Doxorubicin Hydrochloride

本文为转化医学网原创，转载请注明出处  作者：Tracy 【导读】对化疗的耐药性，一直是限制许多类型癌症治疗的主要障碍。本研究通过对多种癌细胞中的7种化疗药物，进行 30 次基因组规模的 CRISPR 敲除筛选，系统地鉴定了化疗耐药性的遗传驱动因素。本研究不仅为化疗耐药性的分子基础提供了信息和见解，而且还提出了针对这种耐药性的潜在生物标志物和治疗策略。 2024年6月29日，东北大学生命与健康学院费腾团队在期刊《Nature Communications》上发表了题为“CRISPR screens reveal convergent targeting strategies against evolutionarily distinct chemoresistance in cancer”的研究论文。本研究通过关注结直肠癌中的奥沙利铂和伊立替康耐药性，揭示了进化上不同的化疗耐药性，进一步将 PLK4 确定为通过遗传消融或药理学抑制，在各种模型中克服奥沙利铂耐药性的治疗靶点，强调了一种拮抗进化上不同的化疗耐药性的单药策略。 https://www.nature.com/articles/s41467-024-49673-4 研究背景  01  尽管靶向治疗和免疫治疗进展迅速，但使用细胞毒性化学药物破坏快速生长的细胞的化疗，继续在癌症治疗中发挥关键作用。对于许多恶性肿瘤，化疗仍然是首选的治疗方案。在某些不可切除或转移性癌症病例中，化疗可能是唯一的治疗方案。化疗药物更常用于在手术前或手术后，缩小肿瘤或根除残留的癌细胞。此外，通过以序贯或组合方式应用化疗，以及靶向治疗和免疫治疗等其他治疗方式，可以获得增强的治疗效果。然而，化疗的耐药性，仍然是癌症患者治疗失败和疾病复发的主要原因。 尽管有证据表明，几个单独的基因与化疗耐药性有关，但对这种现象的理解仍然不完整，并且仍然缺乏克服化疗耐药性的有效治疗策略。最新的基因组分析和功能基因组学，是实现这一目标的巨大贡献。然而，目前仍然缺乏对实体瘤中广泛使用的化学疗法耐药性的遗传驱动因素和脆弱性的系统描述。 为了填补这一空白，本研究进行了30次全基因组CRISPR敲除筛选，探索7种广泛使用的化疗药物（奥沙利铂、伊立替康、5-氟尿嘧啶、多柔比星、顺铂、多西紫杉醇和紫杉醇）在实体瘤癌细胞中化疗耐药的遗传原因。本研究揭示了化疗耐药性的多样化驱动力和分子特征，提出了可操作的靶向策略，以克服进化上不同的化疗耐药性。 研究进展  02  通过包括CRISPR筛选、多种奥沙利铂耐药模型的细胞和分子表征在内的组合努力，本研究获得了一些关于结直肠癌如何产生奥沙利铂耐药性的初步见解。在敏感细胞中，奥沙利铂-DNA加合物的形成，会产生可被p53感知的DNA损伤。然后，激活的 p53-p21 通路诱导 G1 和 G2/M 细胞周期停滞，从而阻断奥沙利铂敏感细胞的细胞生长。一旦细胞发生某些阻断 p53-p21 通路功能的遗传或表观遗传改变（例如，敲除 TP53、CDKN1A 或 SLC43A2），细胞就会因不受限制的周期进程，对奥沙利铂治疗产生耐药性。本研究结果，支持以细胞周期为中心的理论，作为解释结直肠癌奥沙利铂耐药性的主要机制。当细胞对奥沙利铂产生耐药性时，它们也可能具有某些特殊的脆弱性，这些脆弱性伴随着因果改变。事实上，在存在奥沙利铂诱导的 DNA 损伤的情况下，多个奥沙利铂耐药细胞更依赖于 PLK4 功能来完成细胞分裂。这种脆弱性，为应用单药PLK4靶向药物治疗奥沙利铂耐药结直肠癌，创造了机会。 在人类肿瘤中，PLK4在许多类型的癌症中，经常发生突变，包括结直肠癌。携带突变体PLK4的肿瘤，往往具有较高的肿瘤突变负荷，通常与结直肠癌肿瘤进展的晚期有关。与正常组织相比，在结直肠肿瘤样本中发现， PLK4 的 RNA 表达增加。由于难以获得明确的奥沙利铂耐药临床样本，本研究采用了从结直肠癌患者身上切除的肿瘤组织，并成功建立了7种患者来源的类器官（PDO）模型。这些肿瘤组织中的PLK4蛋白水平，也显著高于匹配的相邻正常对应物。因此，PLK4抑制剂CFI-400945的单药给药，可能是一种有前途的治疗策略，可以克服结直肠癌中奥沙利铂参与的化疗耐药性。 