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看点view本周，医药反腐风暴持续，一市卫健委主任被查，一医院院长卸任10年后落马；药品市场迎变局，一批药品被点名，58个品种集采拟中选结果出炉，知名药企产品致5人死亡；研发新进展，恒瑞拿下重磅首仿，华东医药1类新药亮相；企业大动作，中国Biotech“外嫁”，国产胰岛素龙头官宣“二代”接班……医药行业一周大事件，精彩不容错过！米内一周TOP榜米内数据北上广药品销售TOP10！“神药”暴涨134%呼吸系统中成药TOP20！超10亿产品领跑药企动态信达生物开挂了！4个重磅单抗销售大涨华海药业发威！6个畅销品种大涨超100%审评药闻中美华东1类新药来袭，瞄准1700亿市场恒瑞医药4000万元喜提重磅首仿海思科猛攻1类新药，千亿市场再掀波澜一市卫健委主任被查3月28日，据安徽纪检监察网，芜湖市卫生健康委员会党委书记、主任秦正华涉嫌严重违纪违法，目前正接受芜湖市纪委监委纪律审查和监察调查。（安徽纪检监察网）卸任近10年，贵州一医院原院长落马3月25日，中央纪委国家监委网站发布消息：原贵阳医学院党委委员、副院长，原贵阳医学院附属医院党委副书记、院长王小林涉嫌严重违纪违法，目前正接受贵州省纪委监委纪律审查和监察调查。王小林现年已70岁，曾为影像学博士生导师、贵州省放射学会主任委员，是国家二级教授，享受国务院政府特殊津贴。王小林曾长期担任原贵阳医学院、原贵阳医学院附属医院领导，在1991年至2014年担任原贵阳医学院附属医院院长。（法治复兴号）103个药品被点名3月25日，江苏省医保局连续公布三批药品预警情况，3月以来已发布了五批药品价格预警名单，共103个药品因价格过高被点名。其中，因价格高于已挂网同品种最高价10倍（含）及以上，4个药品触发红三星预警，被暂停交易，涉及注射用卡络磺钠、胞磷胆碱钠葡萄糖注射液、桂利嗪片、注射用甘草酸二铵。而价格高于已挂网最高价2倍（含）-5倍、5倍（含）-10倍的，分别会标记为“红一星”“红二星”预警。3月被点名的药品中，共65个药品触发此级预警，相关企业将被约谈，提醒医疗机构谨慎采购。（赛柏蓝）58个品种！13省联盟集采拟中选结果出炉3月27日，河南省医保局发布《十三省(区、兵团)药品联盟采购公告（十）》，进行十三省(区、兵团)药品联盟采购拟中选结果公示，时间为2024年3月28日至2024年3月30日。根据梳理，经竞价、询价和价格谈判纠偏等程序，本次十三省(区、兵团)药品联盟采购拟中选产品涉及阿莫西林、阿奇霉素、奥美沙坦酯等58个品种，涉及科伦药业、石药集团、京新药业、齐鲁制药等236家药企的355个产品。（医药慧）首仿！恒瑞注射用塞替派获批上市3月25日，恒瑞医药公告称，公司的注射用塞替派以化学药品3类获批上市，成为国内首仿，适应症为“本品适用于重型β-地中海贫血儿童（＜18周岁）异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）前预处理”。公司注射用塞替派已先后在美国、欧洲获批上市销售，是国内首个获批移植预处理相关适应症的塞替派产品。（公司公告）华东医药1类新药来袭，首款自研ADC新药3月27日，华东医药的1类新药注射用HDM2005临床试验申请获承办，用于治疗实体瘤和血液瘤。华东医药ADC管线已布局了4款药物，注射用HDM2005是公司首款自研ADC新药。近日，公司与美国ImmunoGen合作的索米妥昔单抗注射液获美国FDA批准上市，成为全球首个卵巢癌ADC药物。（米内网）中国Biotech被美国药企收购3月25日，Nuvation Bio宣布将以全股票交易方式收购葆元医药。这是继阿斯利康收购亘喜生物之后，又一起由美国上市公司发起的对国内Biotech的收购。葆元医药成立于2018年，是一家专注于开发新型肿瘤疗法的生物医药公司，总部在杭州，最近三轮累计融资近1亿美元。目前公司手上有3款抗肿瘤前沿小分子管线。Nuvation看中的主要资产是Taletrectinib，据称是下一代潜在同类最佳ROS1/NTRK双靶点抑制剂，预计今年将在国内上市。（健识局）国产胰岛素龙头官宣“二代”接班3月28日，通化东宝发布年报，实现营业收入30.75亿元，同比增长10.69%；归母净利润11.68亿元，同比下降26.17%；扣非净利润11.68亿元，同比增长38.88%。