Caplacizumab-YHDP

摘要：双特异性抗体（bsAb）和多特异性抗体（msAb）包含多种格式，能够同时结合多个表位，解锁了治疗以前难以治疗或不治之症的机制。早期评估候选抗体的开发潜力可以降低潜力低的抗体的等级，并提升最有前途的候选抗体进行进一步开发。基于蛋白质的治疗需要一套严格的开发潜力要求才能具有竞争力（例如高浓度配方和长半衰期），而这些要求的评估需要一套强大的方法工具箱，其中很少有经过验证用于询问bsAbs/msAbs。在评估bsAbs/msAbs的开发潜力时，需要考虑的重要因素包括它们的分子格式、免疫原性的可能性、特异性、稳定性和高产量生产的潜力。在这里，我们总结了开发潜力评估的关键方面，并提供了如何为给定的bsAb/msAb制定全面计划的指导。 1.介绍 抗体工程的进步已经发展出了多样化的生产和纯化流程，以推进各种大小和复杂性不同的分子格式。双特异性抗体（bsAb；具有两种不同结合特异性的抗体）和多特异性抗体（msAb；具有三种或更多不同结合特异性的抗体）允许在多种疾病领域进行新颖的治疗应用。然而，与传统单克隆抗体（mAb）开发相比，实现双特异性或多特异性所需的典型抗体流程和格式的偏差带来了额外的挑战，并且与开发潜力评估的最佳实践相关的信息很少。本综述总结了bsAbs/msAbs开发潜力的关键考虑因素，这些因素在药物开发过程中集体评估时有助于最大化技术成功的可能性。 通过不变簇分化3（CD3）与靶向肿瘤相关抗原（TAA）的相互作用，招募T细胞来识别T细胞受体/主要组织相容性复合体（MHC），已有几种利用这种免疫细胞重定向策略的分子获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，包括blinatumomab（Blincyto®，抗CD19）、teclistamab（Tecvayli®，抗BCMA）、mosunetuzumab（Lunsumio®，抗CD20）、glofitamab（Columvi®，抗CD20）、talquetamab（Talvey®，抗GPRC5D）、elranatamab（Elrexfio®，抗BCMA）和epcoritamab（Epkinly®，抗CD20）。除了免疫细胞重定向，双特异性和多特异性还被用于增加对细胞亚型（例如，用于治疗转移性非小细胞肺癌的volrustomig）的特异性和克服常见的抗性途径（例如，用于治疗EGFR外显子20插入突变的非小细胞肺癌的amivantamab）。 单克隆抗体（mAbs）作为治疗多种疾病和条件的治疗选择的引入，为患者提供了许多以前未满足的医疗需求的解决方案，或者提供了比早期护理标准更有效和/或更安全的治疗。尽管mAbs的治疗成功是不可否认的，但仍有许多未满足的医疗需求。 bsAbs/msAbs是一类能够同时结合多个靶标的大分子，从而解锁了传统mAbs无法提供的新颖作用机制（MOA）和生理特性。bsAbs已被用于肿瘤学中，通过同时结合所需的免疫细胞和肿瘤细胞本身，有效地治疗多种癌症。bsAb T细胞接合器（TCEs）绕过了通过招募T细胞来识别肿瘤相关抗原的T细胞受体/主要组织相容性复合体（MHC）的需要。几种利用这种免疫细胞重定向策略的分子已经获得了FDA的批准，包括blinatumomab（Blincyto®，抗CD19）、teclistamab（Tecvayli®，抗BCMA）、mosunetuzumab（Lunsumio®，抗CD20）、glofitamab（Columvi®，抗CD20）、talquetamab（Talvey®，抗GPRC5D）、elranatamab（Elrexfio®，抗BCMA）和epcoritamab（Epkinly®，抗CD20）。除了在肿瘤学中的应用，bsAbs在2017年通过emicizumab（Hemlibra®）的批准中展示了成功，这是一种bsAb，能够识别酶因子IXa和底物因子X[凝血因子IXa（FIXa）×FX]，用于治疗血友病。 尽管FDA尚未批准任何msAbs，但在临床前和早期临床开发中已经披露了几个有前景的分子。随着我们对疾病病因学的理解的进步，bsAbs/msAbs有望通过多因素靶向潜在生物学或通过增强药代动力学（PK）和药效学（PD）属性来进一步改善结果。 虽然同时结合多个靶标的能力是bsAbs/msAbs的优势，但将多个异质结合基团整合到单个分子中也存在风险，需要在开发潜力计划中通过仔细的临床前评估、选择和修改来考虑和最小化。例如，虽然CD3 TCE bsAbs/msAbs可以有效地将T细胞与TAA结合起来，但微量杂质的存在或稳定性差可能导致异常的T细胞激活，这可能导致患者的不良反应。此外，开发潜力可能取决于上下文，如在静脉注射抗体不导致免疫原性的情况下，皮下注射相同疗法却导致免疫原性的情况，正如Janssen在voxalatamab（JNJ-63898081）中的经验，这是他们的前列腺特异性膜抗原（PSMA）×CD3 bsAb。 早期、有目的、主动的抗体开发潜力评估和修改对于最小化后期开发中昂贵且耗时的挫折以及高效地识别具有成为安全、有效和可制造治疗潜力最大的分子至关重要。 任何格式的基于抗体的治疗药物的开发路径都是漫长而复杂的，需要大量的财务和人力资源。因此，开发潜力应在药物开发过程的早期进行评估，并减轻风险，以最大化整体成功的可能性。可接受的开发潜力，此处定义为分子对药物开发和给药过程中的测试、制造、储存和给药要求的适应性，因此是任何药物开发计划成功的关键标准。与mAbs相比，bsAbs/msAbs的开发带来了额外的独特挑战，因为它们固有的结构复杂性。虽然每种bsAb/msAb格式都会呈现不同的挑战，但有广泛适用于它们开发的总体方法，可以作为起点，并在需要时在方法上进行偏差。 潜在抗体治疗的开发潜力评估是多因素的，有越来越多的工具和流程可用于协助预测低风险分子。需要考虑的重要开发潜力因素包括了解给定bsAb/msAb的分子格式，以及评估它们的免疫原性、特异性、稳定性和可制造性的策略和方法。 2.抗体格式 在人类中，天然抗体由四个多肽链组成，组织成两个相同的轻链和两个相同的重链。抗原识别是通过两个相同的可变抗原结合（Fab）区域进行的。蛋白质和抗体工程的进步带来了各种不同的bsAb/msAb格式，这些格式从免疫球蛋白（Ig）样格式变化到高度工程化的分子，这些分子与传统IgG的相似性最小，这些主题有无数的变化（图1）。这些不同的bsAb/msAb格式与传统mAbs相比具有独特的属性，并有可能实现精确的功能性属性以治疗一系列疾病。Wilkinson和Hale最近发表的一篇出版物中对抗体设计的多样性进行了深入调查。 图1. 常见的单克隆抗体（mAb）、双特异性抗体（bsAb）和多特异性抗体（msAb）配置。a. 标准免疫球蛋白G抗体；b. 对称IgG样双特异性抗体；c. 含有scFv和sdAb的双特异性抗体；d. 多价双特异性抗体；e. 多特异性抗体。 基于IgG的bsAb/msAb格式通常保留天然蛋白质的可结晶片段（Fc）区域，通常可以细分为对称或不对称格式。这些bsAbs/msAbs通常依赖于有目的的突变来增强链配对效率，以及修改Fc介导的功能或半衰期延长。 基于片段的分子，如单链可变片段（scFv）或驼类重链可变域（VHH），通常不包含Fc区域，保留抗原结合的最小要求，允许连接不同的结合片段。通常引入不同长度的连接子来连接具有独特功能属性的不同部分。虽然这些偏离传统IgG格式的变化是必要的，以便启用或改善功能性活动，但它们也影响了其开发潜力。 确保bsAbs/msAbs的适当开发潜力和可制造性需要特别考虑抗体格式。一般起点是确定正在评估的新型格式与“IgG样”的相似程度，与天然蛋白质的偏差越大，需要越来越严格的审查。例如，为了推动bsAb的轻链和重链的正确组装而应用的有目的的突变，可能会降低稳定性，增加免疫原性，和/或改变Fc功能。 同样，虽然缺乏Fc的格式，如scFvs，可能提供更好的生物分布和更高的效力，它们通常容易高度聚集，并可能导致分子没有所需的溶解度和稳定性水平的最终治疗。此外，通常需要双特异性格式或多特异性格式的连接子，这些格式附加了额外的scFv或Fab到IgG框架，这些连接子本身可能会引入免疫原性或显著改变药代动力学（PK）属性。 一旦传统的IgG骨架被修改以允许双特异性或多特异性，就需要定制的制造过程，以获得足够数量的高纯度bsAb/msAb。一个主要考虑因素是，每种独特的格式通常需要不同的纯化策略。例如，由于许多基于片段的抗体缺乏Fc，它们需要偏离用于典型IgG的基于蛋白A亲和色谱的纯化策略。由此产生的bsAbs/msAbs通常具有缩短的半衰期，需要在配方中进行额外考虑，如持续静脉内输注或修改，如与聚乙二醇或人血清白蛋白融合，以延长半衰期，实现更有利的PK特性。 此外，许多双特异性和多特异性格式可以引入多种格式特定的杂质，这些杂质对许多分析和纯化方法提出了独特的挑战。这些格式特定的杂质在生物物理属性（如分子量和等电点（pI））上可能与所需的双特异性产品几乎相同，需要开发定制的分析测定和/或纯化方法。 对双特异性和多特异性格式的修改也可能影响蛋白质表达水平，因此可能不适合高通量生产和开发潜力调查。因此，必须仔细考虑不同格式及其产生足够产量和产品质量以进行高通量开发潜力测定的能力。综合考虑，正在开发中的格式与所需的治疗候选属性应指导开发潜力评估策略。 2.1.格式考虑 虽然这里没有回顾bsAb/msAb工程策略的细节，但了解为什么做出某些工程选择以及分子格式的修改如何影响功能是重要的，这使得一个知情的过程能够从功能和开发潜力的角度权衡候选分子的相对风险。就与目标结合相关的功能而言，bsAb/msAb格式可以在两个一般类别中相互偏离：结合价（即，任何目标的结合基团数量）和结合几何学（即，组装分子中靶向基团的相对方向）。 这些两个维度的变化如何产生改善活性的例子包括zanidatamab，这是一种HER2靶向双特异性抗体，它采用了scFv和Fab，从而改善了受体聚集和补体依赖性细胞毒性，以及BiTE（双特异性T细胞接合器）格式，这是两个scFv分子的融合，是第一个商业批准的TCE。这种格式虽然容易聚集，但在目标肿瘤细胞和T细胞之间实现了短的细胞间距离，这可以导致与更IgG样的bsAbs相比显著增强的细胞毒性效力。 BiTE格式的演变是双亲和性重定向抗体格式，它包括一个经过工程改造的二硫键，连接了两个可变域（Fv）的重链可变域（VH）和轻链可变域（VL）的交叉融合。分子格式对活性和开发潜力的耦合影响是过去二十年的积极研究领域。 Loh等人比较了八种不同的HER2 × CD3“结-孔”Fc基础bsAb格式在稳定转染池中的表达、纯化容易性、热稳定性、抗原结合和功能表征。在这项研究中，几何学和价的变化没有影响表达水平或热稳定性，但增加scFv的数量导致了更高的异质性和聚集倾向。Madsen 等人进行的一项类似研究通过使用带有10个氨基酸连接子的单域抗体（sdAb）与IgG融合，生成了针对PD-L1 × HER2的不同几何结构的双特异性抗体（bsAbs），并评估了它们的生产、稳定性、抗原结合以及CD16a结合特性。将sdAbs融合到重链的N-或C-末端通常可以提高产量，但某些融合分子导致分子组装不良，高价分子显示出胶体稳定性低的迹象。 此外，与bsAbs/多特异性抗体（msAbs）格式相关，翻译后修饰、片段和格式相关杂质（如错配物种和半抗体）对功能性活动的影响应在定义关键质量属性（CQAs）时考虑。Lippold 等人报道了一种开发2 × 1TCE的优雅方法，该方法使用功能性CD3亲和色谱结合质谱（MS）来定义CQAs，这可能是一种广泛可定制的方法，用于分析化学稳定性风险及其对功能性活动的影响。总之，格式优化是调节bsAbs/msAbs活性的强大方式，但必须与适当选择的开发性检测一起进行。 2.2.生成bsAb/msAb分子的共同组成部分 尽管许多bsAb/msAb格式尝试主要使用来自典型人类IgG的分子组分，但这些分子的复杂性需要偏离。如下所述，多肽连接元件和VHH部分特别是非IgG元素，在bsAb/msAb分子的工程中常用。 多肽连接子可以分为刚性、柔性和体内可裂解连接子。它们不仅用于将不同的蛋白质结构域连接在一起，还可以有其他效果，例如增加活性、调节药代动力学(PK)特性、在体内释放蛋白质结构域，或将治疗剂定向到特定的组织或器官。多肽融合到Fc结构域、转铁蛋白或人血清白蛋白通常用于延长抗体的半衰期，通常需要使用连接子。此外，多肽连接子通常用于构建单链靶向结构域，如单链可变片段(scFvs)，以及将这些结构域与其他蛋白质组分融合，以修改结合价数，并实现不同的双特异性和多特异性几何结构，而不引入额外的链配对复杂性。