Encephalitis, Tick-Borne

导 读在感染性疾病研究领域，宿主遗传因素、微生物群调控及免疫机制的交叉作用为破解疾病发病机制提供了新方向。在欧洲临床微生物学与感染病学会全球大会（ESCMID Global 2025）大会上，多项国际前沿研究利用全基因组关联分析、基因组测序、转录组测序以及单细胞测序技术，深入探讨感染性疾病的发病机制以及病原微生物在结直肠癌、宫颈癌、中枢神经系统疾病发生发展中的作用，对于疾病的防治具有重要意义。01分离株全基因组测序、宏基因组测序及宿主转录组分析揭示儿童肺炎支原体感染反弹及耐药株致病机制北京儿童医院的研究人员通过对中国北京、保定地区169株肺炎支原体临床分离株及全球290个公开基因组的全基因组分析，发现北京地区以4-5-7-2 基因型为主（占比超 80%），保定地区则流行4-5-7-2 与 3-5-6-2 基因型（共占 75%）。功能基因富集分析结果显示，4-5-7-2基因型显著富集毒力相关基因，如黏附蛋白的编码基因，且大环内酯类抗生素耐药率接近100%，主要由23S rRNA基因的A2063G突变导致，使得阿奇霉素、红霉素等一线药物失效。这一研究表明，新冠疫情后中国儿童肺炎支原体感染爆发的核心驱动因素为4-5-7-2 等优势基因型的克隆传播及超高的大环内酯耐药率，这为临床紧急调整抗生素策略提供了依据，为后续感染防控与精准治疗奠定基础。同样是针对肺炎支原体，北京儿童医院的另一研究团队则聚焦大环内酯无反应性支原体肺炎（MUMPP），其发生可能与大环内酯耐药肺炎支原体（MRMP）感染、宿主过度免疫反应及其他病原体共感染密切相关。研究人员通过分析MUMPP儿童下呼吸道微生物群及宿主转录组，以揭示MUMPP的潜在致病机制。该研究纳入88例接受大环内酯类抗生素治疗至少3天且无效、后续换用米诺环素的MUMPP儿童，依据支气管镜病理结果分为三组：黏膜侵蚀伴高分泌组（MucES-HS，18 例）、单纯黏膜高分泌组（MucHS，27 例）和正常组（43 例）。结果发现，MucES-HS组的微生物多样性显著低于其他组，提示黏膜侵蚀与下呼吸道微生物多样性降低相关。肺炎支原体在所有组别的下呼吸道微生物群中均占主导地位，其总负荷、相对丰度与外周血炎症指标强相关。宿主转录组的分析结果则表明，肺炎支原体感染可能通过激活宿主固有免疫和炎症反应加剧病情。该研究为解析MUMPP的发病机制提供了新证据，同时强调了结合支气管镜病理分型进行个体化诊疗的重要性。02多组学及单细胞测序揭示牙周梭杆菌通过癸酸-中性粒细胞轴促进结直肠癌发生机制结直肠癌（CRC）是全球高发恶性肿瘤之一，有研究发现，肠道微生物群失衡及免疫失调与CRC的发生发展相关，但具体致病微生物及分子机制尚不明确。北京协和医院的研究团队通过宏基因组学、代谢组学和单细胞转录组测序等技术，对53例CRC患者、35例腺瘤患者及35例健康人的粪便样本以及3例CRC组织、3例癌旁组织和3例腺瘤组织进行多组学整合分析，以探讨宿主与微生物互作在肿瘤发生中的作用。微生物组学结果表明，CRC患者肠道菌群组成及功能发生了显著改变，其中，牙周梭杆菌被最新发现（Fusobacterium periodonticum）在CRC中特异性富集。此外，功能代谢组学结果显示CRC患者中长链脂肪酸合成通路也出现了异常激活，其中癸酸、棕榈酸等代谢物水平与牙周梭杆菌丰度呈显著正相关。同时，单细胞转录组测序发现CRC肿瘤组织中性粒细胞趋化因子CXCL8呈现高表达，以此驱动中性粒细胞相关免疫通路的激活。体外实验及动物实验结果也表明，牙周梭杆菌产生的癸酸可促进中性粒细胞迁移，并上调白细胞迁移及促癌相关基因的表达，其通过调控中性粒细胞浸润促进肠道肿瘤的形成。首次揭示牙周梭杆菌通过合成癸酸驱动中性粒细胞趋化、重塑肿瘤微环境，进而促进结直肠癌发生的新机制。因此，该研究深化了对CRC发病机制的认识，也为利用多组学整合分析来解析复杂疾病提供了范例。03细菌及宿主RNA-seq助力hv-CRKP毒性的机制研究高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（hv-CRKP）是医疗相关感染的新威胁，不过，对于其携带的新型质粒“pvirhs1”的致病机制尚不明确。复旦大学华山医院的研究团队采用细菌RNA-seq及小鼠肺RNA-seq，深入探究了pvirhs1质粒在hv-CRKP致病性中的作用。体外实验结果显示，pvirhs1组与肺上皮类器官共培养时，出现了更强的细胞损伤能力；小鼠感染实验中，pvirhs1组小鼠体重下降更显著，肺组织也表现出更广泛的出血、炎症浸润和结构破坏。此外，宿主RNA-seq分析显示，pvirhs1感染组小鼠肺组织中，IL-2、IL-4、IL-8等促炎细胞因子水平显著升高；细菌RNA-seq分析显示铁离子稳态、鞭毛组装及脂多糖生物合成通路显著激活，且其鞭毛长度更长、复杂性更高、黏附能力更强。因此，该研究表明，携带pvirhs1质粒的hv-CRKP通过增强鞭毛和脂多糖合成，强化细菌对宿主细胞的黏附与侵袭能力，同时诱导宿主的过度炎症反应，进而导致更严重的肺部感染。这也提示，临床上需要重视对该质粒的早期检测，以实现感染的精准干预和治疗，降低重症风险。The RNA-seq and cytokine responses in different groups.The bacteria RNA-seq in groups and pilus in the hypervirulent strain04GWAS分析提示ABCG1基因变异与蜱传脑炎易感性相关蜱传脑炎（TBE）是由蜱传脑炎病毒（TBEV）引起的中枢神经系统感染性疾病，临床表现为脑膜炎、脑炎、脊髓炎等。截至目前，宿主的遗传因素在TBE易感性及发病机制中的作用尚不明确。格拉茨医科大学的研究团队对1600例TBE病例和9699例对照进行全基因组关联研究（GWAS），并结合体外功能实验，探索了与TBE易感性相关的关键遗传因素。他们在21号染色体的ABCG1基因内发现两个独立的内含子变异（rs35873421 和 rs3787986），两者与TBE易感性呈显著关联，这两个变异还可以影响ABCG1在外周血中的基因表达。体外实验结果也显示，抑制ABCG1功能或沉默ABCG1的表达，可显著减少TBE病毒在神经元细胞和巨噬细胞中的复制，表明ABCG1对病毒复制具有促进作用。因此，该研究为理解宿主遗传因素对TBE的影响奠定了基础，有望为TBE的精准防治策略开发提供新的思路。05孕期抗生素暴露显著影响阴道耐药基因谱及宫内感染治疗风险宫内感染是导致孕产妇和新生儿发病及死亡的重要原因，而抗生素耐药性的加剧使相关治疗面临更加严峻的挑战。