在发布业绩的当天，通化东宝同时还发布了董事长冷春生因个人原因辞职的公告。同日，通化东宝的董事会还选举了李佳鸿担任公司新一任董事长，李佳鸿是通化东宝创始人李一奎之子。（E药CM10）钟睒睒连续四年蝉联中国首富3月25日，胡润研究院发布《2024胡润全球富豪榜》，财富计算的截止日期为2024年1月15日。这是胡润研究院连续第13年发布“全球富豪榜”。榜单显示，中国减少155位企业家，至814位，仍然位居世界第一。钟睒睒财富比去年缩水9%，以4500亿元连续第四次成为中国首富，排名全球第21位，下降6位。2020年，农夫山泉登陆港股市场，万泰生物在A股上市。凭借这两家公司，钟睒睒成了中国首富，且连续四年蝉联中国首富。（蒲公英）11.46亿元！阿胶龙头大手笔分红近日，阿胶龙头东阿阿胶披露2023年年报，公司实现营业收入47.15亿元，同比增长16.66%；归母净利润11.51亿元，同比增长47.55%。公司拟向全体股东每10股派发现金红利17.8元（含税）。3月24日，东阿阿胶披露“2023年年度业绩说明会交流记录”，宣布现金分红总额达11.46亿元，此次分红总额首次突破十亿元，分红比例为99.60%。（公司公告）日本老牌药企产品致人死亡据央视新闻援引日本朝日电视台报道，截至29日，已有5名服用过小林制药含红曲成分保健品的消费者死亡。日本厚生劳动大臣武见敬三当日表示，大阪市命令召回的小林制药含红曲成分相关三种产品中，截至28日下午4时，已经回收4350个“红曲胆固醇颗粒”产品，另外两种产品召回数量为零。22日，小林制药称，近期有部分消费者在使用该公司生产的含有红曲成分保健品后，出现肾脏疾病。24日，小林制药表示，曾向约50家饮料及食品生产商提供红曲。（羊城晚报）科伦博泰上市260天市值涨近200亿港元3月25日，科伦博泰发布了上市以来的首份年报。2023年公司实现营业收入15.40亿元，同比增长91.6%；年内亏损额为5.74亿元，同比收窄6.8%；调整后年内亏损额为4.51亿元，同比收窄24.4%。2023年，依靠从默沙东处获得的管线授权首付款及里程碑付款，科伦博泰营收同比涨超90%，亏损收窄6.8%。也正是凭借与默沙东间的合作关系，在港股创新药板块颓势明显的背景下，上市260天的科伦博泰成功实现股价翻番，市值也上涨了近200亿港元。（蓝鲸财经）翰森制药2023年营收破百亿元3月26日，翰森制药发布2023年年报，公司实现营业收入101.04亿元，同比增长7.69%；净利润32.78亿元，同比增长26.85%。2023年公司创新药与合作产品收入68.65亿元，同比增长37.1%，占总收入比例提升至67.9%，创新药已经成为驱动业绩增长的核心动力。分领域看，2023年公司在抗肿瘤、抗感染、中枢神经系统、代谢及其它疾病领域收入分别为61.69亿元、12.69亿元、13.67亿元、12.99亿元。（公司公告）近4亿元打水漂，舒泰神终止4项临床3月25日，舒泰神发布公告，称基于当前新冠疫情形势，结合年度审计工作开展，对在研项目进行了梳理，经审慎判断，决定终止BDB-001注射液、STSA-1002注射液、STSA-1005注射液、STSA-1002和STSA-1005联合用药项目在COVID-19适应症方向的研究工作。根据被终止临床试验的药物基本信息，四款新冠项目累计研发总投入为3.83亿元。（E药经理人）投稿及报料请发邮件到872470254@qq.com稿件要求详询米内微信首页菜单栏商务及内容合作可联系QQ：412539092【分享、点赞、在看】点一点不失联哦

点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注通常，药品中的活性成分可以通过全合成或者以天然产物为先导化合物，进行结构修饰以获得。而上述这两种情况，均需要使用多种化学试剂并经过一步或多步化学反应。因此，即使经过纯化步骤，在最终的原料或制剂中，还会存在一定量的和药效无关的杂质。同时，在药品的制剂或储存过程中，也可能生成一定量的杂质。这些杂质和药效无关，同时可能具有毒性，甚至具有遗传毒性和致癌性。