NY-ESO-1 x CD19

摘要：嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法已显示出强大的治疗潜力，并成为B细胞恶性肿瘤治疗中的关键组成部分。成功部署CAR-T细胞疗法以治疗血液学和实体瘤癌症，以及其他疾病如自身免疫疾病，取决于有效的CAR-T细胞制造，这不仅影响产品的安全性和有效性，还影响需要的患者的整体可及性。在这篇综述中，我们讨论了自体CAR-T细胞制造的主要工艺参数，以及监管考虑和正在进行的发展，这将使下一代CAR-T细胞疗法成为可能。 1.引言 自2017年美国食品药品监督管理局（FDA）首次批准以来，嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法已成为对抗包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤（MM）在内的B细胞恶性肿瘤的重要武器。迄今为止，已有六种针对CD19或B细胞成熟抗原（BCMA）的产品在美国获得批准，并且有大量正在进行的试验评估针对血液学恶性肿瘤和实体瘤的其他候选产品。此外，CD19 CAR-T细胞疗法最近已应用于自身免疫性疾病的治疗，早期数据显示对系统性红斑狼疮患者的疗效前景看好。成功将CAR-T细胞疗法扩展到实体瘤和癌症以外的疾病高度依赖于CAR-T细胞产品的安全性和有效性。CAR结构设计以及通过工程化CAR-T细胞以促进适应性、持久性和抗肿瘤效果的策略已在几篇最近的综述文章中详细回顾。在这里，我们关注自体CAR-T细胞制造，它通过影响CAR-T细胞产品的表型和功能，在CAR-T细胞疗法的临床影响中发挥关键作用。尽管本综述中讨论的许多方面也适用于同种异体CAR-T细胞的制造，但供体T细胞的工程化或干细胞分化为T细胞产品的工程化存在额外的考虑，这些主题的讨论可以在几篇优秀的文章中找到。由于缺乏完全受控的实验，研究CAR-T细胞制造及其对治疗效果的影响本质上是具有挑战性的。在自体细胞治疗环境中，每个T细胞产品都是独一无二的，供体之间的差异可能非常显著，特别是在接受过血液毒性和淋巴毒性治疗的重度预处理患者的情况下。此外，制造协议因试验而异，通常是专有的，这使得将临床结果的差异归因于特定制造过程的差异变得困难。尽管如此，该领域的经验积累已经确定了与治疗持久反应相关的表型，包括更高比例的原始和/或记忆细胞类型，T细胞表达耗竭标志物的频率较低，调节性T细胞（Treg）含量较低，以及更高的整体增殖潜力。此外，临床证据表明，CAR-T细胞产品的表型也影响患者在输注后经历的毒性反应，突显了能够一致产出具有理想特性的细胞产品的制造过程的重要性。几种FDA批准的CAR-T细胞产品的制造过程已在文献中描述，具有广泛的相似性以及独特的特点（表1）。整个过程包括从白细胞分离产品中分离起始细胞群体，T细胞激活，基因修饰，体外扩增，最终产品配方和产品放行测试（图1）。本综述旨在概述每个关键制造步骤中的工艺参数如何影响最终的细胞产品，并讨论下一代制造策略，这些策略有可能显著改变CAR-T细胞疗法的治疗有效性和患者可及性。 图1. 自体CAR-T细胞制造流程图。自体CAR-T细胞制造通常包括初始细胞分离、T细胞激活、引入CAR转基因（或mRNA）、细胞扩增和最终配方。大多数产品在输注到患者体内之前在床边进行冷冻保存和解冻。传统的制造过程通常涉及1-2周的体外细胞操作和扩增，而简化的制造过程可以将体外周期缩短至24-72小时。然而，由于运输、产品放行测试和患者临床护理考虑所需的时间，实际的静脉至静脉时间可能要长得多。 1.1.选择起始细胞群体 选择CAR-T细胞制造的起始细胞群体是一个早期决策点，对生产过程以及最终产品有显著影响。自体CAR-T细胞制造过程通常从成熟T细胞开始，无论是纯化的还是作为外周血单个核细胞（PBMC）群体的一部分。成熟T细胞从原始（TN）表型分化为干细胞记忆（TSCM）、中央记忆（TCM）、效应记忆（TEM）、效应（TE）和耗竭（TEXH）细胞。此外，T细胞可以被归类为CD8+细胞毒性T细胞、CD4+辅助T细胞和CD4+调节性T细胞（Tregs）。在辅助T细胞类别中，可以进一步识别亚群，如Th1、Th2、Th17和滤泡辅助细胞。T细胞表型的多样性使得起始细胞群体的选择成为CAR-T细胞制造的主要工艺参数。然而，生物学并不是影响起始材料选择的唯一因素，因为患者的临床病史和健康状况也对可以实际获得用于细胞制造的材料施加了实际限制。 CD4+与CD8+ T细胞。CAR-T细胞通过CAR抗原结合直接激活，无需共受体结合到MHC分子。因此，原则上CAR-T细胞功能不需要CD4和CD8分子作为共受体。早期关于CAR-T细胞的发育工作考虑了选择性富集CD8+ T细胞以最大化细胞毒性的优势。然而，CD4+辅助T细胞在促进CD8+ T细胞的效应功能、扩增和持久性方面也发挥着关键作用，并且已经显示肿瘤微环境中CD4+ T细胞的存在导致CD8+细胞毒性T细胞的招募、增殖和功能增加。因此，目前批准的CAR-T细胞产品都包含CD4+和CD8+ T细胞，尽管采用了不同的制造方法。在针对CD19的CAR-T细胞产品中，tisagenlecleucel（tisa-cel）、axicabtagene ciloleucel（axi-cel）和brexucabtagene autoleucel（brexu-cel）都使用混合的CD4+和CD8+ T细胞。相比之下，lisocabtagene maraleucel（liso-cel）由两种不同的细胞产品组成——分别从CD4+和CD8+起始细胞群体中制造——在给药前混合。这种更复杂的制造过程是出于临床前研究的动机，这些研究表明定义的CD4:CD8比例可能带来优越的抗肿瘤效果，尽管需要更广泛和更长期的数据收集来明确liso-cel与其他产品在疗效和安全性方面的明显区别。细胞分离通常通过基于磁珠的细胞分选来实现。可以通过耗尽非T细胞或使用CD4-和CD8结合微珠的组合进行正向选择来分离CD4+和CD8+细胞的混合物。分离混合T细胞群体的过程相对简化，并且与并行制造单独的CD4+和CD8+细胞培养相比成本较低，但它排除了在最终产品中精确控制CD4:CD8比例的可能性。或者，可以单独分离和培养CD4+和CD8+ T细胞，允许制定具有精确CD4:CD8比例的最终产品。然而，这种方法的成本是增加了制造的劳动、时间和成本。此外，最佳的CD8+ T细胞扩增需要CD4+ T细胞的存在，这使得单独制造CD8+ T细胞容易生产失败。解决这一挑战的潜在解决方案是单独分离CD4+和CD8+ T细胞，但在定义的起始比例下共培养，旨在产生具有大约所需CD4:CD8 T细胞比例的最终细胞产品。这种策略已被证明可以克服CD8+ T细胞扩增的困难，与单独培养的CD4+和CD8+ T细胞相比，在小鼠中产生具有增加的细胞毒性功能的产品的。然而，这种“定义”的制造方法不能完全防止制造失败。重要的是，产生所需最终比例所需的起始CD4:CD8比例可能因供体而异，因此通过这种方法精确的产品概况仍然具有挑战性。T细胞分化状态。除了CD4:CD8比例之外，T细胞产品的分化状态已被证明与抗肿瘤效果相关。在抗原刺激下，T细胞经历克隆扩增，并且一部分分化为TE细胞，这些细胞具有很强的细胞毒性和细胞因子产生能力，但相对短命，相比之下，一部分激活的T细胞成为记忆T细胞，这些细胞寿命长，并且能够迅速激活以响应二次抗原挑战。与终末分化的TE细胞相比，TN、TSCM和TCM细胞具有更大的长期持久性潜力，并且产生较低水平的炎症细胞因子，这可能共同实现持久的抗肿瘤反应，同时避免严重的急性毒性，如细胞因子释放综合征。这些发现支持了探索以富集原始和记忆T细胞开始的制造过程，早期证据表明这种产品可以实现强大的效果与有利的安全性概况。CD45RA、CD45RO、CD62L和CCR7的表面表达通常用于识别T细胞亚型，并且可以通过选择CD62L+细胞从白细胞分离产品中分离出原始和记忆T细胞。然而，CD62L+选择可能同时导致CD14+髓样细胞和CD25+调节性T细胞的意外富集，它们也表达CD62L。已经显示髓样细胞显著降低T细胞激活和随后病毒转导的效率，可能是由于吞噬用于激活T细胞的抗CD3/CD28磁珠。此外，CAR-T产品中调节性T细胞的存在已被报道与较差的抗肿瘤效果相关。这些发现表明，CAR-T产品可能受益于在富集CD62L+细胞之前耗尽CD14+和CD25+细胞类型，并且在多个临床试验中评估了使用CD14−/CD25−/CD62L+细胞作为CAR-T细胞制造起始材料（例如，NCT02208362和NCT04007029）。 出人意料的是，一项试验（NCT04007029）的数据显示，在CD62L富集之前未耗尽CD14+和CD25+细胞的起始群体制造的CAR-T细胞产品与从CD14/CD25耗尽的起始群体制造的产品在激活水平、转导效率、扩增和最终CD3+纯度水平上具有相似的水平。从非CD14/CD25耗尽的细胞制造的产品在细胞制造结束时显示出CD4+ T细胞的明显富集，但在这项1期试验的少数患者中，从CD14/CD25耗尽或非耗尽起始细胞群体制造的细胞产品在治疗效果上没有显著差异。值得注意的是，这次特定临床试验中使用的细胞制造过程采用了聚合物纳米基质T细胞刺激剂，而不是基于磁珠的激活试剂，并且髓样细胞对不同大小和刚性的激活试剂的不同吞噬反应可能在最终细胞产品的行为中起了关键作用。接下来我们讨论CAR-T细胞制造过程中激活步骤的重要性。 1.2.T细胞激活方法 T细胞激活对细胞制造过程的成功至关重要，因为它直接影响CAR转基因整合的效率（在下一部分讨论）以及体外培养期间T细胞的扩增。T细胞激活最常通过刺激CD3和CD28结合细胞因子支持来实现。CD3信号（信号1）触发T细胞激活，而CD28信号提供必要的共刺激（信号2）以避免无反应性。此外，细胞因子混合物（信号3）——通常是IL-2、IL-7和/或IL-15——用于支持T细胞扩增。目前，制造协议通常使用涂有抗CD3和抗CD28抗体的磁珠或胶体聚合物纳米基质来提供信号1和2。磁珠提供模仿目标细胞呈递肽-MHC复合物和共刺激配体以供T细胞结合的实体支持，并且抗CD3/CD28珠子可以同时作为基于磁力的细胞分选的T细胞分离剂。然而，磁珠容易被髓样细胞吞噬，因此使用抗CD3/CD28珠子的细胞分选存在富集CD14+细胞的风险，同时减少了可用于刺激T细胞的激活试剂的数量。此外，在重新输注之前，需要通过磁珠分离去除珠子步骤以产生纯化的CAR-T细胞产品。相比之下，胶体聚合物纳米基质似乎不太可能被髓样细胞清除，并且可以通过简单的离心去除。然而，尚未报告这些试剂的直接比较，以严格比较产生的细胞产品。无论格式如何，商业上可用的激活剂是以固定的珠子：细胞比例或每体积稀释比例应用的标准产品。最近的开发探索了为每个单独的产品量身定制的个性化T细胞激活试剂的可能性，基于患者的疾病类型。例如，Mooney及其同事利用涂有脂质双层的介孔硅微棒，开发了APC模拟支架，不仅可以提供抗CD3和-CD28信号，还可以实现IL-2的持续释放。可以精确调节抗CD3和-CD28抗体的密度，以提供最佳的激活强度，以最大化T细胞适应性。实施精细调整的、高度个性化的试剂必须与生产吞吐量和过程稳健性的实际情况相平衡。然而，“智能”材料的出现，可以根据不同的产品需求进行调整，可以显著扩大制造过程的灵活性和质量。应该指出的是，尽管T细胞激活是当今CAR-T细胞制造中不可或缺的一步，但下一代制造过程正在考虑消除T细胞激活的可能性。例如，最近的一份报告描述了通过慢病毒载体成功转导非激活T细胞。接下来，我们讨论CAR转基因引入的各种方法，包括病毒和非病毒方法。 1.3.引入CAR转基因 CAR转基因传递方法可以显著影响CAR转基因表达水平以及基因毒性，这反过来影响最终CAR-T细胞产品的安全性和有效性。在这一部分中，我们广泛评估了CAR-T细胞制造的病毒和非病毒基因传递方法。病毒基因传递。目前，所有FDA批准的CAR-T细胞产品使用慢病毒或逆转录病毒转导来实现CAR转基因整合（表1）。病毒转导的好处是相对较高的整合效率，并且表达稳定整合的CAR结构的T细胞已被证明在T细胞输注后可以持续>10年。然而，病毒整合的转基因缺乏插入位点特异性，存在插入性突变的理论风险。一项全基因组分析研究比较了使用γ-逆转录病毒载体与慢病毒载体制造的CAR-T细胞产品的转基因整合位点，结果表明慢病毒载体更有可能整合到内含子和基因间区域，与逆转录病毒相比；相比之下，逆转录病毒更频繁地整合到启动子、非翻译区和外显子区域，从而对mRNA转录水平产生更大的影响。值得注意的是，迄今为止没有报告过病毒整合导致CAR-T细胞致癌转化的实例。相反，一份病例研究报告了一名患者，其对CD19 CAR-T细胞疗法的反应似乎与单个CAR-T细胞克隆的扩增相关，其CAR转基因随机插入到TET2位点，从而敲除了唯一的功能性TET2副本，因为患者另一个TET2等位基因有先天性错义突变。 同样，CD22 CAR-T细胞的一个副本在CBL基因位点整合的原病毒被发现在治疗B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）患者的残留疾病之前戏剧性地扩增。