不过，怀孕期间阴道菌群中抗生素耐药基因（ARGs）及其受抗生素暴露的影响尚不清楚。法国鲁昂大学医学院附属医院的研究团队通过对1543名孕妇（1938份阴道样本）孕晚期的阴道样本进行宏基因组分析，发现阴道微生物组中存在547种ARGs，其中60%与b-内酰胺类耐药相关。此外，大环内酯类和四环素类的耐药基因最为丰富，其中lsa(C)和tet(M)是最常见且丰度最高的ARGs。更加重要的是，孕期使用抗生素组在分娩时的b-内酰胺类耐药ARGs丰度较未使用组增加了2倍，其耐药表型多样性也均显著高于未使用组。该研究提示，孕期抗生素的使用可能通过改变阴道耐药组的基因分布和表型谱，进而影响宫内感染的治疗策略，因此需进一步关注耐药表型多样性在临床中的潜在风险。06单细胞RNA测序揭示伯氏疏螺旋体逃避宿主免疫机制伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）是引发莱姆病的病原体，作为北半球最常见的虫媒传染病，其感染会触发宿主固有免疫和适应性免疫反应，但宿主难以清除病原体，导致细菌持续存在并通过蜱媒传播。芬兰图尔库大学的研究人员借助单细胞转录组测序，发现伯氏疏螺旋体感染小鼠的生发中心在感染早期被快速启动，但随后被抑制，表现为B细胞中抗原呈递相关基因表达下调，抗体类别转换偏向IgG3、IgG2b、IgG2c 亚类（非中和性抗体），而保护性 IgG1 亚类则出现了下降。此外，细胞通讯与调控也出现了异常，例如，调节性T细胞和滤泡调节性T细胞活性升高，分泌IL-10等抑制性细胞因子；B细胞中Socs1和Socs3持续高表达，阻断 JAK-STAT 信号通路，抑制B细胞活化及生发中心分化，导致T-B细胞间通讯受阻等。因此，该研究揭示了伯氏疏螺旋体通过操纵生发中心进而逃避宿主免疫防御，为理解莱姆病慢性感染的免疫逃逸机制提供了新视角。07嗜血杆菌属在COPD急性加重期通过菌群失衡等加剧病情慢性阻塞性肺疾病（COPD）是与呼吸道微生物组成密切相关的呼吸系统疾病，虽然有研究表明流感嗜血杆菌与COPD的急性加重（AECOPD）相关，但嗜血杆菌属在COPD不同疾病阶段的作用及特征尚不明确。西班牙巴塞罗那贝尔维特医院的研究团队对57例COPD患者（其中24例为AECOPD、19例为稳定期频繁急性加重、14例为稳定期非急性加重）的痰样本进行分析，旨在揭示嗜血杆菌属在疾病发生发展中的关键作用。研究结果表明，AECOPD组微生物多样性显著降低，其中，该研究嗜血杆菌属是唯一在AECOPD组相对丰度显著高于稳定期的菌属，而流感嗜血杆菌的存在与该属丰度升高密切相关。进一步的分析发现，流感嗜血杆菌与副流感嗜血杆菌存在遗传异质性，后者抗菌耐药性显著更高，且两者携带不同耐药相关基因突变。因此，证实嗜血杆菌属在COPD发病机制中具有关键作用，尤其在AECOPD期通过流感嗜血杆菌增殖和微生物多样性降低加剧菌群失衡。08脑肿瘤患者肠道菌群研究近年来，肠脑轴在中枢神经系统（CNS）疾病中的作用日益受到关注，但其在脑肿瘤发生发展中的具体机制仍不明确。土耳其埃尔吉耶斯大学的研究人员通过16S rRNA测序对比鞍区/鞍旁肿瘤、其他脑肿瘤患者与健康人的肠道微生物组成及代谢特征，探索微生物在CNS肿瘤中的潜在作用。通过ROC曲线评估标志物的鉴别效能，重点分析相对丰度数据对诊断效能的影响。研究结果表明，健康人肠道菌群多样性显著高于脑肿瘤患者，集与免疫调节相关的有益菌属（如毛螺菌属、粪杆菌属），而肿瘤组则以芽孢杆菌属等促炎菌种为主。研究发现，结合细菌相对丰度数据可显著增强诊断的效能，例如毛螺菌属AUC 从0.50提升至0.76；拟杆菌属从0.56提升至0.73。而粪杆菌属的AUC始终稳定在0.93，不受丰度影响。该研究为开发基于微生物的诊断和治疗策略、架起肠道菌群研究与CNS肿瘤研究的桥梁奠定了基础。09宿主+病原宏转录组分析揭示NSTIs中的病原-宿主互作坏死性软组织感染（NSTIs）是一类病情凶险、进展迅速的严重感染性疾病，且宿主与病原体的分子互作机制仍未被充分解析。来自印度的研究团队采用宿主及病原宏转录组分析（Meta-transcriptome analysis）策略，对3例健康组织活检样本与3例NSTI坏死组织样本进行对比分析，结果发现NSTI样本与健康样本的基因表达模式存在显著差异，NSTI样本中检测到23831个下调转录本和3066个上调转录本，下调基因数量约为上调基因的8倍，提示宿主防御相关功能可能被广泛抑制。通路富集分析同样表明NSTI样本中多条生物学通路显著下调，提示宿主在感染过程中可能出现免疫应答、组织修复等关键功能的失调。该研究通过宏转录组分析首次揭示了NSTIs中广泛存在的基因表达失调和通路破坏，为理解多微生物感染如何重塑宿主转录组提供了新视角。10嗜麦芽窄食单胞菌通过线粒体功能紊乱驱动宫颈癌进展宫颈癌是全球女性高发恶性肿瘤，研究表明，人乳头瘤病毒（HPV）感染与宫颈微生物群动态变化共同参与肿瘤进展，但微生物在宫颈癌发生中的具体作用及与宿主的互作机制尚不明确。来自印度的一项研究通过分析正常宫颈、癌前病变及宫颈癌组织的微生物组、抗生素耐药基因及宿主细胞功能变化，探讨了关键致病细菌在宫颈癌进展中的潜在作用。研究表明，宫颈微生物群随癌症进展显著失调，与正常宫颈相比，宫颈癌组织中嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎克雷伯菌等致病菌丰度显著升高，而乳酸杆菌属等有益菌显著减少，微生物多样性也下降了40%。进一步的研究发现，嗜麦芽窄食单胞菌通过线粒体功能紊乱促癌，同时，肺炎克雷伯菌和嗜麦芽窄食单胞菌的生物膜产量较正常组高出2-3倍，且与抗生素耐药基因变异呈正相关。该研究首次证实嗜麦芽窄食单胞菌通过调控线粒体功能和诱导氧化应激参与宫颈癌进展，也深化了对宿主-微生物互作驱动肿瘤发生的认识，为开发基于微生物的宫颈癌防治策略奠定了基础。11ARPI治疗前列腺癌对肠道微生物群的扰动前期有研究表明，前列腺癌（PC）的发生发展与肠道微生物群密切相关，雄激素受体通路抑制剂（ARPI）作为转移性前列腺癌的常用治疗药物，其对肠道微生物群的潜在影响尚不清楚。西班牙维戈大学附属医院的研究人员采用鸟枪法测序对接受ARPI治疗的转移性前列腺癌患者的肠道微生物群特征进行了分析，结果发现，ARPI治疗组的微生物丰富度显著低于未治疗组，两组的b多样性也存在显著的差异。ARPI治疗组的Butyricimonas、Enterocloster、Flavonifractor、Sutterella等菌属丰度显著降低，而Alistipes merdavium、Intestinibacter则显著富集，其PI3K-AKT信号通路（细胞存活相关）显著下调，而与二氢睾酮合成相关的通路则出现了富集。