更新于：2024-04-01

CRBN

Cereblon蛋白

更新于：2024-04-01

基本信息

别名

CRBN蛋白、cereblon、CRBN

+ [4]

简介

Substrate recognition component of a DCX (DDB1-CUL4-X-box) E3 protein ligase complex that mediates the ubiquitination and subsequent proteasomal degradation of target proteins, such as MEIS2 or ILF2 (PubMed:33009960). Normal degradation of key regulatory proteins is required for normal limb outgrowth and expression of the fibroblast growth factor FGF8 (PubMed:20223979, PubMed:24328678, PubMed:25043012, PubMed:25108355). Maintains presynaptic glutamate release and consequently cognitive functions, such as memory and learning, by negatively regulating large-conductance calcium-activated potassium (BK) channels in excitatory neurons (PubMed:18414909, PubMed:29530986). Likely to function by regulating the assembly and neuronal surface expression of BK channels via its interaction with KCNT1 (PubMed:18414909). May also be involved in regulating anxiety-like behaviors via a BK channel-independent mechanism (By similarity). Plays a negative role in TLR4 signaling by interacting with TRAF6 and ECSIT, leading to inhibition of ECSIT ubiquitination, an important step of the signaling (PubMed:31620128).

关联

项与 CRBN 相关的药物

Pomalidomide

泊马度胺

靶点

CRBN x IL-6 x TNF x TNF-α

作用机制

CRBN调节剂 [+3]

在研机构

原研机构

在研适应症

非在研适应症

最高研发阶段批准上市

首次获批国家/地区

美国

首次获批日期2013-02-08

Lenalidomide

来那度胺

靶点

CK1α x CRBN x IFNγ x IKZF1 x IKZF3 x IL-2 x IL-6 x TNF-α

作用机制

CK1α抑制剂 [+7]

在研机构

Bristol-Myers Squibb Pharma EEIG [+20]

原研机构

Celgene Corp.

在研适应症

弥漫性大B细胞淋巴瘤 [+51]

非在研适应症

Aase Smith综合征II型 [+123]

最高研发阶段批准上市

首次获批国家/地区

美国

首次获批日期2005-12-27

Iberdomide

伊伯多胺

靶点

CRBN x IKZF1 x IKZF3

作用机制

CRBN调节剂 [+2]

在研机构

Bristol Myers Squibb Co. [+8]

原研机构

Celgene Corp.

在研适应症

多发性骨髓瘤 [+9]

非在研适应症

肝损伤 [+4]

最高研发阶段临床3期

首次获批国家/地区-

首次获批日期1800-01-20

1,773

项与 CRBN 相关的临床试验

NCT06058689 / Not yet recruiting临床1期

A Pilot, Open-label, Randomized, Two-Way Crossover, Single-Dose Bioequivalence Study of Pomalidomide Under Fasting Condition in Indian Healthy Volunteers

Pilot bioequivalence trial of two pomalidomide formulations consisting in 4 mg oral capsules.

开始日期2024-09-15

申办/合作机构

Megalabs

NCT06015880 / Recruiting临床1期IIT

A Phase 1 Study of Mosunetuzumab With Polatuzumab Vedotin and Lenalidomide (M+Pola+Len) in Relapsed/Refractory (R/R) Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL)

This phase I trial studies the side effects and best dose of mosunetuzumab when given together with polatuzumab vedotin and lenalidomide in treating patients with diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) that has come back after a period of improvement (relapsed) or that has not responded to previous treatment (refractory). Mosunetuzumab and polatuzumab vedotin are monoclonal antibodies that may interfere with the ability of cancer cells to grow and spread. Polatuzumab, linked to a toxic agent called vedotin, attaches to CD79B positive cancer cells in a targeted way and delivers vedotin to kill them. Lenalidomide may stimulate or suppress the immune system in different ways and stop cancer cells from growing and by preventing the growth of new blood vessels that cancer cells need to grow. Giving mosunetuzumab with polatuzumab vedotin and lenalidomide may work better in treating patients with relapsed/refractory DLBCL.

开始日期2024-09-03

申办/合作机构

National Cancer Institute

NCT06207799 / Not yet recruiting临床2期IIT

Pre-transplant Purging and Post-transplant MRD-guided Maintenance Therapy With Elranatamab in Patients With High-risk Multiple Myeloma

To learn if giving elranatamab before and after an autologous stem cell transplant (ASTC) can help to control newly diagnosed, high-risk MM. An ASTC is a type of transplant in which a person's own stem cells are collected, preserved, and returned to them.

开始日期2024-07-30

申办/合作机构

The University of Texas MD Anderson Cancer Center

[+1]

100 项与 CRBN 相关的临床结果

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100 项与 CRBN 相关的转化医学

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0 项与 CRBN 相关的专利（医药）

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793

项与 CRBN 相关的文献（医药）

2024-03-12·Molecular therapy. Nucleic acids

Oligo-PROTAC strategy for cell-selective and targeted degradation of activated STAT3.

Article

作者: Jeremy Hall ; Zhuoran Zhang ; Supriyo Bhattacharya ; Dongfang Wang ; Marice Alcantara ; Yong Liang ; Piotr Swiderski ; Stephen Forman ; Larry Kwak ; Nagarajan Vaidehi ; Marcin Kortylewski