通常，在这些应用中使用多甘氨酸-丝氨酸(G4S)n连接子的变体，其中整体长度被优化以最小化聚集倾向，同时保持位点可及性。连接子长度和组成的优化是格式设计的关键组成部分，正如在CD19 × CD3双特异性串联二价体的优化中所展示的，连接子的变化被证明影响折叠效率、稳定性和活性。已经展示了几种稳定多肽连接子的策略，例如通过点突变减少蛋白酶敏感性，从而改变裂解基序，应用稳定框架突变，修改融合几何结构和连接子锚点，引入二硫键，变化连接子长度，以及添加谷氨酸和赖氨酸残基以提高溶解性。VHHs，也称为Nanobodies®，是由骆驼科动物自然产生的只有重链的单变量域抗体。它们缺乏传统抗体中与VL结构域配对所需的疏水界面，因此具有高溶解性和小尺寸(15 kDa)等特征。它们的热稳定性可能有所不同，但许多VHHs具有独特的能力，在热暴露后重新折叠并恢复抗原结合， 因此，与传统的靶向单元如Fab或scFv相比，它们表现出额外的稳定性特征，后者在热暴露后通常显示出不可逆的聚集。VHHs通常具有更长的、高度可变的互补决定区(CDR)3环，这些环补偿了缺失的VL结构域。这些扩展的CDR3环实现了高亲和力和特异性结合，并有助于通过形成折叠覆盖结构来屏蔽否则暴露的疏水残基。与传统的scFv相比，scFv由最小的IgG结合域VH和VL通过多肽连接子连接而成，并且由于它们的“呼吸”界面容易聚集，VHHs是有趣的替代品，作为靶向单元，以实现额外的抗原结合能力和价数在双特异性抗体/多特异性抗体上，具有优越的开发性属性，并避免许多IgG样双特异性格式中常见的链配对复杂性。首个VHH衍生抗体caplacizumab(Cablivi®)在2019年的批准为VHH在双特异性抗体/多特异性抗体中的增加使用奠定了基础。在双特异性抗体/多特异性抗体中使用VHHs已被证明用于靶向FcγRIII，在TNF × F4/80双特异性抗体中，Vδ2-TCE，在双特异性和三特异性VH在CD1d × Vγ9H SEED结构体中，等等。以及在一种增强对HIV株特异性中和能力的双特异性抗体中。 3.免疫原性 生物治疗剂可能具有免疫原性，即在患者体内引起对治疗剂本身的不需要的免疫反应，通常通过产生结合治疗剂的抗体，可能影响安全性和/或有效性。免疫原性可能导致治疗抗体在临床开发过程中的药物失败，导致资本、时间和资源的大量损失。抗药物抗体(ADA)是免疫原反应的标志。ADAs可以降低治疗效果，引起不良反应，甚至导致严重的副作用。T细胞通过反应治疗抗体中的特定序列在决定免疫反应中发挥关键作用，这些序列由抗原呈递细胞(APCs)在人类白细胞抗原(HLAs)中呈递。由于缺乏完整的临床研究来审查双特异性抗体/多特异性抗体，这些替代格式的免疫原性风险的数据很少。最近批准的双特异性抗体/多特异性抗体的报告，或目前在临床开发中的那些，表明不同抗体模式的ADA发病率和这些ADAs的临床结果各不相同，包括TCEs、双免疫检查点抑制剂和各种肿瘤相关抗原(TAAs)的双结合物。这些不同的结果突出了需要从早期临床前阶段到临床阶段开发全面的免疫原性风险评估策略，以促进选择、设计和开发具有降低患者免疫原潜力的最优双特异性抗体/多特异性抗体。下面提供了一个概述，说明可以有助于塑造对双特异性抗体/多特异性抗体治疗剂的免疫反应的多种因素，包括与产品相关的因素、与患者相关的因素和与疾病相关的因素。此外，我们简要讨论了目前可用于预测、监测和减轻双特异性抗体/多特异性抗体在临床前开发阶段的免疫原性的工具和进展。 3.1.基于序列的风险 与所有蛋白质治疗剂一样，对双特异性抗体/多特异性抗体产生免疫反应的主要风险决定因素之一是原始氨基酸序列。双特异性抗体/多特异性抗体通常包含大量工程化序列元素，这些元素使得不同的功能域能够非自然地连接到一个分子中。此外，这种双特异性抗体/多特异性抗体特有的工程通常与额外的抗体工程方法结合，如人源化突变(将小鼠CDRs移植到人抗体框架中)和Fc效应子修饰(要么调节Fc受体介导的效应子功能，要么通过修改与新生儿Fc受体(FcRn)的结合来延长半衰期)。这些新颖的工程序列可能通过引入新抗原或暴露可以被APCs处理和呈递的隐蔽表位来增加免疫原性，从而激活T细胞反应。因此，免疫原性风险评估和减轻策略最好从双特异性抗体/多特异性抗体的工程阶段开始，并在整个表征和筛选过程中使用越来越彻底的方法。通过设计低风险抗体结构使用脱免疫和耐受化(introduction of T regulatory cell epitopes)方法，由计算预测工具和可用的体外/离体确认试验的组合指导，可以实现降低免疫原性。 3.2.计算机模拟免疫原性风险评估 在抗体发现阶段早期，通常会首先应用计算机模拟(in silico)的T细胞表位筛选和预测工具。有多种商业、公共和学术平台可用于筛选抗体序列中的T细胞表位（通常是9到15个氨基酸的序列），以预测可能与HLA分子结合的序列。这些预测工具仅基于抗体的主要序列来识别潜在的T细胞表位。更复杂的计算方法能够使用同源建模和分子动力学模拟等技术生成抗体结构的三维模型。这些方法允许评估可能影响免疫原性的结构特征，如溶剂暴露的环、翻译后修饰和构象灵活性。 计算机模拟预测工具有助于在bsAb/msAb的早期开发过程中识别潜在的免疫原性区域，并允许选择潜在的免疫原性较低的分子或应用进一步的蛋白质工程技术来降低候选分子的风险。这些计算机模拟方法具有高通量和相对较低成本的优势。然而，这些计算工具通常存在一些局限性，例如倾向于过度预测，同时未能充分反映人类群体中发现的重要HLA II类多态性。 因此，建议使用各种体外和离体方法，包括免疫测定和基于细胞的测定，对这些假定的T细胞表位进行进一步的检测。 3.3.体外HLA I类和II类结合测定 HLA结合测定评估肽段在体外与不同HLA等位基因结合的能力，并补充计算机模拟预测工具。纯化的HLA-II肽段（通常是重叠的15个氨基酸的肽段）在一系列浓度下与单体HLA-II分子共同孵化。使用多种方法，包括荧光光谱、生化测定（例如，酶联免疫吸附测定）或表面等离子共振（SPR）来量化结合亲和力和动力学。通常，这些测定以高通量规模进行，能够快速筛选大量的肽库。这些结合测定的一个固有困难是全球人群中各种HLA-II等位基因的正常分布的代表性有限。为了克服这一局限性，HLA-II结合测定通常使用共享表位结合基序的HLA-DR等位基因组，也称为超类型等位基因，能够代表全球超过95%的人类HLA分布。 由于HLA-I分子的高度多态性和结构/构象对结合亲和力的影响，HLA-I结合测定的使用较少，尽管已经描述了几种测定和方法，包括基于荧光激活细胞排序（FACS）的MHC稳定化测定、竞争测定、分型B细胞系或使用HLA的基于细胞的测定。 虽然HLA结合测定可以提供有关特定HLA等位基因结合的有意义的信息，但由于它们依赖于感兴趣的肽段的最佳设计和纯度，因此存在一些局限性。这种依赖性可以直接影响肽-HLA相互作用的结合和稳定，并导致假阴性结果。此外，虽然从HLA结合测定获得的数据可能表明特定肽基序可能与HLA等位基因结合，但这些数据并没有考虑到这种肽基序是否能够在APC表面的HLA分子上被处理和呈递。 3.4.MHC相关肽蛋白质组学 MHC相关肽蛋白质组学（MAPPs）方法在识别存在于APC表面相关HLA分子上的已处理肽段方面被证明是有价值的，特别是鉴于液相色谱/质谱（LC/MS）灵敏度和蛋白质组分析工具的最新进展。在这种方法中，完整的bsAb/msAb分子被装载到体外生成和成熟的单核细胞衍生的树突状细胞（DCs）上，以使DCs摄取和处理抗体，然后细胞裂解和分离肽-MHC复合物，这些复合物稍后被解离并通过MS测序进行测序。 MAPP测定的通量相对较低，主要是由于DC生成的限制。因此，MAPPs通常在临床前开发过程的后期阶段使用，并用于有限数量的开发候选物。从MAPPs获得的数据可以帮助识别可能被工程化以降低免疫原性的主导抗原肽序列。当这些个体的DCs被包括在分析中时，这种方法还可以揭示健康和疾病个体之间在抗原处理和呈递方面的差异。 尽管从MAPP测定中收集到的有价值的信息，但仔细解释至关重要。当评估bsAbs/msAbs与APCs（如DCs）的潜在直接或间接相互作用时，bsAbs/msAbs增加了一层复杂性。在使用MAPPs测定针对DCs表达的靶标或对DC功能重要的途径（如CD40×CD11c或LAG-3×PD-L1 bsAbs）的bsAbs/msAbs时，应考虑这种相互作用。 这些靶标的结合可能会干扰这些细胞中的抗原呈递机制，这反过来可能会影响该测定识别真实主导抗原序列的能力。在使用MAPPs测定之前，可以使用DC结合测定和评估DC成熟、激活和细胞因子测量的测定来了解bsAb/msAb对DCs的影响。 此外，评估bsAbs/msAbs对内源性蛋白的已知表位呈递的影响也可以提供对抗体与MAPP测定潜在干扰的洞察。 通过MAPPs识别的主导抗原序列表明这些序列可能通过抗原呈递机制被处理和呈递；但这并不一定意味着这些序列会转化为T细胞反应。因此，建议进行进一步的确证性体外T细胞激活和增殖实验，特别是当对感兴趣的序列进行进一步重设计可能会对抗体的效力或特异性产生重大影响时。 3.5.T细胞激活和增殖实验 各种体外T细胞激活和增殖实验已经开发出来，并越来越多地被用来评估治疗性抗体候选物的免疫原性。这些实验大多数使用新鲜分离或冷冻保存的健康或疾病个体的外周血单个核细胞（PBMCs）、去除CD8 T细胞的PBMCs，或与单核细胞衍生的树突状细胞（DCs）共培养的分离CD4 T细胞。PBMCs可以被整个抗体刺激，允许抗原呈递细胞（APCs）摄取、处理和呈递肽序列给原始T细胞，导致T细胞激活、增殖和细胞因子分泌。流式细胞术通常用于评估通过标记PBMCs与细胞示踪染料来评估抗原特异性T细胞增殖。此外，使用特定的T细胞激活标志物如CD25、CD69、HLA-DR、CD134和/或CD137通常与增殖评估结合使用，以了解T细胞的激活状态和对刺激的反应程度。 激活的T细胞产生的细胞因子也可以通过流式细胞术进行细胞内细胞因子染色或通过酶联免疫吸附点（ELISpot）或多重荧光斑点（FluoroSpot）实验进行评估。 尽管基于PBMC的实验被认为是最简单且接近体外模拟复杂抗原呈递和T细胞激活过程的设置，但它们受到能够响应特定抗原刺激的前体原始T细胞数量相对较低的限制，导致实验灵敏度降低。DC-T细胞实验提供了一个替代方案，克服了这一限制，作为一个较不复杂的体外系统，允许免疫反应的基本组成部分之间的抗原特异性相互作用，即DCs和T辅助细胞。 虽然这些实验越来越被接受，但它们与bsAbs/msAbs的兼容性需要确认。bsAbs/msAbs通常针对T细胞或其他免疫细胞表达的受体或配体。在这些例子中，使用完整的抗体进行刺激可能不合适，因为免疫反应可能主要由抗体的MOA和与免疫细胞的直接结合驱动，而不是由抗原刺激驱动。这可以通过使用来自抗体序列的重叠肽段库而不是完整的抗体来克服。然而，使用肽段库有自己的局限性，包括更高的成本和可能识别出不一定在体内由APCs处理或呈递的肽段的风险。因此，使用MAPPs实验数据来指导设计和生产感兴趣的序列以在这些体外实验中进行测试可能是有益的。此外，bsAbs/msAbs由于抗体在所需格式中的错配组装，携带更高的杂质风险，导致产生其他不想要的错配格式，这可能会影响体外实验的性能，并导致对免疫原性风险的潜在误解。 因此，使用高纯度的测试文章准备这些实验至关重要。 3.6.B细胞表位和体外B细胞实验 虽然CD4 T细胞在导致ADA产生的免疫反应中起着关键作用，但B细胞也直接识别、结合、内化、处理和呈递治疗性抗体的表位给T辅助细胞，导致原始B细胞分化为记忆和产生高亲和力（IgG）ADAs的浆细胞。然而，体外B细胞实验受到在体外诱导B细胞反应的生物学复杂性的限制。已经描述并商业化了几种评估B细胞在体外刺激后分泌IgG/IgM的比色和荧光B细胞ELISpot实验，这些ELISpot实验主要关注评估记忆B细胞反应。目前尚无强大的实验可用于测量原始B细胞对体外刺激的IgG产生，主要是由于从IgM到IgG产生过程中涉及的免疫过程的复杂性。 在缺乏强大的体外B细胞实验的情况下，已经开发了几种用于预测B细胞表位的计算工具，如免疫表位数据库和分析资源SEPIA。 许多这些预测方法使用序列衍生特征，包括氨基酸组成、亲水性、表面可及性、β-转角和主链柔韧性来提高B细胞表位预测性能，这通常相对于现有的T细胞表位预测工具是有限的。 3.7.与产品关键质量属性相关的风险因素 CQAs是在适当的限制、范围或分布内存在的物理、化学、生物学或微生物学属性或特征，以确保所需的产品质量。 CQA相关的免疫原性风险因素是在治疗性抗体开发过程中的重要考虑因素。 