美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)、欧洲药品管理局(European Medicines Agency,EMA)等各国药品监管机构自2006年已开始持续关注原料药中遗传毒性杂质的情况，及可能对人体健康造成的负面影响。遗传毒性杂质是指能够直接或间接损伤细胞DNA，造成DNA突变并伴有致癌性危害人类健康的物质。其对DNA的损害包括染色体断裂、DNA重组及复制过程中共价键的插入和修饰，也包括在细胞水平上产生遗传毒性物质而造成的突变。由于微量水平的遗传毒性物质也会对服药者造成不可逆转的危害，可能会引发肿瘤甚至癌症的风险，并且该致癌风险可能与剂量没有相关性，存在遗传毒性化合物在极低剂量水平下导致人体DNA损伤，且该损伤效应可通过遗传物质的复制而不断放大的风险。因此对遗传毒性杂质的检测和控制极其重要。遗传毒性杂质的种类较多，有黄曲霉素类、亚硝胺化合物、烷基-氧化偶氮基化合物，磺酸酯类、氯代烷烃类、苯胺类、硝基苯、多环芳烃以及叠氮化物等。由于黄曲霉素类、亚硝基化合物、烷基-氧化偶氮基化合物毒性较强，属于特殊关注队列(表1)。表1 常见亚硝胺类遗传毒性杂质信息注：空格代表未明确分类近年来，亚硝胺化合物残留而引发药品召回的事件频发。2018年，浙江省华海药业在缬沙坦原料药中检测出微量的亚硝胺类遗传毒性杂质N-亚硝基二甲胺(N-nitrosodimethylamine,NDMA)后，亚硝胺类杂质事件引起了业内的普遍关注。2019年3月，FDA公布氯沙坦钾片中亚硝胺类遗传毒性杂质N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(N-Nitroso-N-methyl-4-aminobutyric acid,NMBA)超出暂定控制限度(0.96 ppm)。同年9月，FDA发布安全警告，雷尼替丁中检出亚硝胺类遗传毒性杂质NDMA，之后也导致相关产品被召回。随后FDA又在降糖药二甲双胍中检出微量NDMA。2020年7月，WHO公布在赛诺菲公司的利福平、利福喷丁中检出亚硝胺杂质MNP、1-环戊基-4-亚硝基哌嗪(1-cyclopentyl-4-nitrosopiperazine,CPNP)，随后FDA也公布了其暂定限度为5和20 ppm。2021年，因含有亚硝胺化合物N-亚硝基-伐尼克兰，辉瑞公司召回戒烟药Chantix。次年又因亚硝胺类杂质超标，长效降压药盐酸普萘洛尔被召回。上述事件总结见图1。此类亚硝胺杂质事件频发，增加了患者使用药物的风险，也给企业带来了无法估计的损失，同时也给制药行业和监管机构敲响了警钟。 亚硝胺类遗传毒性杂质的监管20世纪以前，对于药品中遗传毒性杂质的监管的制度和措施几乎空白。随着检测技术和监管理念的发展，近年来，各个国家和地区的药物监管措施的逐渐完善。2002年，EMA的专利药物委员会(Committee for Proprietary Medicinal Products,CPMP)后更名为人用药物委员会(Committee for Human Medicinal Products,CHMP)发布关于遗传毒性杂质的意见书。该意见书按照杂质是否存在有证据的阈值而将遗传毒性杂质进行分类：(1)有足够的研究证据支持其阈值的杂质，建议参照ICH Q3C中二类溶剂的方法进行控制；(2)无充分阈值研究证据的杂质，采用“最低技术可行”(as low as technically feasible,ALATF)的原则进行控制。2004年，EMA发布遗传毒性杂质限度指南(草案)，对意见书进行了修改。默认完全消除遗传毒性杂质的引入风险是无法实现的，改以“最低合理可行”原则(as low as reasonably practical,ALARP)替代了“最低技术可行”(ALATF)原则，建议用毒理学关注阈值(threshold of toxicological concern,TTC)作为遗传毒性杂质的可接受限度。TTC根据半数致癌剂量(median toxic dose,TD50)的五万分之一为摄入量进行线性外推，从而得到十万分之一(10-5)致癌率的摄入量，并以此数值作为每人每天最高摄入量。上述TD50的数据通常来源于致癌性强度数据库(carcinogenicity potency database,CPDB)以及啮齿类动物致癌性试验数据库。