Decoy oligodeoxynucleotides (ODNs) allow targeting undruggable transcription factors, such as STAT3, but their limited potency and lack of delivery methods hampered translation. To overcome these challenges, we conjugated a STAT3-specific decoy to thalidomide, a ligand to cereblon in E3 ubiquitin ligase complex, to generate a proteolysis-targeting chimera (STAT3D^PROTAC). STAT3D^PROTAC downregulated STAT3 in target cells, but not STAT1 or STAT5. Computational modeling of the STAT3D^PROTAC ternary complex predicted two surface lysines, K601 and K626, in STAT3 as potential ubiquitination sites. Accordingly, K601/K626 point mutations in STAT3, as well as proteasome inhibition or cereblon deletion, alleviated STAT3D^PROTAC effect. Next, we conjugated STAT3D^PROTAC to a CpG oligonucleotide targeting Toll-like receptor 9 (TLR9) to generate myeloid/B cell-selective C-STAT3D^PROTAC. Naked C-STAT3D^PROTAC was spontaneously internalized by TLR9⁺ myeloid cells, B cells, and human and mouse lymphoma cells but not by T cells. C-STAT3D^PROTAC effectively decreased STAT3 protein levels and also STAT3-regulated target genes critical for lymphoma cell proliferation and/or survival (BCL2L1, CCND2, and MYC). Finally, local C-STAT3D^PROTAC administration to human Ly3 lymphoma-bearing mice triggered tumor regression, while control C-STAT3D and C-SCR treatments had limited effects. Our results underscore the feasibility of using a PROTAC strategy for cell-selective, decoy oligonucleotide-based STAT3 targeting of and potentially other tumorigenic transcription factors for cancer therapy.

2024-02-21·RSC medicinal chemistry

Development of sulfonyl fluoride chemical probes to advance the discovery of cereblon modulators

Article

作者: Liu, Yingpeng ; Nowak, Radoslaw P. ; Che, Jianwei ; Donovan, Katherine A. ; Huerta, Fidel ; Liu, Hu ; Metivier, Rebecca J. ; Fischer, Eric S. ; Jones, Lyn H.

Sulfonyl fluoride EM12-SF was developed previously to covalently engage a histidine residue in the sensor loop of cereblon (CRBN) in the E3 ubiquitin ligase complex CRL4^CRBN. Here, we further develop the structure-activity relationships of additional sulfonyl fluoride containing ligands that possess a range of cereblon binding potencies in cells. Isoindoline EM364-SF, which lacks a key hydrogen bond acceptor present in CRBN molecular glues, was identified as a potent binder of CRBN. This led to the development of the reversible molecular glue CPD-2743, that retained cell-based binding affinity for CRBN and degraded the neosubstrate IKZF1 to the same extent as EM12, but unlike isoindolinones, lacked SALL4 degradation activity (a target linked to teratogenicity). CPD-2743 had high permeability and lacked efflux in Caco-2 cells, in contrast to the isoindolinone iberdomide. Our methodology expands the repertoire of sulfonyl exchange chemical biology via the advancement of medicinal chemistry design strategies.

2024-02-14·Bioorganic chemistry

Expansion of targeted degradation by Gilteritinib-Warheaded PROTACs to ALK fusion proteins.

Article

作者: Hidetomo Yokoo ; Genichiro Tsuji ; Takao Inoue ; Mikihiko Naito ; Yosuke Demizu ; Nobumichi Ohoka

Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) induce the ubiquitination and subsequent proteasomal degradation of targeted proteins. Numerous PROTACs have emerged as promising drug candidates for various disease-related proteins. This study investigates PROTACs targeted to degrade anaplastic lymphoma kinase (ALK) fusion proteins, which are implicated in diseases such as anaplastic large cell lymphoma and non-small cell lung cancer. We recently reported the development of a gilteritinib-warheaded PROTAC to target and degrade the Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) protein. Gilteritinib is a tyrosine kinase inhibitor that targets FLT3, and recent studies have revealed that it also functions as an ALK inhibitor. We conducted a structure-activity relationship (SAR) study and expanded the range of target proteins for gilteritinib-warheaded PROTACs to include echinoderm microtubule-associated protein-like 4 (EML4)-ALK and nucleophosmin (NPM)-ALK, in addition to FLT3. Our SAR study utilized three types of ligands for E3 ligase- inhibitor of apoptosis protein (IAP), cereblon (CRBN), and von Hippel-Lindau (VHL)- in the PROTAC designs and we observed varied efficacy in the degradation of target proteins. The CRBN-based PROTAC effectively reduced the protein expression of FLT3, EML4-ALK, and NPM-ALK. The IAP-based PROTAC reduced expression of both FLT3 and EML4-ALK proteins but not that of NPM-ALK, while the VHL-based PROTAC was ineffective against all target proteins. Several ALK-targeted PROTACs have already been developed using CRBN or VHL as E3 ligase, but this is the first report of an IAP-based ALK degrader. The length of the linker structure utilized in PROTAC also had a significant effect on their efficacy and activity. PROTACs formed with shorter linkers demonstrated an enhanced degradation activity to target proteins compared with those formed with longer linkers. These findings provide valuable insight for the development of effective PROTACs to target and degrade ALK fusion proteins.