由于分子设计的相对复杂性，bsAbs/msAbs通常与许多制造挑战相关，如增加的聚集、降低的稳定性和由于存在不想要的错配抗体格式而导致的产品相关杂质，这些都影响bsAb/msAb的免疫风险、与先天免疫细胞上的模式识别受体的相互作用以及意外佐剂效应导致打破耐受。 PBMC和全血实验是经常用来评估CQA相关免疫原性风险的工具。 这些实验能够广泛代表特定人群，通常被认为比其他基于细胞系的实验格式更具临床相关性。这些实验中通过与抗体孵化后分泌的细胞因子和趋化因子水平的量化来测量免疫原性反应。这些类型的实验面临的挑战包括从大量供体（通常>25）中获取足够数量的PBMC和新鲜全血样本，以及高供体间变异性。 重要的是，必须考虑特定bsAb/msAb的作用机制（MOA）来解释这些实验获得的数据。通常首先进行全血或PBMC实验以获得更广泛的风险评估，然后进行其他体外实验以进一步进行机制性特征描述。 3.8.与患者相关的风险因素 预先存在的反应性是随着基于抗体治疗领域，特别是bsAbs/msAbs的快速增长而日益受到关注的问题，尽管其对药物安全性和有效性的影响尚不清楚。最近有关bsAb/msAb免疫原性的报告表明，在临床药物开发阶段考虑实施对药物未接触受试者预先存在反应性的筛选和特征化策略是必要的。 许多正在开发的bsAb/msAb模式针对的目标已经使用其他生物治疗药物进行了探索，包括mAbs和抗体药物偶联物。在某些情况下，bsAbs/msAbs可能使用以前开发或批准的抗体的抗体臂，如上文提到的JNJ-61178104（以前称为COVA322）bsAb，它建立在阿达木单抗的骨架上。 在这些情况下，针对先前生物治疗的ADA反应可能导致由于快速记忆回忆反应而对bsAb/msAb的免疫原性反应增强。因此，应考虑对患者进行预先存在的反应性筛选，特别是在有生物治疗药物治疗史的患者中。此外，这种预先筛选可能有助于在预期出现显著免疫原性反应和相关不良事件时定义潜在的患者排除标准。 虽然目前主要在临床环境中使用筛查或治疗前时间点的患者样本来评估预先存在的ADA，但预先存在的ADA的高流行率表明，在临床前开发阶段早期使用健康或药物未接触的捐赠者的人类血清进行更严格的评估是有必要的。用bsAb给药的受试者中出现的治疗性ADA与在健康捐赠者中检测到的预先存在的ADA相关，并且预先存在的ADA的表位特异性能够预测临床ADA的表位偏好。 在评估LY3415244的安全性和免疫原性的1期试验中也有类似的观察结果，其中所有12名入组的患者都对至少一个bsAb臂产生了治疗性ADA。针对anti-TIM-3臂的ADA被发现更早出现，并对大多数患者的可溶性TIM-3目标参与产生负面影响。在最近的一项调查中，评估了60个正常人类血清样本中针对LY3415244的预先存在的ADA反应性，分析同样发现，正常人类血清样本中针对LY3415244的预先存在的ADA免疫原性主要针对TIM-3 CDRs。 3.9.治疗相关风险因素 包括给药途径、药物剂量和给药方案以及使用免疫调节共治疗药物，都是影响生物制剂免疫原性风险的因素，包括bsAbs/msAbs。大多数治疗性抗体通过静脉注射或皮下注射给药。尽管普遍接受的观点是皮下注射治疗性抗体与更高的免疫原性风险相关，但目前临床批准的抗体的数据并不支持这一假设。然而，与皮下注射相关的独特的免疫原性挑战可能对bsAbs/msAbs特别重要。皮下注射通常需要相对于静脉注射的高浓度给药。因此，与增加的bsAb/msAb聚集体以及其他产品属性相关的挑战可能在通过皮下途径产生更高的免疫反应中发挥重要作用。这一假设得到了pasotuxizumab这一例子的支持，这是一种PSMA × CD3 bsAb TCE，在1期研究中评估了静脉和皮下给药。 虽然静脉组的患者中没有检测到任何ADA，但所有接受皮下治疗的患者都发展出非短暂的ADA。此外，在这些患者中超过93%的人发现中和性ADA，并且没有人对局部糖皮质激素治疗有反应。当JNJ-63898081，另一种PSMA × CD3 bsAb TCE，通过静脉和皮下给药给试验参与者时，也报告了类似的结果。 药物剂量和给药方案也可能强调bsAbs/msAbs的免疫反应风险，因为由于细胞因子释放综合征等毒性，给药通常限于相对于mAbs的较低剂量。与msAb/msAb的较低剂量可能潜在地导致ADA介导的药物清除增加和次优的PK和PD性能。此外，治疗持续时间也是一个需要考虑的重要因素，尽管其与免疫刺激性bsAbs/msAbs在肿瘤学中的相关性可能不清楚，因为这些方案不需要长期治疗。此外，可能需要长期治疗的bsAbs/msAbs，如那些用于自身免疫性疾病的，可能从其自身的免疫抑制MOA中受益，导致免疫原性降低。最后，与抗炎药物或化疗的联合治疗也可能影响bsAbs/msAbs的免疫潜力。 3.10.作用机制风险因素 最近批准的bsAbs/msAbs的数据，以及其他在临床开发中的bsAbs/msAbs，表明这些bsAbs/msAbs的作用机制在它们在患者中的免疫潜力中起着关键作用。根据分子的不同，可以增加或减少免疫原性。例如，批准用于B细胞恶性肿瘤的bsAb TCEs，如CD19 × CD3 blinatumomab和BCMA × CD3 teclistamab，显示出最小的ADA发病率（<2%），可能由于它们的B细胞耗竭MOA。另一方面，针对B细胞上共刺激分子的bsAbs/msAbs，ABBV-428，一种间皮素-CD40 bsAb，在1期临床试验中显示出高ADA发病率（63%），可能由于其对B细胞的CD40激动效应和对药物PK的影响。非B细胞耗竭TCEs也可能由于其MOA涉及广泛的T细胞激活而带来更高的免疫原性风险，如AMG 211，一种CEA × CD3双特异性T细胞-引导剂，它在所有接受>3.2 mg高剂量治疗的患者中诱导了ADA，并在高滴度下暴露量下降，导致停药。 免疫调节性bsAbs/msAbs通过激活共刺激通路或拮抗抑制通路（如CTLA-4 × PD-1和CTLA-4 × OX-40双特异性抗体）可能会对患者造成更高的免疫原性风险，导致ADA发生率增加，因为它们相对于针对相同靶点的单抗单药治疗能够释放更强的免疫细胞激活。这一概念得到了抗PD-1和抗CTLA-4单抗的单药治疗和联合治疗报告的支持。当nivolumab与ipilimumab联合使用时，ADA发生率较单药治疗（11%）显著提高，报告为26-38%。 类似地，当抗PD-L1抗体durvalumab与化疗联合使用时，ADA发生率极低（<1%），而与抗CTLA-4抗体tremelimumab和化疗联合使用时，ADA发生率则较高。 与这些观察结果一致，LY3415244，一种针对TIM-3和PD-L1的bsAb，也被报告在所有给药的患者中诱导ADA。最近，在针对HER2和4-1BB的bsAb PRS-343的1期研究中也报告了类似的观察，PRS-343的给药导致ADA发生率为28%。 尽管存在这些趋势，免疫原性仍然难以预测，因为并非所有这些机制总是导致免疫原性增加。 另一个与作用机制相关的风险因素是抗体与其可溶性或膜寡聚靶标形成免疫复合物的能力。由于bsAbs/msAbs能够结合多个靶点，免疫复合物形成的风险可能更高。大型免疫复合物被广泛认为通过增加APCs的摄取以及通过交联和激活B细胞受体的T细胞非依赖性激活B细胞来增强免疫反应。针对炎症细胞因子TNF和IL-17A的bsAb JNJ-61178104支持这一概念，因为其给药已被证明在所有患者中诱导ADA。 尽管目前对免疫调节性bsAbs/msAbs的临床免疫原性数据有限，但现有证据表明它们与增加的免疫原性风险和更高的ADA发生率相关。因此，作用机制的考虑应成为bsAb/msAb开发过程中全面免疫原性风险评估策略的重要组成部分。重要的是，这些考虑也应适用于上述讨论的各种体外和体外工具的兼容性，考虑到正在开发的抗体的作用机制，以及这对这些实验数据解释的影响。 总之，随着bsAbs/msAbs领域的快速发展，以及关于与这一类抗体相关的免疫原性和安全风险的知识逐渐可用，开发全面的免疫原性风险评估策略对于实现最佳抗体开发至关重要。这些免疫原性风险评估策略可以在临床前阶段涉及各种计算工具以及体外和体外实验，同时关注与bsAb/msAb开发相关的重要药物、患者和治疗相关风险考虑。 4.特异性 在双特异性抗体（bsAbs）和多特异性抗体（msAbs）的开发中，多特异性（在蛋白质组中对靶点外的结合）和多反应性（对带电或疏水蛋白、膜或其他生理表面的非特异性结合）都是不希望出现的属性，它们可以改变疗效、清除率和组织分布。这些不需要的效果可能导致靶点外毒性、免疫原性和生产上的挑战。 多特异性可以由几种机制引起，例如与不相关靶标的分子模拟或CDRs中的可塑性，这些特征可能因在同一抗体上具有多个互补决定区而加剧。多反应性归因于不希望的抗体表面属性，例如电正性、电负性和疏水性表面斑块或Fv和Fc的电荷不平衡。在bsAbs/msAbs中，与从亲本分子行为预期的相比，多特异性和多反应性都可以被调节。这些差异可以归因于结合价的改变和/或复杂的互补决定区间相互作用。然而，尽早识别可能产生靶点外效应的抗体至关重要，建议在将亲本分子重新格式化为bsAbs/msAbs之前对其进行评估。 4.1.计算机预测 众多的计算机模拟工具已被开发出来，用于评估抗体特征以预测多反应性。抗体的特性，如序列组成、互补决定区（CDR）的长度和表面特性（即电荷和疏水性），通常从同源模型中得出，已被用来创建多反应性的预测模型。 具有大量电荷在其CDR上的抗体或高疏水性可能具有加速的清除率，对他们的治疗有效性产生负面影响。这种加速清除被认为是由于抗体表面的正电荷可能与负电荷的细胞膜或细胞外基质相互作用，导致 增加的组织吸收和血液清除。几个小组已经评估了使用许多可用的在硅片上的工具来探索抗体开发能力，但这些工具的广泛适用性对bsAbs/msAbs的探索较少。Jain等人。系统地评估了在硅片上派生的特征和体外指标之间的关系， 评估了许多开发能力方面。 虽然预测体外测定结果的能力大于那些仅从计算派生指标派生出来的，总体正电荷被发现对多特异性有害，更大的负电荷区域似乎有益，其他基于序列的趋势对氨基酸组成和位置在CDRs中证实了其他研究，这些研究正在调查多反应性。此外，许多在硅片上的指标的数量下降超出了确定的可接受分布（通常称为标志或违规行为）随着临床路径的进展（即，批准的抗体具有最少的在硅片上的标志）。同样，Zhang等人。生成了用于识别潜在多特异性的物理化学 规则，通过评估序列和结构特征与测定之间的相关性来探测自关联和结合到各种多特异性试剂在137个临床阶段抗体上。最近对1000个mAbs的生物信息学分析系统地 确定了多反应性和非多反应性抗体之间的关键差异，目标是扩展对属性的理解推动多反应性超出疏水性，电荷和CDR环灵活性。多反应性抗体往往有CDRs，平均产生轻微的亲水性，中性电荷的结合表面，可能潜在地允许与广泛的配体进行弱相互作用。这些数据被用来构建一个计算框架，可以识别多反应性抗体，准确率为75%。最近开发的机器学习方法已被用来预测纳米抗体和scFv中的多反应性。这些可变域格式是bsAbs/msAbs中越来越常见的组成部分，因为它们不需要非轻链的共价配对，因此产生较少的格式特异性错配物种。哈维等人。使用一个合成库，旨在模仿一个天真的骆驼库并将其排序到结合池到多特异性试剂（PSR）使用FACS。结果被用来训练逻辑回归和神经网络模型来分类纳米体多反应性。有几个预测特征为多反应性例如，存在精氨酸和色氨酸；然而，它们被位置强烈混淆。值得注意的是，他们的模型能够建议突变以减少估计的多反应性。Lim等人，通过训练四种监督式机器学习方法，利用这些数据计算了19,426个已知多反应性档案的scFv的基于序列和基于结构模型的特征，并得出结论，表现最好的模型具有与多个不同的CDR和全局抗体特征相关的特征，包括CDRH3中的色氨酸数量、等电点（pI）和径向旋转半径。然后，这些模型与基于自然语言的模型描述符相结合，以从scFv特征中提取额外的信息。表现最佳的集成模型在识别多反应性scFv方面的精确度和准确率超过75%。可用于特异性预测的在硅片上工具的数量和可变性可能会令人生畏，而且很少有模型专门针对bsAbs/msAbs的独特属性进行了设计。因此，建议主要使用这些方法作为在开发过程的早期对几个候选分子进行初步评估，以识别抗体和相关的在硅片上指标，这些指标落在任何一个预测的极端。这些数据可以作为进一步实验探究策略的有用指南。 4.2.体外特异性测定 评估PK属性是与特异性相关的主要开发能力属性。事实上，mAbs的长消除半衰期是这类治疗药物的主要优势。调节清除率的最重要元素是Fc中含有的分子在内质网隔室中依赖pH的特定FcRn结合。