Tariquidar

“ 点击蓝字 关注我们 克服小分子耐药的多维度药物化学策略 PPS  孙善亮，李念光* （南京中医药大学药学院，江苏 南京，210023） 李念光 教授，博士生导师，南京中医药大学药学院副院长。现任江苏省药学会药物化学专业委员会委员，南京市药学会药物化学与药物分析专业委员会副主任委员。2007年博士毕业于中国药科大学，2012年赴美国哈佛大学进行访学和合作研究。2012年入选“教育部新世纪优秀人才支持计划”，2013年入选江苏省第十批“六大人才高峰”，2013年获教育部霍英东青年教师奖三等奖。近年来主要从事血液肿瘤新药分子的设计与合成研究，主持10多项国家及省部级项目，于Adv Sci，J Exp Clin Cancer Res，J Med Chem，J ChemInf Model等杂志发表SCI论文100余篇。 [摘要] 耐药性是制约小分子药物疗效的主要障碍，已成为全球公共卫生和肿瘤治疗领域面临的重大难题。系统综述小分子药物耐药的主要机制，包括靶点修饰、旁路信号激活、药物外排增强、酶介导药物失活及细胞表型转化等，并重点阐述针对这些机制的耐药克服策略。相关策略涵盖下一代抑制剂开发、变构抑制、联合治疗、蛋白降解靶向嵌合体技术、外排泵抑制以及抗体药物偶联物等新兴技术。通过整合最新的临床前和临床研究进展，旨在为克服小分子药物耐药提供理论依据和实践指导。 小分子药物作为现代医学治疗的基石，在肿瘤、感染性疾病、心血管疾病等领域发挥着不可替代的作用。然而，无论是抗肿瘤靶向治疗还是抗菌治疗，耐药性的产生始终是制约疗效的主要因素。据统计，肿瘤治疗中约90%的转移性癌症患者最终会对靶向治疗产生耐药；抗感染领域多重耐药菌的出现已导致全球每年超过70万人死亡，预计到2050年这一死亡人数将攀升至1 000万[1]。 耐药性可分为原发性耐药和获得性耐药[2-3]。前者指患者初始治疗即对药物无应答，后者则指在初始治疗有效后发生疾病进展。深入理解耐药机制并开发针对性克服策略，对于延长患者生存期、提高治愈率具有重要意义。近年来，随着结构生物学、化学生物学和人工智能技术的快速发展，多种新型克服耐药策略相继涌现，为临床转化提供了新的思路与可能。 本文从靶点修饰、旁路信号激活、药物外排增强、酶介导药物失活及细胞表型转化等耐药机制出发，系统梳理新一代抑制剂开发、变构抑制、联合治疗、靶向蛋白降解技术及外排泵抑制等克服耐药的核心策略，以及人工智能、分子胶、靶向蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）等新兴技术（见图1），以期为延缓或逆转耐药性提供新思路。 1 小分子药物耐药的主要机制 原发性耐药指细胞或微生物在未接触药物前即具备的固有的耐药特性，获得性耐药则是在药物治疗过程中通过基因突变或水平基因转移新近获得的耐药能力。2类耐药涉及不同分子机制，但均围绕药物作用的3个关键环节:药物进入、靶点作用与药物清除以及产生适应性改变。 1.1  原发性耐药 原发性耐药本质是物种在长期进化过程中形成的生物学屏障。与获得性耐药不同，原发性耐药并非由药物选择压力诱导产生，而是根植于基因组中的固有遗传特征，通过限制药物进入、降低药物靶点敏感性或预先建立药物清除机制，使细胞天然具备抵御药物攻击的能力。根据耐药发生的环节，可将原发性耐药机制归纳为5类[4]，见表1。 1.1.1  靶点天然缺失或结构差异   药物发挥作用的先决条件是与靶点形成特异性结合，而某些物种天然缺乏该靶点，或靶蛋白结构存在种属差异，导致药物无法有效识别。典型案例包括：支原体（Mycoplasma）因无细胞壁结构，完全缺失青霉素结合蛋白（penicillin-binding protein，PBP），故对β-内酰胺类抗生素天然耐药；部分革兰氏阴性菌（如洋葱伯克霍尔德菌）的PBP与青霉素的亲和力较敏感菌株低数个数量级，即使在高浓度药物存在下也难以形成稳定的共价复合物，构成对β-内酰胺类的固有耐药基础。在肿瘤领域，某些亚型的急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）因天然高表达抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），对依托泊苷等促凋亡化疗药物呈现原发性耐药。 1.1.2  膜屏障与低通透性   革兰氏阴性菌的外膜是限制亲水性抗菌药物进入的主要物理屏障。外膜孔蛋白的数量减少或孔径改变可显著降低药物渗透速率。以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为例，其外膜孔蛋白（outer membrane porin D，OprD）的表达量极低，且孔道狭窄，导致碳青霉烯类、氟喹诺酮类等多种抗生素难以有效穿透外膜进入周质间隙，这是该菌对多种药物天然耐药的重要原因。此外，真菌细胞壁为由几丁质、β-葡聚糖和甘露糖蛋白构成的致密三维网络，同样构成有效的药物渗透屏障，使白色念珠菌（Candida albicans）对多种唑类药物表现出固有耐受性。 1.1.3  组成性外排系统表达   某些物种无需药物诱导即可组成性高效表达药物外排泵，将进入胞内的药物主动泵出，维持胞内亚致死浓度的药物水平。铜绿假单胞菌的MexAB-OprM系统属于耐药结节分化（resistance nodulation division，RND）家族外排泵，其组成性高表达可外排β-内酰胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类及四环素类等多种结构不相关的药物，介导天然的多药交叉耐药。类似地，白色念珠菌药物耐药蛋白1（candida drug resistance 1，CDR 1）和CDR2转运体[属于腺苷三磷酸结合盒（ATP-binding cassette，ABC）转运蛋白超家族]在野生型菌株中即存在基础表达，可将氟康唑等唑类药物泵出细胞，构成真菌固有耐药的重要机制。 1.1.4  药物灭活酶的染色体编码   部分细菌的染色体天然编码低水平表达的灭活酶，在未接触药物时即具备基础催化活性，形成“耐药储备”。以AmpCβ-内酰胺酶为例，该酶由肠杆菌科细菌（如阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌）的染色体ampC基因编码，在野生型菌株中呈低水平组成性表达，可水解头孢菌素类等β-内酰胺类药物。虽然基础表达量较低，但在某些诱导条件下（如接触亚胺培南等碳青霉烯类）可发生去阻遏表达，导致高水平耐药。这种“低水平预设、诱导放大”的模式是原发性耐药向获得性耐药过渡的典型桥梁。 1.1.5  细胞周期与代谢特性   实体瘤的增殖动力学特征是原发性耐药的重要生物学基础。肿瘤内部血供不均，大量癌细胞处于G0/G1静止期，而细胞周期特异性化疗药物（如抗代谢药5-氟尿嘧啶、长春碱类）仅对活跃分裂的细胞具有杀伤作用，导致处于静止期的肿瘤细胞天然逃逸药物杀伤。此外，某些正常组织或肿瘤微环境高表达抗氧化酶系统[如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶]，可高效中和铂类、蒽环类等药物诱导的活性氧（reactive oxygen species，ROS）损伤，形成微环境介导的原发性耐药[5]。例如，肺组织因长期暴露于高氧环境而富含抗氧化酶，使得肺癌细胞对氧化应激依赖性化疗药物呈现出固有耐受倾向。 1.2  获得性耐药 获得性耐药是药物选择性压力驱动下的适应性进化结果，其分子机制更为多样。 