由于部分遗传毒性杂质致癌性强，危害较大，即使低于“毒理学关注阈值”也会对人体有较大致癌风险，所以美国药品研究与制造企业协会(Pharmaceutical Research and Manufacturers of America,Ph RMA)又提出了“五分类”系统，将遗传毒性杂质分为5类。2014年，人用药品注册技术协调会(the international council for harmonisation of technical requirements for pharmaceuticals for human use,ICH)在EMA、Ph RMA和FDA的基础上颁布了关于遗传毒性杂质指南ICH M7，对“五分类”做了一些增补，见表2。2017年，ICH评估和控制药物中DNA反应性(致突变)杂质的ICH M7指导原则将致癌风险高的N-亚硝基类化合物列为“特殊关注队列”，并根据其致癌性相关分析，将其列为“具有已知致癌致突变性”的Ⅰ类杂质。根据ICH M7和EMA相关指南，作为“特殊队列”中的亚硝胺类杂质应根据药物每日最高使用剂量计算终身使用的药物中亚硝胺类杂质的临时限度。也可根据TD50等其毒理学参数计算每日允许暴露量(permitted daily exposure,PDE)或每日允许摄入量(acceptable daily intake,ADI)。然后在此基础上，根据每日用药量和用药周期对其限度进行确定。若在CPDB及啮齿类动物致癌性试验数据库中未查见亚硝胺杂质的TD50值，可以采用相似结构化合物的TD50值计算杂质限度。当然，存在着一种药物中含有多种遗传毒性杂质的风险。EMA安全工作小组(safety working party,SWP)对于含有两种及以上的亚硝胺类杂质的限度控制，提出了两种监管策略：第一种策略是按照致癌风险最强的一种亚硝胺杂质的限度进行控制；另一种策略将总含量控制在罹患肿瘤的风险不超过10-5的水平。同时，SWP提供一种替代方法，建议为每种亚硝胺杂质设定一个特定的限值，从而确保所有检出的亚硝胺杂质的总和不超过10-5的总风险水平。而对于毒理学数据不足的亚硝胺类杂质的控制限度，比如N-亚硝基甲乙胺(N-nitroso-methylethylamine,NMEA)、N-亚硝基二丙胺(N-nitrosodi-N-propylamine,NDPA)胺类化合物，EMA推荐使用结构上与其最为接近的亚硝胺类化合物的TD50为基础估算其限度。而对于短期服用药物，ICH M7提出了可使用小于寿命(less than lifetime,LTL)的方法计算其限度。但是，当前多数CHMP专家基于亚硝胺类杂质暴露量与DNA损伤无严格线性关系，同时经过LTL计算后，限度偏高，造成短期风险增大。我国对于遗传毒性杂质的研究起步较晚，2017年我国加入ICH后，相继颁布了指导原则。2019年1月，国家药典委员会发布关于遗传毒性杂质指导原则审核稿，指导遗传毒性杂质的分类和控制，《中国药典》2020版四部通则中新增了该指导原则。2020年5月，我国国家药品监督管理局药品药审中心网站发布了《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则(试行)》，该原则对准备注册申请上市和已上市化学药品中亚硝胺类杂质的研究和控制提供了指导原则。  亚硝胺类传毒性杂质的来源药品中亚硝胺类遗传毒性杂质的产生的原因复杂且多样。从产生机理角度分析，亚硝胺类遗传毒性杂质的产生机理分为两大类：一是经典的亚硝化反应。如不同胺类化合物与不同亚硝化试剂相互作用发生的亚硝化反应，主要以仲胺和叔胺化合物为主，亚硝化试剂主要包括亚硝酸根离子、亚硝酰卤化物、亚硝酸酯、三氧化二氮和四氧化二氮等。二是非经典类的亚硝化反应。硝基胺高温下的还原反应，硝基胍用锌粉还原可形成亚硝胺；肼类化合物如偏二甲肼发生的氧化反应；还有腙臭氧分解成亚硝胺；有机金属的亚硝化；将格氏试剂加入到一氧化氮中可以得到亚硝基羟胺等。其中常见的反应就是亚硝化反应，任何含N-H的化合物都可能发生亚硝化反应，比如胺、(杂)酰胺、氨基甲酸酯、羟胺、羟胺醚、肼、腙、酰肼、脲和胍。上述反应机理如图2所示。图2 亚硝胺化合物形成机理Fig.2 Formation mechanism of Nitrosamine compounds药物在生产、储藏的过程中均有可能产生亚硝胺类杂质。