163

项与 CRBN 相关的新闻（医药）

2024-03-30

·精准药物

利用Cullin E3连接酶接头蛋白SKP1进行靶向蛋白降解

研究背景由与E3泛素连接酶配体连接蛋白质靶向配体形成的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）的靶向蛋白质降解已成为一种通过蛋白酶体介导的降解致病蛋白质的强大治疗方式。虽然有超过600个E3连接酶，但是大多数PROTAC只利用了Cullin-RING E3泛素连接酶的底物受体——cereblon和VHL。近年来，还发现了许多其他针对其他E3连接酶的募集蛋白，包括cIAP、MDM2、DCAF16、DCAF11、RNF114、RNF4、FEM1B、KEAP1和DCAF1。并不是所有的E3连接酶都对癌细胞活力至关重要，因此，癌细胞中可能会出现耐药机制，从而损害E3连接酶募集并使PROTAC无效。开发针对泛素-蛋白酶体机制核心成分的募集剂，例如针对对细胞活力至关重要的CUL1-CUL7 E3连接酶中的Cullin-RING E3连接酶复合接头蛋白（如DDB1、SKP1 或ELOB/ELOC）的募集剂，可以避免PROTAC可能产生的潜在未来耐药机制。加州大学伯克利分校Nomura课题组研究了CUL1-RING E3连接酶接头蛋白SKP1是否可以被募集用于PROTAC介导的新底物降解。研究内容该课题组在基于凝胶的基于活性的蛋白质分析（ABPP）中筛选了1284个半胱氨酸反应性共价配体，筛选了针对人SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物（图1）。该筛选产生的性能最良好的化合物是EN884（图2）。EN884显示了SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物中人SKP1蛋白的半胱氨酸反应性探针的剂量反应置换（图3）。图1.半胱氨酸反应性共价配体库筛选结果（针对SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物）图2.EN884结构图3.EN884与半胱氨酸探针反应该课题组对与 EN884 一起孵育的SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物进行了串联质谱（MS/MS）分析，以确定修饰位点（图4），发现了一个被修饰的位点——SKP1上的C160（图5），该位点由于特定的F-Box结构域，表现出独特的构象。因此，该课题组假设EN884可能会利用SKP1和CUL1底物受体之间的集体界面并结合。图4.串联质谱分析图5.结合位点位置接下来，该课题组合成了两个基于EN884的炔烃功能化探针SJH1-37-m、SJH1-37-p（图6）。基于凝胶的ABPP评估这些探针与SKP1复合物的结合，与对位相比，间位结合能力更佳（图7）。图6.探针结构图7.探针结合能力值得注意的是，由于C160位置特殊，EN884和SJH1-37m不与单体SKP1结合（图8）。这表明，CUL1复合物的其余部分，或至少是底物受体，是配体与SKP1结合所必需的。图8.探针与单体SKP1结合该课题组进一步证明，SJH1-37m通过SKP1的下拉在细胞中结合SKP1，而不是不相关的蛋白质，如GAPDH（图9）。图9.SJH1-37m探针的SKP1下拉接下来，该课题组进行了基于质谱的ABPP，以使用先前建立的同位素脱硫生物素-ABPP（isoDTB-ABPP）鉴定HEK293T细胞中EN884参与SKP1的半胱氨酸。该课题组发现EN884在SKP1上与C160有7%的最小参与（图10）。这种最小参与与已应用在PROTAC（包括DCAF16、DCAF11和RNF114）中的其他共价E3连接酶募集剂观察到的最小参与一致。图10.HEK293T细胞中EN884的isoDTB-ABPP分析为了证明共价SKP1配体可用于PROTAC应用，该课题组合成了四种不同的PROTAC，通过C2、C4、C5或PEG3连接子将EN884的衍生物与BET家族抑制剂JQ1连接起来，分别生成SJH1-51A、SJH1-51B、SJH1-51C和SJH1-51D（图11）。所有四种PROTAC都降解了HEK293T细胞中BRD4的短亚型（图12），其中使用C4烷基接头的SJH1-51B观察到的降解最强。图11.四种PROTAC结构图12.四种PROTAC降解效果并且，基于串联质量标记（TMT）的MDA-MB-231细胞中SJH1-51B的定量蛋白质组学分析显示BRD4中等选择性降解，其中16种蛋白质的水平显着降低>50%（图13）。图13.SJH1-51B的定量蛋白质组学与蛋白酶体介导的降解一致，SJH1-51B介导的BRD4降解通过用蛋白酶体抑制剂硼替佐米预处理而减弱（图14）。它还显示出对活性Cullin RING E3连接酶所需的NEDD化的依赖性，NEDD化抑制剂MLN4924可减弱BRD4的降解（图15）。最重要的是，该课题组证明SKP1敲低完全减弱了SJH1-51B在HEK293T细胞中对BRD4的降解（图16）。图14.硼替佐米预处理结果图15.MLN4924预处理结果图16.SKP1敲低细胞结果BRD4是一种相对容易被PROTAC降解的蛋白质。因此，该课题组接下来测试了共价SKP1募集剂是否可用于降解另一种新底物蛋白——雄激素受体（AR）。该课题组合成了4种AR PROTAC，将共价SKP1募集剂与来自ARV-110的Arvinas AR PROTAC靶向配体连接起来，没有连接子或C4、C6或C7烷基连接子，分别产生SJH1-63、SJH1-62C、SJH1-62D和SJH1-62B（图17）。该课题组观察到所有4种PROTAC的AR降解，其中带有C7烷基接头的SJH1-62B在LNCaP前列腺癌细胞中显示出最有效和最强大的AR降解（图17）。图17.四种AR PROTAC结构与降解效果该课题组进一步证明，SJH1-62B介导的AR降解在蛋白酶体抑制剂预处理后减弱（图18）。定量蛋白质组学分析还表明，AR与其他11种蛋白质的选择性降解在5000多种定量蛋白质中也显著降低（图19）。图18.SJH1-62B的硼替佐米预处理结果图19.SJH1-62B的定量蛋白质组学研究总结该课题组发现了一种SKP1募集物，它共价靶向位于SKP1和CUL1 F-box底物受体界面的SKP1的固有无序C160。这一观察结果为发现仅在含有IDR的蛋白质与其相互作用的蛋白质形成复合物时出现的可连接位点提供了概念证明。他们进一步证明，这种共价SKP1配体可用于PROTAC应用，以降解细胞中的新底物，如BRD4和AR。鉴于SKP1的重要性，SKP1的共价募集可能潜在地克服在癌症治疗中利用非本质E3连接酶的PROTAC的耐药性机制。虽然该课题组证明了在PROTAC中使用Cullin RING E3连接酶衔接蛋白的概念，但SKP1配体仍处于早期阶段，需要进行重大的药物化学优化，以提高效力、选择性和类药物特性。该课题组的研究结果还强调了使用共价化学蛋白质组学方法来识别泛素-蛋白酶体系统中蛋白质的补充物的实用性，该系统可用于靶向蛋白质降解应用。作者：潘相奕校审：周金明编辑：郑一榕时间：2024年3月29日参考文献Exploiting the Cullin E3 Ligase Adaptor Protein SKP1 for Targeted Protein Degradation ACS Chemical Biology 2024 19 (2), 442-450. DOI: 10.1021/acschembio.3c00642 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓

蛋白降解靶向嵌合体

2024-03-26

·精准药物

【Nautre子刊】新型E3泛素连接酶KLHDC2成功用于蛋白降解剂的开发

研究背景PROTAC是一种异双功能小分子，由E3连接酶的配体、靶蛋白结合配体和连接两者的连接体组成，促进靶蛋白和连接酶的相互作用，导致靶蛋白的泛素化及降解。虽然存在一些E3连接酶的小分子配体，但大多数降解化合物都是基于VHL和CRBN的配体，这些配体是Cullin-RING连接酶家族(CRLs)中特定E3连接酶的底物识别亚基。迄今为止，大约600个人类E3连接酶中只有少数被应用于TPD。增加TPD中使用的E3的数量将需要识别额外的E3连接的配体。探索除VHL和CRBN外的E3连接酶及其配体可以为TPD应用提供更多的化学选择。CRL包含人类E3连接酶的一个子集，包含约250种与Cullin支架偶联的底物连接蛋白组合，并且底物连接蛋白具有不同的结构和功能。CRL的一个子集在其羧基端消除具有特定氨基酸序列的蛋白质。其中，三种CRL2底物连接蛋白- KLHDC2, KLHDC3和KLHDC 10 -已被证明可以控制以甘氨酸残基结尾的蛋白质的降解。在一项研究中，测量了数千种带有不同C末端附属物的绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白质的稳定性，以甘氨酸结尾的C末端在驱动UPS介导的降解方面是最强的。可转移的降解促进序列称为降解子，具有临界C端残基的序列称为C端降解子。在识别甘氨酸末端C端降解的三个CRL中，对CRL2KLHDC2的研究最为详细。CRL2KLHDC2的最佳底物位于二甘氨酸基序中，在某些情况下，二甘氨酸基序是由蛋白质的内部蛋白水解裂解产生的在二甘氨酸末端底物肽存在的情况下，KLHDC2底物结合kelch结构域(KLHDC2KD)的高分辨率晶体结构已经被确定，提供了C端降解识别的原子水平细节。因此，CRL2KLHDC2是一种E3连接酶，可以驱动其底物蛋白的快速降解，并且具有良好的底物识别袋，使其成为TPD的一个有吸引力的潜在选择。 KLHDC2靶向小分子的发现利用计算机辅助药物设计(CADD)，著名的靶向蛋白降解药物研发公司Arvinas研究团队从KLHDC2KD与其同源C端底物SelK结合的可用晶体结构开始，SelK由其C端甘氨酸残基锚定(PDB：6DO3)。SelK肽的末端甘氨酸(Gly91)被保留，因为它与底物口袋结合最深，并与Ser269、Arg241和Arg236形成四个氢键(H键，黄色虚线)，而Gly90则被吡啶酮环取代(图1a，步骤1)。吡啶酮环从顶面和底面与Arg236和Lys147形成π-阳离子键，并模仿Gly90的羰基与Trp191形成氢键(图1a，步骤1)。添加了一个萘环后，该环与Lys147形成氢键，以加强π-阳离子与吡啶酮环的相互作用(图1A，步骤2)。大基团的萘甲酮环在两个环系之间实施了非平面构象，分别将KDRLKZ-1和KDRLKZ-2的仲丁基或异丁基引导到由Tyr50、Leu342、Leu343、Trp321和Trp370组成的疏水口袋中(图1a，步骤3)，同时将连接物氨基甲酸酯放置在Arg236附近形成临时氢键，并将连接子从口袋中引导到泛素的区域(图1a，步骤4)。作者依靠从头设计和化合物合成的循环来进一步优化这些新的小分子，并使用表面等离子体共振(SPR)的直接结合实验的连续迭代循环来生成数据，为配体优化提供信息。通过AlphaLISA置换试验测定化合物取代SelK多肽的能力。这最终导致了一系列小分子配体的发现，这些小分子配体有效地与KLHDC2KD结合(图1a-i)。为了评估新发现的KLHDC2小分子配体的特异性(图1b)，作者使用AlphaLISA检测了靶向VHL的小分子VH298和KLHDC2配体是否会相互影响，结果表明KLHDC2配体能够特异性结合（图1c，d）。SPR也测试了KDRLKZ-1与KLHDC2KD的直接结合，显示出1:1的结合模式(图1e)。SPR结果显示KDRLKZ-1与KLHDC2KD的结合Kd为0.36 μM，热移实验显示KDRLKZ-1与KLHDC2KD的结合Kd为+6.8℃, AlphaLISA和时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)实验显示KDRLKZ-1取代SelK肽的半最大抑制浓度(IC50)分别为0.21 μM和0.31μM。用酰胺取代KDRLKZ-1的羧基会导致结合减少，这与C端肽与KLHDC2的结合模式一致。羧基被酰胺取代的化合物将被称为“E3 dead”化合物(如KDRLKZ-3，如图1b所示)，它们不再与KLHDC2结合。 KDRLKZ-1在KLHDC2KD底物结合口袋中的结合位置通过共晶结构得到证实(图1g-i)。如图所示，KDRLKZ-1填充KLHDC2底物结合袋，并进行类似于天然底物的相互作用，其C端与SelK的C端几乎重合(图1h)。正如作者最初对KDRLKZ-1的从头CADD模型预测的那样，羧酸与KLHDC2形成4个氢键或盐桥作用;吡啶酮与Trp191形成氢键，并与Arg236和Lys147分别从上、下两个面发生π-阳离子相互作用;萘啶酮环在空间上强制形成非平面构象，引导羰基与Lys147形成氢键，并将正丁基置于疏水口袋中;连接链氨基甲酸酯位于Arg236附近并指向口袋外(图1i)。为了进一步表征KLHDC2配体，作者纯化了全长KLHDC2 E3连接酶及其同源接头蛋白EloB和EloC(该复合物以下简称KBC)，并使用天然底物(用菁5荧光团标记的USP1肽)进行了泛素化实验。作者确定了USP1泛素化依赖于KLHDC2，并发现过量的底物以及小分子配体KDRLKZ-1可以与USP1竞争KLHDC2的泛素化。