1.2.1  靶点修饰   靶点修饰是靶向治疗中最常见的耐药机制，具体包括点突变，即靶蛋白关键氨基酸残基发生改变，降低药物亲和力或阻碍药物结合[2]，如在表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中，约50%~60%的吉非替尼耐药患者携带T790M守门员突变，该突变通过提升三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）亲和力，削弱药物与靶点的结合能力[6-7]。类似地，间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）重排NSCLC中L 1196M突变、断点簇区-阿贝尔白血病融合基因（breakpoint cluster region-Abelson，BCR-ABL）阳性慢性髓性白血病中T315I突变均属于守门员突变，可阻碍第一代抑制剂与靶点的结合；布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton,s tyrosine kinase，BTK）C481S突变破坏共价抑制剂半胱氨酸结合位点[8]，Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）G 12C抑制剂治疗后出现的Y96D继发突变，可通过空间位阻效应降低药物结合效率；基因扩增/过表达，即靶基因拷贝数增加或转录上调，通过靶点“过量”克服药物抑制，如间质上皮转化因子（mesenchymal-epithelial transition factor，MET）基因扩增是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase  inhibitor，EGFR-TKI）耐药的重要机制，约5%~20%的耐药患者通过持续激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路维持细胞存活；还包括剪接变异，产生缺乏药物结合域的截短型蛋白，逃避抑制剂识别；以及靶点切换，即表达药物不敏感的替代靶点，如真菌FK506敏感蛋白1（FK506-sensitive protein 1，FKS 1）被FKS2替代，进而介导对棘白菌素类药物的耐药[9]。 1.2.2  旁路信号激活   肿瘤细胞通过激活平行信号通路绕过被抑制的靶点以维持下游增殖与存活信号[2]，具体表现为受体酪氨酸激酶扩增，如人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）扩增[10]、MET扩增[11]等可激活PI3K/AKT和MAPK通路，绕过被抑制的EGFR[7]；下游效应子突变，如B型快速纤维肉瘤原癌基因(B-Raf proto-oncogene，BRAF)V600E突变、KRAS/神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物（neuroblastoma RAS viral oncogene homolog，NRAS）突变等使信号通路绕过上游阻滞持续激活[12]；支架蛋白介导旁路激活，如胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF 1R）-胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS 1）-PI3K信号复合体的形成可绕过受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)直接激活存活通路；以及表型转化，上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）不仅改变细胞形态，更通过转录重编程激活PI3K/AKT等旁路信号，最终导致靶向治疗耐药。 1.2.3  药物外排与膜通透性改变   药物外排泵的过度表达是多重耐药的重要机制。具体表现为外排泵基因突变或过表达，如调控基因（淋球菌MtrR）突变导致外排泵组成性高表达，白色念珠菌在唑类药物诱导下CDR 1/多药耐药蛋白1（multidrug resistance protein 1，MDR 1）表达显著上调[5]；肿瘤细胞中ABCB1、ABCC1、ABCG2等基因扩增或转录过表达，导致P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、MDR 1、多药耐药相关蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP 1）和乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）等ABC转运体过表达，进而将结构多样的化疗药物和靶向药物外排至胞外[5]；以及膜电位驱动外排，真菌主要协同转运蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS）转运体利用膜电位梯度驱动药物外排，进而介导唑类药物耐药[9]。 1.2.4  酶介导的药物失活   微生物通过产生特异性酶类直接破坏药物活性以实现耐药。其中水解酶方面，β-内酰胺酶水解β-内酰胺环是革兰氏阴性菌耐药的主要机制，金属β-内酰胺酶依赖锌离子辅因子，可水解包括碳青霉烯类在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素；修饰酶方面，氨基糖苷类修饰酶（乙酰转移酶、磷酸转移酶、核苷酸转移酶）通过化学修饰使药物失活，氯霉素乙酰转移酶则通过乙酰化消除氯霉素活性[5]。 1.2.5  其他   其他获得性耐药机制包括膜通透性降低，如孔蛋白编码基因（如铜绿假单胞菌oprD）突变或缺失会减少药物内流，大肠杆菌ompF表达下调会降低膜通透性；代谢通路重编程，如利什曼原虫通过转录翻译重编程激活抗氧化反应和能量代谢以适应药物压力；DNA修复增强，如O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O 6--methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）等DNA修复酶过表达可修复烷化剂诱导的DNA损伤；抗凋亡机制激活，如Bcl-2家族蛋白过表达或PI3K/AKT信号通路持续激活[13]，能拮抗药物诱导的细胞凋亡；染色体非整倍体，如白色念珠菌形成i(5L)等臂染色体，导致药物靶点ERG 11和外排泵基因拷贝数同步增加，进而产生协同耐药效应[5,9]。 1.3  原发性耐药与获得性耐药的关联及临床意义 原发性耐药与获得性耐药并非截然分开，而是动态连续的过程。原发性耐药机制为获得性耐药提供了进化基础,如组成性低水平表达的外排泵可在药物压力下通过启动子突变实现高表达；染色体编码的AmpC酶可通过基因扩增或调控突变实现产量暴增。此外，获得性耐药可通过质粒、转座子、整合子等可移动遗传元件水平传播，使原本敏感的病原菌获得耐药表型，模糊了2种耐药类型的界限。 临床上，原发性耐药决定初始治疗方案的选择，需基于病原菌或肿瘤的固有特性进行药敏试验指导用药；获得性耐药则导致治疗失败和疾病进展，需通过动态监测耐药突变、及时调整治疗策略来应对。深入理解这2类耐药机制的分子本质，是开发下一代抑制剂、设计合理联合方案、最终实现耐药逆转的根本前提。 2 克服耐药性的核心策略 2.1  新一代抑制剂开发（基于结构的合理设计） 针对靶点突变导致的耐药，开发具有不同结合模式或更高亲和力的下一代抑制剂是最直接的策略。