华海药业在缬沙坦的合成路线中使用了叠氮化钠，其溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)。该合成路线相对于之前的合成路线，具有收率高的特点。但经研究表明，溶剂DMF在合成过程中，会降解生成二甲胺。二甲胺会与淬灭过量的叠氮化钠使用的亚硝酸钠发生亚硝化反应，进而产生亚硝胺类杂质NDMA[6]。强效组胺H2受体拮抗剂雷尼替丁本身结构中的硝基和二甲胺发生也会亚硝化反应，降解产生NDMA。与雷尼替丁结构相似，二甲双胍结构中也含有一个二甲胺，容易与亚硝酸盐生成亚硝胺杂质。基于以上机理，亚硝胺类遗传毒性杂质来源主要有3种途径：一是来源于生产工艺。在生产过程中引入了胺类化合物或亚硝化试剂，如起始原料、反应物、中间体以及药物合成中发生的副反应。此外还应考虑某些溶剂、催化剂等也会降解生成仲胺或叔胺化合物。沙坦类中NDMA的来源就是生产工艺使用了胺类和亚硝酸钠反应产生的。并且生产过程使用的溶剂DMF和N-甲基吡咯烷酮的水解或者热降解分别产生仲胺如二甲胺和甲基丁胺，随后发生N-亚硝化反应，最终产生NDMA和NMBA；二是可能来源于储存过程、包装材料以及并线生产等。含有硝化纤维的泡罩包装也会生成亚硝胺杂质；三是来源于起始物、中间体或原料的降解产物。比如雷尼替丁中的NDMA杂质是在储存过程中降解产生的，尤其高温加热时生成的亚硝胺杂质更多。遗传毒性杂质具有重大的遗传毒性风险，是需要重点控制的杂质，对遗传毒性杂质控制的水平可以反映药品质量标准的水平[17]。因此为了人类的健康和安全，有必要了解其产生机理并建立一种灵敏的方法来检测和定量药品和药品中的遗传毒性杂质。同时对杂质的清除措施也需十分明确。 亚硝胺类遗传毒性杂质的清除2020年6月，EMA就上市许可持有人如何避免在人用药中产生亚硝胺类杂质提出指导意见：调整生产工艺，提前预防亚硝胺化合物的生成；做好合成路线、起始原料、中间体、原料(溶剂、试剂、催化剂等)的风险评估，找出生成亚硝胺化合物的潜在原因；如若通过实验证实确有亚硝胺化合物存在，应考虑改变生产工艺、原料和中间体、原材料或初级包装(如含有硝化纤维的泡罩包装等)，以避免使用亚硝化剂；如果证明亚硝化剂与溶剂、试剂和催化剂的结合在整个过程中不可避免，则应在原料药和制剂生产中实施适当的控制措施。FDA在21世纪提出“质量源于设计”(quailty by design,Qb D)理念，其被定义为基于一种科学和质量风险管理之上，预先定义好目标产品质量并强调对产品与工艺的理解及控制的一个系统的研发方法。对潜在遗传毒性杂质进行风险评估的策略就是利用质量源于设计提供更详尽的对工艺的理解，最终确定杂质产生的临界区域。Madasu等采用上述策略，设计了氯沙坦钾盐的5步合成法。从设计源头避免并控制杂质的产生，才是控制杂质产生的根本途径。药品在设计生产时，如避免不了杂质的产生，也应尽量控制杂质在最终反应4步以外产生，再设立杂质清除步骤。亚硝胺类遗传毒性杂质分析方法研究进展由于亚硝胺类遗传毒性杂质在极低的浓度就具有较强的毒性，同时该类杂质具有低分子量、高亲水性的特点，是检测的难点。目前关于药物中亚硝胺类杂质的检测方法，主要包括如高效液相色谱-紫外检测器(HPLC-UV)、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)、气相色谱-质谱(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)等。4.1高效液相色谱法高效液相色谱法是药物分析中最为普遍的方法，其具有灵敏度高，专属性好的优点。70%以上的化合物都可以用高效液相色谱分离。由于亚硝胺类遗传毒性杂质的高亲水性，十八烷基硅烷(octadecylsilyl,ODS)或苯基硅烷键合相色谱柱常用于亚硝胺类杂质的分离。常使用的检测器包括紫外检测器、质谱检测器和荧光检测器等。4.1.1紫外检测器由于其简便性和可及性，带紫外的液相色谱可应用于较高浓度的遗传毒性杂质测定的快速筛查和定量。Sayaka-M等采用Inertsil ODS-3柱(150 mm×4.6 mm,5μm,GL Science)建立了高效液相色谱-光电二极管阵列检测器(photo-diode array detector,PDAD)检测缬沙坦中NDMA的定量方法。