这些实验证明纯化的KBC具有活性，并且可以与KLHDC2靶向的小分子结合。图1KLHDC2配体结合能力研究为了测试新的KLHDC2配体在被合成为双功能分子时与KLHDC2结合的能力，作者通过与琼脂糖珠上固定配体的相互作用促进KLHDC2的下拉，使用HiBiT信号进行量化。开发了类似的测定VHL与其配体相互作用的方法。对于VHL和KLHDC2，携带靶向各自连接酶的特定探针的微球的HiBiT信号明显高于单独与生物素偶联的微球(图2a)。此外，生物素标记的KLHDC2-配体探针可以与细胞提取物中的内源性KLHDC2结合(图2B)，这种相互作用可以被多余的配体竞争性地抑制。以JQ1作为靶蛋白结合配体，作者用KLHDC2配体的活性和E3-死亡版本(图2C)生成了一系列KLHDC2-BRD4 PROTAC分子(图2c-e)，并通过SPR测试了它们形成三元络合物的能力(图2d，e)。在我们的三元络合物SPR实验中，我们在SPR芯片上固定了BRD4上的His标记的溴域，并在没有或存在GST标记的KLHDC2KD的情况下展示了KLHDC2-BRD4 PROTAC分子。一个PROTAC分子K2-B4-3显示出很强的三元络合物形成(图2D)。三元复合体的形成效率取决于KLHDC2的招募，因为E3-Dead版本K2-B4-3D不形成三元复合体。图2基于KLHDC2的PROTAC在细胞中的降解能力在设计了可以诱导BRD4BD2和KLHDC2KD形成三元复合物的PROTACs之后，作者接下来测试了这些PROTACs是否可以驱动细胞中BRD4的有效降解。BRD4水平由添加到内源性BRD4中的氨基末端HiBiT标签表征。KLHDC2-BRD4 PROTAC分子由两种连接类型和三种KLHDC2配体生成 (图3a)，并将羧基改为甲酯基团作为前药，甲酯在进入细胞后会被细胞酯酶加工后转化为羧酸，并且酯基团比羧酸基团有更好的细胞渗透性。酰胺基PROTAC分子被设计为E3-dead阴性对照。含有甲酯KLHDC2配体的KLHDC2-BRD4 PROTAC分子能够快速有效地降解HiBiT-BRD4，在4-6小时内降低93%(图3b,c)。带有酸基团的PROTAC也能降解HiBiT-BRD4，但不如含酯分子(6小时降解动力学如图3d所示)。根据SPR数据(图2)，非PEG连接子对BRD4的降解效率更高。正如预期的那样，具有酰胺基团的PROTAC分子在HiBiT-BRD4检测中几乎没有活性(图3d)。为了证实观察到的BRD4降解依赖于UPS，作者观察了使用蛋白酶体抑制剂MG-132和类泛素化抑制剂MLN4924后HiBiT-BRD4水平。结果表明，这两种UPS抑制剂都可以抑制在K2-B4-5e存在时观察到的荧光减少(图3e)。为了测试KLHDC2 - BRD4 PROTAC分子的活性是否依赖于KLHDC2，作者使用干扰RNA (siRNA)敲除KLHDC2，发现这完全阻断了K2-B4-5e诱导的HiBiT-BRD4降解(图3f)。作为对照，敲除不相关E3连接酶DCAF16对KLHDC2介导的BRD4降解没有影响(图3f)。在该研究中，作者发现KLHDC2-BRD4 PROTAC分子对细胞系中BRD2和BRD3也有降解效果(图3g)，这个结果与其他使用JQ1作为靶蛋白配体、基于CRBN或VHL的PROTAC表现一致。与BRD4的情况一样，K2-B4-5e对BRD2的降解在敲除KLHDC2后完全阻断(图3g)，但敲除DCAF16没有影响。为了扩大基于KLHDC2的PROTAC降解底物的范围，作者合成了基于KLHDC2，靶向雄激素受体(AR)的PROTAC分子，如K2-AR-1(图3h)。与BET家族蛋白类似，AR的降解也依赖于UPS和KLHDC2 (图3i，j)。图3KLHDC2-EloB-EloC E3连接酶复合体是一种动态的低聚体在纯化全长KBC E3连接酶(KLHDC2与EloB和EloC的复合体)的过程中，作者观察到KBC从尺寸排除色谱柱中洗脱出来的尺寸大于其预期的分子量。KBC络合物的分析尺寸排除层析显示了一个主要峰，其洗脱曲线与分子量约为200kDa的络合物一致(图4a，灰色痕迹，图4b，顶部凝胶)。尽管在一些底物连接蛋白的重组制剂中发现了底物的共纯化，但SDS-PAGE和LC-MS分析表明KBC复合体没有受到污染的迹象。基质辅助激光解吸电离(MALDI)分析表明，样品中存在一到四个KBC络合物的混合物。值得注意的是，KBC与其底物SelK肽孵育后，洗脱图谱发生了变化。在分析尺寸排除色谱实验中观察到的这种变化是浓度依赖的，SelK导致KBC的洗脱向右移动。KBC-SELK肽复合体的右移洗脱图谱与预期的分子量匹配，与一个KBC复合体一致(图4a，蓝色痕迹，图4b，底部凝胶)。在MALDI实验中，作者也观察到KBC-SelK肽复合体的质量图谱发生了变化。对于以上现象，作者提出了一个假设，即KBC复合体是一种动态的低聚物，受到底物结合到其KLHDC2KD口袋中的影响。由于KLHDC2是一种E3连接酶，它识别C-末端的GlyGly-End肽作为底物，作者想知道它自己的C-末端(终止于GlySer)是否参与了这种动态复合体的形成。在AlphaLISA置换试验中，来自KLHDC2 C-末端的短肽可以取代底物SELK(图4c)，尽管亲和力较低(图4d)。与它们较弱的结合亲和力一致，将这些肽与KBC孵育会导致KBC寡聚体的部分解离(图4e)。接下来，作者试图了解KLHDC2KD与其反式C-端肽形成的复合体的结构。KLHDC2 C端肽与KLHDC2KD络合物的共晶结构表明，其结合模式与其天然底物SelK的结合模式相同(图4f)。如图所示，Trp270为了适应Ser406的额外原子而略有移动，但与Arg236的关键相互作用被保留了下来。