尽管这些案例表明随机插入可能偶然导致积极的治疗效果，但插入到不良位点的风险仍然是探索替代转基因整合策略的动力，这些策略可以确保位点特异性。除了整合位点的考虑外，病毒载体还以复制能力的形式呈现另一种潜在风险，即逆转录病毒（RCR）和慢病毒（RCL）。因此，FDA要求对病毒载体以及病毒转导的细胞产品进行RCR/RCL检测。然而，迄今为止在临床CAR-T细胞产品中没有检测到RCR和RCL的报告，RCR/RCL检测的成本和潜在延迟与此类检测的实际效益之间的平衡仍然是积极的科学探索主题。尽管病毒转导原则上可以实现高转导效率，但在患者细胞产品中实现一致的转基因整合水平存在技术挑战。事实上，10%或更低的CAR阳性——基于转导细胞将在体内抗原暴露后扩增的前提设定的水平——在临床试验中使用的细胞产品中作为转导效率的最低阈值并不少见。为了最小化因转基因表达不佳而导致的制造失败风险，制造协议可以包含使用转导增强剂，如鱼精蛋白硫酸盐、肝素结合蛋白和Poloxamer。病毒转导的限速步骤是病毒颗粒最初附着在细胞膜上，这一过程可以通过使用肝素结合蛋白促进逆转录病毒转导，以及使用鱼精蛋白硫酸盐等阳离子聚合物促进慢病毒转导。阳离子聚合物作为静电桥，将病毒与细胞表面连接起来。然而，鱼精蛋白硫酸盐对T细胞的毒性与增加转导效率的好处形成了平衡。相比之下，肝素结合蛋白不会导致T细胞毒性，但其使用仅限于逆转录病毒载体。已经开发出了毒性剖面更有利的专有转导增强剂，尽管它们的高成本和专有访问可能成为广泛使用的障碍。除了病毒转导的生物学特性外，实际考虑也影响病毒在CAR-T细胞制造中的使用。能够生产临床级病毒的认证设施数量仍然有限。因此，病毒生产所需的时间和财务成本可能在研究性药物开发和商业CAR-T细胞制造中造成瓶颈，这突显了替代的非病毒递送系统的吸引力，这些系统可能更灵活、成本效益更高。非病毒基因递送。在CAR-T细胞制造的背景下探索了几种不同的非病毒基因递送方法，包括CRISPR/Cas9、转座子和mRNA转染。CRISPR/Cas9作为一种高效的基因组修饰方法得到了广泛采用，其增强CAR-T细胞疗法的潜力并未被忽视。为了实现位点特异性基因修饰，Cas9核酸酶与单导向RNA（sgRNA）复合，通过与sgRNA的序列互补性识别基因组DNA上的靶位点，并引入双链DNA断裂。接下来，通过编码所需转基因（例如，CAR）的DNA模板和基因组切割位点之间的同源重组促进转基因插入。指定转基因整合位点的能力为工程化T细胞提供了新的可能，以实现所需的功能。已经计算识别并通过实验测试了许多外源“安全港”位点，以支持T细胞的精确遗传修饰以实现治疗功能。特别是，已经显示CAR转基因可以有效地整合到编码内源性TCR α链的TRAC位点，使用腺相关病毒载体作为同源定向修复模板。这种策略指挥内源性基因调控机制，这些机制动态控制TCR表达水平以响应T细胞激活状态，数据表明，由此产生的CAR-T细胞可能比病毒整合的CAR-T细胞更有效。此外，基于非病毒CRISPR/Cas9的基因编辑策略也已用于替换内源性TCR与肿瘤特异性TCR，使得可以开发高度个性化的T细胞疗法。作为另一个例子，上述涉及TET2突变的案例研究激发了随后对故意将CAR转基因整合到TET2位点的评估，作为增强CAR-T细胞增殖和持久性的一种手段。有趣的是，结果显示TET2中断对体内抗肿瘤效果的益处随着表达的特定CAR结构而变化，与将CAR整合到TRAC位点的类似发现相呼应，并强调了为CAR转基因确定最佳整合位点的非平凡性质。除了促进位点特异性转基因整合外，CRISPR/Cas9还与病毒整合结合使用，以敲除不良内源性基因，同时非位点特异性地整合编码肿瘤靶向受体的转基因。例如，第一个FDA批准的涉及CRISPR/Cas9编辑的T细胞的临床试验使用了一种制造过程，该过程使用CRISPR/Cas9敲除了PD-1和内源性TCR，同时慢病毒整合了针对NY-ESO-1的转基因TCR。值得注意的是，观察到输注后PDCD1位点突变的NY-ESO TCR表达细胞的频率随时间减少，这表明PD-1编辑的T细胞可能缺乏形成长期记忆的能力。在另一项1期临床研究中，CRISPR/Cas9被用来敲除PD-1和TCR α链，而间皮素靶向CAR被慢病毒整合。 尽管这两项研究都显示出可接受的安全性概况，但都没有在疗效上取得显著改善，这突显了持续改进的必要性。此外，CRISPR/Cas9介导的双链DNA断裂存在产生非预期基因组变化的非平凡风险，需要仔细分析和质量控制，最近的一项研究揭示了Cas9工程CAR-T细胞中染色体丢失的潜力。有趣的是，同一研究发现操作的特定顺序影响了染色体丢失的频率，如果在T细胞激活之前执行Cas9介导的双链断裂，可以减少染色体丢失。作为CRISPR/Cas9的替代方案，转座子也被用来实现稳定的CAR转基因整合到T细胞产品中。特别是，piggyBac和Sleeping Beauty（SB）转座子系统已在临床环境中进行了评估。转座子系统执行“剪切和粘贴”过程，其中转座酶与目标基因元素（即转座子）两侧的末端反向重复序列结合，通过双链DNA断裂切除转座子，并重新整合转座子到合适的基因组位点（例如，SB转座子的情况下由AT二核苷酸组成的回文序列）。通过这种方式的转基因整合不是位点特异性的，并且已报道piggyBac转座酶表现出优先插入到转录起始位点，类似于逆转录病毒，再次提出了插入性突变的潜在风险。在1期临床试验中，两名接受使用piggyBac转座子系统生成的同种异体CD19 CAR-T细胞产品治疗的患者发展出CAR-T细胞衍生的淋巴瘤，导致一人死亡。事后分析表明，恶性CAR-T细胞没有包含已知致癌位点的转基因插入，但显示出多个染色体的显著拷贝数增加和丢失以及转基因启动子的转录读取。重要的是，导致恶性转化的产品具有异常高的载体拷贝数（VCN），其中一个产品的VCN为25。相比之下，在没有产品特定理由的情况下，FDA推荐的病毒转导细胞产品的上限是每个转导细胞五个拷贝。消除致癌插入风险的一种策略是避免稳定整合编码CAR的转基因，而是从mRNA模板短暂表达CAR。除了消除基因毒性的风险外，作为减少潜在毒性的手段，也探索了从mRNA短暂表达CAR，特别是当CAR针对的抗原也存在于健康组织时。转基因编码的mRNA模板通常通过电穿孔传递到T细胞中，转基因表达持续约1周，电穿孔后每天表达水平下降。因此，短暂基因表达的潜在安全优势必须与治疗的短暂性质相平衡。临床评估表明，mRNA编码的CAR-T细胞是安全的，并且可以表现出抗肿瘤效果，但实现完全和持久的肿瘤控制仍然是一个研究领域。 1.4.体外细胞扩增 一旦T细胞被修饰以表达CAR转基因，产品必须扩增到足够大的数量以满足给药所需的剂量。这个扩增期的持续时间在不同的协议中有所不同，但典型的过程从T细胞激活到细胞收获大约持续1-2周。扩增条件针对T细胞生长进行了优化，有如IL-2、IL-7和/或IL-15等细胞因子支持。尽管扩增期的主要目的是增加T细胞数量，但它也通过将非T细胞暴露在对其他细胞类型次优的培养条件下来消除它们，从而即使制造过程从混合PBMCs开始，也能产生高度富集的T细胞产品。除了细胞因子外，如FBS等培养补充剂也在支持T细胞扩增中发挥关键作用，尽管定义的培养基组成正在迅速取代如FBS等成分，以实现更精确的配方和降低人畜共患病病原体的风险。最后，最近的研究探索了使用各种药理学补充剂来促进理想的T细胞表型，并增强最终CAR-T细胞产品的治疗效果。例如，酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼已在CAR-T细胞制造中使用，以抑制CAR张力信号（即在缺乏抗原刺激的情况下的受体信号），从而防止T细胞过早耗竭并增加CAR-T细胞功能。这种策略被用来生产GD2靶向CAR-T细胞——已知它们会强烈张力信号并倾向于耗竭——用于1期试验，早期结果表明在多名带有H3K27M突变的弥漫性中线胶质瘤患者中显著改善。由于这项试验的每个入组患者都接受了多次CAR-T细胞剂量，关于达沙替尼是否防止了耗竭和/或实现了持续的T细胞功能的明确结论仍然难以捉摸。然而，这个例子证明了药理学调节CAR-T细胞制造过程以产生功能性CAR-T细胞产品用于临床转化的可行性。 1.5.产品放行测试 利用CAR-T细胞在2017年治疗血液学恶性肿瘤方面的开创性成功，全球有1000多项活跃的CAR-T细胞临床试验正在进行中，主要集中在北美和欧亚大陆。这种临床研究的激增完善了我们对成功的CAR-T细胞产品相关参数的理解。与任何提议的治疗方法一样，寻求临床评估的CAR-T细胞必须满足与安全性、纯度、效力、身份和稳定性相关的明确产品特征。所有FDA批准的CAR-T细胞产品使用以下度量的组合来衡量下面加粗的产品特征： • 安全性：支原体、无菌性、内毒素、残留病毒剂定量、存活率和CAR转基因定量 • 纯度：T细胞纯度、存活率、残留试剂定量、转导效率和污染肿瘤细胞的存在 • 效力：转导效力、存活率、CAR表达、抗原刺激后的细胞毒性或细胞因子（例如，IFN-γ）产生 • 身份：CAR表达、外观、清晰度、剂量和存活率 • 稳定性：配方、运输和储存。FDA最近起草了CAR-T细胞产品的标准化期望。特别是，早期阶段研究性新药申请提交的批量放行标准不要求验证效力检测和规格，但在生成支持生物制品许可申请的数据时必须包括这些检测。基于正在进行的临床试验和现实世界经验的累积数据，还提出了额外的参数，以推动未来开发更可重复、有效和安全的治疗方法。例如，鉴于有证据表明具有较少分化、更类似记忆表型的CAR-T产品具有实现持久肿瘤清除的更大潜力，未来的商业产品可能从设定一个效力特征度量中受益，该度量指定了产品中有利T细胞亚群的比例。然而，改变和收紧产品规格必须以严格的科学证据和基本生物学理解为指导，以避免触发可能导致患者无法获得治疗的不必要的制造失败。在某些产品失败的实例中，涉及非生命威胁性的批量放行标准（例如，剂量、转导效力、细胞因子产生水平或CAR表达），在获得必要的监管批准后，可以向患者施用超标规格产品。在扩大获取协议中，患者接受了超标规格的商业和临床试验产品，并经历了与接受标准产品治疗的患者相似的临床结果。在现实世界环境中与CAR-T细胞产品的累积临床经验将对理解真正影响患者安全和治疗效果的产品特征非常有价值，并可能作为进一步改进CAR-T细胞产品放行测试监管指南的指南。 1.6.下一代CAR-T细胞制造策略 到目前为止讨论的制造策略已经支持了多个CAR-T细胞产品的开发，并能够展示CAR-T细胞疗法的潜力，以克服晚期恶性肿瘤。然而，FDA批准后与CAR-T细胞疗法的真实世界经验也突显了传统细胞制造过程的局限性，这些过程产量低且资源密集，导致患者对潜在的救命疗法的访问受到限制。截至2023年初，90%的MM患者经历疾病进展，25%的患者在接受BCMA导向CAR-T细胞产品插槽的等待名单上死亡，等待时间从1到10个月不等，然后进行白细胞分离。在白细胞分离后，细胞必须经过往返制造地点的运输、体外修改和扩增以及严格的质量控制测试。大多数患者在细胞制造期间需要桥接治疗以对抗进一步的临床恶化，这可能导致在接受桥接治疗的患者中进一步延迟输注。即使在没有静脉至静脉时间的医疗并发症的情况下，也有4-7%的患者因制造失败而无法接受他们的CAR-T细胞产品，风险因素包括患者T细胞在多次治疗后的适应性降低和漫长的制造过程本身。制造失败后的治疗选择包括重复白细胞分离或过渡到替代疗法，尽管在这两种情况下生存结果都很差。总的来说，导致生命丧失的多重延迟来源强调了及时获得CAR-T细胞产品的重要性。在这里，我们讨论正在开发的下一代策略，以应对CAR-T细胞制造中的关键挑战（表2）。 加速细胞制造。为了应对CAR-T细胞制造中的这些挑战，已经开发了新策略，以大幅减少细胞制造的持续时间，从而降低生产成本、制造失败的可能性和静脉至静脉时间。这些下一代制造过程可以在至少24小时内完成最终产品配方，提供了显著加速患者获得治疗的可能性。大部分节省时间的结果是显著缩短体外扩增期，从而限制了可以实现的细胞计数增加倍数。然而，减少的体外细胞分裂次数也可能导致较少分化的T细胞群体，这些细胞在输注后具有更大的长期增殖潜力。事实上，早期结果表明，在早期时间点收获的产品显示出更大比例的TCM细胞（CD45RO+CD62L+）和TN/TSCM细胞（CD45RO−/CCR7+），据报道这些细胞表现出治疗上有利的表型和功能。使用加速制造生产的CAR-T细胞产品的一个例子是CD19导向的YTB323细胞，使用“T-Charge”平台制造，该平台在体外培养中需要不到2天。 YTB323细胞据报道富集了TN和TSCM细胞，以及与白细胞分离材料中发现的更相似的CD4:CD8比例，与传统CAR-T细胞制造过程生产的等效产品相比。值得注意的是，2期试验的初步结果表明，YTB323可以在复发/难治性弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者中产生与tisa-cel相当的疗效，但剂量低25倍，这表明减少的体外培养时间可能产生了功能上更优越的产品。