该方法检测限为0.057～0.17 ppm，定量限为0.19～0.57 ppm。上述方法可用于缬沙坦原料药和市售产品中NDMA杂质的快速筛查和定量。Kunjan等采用C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱建立了HPLC-UV同时测定缬沙坦中6种亚硝胺杂质的定量方法，其检测限为6～13 ppm，定量限为20～41 ppm。范婷婷[21]等采用SHISEIDO C18型色谱柱(4.6 mm×250 mm,5µm)建立了HPLC-PDAD测定缬沙坦中N-二甲基亚硝胺含量。检测限为0.01 ppm，定量限为0.03 ppm。4.1.2荧光检测器与化学发光检测器 当然，紫外检测器用于亚硝胺类杂质的检测存在着很多挑战。首先需要对液相色谱条件优化，比如流动相组成、p H等需要花费较长时间。此外，HPLC-UV方法的检测限和定量限也较高。为了降低检测限和定量限以达到遗传毒性杂质测定的需要，可以通过荧光衍生化法(fluorescence derivatizatio,FLD)或化学发光检测法(HPLC-PR-CL)进行检测。由于亚硝胺类遗传毒性杂质结构中无荧光基团，因此需采用荧光衍生化法进行荧光标记，以提高检测灵敏度。Zhao等采用柱前荧光标记建立了高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)测定食品中N-亚硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine,NPYR)、N-亚硝基二乙胺(N-nitrosodiethylamine,NDEA)、N-亚硝基二丁胺(N-nitrosodibutylamine,NDBA)和N-亚硝基二丙胺(N-nitroso-di-N-propylamine,NDPA)4种亚硝胺杂质方法。该方法检测限在1.3～2.5 ng/L范围内。Takahiro等采用Capcell Pak C18 MGII(5μm,4.6 mm,250 mm或100 mm)色谱柱建立了高效液相色谱-光化学反应-化学发光法(HPLC-PR-CL)分析再生水中NDMA的含量。检测限为2 ng/m L。该方法与固相萃取-气相色谱串联质谱法相比具有相同的准确度。但其具有比该法样品用量小、分析时间快、操作方法简单等优点。上述方法论述了对药品、食品和水中亚硝胺类遗传毒性杂质的检测方法和检测限，检测限可达到1～13 ng/m L不等。可根据遗传毒性杂质的性质和含量选择合适的检测方式。但考虑到遗传毒性杂质的含量通常较低，常规液相色谱法只适用于含量较高的遗传毒性杂质的定量，因此HPLC的检测限也往往达不到要求，需要灵敏度更高的检测器来解决。4.1.3质谱检测器由于较高的灵敏度，LC-MS法已被广泛探索用于分析含量较低的遗传毒性杂质当中。表3总结了FDA先后建立了液相色谱串联高分辨质谱法(liquid chromatography tandem high resolution mass spectrometry,LC-HRMS)对血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物、雷尼替丁、利福平、利福喷丁中遗传毒性药物检测方法。表3 FDA公布亚硝胺类杂质LC-MS检测方法Tab.3 FDA announced nitrosamine impurities LC-MS test method采用电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI)的质谱多为高分辨质谱和串联三重四级杆质谱。F D A公布的几种亚硝胺类遗传毒性杂质的检测方法为高分辨质谱。因其分辨率高、质量精密度高等优点被广泛应用在药品检测中。Wohlfart等通过F D A的方法对1 5批利福平胶囊中的遗传毒性杂质MNP检测。该方法采用标准曲线法定量，检测结果为0.7～5.1 ppm。其中一份样品的测定结果略微大于FDA规定的上限(5 ppm)。同时，该研究指出，FDA采用的外标单点法可能由于个别样品中MNP浓度超过了标准曲线法的线性范围，而导致结果不准确。