总之，该研究发现接受ARPI治疗的转移性前列腺癌患者存在肠道微生物群失调，因此，监测肠道微生物群的动态变化可为前列腺癌个体化治疗提供依据。结语总之，上述这项研究不仅深化了对感染性疾病、肿瘤等复杂疾病发病机制的认知，更在耐药性防控、微生物靶向治疗、遗传风险评估等领域提供了创新思路，为推动精准医疗与个体化诊疗策略的研发奠定了重要基础。参考来源：1.ESCMID Global 2025 L0026 Genome-wide association study identifies ABCG1 as a susceptibility locus for tick-borne encephalitis.2.ESCMID Global 2025 O0129 Multi-omics integrated analysis revealed the key role of Fusobacterium periodonticum in colorectal tumorigenesis by decanoic acid-promoting neutrophil chemotaxis.3.ESCMID Global 2025 O0130 Exploring the respiratory microbiome in COPD patients: the role of Haemophilus spp. in disease pathogenesis.4.ESCMID Global 2025 O0193 Antibiotic resistance genes diversity and antimicrobial effects in the vaginal microbiome during pregnancy.5.ESCMID Global 2025 O0194 Distinct gut microbiota and metabolic profiles in brain tumor patients: bridging microbial insights to CNS oncology.6.ESCMID Global 2025 O0868 Bacteria and host responses in both mice and human lung organoid model revealed the role of a novel plasmid pvirhs1 in hypervirulent carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae.7.ESCMID Global 2025 O0870 Meta-transcriptomic insights into host-pathogen interactions in necrotising soft tissue infections using differential analysis.8.ESCMID Global 2025 P0909 Whole-genome analysis unveils genetic factors driving the Mycoplasma pneumoniae outbreak among children post-COVID-19 in China.9.ESCMID Global 2025 P0912 Integrated study of respiratory microbiota and host response in children with macrolide-unresponsive Mycoplasma pneumoniae pneumonia.10.ESCMID Global 2025 P1017 Microbiome analysis of cervical cancer identified Stenotrophomonas as a potential pathogen involved in tumor progression.11.ESCMID Global 2025 P3461 Gut microbiota in patients with metastasic prostate cancer: analysis of potential effects of androgen receptor pathway inhibitors.12.ESCMID Global 2025 P3549 Single-cell profiling of T-dependent immune response of Borrelia burgdorferi infection in a murine model.* 本文转自测序中国公众号.

While Bavarian Nordic's public preparedness sales dropped in 2024, the vaccine specialist’s travel health business—which includes shots for rabies and tick-borne encephalitis (TBE), among others—grew 22%. While the ebb and flow of mpox outbreaks may have taken a toll on Bavarian Nordic’s 2024 sales performance, the year also validated, in large part, the travel vaccines business the Danish company has been building out since the start of the decade.In the years to come, Bavarian Nordic foresees that more commercially minded-business taking the lead over the sort of government supply contracts that have been the company’s bread and butter thus far, Bavarian Nordic CEO Paul Chaplin said in an