第3代EGFR抑制剂奥希替尼通过引入丙烯酰胺基团与C797形成共价键，可有效克服T790M突变，同时对野生型EGFR的选择性提高了近200倍，显著降低了皮疹和腹泻等不良反应[14]。在ALK抑制剂领域，第3代药物劳拉替尼采用大环结构设计，具有更高的刚性，能够紧密嵌入ALK蛋白的活性口袋，克服包括L 1196M和G 1202R在内的多种耐药突变[15]。类似地，普纳替尼专门针对BCR-ABL T315I守门员突变设计，已成为治疗伊马替尼耐药慢性髓性白血病的关键药物（见图2A）。 2.2  变构抑制策略 传统小分子药物主要靶向蛋白质的正构位点（即天然配体结合位点）。然而，许多靶点的正构位点高度保守，导致药物选择性差，或缺乏适合小分子结合的疏水口袋，如平坦的PPI界面。此外，正构位点发生点突变，也是引发药物耐药性的重要因素之一，在激酶类抑制剂领域，这一问题尤为突出[16]。 变构调控通过结合正构位点之外的变构位点，诱导蛋白质构象变化，间接调控其功能。变构药物的优势包括：更高的选择性（变构位点通常比正构位点保守性低）；克服正构位点突变导致的耐药；调控“不可成药”靶点（如缺乏酶活性的支架蛋白）；实现精细的功能调节（增强或抑制，而非单纯完全阻断）。变构药物已在多个靶点取得成功，如ABL 1变构抑制剂阿西米尼[17]；TYK2变构抑制剂氘可来昔替尼[18]；心肌肌球蛋白变构抑制剂玛伐凯泰[19]；GPCR变构调节剂西那卡塞（钙敏感受体正向变构激动剂）、马拉维若，以及替卡拉雷等[20]（见图2B）。 变构药物发现面临的主要挑战是变构位点的识别和验证。计算方法（如分子动力学模拟、网络分析、机器学习）正在加速变构位点的预测。人工智能（artificial intelligence，AI）辅助的变构药物设计，结合冷冻电镜结构解析，有望解锁更多靶点的变构位点[21]。 2.3  联合治疗策略 联用策略的科学基础包括[22]：协同作用（联合效应大于单药效应之和）、相加作用以及增敏作用（通过一种药物增强另一种药物的敏感性）。 肿瘤是进化系统的典型代表，具有高度遗传异质性和环境适应性。单一药物治疗必然面临耐药选择压力。药物联用通过同时或序贯使用多种机制的药物，提升肿瘤逃逸的“能量壁垒”，延缓或克服耐药。联合治疗通过同时阻断多条信号通路或耐药机制，可有效抑制耐药发生[23]。在BRAF突变黑色素瘤中，BRAF抑制剂达拉非尼与丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）抑制剂曲美替尼的联合应用使肿瘤患者中位无进展生存期从单药治疗的5.8个月延长至9.4个月[风险比（hazard ratio，HR）=0.39，P＜0.001]。 在抗菌领域，新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合代表了克服耐药性的重要方向。已有多种新组合相继获批或进入临床后期阶段（见表2）[24-25]。值得注意的是，三重组合疗法（如美罗培南+阿维巴坦+新型金属酶抑制剂InC58）正在研究中，旨在同时覆盖丝氨酸酶和金属酶产生菌。 目前，联合治疗已从经验性“鸡尾酒”疗法发展为基于机制的理性设计。AI技术正在改变联合用药的设计模式：通过分析大规模临床和组学数据，预测最优药物组合；利用网络药理学模型模拟不同联合方案的疗效；设计“智能”给药算法，根据患者实时响应调整剂量和时机。 2.4  多靶点设计策略 癌症、自身免疫病、代谢性疾病等复杂疾病，本质上是多基因、多通路、多节点失调的网络性疾病。传统“单靶点”药物虽然初期疗效显著，但肿瘤细胞易通过旁路激活、表型转换或突变产生耐药。多靶点药物设计（multi-target drug design，MTDD）通过理性设计同时调节多个靶点，克服单靶点治疗的局限性。多靶点设计的核心优势包括：协同效应产生“1+1>2”的疗效；同时阻断多条逃逸通路，降低耐药风险；简化给药方案，提高患者依从性；降低单靶点高剂量导致的毒性[26-27]。 2023—2024年，欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）批准的73种新活性物质中，有18种具备多靶点药物概念，包括10种抗肿瘤药、5种自身免疫病药物等，比如呋喹替尼、卡帕塞替尼、莫洛替尼等小分子药物[28]（见图3）。 2024年，AI在多靶点药物设计中取得突破[29]。多药药理学生成优化网络（polypharmacology generative optimization network，POLYGON）使用变分自编码器（variational autoencoder，VAE）和强化学习，生成同时抑制2个靶点的分子。2024年，Munson等[30]报道了32个AI设计的MEK1/雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin，mTOR)双靶点抑制剂，大多数在酶学实验中显示出大于50%的抑制率，并在癌细胞系中抑制增殖。MTMol-GPT等生成式AI模型，能够同时优化多个靶点的活性，为理性设计多靶点药物提供新工具[31]。 多靶点药物的设计策略包括：药效团连接（通过化学连接子linker连接2个靶点的配体）；药效团融合（共享共同结构特征）；药效团合并（设计全新骨架同时容纳2个靶点的结合特征）。同时，AI辅助的靶点选择、分子生成和优化，正在将多靶点设计从偶然发现推向理性设计。 2.5  靶向蛋白降解技术 新药发现速度常难以及时覆盖耐药机制的演化。肿瘤治疗中的耐药性，可源于靶基因突变、靶蛋白过度表达等分子改变，使传统小分子抑制剂效力下降或失效；与此同时，部分疾病相关蛋白因缺乏适合小分子结合的结构口袋或PPI界面平坦等原因，长期被视为“不可成药”靶点，也限制了常规小分子药物的开发空间。上述耐药演化与成药性瓶颈叠加，成为抗肿瘤等治疗药物研发的重要挑战。因此，亟需创新策略以应对恶性肿瘤细胞中靶蛋白快速修饰的挑战。蛋白降解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimera，PROTAC）的出现是该领域重大进展，它扩展了可成药靶点范围，实现了思维模式转变，提供了一种克服传统小分子药物局限性的新兴药物类型。PROTAC技术通过招募E3泛素连接酶诱导靶蛋白降解，实现了从“占据驱动”向“事件驱动”药理学的范式转变。与传统抑制剂相比，它具有催化性作用机制，可在低浓度下发挥作用；能靶向“不可成药”蛋白；可克服因靶蛋白过表达或突变导致的耐药[32]。 在肿瘤治疗中，PROTAC技术已显潜力。ARV-110（见图3）是首个进入临床试验的口服PROTAC药物，靶向雄激素受体治疗前列腺癌，聂期临床试验显示其对特定突变患者有良好效果[33]。针对BTK的PROTAC能降解多种耐药突变形式，为B细胞恶性肿瘤提供新选择[8]。溴结构域和额外末端蛋白（bromodomain and extraterminal domain，BET）-PROTAC可克服BET抑制剂耐药，在三阴性乳腺癌模型中显示出抗肿瘤活性[34]。 除PROTAC外，分子胶（molecular glue，MG）、溶酶体靶向嵌合体（lysosome-targeting chimera，LYTAC）、自噬靶向嵌合体（autophagy- targeting chimera，AUTAC）、磷酸酶招募嵌合体（phosphatase-recruiting chimera，PHORC）、去泛素化酶靶向嵌合体（deubiquitinase-targeting chimera，DUBTAC）和磷酸化靶向嵌合体（phosphatase- recruiting chimera，PhosTAC）等新兴靶向蛋白降解（targeted protein degradation，TPD）技术也在扩展可成药靶点范围。