刘博等建立LC-ESI-HRMS法测定54批盐酸二甲双胍缓释片中7种亚硝胺杂质的检测方法。此外，LC-MRM-MS也广泛应用于药物中遗传毒性杂质的检测中。Tao等建立了HPLC-ESI-MS/MS方法检测30批利福平制剂中遗传毒性杂质MNP的含量。该方法与六通阀切换相结合，避免了利福平进入质谱仪造成污染。采用LC-MS技术对遗传毒性杂质进行检测时，药品中的辅料、杂质可能会对待测成分产生基质效应，对检测结果造成影响。有文献表明，与ESI离子源相比，使用大气压化学电离源(atmosphericpressure chemical ionization,APCI)时，基质效应较小。同时，APCI源的灵敏度要高于ESI源，且APCI源更适合一些难离子化的化合物。APCI离子源在药物杂质检测中应用范围较广，常见的化学药品(雷尼替丁、二甲双胍、沙坦类等)中的亚硝胺化合物都可采用APCI离子源检测。此外，APCI离子源还可用于生物制品中遗传毒性杂质的检测，Luo等采用盐析液液萃取(salting-out liquid-liquid extraction,SALLE)前处理技术建立了SALLE-LC-APCI-MS/MS法测定单克隆抗体中的13种亚硝胺杂质的方法。这是首次为生物制药中亚硝胺遗传毒性杂质的定量提供了一种可靠而灵敏的方法。表4总结了上述文献中亚硝胺类杂质LC-MS检测方法。表4 文献中亚硝胺类杂质LC-MS检测方法Tab.4 nitrosamine impurities in literature LC-MS detection method综上所述，液相色谱串联质谱检测技术由于具有灵敏度高等特点，已成为ppm级别的遗传毒性杂质定量检测的常用方法。色谱柱多采用C18或苯基柱。APCI源和ESI源均可应用于药物中亚硝胺类遗传毒性杂质的检测，但采用APCI源的基质效应风险通常低于采用ESI源。由于遗传毒性杂质含量较低，为了保证较好检测结果，往往需要向质谱中注入较高浓度的样品。但是，对于没有经过前处理的样品，直接进样会使高浓度的主成分进入离子源，对质谱仪造成污染。因此，可以通过固相萃取(solid phase extraction,SPE)、固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)和分散液-液微萃取等方法或阀切换技术连接在线样品处理技术对样品进行前处理。4.1.4气相色谱法 虽然质谱串联热能分析仪(gas chromatography tandem thermal energy analyzer,GC-TEA)联用也可应用于遗传毒性杂质的检测中，但GC-MS更为普遍。表5总结了FDA先后建立的直接进样(direct injection,DI)气相色谱串联质谱法(DI-GC-MS)和顶空(headspace,HS)气相色谱串联质谱法(HS-GC-MS)对沙坦类药物中亚硝胺类遗传毒性药物的检测方法。表5 FDA公布亚硝胺类杂质GC-MS检测方法Tab.5 FDA announced nitrosamine impurities GC-MS detection methodDI-GC-MS精密度较高，重复性好，适合液体进样，但进样时可能会有主成分造成的干扰。目前DI-GC-MS已用于很多药品(缬沙坦、西洛他唑、苹果酸舒尼替尼、奥美沙坦酯、阿莫西林等)中遗传毒性杂质的定量检验。顶空进样法适合挥发性较大的杂质。该方法将样品置于顶空瓶中，只抽取样品中挥发性气体进行测定，大大减少了样品基质对被分析物的干扰。同时，该方法具有无须复杂的前处理过程且操作简单的特点。Wichitnitnithad等建立了HS-GC-MS法检测10批缬沙坦原料药中遗传毒性杂质含量的方法。Lee等建立了无溶剂(SF)-HS-GC/MS对原料药和制剂中NDMA进行检测，与传统的HS-GC/MS和LC-MS/MS方法相比，该法对NDMA的快速筛选更加方便，不需要样品前处理。具有较高的灵敏度和选择性。需要注意的是，无论使用直接进样还是顶空进样，GC-MS最大的挑战在于待测主成分的遗传毒性杂质在高温下有增加的风险。Lim等建立了一种GC-MS/MS同时测定沙坦类、二甲双胍和雷尼替丁等8种药品中遗传毒性杂质的方法。该方法采用沉淀法和固相萃取法进行前处理。该方法在去除药物和辅料的同时，NDMA和NDEA得到了有效的回收。