综上所述，根据作者对KBC复合体动力学的生化特征研究，KLHDC2以高阶低聚状态存在，这种状态可以通过占据其底物结合口袋来调节，比如通过它自己的C-末端。图4Cryo-EM显示KLHDC2-EloB-EloC复合物是一个四聚体为了更详细地定义低聚KBC物种的性质，作者对化学交联的KBC复合物进行了单粒子冷冻电镜（single-particle cryo-EM）分析。KBC复合物的单粒子分析和cryoSPARC的初始模型生成显示了异质性KBC复合物，但大多数颗粒是KBC四聚体。四聚体复合物的三维(3D)变异分析在cryoSPARC中产生了四个密度不同的EloBC亚基类别。对密度最完整的一小部分粒子的进一步细化表明，KBC 分子的对称排列是二聚体的二聚。因此，作者将C2对称性应用于非均匀细化（non-uniform refinement），以获得最终分辨率为3.8Å的全长KBC复合体的3D重建(图5a)。对称复合体的一半由两个KBC亚复合体组成；作者将一个原型染成紫色并将其命名为KLHDC21，将另一个染成橙色并将其命名为KLHDC22。在每个亚复合体中，KLHDC2是饱和的，而相应的EloB和EloC结合配对以较浅的颜色着色(图5a)。KLHDC2、EloB和EloC的kelch结构域在图中被明确地建模，并且在连续kelch结构域的界面处存在额外的密度，在那里它们与EloB和EloC相互作用。非对称KBC单元的叠加表明，KLHDC2与EloB和EloC的BC-box结合是由KLHDC2的Leu364、Ser366和Val372介导的。虽然BC boxes重叠，但KLHDC2的C-末端的其余部分没有重叠。C-末端的剩余部分对应于KLHDC2预测的Cullin box。如图7b所示，在四聚体中，只有紫色的KLHDC21 Cullin盒被正确定位以与CUL2相互作用，而KLHDC22 Cullin盒则没有。通过分析尺寸排除色谱，我们发现CUL2可以与KBC形成配合物(扩展数据图7c)。我们的模型进一步表明，连续KLHDC2分子之间的相互作用是由KLHDC21的N和C末端介导的。首先，KLHDC21的残基400-406与KLHDC22的底物结合位点结合介导了一组相互作用(图5b)。这些相互作用与上述晶体结构中观察到的与C端肽的相互作用非常相似。其次，BC boxes和Cullin boxes中KLHDC21的C端残基也与KLHDC22相互作用(图5b，插图)。KLHDC21的Lys376在KLHDC22的主链上与Asn184形成氢键;KLHDC21的Glu377与KLHDC22的His345形成氢键;KLHDC21的Phe375与KLHDC22的Leu58形成疏水相互作用。另外，作者观察到KLHDC21的N端残基向KLHDC22延伸，尽管在这个分辨率下很难解释具体的相互作用。作者没有看到KLHDC21和KLHDC22的kelch结构域之间有任何特定的相互作用。沿着KBC原蛋白的daisy chain，KLHDC22和KLHDC21'之间的许多相互作用是明显的。KLHDC22的C端被重新排列，以“打开”BC和Cullin盒子，它们围绕EloC2套圈，使KLHDC21'和EloC2接近(图5c)。KLHDC22的残基363-397组成了这个套索，作者已经在图中粗略地建模了(图5c，插图)，但该分辨率不足以最终描述该区域的大多数相互作用。然而，很明显，在这个套索的最后，KLHDC22的400-406残基结合到KLHDC21'的底物结合口袋中。KLHDC22和KLHDC21'的kelch结构域之间也存在显著的相互作用。其中一个片段由KLHDC21'的Glu179、Thr180和Trp183以及KLHDC22的74-77个残基介导。第二个片段由KLHDC21'的His346和Arg347以及KLHDC22的Asp127介导(图5c，插图)。作者的低温电镜模型和生化数据表明，KLHDC2四聚体通过低亲和力相互作用结合在一起，这种低亲和力相互作用是由KLHDC2蛋白的C端与邻近底物结合袋结合介导的。高亲和力底物被认为取代了KLHDC2 C末端，从而将低聚物分解成较小的二聚体和单体。与它们作为高亲和力KLHDC2配体的属性一致，作者合成的KLHDC2靶向小分子系列也能够调节KBC四聚体动力学，正如通过分析尺寸排除色谱法测量的它们解离KBC四聚体的能力所示(图5d)。通过SPR动力学测量，具有较长半衰期的KLHDC2配体倾向于诱导更明显的四聚体解离(图5d)。总的来说，作者的数据与KBC通过其自身的C端结合在一起的模型是一致的，底物和小分子(配体或PROTACs)必须能够单独与KLHDC2底物结合口袋来破坏四聚体并诱导形成二聚体或单体，最终诱导生成与CRL2复合物结合的活性形式(图5e)。图5总结本研究发现了靶向KLHDC2的高亲和力小分子，这些小分子可用于TPD，不仅展示了KLHDC2如何被小分子所靶向，还描述了KLHDC2的动态组装，并证实了其四聚体的形式。此外，本研究描述的非共价小分子和PROTAC降解剂代表了第一个靶向C-末端的E3连接酶底物结合口袋并将其劫持为TPD的例子。最后，引入了小分子工具，这些工具将使未来能够对C-末端降解连接酶的生物学和机制进行研究。作者：章建涛校审：周金明编辑：郑一榕时间：2024年3月23日原文连接：Nat Struct Mol Biol. 2024，31(2):311-322. doi: 10.1038/s41594-023-01146-w. https://www.nature.com/articles/s41594-023-01146-w#Abs1 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓

蛋白降解靶向嵌合体

2024-03-26

·药明康德

重磅！分子胶产业动态报告出炉

▎药明康德内容团队编辑分子胶的小分子量及其调控蛋白质间相互作用（PPI）的能力，以及更易于成药的特性使其成为近年来产业界密切关注的新型治疗模式。近日，《自然》子刊Nature Biotechnology针对分子胶降解剂在产业界的开发现状发布了报道，药明康德的内容团队将依据该报道以及公开资料，向读者展示分子胶领域的最新产业动态。分子胶概述及其研发挑战分子胶是一类单价小分子（<500 Da），能够改变E3连接酶的表面结构，从而促进新的蛋白质-蛋白质相互作用。与蛋白降解嵌合体（PROTAC）相比，分子胶因其较小的分子量而更易于细胞吸收，并且可以在较低剂量下发挥作用。不同于靶向PROTAC采用灵活连接子（linker）连接两个配体、并允许它们扭曲和转动以形成接触点的方式，分子胶降解剂通过更直接地介入蛋白质界面，加强E3连接酶与靶蛋白之间的复合物形成，从而诱导它们之间的亲和力增加，最终导致靶蛋白的泛素化与降解。目前最广为人知的分子胶降解剂是沙利度胺（thalidomide）及其类似物泊马度胺（pomalidomide）等获批的免疫调节药物（IMiD），它们能与CRL4CRBN E3泛素连接酶中的底物受体蛋白cereblon（CRBN）相结合，通过改变CRBN所靶向底物蛋白的特性，使得CRL4CRBN E3泛素连接酶得以与新的底物蛋白相连并诱导该蛋白后续的降解。▲分子胶作用原理图示（图片你来源：参考资料[1]）然而，开发创新的分子胶降解剂面临着不少挑战。首先，分子胶降解剂的初步筛选必须在细胞环境中完成，这不仅提高了成本、增加了时间消耗，还需要大量的后期验证工作。人体内存在600多种E3连接酶，从中挑选出适合降解特定目标蛋白的连接酶颇具挑战性，尤其是考虑到科学家对这些连接酶中的仅20-30种有较深入的生物学理解，这为发现新的分子胶增加了难度。此外，找到能够促使E3连接酶与目标蛋白互动的小分子的几率较低，并且目前对分子胶的一般化学特性的了解尚浅，这些因素均提高了化合物库筛选的复杂性，通常需要依赖大型的化合物库才有可能找到合适分子。分子胶疗法领域的弄潮儿尽管分子胶类药物的开发过程不易，仍有不少公司勇敢地接受了这一挑战，通过不同研发策略来开发潜在的分子胶药物，尤其是针对难以成药的蛋白，像是转录因子这样缺乏可供小分子药物结合口袋结构的蛋白。这些专注于分子胶疗法开发的公司及其策略主要包含：▲专注于分子胶疗法研发的部分公司名单（图片来源：药明康德内容团队根据参考资料[1]制表）Monte Rosa TherapeuticsMonte Rosa Therapeutics专注开发利用cereblon E3连接酶降解特定靶标蛋白的分子胶疗法。该公司的联合创始人Raj Chopra先生在Celgene公司工作期间，曾带领团队成功鉴定了首批cereblon降解底物，并展现了通过合理方法发现其新底物的巨大潜力。Monte Rosa公司的核心理念是通过使用不同的分子胶来改变cereblon的表面结构，从而招募并降解多种蛋白质。这些cereblon底物蛋白中，大部分是带有被称作“G环”的降解结构的锌指转录因子。Monte Rosa利用人工智能工具来预测不同小分子如何重新塑造cereblon的表面，使其能够招募并降解含G环的转录因子及其他蛋白质。基于已知的cereblon-分子胶复合体晶体结构，公司合成了这类分子，并在蛋白质和细胞层面进行筛选，通过生化和细胞亲和性测定来鉴定被降解的蛋白质，以验证蛋白间的相互作用，并利用蛋白质组学技术来验证降解事件并确保其特异性。Monte Rosa的首席战略官Owen Wallace博士透露，通过筛选，Monte Rosa已经鉴定出与cereblon结合的新靶点，这些靶点的结合方式与预期不同。公司目前正在研究的两个项目分别针对cdk2和Vav1，这两个靶点都不包含传统的G环结构。这一发现表明，通过引导cereblon识别非传统靶点的方法是可行的，并且其潜在的靶标空间仍在不断扩展。ProxygenProxygen公司开发了一种功能强大的专有技术平台，专注于大规模识别针对难治性或传统手段难以作用的靶点的分子胶降解剂。Proxygen高度通用、专有的发现引擎，支持针对难以成药或不可成药靶点的分子胶降解剂的大规模特异性和无偏倚的筛选。公司的首席执行官Bernd Boidol博士表示，仅依赖结构方法无法揭示所有的作用机制，因此公司旨在深入了解分子胶降解剂和E3连接酶之间的生物学机理，以推动该领域的发展。同时，Proxygen通过结合精准的靶点选择和临床验证来平衡技术与生物学风险。Seed TherapeuticsSeed Therapeutic强调在分子胶药物开发中选择恰当的E3连接酶的重要性。公司的研发流程从评估靶蛋白与E3连接酶之间的互补性开始，利用AlphaFold等计算技术，并考虑E3连接酶在细胞内的位置；然后在细胞模型中研究E3连接酶与靶蛋白的相互作用；验证E3连接酶对靶蛋白的泛素化能力；随后通过高通量筛选来发现合适的降解剂，并进行验证；最终通过药物化学研究来提高药物的效能、特异性和稳定性。Seed Therapeutics的总裁及首席科学官James Tonra博士指出，选择一个能够经受包括高通量筛选和基于细胞的活性测试等所有检验的E3连接酶，是避免在长期研发结束后因需更换E3连接酶而重复研究的关键。A-Alpha BioA-Alpha Bio是一家运用合成生物学和机器学习技术来测量、预测和设计蛋白质之间相互作用的生物技术公司。该公司拥有两个核心技术平台：AlphaSeq能够快速且定量地测量数百万种蛋白质间的结合亲和力；而AlphaBind则是一个计算平台，它使用全球最大型之一的蛋白质相互作用数据库进行训练，能够基于序列预测蛋白质结合强度。A-Alpha Bio公司采用了一种高通量酵母细胞表面展示系统来测试蛋白之间的相互作用。通过将目标蛋白与酵母的锚定蛋白以及参与蛋白质分泌的信号肽序列融合，工程化改造后的酵母细胞能够在其表面表达各种细胞内部蛋白。这些酵母细胞在液体培养中混合并振荡，通过蛋白-蛋白相互作用引导的细胞融合来筛选相互作用的蛋白对。随后对产生的二倍体细胞进行测序，以确定参与相互作用的蛋白质，并通过生物物理验证实验进一步确认。接着，公司会对蛋白-蛋白界面进行突变实验，以探究增强这些相互作用的可能性。