏感细胞相比，耐顺铂细胞中乳酸脱氢酶的释放显著减少，Annexin V/PI双阳性信号显著降低。这些发现表明，在耐顺铂细胞株中，自噬增加，而细胞焦亡受到显著抑制。因此，可以合理地假设，靶向自噬和p53介导的细胞焦亡的联合疗法可能逆转顺铂耐药性。为了验证这一假设，研究人员采用MTT法进行了药物联合试验，结果显示，ULK1敲低联合APG-115治疗可有效诱导耐顺铂细胞死亡。该研究结果表明，线粒体自噬的激活和GSDME表达的降低可能在赋予肿瘤细胞顺铂耐药性方面发挥关键作用。此外，同时使用ULK1抑制剂和激活p53的联合治疗显示出有效消除耐药细胞的潜力，为潜在的临床干预在顺铂耐药患者中的应用提供了理论基础。 研究小结 04 总之，研究人员开发了一种创新的方法，结合MDM2抑制剂治疗，靶向与自噬相关的关键基因，以有效增强细胞焦亡，诱导肿瘤细胞死亡。这种组合疗法的协同作用及其潜在的分子机制的阐明表明，过度激活自噬的癌症对MDM2抑制剂更敏感。 这一发现为激活p53的抗肿瘤疗法开辟了新的途径。此外，本研究 为选择铂类耐药患者的临床治疗策略提供了重要的理论依据。 【参考资料】 https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-024-03168-8#Sec24 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 上海｜09月11日 ▶ 微驭万物-单细胞空间组学技术前沿与临床应用研讨会 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会 点击对应文字 查看详情

引言 免疫治疗已彻底改变了癌症治疗的前景并治愈了一部分难以治疗的癌症。然而，大多低免疫原性肿瘤仍对现有免疫疗法响应率极低。揭示肿瘤免疫逃逸机制有助于高效识别免疫治疗新靶点，扩大可治疗肿瘤的范围。早期肿瘤形成中，肿瘤会编辑其基因表达以逃避免疫监视，该‘肿瘤编辑’过程是塑造肿瘤免疫原性的关键时期【1-3】。新生肿瘤中优先沉默的基因很可能对提升肿瘤免疫原性及诱发有效的抗肿瘤免疫反应起重要作用。探究早期肿瘤编辑优先下调的基因及其表达调控机制将为找到更具抗癌潜力的免疫治疗靶点提供重要指南。然而，肿瘤在被临床检测到前已经历了广泛的编辑，捕获肿瘤编辑早期事件在技术上颇具挑战性。常用的同源移植肿瘤模型中，肿瘤细胞系已在体内被充分编辑过，很难用于早期肿瘤编辑相关研究。由于检测及分离早期肿瘤的难度，新发肿瘤中的基因编辑程序及其作用机制尚不明确。肿瘤编辑的前期研究中，关注点通常局限于活化适应性免疫所需关键基因，如抗原呈递与加工相关基因等的表达调控【4】。其他可能在肿瘤发生初期调控其免疫原性的重要途径，特别是先天免疫途径的活性变化仍然未知。直到最近，尚未有研究在全基因组范围内分析早期肿瘤编辑过程, 并以单细胞分辨率解析该过程中肿瘤细胞及肿瘤浸润淋巴细胞 (Tumor-infiltrating lymphocytes,  TIL) 内的基因表达动态变化。 2024年 8月 21日, 北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心张莹课题组与哈佛大学医学院合作在Nature Immunology 期刊在线发表了题为 Tumor editing suppresses innate and adaptive anti-tumor immunity and is reversed by inhibiting DNA methylation 的研究论文。张莹研究员与Judy Lieberman教授针对该研究的讨论 Emerging tumor repression of immune recognition is reversed by inhibiting DNA methylation 同期发表于Nature Immunology Research Briefing。