interview.Last year, Bavarian Nordic’s total revenue dropped 19% to 5.7 billion Danish kroner (around $527 million), the company reported Wednesday.That drop is largely explained by the fact that Bavarian Nordic’s public preparedness business, which includes its smallpox and mpox vaccines and makes up nearly 60% of the company’s revenue, plunged around 44% to 3.2 billion kroner ($295 million) last year.Still, there was a silver lining for Bavarian Nordic, as the vaccine specialist’s travel health business—which includes shots for rabies and tick-borne encephalitis (TBE), among others—grew 22%. “We started a journey, back in 2020 really, to become a much more robust, profitable vaccine company,” Chaplin told Fierce Pharma. “[20]24 was our fifth consecutive year now of reporting profitable growth.”That said, “the issue with public preparedness is it’s a little lumpy in terms of the revenue,” Chaplin explained. “It’s not a classical revenue stream.”As it stands, Bavarian Nordic assumes base sales from its public preparedness business between 1.5 billion to 2 billion kroner with “some spikes” from outbreaks of disease such as mpox.“To be honest, from an investor point of view, that is a very difficult one to model or to appreciate,” Chaplin admitted.In turn, Bavarian is looking to continue to expand its commercial business in earnest, both through the launch of vaccines like the company’s newly approved chikungunya shot Vimkunya, and by acquiring more commercial assets via M&A, the CEO said.Ultimately, Chaplin anticipates Bavarian Nordic’s “more traditional portfolio” of vaccines to become the dominant one, with public preparedness becoming a “smaller component” of the firm’s overall strategy.That should “create less noise in terms of the revenue swings that we see from year to year,” Chaplin explained.“Before 2020, we really only had smallpox and mpox, and it was direct sales to governments,” Chaplin explained. “We want to add more, what I would call, regular revenue streams into the business.”That desire prompted Bavarian Nordic to purchase its rabies and TBE vaccines from GSK, followed by a transaction for Emergent Bio’s travel health business in 2023, which added shots for typhoid, cholera and chikungunya to Bavarian’s vaccine armamentarium.“That was a bold move at the time, because we had no real commercial setup,” Chaplin said of the GSK deal.Since then, the company has built out commercial infrastructure in places like Germany and the U.S., navigated marketing during COVID, and is now in the process of expanding its commercial base into countries like the U.K., France, Austria, Switzerland and Canada, Chaplin said.As for why those travel vaccines are now proliferating under Bavarian Nordic, the shots simply “weren’t that meaningful to a company the size of GSK that had a portfolio of 30-plus vaccines,” Chaplin speculated.