另一个例子是使用相同的T-Charge平台生产的BCMA导向PHE885细胞，在1期试验中为复发/难治性MM患者实现了98%的总响应率。值得注意的是，在输注后6个月，93%（13/14）的患者和12个月时71%（5/7）的患者可以检测到CAR-T细胞，表明在体内T细胞持久性良好。另一个称为FasT CAR-T的加速制造平台，已被用于为B-ALL患者生成“CD19 F-CAR-T”细胞，其中92%（23/25）的患者实现了最小残留病阴性完全反应。在这项试验中，大多数（20/25）患者随后进行了同种异体造血干细胞移植，因此无法评估对CAR-T细胞治疗的长期持久反应。随着多项试验的临床数据不断成熟，通过不同制造平台生成的CAR-T细胞产品诱导的相对持久反应将是一个重要的关注点。与加速细胞制造过程相关的理论担忧是，体外激活后不久冷冻保存的CAR-T细胞可能表现出过度刺激的表型。此外，特别是在血液恶性肿瘤的背景下，高度简化的制造过程的产品增加了包含肿瘤细胞的可能性，在长时间的体外培养期间，在优化T细胞生长的条件下，这些肿瘤细胞本可以被耗尽。然而，现有的临床数据表明，通过这些缩短的协议生产的CAR-T细胞产品的安全性概况在临床上仍然可以管理。YTB323治疗DLBCL的1期研究结果显示，33%（15/45）的患者经历了CRS，其中一例为4级事件，11%（5/45）的患者经历了免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），其中两例为3级事件。在B-ALL患者中，CD19 F-CAR-T细胞表现出更大的毒性，CRS的发生率增加了三倍（96%总体；24% 3级或以上）和ICANS的发生率翻倍（28%，全部3级或以上）。25名患者中有21名在CRS发作期间需要使用干预性皮质类固醇，尽管治疗没有消除CAR-T细胞的峰值扩增。正在进行的临床试验的额外数据将在建立我们对通过不同平台生产的CAR-T细胞产品之间的生物学差异的理解方面非常有启发性。最后，重要的是要注意，产品放行测试的监管要求仍然适用于使用加速过程生产的产品的放行测试，因此在估计静脉至静脉时间时，仍然需要考虑此类放行测试所需的时间。过程自动化。另一种可能改善商业CAR-T细胞生产的途径涉及制造过程的自动化，这有可能降低生产成本、因人为错误导致的制造失败的可能性，以及通过接触点的污染。在某些司法管辖区（例如，美国），一些自动化系统被认为是完全封闭的，并允许在不符合良好生产规范标准的设施之外运行。此外，自动化可以显著减少制造人员的数量和经验水平要求。这些因素反过来支持现场制造的可能性，为患者提供新鲜的、非冷冻保存的产品。在非霍奇金淋巴瘤患者的1期试验中，患者接受了CD19/CD20双特异性CAR-T细胞，这些细胞要么是新鲜的，要么是从冷冻保存的等份中解冻的，早期数据显示新鲜CAR-T细胞产品的存活率更高（新鲜93%对冷冻保存63%）。对试验的后续报告证实，接受新鲜CAR-T细胞产品治疗的患者经历了更高的完全反应率（新鲜80%对冷冻保存29%），以及与接受冷冻保存CAR-T细胞治疗的患者相比，更大的CAR-T细胞扩增和持久性。尽管改进的细胞冷冻保存程序可能会减少新鲜和冷冻保存CAR-T细胞产品之间观察到的效力差异，但这些结果突出了现场细胞制造的潜在优势。然而，将这种做法扩展到大量医疗中心的同时确保一致的产品质量问题仍然是一个关键挑战。重要的是，需要进行几项监管变更以允许点对点护理CAR-T细胞制造，全球各司法管辖区之间的差异在实际实施现场细胞制造方面代表了重大障碍。此外，使用新鲜细胞产品排除了需要长时间孵化的放行测试的完成，需要依赖过程样品测试以及在细胞产品已经输注后收到失败的无菌性或其他测试结果的情况的应急临床管理计划。此外，新鲜产品的管理提出了重大的后勤挑战，因为它需要在细胞制造和患者准备接受细胞输注之间进行密切的时间协调。最后，自动化系统的高度标准化性质在需要根据每个患者调整最佳过程参数设置时可能会带来挑战。例如，不同患者的细胞可能有不同的扩增率，因此每天维持培养中适当细胞密度所需的培养基量在制造活动中可能有很大差异。为了实现最佳结果，仪器需要配备感应关键参数并相应做出反应的能力。 体内细胞制造。展望更远的未来，下一代制造过程可能会完全消除体外细胞操作和扩增，而是在体内产生治疗性细胞群。几项临床前研究已经证明了使用慢病毒或腺相关病毒在体内转导T细胞的能力。此外，已经证明脂质纳米颗粒（LNPs）和聚合物纳米载体能够在体内向T细胞传递核酸有效载荷。为了实现T细胞靶向，病毒颗粒、LNPs和纳米载体通常用单链可变片段或其他靶向CD3、CD4或CD8的结合域进行修饰。然而，对T细胞靶向的特异性可能不需要绝对，并且可以考虑同时产生CAR-T细胞、CAR-自然杀伤细胞和CAR-巨噬细胞的潜在优势。尽管如此，确保转基因没有传递到恶性细胞中仍然至关重要，因为这样的整合事件可能导致CAR蛋白掩盖目标抗原，并保护肿瘤细胞不受表达CAR的效应细胞的检测。此外，在能够实现稳定转基因整合的病毒载体的情况下，非靶向基因传递增加了基因毒性的风险。在实际应用中，将转基因传递工具特异性地靶向T细胞，以及在没有外部T细胞激活的情况下促进有效转基因整合的策略，可能对于产生能够有效剂量的CAR-T细胞以实现持久的抗肿瘤效果是必要的。最后，在体内CAR-T细胞制造平台的临床转化之前，将需要进行深入的药代动力学和安全性验证。尽管仍然存在许多障碍，但绕过体外细胞制造的能力有潜力显著降低成本，并增加需要这种治疗选择的患者对CAR-T细胞治疗的访问。 2.结论 CAR-T细胞治疗已成为血液恶性肿瘤的越来越重要的治疗选择，临床试验不断扩大CAR-T细胞治疗在实体瘤治疗和自身免疫疾病治疗中的应用。因此，能够高效可靠地生产高质量细胞产品的CAR-T细胞制造过程对于支持及时、安全和有效的患者护理至关重要。累积的临床经验、现实世界制造数据收集、自动化系统工程的进步，以及对T细胞生物学的基本理解，在不断改进自体CAR-T细胞制造过程中都发挥着关键作用。此外，涉及额外免疫效应细胞类型以及来自干细胞群体的T细胞的同种异体细胞治疗的快速发展，在未来几年将继续是引人入胜的科学问题和实际工程挑战的源泉。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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摘要：过继免疫治疗使用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞是一种新的治疗范式，它使用一类新的治疗“药物”在某些迄今为止难以治疗的B细胞恶性肿瘤患者中产生完全且持久的缓解。CAR T细胞源自患者自身的免疫细胞，这些细胞在体外通过基因工程改造，带有能够结合特定目标并在目标结合时传递激活信号的CAR。CAR激活细胞毒性T细胞以有效、重复和持久的方式破坏和消除识别的癌细胞。然而，各种障碍限制了CAR T细胞在其他类型的癌症或其他疾病中的广泛应用。目前的挑战包括设计最优的CAR、积极穿透肿瘤病变，并在不诱导对健康组织产生毒性的情况下维持T细胞的抗肿瘤激活。本章回顾了CAR的代际、增强CAR T细胞效力和选择性的策略，以及为日益增多的患者建立高效的制造流程。 1.原型嵌合抗原受体（CAR，T-Body，免疫受体） 在20世纪80年代中期，Steven A. Rosenberg（美国国立卫生研究院）将从黑色素瘤活检中分离并大量体外扩增的肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）重新注入黑色素瘤患者体内时，患者T细胞识别和有效摧毁癌细胞的能力变得显而易见。这些以及随后的发展促使了采用自体免疫细胞治疗肿瘤患者的概念，这些免疫细胞有能力在大量患者中诱导肿瘤退缩和长期缓解。这些扩增的TILs被认为对特定肿瘤抗原具有特异性，并具有迁移能力以进入肿瘤病变；然而，抗原特异性大多仍然未知。 接下来的几年中，为了给患者的T细胞提供明确的靶向特异性，人们付出了巨大的努力；与T细胞受体（TCR）链或重组嵌合抗原受体（CAR）的遗传工程化，证明是成功的策略之一。与TCR不同，CAR是一个复合的、单多肽链跨膜受体，它在目标识别时提供靶向特异性和T细胞激活能力。原型CAR由四个主要结构域模块化组成：在细胞外末端是用于目标识别的单链可变区（scFv）抗体，一个连接到跨膜结构域的间隔区，以及主要来自TCR/CD3ζ或Fcε受体I（FcεRI）的细胞内信号传导结构域，有或没有连接的共刺激结构域（图1）。目标细胞表面的同源抗原的参与启动了CAR工程化免疫细胞的激活，导致持久的T细胞反应。每个CAR结构域都有独特的功能，并对重定向的T细胞激活产生影响；对于每个特定应用，CAR设计需要进行一些调整，以提供优化的靶向和T细胞激活，如下文详细描述。 图1 嵌合抗原受体（CARs）的世界在不断增长。第一代CAR在细胞外域（外域）中拥有抗原结合和间隔基团，在跨膜域中，在细胞内域（内域）中拥有来自CD3ζ或FcεRI γ链的激活基团。第二代CAR除了拥有一个共刺激域之外，第三代CAR在内域中拥有两个共刺激域。第四代CAR（“TRUCK”，“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”）由第二代或第三代CAR组成，该CAR在CAR信号传导后诱导转基因蛋白的表达。虽然在规范设计中描绘，但已经工程化了大量CAR变体，每种变体都针对不同的应用进行了优化。 原型CAR的基本设计最初由Zelig Eshhar及其同事（魏茨曼科学研究所）提出，他们展示了一个模块化复合受体，最初命名为“T-Body”或“免疫受体”，具有用于结合的抗体衍生结合域和用于T细胞激活的TCR信号域，为工程化T细胞提供了特异性识别和激活。在随后的几年中，引入了许多修改，允许靶向广泛的抗原，并通过各种细胞内结构域发送信号，以启动和重定向定义的免疫细胞功能（表1）。 表 1 CAR构建模块及其替代模块。 EMA（欧洲药品管理局）批准。其他使用其他宿主细胞和不同CAR设计的应用程序也在早期临床试验中越来越多地被研究。 规范的CAR由抗体衍生的结合域、间隔区、跨膜域和细胞内主要及共刺激信号域模块化组成。每个结构域可以通过不同的模块构建，这些模块影响不同的变量，并最终影响T细胞的激活和性能。 CAR工程化的细胞毒性T细胞重定向至癌细胞是该技术研究最多的应用；自体抗CD19 CAR T细胞的过继转移成为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的首个基因工程细胞疗法；随后，欧洲药品管理局（EMA）也批准了。使用其他宿主细胞和不同CAR设计的其他应用也越来越多地在早期临床试验中研究。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.1.结合域 抗原结合域传统上由来自小鼠或人类单克隆抗体的单链可变区（scFv）组成。通过短柔性连接子（通常是(Gly4Ser)3肽）将重链（H）和轻链（L）抗体链的可变（V）区域连接起来，形成VH-linker-VL或VL-linker-VH的顺序。甘氨酸残基提供了灵活性，以允许VH和VL正确折叠形成抗原结合口袋，而丝氨酸则为连接子提供了一些溶解性。VH和VL链的空间位置和相互作用可以显著影响亲和力、特异性和溶解性。足够高的结合亲和力对于诱导T细胞激活至关重要；然而，存在一个亲和力上限，超过该上限CAR介导的T细胞激活不会改善，但会导致激活诱导的细胞死亡（AICD）。在CAR的背景下，一些scFvs通过张力信号独立于抗原参与诱导AICD、耗竭和T细胞的终端分化。除了亲和力和细胞表面的抗原密度外，目标表位在抗原内的位置也很重要；通常，靶向膜近端表位比靶向膜远端表位诱导更强的T细胞激活。 通过使用抗体进行靶向，CAR介导的识别是MHC独立的。这在靶向MHC-肽处理和呈递机制有缺陷的肿瘤时是有益的。此外，通过抗体识别目标，还可以识别传统T细胞看不见的抗原，如碳水化合物、脂质或抗原的结构变体。规范的CAR识别目标细胞表面的抗原；也可以通过使用特异性针对定义的MHC-肽复合物的抗体，工程化MHC-肽识别CAR，使其能够感知由MHC呈递的细胞内抗原。例如，一个scFv识别HLA-A2背景下的NY-ESO-1肽的CAR提供了与相应TCR类似的TCR样识别目标。 2.CAR的模块化组成：细胞外CAR结构域 2.2.间隔区 原型CAR经常在抗原结合域和跨膜域之间包含一个“间隔区”，以便接近目标抗原；连接的铰链区提供了一定的灵活性。间隔区的类型和长度对于最佳目标结合和信号传递至关重要。间隔区并非必需，因为有些CAR在scFv直接融合到跨膜域时是活跃的，而其他CAR只有在具有一定长度的间隔区时才活跃。间隔区通常来源于IgG1或IgG4恒定域或来自细胞外CD28、CD4或CD8（图2）。一般的想法是，间隔区在工程化T细胞和相应目标细胞之间提供最佳距离，以允许与目标细胞形成有效的接触区。基于TCR-MHC相互作用的知识，人们普遍认为CAR-目标相互作用需要在T细胞和目标细胞之间创建约15纳米的距离，以最佳形成接触区。