BsAbs/msAbs通常通过扰动或移除Fc-常驻FcRn相互作用来大幅度改变这一档案。分析FcRn亲和液相色谱使用从pH 5.5到8.8的线性pH梯度来分离IgG异构体、降解产物和工程抗体，如bsAbs/msAbs，基于它们在不同pH下对FcRn的亲和力。与野生型IgG相比，突变体的洗脱峰档案和保留时间的变化与FcRn转基因小鼠中的PK档案相关。尽管普遍认为Fc在FcRn介导的循环中起主导作用，但还表明，可变域的净电荷也影响与FcRn的结合，正如brakinumab所示，其Fv净电荷较高，但与ustekinumab相比具有类似的pI。FcRn有一个扩展的负电荷表面补丁和增加的brakinumab结合，阻止了在生理pH下与FcRn的有效解离，并减少了其终端半衰期。在中性pH下从FcRn的缓慢释放已被证明对两个具有类似pI和生物物理属性的bsAbs的PK产生不同的影响。 除了FcRn独立特性如单克隆抗体（mAbs）的Fv电荷、目标结合和定位、多特异性和多反应性或糖基化变化可能导致不期望的增加清除率，影响mAbs的药代动力学（PK），这些特性对于双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）的开发同样重要。特别值得注意的是，针对CD3的bsAb TCEs通常具有与不良PK相关的多反应性标志，部分原因是许多针对CD3的抗体结合到CD3 epsilon极端N-末端的电负性线性表位，并且具有较高的等电点（pI）值。基于结构的方法和使用基于酵母的检测平台的抗体工程已被证明可以纠正这种多反应性行为，同时增加对CD3的亲和力。 测试更广泛的多反应性和多特异性，这与药代动力学不佳、制造困难和耐受性问题有关，由于人类蛋白质组和其他生理表面呈现的巨大潜在非目标空间，这是一项挑战。人类细胞微阵列技术可以在体外分析人类蛋白质组，以减少体内非目标毒性和加速清除的风险。 筛选多特异性性还可以包括结合由CHO、HEK或Sf9细胞提取物制成的PSRs，其中包含溶解的膜蛋白。这种方法可以作为基于展示的方法的反筛选，如针对SARS-CoV-2的基于纳米抗体的四价bsAb所示。 如上所述，局部正电荷可以导致通过增强FcRn结合、防止FcRn-抗体解离和有效回收来加速清除率。虽然可以从序列或通过毛细管等电聚焦等直接方法估算抗体的pI，但它是多反应性的一个差指标，因为它不显示电荷斑块或局部不平衡，通常更倾向于使用结构衍生方法，如Fv电荷对称性和空间电荷图（SCM）。 除了静电相互作用外，抗体的疏水性是多特异性以及潜在胶体稳定性问题的可靠指标。可以通过分析疏水相互作用色谱上的保留时间和洗脱曲线来评估抗体的疏水性。某些抗体germlines，如VH1–69，由于它们的重链CDR2更疏水，更可能产生疏水性较高的抗体，但这种倾向可以通过工程方法和生物物理评估来最小化。 在bsAbs/msAbs的临床前阶段进行特异性测试，应考虑作为降低开发和制造风险的两阶段方法。应评估每个亲本抗体，并仅选择低风险的亲本抗体或结合域进行重组成bsAbs/msAbs。重组成后，应在衍生的bsAb/msAb上重复相应的特异性测定，以确认所应用的设计和格式没有显著改变每个亲本抗体或结合域的特性。选择具有良好特异性特性的低风险亲本序列是有效生成可开发bsAbs/msAbs的先决条件。 5.稳定性 抗体的稳定性包括许多分子内在和药物相关的外在组成部分，包括热稳定性、胶体稳定性、耐蛋白水解性和血液中的化学稳定性。这些领域的缺陷可能导致制造过程中的困难、影响货架期以及改变抗体的免疫原性和活性。 5.1.热稳定性 热稳定性是承受热应用时蛋白质展开和降解的能力。成功开发的抗体的一个关键特性是它们良好的热稳定性，这主要由mAbs中的Fab区域决定，但对于bsAbs/msAbs可能不那么明显。就稳定性而言，Fv区域具有最高程度的变异性，因为其主要序列因每种抗体而异。 低热稳定性可能使抗体更容易聚集，限制了它们作为治疗性抗体的潜力。抗体热稳定性的一个有用估计值是其熔化温度（Tm），定义为抗体在其展开状态的浓度等于其在折叠状态的浓度的温度。抗体包含几个区域，包括可变Fv区域和恒定CL、CH1、CH2和CH3区域。这些区域中的每一个都是伪独立的，因此在不同区域之间通常观察到不协同的展开。众所周知，IgG1 CH2区域的Tm约为70°C，CH3区域的Tm约为82°C。 一项研究发现，当通过异二聚体CH3界面构建bsAbs时，所得抗体的CH3热稳定性显著降低，与K409突变相关的Tm降低约为12°C。 Fv、CH1和CL区域倾向于协同展开，其Tm可以根据可变区域序列跨越大范围。差示扫描量热法（DSC）用于建立不同区域的热稳定性和热力学特性。 差示扫描量热法（DSC）特别适合于双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs），因为它可以通过额外的信息，如展开焓变，来识别不同区域的展开事件，但由于仪器限制和样品需求，通常相对低通量。相比之下，差示扫描荧光法（DSF），也称为热移测定，基于色氨酸和酪氨酸在展开时的内在荧光或添加荧光染料，通常高通量。这种技术在高通量环境中的一个典型用例是识别低稳定性抗体进行优先级降低，这些抗体的Tm接近或低于CH2热展开温度。 除了热展开外，许多DSF仪器还能够检测由热展开引起的聚集体形成，这导致光散射增加。这种聚集的起始温度通常用于筛选各种配方对聚集倾向的影响。 bsAbs/msAbs的形式对热稳定性有若干重要影响。一般来说，bsAb/mAb设计策略很少相对于亲本mAbs增加热稳定性。因此，建议在开发过程早期评估亲本抗体的热稳定性，并且理想情况下应降低热稳定性低的mAbs的优先级。在bsAb/msAb工程之后，通常一个或多个重组成的可变区域会失去热稳定性。设计可能如何影响亲本抗体不同区域的热稳定性，理想情况下应通过DSC进行评估，DSC非常适合解耦大多数mAb和bsAb格式中存在的众多展开事件。使用不需要突变Fv区域的bsAb/msAb格式，如VHH域，可能完全避免基于重组成的热稳定性下降的不可预测性。 已经开发和优化了几个bsAb平台和结合域的工程解决方案，以避免热稳定性的损失。对于目标域，包括在Fabs的VH-VL和CH1-CL界面、scFvs的可变域之间、scFvs的连接和可变域之间引入二硫键，或在scFvs的连接和可变域之间引入二硫键。后一种方法被证明可以将二硫键固定的scFvs的热稳定性提高约10°C。用于保持热稳定性的其他方法包括合理工程或随机突变方法的组合、人源化到更稳定的框架、或将稳定框架残基转移到不太稳定的框架上。 5.2.化学稳定性 化学稳定性指的是抗体一级序列中共价键的完整性以及重链-重链或重链-轻链之间。基于抗体的治疗药物的化学稳定性可能受到多种不同的降解途径的影响，包括脱酰胺作用、异构化、氧化、二硫键交换、N-末端焦谷氨酸形成、C-末端赖氨酸剪切、片段化和糖基化。 根据这些降解事件的位置与亲和位点和恒定域的关系，抗体的活性或半衰期可能会受到影响。一个众所周知的例子是曲妥珠单抗，其中LC-Asn30的脱酰胺对效力有轻微影响，而HC-Asp102的异构化显著降低了其效力。由于氧化应激，蛋氨酸氧化为蛋氨酸亚砜可能会对抗体产生几种影响，如报告的单克隆小鼠抗体OKT3。在Fc区域的M428/M252处蛋氨酸氧化可能会影响与FcRn的结合，从而影响抗体的回收，这会减少抗体的半衰期。任何影响亲和位点活性或Fc效应功能的化学降解都是有害的。因此，选择化学稳定的靶向单元以限制项目失败的风险非常重要。bsAb/msAb格式及相关的连接子或突变应用于生成bsAbs/msAbs也可能影响化学稳定性。化学稳定的靶向单元在重组成bsAbs/msAbs时可能会遇到不可预见的化学稳定性问题；因此，仔细评估亲本和衍生的bsAbs/msAbs都很重要。如果检测到降解事件，它们有时可以通过适当的配方条件来减轻。但重要的是要注意，强大的化学稳定性对于体内给药后的稳定性很重要，因此工程方法通常比配方筛选更可取。导致抗体降解的常见事件包括脱酰胺作用、异构化和片段化。脱酰胺作用是抗体中普遍存在的修饰，它发生在生产、储存或体内，并且更容易影响天冬酰胺残基，以及在较小程度上影响谷氨酰胺残基。脱酰胺作用是通过主链酰胺氮对侧链酰胺的羰基碳的亲核攻击和随后氨的丢失，导致通过天冬酰-琥珀酰亚胺（Asu）中间体形成天冬氨酸，通常在中性或碱性pH下加速。 相反，天冬氨酸通过Asu中间体的水解异构化通常在酸性pH下加速，并导致异天冬氨酸或天冬氨酸的形成（在中性条件下的比例为3:1）。异构化不依赖于水的存在，因此也可能发生在冻干的抗体配方中。 识别化学降解风险最直接的方法是通过对一级氨基酸的简单基序分析。然而，任何给定基序的降解倾向高度可变，并且取决于额外的结构因素，如溶剂可及性和二级结构构象，以及诸如pH、温度、辅料等外在因素。因此，基序方法仅作为化学责任风险的初步评估，任何情况都应通过额外的分析来确认。最近，基于结构和同源模型的方法已被开发出来，以更好地评估这些降解事件的可能性，某些位置和溶剂暴露的CDR环中的序列基序被识别为脱酰胺、异构化和氧化的热点。 虽然从开发的角度来看，Fv区域的降解通常是最具问题的，但这些修饰也常位于IgG的恒定区域。 化学稳定性问题可以通过强制降解研究来识别，这些研究通过故意将治疗性抗体暴露于应力条件下，在其整个生命周期中进行调查。这些研究可以包括长时间暴露于高温、低/高pH值、冻融循环、搅拌、糖基化、光照和生理或氧化应激。这些研究通常结合实验方法来检测和定量任何化学修饰，如离子交换和疏水相互作用色谱、标记和HPLC-UV-Vis、通过质谱的肽图、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或毛细管电泳和等电聚焦。 这些研究劳动密集、耗时且耗费材料，通常在发现过程的后期阶段对较少数量的抗体进行，通常在细胞系开发前。根据检测到的任何化学责任的位置，这些研究的样本通常也通过结合和活性测定来表征，以评估任何化学降解事件是否影响对目标的结合亲和力或抗体的活性和回收。抗体治疗中化学稳定性受损的另一种表现是片段化，可以分为非酶促和酶促片段化。非酶促片段化在抗体中经常观察到，主要在恒定区域，最有可能在上铰链区域，由于其动态环结构，可能性最高。 在上铰链区域的非酶促片段化发生在蛋白质主链中，通过诸如β-消除、直接水解、介导的裂解或自由基催化等化学反应，这取决于溶剂条件，如碱性或酸性pH值、温度以及自由基或金属的存在。非酶促片段化也可能伴随着二级、三级和四级结构以及构象灵活性发生，将序列空间中相距甚远的侧链带到局部环境中。非酶促片段化事件经常发生在天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺残基上，其中除了甘氨酸外，其他残基都可以通过它们的侧链介导片段化事件。CH1恒定区域的K(133)STSGGT环可能是一个常见的裂解位点，产生两个约35和15千道尔顿的片段，CH2区域（G236-G237，D270-P271）的其他位点也被发现可以迅速裂解。酶促片段化通常由蛋白酶裂解介导，这发生在mAbs和bsAbs/msAbs的生产和纯化过程中，铰链区域是酶促裂解最常见的位点。在所有情况下，片段化主要通过如天然尺寸排除色谱或SDS-PAGE等分离方法检测。与任何已识别的化学稳定性问题一样，需要根据裂解位点在Fv或恒定区域的位置评估其对抗体活性的影响。检测bsAbs/msAbs中片段化的工作与mAbs相同，但由于存在两个或更多的靶向区域，事件的复杂性和分配裂解基序的难度可能会增加。 此外，双特异性/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）可能会经历一个更为严格的纯化过程，包括额外的色谱步骤来去除与格式相关的杂质，因此任何化学稳定性的缺陷在制造过程中可能变得更加明显或累积。 焦谷氨酸的形成通常出现在抗体重链和轻链的N-末端，特别是当N-末端残基是谷氨酰胺时，对于谷氨酸来说则较少见。焦谷氨酸的形成可以通过非酶促的自发环化在体外通过亲核攻击N-末端主链酰胺氮对侧链酰胺形成稳定的五元环与H2O离去基团，或在体内由谷氨酰胺环化酶催化，这是一种在人类、动物和植物中发现的酶。如果控制不当，焦谷氨酸的形成可能导致抗体异质性，并可能影响制造过程中关键质量属性（CQAs）的维持。对于bsAbs来说也是如此，由于所有链的N-末端在某些双特异性格式中可能不同，检测和控制焦谷氨酸形成的复杂性增加了。 主要发生在赖氨酸侧链胺基和较小程度上的N-末端胺基和精氨酸的糖基化是一种非酶促的糖基化修饰，可以改变对抗原的亲和力，影响抗体的效力，并增加聚集。这种现象在治疗性抗体中很常见，并已在bsAbs中得到证实。