MG可稳定蛋白相互作用，LYTAC可促进溶酶体降解，AUTAC可利用自噬-溶酶体系统降解[2]。总之，TPD技术拓宽了药物靶点范围，为应对复杂生物学挑战提供有力方案，革新了药物发现领域，为治疗干预提供新途径。 2.6  外排泵抑制 针对药物外排导致的耐药，开发外排泵抑制剂（efflux pump inhibitor，EPI）是重要策略。Tariquidar是研究最广泛的P-gp抑制剂，但因其毒性尚未获得上市审批。新一代吲哚类、吡喃并吡啶类化合物（如MBX3132）显示出更好的安全性和有效性（见图3）。 在抗菌领域，多粘菌素B和喷他脒通过破坏革兰氏阴性菌外膜的阳离子桥，增加膜通透性，促进其他抗生素的进入。纳米技术也为克服膜屏障提供了新途径，如聚乙二醇包覆的氧化铜纳米颗粒负载环丙沙星，可通过破坏膜完整性增强抗菌活性[35]。 2.7  靶向肿瘤微环境 肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是肿瘤细胞生存、增殖和转移的土壤，由缺氧区域，酸性环境，免疫抑制细胞如肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）、髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）、调节性T细胞（regulatory T cell，Treg），癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast，CAF）及异常血管网络等构成。靶向TME的小分子药物通过重塑微环境、解除免疫抑制、改善药物递送等机制克服耐药性，成为当前研究热点。 针对缺氧微环境，缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)抑制剂KC7F2[36]、碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydraseⅨ,CAⅨ)抑制剂SLC-0111以及钠氢交换体1（sodium-hydrogen exchanger 1，NHE 1）抑制剂cariporide[37]（见图3）等通过缓解肿瘤缺氧和酸中毒，改善药物递送并增强化疗敏感性。在免疫抑制性信号通路方面，转化生长因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β)受体抑制剂galunisertib[38]（见图3）已完成聂期临床试验，单药治疗可增强分化决定族抗原4+（cluster of differentiation 4+，CD4+）1型辅助性T细胞（T helper type 1，Th1）反应和CD8+T细胞溶细胞活性，与程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L 1）抑制剂联用显著提高治疗应答率，尤其在结直肠癌CMS4亚型中显示出明确的抗肿瘤活性；吲哚胺2,3-双加氧酶1（indoleamine 2,3-dioxygenase 1，IDO 1）抑制剂linrodostat[39]（见图3）则通过解除色氨酸耗竭和犬尿氨酸介导的免疫抑制，与免疫检查点抑制剂联用产生协同效应。 针对TAM和MDSC，集落刺激因子1受体抑制剂（colony-stimulating factor 1 receptor inhibitor，CSF 1R）西达替尼（pexidartinib）[40]（见图3）、多靶点酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼（sunitinib）[41]以及5型磷酸二酯酶（phosphodiesterase type 5，PDE5）抑制剂西地那非（sildenafil）[42]等可通过耗竭或重编程免疫抑制细胞恢复抗肿瘤免疫。特别值得注意的是，从海洋生物海蛸中提取的四氢异喹啉类生物碱曲贝替定（trabectedin）[43]，对TAM及循环单核细胞具有选择性细胞毒作用，该药已获批用于特定类型的软组织肉瘤及复发性卵巢癌（常与脂质体多柔比星联合）。 此外，热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）抑制剂ganetespib[44]（见图3）和luminespib通过抑制HSP90分子伴侣活性、促进多种致癌激酶等客户蛋白降解，调控肿瘤及免疫微环境；与免疫检查点抑制剂联用可增强T细胞介导的抗肿瘤免疫。靶向肿瘤血管/基质的相关策略包括：基质金属蛋白酶-2/基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-2/matrix metalloproteinase-9，MMP-2/MMP-9）抑制剂SB-3CT、氨肽酶N靶向药物NGR-hTNF以及肿瘤内皮标志物8（tumor endothelial marker 8，TEM8）靶向抗体CMG4-Fc等，可通过抑制血管生成、靶向肿瘤内皮或改善瘤内药物分布等途径影响递送。此外，糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)抑制剂SB415286与PI3Kδ抑制剂IC87114等免疫调节性小分子，可分别通过增强CD8+T细胞功能或抑制Treg活性等机制，辅助恢复抗肿瘤免疫。 值得关注的是，诱导铁死亡[45]已成为克服凋亡耐药的新兴策略。谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抑制剂RSL3和SLC7A 11抑制剂erastin（见图3）可选择性诱导耐药肿瘤细胞发生铁死亡，为克服传统治疗耐药提供了新途径。这些靶向TME的小分子药物通过单药或联合策略，有望将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，显著提高肿瘤治疗的整体疗效。 3 新兴技术与未来方向 3.1  人工智能辅助药物设计 AI技术正从根本上重塑小分子药物研发的全流程，构建起从靶点发现到临床候选药物优化的智能化研发新范式。这一变革性流程以蛋白质结构预测为起点，以AI驱动的分子设计为核心，以实验验证与迭代优化为闭环，显著提升了研发效率并降低了失败风险[21]。 AlphaFold2及其后续版本[46]的突破性进展，解决了困扰结构生物学数十年的蛋白质折叠问题，为药物设计提供了前所未有的结构基础。AlphaFold3更进一步，能够预测蛋白质-配体复合物、蛋白质-核酸复合物以及翻译后修饰蛋白的结构，精度接近实验解析水平。此外，ESMFold等语言模型基于序列的进化信息直接推断结构，为缺乏同源模板的“孤儿”靶点提供了可行方案。这些预测结构不仅加速了靶点成药性评估，更为后续分子对接和基于结构的药物设计奠定了原子水平的精度基础。 AI增强的分子对接算法显著提高了预测精度。传统对接依赖刚性受体假设和简化打分函数，难以准确预测诱导契合效应和水分子介导的相互作用。基于图神经网络（graph neural network，GNN）和Transformer架构的深度学习模型（如AtomNet[47]、GNINA[48]），通过从海量晶体结构数据中学习蛋白质-配体相互作用的复杂模式，能够更准确地预测结合构象和亲和力。在耐药研究中，这些模型可评估候选分子对野生型和突变型靶点的选择性差异，优先保留对耐药突变体仍有纳摩尔级亲和力的分子，实现“一药多靶”或“抗耐药”的设计目标。 