“I think they fit better in a smaller company like Bavarian Nordic than they do in a larger company with different growth agendas,” he said.Looking ahead, much of Bavarian Nordic’s focus in 2025 will hinge on the rollout of its commercial chikungunya shot. To build the market for Vimkunya, education of healthcare professionals will be key, Chaplin said, highlighting two types of HCPs in particular: Those who know about the virus but may not be aware of its severity, and those are largely oblivious to chikungunya altogether.While Bavarian Nordic is already seeing demand for Vimkunya start to build in Europe and the U.S., the company’s prospects in the States are slightly less clear at the moment, given the recent cancellation of a Centers for Disease Control and Prevention advisory committee meeting that would have determined whether to recommend Vimkunya, Chaplin noted.As Bavarian holds out hope that the meeting gets rescheduled, the lack of a positive recommendation will likely diminish sales, Chaplin said. Nevertheless, the CEO stressed that the company continues to go full speed ahead with its awareness efforts.Speaking to the current uncertainty around U.S. immunization policy going forward, Chaplin acknowledged that vaccine hesitancy has been on the rise globally for some time now, with the issue exacerbated even further by the COVID-19 pandemic.Even still, Bavarian Nordic has witnessed a “rebound” in vaccine uptake in more recent years and is seeing “strong growth in our sector against the backdrop of some vaccine skepticism,” Chaplin said.Whatever happens with U.S. vaccine policy, “we will all be in the same boat as vaccine manufacturers, and we’ll have to adapt to the situation,” he added. Looking ahead to the rest of the year, Bavarian Nordic aims to grow earnings some 26% to 30% over that same span.As for what could be next in the company’s travel health portfolio, Bavarian Nordic on Wednesday unveiled two new early-stage pipeline programs for Lyme disease and Epstein-Barr virus.Despite high unmet need for a vaccine in both conditions, both candidates are backed by existing, validated technologies and Bavarian Nordic has been working on each asset for around 3 years now, Chaplin pointed out. Bavarian Nordic’s Lyme and Epstein-Barr prospects are slated to enter the clinic next year. 