A-Alpha Bio的最终目标是通过优先识别和改进现有的蛋白质相互作用，来增加发现有效分子胶的成功率。PlexiumPlexium是一家新一代靶向蛋白降解（TPD）疗法研发公司，致力于开发单价直接降解剂和分子胶，针对治疗癌症中难以攻克的靶点。公司专有的药物发现平台旨在发现新型小分子药物，通过E3连接酶介导的蛋白酶体降解途径，诱导致病蛋白的选择性降解。Plexium的平台将“on-bead”DNA编码文库（DEL）筛选技术与超高通量微型化细胞检测相结合，能够在与疾病相关的细胞环境中直接测量一个或多个目标蛋白的降解情况。Plexium正在利用其平台来鉴定针对致病蛋白的单价降解剂或分子胶降解剂。Plexium旗下多款分子胶研发项目正在积极推进，其中PLX-4545已进入临床开发阶段。▲Plexium公司研发管线（图片来源：Plexium公司官网）诺华（Novartis）诺华公司也在分子胶领域有所布局，专注于开发针对转录因子WIZ的分子胶降解剂。在美国血液学会年会上，该公司报告了两种新型降解剂dWIZ-1和dWIZ-2的研发成果。dWIZ-1是通过针对CRBN的化学库进行表型筛选获得的，筛选标准是寻找能促进胎儿血红蛋白（HbF）表达而不影响红系细胞增殖和分化的化合物。后续的蛋白质组学分析确认了WIZ为其靶点。诺华的dWIZ-2是基于dWIZ-1优化后的分子，因其优良的药物动力学属性而适用于体内WIZ降解和HbF诱导的评估。在体外实验中，dWIZ-2显著增加了镰状细胞病患者来源的红系细胞的HbF表达。利用人源化小鼠模型对dWIZ-2的体内效应进行评估时，显示其能剂量依赖性地降解WIZ并提高HbF水平。在动物模型中，连续28天每日口服dWIZ-2治疗后，观察到外周血中γ-珠蛋白mRNA水平和HbF阳性网织红细胞比例显著增加。此外，dWIZ-2具有良好的耐受性，未观察到任何与治疗相关的血液学、凝血或临床化学指标的变化。这些研究成果支持将口服WIZ降解剂作为治疗镰状细胞病的新策略。近年大型药企在分子胶领域的布局分子胶疗法的发展被广泛看好，许多大型药企也在这个领域进行布局，并与许多生物科技公司达成合作协议。例如，Proxygen分别在2020年、2022年、2023年与勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）、德国默克（Merck KGaA）和默沙东（MSD）达成共同开发分子胶降解剂的协议。而Monte Rosa Therapeutics公司则在去年10月与罗氏（Roche）达成合作，将共同针对此前被认为不可成药的癌症和神经疾病靶点共同开发分子胶药物。此外，Orionis Biosciences也在去年9月宣布与罗氏（Roche）旗下基因泰克（Genentech）达成金额高达20亿美元的多年合作，将共同针对重大疾病领域中的挑战性靶点发现新型分子胶药物，包括肿瘤学和神经退行性疾病。今年2月，百时美施贵宝（Bristol Myers Squibb）与VantAI达成战略合作，将共同针对某些治疗靶点发现新的分子胶。此次合作利用VantAI的几何深度学习能力和百时美施贵宝在靶向蛋白质降解方面的专业知识来发现和开发新的小分子疗法。同月，诺和诺德（Novo Nordisk）也与Neomorph达成14.6亿美元的合作，将共同发现、开发和商业化分子胶蛋白降解剂的合作。尽管在这一创新领域还存在许多挑战，包括需要解析复杂的生物学相互作用和实现精确靶向等，但大型药企的大力投资和生物技术公司的持续关注表明，分子胶疗法具有广阔的发展前景。随着研究人员不断在科学研究上取得新的突破，让我们期待在不久的未来会有更多分子胶降解剂进入临床、造福患者。大家都在看▲欲了解更多前沿技术在生物医药产业中的应用，请长按扫描上方二维码，即可访问“药明直播间”，观看相关话题的直播讨论与精彩回放参考资料：[1] Garber, K. The glue degraders. Nat Biotechnol (2024). https://doi.org/10.1038/s41587-024-02164-9[2] Sasso JM, Tenchov R, Wang D, Johnson LS, Wang X, Zhou QA. Molecular Glues: The Adhesive Connecting Targeted Protein Degradation to the Clinic. Biochemistry. 2023;62(3):601-623. doi:10.1021/acs.biochem.2c00245[3] pipeline，Retrieved March 12, 2024 from https://www.monterosatx.com/queen/[4] Science，Retrieved March 12, 2024 from https://proxygen.com/science/[5] Our Technology，Retrieved March 12, 2024 from https://www.aalphabio.com/technology/[6] A Boundless Platform，Retrieved March 12, 2024 from https://www.plexium.com/platform-plexium-e3-ligase-drugs/[7] Pamela Y Ting, Sneha Borikar, et al; Targeted Degradation of the Wiz Transcription Factor for Gamma Globin De-Repression. Blood 2023; 142 (Supplement 1): 2. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2023-179331免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。版权说明：本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「药明康德」微信公众号回复“转载”，获取转载须知。分享，点赞，在看，聚焦全球生物医药健康创新

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