Rentosertib（见图4）是首个完成临床概念验证（聂期临床试验）的AI驱动药物，标志着AI药物研发进入新纪元[49]。从项目启动到临床候选化合物（preclinical candidate，PCC）提名仅18个月，合成测试约60~200个分子（传统方法需2.5~4年，合成数千分子）。此外，甲硫氨酸腺苷转移酶2A（methionine adenosyltransferase 2A，MAT2A）抑制剂ISM3412、泛TEA结构域转录因子抑制剂 ISM6331等均为AI技术参与主导发现的候选药物。 随着多模态大模型和数字孪生技术发展，AI药物研发从“预测已知”向“创造未知”演进。未来智能研发平台将整合多组学和临床数据，构建数字孪生模型，预演耐药并测试策略，有望实现“设计即克服耐药”，为耐药管理带来突破[50]。 3.2  分子胶与靶向蛋白降解 若将PROTAC比作“显性双功能”降解剂（以linker明确连接2个配体），分子胶则堪称“隐性双功能”的魔术师：单个小分子同时结合靶蛋白与E3连接酶，诱导二者形成三元复合物，触发靶蛋白泛素化降解。分子胶作用机制精妙：小分子结合E3连接酶（如CRBN、DCAF 15）后，诱导其底物识别界面构象改变，创造与靶蛋白的全新作用面。此“诱导契合”机制，使原本无相互作用的蛋白产生高亲和力结合，进而降解。与PROTAC相比，分子胶优势独特：相对分子量小（通常<500），口服生物利用度佳；成药性高，符合Lipinski 5规则；免疫原性低；可靶向PPI界面，扩展可降解蛋白质组。分子胶领域成功代表来那度胺（lenalidomide）（见图4）及其衍生物[51]。这类免疫调节酰亚胺类药物结合CRBN，诱导转录因子IKZF 1/3和CK1α降解，在多发性骨髓瘤等疾病治疗中成效显著，2021年全球销售额达128亿美元。 2024—2025年，分子胶步入理性设计时代[51-52]。以NVP-DKY709（见图4）为例，通过分析泊马度胺（见图4）与IKZF 1/CRBN三元复合物的结合模式，引入额外基团提升活性，最终优化获得新一代分子胶。分子胶面临的核心挑战在于理性设计困难，无法如PROTAC般通过连接2个已知配体构建，需依赖高通量筛选或AI辅助发现诱导PPI的化学骨架。前沿研究方向包括：开发非CRBN/VHL的新型E3连接酶（如DCAF 16、DCAF 11、RNF 114等）；利用AI和机器学习预测分子胶活性；设计组织特异性分子胶（基于E3连接酶组织选择性表达）；开发“靶向胶”策略，通过修饰靶蛋白配体创造降解界面[53]。 3.3  老药新用 药物重定位已成为克服小分子药物耐药的重要策略[54-55]，其核心价值在于突破传统新药研发周期长、成本高的瓶颈，为耐药性问题提供快速可及的解决方案。当前，该策略已从早期的经验性发现转向基于系统生物学、网络药理学和AI的理性筛选阶段。在肿瘤领域，沙利度胺（thalidomide）作为免疫调节剂成功用于多发性骨髓瘤治疗，其通过降解IKZF 1/3转录因子发挥抗肿瘤作用；经典老药阿司匹林（aspirin）则被发现在特定肿瘤背景下可通过抑制炎症微环境逆转化疗耐药。南京中医药大学课题组近期发现，升血小板药物艾曲波帕（eltrombopag）（见图4）可通过靶向Wnt/β-连环蛋白信号通路抑制多发性骨髓瘤细胞，为克服蛋白酶体抑制剂耐药提供了新选择[56]。在抗感染领域，他汀类药物可通过破坏细菌膜脂质筏增强抗生素活性[57]；抗精神病药物氯丙嗪（chlorpromazine）（见图4）和硫利达嗪（thioridazine）能抑制外排泵功能，恢复耐药菌对氟喹诺酮类的敏感性[58]，非甾体抗炎药塞来昔布在肿瘤等领域的重定位研究也为克服耐药提供了新思路[59]。这些成功案例表明，老药新用正从“偶然发现”走向“系统性挖掘”，结合微量热法等生物物理技术，可快速筛选具有协同效应的药物组合，为个体化抗耐药治疗提供依据。 3.4  靶向蛋白-蛋白相互作用 PPI是细胞信号传导的核心机制。人类蛋白质组中估计有30~50万种PPI，其中许多与疾病密切相关。然而，PPI界面通常大而平坦，缺乏深疏水口袋，传统上被认为是“不可成药”的[60]。 PPI抑制剂/调节剂的设计策略包括：靶向PPI界面的“热点”区域；稳定内源性抑制蛋白的结合（分子胶的“逆过程”）；设计“分子楔”插入PPI界面，阻断相互作用；利用环肽、订书肽等中等分子量分子跨越PPI界面。 Menin抑制剂是PPI靶向领域的明星[61]。Menin与KMT2A（MLL1）的相互作用对急性白血病（特别是KMT2A重排和NPM 1突变型）的维持至关重要。阻断这一PPI可抑制HOXA/MEIS1基因表达，诱导白血病细胞分化。2024—2025年，多个Menin抑制剂进入临床试验，比如瑞维美尼（revumenib)(见图4），首个进入临床的Menin抑制剂，在复发/难治性急性白血病中显示良好疗效。近年来，选择靶向Hsp90伴侣蛋白的策略亦成为研究的热点[62]，由于其克服了传统直接靶向Hsp90所致的严重不良反应，如靶向Hsp90-CD37的DDO-6079[63]（见图4），靶向Hsp90-AHA1的KU-177[64]（见图4），靶向Hsp90-p23的gedunin，以及靶向Hsp90-HSP90组织蛋白（HSP90 organizing protein，HOP）的Y-632等。 PPI靶向的策略正在从“阻断相互作用”扩展到“降解相互作用蛋白”。例如，靶向Menin-KMT2A相互作用的抑制剂[65]，同时导致Menin蛋白的降解（通过分子胶机制），产生更持久的药效。这种“PPI阻断+蛋白降解”的双重机制，代表了下一代PPI调节剂的发展方向。同时，针对传统小分子难以靶向的PPI，环肽提供了新选择[66]。环肽具有中等分子量、高亲和力、高选择性、可口服（某些情况下）的优势。同时，AI辅助的环肽设计（如DeepMind的AlphaFold结合分子动力学模拟）正在加速这一领域的发展。 3.5  抗体-药物偶联物 抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC）素有“生物导弹”的美誉[67]。ADC是通过化学连接子Linker，将具有细胞毒性的药物（Payload）与能靶向特异性抗原的单克隆抗体进行偶联，进而达成精准递送药物的目的。 目前，ADC已从早期的概念验证阶段，成功迈入临床应用的爆发期。截至2024年，全球范围内已有10余款ADC药物获批上市，其适应证广泛覆盖血液系统恶性肿瘤以及实体瘤。2025年，第一三共与阿斯利康携手合作的德达博妥单抗获批，用于治疗激素受体阳性（hormone receptor-positive，HR+）/HER2-乳腺癌，成为首个在该适应证获批的滋养层细胞表面抗原2（trophoblast cell surface antigen 2，Trop2）靶向ADC，这一成果标志着ADC药物从以HER2为靶点，向更为广泛的靶点领域实现了拓展[68]。 ADC技术历经3代发展演进：第1代ADC采用不稳定连接子，这导致药物容易出现脱靶毒性问题；第2代ADC改用可裂解连接子，有效提高了对肿瘤的选择性；第3代ADC则运用高药物抗体比（drug-to-antibody ratio，DAR）、高活性的细胞毒药物，例如拓扑异构酶Ⅰ抑制剂或微管抑制剂，并且成功实现了“旁观者效应”，能够对具有抗原异质性的肿瘤进行有效杀伤。然而，当前ADC药物仍面临一些技术瓶颈，包括如何平衡连接子的稳定性与释放效率、应对细胞毒药物的耐药机制、突破实体瘤渗透性的限制，以及解决免疫原性相关的不良反应等问题。未来，ADC药物的发展方向将聚焦于双特异性ADC、免疫刺激型ADC、多载荷ADC等创新设计[67,69]。 