中文摘要 病毒检测技术可根据原理不同分为电子显微镜（电镜）观察、细胞培养、免疫学方法、核酸检测等。电镜观察法具有超高的分辨率，可直接观测到病毒结构，适用于对新现未知病毒的研究；细胞培养法可直观地得到病毒活力信息，可用于病毒滴度的检测；免疫学方法特异性强且成本低、速度快，适用于大规模的群体筛查；核酸检测灵敏度高、特异性更强，且允许同时检测多种病毒。研究者需要在方法的选择上做出权衡。此文论述不同病毒检测方法的优缺点，并讨论其适用情况，以期为制定更准确、高效的病毒检测和防控策略提供参考。 正文 病毒检测在生物学和医学领域中非常重要，可用于确诊感染者、监测传染性疾病的流行趋势以及评估治疗效果等。快速、准确地检测病毒一直是相关领域追求的目标。近年来，全球范围内SARS冠状病毒、H1N1流感病毒和新型冠状病毒等引起的传染病疫情进一步凸显了快速、准确地检测病毒从而辅助诊断的重要性。随着生物技术的发展，各种新型病毒检测方法不断涌现。本文列举传统的病毒检测方法和技术，分析各自的优劣势和适用情况；并介绍几种较新的检测方法，讨论其与传统方法相比的优势所在。通过全面了解各种方法的特点，可以更清晰地理解其在不同场景下的适用性，为研究人员和临床实践者提供指导，以便更好地选择和利用适合当下需求的检测方法。 1 电子显微镜（电镜）观察法 电镜利用高速电子束与样品相互作用，通过探测和处理电子束的反射、散射或透过情况来获取样品图像，透射电镜和扫描电镜是常见的2种电镜技术。电镜观察通常需要对感染物样本进行离心、除杂、组织固定等一系列处理，然后根据不同电镜技术进行相应的组织处理，如负染技术、超薄切片技术、免疫共定位技术。通过电镜观察可获得病毒的高分辨率图像，分辨率达nm级别，可用于研究病毒大小、形态、核酸包膜等重要特征，对于病毒的分类、诊断和研究作用机制都具有重要意义，尤其适用于那些无法通过其他方法直接观察和检测到的病毒，如难以分离、培养的病毒或新出现的未知病毒。电镜的高分辨率在新型冠状病毒疫情中成为病毒的结构和分子作用机制研究的重要手段，帮助科研人员从形态学、形态发生等角度认识病毒，其中冷冻电镜技术更是可在分子层面分析病毒与宿主作用的蛋白结构位点。在疫情暴发早期，Wrapp等利用高分辨率冷冻电镜技术解析了新型冠状病毒刺突蛋白（spike，S）膜外区段的融合前构象，分辨率可达0.35 nm，揭示了三聚体S与其入侵宿主细胞的受体血管紧张素转换酶2的结合方式，为抗体和疫苗的研发指明了方向。 电镜观察法对样品制备和操作技术要求较高，需要有一定经验和技能的专业人员来处理样品和操作显微镜。且电镜造价高昂，使用和维护成本也较高，如仪器维护不当或图像处理设备性能不足，可能会影响分辨率。 2 细胞培养法 2.1 噬斑试验法 将待测病毒样本接种于贴壁培养的宿主细胞后覆盖琼脂形成固体层，经过一段时间培养通过染色处理观察蚀斑。在适当的稀释浓度下，1个噬斑即表示1个活病毒，通过稀释倍数的计算即可得到样品中病毒的滴度。该方法可以较为直观地检测出病毒活力，而不会检测到已失活的病毒颗粒。陈娜娜等建立并验证了森林脑炎病毒传染性滴度检测噬斑法，代替森林脑炎病毒滴度检测常用的小鼠脑内攻毒滴定法，缩短了检测周期、减轻对实验动物的伤害，且敏感性较好，为疫苗生产中间品的质量控制提供了较准确的检测手段。同时噬斑法还可用于单株病毒的分离，以方便后续的病毒研究工作。路明华等在进行新采集的伪狂犬病毒的分离与鉴定时，采用连续3次噬斑培养、挑取噬斑接种的方法，对病毒株进行纯化，获得基因组完全一致的病毒株，以便于后续的研究工作。Seyedalinaghi等整理、统计了数十篇关于新型冠状病毒活力检测的报告，提出以出病毒最小感染剂量来表示病毒对不同宿主的感染活力，发现人、猴、小鼠等宿主在不同传播途径下的最小感染剂量不尽相同，这种计算方法有助于研究疾病的传播。 该法的局限性在于检测周期较长，1次噬斑检测的细胞培养通常需要5~7 d，消耗大量时间和人力成本。且此方法的重复性较差，误差难以避免，需要多组重复实验取均值。 2.2 TCID50分析法 一些病毒在感染宿主细胞后大量增殖使宿主细胞产生细胞病变效应，如细胞的大小、形状、贴壁状态等特征发生变化甚至死亡。将待检测样本接种到特定的细胞系中观察是否出现细胞病变效应，以此判断病毒的活性，可通过对待测样本的梯度稀释计算出病毒的滴度。该方法适用于已知病毒样本的活力测定，且需要选择对病毒敏感的细胞作为宿主，常用于验证病毒灭活处理的灭活效果。如王春等以TCID50法分别测算消杀前后样品中病毒的滴度，评价3种不同消毒原理的消毒机对流感病毒气溶胶的消灭效果。 TCID50法和噬斑法均是基于细胞培养的测定活病毒滴度的常用方法，由于噬斑法得到的噬斑形成单位表示的是病毒具体浓度，而TCID50/ml所表示的是统计细胞病变情况而估算的大致病毒浓度。因此噬斑法比TCID50法具有更高的精确度，但TCID50法可一定程度上弥补噬斑法对操作误差的敏感，得到相对准确的结果。由于传统的细胞培养病毒检测方法往往耗时长、复杂且需要实验室环境，限制了其在紧急情况下的应用，因此TCID50法具有实际应用方面的意义。 3 免疫学方法 3.1 抗原检测法 通过抗原抗体特异性结合的免疫学原理，以病毒的特定蛋白结构作为抗原，使用特异性抗体进行检测，可确定人体或动物体内是否存在病毒感染。基于抗原的检测常用方法有ELISA、免疫印迹法、免疫荧光分析以及胶体金免疫层析检测等。抗原检测法适用于病毒感染的早期诊断，可以快速获得结果。马家秀等开发了1种HBV核心相关抗原定量检测试剂盒，检测灵敏度为1.43 pg/ml，能够较准确地反映慢性乙型肝炎患者血清中的抗原水平，在辅助治疗和监测判定治疗重点等方面具有重要的应用价值。Wang等以水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白E为目标抗原开发了1种针对该病毒的胶体金检测试纸，检出下限为30 ng/ml，该方法具有操作简单、成本较低的优势，适用于大规模筛查和快速诊断。 然而，抗原检测法的灵敏度易受到环境因素和受试者自身因素的影响，例如当患者接种了针对相应病原体的疫苗后，短时间内进行抗原检测可能造成假阳性；抗原抗体特异性结合的最适pH约为6~9，如患者在咽拭子样本采集前食用了酸性或碱性食物则可能导致假阴性；当患者自身产生的特异性中和抗体亲和力高于检测用抗体，同样可能造成假阴性。 3.2 抗体检测法 抗体检测法通过检测人体对病毒产生的特异性抗体以确定机体的感染状态。卞论等建立了抗人狂犬病病毒抗体ELISA定量检测方法，检出下限为0.03 IU/ml，可用于人用狂犬病疫苗的免疫效果初步评价。刘金月等建立了基于登革病毒糖蛋白E的萤光素酶免疫吸附法，用于检测登革病毒的特异性IgG抗体，可在20 h内获得检测结果，适用于登革病毒感染的筛查、监测预警、流行病学调查等。 抗体检测法具有应用范围广泛、能够评估免疫应答状态的优势。然而其缺点在于，机体在感染病毒后激活免疫应答产生特异性抗体的过程需要时间，因此该方法在早期感染阶段可能不敏感，容易发生漏检。同时抗体检测法也存在交叉反应和抗体水平变化的问题，需要结合实际应用不断调整优化。 3.3 免疫组织化学法 免疫组织化学法是将待检测的组织或细胞进行固定、通透处理后，利用抗原抗体特异性结合的原理进行免疫组织化学染色，并在显微镜辅助下观察。解中等探索鸭源性H6N1禽流感病毒在猪和人呼吸道感染特点时，将组织切片脱蜡水化后抗原修复，内源性过氧化物酶阻断，非特异性染色阻断剂封闭，后用鼠抗禽流感病毒核蛋白抗体作为一抗，生物素标记的羊抗兔/鼠IgG聚合物作为二抗，加入链霉菌抗生素-过氧化物酶，二氨基苯联胺显色，在猪气管、肺部组织和人肺组织中检测到病毒的抗原，从而提示H6N1有可能感染人和猪的呼吸系统。