这种糖基化事件通常由细胞培养中的发酵过程或储存期间引起，当含有蔗糖的配方水解导致非还原糖时，这会通过低pH和高温度加速。因此，制造过程需要严格控制，以通过适当的生产和配方条件满足CQAs。糖基化可以通过硼酸盐或离子交换色谱、毛细管等电聚焦、LC/MS方法和比色法检测。 5.3.胶体稳定性和粘度 胶体稳定性指的是折叠蛋白通过自相关沉淀在溶液中的倾向，由电荷不平衡、疏水斑块、融合蛋白界面解离和结合以及与离子的相互作用介导。 粘度是描述给定抗体配方流动阻力的相关属性，由不希望的分子间蛋白-蛋白相互作用引起，这些相互作用由胶体和构象浓度依赖行为介导。这些相互作用可能源于与部分原子电荷分布、等电点和偶极矩相关的变量域的静电属性，或导致自相关的疏水属性和形状互补性。对于高浓度的治疗性bsAbs/msAbs配方，胶体稳定性和粘度是重要的属性。通常通过盐或PEG诱导沉淀、静态光散射、多角度光散射和动态光散射（DLS）来评估蛋白质治疗剂的胶体稳定性。DLS可以在高通量设置中确定扩散相互作用参数（kD），特别适合评估配方条件及其在搅拌等应激条件下对胶体稳定性的影响。胶体稳定性通常在含有scFv域的bsAbs/msAbs中受损，由于VH-VL界面的柔韧性增加，这种柔韧性通过可逆解离和结合形成寡聚体，这一过程取决于蛋白质浓度，并可能受到pH值、离子强度和其他辅料的影响。Majumder等人证明，一个易于聚集的scFv-bsAb在组氨酸和谷氨酸的等摩尔缓冲液组合中具有改善的胶体稳定性，展示了配方对改善胶体稳定性的潜力。 自相互作用测定评估抗体在高浓度（>100 mg/mL）下配制用于治疗管理时的胶体稳定性风险。由于bsAbs中靶向臂的价数通常减少，mAbs中自相互作用测定观察到的趋势在bsAbs/msAbs中可能减弱，但不太可能完全消失。此外，任何bsAbs/msAbs平台的设计突变以强制正确的重-重和重-轻界面组装，如引入电荷对和疏水界面工程，如果突变部分或完全暴露或引起构象变化影响抗体表面属性，可能带来自相关风险。因此，重要的是只考虑低风险的靶向单元进行重组成bsAbs/msAbs，并通过自相互作用测定再次评估重组成分子对不希望的自相互作用的倾向。评估自相互作用的方法包括动态光散射（DLS）、亲和捕获自相互作用光谱（AC-SINS）、电荷稳定自相互作用光谱（CS-SINS）和生物层干涉测量（CSI-BLI）。DLS是一种广泛使用的评估抗体自相关性的技术，可以在微孔板格式中进行，使用少量抗体评估数百个样本。DLS测量增加的水动力半径作为蛋白质浓度的函数。从在相对较低的抗体浓度（1-20 mg/mL）下进行此分析得出的kD与高达175 mg/mL浓度的29种不同mAbs的粘度测量结果相关性良好。在AC-SINS中，抗体被吸附到金纳米颗粒上，产生高局部蛋白质浓度，模拟浓缩的抗体溶液。吸引的自相互作用减少固定抗体之间的粒子间距离，导致最大吸收波长（等离子体波长，λp）的红移。AC-SINS在高通量板格式中识别具有高自相关风险的抗体，同时在稀薄浓度（<50 μg/mL）下使用极少量的样本。这种方法通常用于筛选临床前阶段的抗体胶体稳定性风险。这种方法进一步发展为通过聚赖氨酸涂层通过电荷稳定（CS-SINS）筛选某些配方条件和弱酸性缓冲条件。虽然bsAb重组成可能导致衍生的bsAb与亲本mAb相比AC-SINS得分降低，但由于bsAbs AC-SINS得分与粘度风险之间关系不太明确，因此必须选择低风险的mAb进行重组成。 在生物层干涉测量（CSI-BLI）中，抗体通过其Fc区域装载到生物层干涉测量生物传感器上，以测量自结合反应。Fab可用于通过氢键配对、离子相互作用或疏水相互作用进行结合，该测定可以在低样品量（15μg）的高通量格式下进行。 抗体候选物和配方的粘度风险通常通过使用粘度计直接测量。由于高浓度配方需要大量样品，通常在开发过程的相对后期进行此实验。将单克隆抗体重组成bsAbs/msAbs可能会导致粘度增加，因为在存在两个靶向单元时会出现新的相互作用，特别是如果这些单元具有相反的静电属性。混合两种低粘度mAbs（pI分别为6.3和9.3）的粘度数据与相关bsAb的高粘度相关。新型几何结构导致的更大的bsAbs/msAbs也可能导致粘度问题，如一项研究中所示，一种双变量域免疫球蛋白bsAb比亲本mAb更粘稠，粘度的增加归因于bsAb的整体大小。有几种策略可以预防适用于mAbs和bsAbs/msAbs的粘度问题。首先选择对其预期给药途径具有有利的低粘度行为的bsAbs/msAbs非常重要。选择低粘度亲本抗体进行双特异性IgG重组可能无法预测具有有利粘度的bsAb/msAb，正如Tilegenova等人所证明的，用一个抗IL-13/IL-17双特异性IgG4抗体进行的研究发现，怀疑引起阳离子-π和/或π-π相互作用的芳香族点突变降低了双特异性的粘度，并且对一个在150 mg/mL时粘度高的单特异性抗GCGR IgG1抗体也成功。从蛋白质序列或结构计算的Fv净电荷可以表明潜在的粘度风险。Fv电荷<2的抗体被认为是高风险，因为它们可能有负电荷斑块，可能驱动与恒定域中的正电荷斑块自相关。此外，Fv电荷对称参数，即VH和VL的净电荷乘积，也可以表明由于自相关引起的粘度风险。 总之，稳定性评估是非常多维的，并且是全面开发性评估的关键要素。在目标给药途径和粗略配方的背景下最好评估稳定性。有大量的测定可用于这些测量，这些测定在实施的难易程度、通量和预测能力上有所不同，一个结构良好的评估策略应该在开发过程中利用多种测定。5.4.体内稳定性 治疗性抗体在给药后数天和数周内的体内物理化学稳定性可能对药物效力、清除和免疫原性有影响。与mAbs一样，IgG样的bsAbs/msAbs最好具有提供长半衰期的药代动力学（PK）特性。由于它们的半衰期较长，因此可以减少给药频率并改善患者依从性。与mAbs一样，bsAbs/msAbs的体内稳定性可以通过检测其在体内的浓度随时间的变化来评估，这通常通过ELISA或基于质谱的检测来完成。体内稳定性的测定对于预测药物效力和评估长期给药方案的可行性至关重要。 由于它们在循环中的半衰期大约为3周，内源性和重组抗体可以经历与治疗性抗体在制造和储存过程中类似的体内生物转化事件，包括异构化、氧化、糖基化、二硫键修饰、N-末端焦谷氨酸形成、C-末端赖氨酸剪切和蛋白水解裂解。在体内对抗体药物的生物转化事件的检测和定量是治疗性抗体开发中一个相对较新且日益增长的领域，这一领域面临着一些技术挑战。 血清是血液的一个亚室，含有富含白蛋白、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、同型半胱氨酸和其他小硫醇的异质环境，这可能导致抗体二硫键的重新排列，特别是对于IgG和IgG4。根据局部环境和溶剂暴露，这种混乱可能与使用工程二硫键以增强热和胶体稳定性的bsAb/msAb格式相关。 在啮齿动物和非人灵长类动物中进行的血清稳定性研究和药代动力学（PK）评估有助于评估bsAbs/msAbs的稳定性，并在开发性评估的早期识别潜在的责任。PK与抗原结合能力之间的关系可以用来识别体内不稳定的开发候选物。例如，体内脱酰胺作用可能导致抗原结合的丧失，影响效力，并可能引起潜在的关注。 IgG1、IgG2和IgG4亚类的的治疗性抗体可能容易受到木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和链球菌免疫球蛋白降解酶的重组蛋白酶裂解，不同的酶特异性和裂解效率主要基于它们各自的铰链序列。此外，IgG1可以被肿瘤微环境中的蛋白酶如基质金属蛋白酶裂解，或者在循环中，而IgG2则较不易受到裂解。IgG1两个重链的下铰链的裂解可能对Fc效应功能产生负面影响，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性，因为裂解位点靠近Fcy受体和C1q的结合位点，可能与自身炎症性疾病中mAbs的治疗抵抗性有关。蛋白酶裂解事件可能以类似的方式影响IgG型bsAbs/msAbs格式的铰链区域，具有潜在的意想不到的裂解敏感性、特异性和效率。因此，应在临床前开发阶段监测这些裂解事件。许多bsAb格式使用甘氨酸-丝氨酸的扩展连接序列来系上额外的模态并增加价数，这些可能容易受到体内蛋白水解裂解的影响。 相反，最近已经利用在实体瘤的肿瘤微环境中优先表达的某些蛋白酶的存在来激活被蛋白酶可裂解的域或肽段掩盖的bsAb TCEs，以限制它们在循环中的靶向毒性。在另一个例子中，蛋白酶敏感的连接子被用来将两个域抗体系成一个bsAb分子，用于治疗性口服治疗炎症性肠病。 6.可制造性 可制造性是分子开发性评估的一个组成部分。通过可制造性评估，可以更深入地了解分子行为，从而设计出既注重质量又注重数量的制造过程和控制策略。这种评估最好在代表性材料上进行，评估与产品质量、可扩展性和工艺产量相关的大规模生产过程的技术可行性。通常，可制造性评估分子适应平台流程和方法，以支持简化的开发工作。及早识别CQAs（关键质量属性）和工艺及分析开发的风险，可以减轻开发挑战，并允许优先分配工艺开发资源。开发候选物的可制造性是实现供应高质量、纯化和配方化的抗体以推进毒理学研究、临床研究和商业化的关键考虑因素。执行严格和全面的临床计划以及满足商业化视角下的供应链目标所需的抗体数量，突出了建立强大和可扩展制造工艺的基本需求。 6.1.双特异性抗体/多特异性抗体的制造考虑 从可制造性的角度来看，单克隆抗体（mAbs）已经通过发表的报告和行业指导文件得到了很好的表征。自1986年首个单克隆抗体商业化以来，已经开发了许多可制造性工具，并对潜在的责任进行了表征，降低了将单克隆抗体治疗推进到制造过程中的相关风险和挑战。 尽管双特异性抗体/多特异性抗体（bsAbs/msAbs）作为一类治疗药物取得了进展和势头，但与单克隆抗体相比，支持其开发到制造的资源相对较少，这主要是因为它们在临床和商业制造方面的历史相对有限。此外，bsAbs/msAbs的结构异质性除了必须克服的单克隆抗体工艺障碍外，还提出了几个可制造性挑战。 6.2.工艺考虑 上游工艺考虑 在开发稳定表达bsAb/msAb的细胞系时，上游处理考虑不仅必须评估典型的开发标准，如蛋白质滴度、细胞系稳定性、群体倍增时间、翻译后修饰以及在预测设备、材料、培养基和饲料背景下的可制造性，而且还必须额外评估完整bsAb/msAb分子正确组装的可能性。 开发bsAb/msAb上游工艺可能非常具有挑战性，因为几个变量可能影响正确与错误组装分子的比例，以及错误组装物种的身份和相对丰度。载体和序列设计、选择克隆性和正确组装分子产量的过程，以及细胞培养和蛋白质表达的多因素性质（如上所述），都是需要考虑的关键因素。使用导向突变，如knob-into-hole突变，结合细胞系开发选择和上游工艺开发考虑，通常用于努力优化粗提物中正确配对目标分子的浓度。 尽管在细胞系开发和上游处理方面取得了进展，但在细胞培养上清液中存在错配的bsAb/msAb并不罕见，制造过程中还需要在下游成功纯化此类产品相关杂质的方法。 下游工艺考虑 在下游处理中，上游bsAb/msAb制造过程中产生的错配变体是不受欢迎的，它们作为工艺杂质，给纯化过程带来额外负担。在典型的单克隆抗体制造过程中，半抗体和抗体片段是常见的杂质，但具有显著结构和生化特性差异的变体更容易使用依赖分子电荷差异的色谱方法分离。这对bsAbs/msAbs的可制造性提出了特别的挑战，因为潜在的错误组装分子，如几个四链bsAb分子中的那些，可能表现出难以用制造中常用的分离方法区分的生物物理特性。不同质量的产品相关杂质也可能影响纯化和表征方法，包括由于bsAb/msAb变体的聚集倾向增加而产生的重大制造挑战。因此，在开发bsAb/msAb候选物时及早评估可制造性是非常有利的，以确定由于链错配而产生的结构变体之间的分子属性差异是否提供了足够的分辨率，以实现大规模成功纯化。变体之间的pI差异是主要关注点，因为在大规模制造中广泛使用了pH和/或电导依赖的色谱过程。 也可以利用其他纯化方法从其他属性中分离产品相关变体，包括利用疏水相互作用色谱针对变体之间的疏水性差异，或依靠独特的属性组合通过多模式色谱方法实现分离。虽然结合多种纯化方法可以增加成功分离配对的bsAbs/msAbs与错配变体的可能性，但涉及的额外时间和成本通常是不受欢迎的。在制造过程中，定制与建立可靠的平台流程相反，突出了开发需要有限工艺定制的bsAbs/msAbs的价值。 使用适当的分析方法对于生产中双特异性抗体/多特异性抗体（bsAb/msAb）的特性描述至关重要。除了典型的与产品相关的、宿主细胞相关的以及其他与工艺相关的杂质外，建立一个足够灵敏的分析方法以区分正确和错误组装的抗体产品非常重要。