因此，针对膜近端表位需要较长的间隔区，而较小的间隔区对更远离膜的表位是最佳选择；通过使用不同长度的间隔区可以轻松调整距离。在这个背景下，IgG衍生的间隔区具有可以通过结合一个、两个或三个CH1-CH2-CH3部分来调整长度的优势。IgG1衍生的间隔区还有利于CAR分子的稳定；然而，它可能与髓系细胞上的Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，介导CAR T细胞和髓系细胞的“非肿瘤”激活。这可以通过删除间隔区内的IgG1 CH2域或通过删除IgG1 Fc受体结合部分内的Asn297糖基化位点来预防。类似的修改也可以引入到IgG4间隔区。 图 2 第二代CAR设计的变体。由于模块化组成，可以使用各种替代域来构建CAR，其中一些示例性地列出。各个组分的变化允许调节CAR的结合和信号传导，最终调节细胞功能、代谢和工程化T细胞的抗肿瘤活性。其他变体旨在提高结合亲和力、目标的可及性、信号强度和细胞膜上的持久性等。最后，安全预防措施导致CAR设计中进一步的修改。 2.3.跨膜区 典型CAR的跨膜区来源于如CD3ζ、CD4、CD8α、CD28或OX40等类型1跨膜蛋白，由20-23个疏水性氨基酸组成，富含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸（图2）。带有CD3ζ跨膜域的CAR似乎比其他CAR更有效地整合到TCR/CD3复合体中，因此在表达和信号传导方面更为稳健；带有CD28跨膜区域的CAR似乎同样稳定。另一方面，带有CD8α铰链和跨膜域的CAR不易于AICD；然而，它们通过减少促炎细胞因子的释放来介导较少的T细胞激活。 2.4.细胞内信号传导域 “第一代”CAR完全通过主要信号传导域（信号-1）进行信号传导。TCR/CD3ζ细胞内链含有三个免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs），FcεRI γ链含有一个ITAM，这些在磷酸化后作为下游信号蛋白的特定适配器。因此，CAR利用内源性TCR信号机制来启动T细胞激活事件的级联。下游激酶如Lck或Fyn也可以作为CAR介导的T细胞激活的主要信号，等等（图2）。CAR信号传导域本身足以与下游激酶结合并启动有效的激活级联，因为CAR在TCR敲除细胞和非T细胞如NK细胞中也是功能性的。然而，仅有主要信号的CAR不足以激活以允许长期持久；这样的CAR T细胞迅速进入凋亡。根据“双信号假说”，静息T细胞还需要一个共刺激信号以持续激活。这就是将主要信号与共刺激信号（信号-2），如CD28或4-1BB（CD137），结合在“第二代”CAR中的理由。也在临床前和临床上探索带有替代共刺激域的CAR，如OX40、ICOS、CD27、CD40-MyD88、CD2和CD244。为了方便下游激酶的接近，CD28通常位于膜近端位置，随后是远端位置的CD3ζ；OX40和4-1BB在膜远端和近端位置都活跃。与第一代CAR相比，第二代CAR T细胞在细胞因子释放、扩增和抗肿瘤活性方面显示出稳健和持久的反应。 CAR介导的共刺激以不同的方式影响T细胞效应功能、存活、持久性和代谢。例如，4-1BB CAR T细胞在患者血液中的持久性超过6个月，而CD28 CAR T细胞在3个月之后大多无法检测到。经过重复刺激后，CD28 CAR T细胞重新编程为CD45RO+ CCR7−效应记忆细胞，这些细胞随后需要OX40来延长持久性并避免快速耗竭；4-1BB CAR T细胞主要转化为CD45RO+ CCR7+中央记忆细胞，并在外围血液中长期持久。CD28 CAR信号激活PI3K/Akt/mTOR途径，刺激有氧糖酵解，增加葡萄糖摄取和ATP生成，而4-1BB CAR信号激活Wnt/β-catenin途径和脂肪酸氧化，增加代谢和线粒体呼吸链能力。典型的Wnt/β-catenin有利于中央记忆细胞的形成和T细胞的长期存活，而CD28诱导的PI3K/Akt信号维持效应细胞的即时响应。在高剂量下，CD28和4-1BB CAR T细胞都能在临床前模型中根除大型已建立的肿瘤；在低剂量下，CD28 CAR T细胞比4-1BB CAR T细胞表现出更大的耗竭程度，结果是4-1BB CAR T细胞在长期内更有效地根除大型肿瘤负荷。另一方面，带有4-1BB CAR的T细胞仍然对肿瘤介导的通过TGF-β的抑制敏感，这对CD28 CAR T细胞来说较少见。因此，选择CAR设计的标准取决于多个参数，包括T细胞持久性、抗抑制能力、共刺激和共抑制配体的模式、肿瘤细胞上的抗原密度、T细胞上的CAR密度等。 “第三代”CAR结合两个共刺激域以及主要激活信号。联合共刺激的好处只在少数情况下得到证明，例如，通过CAR提供CD28-OX40共刺激对T细胞在终端成熟中的进展有益。 3.TRUCK：“第四代”CAR T细胞 CAR T细胞可以用来按需将转基因蛋白输送到预定的、靶向的组织。因此，CAR T细胞被设计成带有CAR诱导表达盒的额外“有效载荷”。所谓的“第四代”CAR T细胞，即TRUCKs（“T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤”），旨在在靶向组织中沉积分泌型转基因蛋白，以实现治疗有效浓度（图3）。“有效载荷”的表达受NFAT6-IL-2最小启动子的控制，该启动子在CAR信号传导时被激活；有效载荷可以是转基因编码的任何蛋白或肽。这种策略特别有趣，因为它结合了重定向CAR T细胞攻击和局部沉积的生物活性蛋白的作用，同时避免了系统毒性。只要CAR T细胞保持激活状态，TRUCKs就会沉积转基因产物，例如，IL-12或IL-18作为转基因免疫调节剂，以特定方式塑造靶向肿瘤环境，而不引起系统毒性。累积的TRUCK产生的IL-12在CAR靶向的肿瘤组织中招募天然免疫细胞，如NK细胞和巨噬细胞，在那里反过来启动二次抗肿瘤免疫反应。IL-12 TRUCKs抵抗Treg细胞的抑制，并显示出增加的细胞因子释放和扩增。当快速进展的肿瘤积累抗原丢失的癌细胞，导致对CAR T细胞不可见的肿瘤复发时，这种策略特别有趣。释放IL-18的TRUCKs将CAR T细胞转化为T-bet高FoxO1低效应细胞，抵抗耗竭并显示出对大型已建立肿瘤的优越细胞毒性。IL-18 CAR T细胞治疗改变了整个肿瘤免疫细胞景观，特别是通过增加CD206− M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，减少抑制细胞如Tregs、抑制性CD103+ DCs和M2型巨噬细胞。其他例子包括释放过氧化氢酶以保护T细胞免受过氧化压力介导的抑制和释放肝素酶以改善T细胞通过肿瘤基质的穿透。 图 3 第四代CAR T细胞（“TRUCKs”）。在抗原结合时，第二代或第三代CAR诱导表达一种转基因蛋白，该蛋白在细胞内作用、整合到膜中或由CAR T细胞释放。释放的转基因蛋白旨在改变肿瘤环境、重塑肿瘤组织或吸引二次免疫反应。CAR T细胞被诱导仅在CAR与其靶标结合时释放蛋白质，从而将“有效载荷”在预定义的交付点作为“TRUCK”进行交付。这种CAR T细胞被理解为“活体工厂”，用于精确和持续地交付治疗性细胞产品。 所谓的“装甲CAR”通过产生4-1BB配体提供增加的共刺激通过刺激4-1BB途径。工程化的T细胞被设计为分泌Toll样受体（TLR）配体，可以刺激T细胞和抗原呈递细胞上的TLR途径，然后可以激活一组T细胞进行广泛的抗肿瘤攻击。靶向Muc16ecto（即黏蛋白-16（CA-125）的膜保留残余物）并分泌IL-12的CAR T细胞正在临床试验中评估（NCT02498912）。IL-15 TRUCK细胞显示出改善的扩增和抗肿瘤活性，但在未受控制的扩增情况下需要自杀基因，由于其白血病潜力。“装甲”CAR通过与CAR共表达IL-7受体-α链来恢复对IL-7的反应性，并促进Th1反应。类似地，在IL-4水平增加的前列腺癌中，共表达IL-4结合/IL-7信号传导受体提高了抗PSCA CAR T细胞的抗肿瘤活性。另一方面，CAR T细胞上共表达的显性负性TGF-β DNRII受体可以在TGF-β存在的情况下与TGF-β竞争，以改善T细胞的抗肿瘤活性。也可以设想提供细胞因子或细胞因子受体之外的应用，如输送可溶性HVEM外域，以靶向肿瘤血管，以维持肿瘤穿透。 4.具有双重特异性、组合抗原识别和条件性CAR的CAR T细胞 原型CAR通过一个scFv将特异性重定向到一个抗原；多种原因要求具有多重特异性的CAR：(1)肿瘤病变在可靶向抗原方面可能是异质的，或在肿瘤进展过程中丢失抗原；(2)靶向癌细胞和肿瘤基质或血管可能有益或需要增加治疗效果。将两种或更多CAR T细胞产品应用于癌症患者基本上是可行的，尽管需要在GMP条件下制造两种细胞产品。例如，通过顺序输注应用CD19和CD22 CAR T细胞目前正在评估治疗难治性B-ALL的试验中（NCT03620058）。或者，T细胞被设计为表达两个CAR，即所谓的双顺反子CAR，每个CAR针对不同的抗原（图4）。通过灵活的连接子将两个scFv相互连接，设计出具有双重特异性的CAR。这种串联排列的双特异性CAR（“串联CAR”，“Tan-CAR”）或环状结构，针对两种不同的抗原，并能够在结合任一抗原时提供T细胞激活（“或”门控）；具有其中一种相应抗原的目标细胞仍然被识别。除了两个连接的scFv外，双抗体、二合一抗体和双变量域抗体也可以用来设计具有两种特异性的CAR。三特异性CAR包含单价和/或多价CAR结构的组合，以针对三种抗原，进一步扩大靶向特异性。一个例子是设计了一种双特异性CAR，将针对CD20和CD19的scFv连接起来，旨在减轻在接受CD19 CAR T细胞治疗后经常发生的B细胞白血病/淋巴瘤的复发。CD19− CD20+白血病细胞的复发旨在通过CD20-CD19双特异性CAR T细胞得到控制。双特异性CAR中scFv的顺序取决于特定抗原中目标表位的空间可及性。CD20-CD19 CAR对CD19和CD20都具有相同的结合能力，并重定向T细胞激活，而CD19-CD20 CAR则效率要低得多。其他双特异性CAR的例子是针对CD19和CD123治疗B-ALL或CD19共靶向CD22、ROR1和免疫球蛋白κ轻链（Igκ）。多特异性CAR T细胞目前正在早期临床试验中评估。通过双顺反子表达盒设计了同时具有CD19和CD22 CAR的T细胞，正在进行治疗高风险B-ALL或干细胞移植后复发的试验（NCT03289455）。具有CD19和CD22特异性的双价CAR正在评估治疗B-ALL或B细胞淋巴瘤（NCT03241940, NCT03233854, NCT03330691, NCT03448393, NCT03019055）。目前正在进行的II期试验中评估了针对BCMA两个表位的双特异性CAR（NCT03758417）。 图4 基于逻辑门控的CAR介导的T细胞激活，以证明在肿瘤靶向中的选择性。共表达两种CAR，每种CAR在与相应的目标抗原结合时都能完全激活T细胞；双特异性CAR（串联CAR，Tan-CAR）也是如此。在这种情况下，通过表达抗原A或B或两者的细胞激活T细胞（"OR"门控）。为了仅通过同时表达A和B抗原的细胞激活CAR T细胞，识别A的CAR仅通过CD3ζ提供基本激活，这不足以实现完全和持续的激活，而识别B的CAR提供共刺激；通过两种CAR的同时信号传导诱导T细胞完全激活（"AND"门控）。识别抗原A的synNotch CAR驱动转录并表达第二种CAR，该CAR在识别抗原B时驱动T细胞完全激活。具有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR在其识别的抗原B结合时阻止通过激活CAR的信号传导。当抗原B不存在时，CAR可以在结合抗原A时激活T细胞（"A-not-B"门控）。 当结合两种抗原时，双特异性CAR比单特异性CAR具有更高的亲和力，理论上稳定了突触并改善了T细胞对低抗原水平目标细胞的反应。这种情况可以用来只将CAR T细胞重定向到表达两种抗原而不是一种的细胞（图4）。这种“与”门控的抗原模式旨在提高对癌细胞的靶向选择性，同时保留健康细胞。两个共表达的抗原被两个共表达的CAR识别，每个CAR识别特定的抗原，并分别提供主要或共刺激信号。这样，只有同时结合两种抗原才提供完全T细胞激活所需的两个信号；结合一种抗原是不足够的。组合抗原识别的例子是，通过CD3ζ CAR靶向ErbB2和通过CD28 CAR靶向Muc1，或通过CD3ζ CAR靶向间皮素和通过CD28 CAR靶向叶酸受体-α。靶向CD13和TIM3的双特异性和分裂CAR T细胞在临床前模型中根除患者衍生的急性髓性白血病细胞，减少了对骨髓和外周髓性细胞的毒性。 通过异二聚体化两个多肽链，可以加强两个CAR上的初级和共刺激信号的组合；一个链由细胞外和跨膜以及初级信号传导部分组成，第二个链提供共刺激信号传导部分，并通过添加“二聚体化剂”与第一个链相连。CAR在二聚体化剂允许异二聚体化和功能性CAR形成之前保持沉默。通过滴定二聚体化剂剂量可以微调T细胞活性；撤除二聚体化剂终止CAR信号。