4 结语与展望 小分子药物耐药性已然成为当下医学领域亟待攻克的难题，攻克这一困境，需采取多维度、多层次的综合策略。传统药物设计遵循的“占据驱动”理念，正向“事件驱动”范式实现战略转型。从基于结构优化研发的下一代抑制剂，到机制创新的 PROTAC技术；从临床沿用已久的传统联合化疗方案，到智能化赋能的AI药物设计技术。这些策略各具应用优势且互为补充，共同构筑起攻克药物耐药性问题的研究体系与发展前景。 多策略整合已成为抗耐药药物开发的核心方向。未来以下几个研究方向值得重点关注与深入探索：其一，全力开发新型抑制剂。致力于研发能够同时覆盖多种耐药突变的新型抑制剂，此类抑制剂如同“万能钥匙”，有望打破耐药突变带来的治疗困境，为患者带来新的生机。其二，加速PROTAC等蛋白降解技术的临床转化。积极推进PROTAC等蛋白降解技术的临床转化进程，同时不断优化其药代动力学特性。PROTAC技术作为新兴的抗耐药利器，只有顺利跨越临床转化这道门槛，并提升其在体内的稳定性和生物利用度等特性，才能更好地服务于临床治疗。其三，构建精准治疗体系。建立基于耐药机制分型的精准治疗体系，通过对耐药机制的精准剖析和分类，为患者量身定制个性化的治疗方案，实现治疗的精准化、高效化，提高治疗的成功率和患者的生活质量。其四，探索联合治疗策略。深入探索靶向TME和免疫系统的联合策略，TME和免疫系统在肿瘤的发生、发展以及耐药过程中扮演着重要角色，通过联合靶向这些关键环节，有望打破肿瘤的耐药防线，实现协同增效的治疗效果。值得一提的是，传统中医药蕴含着丰富的宝藏，其独特的作用机制为克服耐药性提供了新的思路。无论是中西医结合的协同治疗模式，还是从小分子天然结构中挖掘潜在的有效成分，都为应对耐药性问题提供了潜在的解决策略，值得进一步深入研究与挖掘。 随着耐药机制解析的精细化和新技术平台的成熟，克服小分子药物耐药正从“被动应对”转向“主动设计”。药物化学作为连接基础研究与临床应用的桥梁学科，需以范式革新为引领、以多策略整合为路径、以原创突破为目标，在全球抗耐药药物研发竞争中占据主动地位，最终实现耐药性疾病治疗从“有限控制”到“功能性治愈”的跨越。 参考文献: [1]     Bognár B, Spohn R, Lázár V. 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组蛋白去乙酰化酶 6（HDAC6）作为 IIb 类锌依赖型组蛋白去乙酰化酶，拥有区别于其他 HDAC 亚型的独特双催化结构域与 C 端锌指泛素结合结构域，是调控细胞骨架动力学、蛋白质质量控制、细胞应激应答通路的核心分子开关，其表达与功能异常和多种实体肿瘤、阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病高度关联，也因此成为药物研发领域极具潜力的治疗靶点，大量高选择性 HDAC6 小分子抑制剂已经推进至临床研究阶段，但长久以来科研人员始终缺少能够直观追踪活细胞内 HDAC6 时空动态分布的化学工具，传统研究手段存在无法规避的固有缺陷，一方面荧光蛋白基因标记法会引入蛋白体积过大带来的空间位阻效应，极易造成 HDAC6 融合蛋白错误折叠、异位表达，无法还原内源蛋白真实胞内分布，另一方面已报道的 HDAC6 小分子荧光探针普遍存在明显短板，三苯胺、四苯乙烯、萘酰亚胺、荧光素等短波长荧光团会受细胞自发荧光干扰、组织穿透性差且光毒性显著，近红外花菁修饰探针无法适配 STED 超分辨显微成像，光敏型 HDAC-MB 探针会诱导细胞光损伤，难以用于长时间活细胞动态观测，基于以上研究现状，本文作者团队锁定 “构建兼具高亚型选择性、细胞膜通透性、低细胞毒性、远红光发光、适配超分辨成像” 的 HDAC6 活细胞荧光探针这一核心科学目标，以高选择性 HDAC6 抑制剂 Nexturastat A 为靶向骨架，结合光稳定性优异的远红光硅罗丹明（SiR）荧光团，通过系统构效关系筛选优化连接臂长度、荧光团母核、锌结合基团、骨架修饰方式，最终开发得到最优探针分子 6SiR-C3-NextA，整套探针开发流程依托自主搭建的活细胞共定位筛选体系完成性能验证，突破了传统体外蛋白结合实验无法模拟胞内复杂微环境、难以评估探针膜通透性与脱靶结合的局限，该筛选体系构建了可强力诱导单一 HDAC 亚型（HDAC1-8）表达的 U-2 OS 细胞株，各 HDAC 蛋白 C 端融合 HaloTag 标签，可结合光谱与探针完全分离的 TMR 荧光配体作为蛋白定位金标准，通过计算探针荧光信号与 HaloTag 参考信号的皮尔森相关系数（PCC）定量评判探针亚型选择性，该方法无需纯化蛋白、可直接在活细胞内同步评估靶向结合、膜穿透、非特异性吸附多重性能，还可拓展至其他 HDAC 亚型探针的筛选工作。 团队采用模块化探针设计思路，将靶向识别单元、连接臂、荧光发色团三部分拆分进行梯度优化，首先对比三种成熟 HDAC6 选择性抑制剂骨架（CAY10603、Tubastatin A、Nexturastat A）偶联 SiR 荧光团后的初代探针性能，CAY10603 衍生探针 1 的 HDAC6 共定位系数仅 0.29±0.03，几乎丧失靶向能力，Tubastatin A 衍生探针 2 虽可结合 HDAC6 但脱靶效应明显，PCC 值为 0.66±0.08，而 Nexturastat A 衍生探针 3 展现出极强亚型特异性，PCC 高达 0.84±0.02，证明该抑制剂骨架偶联大体积荧光团后仍能保留原有靶向结合能力，在此基础上开展全方位构效关系筛选，荧光团层面对比四甲基罗丹明（TMR）与硅罗丹明 SiR，SiR 两性离子形式 cLogP 约 - 0.88、内酯中性形式 cLogP 达 5.86，更高脂溶性赋予其更强细胞膜穿透能力，TMR 极性过强导致细胞摄取效率极低，同时对比 SiR 4/5/6 位三种连接位点异构体，6 位取代 SiR 探针信号强度最优，成为固定荧光团母核；骨架氟化修饰实验中，将 Nexturastat A 苯环全氟取代得到探针 9，细胞成像信噪比与荧光强度大幅下降，证实氟修饰会降低探针与 HDAC6 结合亲和力或胞内富集量，无需对抑制剂骨架进行氟化改造；锌结合基团（ZBG）对比传统异羟肟酸与二氟甲基恶二唑（DFMO）不可逆结合基团，引入 DFMO 的探针 10、11 共定位系数显著降低，说明 Nexturastat A 自带的异羟肟酸基团是维持高效靶向结合的核心结构；连接臂模块系统筛选 C2-C10 烷基链、1-4 单元 PEG 链，烷基链过短会造成荧光团空间位阻遮挡抑制剂结合口袋，过长则增加分子柔性引发非特异性吸附，PEG 链强极性大幅削弱细胞穿透效率，最终碳 3 烷基连接臂修饰的探针 6SiR-C3-NextA 兼具最高荧光强度与信噪比，成为后续全部表征与生物学实验的核心工具分子。 完成分子结构优化后，研究团队首先开展体外生化水平定量表征，利用均相时间分辨荧光（HTRF）饱和结合实验测定探针与 HDAC6 的结合亲和力，基于蛋白标记铽供体与 SiR 荧光团的 FRET 能量转移效应实现高灵敏定量检测，测得探针表观解离常数 Kd^app=21±4 nM，展现纳摩尔级高结合能力，同步检测 I 类 HDAC1、IIa 类 HDAC7 无明显 HTRF 信号，证明对其他亚型无结合作用，针对同属 IIb 类的 HDAC10 开展荧光激活实验，探针仅在 HDAC6 存在下荧光提升 3.6 倍，HDAC10 体系无荧光增强，对比 Tubastatin A 探针可同时激活 HDAC6 与 HDAC10 荧光信号，凸显 6SiR-C3-NextA 在 IIb 亚型内部仍具备高度区分能力，探针自带荧光激活特性是实现高信噪比成像的关键，未结合靶点的游离探针荧光微弱，仅结合 HDAC6 后分子构象改变释放强荧光，大幅降低胞内背景干扰；细胞毒性层面分别通过细胞周期流式分析与 Annexin V 凋亡检测验证，HeLa 细胞经最高 5 μM 探针处理 24 h 无明显细胞周期阻滞，SUP-M2 细胞在 1.25 μM 及以下成像常用浓度下未出现细胞凋亡，毒性远低于常规工作浓度 100 nM，生物相容性完全适配长时间活细胞观测；同时评估探针对 HDAC6 内源酶活的干扰能力，HDAC6 核心底物 α- 微管蛋白 40 位赖氨酸乙酰化水平可直接反映酶活，梯度浓度探针处理细胞后免疫荧光定量检测乙酰化微管比例，探针 EC50 达到 675 nM，远高于 100 nM 成像浓度，常规染色条件下不会显著抑制 HDAC6 去乙酰化功能，能够真实还原细胞未受扰动的内源 HDAC6 动态行为，避免探针本身干预细胞生理通路带来的观测偏差。 