南方科技大学饶海团队发布基于N端降解机制的新型PROTACs研究

蛋白水解靶向嵌合体技术（PROTACs）是一种通过连接子将目标蛋白（POI）与E3连接酶相连，促使目标蛋白被泛素化并最终降解的技术。自2002年诞生以来，这一技术已发展了二十多年，多个PROTACs分子已进入临床试验阶段，例如Arvinas公司的ARV-471。然而，尽管已有超过600种E3连接酶被发现，目前仅有少数几种能够应用于PROTACs的设计和开发，如VHL与CRBN。由于CRBN和VHL在不同细胞或组织中的特异性表达差异，以及相应配体较大的分子量，PROTACs的开发面临挑战。此外，度胺类配体的潜在致畸副作用也限制了其应用，亟需寻找新的降解信号以优化PROTACs技术。

非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的肺癌类型之一，分子特征复杂且容易产生耐药性，治疗难度极大。ALK重排和EGFR突变是NSCLC中最重要的致癌驱动因素。目前虽已有多种ALK和EGFR酪氨酸激酶抑制剂问世，但持续性结合目标激酶容易导致耐药性，限制了长期疗效。

南方科技大学饶海教授课题组针对这一问题，利用N-末端降解途径的氨基酸（甘氨酸、脯氨酸和赖氨酸）为E3连接酶配体，设计了能够降解EML4-ALK和突变型EGFR的全新PROTACs分子，称为AATacs。该研究发表在Journal of Medicinal Chemistry上。N-末端降解技术的核心在于不稳定的蛋白N-末端残基易被修饰并暴露出来，随后被E3连接酶识别并经泛素-蛋白酶体途径降解。研究人员通过聚乙二醇（PEG）连接子将三种氨基酸残基（Pro、Gly和Lys）与ALK酪氨酸激酶和EGFR激酶抑制剂Brigatinib相连，设计并合成了AATacs分子。通过调整PEG连接子的数量，研究人员探索了最佳连接子长度，并发现PEG3为最佳选择。

研究人员在H3122（EML4-ALK）和H1975（EGFR-L858R/T790M）细胞中评估了基于Pro的不同连接子长度的AATacs的降解能力。尽管连接子长度不同，这些化合物均能显著下调H3122细胞中EML4-ALK蛋白或H1975细胞中EGFRL858R/T790M蛋白的含量。研究表明Pro-PEG3-BA活性最优，随后将Pro替换为Lys与Gly进行改造，结果也显示出良好的降解活性。此外，通过蛋白质组学分析，研究人员证明了Pro-PEG3-BA处理的H3122细胞中ALK蛋白含量降低最为明显，表明该AATacs分子具有良好的选择性。

在进一步评估中，Pro-PEG3-BA、Lys-PEG3-BA、Gly-PEG3-BA在H3122细胞中对EML4-ALK蛋白的DC50值分别为0.42 μM、1.32 μM和0.50 μM，且Dmax均大于90%。在H1975细胞中AATacs对EGFR L858R/T790M蛋白的降解能力显著降低，DC50值均高于10 μM。CCK-8细胞毒性实验显示，Pro-PEG3-BA在H3122细胞中比原药BA更强的抑制细胞增殖的活性，表明PROTAC化改造提升了化合物的抗肿瘤活性。此外，Pro-PEG3-BA在正常细胞中没有表现出毒性，表明其安全性良好。蛋白酶体抑制剂MG132的引入也证明了AATacs分子通过蛋白酶体途径进行降解。

研究人员进一步探究了AATacs的作用机制，鉴定了参与AATac介导降解的E3连接酶。通过敲低或沉默H3122和H1975细胞中的GID4、ZYG11B和ZER1蛋白，研究人员证明GID4介导了Pro-AATacs的降解，ZYG11B和ZER1介导了Gly-AATacs的降解，而Lys-AATacs的媒介E3连接酶尚不明确。

最后，研究人员评估了Pro-PEG3-BA的药代动力学性质。静脉给药半衰期（T1/2）为2.9小时，腹腔给药时为5.2小时，表明该分子代谢较慢，能提高患者依从性。生物利用度约为53.2%。在H3122异种模型中，以10 mg/kg腹腔给药能显著降低肿瘤组织中ALK水平，体现出良好的抗肿瘤活性。

用于PROTACs开发的E3连接酶数量有限、潜在副作用风险大和类药性差是设计的难点。使用激酶抑制剂治疗NSCLC产生的耐药性也严重影响药物疗效。研究运用N-末端降解技术，以小分子量氨基酸为配体招募新的E3连接酶，结合Brigatinib开发了基于氨基酸的AATacs分子，特别是Pro-PEG3-BA展现了良好的降解活性和药动学性质，为NSCLC治疗提供了新的策略，展现了PROTACs在癌症治疗中的前景。

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