只有当每个CAR信号单独不足以驱动T细胞激活时，才能通过组合抗原识别实现清晰的“开-关”T细胞激活。由于预先激活的T细胞中的CD3ζ信号可能重新诱导T细胞反应，因此需要调整信号或降低结合亲和力以实现平衡的激活阈值。 可调CAR的另一种策略基于合成Notch（synNotch）受体。Notch由一个细胞外受体、一个跨膜域和一个细胞内转录调节器组成，激活后介导内部域的蛋白水解，释放细胞内转录调节器。这些特性用于控制与Notch受体不同特异性的真正CAR的转录。优点在于Notch受体的抗原识别基于逻辑“与”门控，并以空间定义的方式控制CAR T细胞功能。在CD19结合后，CD19特异性synNotch受体释放转录效应域Gal4-VP64或TetR-VP64以诱导抗间皮素CAR的表达。只有当在靶向组织中同时识别synNotch配体和CAR配体时，T细胞才被激活。另一个例子是通过CAR靶向ROR1和通过Notch受体靶向EpCAM或B7-H3。虽然CAR的“开开关”决定了靶向癌细胞的选择性，但这种策略可能受到诱导足够水平的CAR表达和在没有Notch信号进一步发生时衰减CAR所需的时间的限制。 工程化T细胞的TCR特异性也可以用来提供更复杂的识别轮廓。带有γδ TCR的T细胞识别肿瘤细胞特有的磷酸化抗原；转基因表达GD2特异性CAR和共刺激域只会在γδ TCR和CAR同时结合它们相应的抗原时提供完全的T细胞激活；由于缺乏γδ TCR激活，不会攻击GD2+的健康细胞。 虽然许多可靶向的抗原既表达于健康细胞也表达于癌细胞，但有些抗原仅由健康细胞表达，而癌细胞缺乏表达。在这种情况下，结合共同抗原“A”但在结合健康细胞上的抗原“B”时阻断，将阻止CAR T细胞激活对抗健康细胞（图4）。带有ITIM（免疫受体酪氨酸基抑制基序）的抑制性CAR只要结合其相应的抗原“B”，就阻止通过激活性CAR的信号传导。结合缺乏抗原“B”的“A”癌细胞允许CAR T细胞激活，因为缺乏通过抑制性CAR的信号传导（“A非B”门控）。 5.具有植入多重抗原特异性的通用CAR 目前，原型CAR具有一个确定的抗原特异性；改变特异性需要用新的CAR工程化T细胞。在这种情况下，开发了一种“通用”CAR，它识别一种抗体，该抗体转而提供癌症特异性（图5）。例如，抗癌抗体的免疫球蛋白Fc区域被具有CD16作为结合域的CAR结合。CD16 CAR T细胞结合抗癌抗体，从而获得对癌细胞的特异性。或者，CAR结合至与抗癌靶向抗体相关联的蛋白质表位。具有荧光素异硫氰酸酯（FITC）特异性CAR的T细胞识别FITC标记的叶酸，该叶酸与叶酸受体阳性癌细胞结合。也可以设想将其他表位与桥接抗体相关联，如亲和素。同时添加不同特异性的抗体，允许将相同的CAR T细胞产品（“UniCAR”）重定向至多种抗原，无需重新制造CAR T细胞。该策略的优点是同时使用不同的抗体靶向广泛的抗原，同时只应用一种制造的CAR T细胞产品。实际的特异性由应用的抗体混合物在治疗足够浓度下定义。随着应用的抗体的短半衰期，此外，意外的不良事件在抗体撤除后很快就会有限。从机制上讲，有效的肿瘤控制需要CAR T细胞和连接抗体都渗透到肿瘤病变中；目前尚不清楚这是否适用于晚期实体瘤。也尚未解决“通用”CAR T细胞是否能够建立对癌症抗原的持久免疫记忆，这被认为是长期控制癌症所需的。 图 5 “通用”CAR的概念。T细胞表达一种特异性针对标签的CAR，该标签与连接分子相连，最好是天然抗体、单链抗体(scFv)或双特异性T细胞导向抗体(BiTE)，这些分子能够识别肿瘤细胞上的目标抗原。通过添加不同的连接分子，无需工程化新的CAR T细胞，就可以为T细胞配备不同的特异性。这被认为在将CAR T细胞应用于患者后也是可行的；注入针对不同肿瘤抗原的抗体，为CAR T细胞提供不同的特异性。 6.转换抑制信号为激活信号的Switch CAR 在肿瘤病变中，重定向的T细胞攻击通常以各种方式受到抑制；抑制性配体如程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）和PD-L2与激活的T细胞表达的程序性细胞死亡-1（PD-1）结合。一种结合这种抑制性配体但向工程化T细胞传递激活信号的CAR，不仅可以与抑制性受体竞争结合，还可以通过提供激活信号克服抑制（图6a）。理想情况下，PD-L1:CD28 “开关”CAR在工程化T细胞中克服PD-1介导的抑制信号。特别是，一个具有PD-1细胞外域结合PD-L1和CD28细胞内信号传导域的CAR，将抑制信号转换为激活信号，导致ERK磷酸化增加，促炎细胞因子释放，T细胞扩增和目标细胞的细胞溶解。由TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）的外域与CD28共刺激域融合而成的嵌合受体，在结合TIGIT配体CD155时增强T细胞功能。鉴于肿瘤组织提供的大量抑制信号，确定需要克服的“关键”抑制因素以维持有效的T细胞反应仍然是一个挑战。 图 6 开关CAR和抑制性CAR（iCAR）。(a) 开关CAR与生理性T细胞抑制性受体的配体结合，但为工程化T细胞提供激活信号。(b) 抑制性CAR在与抗原结合后，通过ITIM信号向工程化T细胞提供负信号。抑制信号压倒了通过TCR或共表达的激活CAR的激活。 7.抑制性CAR：iCARs 虽然原型CAR向工程化T细胞提供激活信号，但具有抑制信号的CAR旨在在结合健康细胞时抑制CAR T细胞激活。理想情况下，抑制性CAR通过在面对健康组织时覆盖激活CAR信号来减轻非肿瘤毒性。与激活性、肿瘤特异性CAR共表达的具有优势抑制信号的CAR，识别健康细胞；从而CAR T细胞只在结合癌细胞时激活，抑制性CAR不结合健康细胞（图6b）。这种抑制性CAR提供PD-1或CTLA-4信号，并覆盖癌症特异性CAR的激活信号。 8.异体CAR T细胞和CAR NK细胞 到目前为止，CAR T细胞治疗是一种通过体外制造患者自己的T细胞的个性化治疗。这不仅繁琐、成本密集和耗时，而且在患者晚期疾病无法提供足够或足够活跃的T细胞进行CAR工程化时通常也不适用。在这种情况下，异体“现成的”CAR T细胞将为广泛的患者群体带来好处。为了避免移植物抗宿主病（GvHD），需要删除内源性的αβ TCR和HLA分子，这可以通过锌指核酸酶或CRISPR/Cas技术实现。随后清除剩余的TCRαβ T细胞，通过污染的异体TCR+细胞降低GvHD风险。T细胞通过转录激活样效应核酸酶（TALENs）技术在TCRα和CD52位点进行基因编辑，用于治疗无法生产自体CAR T细胞的患者的儿童CD19+ ALL。CD52存在于患者的恶性B细胞上，需要从CAR T细胞中删除，以允许消除恶性淋巴细胞，同时保留注入的CD52阴性CAR T细胞。对于工程化异体CAR T细胞，CRISPR导向RNA和Cas9目前由病毒载体编码以实现组成性表达；当前的研究旨在短暂提供基因编辑工具，而不持久的载体，以最小化非目标编辑。 针对BCMA治疗多发性骨髓瘤的异体CAR T细胞，通过BCMA CAR和基因编辑技术进行了改造，以限制TCR介导的免疫反应。通过将CD20模拟表位整合到CAR的细胞外域，使CAR T细胞能够通过利妥昔单抗消除，从而提供了异体BCMA CAR T细胞的安全性。 关于使用异体效应细胞，NK细胞也可以用于诱导有效的抗肿瘤反应，因为它们具有细胞毒性潜力和分泌促炎细胞因子。除了使用异体细胞，使用NK细胞进行癌症的过继细胞治疗有很强的生物学理由；NK细胞表现出广泛的抑制性和激活性受体库，以识别外来、感染或恶性细胞。两种信号的平衡最终诱导或阻断细胞毒性CD56dim NK细胞释放细胞毒性颗粒以杀死目标细胞。虽然可能存在广泛的NK细胞亚群多样性，基于激活和抑制受体的库，但通过CAR工程化NK细胞将为特定癌细胞提供预定的特异性。原型CAR具有CD28-CD3ζ信号也在NK细胞中活跃；具有NK细胞2DS2和DAP12信号蛋白的CAR产生了更强的抗肿瘤活性。为NK细胞工程化的CAR通常包含DAP10或DAP12用于激活，单独或与CD3ζ一起。具有NKG2D作为结合物和DAP10-CD3ζ用于激活的CAR有效地激活了小鼠模型中针对骨肉瘤的原代NK细胞。CD3ζ在NK细胞中作为激活域优于DAP10，而DAP12优于CD3ζ。 9.制造CAR T细胞用于临床应用 对于临床应用，CAR T细胞产品是根据良好生产规范（GMP）规则，使用预期接受患者的自体T细胞制造的（图7）。在大多数情况下，通过白细胞分离术收集血液，分离T细胞，通过病毒感染或电穿孔进行基因工程改造，并扩增到临床相关的数量。大多数临床试验使用通过γ-逆转录病毒或慢病毒基因转移修饰的T细胞；基于转座子的载体，如Sleeping Beauty和PiggyBac，越来越多地应用于临床，其好处是避免了成本和时间密集型的病毒生产。病毒和转座子介导的基因转移程序旨在永久性地修改患者的T细胞以表达CAR；一些试验使用通过RNA电穿孔修饰的T细胞进行短暂的CAR表达。在永久性基因改造后，插入突变和随后成熟T细胞的致癌转化的风险似乎很低，到目前为止在这方面还没有报告致癌事件。一个需要注意的问题是，通过慢病毒转移，CAR基因插入到Tet2位点导致T细胞的克隆扩增，然而，它们自发地收缩了。然而，白细胞分离产品中污染的恶性细胞也可能意外地被CAR改造，存在重新输注给患者后通过CAR介导的肿瘤促进的风险。 图7 CAR T细胞制造和患者治疗时间表。(a) 通过白细胞分离术从患者体内收集T细胞，并在体外处理以获得最终的CAR T细胞产品，包括T细胞工程化以携带CAR、扩增至临床相关数量，以及最终的质量控制程序（QC）。在输注CAR T细胞产品之前，患者需接受非清髓性淋巴细胞减少（“预处理”），以促进CAR T细胞的植入和体内扩增。随后需要院内护理以管理潜在的副作用，如CRS或神经毒性。(b) 体外CAR T细胞制造过程通常从白细胞分离产品开始，并涉及多个后续生产步骤，包括T细胞分离和激活、基因工程、CAR T细胞扩增、制剂、CAR T细胞产品的冷冻保存，以及最终的质量控制以供释放。整个过程可以手动运行，或在监督下（半）自动化进行。 经过基因改造后，CAR T细胞在细胞因子存在的情况下在体外广泛扩增到临床相关的细胞数量；目前使用手动处理的摇动反应器或袋子以及完全自动化和监督处理设备。自动化的目标是允许以高再现性和质量进行生产，并从越来越多的患者中并行生产细胞，并缩短静脉到静脉的时间。 最适合CAR治疗的T细胞群体被认为是具有急性炎症特征的原始或年轻中央记忆细胞。在IL-2存在下扩增CAR T细胞优先触发效应T细胞，而IL-7或IL-2加IL-15扩增具有持续细胞因子释放和抗肿瘤活性能力的中央记忆T细胞。添加IL-21使CAR T细胞保持较少分化状态。刺激方式不仅决定了扩增CAR T细胞的产量，还决定了代谢依赖性；IL-15增加氧化代谢以及肉碱棕榈酰转移酶，这是脂肪酸氧化的限速步骤。IL-7通过STAT5和Akt激活增加Glut1，并诱导甘油运输和甘油三酯合成，从而改善T细胞持久性和存活。在体外扩增期间抑制Akt触发具有高水平脂肪酸氧化的中央记忆表型，最终改善CAR T细胞的抗肿瘤活性。CD45RO+ CD62L+记忆CAR T细胞比更高级分化阶段的效应T细胞提供更持久的抗肿瘤反应，使富含CD62L的CAR T细胞成为进一步探索的有吸引力的选择。 因此，中央记忆CAR T细胞在临床应用中似乎更优越，因为响应的患者没有累积具有早期记忆和耗竭特征的T细胞，而非响应的患者则累积了。最终产品中工程化细胞的活性可能影响治疗效果。然而，基于制造的细胞产品的活性对CAR T细胞治疗结果的首次回顾性分析表明，当患者接受70-80%活性的产品与至少80%活性的产品相比，CD19 CAR T细胞扩增或患者存活没有差异的证据。 制造T细胞产品是一种个性化方法，当前程序有一些显著的限制： 一些癌症患者淋巴细胞减少或具有低数量的原始T细胞，导致生产延迟或失败，如在为儿科患者生产时所经历的。 生产过程耗时，这对急性或晚期疾病的患者不利。 由于疾病，患者的T细胞可能功能失调，如CLL和一些实体瘤所报告的，导致产品反应率低。 在某些情况下，工程化异体T细胞可能是另一种策略。在接受造血干细胞移植的患者中，使用移植的异体T细胞制造CAR T细胞产品。这样的异体CD19特异性CAR T细胞诱导了部分和完全缓解；然而，一些患者遭受了GvHD。病毒抗原特异性、部分HLA匹配的供体T细胞缺乏异体反应性，并且通过CAR工程化，显示出抗淋巴瘤活性。NK细胞以其MHC独立活性也是第三方供体细胞CAR工程化的来源；然而，它们在患者中表现出较差的持久性。 10.通过CAR T细胞的过继治疗在血液学恶性肿瘤中诱导持久缓解 过继转移CAR T细胞的治疗效果取决于多个参数，包括CAR设计、CAR信号传导、结合亲和力、目标细胞上的抗原数量、目标抗原表位的空间可及性、T细胞的成熟阶段、CAR T细胞的持久性和扩增、患者免疫系统的预处理等。目前的努力旨在优化特定疾病的状况；一些治疗方案已在CAR T细胞治疗恶性疾病的方面证明成功，特别是B细胞白血病/淋巴瘤；少数试验旨在治疗实体癌。 