在开发过程中，区分这些变体的可制造性和工艺开发至关重要。此外，这种材料可能用于临床前研究，强调了其质量的重要性。当考虑制造规范时，批量放行标准推动目标分子的最终浓度以及任何指定杂质在可接受的范围内。液相色谱/质谱（LC/MS）方法，包括去糖基化完整质谱，通常能够区分错配变体，识别包含错配的重链（HC）和/或轻链（LC）组合的分子，以及正确配对的bsAbs/msAbs。随着bsAb/msAb药物开发向商业化发展，另一个关键的分析挑战是生物测定法的开发。bsAb/msAb的生物测定法必须准确且可重复地反映分子的双重作用机制和潜在的机制协同作用。将这些组合到单一测定中可能证明是一个重大挑战，评估是否需要开发两个单独的生物测定法是建立适当分析策略时的一个重要因素。7.结论 首个基于bsAb和msAb的药物开发涉及大量投资，用于制造和评估这些新兴分子，以满足现代治疗药物所期望的严格的安全性和有效性标准。治疗性双特异性抗体的开发有着悠久且研究深入的历史，始于20世纪60年代双特异性F(ab)2分子的形成，并于2018年首个双特异性药物blindumomab获得FDA批准。随后，用于生成这些复杂分子的蛋白工程方法以及高效评估其功能和开发性属性所需的技术和知识都有了显著改进。这些努力的结果是，过去几年有数百个bsAb/msAb分子进入临床研究，为临床上评估这些令人兴奋的分子提供了独特的治疗潜力。同时在体内对多个靶标采取行动的能力为药物开发提供了组合机会，并有望改变许多疾病的治疗格局。因此，用于工程化和评估这些独特分子的方法必须继续发展，以满足这一机会并为患者提供价值。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：本章介绍了历史上和当代双特异性抗体的发展历程，以及当前蛋白工程界和制药行业推动此类分子应用于医学治疗的巨大热情。你将详细了解它们独特作用方式及其背后的原理。对各种双特异性抗体构型的详细介绍将帮助你判断它们在特定生物学场景下的适用性。双特异性抗体在生产和质控方面的挑战将激发你的兴趣，以运用所学知识设计新的解决方案，让这一前景广阔的疗法在生产和质控技术上得到改良。 1.前言 本质上来说，双特异性抗体（bsAbs）是一类具有针对两个不同表位或抗原的特异性的分子。即使仅从这个角度来看，在应用上，它也比必须生产和鉴定两个单特异性分子更有优势。在临床上有时面对配体冗余所驱动的疾病时，能够同时靶向两个不同表位或抗原的bsAbs就能体现其不可估量的价值。而且，在过去的三十年中，我们积累了丰富而扎实的知识贮备，意识到某些生物学效应只能通过具有双特异性的单个分子的物理连接来实现，而不是单特异性的双分子混合物。这使得这样的专性bsAbs非常受到重视，以致于在2019年有87个bsAbs正在进行临床研究，其中包括2个已经获批上市的bsAbs。这些独特的生物学作用可以是空间性的，bsAb的双臂分别结合在哪对于抗体的功能至关重要：典型的例子包括连接两种不同细胞类型或将酶与其底物连接的bsAbs。另外一类专性bsAbs是时间性的，双臂的结合依次进行，并且由于动力学或空间原因，一只臂与抗原的结合依赖于另一只臂与其抗原的结合。 如本章所述，bsAb通常是在一个分子中整合了完整的天然样IgG和/或其中的片段，以及通过linker连接排列，保留了抗原结合能力的抗体片段。尽管bsAb使用了与被整合抗体片段相同的氨基酸序列，理论上这些氨基酸链能够构建出与被整合片段相同的结构域，但是所有氨基酸被重新整合成一个全长IgG抗体时，它们的抗原结合和功能特性可能就会发生改变。不过，通过从抗体文库中筛选的方法，可以定向筛选出特性符合要求的抗体，例如高抗原亲和力, 高产量，以及良好的生理性质和特定的结合方式。正是由于这些优势，研究人员正在积极开发在抗体早期发现阶段对全长抗体进行筛选的策略。 2.双特异性抗体的历史 大约50年前，Linus Pauling领导的小组中的科学家Alfred Nisonoff得出了一个关于抗体分子结构的重要结论：每个抗体分子都由两个对靶抗原具有相同特异性的结合位点组成。诺贝尔奖获得者Rodney Porter使用木瓜蛋白酶将抗体切割成了两个Fab片段和一个Fc片段,Nisonoff继续了这项工作并使用了另一种蛋白酶，胃蛋白酶来进行抗体的蛋白水解切割，结果得到了一个二价F(ab)2片段和许多来源于Fc片段的多肽。他认为产生这种现象的原因是木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的切割位点分别位于重链二硫桥的两侧。之前人们认为两个Fab分别位于Fc片段的一端，而Nisonoff的发现改变了这个观点，他认为两个Fab片段都处于Fc片段的同一侧。随着对抗体结构认识的改变，很快便有人提出了人造bsAbs的想法：使用胃蛋白酶裂解，温和的还原和氧化两个具有不同特异性的F(ab)片段，于是Nisonoff和Rivers合成了一种双特异性的二价F(ab)2。他们运用同样的方法制备了针对小鼠免疫球蛋白（Ig）和铁蛋白的双特异性试剂，该试剂被用于通过电子显微镜观察小鼠淋巴细胞表面的Ig。 在接下来的20年中，Köhler和Milstein发明的杂交瘤技术被广泛使用并能高效的生产单克隆抗体。双特异性F(ab)2的产率也可以通过使用化学偶联剂（二巯基化物和硫醇激活剂）或硫醚键连接来提升。实际上，Milstein本人已经从杂交瘤的概念衍生出了“杂交-杂交瘤（hybrid hybridoma）”，设想了一种“四源杂交瘤（quadroma）”细胞，其中包含两种不同抗体的重链和轻链的编码基因能够组装并分泌一种bsAb（尽管它只是由两种重链和轻链混杂配对形成的产物之一）（图1）。 图1. 链错配问题  在一个细胞中表达4条不同的抗体链（图中分别用蓝色和绿色表示了分别对应不同抗体的链）时，通过排列组合可以预计产物是一种混有10种不同的潜在产物的混合物。多种抗体工程技术旨在让抗体链配对时倾向于形成所需的双特异性产物（图中心） 大约也是在那个时候，首次报道了bsAb可以通过重定向T细胞攻击肿瘤细胞来诱导有效的细胞毒性：一方面结合T细胞受体（TCR）以激活T细胞，另一方面结合淋巴瘤细胞系中表达的肿瘤相关抗原（TAA）Thy-1。在随后的几年中，有证据表明仅由化学偶联的F(ab)2片段组成的bsAb也能够介导T细胞活性重定向至肿瘤细胞。一方面，其功能不依赖于MHC；另一方面，诱导细胞裂解的极强效力这两个优势使得这种作用方式的bsAb至今都是临床发展的重点。 重组DNA技术的发展极大地影响了下一个十年bsAb的开发。1988年，单链可变片段（scFv）首次出现。它由抗体重链和轻链的可变区被一个柔性接头连接而成, 由此为多特异性抗体的设计开创了一个新时代。为了解决抗体各链随机结合的问题，现在可以将组成多个抗原结合位点/分子的序列放入一条多肽链中在大肠杆菌中表达，而且由于不存在糖基化的Fc片段，产率大幅提升。此外，有了重组DNA技术，我们还可以根据需求随意设计这些多特异性制品的效价，从而让它们能够满足更多的应用场景。但是，缺少Fc片段会导致抗体在体内半衰期短得多，必须通过在抗体上引入人血清白蛋白（HSA）或Fc融合的其它生物制品来弥补，来更好的发挥其生物学活性。因此，第一个公开发表的对称形式具有四价的双特异性分子，是一种将scFv与每个重链的C末端融合的单克隆抗体。此外值得注意的是，基于scFv的抗体容易聚集和稳定性较低的问题通常需要对最终产品进行重新优化。 1996年，Carter和同事们开创了另一种方法用于解决链错配问题（同时表达的重链和轻链随机配对，从而产生十种不同分子种类的混合物，图1)。Carter和同事们在观察到抗体重链二聚化是通过CH3结构域的二聚化（亲和力大约为10-15 nM）导致的之后，提出了“Knobs-into-Holes”工程设计的策略。该策略通过将抗体一条重链上一个侧链较小的氨基酸替换为一个侧链较大的氨基酸（“knob”），将另一条重链上一个侧链较大的氨基酸替换为一个侧链较小的氨基酸（“hole”），来诱导抗体的异二聚化，结果产生了超过95％的异二聚抗体产物(Fig. 7.2a)。之后，这种通过位阻效应制备不对称抗体的方法被不断优化，以进一步增加异二聚抗体的产率。此外，后续通过其他工程改造步骤，例如引入链间二硫键以及点突变，成功地改善了所得分子的热稳定性(Fig2b)。除了通过空间位阻的方法，抗体异二聚化还可以通过在异源重链的CH3结构域上引入带相反电荷的氨基酸(Fig2c)，或者同时运用空间位阻和静电排斥来实现(Fig2d)。为了实现更高的异二聚化效率，最近的方法引入了更广泛的突变，甚至通过使用天然存在于异二聚体分子中的异二聚化基序（motif），如BEAT body平台中使用的(Fig2e)。在21世纪的第一个十年中，科学家们提出了许多解决轻链错配的方法，例如使用共用轻链（common light chain）或具有物种特异性匹配性质的轻链；然而，直到2014年才出现了第一个可以促进同源的重-轻链选择性配对的正交互补平台。另一个有效的解决方案是使用CrossMab，这种异二聚体的每个臂上CH1和CL结构域的位置进行了互换。还有一种解决方案是用一对CH3结构域与两个Fab之一的CH1/CL的恒定区互换位置。 图2 使两个异源重链优先配对的工程方法  图中以卡通的形式显示了异源CH3结构域骨架，并在CH3结构域之间绘出了突变的氨基酸残基。(a),“Knobs-into-Holes”异二聚体 T366W + T366S/L368A/Y407V (PDB: 5DI8);(b),二硫键连接的“Knobs-into-Holes”异二聚体(PDB:5HY9);(c),通过引入带相反电荷的氨基酸形成的异二聚体 E356K/D399K + K392D/K409D(PDB: 5DK2);(d),位阻效应和电荷效应相结合的方法“EW-RVT,”包括 K360E/K409W + Q347R/D399V/F405T(PDB: 4X98);(e),基于BEAT body 异二聚体，基于TCR基序进行异二聚化(PDB: 6G1E)  在努力开发人工bsAbs的同时，还有一种古老得多的天然形成的一类双特异性抗体，具有开发成为治疗双特异性试剂的巨大潜力，其特殊的生物学性质引起了人们的关注。然而，在很长一段时间当中，人们并不清楚是什么样的结构生物学机制促使了它的产生。人们发现血清来源的IgG4抗体无法交联抗原并产生大型免疫复合物，而重组IgG4抗体能够很好地交联相同的抗原。此外，长期接触蜂毒素磷脂酶-A2（PLA2）的养蜂人血清中发现IgG4抗体水平升高，引起了人们对这些全长“单价”抗体的研究的兴趣。这些抗体可以阻断其他PLA2特异性抗体与PLA2结合：它们由两对重链-轻链组成，而其Fab臂发生了交换，导致每对重-轻链来自不同的抗体。在后来的研究中发现，Fab臂的交换是偶然地在翻译后发生的：首先大量互不相干的IgG4抗体阻碍了体内杂合抗体的形成。之后通过使用灵敏的实时FRET技术，科学家们发现Fab臂的交换可以在特定的氧化还原条件下在体内发生。通过总结这些现象，科学家们发明了当今构建bsAb最成功的技术之一，即“ DuoBody”技术平台。该技术平台在不同来源的IgG1半抗体的CH3结构域中引入突变，通过温和的还原和氧化反应进行受控的Fab臂交换（controlled Fab-arms exchange）。不同于在一个细胞中表达不同抗体链，利用duobody技术，我们甚至可以在细菌中共培养表达两种截然不同的半抗体并得到IgG4型的bsAbs。 综上所述，双特异性抗体的工程化，生产以及下游加工和质量控制方面的技术创新不仅导致如今出现了超过100种bsAb构型，而且还成功地将bsAb推动为当下基于抗体的疗法中，研究最火热、最具前景的化合物。在本章后面的小节中，我们将进一步介绍bsAb不同的生物学作用方式，不同的构型，并探讨其应用前景和局限性。 3.当今双特异性抗体的作用方式（mode of action，MOA） 从历史上看，某些只能通过用一个分子特异性结合两个靶点的抗体才能实现的生物学功能引起了科学界的广泛关注(图3)。表1列出了已经获批用于临床的治疗性抗体。除了3.1小节中图3a这种桥接不同细胞类型（例如T细胞重定向策略）的“反式”相互作用之外，bsAbs还能够桥接同一细胞上的两个受体（“顺式”相互作用）（3.2小节中图3b），以及靶向同一信号通路中的多个配体以克服它们在体内的冗余（3.3小节），或同时结合同一抗原的两个不同表位（3.4小节）。 图3.