该研究利用可诱导乳腺癌的转基因小鼠模型收集极早期及晚期肿瘤进行全面的单细胞转录组测序 (scRNA-seq),  揭示了早期肿瘤编辑对肿瘤中关键先天及适应性免疫通路的优先沉默, 对TIL分化、功能及肿瘤-免疫细胞通信的显著影响, 并阐释了DNA去甲基化治疗在逆转肿瘤免疫编辑、促进炎性癌细胞死亡、提升肿瘤免疫原性及抗肿瘤免疫力方面发挥的重要功效。 转基因小鼠肿瘤模型中,  诱导特定组织内致癌基因的表达可在原位引发肿瘤, 肿瘤细胞可特异性表达荧光蛋白以便于早期肿瘤的捕获。相较于依赖细胞系的移植肿瘤, 转基因小鼠肿瘤更接近人类癌症,  通常对免疫治疗不敏感, 是研究早期肿瘤编辑、肿瘤微环境中肿瘤-免疫互作演变及潜在免疫治疗策略的理想严格模型。 本研究中,  作者利用了一种可诱导乳腺癌的转基因小鼠模型 ‘ErbB2Ex16小鼠’, 其可在多西环素(Dox)诱导后在乳腺上皮细胞中特异表达致癌基因Her2的持续激活突变体ErbB2Ex16, 在7-28天内引发侵袭性乳腺癌。乳腺肿瘤的浅表位置使研究者可第一时间探测肿瘤发生并取样。Dox诱导仅一周左右,  研究者即可收集新发早期肿瘤,  并收集诱导一个月左右的晚期肿瘤同时进行scRNA-seq,   分析肿瘤早期发生过程中肿瘤细胞和TIL内全基因组水平的基因表达变化 (图1.A)。结果显示, 晚期肿瘤相较于早期肿瘤主要下调先天及适应性免疫途径相关基因的表达 (图1.B), 而与肿瘤细胞自身存活、增殖及侵袭相关基因的表达变化不大, 提示早期肿瘤编辑主要为免疫编辑。下调基因主要富集在先天免疫途径,   包括I型及II型干扰素 (Interferon,   IFN) 信号传导,   病毒防御反应,   及细胞因子信号通路。晚期肿瘤细胞中下调基因所富集的前20条最显著通路全部为先天免疫途径, 提示其对肿瘤免疫原性有重要影响。肿瘤进展中, 早期肿瘤中初始及效应CD8+ TIL大部分被功能耗竭或耗竭前体CD8+ TIL所取代。同时, 肿瘤细胞与NK或不同CD8+ TIL亚群之间的多种重要通讯, 包括IFN-g及IL-2通路, CD80和LIGHT共刺激信号等抗肿瘤免疫途径均被破坏, 突显了早期肿瘤编辑削弱肿瘤免疫原性的能力。 (Credit: Nature Immunology) 表观遗传修饰是调控肿瘤中基因表达的重要机制, 其中DNA甲基化可抑制多种免疫基因表达【5】。为探究早期肿瘤编辑的作用机制, 研究者利用携带乳腺癌或黑色素瘤的多种自发或同源移植肿瘤小鼠模型, 使用低剂量DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨 (Decitabine,  DAC) 治疗。结果显示DAC可强效抑制肿瘤生长甚至治愈以形成的转基因小鼠肿瘤,  同时高效提升抗肿瘤免疫力, 增加肿瘤微环境中杀伤淋巴细胞的数量及功能, 增加具有更强肿瘤杀伤能力的组织驻留记忆CD8+ TIL【6】及负责抗原交叉呈递激活CD8+ T细胞的经典I型树突细胞【7】的数量, 同时大幅降低髓系抑制性细胞的数量。 进一步研究发现，在携带ErbB2Ex16或4T1原位乳腺癌, 或B16F10黑色素瘤的荷瘤鼠中使用低剂量DAC治疗可显著提升多种先天免疫基因表达, 包括参与炎性细胞死亡、炎性细胞因子及I型干扰素(IFN-I)信号通路的不同关键基因。同时, 研究人员对低剂量DAC处理的乳腺癌细胞系进行转录组测序, 发现DAC主要上调基因表达。令人意想不到的是, DAC上调基因几乎完全富集于能够提升肿瘤免疫原性的免疫相关通路。DAC最显著上调的基因主要富集在IFN 信号转导、 炎症细胞因子及T细胞免疫相关途径、以及炎性细胞死亡途径 (包括细胞焦亡和坏死性凋亡) 。重要的是,  DAC在乳腺癌细胞中上调的基因与转基因小鼠肿瘤从早期向晚期发展过程中下调的基因显著重叠。重叠基因大多是干扰素诱导基因 (Interferon stimulated genes,  ISG) ,  参与所有主要的先天及适应性免疫通路。重叠基因最显著富集的前 22 个GO 通路均为先天免疫途径,  表明优先沉默关键先天免疫途径是免疫编辑降低肿瘤免疫原性的主要方式,   而DNA甲基化是早期肿瘤免疫编辑的重要机制之一。 本研究同时发现,  DAC治疗能在肿瘤内高效激活炎性癌细胞死亡,  包括膜打孔蛋白GSDME介导的细胞焦亡以及RIPK3介导的坏死性凋亡。