在迄今为止难以治疗的B细胞白血病和淋巴瘤的治疗中，使用“第二代”抗CD19 CAR T细胞的早期临床试验实现了完全且持久的缓解；使用“第一代”CAR T细胞的治疗大多失败，因为CAR T细胞从循环中迅速清除。目前，近600项早期阶段的CAR T细胞试验正在进行临床探索，主要由学术中心进行（截至2020年初，中国有268项，美国有227项，欧洲有67项）。用于治疗儿童B-ALL（Kymriah™，tisagenlecleucel，诺华）和成人大B细胞淋巴瘤（Yescarta™，axicabtagene ciloleucel，Kite-Gilead）的抗CD19 CAR T细胞已获得FDA和EMA的批准；其他将很快跟进。 CAR T细胞治疗的标准程序从患者的白细胞分离开始，分离T细胞，体外基因工程改造相应的CAR，CAR T细胞扩增，以及在非清髓性淋巴细胞减少和IL-2支持后，通过静脉输注将最终的细胞产品重新给患者（图7）。由于CAR T细胞的持久性对临床效果至关重要，目前在试验中使用的CAR具有一个或两个共刺激内域，其中大多数提供CD28或4-1BB共刺激。在持久性方面，4-1BB共刺激的CAR T细胞似乎优于CD28 CAR T细胞，在循环中持续4年以上，而CD28 CAR T细胞持续30天。由于CD19 CAR T细胞不区分健康和恶性B细胞，只要CD19 CAR T细胞持续存在，患者就会经历持久的B细胞耗竭。尽管B细胞耗竭在临床上是可管理的，但这种情况要求在靶向恶性B细胞时更具选择性。最近，Fcμ（IgM）受体被确定为治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）时可能更具肿瘤选择性的目标，由于目标表达水平较低，因此大多数健康B细胞免于被淘汰。目前也在探索其他替代靶标。 在缓解期间，大多数接受4-1BB CAR T细胞治疗的白血病/淋巴瘤患者没有接受进一步的癌症特异性治疗；接受CD28 CAR治疗的患者经常接受异体干细胞移植，这似乎是有益的，因为CD28 CAR T细胞的持久性不如4-1BB CAR T细胞。需要进一步探索以确定长期内更成功的策略。 迄今为止，患有DLBCL、CLL、B细胞急性淋巴细胞性白血病（B-ALL）和滤泡性淋巴瘤的患者已通过CD19 CAR T细胞成功治疗。值得注意的是，接受CD19 CAR T细胞治疗的多发性骨髓瘤患者也经历了缓解，尽管通过流式细胞术评估，骨髓瘤细胞是CD19low或CD19阴性。目前也在探索用于治疗B细胞恶性肿瘤的其他替代靶标，包括CD20、CD22、Igκ轻链、ROR-1和CD30。 由于缺乏标准化的试验设计、CAR组成、靶向抗原、预处理等方面，很难比较各种试验中CAR T细胞治疗的成功。然而，越来越明显的是，CAR T细胞剂量和淋巴细胞减少的程度或淋巴细胞减少方案对于允许广泛的T细胞扩增、持久性和最终治疗效果至关重要。应用后对CAR T细胞的重复再刺激可能改善它们在长期内的持久性和抗肿瘤效果。这是使用病毒特异性T细胞进行CAR植入的合理性，它们在接触病毒抗原时通过TCR重复再刺激；例如，Epstein-Barr病毒（EBV）特异性T细胞通过CAR工程化，并被EBV感染的细胞触发扩增。事实上，EBV特异性CAR T细胞的表现优于没有病毒特异性的CAR T细胞。 11.治疗实体癌的CAR T细胞面临的挑战 虽然血液学恶性肿瘤的治疗越来越成功，但实体癌的治疗仍然具有挑战性（表2）。作为“活药”的CAR T细胞基本上非常适合治疗实体癌，特别是由于T细胞固有的迁移和组织穿透能力，穿透血脑屏障，并在几乎所有组织中积累，包括睾丸和眼睛等特权组织，因此特别适合消除（微）转移。然而，大多数实体肿瘤具有大量策略，以非常有效的方式对抗CAR T细胞的迁移、渗透和激活。其中，改变的趋化因子环境损害了CAR T细胞向肿瘤的迁移；肿瘤内皮细胞上丢失了一些粘附因子，妨碍了T细胞的渗透。通过局部沉积TNF-α可以对抗后者，它增加了血管粘附分子，如血管细胞粘附蛋白-1和内皮细胞上的细胞间粘附分子-2。靶向血管内皮生长因子（VEGF）受体-2或阻断迁移抑制因子如内皮素B受体也改善了内皮细胞粘附和/或T细胞的跨内皮迁移。在T细胞上下调的趋化因子受体被重新表达，如CXCR2（CXCL1受体），以便于靶向黑色素瘤或CCR2b用于靶向神经母细胞瘤。 表 2 CAR T细胞疗法面临众多挑战。 为了绕过迁移障碍，CAR T细胞被瘤内植入或分别注入胸膜或腹膜以治疗间皮瘤和卵巢癌。通过内窥镜将抗CEA CAR T细胞应用于肝转移；抗c-Met CAR T细胞被注入乳腺癌转移。一旦进入肿瘤病变，CAR T细胞需要突破基质细胞和细胞外基质的障碍，才能接近癌细胞以执行它们的细胞毒性攻击。通过基因工程释放的肝素酶在基质中降解肝素硫酸蛋白多糖，改善T细胞的渗透；需要高水平的IFN-γ来消除基质细胞并根除大型已建立的肿瘤病变。通过直接针对基质细胞的CAR T细胞特异性针对成纤维细胞激活蛋白（FAP），一种参与细胞外基质重塑的丝氨酸蛋白酶，整体抗肿瘤活性得到改善。 许多过程使肿瘤病变对重定向的CAR T细胞产生敌意，使它们变成耗竭状态或进入凋亡。调节性T（Treg）细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关M2型巨噬细胞释放抑制性细胞因子，如IL-4、IL-10、白血病抑制因子（LIF）和TGF-β。MDSCs和巨噬细胞降低肿瘤内色氨酸水平；基质细胞释放吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和犬尿氨酸，抑制T细胞效应功能并剥夺组织中的葡萄糖和其他营养物质。严重的酸中毒也对抗肿瘤活性的CAR T细胞产生反作用。由于MDSCs释放的精氨酸酶，低精氨酸水平抑制CD3ζ表达和TCR信号传导。 12.CAR T细胞治疗与毒性相关 作为“活药”的CAR T细胞治疗在一些试验中取得了显著的治疗效果；然而，CAR T细胞在初始应用后的几天甚至几周内可能导致严重的副作用，需要重症监护干预，甚至可能致命。大多数毒性是由于CAR T细胞的特殊生物学特性，其他与CAR T细胞相关的毒性目前尚未完全理解。从机制上讲，主要毒性是(1)由于大量T细胞激活、细胞因子释放和肿瘤溶解引起的全身毒性，以及(2)由于CAR T细胞与健康组织相互作用引起的特异性毒性（“靶上非肿瘤”毒性）。 12.1.系统性毒性 细胞因子释放综合征（CRS）：大量CAR T细胞与目标细胞的结合导致大量细胞因子释放，血清中促炎细胞因子（包括IFN-γ和TNF-α、IL-10和IL-6）的水平异常高，这本身会导致其他免疫细胞的交叉激活，以及进一步的细胞因子释放，直至达到有毒水平。这些毒性被称为细胞因子释放综合征（CRS），临床上伴有高烧、不适、疲劳、肌肉痛、恶心、厌食、心动过速、低血压、毛细血管渗漏、心脏功能障碍、肾功能损害、肝功能衰竭和弥散性血管内凝血。CRS常与血管渗漏综合征（VLS）一起出现，与巨噬细胞激活综合征（MAS）和巨噬细胞激活密切相关，临床上类似于噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）。CRS的风险与T细胞激活和扩增有关，这可能与总体肿瘤负荷相关，但并非绝对。为了避免CRS，需要在肿瘤负荷高的患者中使用较低剂量的CAR T细胞，这是一个需要通过精确定义治疗窗口来解决的悖论，通过调整T细胞激活、细胞因子释放和抗肿瘤活性。 CRS的早期诊断和临床管理通过新建立的评分系统和治疗指南得到便利。C反应蛋白，即由肝细胞在IL-6水平增加时释放的蛋白质，目前作为CRS发作和严重程度的实验室标志物；成人的预测标志物还包括可溶性gp130（sgp130）、IFN-γ和IL-1Rα的增加，在儿科患者中，IFN-γ、IL-13和MIP1α的增加。目前CRS的治疗基于阻断IL-6/IL-6受体信号轴，通过阻断抗体如抗IL-6受体抗体tocilizumab或抗IL-6抗体siltuximab，这似乎不会干扰CAR T细胞的疗效。短期系统性皮质类固醇治疗也能迅速逆转CRS，且不影响最初的抗肿瘤反应；然而，它可能在长期内损害CAR T细胞反应。在CRS期间中和促炎细胞因子有助于减轻CRS的严重程度。在CRS期间，活化的单核细胞和/或巨噬细胞释放高水平的IL-1；通过IL-1受体拮抗剂中和可以改善临床模型中的CRS和神经毒性。通过给予lenzilumab抗体中和巨噬细胞-单核细胞激活细胞因子GM-CSF，降低了CRS的风险。通过阻断酪氨酸羟化酶减少儿茶酚胺，降低了小鼠模型中的细胞因子水平，暗示了临床干预的途径。 与CAR T细胞相关的HLH/MAS通常与CRS症状一起出现，伴有铁蛋白和肝酶血清水平升高、噬血细胞现象、细胞减少、肺水肿、脾肿大、肾功能衰竭和NK细胞丢失。治疗包括使用依托泊苷或阿糖胞苷进行系统性化疗，如果与神经毒性相关，也可以鞘内应用；在这种情况下，IL-6/IL-6R阻断大多无效。 神经毒性（ICANS）：CAR T细胞治疗相关的神经毒性现在被称为免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。神经系统效应包括失语症、幻觉、混乱、谵妄、表达性失语症、肌阵挛、谵妄、癫痫发作和脑水肿。这种神经毒性发生在大约40%的患者中，是可逆的，并且在CD19 CAR T细胞治疗期间频繁发生；其他CAR T细胞也可以引起神经毒性，指向由于活化CAR T细胞的浸润导致的弥漫性但暂时性脑病。神经毒性的机制尚不清楚，但与破坏血脑屏障和脑脊液中细胞因子水平增加有关。如果与CRS一起治疗，用IL-6阻断和类固醇治疗可以成功。 12.2.“靶上非肿瘤”毒性 由于大多数靶向抗原也由健康细胞表达，CAR T细胞治疗与攻击健康组织的风险相关，导致巨大的“靶上非肿瘤”毒性。治疗B细胞白血病的CD19靶向CAR T细胞也消除了健康的B细胞；持久的B细胞耗竭需要免疫球蛋白替代和抗生素及抗真菌保护，这在临床上是可管理的。当目标抗原由重要组织表达时，毒性更严重。在一项针对肾癌患者的碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞治疗试验中，患者由于胆管上皮细胞上碳酸酐酶IX水平较低而出现肝毒性；通过预先给予阻断抗体，可以减少“非肿瘤”毒性的严重程度。避免“靶上非肿瘤”毒性的策略目前旨在增加肿瘤选择性，并以空间和时间的方式限制CAR活性。T细胞给药的替代途径可能是避免通过血液系统分布大量CAR T细胞的选项。通过内窥镜或胸膜内或腹膜内应用局部CAR T细胞给药，在肿瘤部位提供高剂量的CAR T细胞，并在一定程度上避免了非肿瘤毒性。然而，这种应用是有限的，因为在大多数情况下，肿瘤病变无法接触或肿瘤广泛扩散。 12.3.“靶外非肿瘤”毒性 大多数过去工程化的CAR在细胞外部分包含IgG1 CH2CH3结构域作为间隔区，这可能会与Fcγ受体（FcγR）（CD64）结合，从而激活NK细胞和巨噬细胞等先天细胞。尽管到目前为止在临床上并不突出，但理论上可以通过删除IgG1 CH2结构域或突变FcγR结合位点内的Asn297来减少风险。替代间隔区包括IgG4 Fc结构域或细胞外CD8结构域。 第三代曲妥珠单抗衍生的CAR T细胞靶向ErB2导致可能由于急性呼吸窘迫综合征和CRS导致的致命的心肺衰竭。同样，在用EGFR变体3特异性CAR T细胞和CEA特异性CAR T细胞治疗时记录了肺水肿，而没有直接证据表明CAR T细胞攻击肺上皮。由于使用针对同一目标的不同表位或传递不同信号的CAR可能产生显著不同的毒性，因此毒性概况更加复杂，例如，使用来自FRP5抗体的第二代ErB2 CAR的T细胞在肉瘤患者中并未诱导靶外非肿瘤毒性。 12.4.改善CRS的策略 基本上，当CRS在临床上显著时，需要对CAR T细胞进行下调或去激活；瞬时CAR表达、“关闭开关”和“自杀开关”是常用工具。 当存在严重CAR T细胞相关毒性的重大风险时，瞬时CAR表达可能有益。RNA转移产生瞬时表达的CAR。CAR在T细胞表面存在数天，并在目标细胞结合时介导有效的T细胞激活，然而，随着RNA降解和T细胞扩增时RNA稀释，CAR表达会下降。这种RNA修饰的T细胞在试验中显示出一些虽短暂但有效的效果。然而，由于CAR T细胞迅速清除，其缺点是短期效果。 然而，永久性修改的CAR T细胞需要在毒性不受控制的情况下主动消除这些细胞的策略。大剂量脉冲治疗类固醇在应用碳酸酐酶IX特异性CAR T细胞后停止了自身免疫。虽然这是非选择性地清除激活的T细胞，但可以通过特定靶向更有选择性地消除CAR T细胞。CAR结合域基本上也可以通过抗独特型抗体进行靶向，以诱导CAR T细胞的溶解性消除。通过给予识别细胞外CAR结构域中整合的表位的消耗性、FDA批准的抗体，也可以实现CAR T细胞的消耗。例子包括使用利妥昔单抗来消耗具有CD20表位或模拟表位的CAR T细胞，或使用西妥昔单抗来消耗具有EGFR表位的CAR T细胞。是否能够迅速实现足够的CAR T细胞清除以逆转正在进行的CRS，还有待在临床情况下证明。 诱导凋亡的CAR T细胞消除似乎是这种情况下更快速的解决方案。