所有7种肿瘤衍生类器官（C-1 至 C-7）响应奥沙利铂（左图：0、1、5、10 和 20 μM 奥沙利铂）或 CFI-400945（右图：0、5、15、20 和 40 nM CFI-400945）的相对活力的反相关模式。 研究结论  03  本研究发现细胞周期的异常变化、DNA损伤反应和肿瘤微环境重塑，代表了基因改变驱动多药耐药性的主要机制，补充了以前关于多药耐药性的理论。对于具有相同作用机制的药物，如多西他赛和紫杉醇，它们的一般耐药机制之间也存在显著差异，尽管主要的遗传驱动因素和功能仍然相同。 因此，使用单一药物，而不是复杂的联合疗法的收敛方案，来克服由多样化的遗传改变，或分子途径引起的化疗耐药性，可能是一种很有前途的策略。 本研究有几个局限性。首先，研究设计侧重于主要由细胞自主效应驱动的化疗耐药性，而涉及肿瘤微环境和细胞-细胞相互作用的其他类型的化疗耐药性则未涵盖。其次，化学基因组筛选仅基于特定细胞系的体外培养为2D单层细胞。3D球体和体内小鼠模型中的进一步筛选，可能会产生更多的发现和见解。第三，本研究中应用了功能丧失的CRISPR筛选。研究的下一阶段应转向碱基编辑筛选，以更好地研究化疗耐药期间的癌症基因突变。第四，本研究优先检查了每种药物的化疗耐药性效应，而药物组合通常用于临床环境，剂量效应也可能影响药物反应。最后，本研究无法充分探索每个化疗耐药基因背后的详细机制。需要作出更多努力来填补这些空白。对这些潜在的生物标志物和治疗干预措施进行全面评估，有望使患有化疗耐药的患者受益。 【参考资料】 https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-024-03085-w#auth-Lin-Fang-Aff1 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

引言 在癌症治疗中，小分子抑制剂通过靶向基因组和表观基因组相关蛋白质来发挥作用，因此研究这些小分子抑制剂在分子和细胞层面的功能尤为重要。然而，目前对单细胞水平的药物靶点结合的测量仍存在技术挑战。7月18日Nature Methods的研究报道“Single-cell EpiChem jointly measures drug–chromatin binding and multimodal epigenome”介绍了一种新方法EpiChem，这是一种原位单细胞联合绘图技术，能够同时测量小分子药物与染色质的结合以及多模态的表观基因组特征。 EpiChem通过在单细胞水平上联合检测多种小分子药物与组蛋白修饰、染色质可及性或靶蛋白的共测实验，展示了其在研究人类结直肠癌（CRC）类器官中的多样化药物相互作用的能力。多模态综合分析揭示了在异质性CRC类器官中的染色质状态背景下的多种药物相互作用。进一步研究发现，在小分子药物处理后的CRC类器官中，不同细胞类型的药物基因组结合动态和适应性表观基因组特征。该方法为探索细胞类型特异性药物作用机制提供了独特的工具。 小分子药物在调节细胞过程、影响基因表达、染色质结构和信号通路中起着关键作用。这些相互作用构成了广泛的治疗干预的基础，涵盖了传统药物和先进的靶向治疗。尽管许多小分子药物在医学治疗中的疗效已被广泛认可，但其在基因组水平上的具体相互作用机制往往尚不清楚。迄今为止，仅有少数技术能够在整体样本中测量小分子与细胞DNA的相互作用，而且这些技术通常需要数百万个细胞。例如，Chem-seq和Click-Chem-seq技术通过使用亲和标签富集治疗药物结合的剪切染色质来检测小分子的基因组结合。Chem-map技术则通过目标标签结合的生化设计来实现这些相互作用的映射，但目前尚未实现单细胞水平的小分子靶点结合的测量。 通过EpiChem方法，研究人员能够在单细胞水平上进行高通量的小分子药物与基因组结合位点的联合分析。该技术采用裂池条形码（split-pool barcoding）和蛋白A-Tn5抗体定向标签的方法来获取单细胞的小分子结合位点，能够有效地处理从体内和体外实验中获得的数千个细胞的数据。这一方法的成功应用不仅展示了其在三种小分子抑制剂（JQ1、THZ1和多柔比星）与附加表观基因组特征联合分析中的有效性，还揭示了药物与其已知蛋白靶点之间的共享和特有结合位点的细微差异，为药物基因组结合的深入研究提供了新的工具和方法。 综上，EpiChem为在单细胞水平上解析小分子药物与基因组相互作用及其表观基因组状态提供了一种独特的方法。