免疫组织化学法虽有助于病毒在感染部位的定位和病理分析研究，可为抗病毒工作的开展提供引导，但其步骤较为繁琐，不适用于大规模的检测工作。 4 核酸诊断方法 4.1 PCR PCR是1种常用的病毒检测方法，通过将病毒的DNA片段特异性扩增，对样品进行琼脂糖凝胶电泳来观察扩增结果从而判断样品中病毒的存在。其扩增产物量以指数方式增加，经过30~40个循环后理论上1个靶DNA分子可扩增至10亿个。由于基因的特异性，核酸检测可以快速获得高度准确的检测结果。且可根据目的片段的长度不同，在同一检测体系内同时检测多个病毒。门旭坤等建立了1种可以同时检测3种导致猪呼吸道综合征病毒的多重PCR方法，检测下限约为2×105 拷贝，且特异性良好，可用于3种病毒的临床快速检测与流行病学调查。 然而，对于PCR扩增结果只能观测到不同大小的DNA片段，难以进行底物的准确定量，且PCR技术需要严格的实验条件，包括实验室设备、环境条件和专业的操作人员。 4.2 定量PCR（quantitative PCR，qPCR） qPCR是在PCR技术的基础上发展出来的，其原理是在PCR反应体系中加入荧光物质以实现对目的核酸片段扩增的实时定量。qPCR检测荧光强度可直接在电脑中读取并处理数据，比PCR简便；且相比PCR，qPCR可对病毒进行精确定量，判断样品中的病毒载量。qPCR根据添加荧光物染料的原理不同，一般又可分为荧光染料法和TaqMan探针法。 SYBR Green Ⅰ染料可与双链DNA结合并发出较强荧光，因此荧光强度与体系中扩增片段浓度呈线性关系，可计算得到待测底物中的病毒量。陈佳圣等建立鸡圆环病毒的SYBR Green ⅠqPCR检测方法，检出限为287 拷贝/μl，灵敏度比常规PCR高100倍。此方法成本相对较低，只需要针对目的片段设计特异性的引物即可进行检测。由于染料与双链DNA的结合是非特异性的，每次实验只能针对1种病毒进行检测，且可能出现非特异性扩增造成假阳性。 TaqMan探针法则是在1段与目的扩增片段特异性结合的探针两端分别添加荧光基团和淬灭基团，当两基团连接在1条探针链上时，荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号。探针在扩增过程中被Taq酶切割，使两端基团远离，从而能检测到荧光信号，且荧光强度与扩增目的片段数量成正比。张峰等建立检测人疱疹病毒6型、7型的单一实时qPCR方法，检测下限达到103 拷贝，检测灵敏度高于常规PCR方法。与荧光染料法相比，TaqMan探针法可避免非特异性扩增的干扰，特异性更强；还可针对多个的目的片段分别设置携不同荧光信号的探针，同时检测多个目的片段，提高检测准确性的同时还提升了检测效率，可以对同一样本同时检测多种病毒。但其特异性的探针需要定制，投入成本较前者高。此外，qPCR法测得结果中包含已失活病毒颗粒的DNA含量，无法判断病毒的感染活力。 4.3 反转录PCR（reversal transcription PCR，RT-PCR） 由于有些病毒的基因组由RNA组成，因此不能直接进行PCR检测，必须先将RNA逆转录得到相应的互补DNA，再进行扩增步骤。RT-PCR方法同样可以结合荧光染料或探针对目的片段进行实时定量分析，称为RT-qPCR，该法同样具有特异性强、灵敏度高的特点。张伟等建立了1种结合荧光染料的柯萨奇病毒B组3型RT-PCR检测法，特异性良好，检测范围101~109 拷贝/ml。Yan等建立了1种结合探针的多重RT-PCR技术，可同时检测禽流感病毒H1、H2、H3亚型，检测下限达到10~100 拷贝。除了用于定量病毒基因组，针对mRNA的特异性检测还可用于测定不同时期或组织中特定基因的转录活跃程度，这对于探索病毒的生物学活性机制具有很大的帮助。Bartolomeo等将新型冠状病毒接种于不同组织来源的人源细胞系，并通过RT-PCR检测病毒入侵细胞的重要受体和辅助蛋白受体血管紧张素转换酶2、跨膜丝氨酸蛋白酶2的mRNA，来评估其在不同人体组织中的表达活跃程度，以探究新型冠状病毒对人体的器官或组织嗜性。 由于RNA的单链结构不稳定易在体外分解，可能造成检测结果偏低，因此在检测和样品储存上对实验人员操作及环境的洁净度有较高的要求，在一定程度上提高了成本。 4.4 等温扩增技术 利用等温扩增技术可在恒定温度下进行核酸高效特异性扩增。区别于传统PCR扩增技术的循环升温、退火程序，等温扩增技术只需在温和且恒定环境下即可进行，最适反应温度在37~65 ℃之间，根据检测体系中是否发生特异性扩增判断目标病毒的存在，结果通过光学或电化学方法判读。常用的等温扩增技术包括环介导等温扩增技术、重组酶介导扩增技术、交叉引物扩增技术、链置换扩增技术，转录介导扩增技术（transcription-mediated amplification，TMA）等。在定量检测血浆样本中的HBV和HCV时，TMA被证明与RT-PCR检测结果具有高度的相关性，在感染患者的诊断中可被相互替代 。等温扩增技术省去了需要严格控温的热循环仪器的实验室条件，也省去了反复变温所消耗的时间，可在常见的保温设备中进行扩增，使检测工作变得快速、便捷，同时也节省了检测成本。在新型冠状病毒的临床检测应用中，TMA对新型冠状病毒RNA检测的灵敏度高于通用的RT-PCR方法。 由于从流行病学角度出发，TMA过高的敏感性可能导致难以区分需要治疗的感染者和病毒载量低的无症状感染者，在大流行中可能会影响医疗资源的合理分配，因此需要与其他方法及临床经验相结合来使用。 4.5 成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）-CRISPR相关蛋白（CRISPR associated protein，Cas）检测法 CRISPR-Cas是1种新型病毒检测技术，其本质也是利用核酸的特异性互补配对原理进行检测。当细菌受到病毒感染后，会将病毒的DNA片段整合到细菌基因组中，形成CRISPR序列。Cas是一系列与CRISPR相互作用的蛋白，其中Cas13/Cas12可与目标基因片段特异性结合并被激活RNA或DNA内切酶活性，导致周围的核酸分子被非特异性切割。通过检测报告器释放的发光、荧光或电化学信号，确定待测样品中是否存在目标病毒。王彦贺等建立了1种基于CRISPR-Cas13的埃博拉病毒检测方法，检测下限低至1 拷贝/μl，相比普通PCR法灵敏度提高了至少10倍，为实现痕量埃博拉病毒的现场检测提供了新方法。