转基因脲酶-9（Cas9）与FKBP1A相连，在系统应用原本惰性的小分子AP1903后，会在工程化CAR T细胞中诱导凋亡，该分子促进二聚体化和激活诱导性Cas9（iCas9）。这种策略是有效的，因为供体T细胞介导的GvHD可以在实验系统中通过iCas9介导的T细胞凋亡在一小时内停止。 与其消除CAR T细胞，不如通过整合模块控制细胞表面的CAR。CAR被设计为融合蛋白，整合了一个自切割降解结构域，该结构域被可以被特定蛋白酶抑制剂特异性阻断的蛋白酶反向调节。在蛋白酶存在的情况下，产生的CAR融合蛋白从连接的降解结构域分离并表达在细胞表面；抑制蛋白酶导致CAR降解和缺乏表面表达。 CAR也可以通过添加酪氨酸激酶抑制剂dasatinib来降低其表达或调节其信号强度，该抑制剂可以迅速且可逆地阻断Lck激活；从而在小鼠模型中减少CRS的严重程度。该策略的好处是，只要存在dasatinib，CAR T细胞的信号强度就会减弱，但不会被清除；然而，该策略仍需临床验证。 需要进一步开发以降低细胞因子介导毒性风险的CAR。调节信号强度的一个关键是CAR共刺激。CD28-ζ CAR更快地诱导T细胞激活，并诱导更高的细胞因子释放、扩增和随后的耗竭，而4-1BB-ζ CAR则驱动较少的急性扩增，但具有较低的细胞因子水平，因此与严重CRS的风险较低。因此，4-1BB-ζ CAR可能更适用于肿瘤负荷和抗原密度高的患者，而CD28-ζ CAR可能需要用于肿瘤负荷低的情况。 降低CAR介导的T细胞激活的其他策略，例如，修改CD8跨膜和铰链区域，从而降低ICANS或高于1级CRS的风险。作为一种替代策略，“通用”CAR允许通过调整将CAR T细胞与目标细胞链接的适配器分子来动态控制T细胞激活。 13.CAR T细胞治疗的挑战 在过去的几年里，临床试验正致力于将CAR T细胞治疗确立为治疗几种类型的B细胞白血病和淋巴瘤；然而，在治疗其他恶性疾病的方面，仍然存在重大障碍。 13.1.如何选择最佳的肿瘤选择性抗原作为靶标？ 在CAR T细胞治疗中，肿瘤靶向的选择性对于长期兼容性至关重要。大多数可靶向的肿瘤相关抗原并不具有肿瘤选择性，这增加了CAR T细胞疗法中诱导靶上非肿瘤毒性的风险。肿瘤特异性的表面蛋白突变或肿瘤相关糖基化变体如Muc1或Muc16是罕见的。然而，有些抗原虽然由健康组织表达，但似乎是安全的靶标。例如，癌胚抗原（CEA，CD66e）严格表达在胃肠道和肺部健康上皮的腔面，而在癌细胞上以去极化方式表达。系统性应用CEA特异性CAR T细胞（NCT01212887, NCT02349724）和通过肝动脉输注局部给药的抗CEA CAR T细胞（NCT01373047）在减缓肿瘤进展的同时，并未诱发治疗相关结肠炎。其他如ErB2等抗原可能在高表达ErB2的肿瘤细胞被选择性靶向时是合适的靶标，同时保留中低表达的健康细胞。 为了增加肿瘤选择性，优先考虑靶向一组抗原模式而不是单一特定抗原。技术上，在同一T细胞中共表达两种具有不同特异性的CAR，以在两种CAR同时结合它们相应的抗原时仅诱导完全的T细胞激活；一种CAR提供主要信号，另一种CAR提供共刺激信号，从而仅在存在两种抗原的情况下补充完全T细胞激活所需的信号。该策略需要一个弱的主要信号，以避免在存在一种抗原的情况下进行一些基本的CAR T细胞激活，以及一个强的共刺激信号以驱动完全的T细胞激活。 为了在结合健康细胞时阻断CAR T细胞激活，与激活性CAR共表达具有细胞内PD-1或CTLA-4信号传导的抑制性CAR（iCAR）。iCAR识别健康细胞上存在但在癌细胞上不存在的抗原。因此，仅在结合缺乏iCAR识别的抗原的目标细胞时才发生CAR T细胞激活。 有些抗原在癌细胞上的表达水平高于健康细胞；“亲和力调节”CAR结合域可能有助于区分这两种组织。虽然在临床前模型中证明了可行性，但癌细胞可能通过下调相应抗原来逃避监视。亲和力调节的治疗窗口狭窄，因为增加亲和力可能导致识别健康细胞，如GD2特异性CAR在实验模型中诱发致命性脑炎。 13.2.如何优化CAR结构？ 目前临床评估中的大多数CAR基于近二十年前设计的原型CAR结构。临床前研究表明，对于每种抗原，特定CAR需要针对目标抗原表位、结合亲和力、间隔区长度以及信号传导和跨膜结构域等进行优化。由于各组分之间复杂的依赖性，目前无法预测特定抗原的最佳CAR组成。例如，结合亲和力和目标表位的位置为靶向高抗原负载的癌细胞同时保留低抗原负载的健康细胞提供了狭窄的亲和力窗口。 13.3.如何在CAR T细胞治疗后建立长期癌症控制？ 尽管在儿童B-ALL中可以高频率诱导完全缓解，但约40%的白血病患者在持续存在CAR T细胞的情况下仍然复发。多种原因导致复发频率高，包括整个CD19分子的丢失或表达缺乏目标外显子2的CD19异构体，从而使其对CAR T细胞不可见。在CD19 CAR治疗后，B-ALL的两个案例中通过转换为CD19阴性的髓系谱系丢失CD19。在这种情况下，靶向对癌细胞存活至关重要的抗原将是一个理想的策略。由于这样的抗原通常不可用，通过双特异性CAR共靶向第二种抗原（例如CD20或CD22）可能会增加对白血病细胞的治疗压力。在实体瘤中这种情况更为重要，因为它们在抗原表达上通常表现出深刻的异质性；在初始肿瘤消退后的早期肿瘤复发可能是由于选择抗原丢失的癌细胞。这些癌细胞可能以抗原非依赖性方式被先天免疫细胞反应识别和消除。为了吸引和激活先天细胞并启动更广泛的免疫反应，CAR T细胞在实验模型中被赋予了诱导释放转基因IL-12的能力，使抗肿瘤攻击更有效。有一些迹象表明，结合抗原依赖性和非依赖性免疫反应可能在长期内控制肿瘤。 13.4.哪种T细胞亚群提供长期肿瘤控制？ 临床前模型表明，具有增强扩增能力和长期持久性的原始或早期中央记忆T细胞是过继治疗最合适的细胞。沿着这条线，CD62L+记忆T细胞似乎表现出优越的性能。发现中央记忆干细胞（TSCMs），这是CD62L+中央记忆T细胞库的一部分，具有非凡的扩增潜力，激发了对这些细胞进行过继细胞治疗的探索。人们对识别和调节干细胞样T细胞形成和维持的因素和调控网络越来越感兴趣，因为这些细胞在过继转移到患者后似乎对长期治疗效果至关重要。另一种策略是基于预测性地诱导T细胞成熟。例如，4-1BB共刺激在年轻T细胞中启动中央记忆T细胞反应，这与CD28 CAR T细胞表现出更短暂的效应细胞反应形成对比。另一方面，更成熟的阶段的细胞在大多数肿瘤所在的外围显示出优先积累。然而，这些细胞需要不同的共刺激信号，即优先迁移到外围的CCR7− T细胞从联合CD28-OX40共刺激中受益。特定T细胞亚群的功能能力也可以通过与激酶抑制剂的联合治疗来调节；ibrutinib，一种布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂，降低了PD-1和CAR T细胞的耗竭，从而增加了持久性和抗肿瘤活性。 13.5.如何使CAR T细胞制造适应日益增长的患者数量？ 目前，大多数CAR T细胞由专门的GMP设施生产，冷冻并运送到患者的医院。生产越来越多的细胞产品将使当前程序达到极限，特别是当及时需要数千个自体细胞产品时。在医院内（半）自动化、完全控制和完全封闭系统的分散制造是解决这种情况的首选概念之一。这也将需要在制造过程中高度标准化，并避免血液和细胞产品运输中的复杂物流。作为另一种概念，一个高度专业化的、集中的生产设施，具有多个并行的自动化制造过程，可能作为患者细胞产品的区域供应商。 另一个限制是由患者自体T细胞治疗的需要设定的；对于每位患者来说，“通用”供体将使治疗在多个方面更容易。一个包含不同工程化CAR的“通用”供体T细胞产品库将在临床应用中提供更大的灵活性，根据患者的具体情况。此外，扩大生产规模将使更多的患者能够使用CAR T细胞产品。正在努力生成可以应用于众多患者的这种“通用”T细胞。这需要使CAR T细胞对宿主免疫细胞“隐形”，缺乏对患者健康组织的异体反应性，同时保留CAR介导的抗肿瘤活性。在这种情况下，通过基因组编辑技术获得的MHC缺陷、CAR修饰的病毒特异性T细胞和TCRα敲除T细胞，目前正在开发作为“现成的”或“第三方”细胞产品，GvHD风险低。CAR基因插入TCRα位点一步实现CAR的遗传工程和TCR表达的废除。编辑MHC I类以防止宿主识别和排斥供体T细胞可能通过NK细胞诱导消除，并不防止MHC II类介导的排斥。然而，目前探索的所有基因编辑程序在某种程度上都容易受到非目标修饰的影响，因此与意外的突变风险相关。该领域发展迅速，首次使用异体CAR T细胞治疗B细胞恶性肿瘤和实体瘤的试验已经启动。 13.6.如何平衡CAR T细胞的疗效和副作用？ 目前，一些CAR T细胞治疗与高风险的严重副作用相关，可能需要重症监护住院治疗。尽管各种CAR T细胞协议和治疗程序不同，并且没有在比较性的临床环境中进行评估，但一些临床管理规则变得明显。例如，CRS的早期诊断、分级和临床管理将标准化，建立共识的治疗方案。在毒性不受控制的情况下，可以通过各种手段选择性地和迅速地消除CAR T细胞。通过添加二聚体化剂AP1903二聚体化转基因诱导的脲酶-9（iCasp9），在30分钟内消除超过90%的T细胞。或者，通过给予针对CAR结构域或共表达表位的抗体，诱导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）清除循环中的CAR T细胞。免疫介导的CAR T细胞消除的缺陷仍然是，癌症患者的潜在功能障碍免疫系统可能通过ADCC消除CAR T细胞的能力有限。 13.7.我们是否需要针对每种癌症类型的特定预处理？ 在大多数试验中，患者在过继T细胞治疗前接受非清髓性淋巴细胞减少，使用氟达拉滨和环磷酰胺；这种预处理的理由是暂时提供“空间”和细胞因子，以实现转移的CAR T细胞在体内的充分扩增。淋巴细胞减少还通过免疫调节提供抗肿瘤效果，因为它耗尽抑制细胞，并在肿瘤破坏时释放肿瘤相关抗原到免疫系统。尽管目前的预处理方案基本上是有效的，但基本方案可能需要针对每种癌症实体进行调整。例如，用于治疗Her2+肿瘤的调节方案通过应用nab-紫杉醇来耗尽间质性基质，并促进Her2呈递，并通过应用环磷酰胺耗尽Treg和MDSC，用于胆道和胰腺癌的修改。另一方面，预处理在CAR T细胞治疗的背景下可能具有高度毒性，通过诱导脑水肿和神经系统毒性，特别是在最近的一项试验（NCT02535364）中观察到的氟达拉滨治疗后。 13.8.如何激活免疫网络以诱导广泛的炎症性抗肿瘤反应？ CAR T细胞作为“活药”，越来越成为在目标器官产生和释放生物活性化合物的“活工厂”。使用CAR T细胞作为工厂的合理性基于实验肿瘤模型的证据，即宿主免疫系统在肿瘤排斥中起着重要且必要的作用，这使得在目标肿瘤组织内产生免疫刺激性条件成为必要。释放IL-12的CAR T细胞（IL-12 TRUCKs）可以通过吸引和激活M1型巨噬细胞来在肿瘤组织中诱发免疫反应，这些巨噬细胞可以消除CAR T细胞未能识别的癌细胞。其他具有特定影响局部免疫环境的细胞因子也可以使用；释放IL-18的CAR T细胞增加了肿瘤相关CD206+ M1型巨噬细胞和NKG2D+ NK细胞的数量，并减少了如Treg细胞、CD103+树突细胞和M2型巨噬细胞等抑制细胞。目前正在试验中探索使用靶向PD-1的检查点阻断，以激活CAR T细胞和浸润性淋巴细胞（NCT02650999）；其他检查点的阻断或组合，以重新激活肿瘤内源性免疫细胞，同样值得进行临床探索。 14.CAR T细胞用于其他疾病的治疗 将T细胞激活重定向的CAR不仅限于靶向癌细胞，还可以用于靶向任何由目标抗原定义的细胞。通过抗Dsg3 CAR靶向记忆B细胞的CAR T细胞被设计用来消除导致天疱疮病理的细胞。通过识别MHC呈递的自身抗原的CAR T细胞靶向自反应性T细胞。CAR被工程化以靶向病毒感染的细胞，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒和HIV感染的细胞。源自Dectin-1的CAR T细胞被用于破坏真菌Aspergillus的发芽。实验模型暗示，CAR重定向的Treg细胞可用于促进自身免疫疾病如结肠炎、过敏性哮喘和移植物抗宿主病的免疫耐受治疗，通过靶向HLA。最近，通过识别心脏成纤维细胞激活蛋白（FAP）的CAR T细胞靶向心脏纤维化，该蛋白在心肌损伤重塑时由心脏成纤维细胞高度表达。采用FAP特异性CAR的T细胞过继转移减少了心脏纤维化并恢复了小鼠的损伤后功能。该报告暗示CAR T细胞作为“活药”，在治疗目前疗法非常有限的心脏病中消除激活的心脏成纤维细胞。CAR T细胞用于治疗非恶性疾病其他应用的临床前开发正在进行中。 要点 采用嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞的过继细胞治疗在某些血液学恶性肿瘤中取得了显著的治疗效果；然而，在其他疾病中的治疗效力仍然有限。 CAR是由结合域、跨膜域和细胞内信号传导域组成的模块化、重组的跨膜分子，用以激活工程化细胞。最佳分子设计需要通过变化组成域在每种情况下探索。 原型CAR设计可以通过使用各种靶向和信号传导元件进行修改，使CAR更加通用。此外，各种免疫细胞可以通过CAR重定向，提供方便的治疗细胞。 CAR T细胞治疗经常与毒性相关，这些毒性可以通过同时进行的治疗、改变CAR设计和靶向替代抗原来减少靶上非肿瘤毒性来减轻。 通过共同激活广泛的免疫反应、共同靶向肿瘤基质、癌症干细胞和其他与肿瘤相关的结构，可以提高CAR工程化免疫细胞的抗肿瘤效力。 生产CAR T细胞产品仍然具有挑战性，为所有患者提供个性化治疗；正在努力为广泛的患者群体制造异体细胞产品“现成”。 下章预告：抗体关键特性的改进 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 第七章：双特异性抗体 第八章：抗体偶联药物 第九章：替代性结合框架：用于基础研究和治疗应用的多功能结合剂 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