是一种方便可行、灵敏度高、专属性好、准确性和精密度较高的检测方法。该法通过前处理除去了主成分，使得雷尼替丁这种受热易分解的药物也可用GC-MS/MS法检测，为此类药物的检测提供了可替代的方法。Alshehri等建立了HS-SPME-GC-MS法检测雷尼替丁中遗传毒性杂质NDMA。该法采用固相微萃取技术，制备过程简单，采用低温从而避免了雷尼替丁受热分解，可用于其他受热易分解药物的遗传毒性杂质检测。Chang等[29]采用固相萃取前处理法建立了HS-SPME-GC-MS/MS检测44种药物中14种亚硝胺的方法。GC也可与TEA联用，但该仪器价格昂贵，故适用范围比较小。GC-TEA的原理是热能分析仪能特异性催化亚硝胺类化合物裂解成一氧化氮(NO)基团，与臭氧反应后会产生近红外光，利用光电倍增管检测，从而对亚硝胺类化合物的含量进行测定。咸瑞卿等建立了GC-TEA法检测13批缬沙坦原料药及其制剂中NDMA含量。GC-TEA法相对于GC-MS，减少了背景和基质干扰，避免了采用GC-MS法时定性、定量离子保留时间附近有较多干扰峰的问题，保证了低浓度样品的定量准确性。但由于其价格昂贵，通常不作为亚硝胺类杂质的检测方法。表6总结了上述文献中亚硝胺类杂质GC-MS检测方法。表6 文献中亚硝胺类杂质GC-MS检测方法Tab.6 Methods for determination of nitrosamine impurities in literature by GC-MS以上内容总结了近年来气相色谱串联热能分析仪和质谱检测亚硝胺类遗传毒性杂质的分析方法。GC-MS相对于LC-MS具有分析速度快、操作简单、成本低等特点，虽然应用范围较LC-MS窄，主要适用于易挥发性成分的分离检测，但也是遗传毒性杂质检测不可或缺的方法。直接进样法相对于顶空进样法的灵敏度高，但可能会有主成分或者辅料等干扰造成的基质效应，该基质效应是待测样品与硅醇基或玻璃衬管表面金属离子间的相互作用所导致。这些基质成分有利于被测样品转移至检测器，从而导致较高的分析信号。因此，GC-MS中的基质效应更多表现为基质诱导增强效应，产生假阳性。为了避免这种干扰，要考虑色谱条件和前处理方法的优化。选择合适的内标可以校正测量过程产生的误差，是避免基质效应的有效方法。同位素内标法常用于计算检测结果。除此之外，还可采用固相萃取法、沉淀法等除去主成分和辅料的干扰。顶空进样收集挥发性气体进行检测，操作简单，无须前处理。同时结合固相微萃取技术，可显著降低复杂基质的干扰，增加检测灵敏度，并且适用于受热不稳定样品的检测。SPME是一种附加在注射针上的辅助纤维萃取技术，可用于在样品分析前提取目标分析物。SPME结合HS-GC-MS法已广泛应用在遗传毒性杂质检测中。由于微量水平的遗传毒性物质也会对服药者造成不可逆转的危害，可能会引发肿瘤甚至癌症的风险，并且其引发的致癌风险可能与使用的剂量没有相关性，存在遗传毒性化合物在极低剂量水平下导致人体DNA损伤，且该损伤效应有通过遗传物质的复制而不断放大的风险。因此各国监管机构要求对药品中遗传毒性杂质进行严格控制。而对于制剂中的遗传毒性杂质检测，由于成分复杂，制剂中的辅料可能会引起基质效应，从而影响遗传毒性杂质检测结果的准确。目前，多是根据不同品种、不同生产企业去建立相应的检测方法，使得监管效率降低。可以尝试通过在线阀切换、固相萃取等方式建立前处理方法，使得检测方法更有通用性。此外，近年来，随着各国对遗传毒性杂质的研究逐渐深入，对于遗传毒性杂质认知也发生了变化。监管机构对遗传毒性杂质的控制也更加科学、合理。生产企业通过采用“避免-控制-清除”的策略，使实际工艺中所有可能涉及的遗传毒性杂质风险得到明确鉴别和控制，是达到监管期望的有效途径。本文从监管机构对药品中遗传毒性杂质的监管策略、遗传毒性杂质来源、检测方法及清除策略4个方面进行了综述，为药品中遗传毒性杂质的控制/清除、检测提供了参考和依据。文章信息源于公众号药连云科普，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。学如逆水行舟，不进则退；心似平原走马，易放难收。行舟Drug每日更新 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