专性双特异性抗体的作用机制(a), bsAb 通过桥接效应细胞和靶细胞诱导细胞杀伤; (b) bsAb 结合同一细胞上的两个不同抗原诱导增殖、代谢激活或者凋亡; (c) bsAb 充当酶级联反应中的链接，使酶活化; (d) bsAb 作为载体介导载荷的运输 表1 获批用于临床的双特异性抗体 在某些情况下，激动性bsAbs可以增强细胞代谢和再生过程（图3b），或者可以串联某些酶级联反应（图3c和第3.5小节）。在某些特定的生物学场景中，我们还可以利用bsAb作为分子运输的载体。以此将载荷或者bsAb中的功能臂富集或逃离特定器官、组织或细胞区室，从而使载荷或者功能臂在这些区域发挥作用（图3d和3.6小节）。 3.1.桥接不同类型细胞的BsAb 这种方法主要是通过运用bsAb重定向T细胞，利用T细胞的细胞毒性以消除肿瘤细胞。bsAb充当T细胞与肿瘤细胞之间的物理连接，一条臂与T细胞结合，另一臂与肿瘤细胞结合。绝大多数以这种方式起作用的bsAb都选择与TCR复合物中的CD3ε结合，同时可以诱导T细胞活化而不依赖于TCR的抗原特异性以及MHC的限制，而且不需要辅助因子参与（例如CD4或CD8）。尽管此类药物在体外试验中展现出了令人鼓舞的疗效，但由于这些分子在体内诱导不受控制的细胞因子释放，以及难以生产等问题，限制了其在临床上的应用。直到blinatumomab（Blincyto®）惊人的临床效果披露后，人们才对T细胞重定向bsAb产生了浓厚兴趣，而因此，目前进行临床研究超过50％的bsAb都以T细胞重定向作为主要的作用方式。 Blinatumomab是一种由两个scFv组成，靶向CD19和CD3ε的bsAb。由于不包含Fc片段，因此它的分子量大小仅为55 kDa。其在体内的血清半衰期约为1小时，因此它的给药方式通常是使用便携式泵进行连续静脉输注。该药在非霍奇金淋巴瘤患者的治疗中已经展现出了疗效：它在复发/难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中的完全缓解率达到惊人的的43％，这使其在2014年获得美国监管部门的上市批准。 T细胞桥接抗体如何发挥作用？此类bsAb通过桥接T细胞和肿瘤细胞以形成免疫突触，从而使TCR活化并让T细胞释放颗粒酶和穿孔素，最终诱导靶细胞凋亡。由于blinatumomab的临床结果令人印象深刻，以至于好几种双特异性T细胞桥接抗体（BiTE）均使用了它的构型且都具有CD3结合片段，不同点是靶向的肿瘤相关抗原（TAA）不同。影响T细胞重定向bsAb效果的关键因素包括：肿瘤细胞表面靶抗原的表达水平，其在细胞膜上的流动性以及与抗原表位与靶细胞膜之间的距离。还有证据表明，与TAA的多价结合可以让T细胞更紧密的与靶细胞连接，从而提高杀伤效果（例如多价TandAb具有两个CD3结合位点和两个TAA结合位点，以此来提高T细胞桥接的效率）。另一方面，CD3特异性结合臂通常具有相对较低的亲和力（约200 nM），使得bsAb能够与CD3复合物发生多次连续接触，并引发一种称为“连续杀伤（serial killing）”的现象，从而使单个bsAb分子连接的T细胞可杀伤多个靶细胞。 此外，不含Fc片段的或含有不能结合效应细胞的Fc片段的T细胞桥接抗体，与具有功能性Fc片段的T细胞桥接抗体相比似乎更有优势。甚至在靶向CD3的双特异性抗体出现之前，科学家们就通过沉默OKT3（Muromonab，一种单特异性抗CD3抗体，在移植医学中用作为免疫抑制剂）Fc片段的效应功能提高了其安全性。通过阻止Fc片段与Fcγ受体结合，可以避免免疫细胞表面CD3不受控制地聚集。以这种方式修饰的抗体可显著降低细胞因子的释放。与blinatumomab相比，第一个获批的bsAb catumaxomab由小鼠和大鼠的重-轻链组成的异二聚体，并且靶向CD3和Ep-CAM，含有功能性Fc片段。由于catumaxomab的Fc片段能够结合除了肿瘤以外表达在肝脏中Kupffer细胞上的Fcγ受体导致的的靶点毒性（on-target/off-tumor toxicity），静脉注射后会引起患者出现严重不良事件，如强烈的局部细胞因子释放和T细胞介导的肝毒性。大多数（67％）靶向CD3的T细胞桥接bsAb被用于治疗血液系统恶性肿瘤，其靶标包括CD19、CD20、CD33、CD38和CD123（B细胞成熟抗原，BCMA）。T细胞桥接bsAbs在实体瘤中的应用进展相对缓慢，这是因为许多实体瘤抗原在健康组织中也以低水平表达，这可能导致毒副作用。其他影响该类bsAb在实体瘤中应用的因素还包括抗体和效应细胞难以渗透进入实体瘤组织，以及肿瘤的免疫抑制性微环境。目前约有14种T细胞桥接bsAb正在进行治疗实体瘤的临床试验，靶点包括Her2、EGFR、PSMA和Ep-CAM。 长期使用T细胞桥接抗体治疗可能会由于肿瘤抗原的丢失而出现耐药。一个典型的例子是ALL患者中CD19阴性白血病细胞的增殖。其它抑制T细胞活性的机制还包括调节性T细胞的抑制功能或免疫检查点分子（例如PD-1和PD-L1）的表达。不意外的是，对PD-1/PD-L1抑制可以增强T细胞桥接bsAb的治疗效果。因此，目前基于bsAb的疗法通过同时阻断PD-1/PD-L1轴以及其它免疫检查点CTLA-4、LAG-3或TIM-3来增强T细胞活性已经在进行早期临床研究。一些联合疗法令人鼓舞的早期数据更加支撑了这种观点：与ipilimumab单药治疗相比，联用ipilimumab（Yervoy®）（抗CTLA4）和nivolumab（Keytruda®）（抗PD-1）治疗可显著延长黑色素瘤患者的无进展生存期（PFS）。在双特异性药物的设计中，科学家们已经设想了用Fc沉默的bsAb分别以高亲和力PD-1结合臂和低亲和力CTLA-4结合臂来阻断肿瘤浸润淋巴细胞上的PD-1和CTLA-4，与此同时还能减少bsAb与CTLA-4阳性的外周血T细胞的结合。该设计旨在提高bsAb的安全性和耐受性。 在临床上，使用T细胞桥接bsAbs对抗癌症已经逐渐从激活的效应细胞扩展为使用其它合适的效应细胞类型。Vγ9Vδ2 T细胞是一类涉及免疫监视并且能与肿瘤产生的磷酸化抗原反应导致代谢失调的细胞。该细胞通过bsAb重定向到EGFR阳性肿瘤，并能够诱导结肠癌细胞死亡。另一类适合被桥接的是自然杀伤（NK）细胞。研究人员通过基于scFv构型的三特异性抗体靶向CD16a受体，并融合了IL-15和Her2特异性结合片段实现了NK细胞的桥接。TandAb AFM 13，一种通过接头连接四个抗体可变区片段的抗体，分别拥有两个CD30和CD16a结合位点，能够诱导NK细胞介导的CD30阳性非霍奇金淋巴瘤细胞的杀伤。 除肿瘤领域外，T细胞重定向策略也可能被应用于传染病的治疗。靶向病毒的bsAbs已被证明可将细胞毒性T细胞重定向至已经被乙型肝炎病毒，巨细胞病毒和HIV-1感染的细胞。此类bsAb能够诱导杀伤被HIV感染的细胞并抑制HIV的离体复制。最近的研究有望成功地将bsAb用于再生医学：通过靶向递送CD34阳性的内皮祖细胞至CD41阳性的血小板，可在急性心肌梗死的小鼠模型中有效地修复心脏。通过靶向干细胞抗原1，bsAb可以将PBMC的一个亚群递送至损伤部位，再加上血小板上GPIIb/IIIa的活化，导致损伤部位的炎症细胞和纤维化明显减少，而毛细血管密度增加，心脏功能恢复。 3.2.桥接受体阻断信号通路 桥接受体的bsAb中最成功的例子当属靶向酪氨酸激酶受体家族的抗体。这可能是因为它们靶点组合的协同特性，但是在某些例子中也由于其专性的双特异性。令人惊讶的是，迄今为止，所有受体桥接bsAb在体外和体内试验中表现出的功能，都不能通过参考其亲本抗体的特性来预测。例如，有一个很好的靶向EGFR和Met的bsAb是通过在含有大量bsAb的文库中广泛筛选而来，并且是唯一一个不会在Met/EGFR阳性细胞诱导该通路激活的候选物。要知道，通常二价抗met抗体会引起met分子发生交联并诱导肿瘤发生。因此，这种靶向Met和抗EGFR结的不对称的双特异性抗体被用来阻断Met和EGFR诱导的信号传导。另一个例子是靶向Her2和Her3的单价双特异性抗体。通过与Her2高亲和力结合，可以使抗Her3 Fab在局部富集，从而可以阻止Her3与其配体HRG的结合并抑制两个受体的信号传导。 靶向受体的bsAb也可以表现出激动活性。有研究表明，成纤维细胞生长因子21（FGF21）代谢途径的激活可以有效缓解肥胖和糖尿病，但由于其毒副作用，无法直接靶向该分子。因此，bsAb BFKB8488A（Roche）通过靶向广泛表达的成纤维细胞生长因子受体1C和仅在肝脏、脂肪组织和胰腺中表达的β-klotho受体激活了该代谢途径。并且，毒副作用被有效地限制在同时表达两种靶点的组织中。 3.3.克服配体冗余 仅仅通过抑制支持癌细胞生长的细胞因子通常不足以阻止癌细胞的增殖，因为癌细胞增殖所涉及的信号传导途径依赖于激活这些通路冗余的配体。在抗血管新生方面，克服配体冗余作用方式的bsAb与单特异性药物相比具有一定优势。例如，一款靶向并抑制VEGF和δ样配体4（DLL-4）的DVD-Ig构型的bsAb目前正在进行治疗结肠癌患者的临床研究。研究人员开发了一款人源化IgG1 靶向VEGF和Ang2的CrossMab来治疗眼科疾病。在该药用于糖尿病相关性黄斑水肿患者之前，应该对其Fc区进行的额外工程改造，一方面避免与Fc受体的结合以减少二级免疫反应，另一方面提高药物的全身清除效率。 3.4.靶向同一抗原的两个不同表位: Biparatopic 双特异性抗体 Biparatopic bsAb靶向同一抗原的两个不同表位并可以充当交联剂，通常会导致抗原聚集。在这方面，它的活性可以与抗体的混合物相比。此类抗体的一个例子是抗Her2的bsAb ZW25。它极强的结合作用体现为更高的亲和力，能够更好地在细胞表面阻断Her2以抑制Her2介导的信号传导。它Fc区经过工程化改造后，能够更有效地发挥效应功能。在治疗晚期胃食管癌和乳腺癌患者的临床试验数据显示，该抗体比赫赛汀疗效更好。此外，以该抗体为基础，研究人员开发了一款抗体药物偶联物（ADC）ZW49。研究人员预计该药物能够介导更强烈的细胞内化，所以应该能够更有效的在胞内裂解毒素，从而获得更好的临床结果，目前，该药物正在开展临床试验。 3.5.酶模拟 典型的充当酶复合物共作用因子的bsAb的例子是emicizumab（Hemlibra®），它是目前获批上市的第二款bsAb。这种抗体通过以微摩尔级别的亲和力同时结合IXa和X因子，在A型血友病患者中模拟VIIIa因子（FVIII的活化形式，在A型血友病患者中缺失）。作为一种预防性治疗，这种bsAb可以有效地缓解A型血友病患者的出血，无论患者体内是否存在VIIIa因子抑制物。该bsAb是通过对40,000个bsAb（由200种靶向IXa因子的抗体和200种靶向X因子的抗体排列组合）的活性筛选而来。为了解决链错配问题，该bsAb由两条异源IgG4重链二聚体和一条共用轻链（common light chain）组成。在40,000个bsAb中大约有0.3%在筛选中表现出酶模拟活性。研究人员对最佳候选药物的轻链通过构架和CDR重组进行了优化。后续进一步的优化包括人源化以降低免疫原性，电荷优化以减少聚集问题，以及等电点优化以实现基于离子交换色谱的双特异性产物与副产物的分离。最终，该药物于2018年在美国和欧洲获批。 3.6.双特异性抗体介导的转运:背负式劫持 该概念涉及专性BsAb，其能够将分子转运进/出某些组织或细胞区室。其中一个开拓性的例子是，由抗体作为靶向部分和蓖麻毒素A组成的分子，毒素在该分子被细胞内化后会释放毒性。另一个由抗体和突变型假单胞菌毒素组成的药物正在临床开发中。 目前，科学家正在对利用bsAb作为“特洛伊木马”进行深入研究。因为它们可以穿过脑血屏障并将活性化合物递送到该区域。最常见的方式是，它们通过一个抗原结合臂与铁转运蛋白受体结合，从而让整个分子通过胞吞途径进入。有一个此类bsAb另一结合臂与ß-分泌酶1（BACE1）结合，能够在小鼠和猴子模型中显著抑制该酶的活性，从而减少脑和脑脊液中β-淀粉样蛋白斑块的数量。 核内体似乎也是一个可以作为bsAb转运功能的靶标。例如，bsAb一方面可以靶向埃博拉病毒糖蛋白胞外暴露的保守的抗原表位并以病毒作为载体，随之一起被内吞进核内体。病毒的糖蛋白被蛋白水解切割后，病毒与内体受体的结合位点暴露出来，该位点的结合是病毒从核内体进入细胞质所必需的。另一方面，bsAb通过靶向内体受体，阻断病毒与其结合，从而阻止病毒进入细胞质。通过这种机制，bsAb能够在体外中和几种已知的埃博拉病毒株并为小鼠提供抗病毒保护。另一款靶向次级内体蛋白（late-endosomal protein）CD63的bsAb能够提高靶向Her2的抗体-药物偶联物的递送效率并降低其的外周毒性。