▎药明康德内容团队编辑 本期看点 1. 现货型同种异体嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法azer-cel在一项1b期临床试验中使3名复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者获得完全缓解（CR），CR率为33%。 2. 治疗因GUCY2D双等位基因突变引起的Leber先天性黑蒙（LCA1）患者的在研基因疗法ATSN-101的早期临床试验结果积极，高剂量组患者的一项视力指标改善了100倍。 3. 治疗杜氏肌营养不良（DMD）的在研抗体偶联寡核苷酸疗法DYNE-251在一项早期临床试验中使多个队列患者的抗肌萎缩蛋白表达达到前所未有的水平，且患者的临床功能获得改善。 药明康德内容团队整理 Azer-cel：公布1b期临床试验数据 Imugene公司宣布，其现货型同种异体CD19靶向CAR-T细胞疗法azercabtagene zapreleucel（azer-cel）治疗复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（一种非霍奇金淋巴瘤）的1b期临床试验取得了令人鼓舞的初步结果。该研究针对的是接受自体CAR-T细胞疗法治疗后复发的DLBCL患者，所有患者在试验前均接受过4-5线治疗。截至目前，已有10名患者接受了azer-cel治疗，A队列的6名患者接受了azer-cel+清淋化疗治疗，B队列的4名患者接受了azer-cel+清淋化疗+白介素-2（IL-2）治疗。 研究结果显示，所有接受azer-cel和清淋化疗的患者都显示出可接受的安全性。此外，azer-cel+清淋化疗+IL-2的治疗在DLBCL患者中显示出了临床上有意义的疗效和持续性。在所有接受治疗的患者中，总缓解率为44%，其中3名患者达到了CR，1名患者达到了部分缓解（PR）。队列B中获得CR的两名患者已分别持续缓解超过90天和120天。目前，B队列的4名患者均仍在试验中，1名患者在等待评估。 ▲Azer-cel的1b期研究结果（图片来源：参考资料[1]） 除了研究azer-cel在血液癌症中的疗效外，Imugene公司还计划将azer-cel与其新颖的onCARlytics结合，用于治疗实体肿瘤患者。 ATSN-101：公布1/2期临床试验数据 Atsena Therapeutics公司公布了其在研基因疗法ATSN-101治疗因GUCY2D双等位基因突变引起的Leber先天性黑蒙患者的1/2期临床试验数据。ATSN-101是一种以腺相关病毒5（AAV5）为载体的基因治疗药物，通过视网膜下注射将功能性的人类GUCY2D基因引入光感受器。ATSN-101已获得美国FDA授予的罕见儿科疾病认定、再生医学先进疗法认定和孤儿药资格，用于治疗GUCY2D相关LCA1。 该研究中，15名经过确认的LCA1患者接受了单侧视网膜下注射，以确定ATSN-101的安全性和初步有效性。结果显示，在高剂量组中，暗适应全视场刺激测试（FST）的平均变化为20.3 dB，这意味着接受治疗眼睛的暗适应FST改善了100倍。这种改善在第28天时首次被观察到，并持续了12个月（p=0.012）。在最佳矫正视力（BCVA）方面也观察到轻微的改善，治疗后第12个月时高剂量组的平均改善为0.16 logMAR，或相当于视力表上的8个字母（p=0.10）。 安全性方面，所有不良事件的严重程度均为轻度（91%）或中度（9%）。没有报告与药物相关的严重不良事件，且大多数治疗伴发不良事件与手术过程相关。眼部炎症为轻度，并可通过类固醇治疗逆转。 DYNE-251：公布1/2期临床试验的新数据 Dyne Therapeutics公司公布了其进行中的1/2期试验DELIVER的最新临床数据。该试验旨在评估其在研抗体偶联寡核苷酸疗法DYNE-251在适合进行外显子51跳跃治疗的杜氏肌营养不良患者中的疗效与安全性。DYNE-251由磷酸二氨基甲酰吗啉寡核苷酸（PMO）与靶向转铁蛋白受体1（TfR1）的抗体片段（Fab）偶联而成，TfR1在肌肉组织中高度表达。该疗法旨在实现靶向肌肉组织递送，促进核内外显子跳跃，从而使肌肉细胞生成截短但功能正常的抗肌萎缩蛋白，目标是停止或逆转疾病的进展。 此次公布的结果显示，在接受DYNE-251治疗后，多个队列患者的抗肌萎缩蛋白表达达到前所未有的水平，且患者的临床功能获得改善。接受20 mg/kg剂量治疗患者的平均绝对抗肌萎缩蛋白表达为正常值的3.71%（未根据肌肉含量进行调整），比接受每周一次标准治疗的临床试验中所报告的0.3%高出10倍以上。接受20 mg/kg和10 mg/kg剂量治疗的患者在多个临床功能终点均有显著改善，包括北极星步行评估（NSAA）、步速95百分位数（SV95C）、10米步行/跑步时间（10-MWR）、从地面起身的时间。在试验6个月到12个月期间，10 mg/kg组患者在所有的指标中均显示出持续改善。基于这些积极数据和与监管单位讨论的结果，Dyne正在准备启动DELIVER试验中的注册性队列。 VAX-31：公布1/2期临床试验数据 Vaxcyte公司宣布，其候选31价肺炎球菌结合疫苗VAX-31在一项针对1015名50岁及以上健康成人的1/2期临床试验中取得了积极的顶线结果。基于这一积极结果，该公司已决定将VAX-31推进至成人3期临床试验。 在这项1/2期研究中，VAX-31在所有研究剂量中均显示出良好的耐受性，并在整个六个月的评估期间展现了与获批20价肺炎球菌结合疫苗相似的安全性。VAX-31在所有研究剂量中对所有31种血清型均表现出强劲的调理吞噬作用（OPA）免疫反应。在中剂量和高剂量下，VAX-31与获批疫苗相比，针对两种疫苗共享的20种血清型，均达到或超过了OPA反应非劣效性标准。高剂量的VAX-31与获批20价疫苗相比，20种血清型中18种的平均OPA免疫反应更强，其中7种血清型的免疫反应显著高于活性对照。对于VAX-31独有的11种血清型，所有三种剂量与获批20价疫苗相比均达到了优效性标准。 JNT-517：公布1/2期临床试验的新数据 Jnana Therapeutics公司公布了其在研疗法JNT-517治疗苯丙酮尿症（PKU）成人患者的1/2期临床试验中的第二剂量组（150 mg，每日两次）的试验结果。JNT-517是一种针对苯丙氨酸（Phe）转运蛋白SLC6A19的小分子抑制剂，为潜在“first-in-class”口服疗法，适用于所有年龄段和基因型的PKU患者。 此次公布的150 mg组数据基于18名受试者，其中11人服用JNT-517，7人服用安慰剂，历时28天。结果显示，JNT-517在第14、21、28天将患者平均血液Phe水平较基线降低了60%（p<0.0001）。相比之下，之前研究的75 mg剂量组在相同时间段内的平均血液Phe水平降低了44%。患者在用药开始后7天内观察到快速的疗效，血液Phe水平显著降低，并在28天的用药期间持续维持。无论基线Phe水平或之前的PKU治疗史如何，所有参与者均表现出显著的疗效。安全性方面，JNT-517耐受性良好，无严重不良事件，无临床显著的实验室参数变化，除Phe外，未观察到血液氨基酸的临床显著变化，与75 mg剂量组和1a期健康志愿者研究的安全性一致。基于这些积极结果，该公司计划在2025年初启动关键性3期临床试验，评估JNT-517治疗PKU的效果。 BX004：公布1b/2a期临床试验的新数据 BiomX公司公布了其用于治疗铜绿假单胞菌（PsA）引起慢性肺部感染的囊性纤维化（CF）患者的固定多噬菌体组合疗法BX004的1b/2a期研究的新数据。PsA是引起CF患者肺部感染和死亡的主要因素。BX004旨在靶向和破坏PsA。 此次公布的结果显示，在研究的第一部分，接受BX004-A鸡尾酒疗法的受试者在第15天时，其痰液中的PsA菌落形成单位（CFU）/g的减少幅度较基线相比更大，而安慰剂组没有这种效果。在试验的第二部分，14%的BX004-A治疗组受试者在第10天（治疗结束）时痰液中的PsA培养结果为阴性，而安慰剂组的这一比例为0%。此外，在持续使用相同吸入抗生素且未更换或交替使用抗生素、正在接受elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor（ETI）标准治疗、1秒用力呼气量（FEV1）＜70%的肺功能较差的患者亚组中，BX004-A治疗组患者的肺功能（以FEV1衡量）增加了5.66%，而安慰剂组则下降了3.23%。此外，所有接受BX004-A治疗的受试者痰液中均检测到了噬菌体，治疗过程中未发现与治疗相关的噬菌体耐药性，也没有严重的不良事件。 APTN-101：IND申请获得FDA许可 Adaptin Bio公司宣布其主打项目APTN-101的IND申请已获美国FDA批准，该公司即将推动该候选药物的“first-in-human”临床1期试验，以评估其用于治疗胶质母细胞瘤（GBM）的疗效与安全性。APTN-101是该公司专有的BRiTE（大脑双特异性T细胞接合剂）疗法，设计靶向EGFRvIII分子，这是一种与侵袭性脑肿瘤相关的蛋白。在临床前研究中，APTN-101具有超过对照药物7倍的大脑分布增强的效果，并在消除恶性胶质瘤肿瘤方面表现强劲，具有成为“best-in-class”药物的潜力。 MDG1015：IND申请获得FDA许可 Medigene公司宣布，其主打项目MDG1015的IND申请已获得美国FDA的批准，可启动1期临床试验，针对晚期胃癌、卵巢癌、粘液样/圆细胞脂肪肉瘤和滑膜肉瘤患者。MDG1015是一种潜在“first-in-class”的第三代T细胞受体（TCR）工程化T细胞疗法，靶向NY-ESO-1/LAGE-1a，其TCR能够特异性识别靶点，同时具有较高的安全性和敏感性。这些TCR-T细胞通过添加专有的PD1-41BB共刺激开关蛋白（CSP）技术得到进一步增强，对表达不同水平PD-L1的肿瘤细胞均具有显著增强的抗肿瘤活性。 与第一代TCR-T疗法相比，MDG1015的生产过程更快，只需要6天就可以扩增出治疗所需的细胞。这些细胞更年轻、更健康，在治疗时需要的细胞数量可能更少。整个治疗过程从采集患者的细胞到输注治疗的时间缩短到大约20天。此外，生成的MDG1015细胞几乎都是CD8+细胞，其中大约95%的细胞都具有类似干细胞的特质，这意味着它们可以在体内存活更长时间，提供更持续的治疗效果，同时可能减少不良事件。 OpCT-001：IND申请获得FDA许可 BlueRock Therapeutics公司宣布OpCT-001的IND申请已获得美国FDA的批准。OpCT-001是一种在研诱导多能干细胞（iPSC）衍生的细胞疗法，旨在治疗原发性光感受器疾病。原发性光感受器疾病是遗传性视网膜病变的一个亚组，影响视网膜中光感受器细胞的结构和功能，导致儿童和成人视力的不可逆丧失。新闻稿指出，OpCT-001是首个针对原发性光感受器疾病进行临床测试的iPSC衍生细胞疗法。 LA-GLA：IND申请获得FDA许可 Hanmi Pharmaceutical公司宣布，其用于治疗法布里病的候选药物LA-GLA的IND申请已获得美国FDA的批准。目前，大多数法布里病患者通过使用基因重组技术开发的酶替代疗法进行治疗，患者每两周需要到医院接受长时间的静脉注射。LA-GLA是一种每月一次皮下注射的下一代长效酶替代疗法，使用更具便利性。在非临床研究中，LA-GLA在改善肾功能、血管疾病和外周神经障碍方面显示出优于现有治疗药物的效果。基于这些成果，该药物于2024年5月获得了美国FDA授予的孤儿药资格。 ▲欲了解更多前沿技术在生物医药产业中的应用，请长按扫描上方二维码，即可访问“药明直播间”，观看相关话题的直播讨论与精彩回放 参考资料（可上下滑动查看） [1] Three Complete Responses in Azer-Cel Allogeneic CD19 CAR T Phase 1b Trial in Blood Cancer (Diffuse Large B-Cell Lymphoma). 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