尽管DAC处理肿瘤细胞中IFN-I信号通路相关基因上调最为显著, 利用DAC 治疗IFN-I受体Ifnr敲除的小鼠并未显著影响其抗肿瘤能力。敲除肿瘤细胞中的Gsdme、Ripk3、或 IFN-I通路关键转录因子Irf3/7均可显著削弱DAC抑制肿瘤生长及激活抗肿瘤免疫力的能力, 表明多种先天免疫通路(干扰素、焦亡和坏死性凋亡)的激活都可作为危险信号招募并激活杀伤淋巴细胞, 诱导有效的抗肿瘤免疫反应并增强免疫系统对肿瘤的控制。 综上, 该研究详细刻画了早期乳腺癌中的肿瘤编辑进程, 揭示了肿瘤编辑对关键先天免疫途径的优先抑制及其在调控肿瘤免疫原性中的重要性, 阐释了DNA甲基化在肿瘤免疫编辑中发挥的关键作用并证明了通过DAC抑制DNA甲基化的抗癌潜能及作用机理。该研究提示, 通过靶向性地表观遗传调控提升肿瘤中关键先天免疫途径的活性有潜力促进肿瘤由“冷”转“热”, 为提升抗肿瘤免疫力及开发高效免疫治疗新策略提供了新思路。 参考文献 1 Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J. & Schreiber, R. D. Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol 3, 991-998 (2002). 2 Dunn, G. P., Old, L. J. & Schreiber, R. D. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting. Immunity 21, 137-148 (2004). 3 Schreiber, R. D., Old, L. J. & Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science 331, 1565-1570 (2011). 4 O'Donnell, J. S., Teng, M. W. L. & Smyth, M. J. Cancer immunoediting and resistance to T cell-based immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol 16, 151-167 (2019). 5 Jung, H. et al. DNA methylation loss promotes immune evasion of tumours with high mutation and copy number load. Nat Commun 10, 4278 (2019). 6 Schenkel, J. M. et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science 346, 98-101 (2014). 7 Bottcher, J. P. & Reis e Sousa, C. The Role of Type 1 Conventional Dendritic Cells in Cancer Immunity. Trends Cancer 4, 784-792 (2018). https://www.nature.com/articles/s41590-024-01932-8 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