细胞层面靶向特异性验证覆盖 HeLa、HEK293T、SH-SY5Y、人成纤维细胞、3T3、Huh-7、SUP-M2 七种细胞系，固定细胞内探针荧光信号与商品化 HDAC6 抗体共定位 PCC=0.85±0.04，活细胞中与 HDAC6-HaloTag 融合蛋白信号 PCC=0.90±0.03，使用过量无荧光 Nexturastat A 进行竞争性阻断实验后胞内荧光几乎完全消失，双重证据证明探针靶向专一性，且探针可适配多聚甲醛固定流程，能够与免疫荧光染色联用开展固定样本联合观测；研究同时发现探针是细胞外排泵底物，主动转运会大幅降低胞内探针富集量，借助流式细胞术定量对比不同外排抑制剂的提升效果，7 种细胞中 6 种共孵育外排抑制剂后胞内荧光最高提升 9 倍，3T3、Huh-7 细胞使用 Tariquidar、Zosuquidar 效果最优，HeLa 与人成纤维细胞搭配维拉帕米信噪比提升最显著，该结论为后续所有活细胞成像实验提供标准化优化方案，只需同步添加对应外排抑制剂即可大幅改善成像质量。 依托性能成熟的 6SiR-C3-NextA 探针，团队开展多项生物学功能可视化实验，首先聚焦 HDAC6 两大经典生理行为：微管网络结合与应激颗粒动态募集，高渗诱导渗透压应激处理 HDAC6 过表达 U-2 OS 细胞，借助 STED 超分辨显微成像实时捕捉 HDAC6 从均匀胞质分布快速聚集形成点状应激颗粒的全过程，活细胞时序成像完整记录应激前后蛋白定位动态变化，证实探针兼容超分辨纳米尺度观测；在内源蛋白水平重复实验，HeLa 细胞共孵育维拉帕米与微管靶向探针 4TMR-CTX，双色共聚焦成像清晰观测到内源 HDAC6 沿微管纤维分布，应激刺激后全部转运至微管上形成的应激颗粒，同时应激状态下少量核内 HDAC6 向核内膜聚集，该现象与 HDAC6 核定位信号乙酰化调控机制吻合，完整还原 HDAC6 参与细胞应激应答的动态调控过程；考虑 HDAC6 在神经退行性疾病中的关键作用，进一步在大鼠原代神经元中开展成像测试，探针可穿透神经元细胞膜标记内源 HDAC6，加入过量游离抑制剂后荧光完全消失，证明神经元内靶向结合特异性，但神经元高脂质微环境会造成少量非特异性吸附，探针荧光与 HDAC6 抗体共定位系数仅 0.4-0.6，为后续探针迭代优化指明改进方向。 综合全文全部设计、合成、表征与细胞生物学实验结果，这项工作填补了现有 HDAC6 活细胞成像化学工具的技术空白，通过模块化分子设计与细胞水平高通量共定位筛选体系，系统性完成荧光团、连接臂、靶向骨架、锌结合基团的全方位构效优化，最终得到 6SiR-C3-NextA 探针，该分子兼具纳摩尔级 HDAC6 结合亲和力、跨 HDAC1-10 全亚型超高功能选择性、优异细胞膜通透性、极低细胞毒性、远红光发射与光稳定性，适配共聚焦、STED 超分辨等多种主流显微成像平台，探针自带荧光激活效应有效降低成像背景，常规工作浓度不会干扰 HDAC6 天然酶活，可精准追踪多种肿瘤细胞、正常成纤维细胞、原代神经元中内源 HDAC6 的亚细胞定位动态，利用该探针直观可视化 HDAC6 与微管骨架的结合模式、细胞应激下向应激颗粒快速转运的动态过程，为解析 HDAC6 调控细胞骨架稳态、应激应答、神经轴突运输的分子机制提供了不可替代的化学工具，同时搭建的 HaloTag-HDAC 活细胞共定位筛选平台具备通用性，可推广至其他 HDAC 亚型高选择性荧光探针的开发工作，长远来看该探针能够助力阿尔茨海默病、帕金森病、多种恶性肿瘤相关 HDAC6 病理机制研究，推动 HDAC6 靶向药物筛选与药效动态评价体系发展，为表观遗传、细胞应激、神经生物学相关基础研究提供全新可视化技术手段，仅原代神经元中存在少量非特异性吸附的短板，也为下一代靶向 HDAC6 荧光探针的结构优化提供了明确的改进思路与实验依据。 https://doi.org/10.1021/jacs.5c22444 全文附图严格遵循探针筛选→结构优化→体外生化定量→细胞毒性与酶活干扰验证→胞内摄取与外排调控→生物学功能成像完整实验递进逻辑，从分子初筛到功能应用层层递进，每一张图承接上一组实验结论、引出下一阶段验证方向，整体形成闭环式探针开发证据链，下面按文中 Figure 1 至 Figure 6 依次完整拆解内在逻辑与对应实验目的。 最先出现的 Figure 1 是整套研究的起点，承担探针初筛体系搭建与三类先导探针横向对比的核心作用，整体分为四个子模块，逻辑上先建立评价平台、再合成候选分子、最后定量打分筛选最优骨架。图 1a 为基于活细胞 HaloTag 的共定位筛选实验原理图，也是全文所有探针选择性评价的核心技术基础，作者先解释人工构建 HDAC1–8 单亚型诱导表达 U-2 OS 细胞系，HDAC 蛋白末端融合 HaloTag，搭配光谱完全分开的 TMR 荧光配体作为 HDAC 真实定位参照，将待测探针与细胞共孵育后通过双荧光成像计算皮尔森相关系数 PCC，以此量化探针靶向特异性，这一步先解决了传统体外蛋白实验无法模拟胞内微环境、不能同时评估膜穿透与脱靶结合的痛点，为后续所有探针筛选定下统一评判标准；图 1b 展示第一代三类探针的合成路线，分别以 CAY10603、Tubastatin A、Nexturastat A 三种经典 HDAC6 选择性抑制剂为靶向骨架，共价偶联同一款 SiR 硅罗丹明荧光团，得到探针 1、2、3，用来横向对比不同抑制剂骨架偶联荧光团后是否保留亚型选择性；图 1c 是探针 3（Nexturastat A 骨架）的典型明场荧光成像实拍图，直观肉眼层面就能看出探针信号与 HDAC6-HaloTag 参考荧光高度重合，提供可视化直观证据；图 1d 是三类探针 PCC 定量统计柱状图，数值直接量化差异：CAY10603 衍生探针 1 PCC 仅 0.29±0.03，靶向能力基本丢失，Tubastatin A 探针 2 PCC 0.66±0.08 存在明显脱靶，Nexturastat A 探针 3 PCC 高达 0.84±0.02，综合原理图、合成路线、成像实拍、定量数据四重证据，完成第一轮骨架筛选，直接锁定 Nexturastat A 作为最优识别单元，顺势引出下一阶段系统构效关系优化实验，也就是 Figure 2 的内容。 