这一技术的潜在应用范围广泛，从药物开发到理解细胞异质性，都具有重要意义。通过不断优化和改进，EpiChem将进一步推动我们对药物基因组结合的认识，并为更有针对性和个性化的治疗干预铺平道路。 在癌症治疗中，小分子抑制剂通过靶向基因组和表观基因组相关蛋白质来发挥作用。然而，传统方法在单细胞水平上测量这些药物的靶点结合仍存在技术挑战。为此，研究人员开发了EpiChem技术，这是一种能够同时测量小分子药物与染色质结合以及多模态表观基因组特征的原位单细胞联合绘图技术。研究介绍了该技术在研究人类结直肠癌（CRC）类器官中的应用，揭示了异质性CRC类器官中不同药物相互作用的复杂性。 为了研究小分子药物在单细胞水平上的作用，EpiChem方法采用裂池条形码（split-pool barcoding）和蛋白A-Tn5抗体定向标签的方法来获取单细胞的小分子结合位点。具体步骤包括： 样品固定：将细胞固定后，重新悬浮在冷的1% BSA/PBS中，并加入冷的甲醇，储存在-80°C。 EpiChem实验：体内实验：细胞用10 µM JQ1-btn处理15分钟，然后固定。小分子与染色质的相互作用通过抗生物素抗体在4°C过夜捕获。 体外实验：固定后的细胞在25°C下用2.5 µM JQ1-btn和抗生物素抗体孵育1小时。洗涤后，细胞用次级抗体在4°C孵育30分钟，继续洗涤并孵育。 细胞和类器官培养：mES细胞、HGC27细胞系和K562细胞系在适当的培养基中培养，CRC类器官则根据相应的方法建立并培养。 单细胞EpiChem在不同细胞系中的具体应用结果（Credit: Nature Methods） 实验设计示意图（a）：展示了单细胞EpiChem设计的示意图，包括细胞裂解和文库制备、两轮裂池条形码杂交、配体PAT孵育和靶向标签。 轨迹视图（b）：显示了在代表性基因座上K562和HGC27细胞中的JQ1-btn信号。基因组轨迹显示了大规模水平（JQ1-btn）、单细胞聚合（JQ1-btn agg）和随机选择的100个单细胞的JQ1-btn结合信号，以及相关蛋白的轨迹。 物种混合测试散点图（c）：展示了人类和小鼠混合物种测试的JQ1-btn信号。根据细胞身份将点着色为人类（红色，>95%的读数映射到hg19）和小鼠（蓝色，）或混合（灰色）。 UMAP可视化（d）：展示了基于JQ1-btn信号的K562和HGC27细胞的UMAP投影，显示了细胞类型的分布。 THZ1-btn信号轨迹视图（e）：显示了在K562和HGC27细胞中代表性基因座上的THZ1-btn信号。轨迹显示了大规模水平（THZ1-btn）、单细胞聚合（THZ1-btn agg）和随机选择的100个单细胞的THZ1-btn结合信号，以及相关蛋白的轨迹。 小提琴图（f）：显示了K562（n = 2,000）、HGC27（n = 2,000）和mES细胞（n = 2,000）中每个细胞的非重复读数。小提琴图顶部的数字表示中位值。 岭线图（g）：展示了K562、HGC27和mES细胞中JQ1-btn和THZ1-btn的FRiP。 通过利用EpiChem方法，研究人员在CRC类器官中对多种小分子抑制剂（如JQ1、THZ1和多柔比星）进行了联合分析。结果表明，药物与其已知蛋白靶点之间存在共享和特有的结合位点。 单细胞EpiChem剖析：通过质量控制，保留了14,027个单细胞用于进一步分析。结果显示，Dox-btn和H3K27ac在代表性基因座上的特异和共享信号。Dox特异性特征参与了阳离子跨膜运输和细胞代谢过程的正调控。 多模态综合分析：研究揭示了异质性CRC类器官中药物相互作用的多样性。药物处理过程中，不同细胞类型的药物基因组结合动态和表观基因组特征的差异。在药物耐药细胞中，JQ1-btn结合位点主要集中在细胞周期相转换的调控区域，而在药物处理后的细胞中，THZ1-btn结合位点集中在多细胞有机体水平的稳态和酶联受体蛋白信号通路。 单细胞EpiChem实现小分子JQ1基因组结合与组蛋白修饰或染色质可及性的联合分析（Credit: Nature Methods） 实验设计示意图（a）：展示了单细胞EpiChem的设计示意图，包括小分子JQ1与组蛋白修饰或染色质可及性的联合分析流程。