细胞焦亡（Pyroptosis）是由Gasdermin（GSDM） 家族蛋白介导的程序性细胞坏死。近年来，大量的研究表明细胞焦亡与多种疾病相关，包括败血症、细菌感染、慢性炎症、自身免疫病、神经退行性疾病以及肿瘤等。前期研究表明，GSDM蛋白的C端对N端的抑制作用使得全长Gasdermin蛋白处于自抑制状态，阻碍其诱导细胞焦亡。因此，在细胞焦亡过程中，Gasdermin蛋白需要被蛋白酶剪切释放其具备打孔活性的N端结构域，再转运至细胞膜形成孔道，导致细胞膜通透性改变，细胞不断吸水胀大，最终引起细胞焦亡。 前期，吴乔课题组在细胞焦亡领域取得了多项研究成果，包括阐明了Tom20感知铁激活的ROS信号促进细胞焦亡抑制黑色素瘤生长的机制（Cell Research，2018，封面文章）；揭示了代谢产物α-KG通过死亡受体DR6激活caspase-8诱导GSDMC依赖的细胞焦亡机制（Cell Research，2021，highlighted in the cover）；发现甘露糖可以通过激活 AMPK，磷酸化GSDME的第6位苏氨酸，阻断caspase-3剪切GSDME，进而抑制细胞焦亡。这一新发现进一步应用于临床，证实了甘露糖可以减轻化疗药物引起的正常组织焦亡所导致的毒副作用（Cell Research，2023，封面文章）。系列研究成果丰富了细胞焦亡的调控网络，为细胞焦亡的临床应用提供了理论依据。 在细胞应激状态下，全长Gasdermin能否直接诱导细胞焦亡以及如何解除自抑制状态并不清楚。邵峰院士课题组早期发现在GSDM-C端和GSDM-N端结合的界面引入氨基酸突变，可以解除Gasdermin的自抑制状态，全长Gasdermin则具备了自主诱导细胞焦亡的能力，首次提示Gasdermin蛋白可以通过不依赖于蛋白酶剪切的方式诱导细胞焦亡（Nature，2016）。 近期，美国吴皓院士课题组在Nature发文，报道了ROS通过诱导全长GSDMD发生棕榈酰化修饰，使其具备了成孔和诱导细胞焦亡的能力（Nature, 2024）。与此同时，邵峰院士团队也在Science 发表文章，揭示了在低等真核生物中两类只含有膜打孔结构域的GSDM蛋白可以分别通过氧化还原调控或配对的分子间相互作用释放其膜打孔活性，从而诱导焦亡（Science, 2024）。这两篇文章进一步证明全长Gasdermin蛋白（如GSDMD）可以通过不依赖于蛋白酶剪切的方式诱导细胞焦亡。 2024年7月12日，吴乔课题组在Nature Cell Biology在线发表文章"Fulllength GSDME mediates pyroptosis independent from cleavage"，从机制上阐释了全长GSDME通过剪切非依赖的方式诱导细胞焦亡的新通路。 研究发现，当细胞被UVC照射后，线粒体发生断裂（mitochondrial fission），导致线粒体ROS（mitoROS）提高，进而触发细胞色素c的过氧化物酶活性，氧化线粒体心磷脂，促进lipid ROS的产生。 Lipid ROS信号被GSDME直接感知，导致GSDME氧化多聚。与此同时，UVC照射导致的DNA损伤激活PARP1产生大量的PAR（Poly(ADP-ribose)）并释放到胞浆，胞浆中的PAR则与PARP5结合，激活 PARP5活性，以此促进其与GSDME结合，诱导GSDME发生PARylation修饰，导致GSDME构象发生改变，解除GSDME-C端对其N端的自抑制状态，进而促进GSDME感知lipid-ROS信号。这两种不同的蛋白修饰协同作用导致了全长GSDME靶向质膜定位并打孔，从而诱导细胞焦亡。 基于这一新发现，作者进一步确定了全长GSDME介导的细胞焦亡不仅仅局限于UVC照射。同时激活PARP的活性和提高lipid ROS水平的药物或者DNA损伤诱导剂和lipid ROS诱导剂联合处理同样能够诱导全长 GSDME 依赖的细胞焦亡。该研究挑战了焦亡诱导需要蛋白酶剪切的传统概念，阐明了全长GSDME不依赖蛋白酶剪切诱导细胞焦亡的新机制及其调控模式，进一步证实了全长GSDME与GSDMD一样可以直接诱导细胞焦亡，为研究细胞焦亡的新范式奠定了理论基础。 全长GSDME通过非剪切方式诱导细胞焦亡的信号网络和调控机制模式图 生命科学学院吴乔教授和陈航姿教授为论文的共同通讯作者，博士后周波、博士生江志洪和硕士生戴梦燃为论文的共同第一作者。 文章链接： https://www.nature.com/articles/s41556-024-01463-2 原文链接： https://life.xmu.edu.cn/info/1045/27831.htm 本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！