Chen等基于CRISPR-Cas12建立了1种快速便捷的可视化猴痘病毒检测方法，将检测时间缩短至35 min。 CRISPR-Cas技术的优势在于特异性强、灵敏度高，同时由于其不需要目的片段扩增，可以简单、快速地获得结果。但其引物设计相对复杂，需要考虑引物的特异性和结构等因素，需要一定的专业知识和经验支持。 4.6 高通量测序技术（high-throughput sequencing，HTS） HTS也被称为第2代测序技术。区别于第1代测序技术即Sanger测序法，HTS将大量核酸片段扩增并分别进行测序，再通过生物信息学技术进行整合。HTS的优势在于可获取病毒的完整基因组信息，对于病毒种类甚至突变株系的区分具有较高的分辨率，对于新现未知病毒的定位和病毒易突变位点的识别具有极大的作用。在新型冠状病毒流行期间，研究人员通过对阳性样本的HTS，进行对病毒感染的突变研究及溯源等流行病学调查，使人们对新型冠状病毒的认识逐渐清晰，从而有效应对疫情。 HTS的成本较高，尤其对于人群大范围筛查，相对于特异性精确诊断的方法，HTS并不具有更高的性价比，而是更适用于对未知病毒基因的大范围研究。Kawasaki等提出为了应对人畜共患感染病，对动物样本大范围取样进行HTS建立病毒宏基因组；Cebriá-Mendoza等提出对人血浆采样进行HTS建立病毒宏基因组，以便于对未知病毒提前发觉，防患于未然。 5 组合方法 为了进一步开发灵敏度、准确性更高的病毒检测方法，研究者们将多种检测技术结合形成新的检测体系，从而将不同技术的优势结合起来以达到更佳的效果。 有研究者开发了PCR-ELISA联用法，在PCR扩增时使用生物素标记的引物，然后用ELISA检测生物素含量即可定量病毒，将2种方法结合用以检测猪瘟病毒，其灵敏度比普通PCR检测法高约100倍，且在确保准确率的同时简化了操作步骤，降低了检测成本，为猪瘟的流行病学监测提供有力帮助。Gootenberg等将CRISPR-Cas13系统和环介导等温扩增技术相结合，开发了1种分子检测平台并命名为SHERLOCK，进一步提升了CRISPR-Cas系统的检测精度，便携式平台的建立也将为众多科研工作带来便利。 生物芯片技术是通过微加工和微电子等微缩技术将特定蛋白或核酸序列固定于芯片表面，并依靠分子间的特异性相互作用来检测病毒的方法。其中载体材料和固定的生物分子都可依据检测需求来选择，常用的方法可分为基于抗原抗体特异性结合原理的蛋白质芯片，和基于核酸互补配对原理的基因芯片。1块芯片上能够固定多个抗体或核酸探针，因此可以同时进行多种病毒的检测，提高了效率和检测范围。芯片实验室又称微全分析系统，是以微刻技术为基础、在芯片上进行多种生化分析方法的高度自动化系统，如将PCR等核酸检测技术或免疫荧光技术集成于芯片中，并设计可由电脑操控的自动化检测程序。该方法具有高通量、多重检测、高度自动化的优势，且具有较高的包容性。随着科技的进步，芯片系统也可与未来的新技术结合，从而不断优化自身。由新型冠状病毒引发的全球性疫情给全球公共卫生和医疗系统带来了巨大的挑战，大范围筛查工作提示需要发展高通量、自动化的检测系统以缩减人员成本。新型冠状病毒感染疫情以来，已有大量研究提出基于芯片技术的新型冠状病毒检测方法，其中一些在抗击疫情工作中做出了重要贡献。Xing等建立了集成式微流控核酸分析系统用于新型冠状病毒的检测，将样本采集、灭活、核酸提取和等温扩增等步骤形成自动化机械操作，其检测灵敏度可在45 min内达到150 拷贝/ml，且经过评价，检测结果与RT-qPCR法结果高度一致。由于芯片的设计和制备需要专业设备和技术，成本较高，且与CRISPR-Cas、等温扩增等技术的结合也使得该系统的成本高于传统方法，如何在保留其快速、精准的优势同时缩减检测成本仍是芯片技术的热门议题。 6 结论与展望 本文对多种病毒检测方法进行了总结，各种检测方法都有其特定的优势和局限性。综合考虑敏感性、特异性、操作便捷性、实验条件场景以及成本效益比等因素，选择相适应的检测方法是十分重要的环节。 传统的细胞培养病毒检测方法可以反映病毒样品的滴度，为病毒灭活条件的摸索提供指导，但往往耗时长、操作复杂且需要实验室环境，限制了其在紧急情况下的应用。基于免疫学原理的抗原或抗体检测法成本较低、检测快速简便，适用于大范围传染病排查及现场即时检测，但易受到环境等因素的影响导致灵敏度和准确性不足。免疫组织化学法可用于病毒感染病理的研究，为病毒的防治提供思路。PCR、qPCR等检测方法在灵敏度上有所提升，适用于病毒流行病学监测和小样本的精准检测，但此类方法需要专业的仪器设备和技术人员操作，在大规模排查时消耗大量时间和人力物力资源。基于核酸检测的CRISPR-Cas方法、等温扩增等新兴检测技术通常具有高灵敏度、高特异性、响应速度快、高度自动化的特点，有潜力应用于现场即时检测和大范围筛查；同时新兴技术也伴随更高的开发成本、技术门槛和尚未完善的标准化体系。随着科技的进步和创新，病毒检测技术还有很多潜在的发展方向和改进空间，可以进一步提高病毒检测的准确性、灵敏度和速度。例如，基于纳米技术的病毒检测方法、新型放大技术的引入以及人工智能算法的应用，都有望为病毒检测带来革命性的突破。面对潜在的传染病威胁，病毒检测技术的发展趋势应是在保有较高灵敏度的基础上提升检测效率，并降低对检测环境条件和人员专业性的要求。未来的发展趋势可能包括微型化和便携式设备的开发，以便在疫情暴发或偏远地区进行快速检测。 同时，与其他领域的交叉合作也将推动病毒检测技术的进一步创新，如材料、光学等领域为生物检测的应用带来了生物芯片、电镜等新技术，并在其领域内不断创新优化。病毒检测技术在不同的领域有很多其他应用，除了临床诊断和流行病学调查监管，还可应用于疫苗研发和评估、食品水源安全、动物防疫等诸多方面。除了被动地检出和防御，高通量测序技术的发展也为病毒学研究提供了有力的工具。新型冠状病毒流行对全球的影响也提示我们要化被动为主动，在病毒造成威胁前先一步探索病毒。随着技术的不断发展，病毒检测技术将继续为人类健康和公共安全做出更大的贡献。 作者 曹鹤宵综述  李冬梅审校 上海生物制品研究所有限责任公司第七研究室，200051 上海 通信作者：李冬梅， Email：alhal@163.com 引用本文：曹鹤宵, 李冬梅. 病毒检测方法的研究现状与展望 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(6): 390-396.   DOI:  10.3760/cma.j.cn311962-20231222-00026 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。