双特异性结合还可以通过介导与Fc或HSA的非共价融合，让不含Fc的抗原结合片段进入新生儿Fc受体（FcRn）循环途径，从而避免被溶酶体降解，在体内具有更长的血清半衰期。多种抗体运用这种设计并证实了其可行性：基于VHH的bsAbs vobarilizumab和ozoralizumab，它们分别靶向IL-6受体和肿瘤坏死因子并融合了能够结合HAS的片段，目前处于临床II期研究中。另一款基于VHH的，利用HAS延长半衰期的药物是靶向VWF蛋白（von Willebrand factor）的caplicizumab（Cablivi®）。FDA已经批准该药的用于治疗血栓性血小板减少性紫癜的患者。 4.双特异性抗体的构型 bsAb在完成单特异性抗体无法处理的任务中的成功引起了人们的兴趣。科学家希望推动bsAb用于更复杂的生物学场景。为了实现它们多样化的功能，有时需要不同的结合价位，有时甚至需要控制两个结合位点的空间位置。这促使蛋白质工程界设计出许多巧妙的解决方案来满足其多样化结构的需求。因此，目前已经有超过100种可用的，不同的bsAb构型 (图4)。 在IgG类的天然二价抗体中，两个抗原结合位点是相同的，并且重链和轻链的可变区都参与抗原结合。化学偶联以及共表达两对不同的重-轻链会导致混合产物的产生，从而造成链错配问题： 这会降低目标产物的产量，需要对各链做标签化标记以进行额外的纯化步骤，并需要对最终产物重新分析和质控。目前研究人员已经开发了多种技术来增加所需双特异性分子的产率。除了可以根据bsAb的基本结构将它们分类之外，还可以通过bsAb所应用的工程化方法对它们进行区分。 4.1.基于片段结构的双特异性抗体 单链可变片段（scFv），一种由连接子（linker）将重链和轻链的可变区连接在一起组成的多肽链。作为最小的抗体衍生结构，它保留了完整IgG抗体的抗原特异性，并且成为了如今构建多特异性抗体最常用的构型(图4A2)。我们可以在这种构型中通过选择合适长度的连接子来调整重链和轻链的空间排列，而缺少Fc片段则可以规避抗体的同二聚化(图4A)。特别是后一特性还让其适合在原核微生物或低等真核生物中表达，从而使它的生产变得廉价和简单。它们的模块化性质让我们可以按照意愿选择特异性结合的效价：目前，多效价靶向每个靶点的构型正在进行临床评估。与此同时，其模块化特性让我们能够调整结构域的排列，以找到最佳的组合形式，以此解决基于片段的bsAbs在溶解性和稳定性方面的潜在问题。 图4 bsAb构型的选择抗体各链标示: 红色, VL1; 蓝色, VH1; 黄色, VL2; 绿色, VH2; 黑色, CL; 白色, CH1; 灰色, CH2; 浅蓝, CH3. (A) 基于片段结构的构型: A1 F(ab)2, A2 T细胞桥接双特异性抗体(BiTE), A3 diabody, A4 dual affinity retargeting (DART),A5tandemdiabody(TandAb);(B)对称融合构型,B1dual-variabledomain-Ig (DVD-Ig),B2IgG-(scFv)2,B3(scFv)4-Fc,B4cross-overdualvariableIg(CODV-Ig);(C)对称构型, C1 Two-in-One Ab, C2 DutaMab, C3 mAb(粉色表示做了突变处理的CH3结构域); (D)不对称构型, D1 “Knobs-into-Holes”异二聚化的IgG, D2 通过电荷作用异二聚化的IgG, D3 通过位阻效应诱导、二硫键稳定异二聚化的IgG, D4 通过位阻效应诱导、点突变稳定异二聚化的IgG,D5SEED-body(条纹表示异二聚化的CH3); (E) 解决了轻链错配的不对称构型, E1 大鼠-小鼠 杂合IgG (带边框的洋红色,小鼠CL;带边框的粉色,小鼠CH1;洋红色,小鼠CH3;带边框的深灰色,大鼠CL;带边框的灰色,大鼠CH1;深灰色,大鼠CH3), E2 共用轻链异二聚化IgG, E3通过突变CH1/CL和VH1/VL结合界面异二聚化的IgG, E4 DuetMab, E5 CrossMab 相比之下，diabodies（图4 A3）包含两条链，每条链具有一个VH和VL结构域，并通过很短的（通常为5个氨基酸长度）linker连接。因为linker的长度比scFv中装配抗原结合位点所需的长度短得多，所以两条链在相反的方向上形成二聚体，当其在同一细胞中共表达时形成双特异性异二聚体分子。而有证据表明，两个结合位点位置的变化会影响抗体的有效应。例如DART构型的抗体（图4A4），由两个diabody组成。其中，两个diabody被一个额外的半胱氨酸键将抗体中靶细胞和效应细胞的结合位点限制在比其他基于linker设计的构型更近的距离，因而可以诱导更有效的靶细胞杀伤。但是，不含有Fc区会使此类分子无法进入FcRn循环途径，从而导致较短的血清半衰期。然而，我们可以通过在抗体中融合Fc片段或HSA结合片段来改善它们的药代动力学性质。 4.2.对称的双特异性抗体构型 既要保留Fc片段又要克服链错配问题的另一种方法是选择未修饰的IgG构型作为基本骨架，并为其加上第二种特异性。因此，这种构型通常都是以二价的形式靶向每种抗原（图4B, C）。通过融合组成的构型通常包括附加在重链C末端的scFv以及Fab片段，例如(scFv)2-Ig（图4B2）；这里Fab片段的可变区和恒定区可以用scFv取代，(scFv)4-Fc（图4B3）。但是，在DVD-Ig（dual-variable domain-Ig）的构型中（图4B1），靶向第二种抗原的特异性是通过在重链N端添加另一对重-轻链可变区实现的。此外，最近报道的CODV-Ig（cross-over dual variable Ig，图4B4）构型通过将两个可变区阵列附加到每个Fab片段的恒定区来给抗体添加第二种特异性，并通过优化了的linker将VH和VL相连，以确保其正确的空间位置。 另一类工程化方法旨在通过引入突变和选择而不是共价连接的方法来生产对称的bsAb，同时保留其分子结构和IgG分子的大小(图4C)。其中包括“Two-in-One antibody”（图4C1），其可变区的CDR被修饰为可以特异性识别两种不同的抗原；DutaMab，其重链和轻链的CDR可以分别结合一种不同的抗原（图4C2）；mAb 具有从文库而来的抗原结合性Fc，通过在CH3结构域突变残基赋予其抗原结合能力（图4C3）。 4.3.不对称的双特异性抗体构型 此类设计的双特异性抗体构型的原理是通过在共表达四个多肽链后，为异二聚体的两个异源抗体链之间创造优先配对的条件(图4D, E)。这种构型的bsAb除了基本保留了抗体的天然构型和大小，此外，它们的巨大优势是最大程度减少了免疫原性非天然抗体序列（例如标签和linker）的使用。为了实现异二聚化，第一种策略是基于点突变的空间位阻效应（图4D1）或电荷效应（图4D2），之后再优化突变了的Fc区以保持分子的稳定性(图4 D3, 4)。最近，旨在实现异源二聚化的方法采用了更广泛的突变，例如运用链交换技术改造结构域的SEEDbody：利用了IgG3和IgA CH3片段易于配对的特性，将其中类似的结构分别引入bsAb的两条重链中（图4D5）；BEAT构型：利用TCR（T-cell receptor）两条链异二聚化的特性，将介导TCR链异二聚化配对的残基引入到Fc区上(图2E) 。最近，出现了一种适用于IgG1骨架CH3结构域的方法是先表达两个半分子抗体，之后组装，也称为受控的Fab臂交换（controlled Fab-arms exchange）。 通过利用一个scFv作为抗原结合位点（图4D5）或使用多个物种的抗体结构域(图4E1)，解决了不对称构型中轻链错配的问题。后来研究人员通过让两个结合位点使用同样的轻链的方法也解决了这个问题(图4E2)。它为两个结合配偶体使用序列相同的轻链（图4E2）。但用这种方法构建的bsAb的局限性在于这种bsAb不能利用已经存在的单特异性抗体，因此需要一系列配套的噬菌体文库和转基因动物平台来支持其抗体发现过程。此外，通过修饰重链和轻链之间的结合界面也可以让某个Fab优先形成，避免轻链错配(图4E3)。还有一种促使轻链正确配对的策略是，通过去掉Fab片段恒定区之间的天然二硫键并人为引入另一条二硫键，称为DuetMab构型(图4E4)。在CrossMab中，轻链和Fd（VH-CH1）片段的位置在两个不对称半抗体中互换了位置（图4E5）。依赖于轻链结合抗原的bsAb的分离纯化步骤如下：在“κλ-body”构型中，采用了两个不同亚家族（κ和λ）的独特轻链。在进行亲和色谱分离时，使用诸如Kappa选择和Lambda Fab选择之类的载板来选择性捕获包含κ和λ两个轻链的不对称bsAb。此外，能够与bsAb两个Fab相结合的抗原蛋白如今也可以被用作色谱载板来特异性捕获bsAb。 实际上，对某些不对称bsAb的设计进行微调，是为了通过下游生产纯化达到所需均质终产物的最佳产量。此类方案根据目标产物与副产物的微小区别，例如基于与重组纯化蛋白A结合能力的差异、所带电荷的差异或分子量差异，可以分别通过离子交换色谱或凝胶过滤柱进行分离纯化。由于bsAb结构的复杂性，导致了其需要灵敏的分析工具监控并分离纯化正确配对的产物。bsAb的分析由一系列互补的方法组成。分析的第一步通常是基于液相色谱-质谱（LC-MS）的方法来测定抗体的分子量，以便快速分析bsAb各链是否正确配对；第二步包括疏水层析（HIC）分析，可基于目标产物和副产物疏水性的不同测定bsAb的纯度。 值得注意的是，目前大多数不对称构型的bsAb对每种抗原都只有一个单价结合位点，想要引入靶向抗原的多个结合点仍然是未来蛋白质工程面临的挑战：多价结合所获得的亲和力效应可能会挖掘出抗体的潜力，通过提高结合位点的数量，从而增强与表达抗原的靶细胞的相互作用强度。 5.展望 在了解了几类双特异性抗体的构型后，我们可以得出结论，未来大多数打算用于治疗的候选分子都倾向于含有Fc片段，主要是因为它带来的较长的体内血清半衰期。此外，之前被证明对单克隆抗体有益的所有基于Fc的修饰也都适用于bsAb：选择合适的Fc类型来延长半衰期；通过点突变或改变糖基化来增强次级免疫反应；或通过减少点突变造成空间位阻或减少糖基化使其难于结合FcγR分子。或者，如果不需要介导次级免疫反应，则可以使用IgG2或IgG4类的Fc片段。IgG4介导天然异源二聚化的特性似乎更适合用作bsAb的骨架。 尽管目前在临床试验中的分子最多具有两个结合位点，但在一些抗体构型中，多价靶向特定抗原似乎会更有利。未来的抗体工程化还可以利用天然的多价抗体分子，例如基于IgA的四价构型或基于IgM的十价构型。 6.总结 在本章中，我们了解了几十年来bsAb的发展历程，并学习了它们的多种构型以及作用方式。每种构型都在调整针对目标抗原的效价、靶向两种抗原时距离和浓度的物理化学参数等方面表现出独特的性质。而它们在理化性质，制造要求，生产后分析和配制以及体内药代动力学性质方面就更加差异化。但是，对bsAb的结构和功能同质性以及生物学效应的要求与经典的单特异性抗体是高度类似的，这对于其在人体和医疗上的应用至关重要。 Take Home Messages •根据生物学效应，BsAb可以充当两种单特异性抗体组合的混合物来发挥作用；也可以作为专性bsAb，将两种不同的抗原特异性组合在一起产生新的生物学效应。 •bsAb的专性作用要么是空间性的（两个抗原结合臂分别同时结合抗原），要么是时间性的（其中一条抗原结合臂与抗原的结合是实现另一臂结合活性的先决条件）。 •常用的bsAbs作用方式包括桥接不同细胞类型，桥接不同抗原，结合同一抗原的两个不同表位，靶向同一信号途径的两个抗原以及作为载体将携带的生物学功能递送至所需的器官和细胞室。 •bsAb的构型包括不含Fc片段的基于片段结构的构型；通过利用融合或突变方法添加第二种特异性的同源二聚化Fc的对称构型；以及通过空间位阻效应或者静电效应诱导两个异源Fc半分子结合的非对称构型。 •不对称构型通常通过点突变引入链配对基序，以诱导两个异二聚半抗体重链分子的优先配对。轻链错配的问题可以通过让两个不同的抗原结合位点共用序列相同的轻链；或者改造重-轻链结合界面，包括引入改造的二硫键；通过结构域交换或恒定区位置互换来解决。此外，对于具有κ和λ类轻链的抗体可以利用特异性结合κ和λ类轻链来进行分离纯化。 •抗原识别位点的效价在各种构型的抗体中是不同的，可以根据特定的生物学应用进行选择。目前的抗体工程技术甚至可以满足设计多价抗体的需求。 •使用IgG1、IgG2和IgG4不同骨架的bsAb构型可以调节不同的免疫效应功能。 下章预告：抗体偶联药物 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。