该流程涉及将生物素化的小分子JQ1与抗生物素抗体结合，利用带有条形码的蛋白A-Tn5（Protein A-Tn5）进行目标片段化，并通过多轮条形码杂交进行细胞识别和信号读取。 UMAP嵌入图（b）：展示了JQ1-btn和H3K27me3双模态scEpiChem数据的UMAP嵌入图。每个点代表一个细胞，连接线表示不同模态下的同一细胞（共3,619个细胞，来自两个生物重复实验）。该图显示了在双模态条件下细胞群体的分布和聚类情况。 小提琴图（c）：展示了K562和HGC27细胞中JQ1-btn和H3K27me3的非重复读数（non-duplicated reads）的中位值。小提琴图的中心标记中位数，方框边界定义第25和第75百分位数。结果表明，在两种细胞类型中，JQ1-btn和H3K27me3的读数均有良好的分布和检测效果。 轨迹视图（d）：展示了K562细胞中scEpiChem（双模态）数据的单细胞聚合视图和随机选择的100个单细胞的轨迹视图，参照bulk数据在DESI2基因座上的数据。轨迹视图显示了JQ1-btn和H3K27me3在特定基因区域的结合信号，验证了EpiChem方法在双模态分析中的有效性和准确性。 三模态数据可视化（e）：通过计算JQ1-btn、BRD4和ATAC在BRD4峰上的标准化信号，展示了K562细胞中scEpiChem三模态数据的兼容性。结果显示，JQ1-btn的基因组结合信号与BRD4高度相关，验证了三模态数据的一致性。 关联分析（f）：通过计算Cramér’s V值，量化了在相同单细胞中不同靶点（如JQ1-btn和BRD4、JQ1-btn和ATAC等）之间的共富集程度。结果显示，JQ1-btn和BRD4之间的共富集程度最高（71%），显著高于JQ1-btn与随机区域（2%）的共富集程度。 基因座轨迹视图（g）：展示了代表性基因座上JQ1-btn、BRD4和ATAC的聚合单细胞信号与bulk参考数据的轨迹视图。结果显示，这些信号在相应基因区域的一致性和特异性，进一步验证了EpiChem方法的有效性。 为了更深入地了解药物与基因组结合的动态变化，研究人员进行了以下具体分析： UMAP投影：通过UMAP投影展示了CRC类器官中VIM和CDH1的基因活性评分，以及JQ1-btn和H3K27ac在不同细胞类型中的动态变化。 热图分析：显示了在不同时间点JQ1-btn结合位点的动态变化，揭示了在治疗过程中不同细胞类型的基因组信号。 THZ1-btn和多柔比星分析：进一步分析了THZ1-btn和多柔比星（Dox-btn）在CRC类器官中的结合动态，展示了它们在不同细胞类型中的特异性结合位点。 EpiChem方法展示了其在多种小分子抑制剂与表观基因组特征联合分析中的有效性。该方法不仅揭示了药物与其已知蛋白靶点之间的共享和特有结合位点，还为药物基因组结合的深入研究提供了新的工具和方法。 未来，通过不断优化和改进，EpiChem将进一步推动我们对药物基因组结合的认识，并为更有针对性和个性化的治疗干预铺平道路。EpiChem不仅在药物开发中具有重要意义，还可以帮助我们理解细胞异质性及其在疾病中的作用，从而推动精准医疗的发展。 综上，EpiChem为在单细胞水平上解析小分子药物与基因组相互作用及其表观基因组状态提供了一种独特的方法。这一技术的潜在应用范围广泛，从药物开发到理解细胞异质性，都具有重要意义。通过不断优化和改进，EpiChem将进一步推动我们对药物基因组结合的认识，并为更有针对性和个性化的治疗干预铺平道路。 参考文献 Dong C, Meng X, Zhang T, Guo Z, Liu Y, Wu P, Chen S, Zhou F, Ma Y, Xiong H, Shu S, He A. Single-cell EpiChem jointly measures drug-chromatin binding and multimodal epigenome. Nat Methods. 2024 Jul 18. doi: 10.1038/s41592-024-02360-0. Epub ahead of print. PMID: 39025969. https://www.nature.com/articles/s41592-024-02360-0 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述