紧随其后的 Figure 2 承接 Figure 1 筛选出的 Nexturastat A 骨架，开展全维度系统构效关系（SAR）研究，是探针分子精细化改造的核心图谱，图中罗列了 20 余种不同修饰变体探针的化学结构，所有改造维度都围绕影响探针性能的四大关键结构模块分层设计，逻辑上是对先导探针 3 进行变量单一控制的梯度改造，分别改变荧光团母核、荧光团连接位点、抑制剂骨架氟化修饰、锌结合基团 ZBG、中间连接臂五类结构，每一类改造都对应一组对照探针：荧光团变量分为 SiR 系列（3/4/5）与 TMR 系列（6/7/8），对比远红光硅罗丹明与短波长四甲基罗丹明对细胞穿透、靶向结合的影响；荧光团同分异构体改变氧杂蒽母核连接位点（4/5/6 位），判断连接位点带来的空间位阻、荧光量子产率变化；骨架修饰探针 9 为全氟苯环 Nexturastat A 衍生物，验证氟化对胞内富集、结合亲和力的调控；锌结合基团改造探针 10、11 替换经典异羟肟酸为 DFMO 二氟甲基恶二唑不可逆结合基团，对比两类 HDAC 结合核心基团的适配性；连接臂系列探针 12–23 梯度更换 C2–C10 烷基链、1–4 单元 PEG 亲水链，筛选长度与疏水性最优连接片段。整张图相当于一份完整的分子改造变量清单，所有变体均统一使用 Figure 1 建立的 HaloTag 共定位体系平行测试，Figure 2 只展示化学结构，对应的成像定量结果全部放在补充图 S3–S6，通过单一变量对照逐一排除劣势结构，最终收敛到 6 位 SiR 荧光团、未氟化 Nexturastat A、异羟肟酸 ZBG、C3 烷基连接臂组合，确定最优分子 6SiR-C3-NextA，完成分子结构全部优化工作，接下来进入 Figure 3 体外生化与细胞基础安全性定量表征阶段。 Figure 3 是最优探针 6SiR-C3-NextA 的体外生化、细胞毒性基础表征合集，承接 Figure 2 确定的终产物，从分子结合能力、荧光激活特性、细胞生物相容性三个维度完成探针基础性能定量验证，分为 abcd 四张子图，逻辑从分子互作到细胞安全逐层递进。图 3a 为 HTRF 均相时间分辨荧光饱和结合曲线，用来定量探针与不同 HDAC 亚型的结合亲和力，曲线显示探针仅对 HDAC6 存在浓度依赖性 FRET 信号，计算得到表观解离常数 Kd^app=21±4 nM，而 HDAC1、HDAC7 全程无明显信号，从纯蛋白层面证明跨 I/IIa 类 HDAC 亚型高选择性；图 3b 检测探针的荧光激活特性，对比细胞裂解液中单独探针、探针 + 重组 HDAC6 两组荧光强度，加入靶蛋白后荧光提升约 3.6 倍，解释探针高信噪比成像的分子机理：游离探针荧光微弱，结合 HDAC6 后构象改变开启荧光信号，降低胞内游离探针背景干扰；图 3c 是 HeLa 细胞 24 h 梯度探针处理后的细胞周期流式统计，梯度浓度最高至 5 μM 仍无显著 G1、G2/M、SubG1 周期分布扰动，证明高浓度下也不会干扰细胞正常增殖周期；图 3d 为 SUP-M2 细胞 Annexin V 凋亡检测结果，成像常用浓度≤1.25 μM 时细胞凋亡水平与空白对照组无差异，仅远超工作浓度才出现轻微凋亡，双图联合证明探针极低细胞毒性，满足长时间活细胞动态成像的生物安全要求，在明确探针结合能力与安全性后，下一步需要验证探针是否会干扰 HDAC6 自身酶功能，对应 Figure 4 的实验内容。 Figure 4 聚焦探针的酶活干扰评估，承接 Figure 3 的安全性结论，专门解决小分子抑制剂衍生探针的核心隐患：探针是否会抑制内源 HDAC6 功能、造成细胞生理通路扰动，分为 ab 两部分形成图像 + 定量曲线完整证据链。图 4a 是人成纤维细胞免疫荧光实拍图，分别设置空白对照组与探针处理组，使用乙酰化 α- 微管蛋白特异性抗体标记 HDAC6 核心底物，直观对比两组乙酰化微管荧光水平，肉眼可见常规成像浓度下乙酰化信号无明显升高；图 4b 是梯度浓度下乙酰化微管相对荧光定量剂量响应曲线，同时平行测试母体抑制剂 Nexturastat A 作为对照，曲线计算得出探针 EC50=675 nM，母体抑制剂 EC50 仅 31 nM，成像标准工作浓度 100 nM 远低于探针有效抑制浓度，定量数据证实日常染色条件下探针几乎不会抑制 HDAC6 去乙酰化活性，不会人为改变细胞内源蛋白修饰水平，保障后续成像观测到的 HDAC6 定位动态是细胞原生生理状态，排除探针自身带来的实验偏差，在确认探针靶向、安全、不干扰靶蛋白功能后，进入 Figure 5 探究影响胞内成像质量的关键变量 —— 细胞外排泵效应。 Figure 5 围绕探针胞内富集效率展开，承接前面基础表征，解决实际成像中信号偏弱的实操问题，从流式定量与荧光成像两个层面验证外排泵对探针的清除作用、以及抑制剂的改善效果，分为 ab 子图。图 5a 是七种不同细胞系的流式荧光强度统计，分别检测仅探针孵育、探针搭配对应外排抑制剂两组胞内荧光均值，数据显示 7 种细胞中有 6 种加入抑制剂后胞内探针荧光最高提升 9 倍，同时区分不同细胞适配的最优抑制剂：3T3、Huh-7 适配 Tariquidar/Zosuquidar，HeLa、人成纤维细胞适配维拉帕米，定量明确外排是限制探针胞内富集的核心因素；图 5b 是对应七种细胞的荧光显微实拍对照图，左侧单探针孵育组信号微弱，右侧探针 + 外排抑制剂组荧光显著增强，可视化直观印证流式定量结果，同时给出标准化成像优化方案，为后文 Figure 6 所有 HDAC6 动态生物学成像实验提供操作改进依据，在解决探针胞内摄取短板后，正式进入全文应用层面的核心成像图 Figure 6，利用优化完成的探针解析 HDAC6 真实生理动态。 Figure 6 是探针生物学功能应用成像合集，是前面全部分子筛选、生化、细胞表征的最终落地应用，分为 abcd 四张子图，按照肿瘤细胞超分辨成像→内源蛋白共聚焦动态追踪→原代神经元特异性验证→神经元共定位短板分析的逻辑排布，逐层展示探针在不同细胞体系解析 HDAC6 生理行为的能力。图 6a 是 HDAC6 过表达 U-2 OS 细胞 STED 超分辨成像对比，分别拍摄渗透压应激前、应激 30 min 后两组细胞，纳米尺度清晰捕捉 HDAC6 从均匀胞质弥散分布快速聚集形成点状应激颗粒的全过程，直接证明探针兼容 STED 超分辨显微，可实现亚微米级 HDAC6 动态观测；图 6b 是 HeLa 内源 HDAC6 双色共聚焦成像，同时标记 6SiR-C3-NextA（HDAC6）、4TMR-CTX（微管）、Hoechst（细胞核），并共孵育维拉帕米抑制外排，应激前后时序成像直观呈现内源 HDAC6 沿微管网络分布，应激刺激后全部转运至微管上形成应激颗粒，同时观测到核内 HDAC6 向核内膜富集的全新动态细节，完整还原 HDAC6 调控细胞骨架、参与应激应答的生理机制；图 6c 是大鼠原代神经元特异性阻断对照成像，左侧仅探针孵育可见神经元清晰荧光，右侧探针 + 过量游离 Nexturastat A 竞争性阻断后荧光完全消失，证明神经元中探针结合 HDAC6 具备靶点特异性；图 6d 是神经元内探针与商品化 HDAC6 抗体免疫荧光共定位图，标注区域皮尔森相关系数仅 0.4–0.6，说明神经元脂质丰富的复杂胞内环境会造成少量非特异性吸附，客观指出当前探针存在的局限，为下一代探针结构优化提供明确方向，整套 Figure 6 完成探针从工具开发到生物学机制解析的完整闭环，同时客观提出现有分子的不足，收束全文全部实验证据。 整体六张主图形成一条不可倒置的线性实验逻辑链：Figure1 搭建评价平台 + 初筛靶向骨架→Figure2 系统改造分子完成构效优化锁定最优探针→Figure3 体外结合 + 荧光激活 + 细胞毒性基础表征→Figure4 验证探针不会干扰靶蛋白内源酶活→Figure5 探究胞内外排影响并给出成像优化方案→Figure6 利用成熟探针完成多细胞体系 HDAC6 生理动态可视化应用，每一张图的实验结论都作为下一张图的实验前提，从分子设计筛选、基础理化生化表征、成像条件优化到生物学功能探索层层递进，完整覆盖新型荧光探针开发从源头设计到实际科研应用的全流程验证思路。