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本文较长，将分为上下两篇来介绍体内CAR-T的载体对比：AAV/CRISPR vs 慢病毒，关注加收藏，点赞不迷路! 一、In Vivo CAR T重磅消息不断 2025年的In Vivo CAR T重磅消息不断，国际巨头频频出手收购相关公司：2025年3月17日，阿斯利康以10亿美元收购 EsoBiotec；6月30日，艾伯维以21亿美元收购 Capstan Therapeutics；8月21日，吉利德子公司 Kite Pharma以3.5亿美元收购 Interius BioTherapeutics；10月10日，BMS 以15亿美元收购Orbital Therapeutics。 紧接着，2025年11月24日，Kelonia官宣，其研发的KLN-1010 管线1期首批临床结果在2025年美国血液学会(ASH)年会上公布，其披露的摘要聚焦首批3名受试患者的疗效和安全性，整体表现亮眼。 而国内也不断的传来好消息，先是2025年7月2日，武汉协和血液科团队使用普瑞金/EsoBiotec的ESO-T01在复发/难治多发性骨髓瘤的治疗上，也取得了良好的疗效。2025年9月18日，虹信生物和中国科学技术大学附属第一医院合作，在系统性红斑狼疮病的非人类灵长类生物实验和临床实验中，结果预后良好。 2026年1月29日，新年伊始In Vivo CAR T就传来重磅消息，国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）公示，石药控股集团旗下北京抗创联生物制药技术研究有限公司申报的SYS6055注射液临床试验申请获批，标志着中国首款体内CAR-T产品正式进入临床验证阶段。 ▲ 图1：SYS 6055注射液获批信息，来源：CDE官网 ▲ 图2：SYS 6055注射液获批公告，来源：石药集团公告 据石药集团公告，SYS6055注射液采用慢病毒载体在患者体内直接生成靶向CD19的CAR-T细胞，可特异性识别并清除靶细胞，从而达到治疗目的。相比传统CAR-T产品，SYS6055在成本、可及性与即时性方面具备突出优势，不仅有望显著降低生产与治疗费用，还能缩短从诊断到治疗的时间窗口，让更多患者尽早获益。 以病毒作为载体的In Vivo CAR T研究在2026年的好消息还不止如此，2026年2月3日，西湖大学马丽佳实验室发表名为《An AAV variant enables human T cell engineering in vivo》的文章，探讨了AAV作为病毒载体在In Vivo CAR T治疗中的可能性。就在大家还在消化这篇重磅文章的时候，3月18日，来自加州大学旧金山分校和加州大学伯克利分校的团队又在《Nature》上发表《In vivo site-specific engineering to reprogram T cells》，进一步研究了AAV/CRISPR-Cas9这种病毒载体+基因编辑在人源化小鼠中的治疗效果。 2026年3月25日，华中科技大学同济医学院同济医院李春蕊教授团队在《Nature Medicine》发表关于ESO-T01的第二篇临床文献《In vivo generation of anti-BCMA CAR-T cells in relapsed or refractory multiple myeloma: a phase 1 study》，报道了体内生成的抗 BCMA CAR-T 细胞治疗复发或难治性多发性骨髓瘤的 1 期临床试验结果，进一步夯实了以慢病毒作为载体的In Vivo CAR T在血液瘤中的应用。 今天小编就以这两种在基因治疗/细胞治疗中最常见的两种病毒载体——腺相关病毒载体（AAV）和慢病毒载体（LV）为例，以这两篇文章为例，分别比较不同病毒载体在体内治疗的不同点。 二、病毒载体结构 目前成熟的商品化载体以慢病毒载体居多，通常情况下慢病毒载体的外壳蛋白会表达一些用于精准识别T细胞以及避免免疫反应的结合位点，和降低免疫源性的突变包膜蛋白（例如常见的VSVG ——水疱性口炎病毒糖蛋白），而病毒内部则含有可以整合到宿主基因组内的CAR基因（如BCMA CAR）。 以ESO -T01（普瑞金/EsoBiotec）的载体设计与CAR构建体为例，在ESO -T01的载体外壳上设计了四个蛋白：抗TCR纳米抗体（VHH）靶向TCR/CD3复合物以赋予T细胞特异性；突变型 VSVG（ENV）包膜降低了广谱趋向性并减弱免疫原性；高CD47表达可减少单核吞噬细胞系统的清除作用，从而增强持续性和转导效率；MHC I类基因敲除可降低免疫原性及对补体或抗体介导失活的敏感性。而病毒基因组上含有合成T细胞特异性启动子（SYN）可将表达限制于T细胞，而 BCMA CAR骨架源自临床验证的PRG1801第二代 VHH CAR。 通过对ESO -T01的CAR构建体进行分析，该CAR包含抗 BCMA VHH 用于抗原识别、CD8铰链区及跨膜结构域（TMD）以维持结构稳定性、4-1BB共刺激结构域，以及用于T细胞激活的 CD3ζ 信号传导结构域。 ▲ 图3：ESO-T01的载体设计与CAR结构 缩写说明：CAR，嵌合抗原受体； BCMA，B细胞成熟抗原；MHC，主要组织相容性复合体；SYN，合成T细胞特异性启动子；TCR，T细胞受体； VHH，重链抗体可变区； VSVG，水疱性口炎病毒糖蛋白。 目前进入到临床实验的以AAV基因为载体的体内CAR T疗法很少，主要还是因为AAV载体的靶向性以及基因毒性。而AAV/CRISPR-Cas9双载体的探索性实验，则给后续的临床治疗提供了参考，该系统借助 CRISPR -Cas9 系统和腺相关病毒（AAV）介导的同源定向修复（HDR），把 CAR 靶向整合到人类内源性 TCRα 基因座（TRAC）。 通过采用AAV6载体，递送编码无启动子CAR cDNA的 HDR模板，该cDNA两侧分别连接自切割2A肽段及截短型表皮生长因子受体（EGFRt）。该设计可在整合后通过内源性TRAC启动子（T细胞特异性启动子）驱动CAR表达。为构建TRAC-CAR T细胞，将靶向TRAC的Cas9- 包膜递送载体（EDV）与水疱性口炎病毒（VSVG）糖蛋白G31联合使用，并将TRAC-CD19 CAR HDRT （同源定向修复模板）包装于AAV6载体中。 ▲ 图4： 携带Cas9– RNP VSVG -WT包膜递送载体和携带HDRT的AAV6载体LHA，左同源臂；RHA，右同源臂 三、T细胞靶向特异性 如图5和图6所示， ESO -T01的特异性通过载体注射后第7天的流式细胞术进行评估。结果显示， ESO -T01对人源化小鼠外周血中主要免疫细胞群（T细胞、B细胞、CD45阳性细胞及CD56阳性细胞）的CD3+细胞具有剂量依赖性转导作用，且仅发生于T细胞中，非T细胞群中未检测到 BCMA CAR表达。而进一步通过临床实验表明，在 CAR-T细胞扩增高峰期，对患者外周血中脱靶转导的流式细胞术分析。 a-c图显示患者I001–I005在CAR-T细胞达到最大扩增时，CD3⁻淋巴细胞亚群(a)、单核细胞亚群(b)及中性粒细胞亚群(c)中CAR表达的代表性散点图。所有患者中CAR阳性非T细胞比例均低于1%，且多数样本中未检测到CAR信号，表明脱靶转导程度极低。这些数据证实了 ESO -T01载体的体内T细胞特异性。 ▲ 图5：注射后第7天外周血细胞中 BCMA CAR表达情况；来源：DOI：10.1038/s41591-026-04244-6 ▲ 图6： CAR-T细胞扩增高峰期患者外周血中脱靶转导的流式细胞术分析 缩写说明：CAR，嵌合抗原受体；CD3，分化簇3；Lym，淋巴细胞；Mon，单核细胞；Neu，中性粒细胞。 为鉴定调控新进化的 AAV 变体转导的宿主因素，研究人员开展了全基因组 CRISPR 敲除筛选实验。简言之，如图7所示，将扰动T细胞混合群体与表达 GFP 的 AAV 共转导，该 AAV 以AAV6或T细胞进化 AAV 形式包装后，按高 GFP 与低 GFP 分选进行 NGS，经过筛选表明T细胞与 NK 细胞表面表达的跨膜受体CD7为T细胞进化 AAV 转导的主要决定因子。通过敲除了CD7基因以及已知影响 AAV 生物学功能的对照基因（KIAA0319L和参与聚糖生物合成的SLC35B2），进一步验证CD7缺失显著降低了进化变体的转导效率，而AAV6则未受影响。 研究将这种在人类T细胞上进化且靶向CD7的变体命名为 AAV -hT7。在人源化小鼠模型中的生物分布分析显示，AAV6和 AAV -hT7的 AAV 基因组均可被检测到。为进一步提高EDV / AAV 递送系统的选择性，通过引入对 LDLR 受体家族亲和力缺失的突变 VSVG 来限制 EDV 特异性，并添加了兼具靶向和激活功能的抗CD3单链可变片段（scFv）27。为验证递送方法的特异性，研究设计了一项实验：通过HDR41介导，双重 EDV / AAV 治疗可促使无启动子 GFP 特异性整合至广泛表达的网格蛋白A（CLTA）基因第一外显子中。由于 CLTA 在所有细胞类型中均广泛表达， GFP 表达表明其整合是由于同时摄取了 AAV 和 EDV 。通过采用原始 AAV 与进化 AAV 的组合，通过 VSVG 或抗CD3假型EDV载体将 GFP 敲入模板递送至 CLTA ，以实现 CLTA 靶向Cas9– RNP 的递送。 原代人T细胞、 NK 细胞、巨噬细胞、造血干细胞（HSCs）及一组人B细胞癌细胞系（NALM6、SupB15、JeKo1、Raji）均以固定感染复数（MOI，3×10⁵ sgRNA/细胞 EDV ，5×10⁵ vg/细胞 AAV）的 EDV / AAV 组合进行 GFP CLTA 敲入处理，并通过流式细胞术评估表达水平（图7i，j）。然而VSVG /AAV6表现出广泛的趋向性，在所有测试的细胞系中均检测到显著的 GFP +细胞群，而 AAV -hT7完全阻断了对造血干细胞（HSCs）的靶向作用，因此 AAV -hT7/抗CD3- EDV 的联合使用对CD4+和CD8+ T细胞表现出选择靶向性。 ▲ 图7：不同类型VSVG的包膜递送载体在免疫细胞中的分布 四、依科赛OptiVitro® 293无血清病毒包装培养基HE03 OptiVitro® 293无血清病毒包装培养基HE03 ✅ 无血清、无异种成分，化学成分限定。 ✅ 支持多种悬浮293细胞的快速扩增和高密度生长。 ✅ 支持高效转染，高滴度病毒包装（AAV&LV），慢病毒滴度最高可达4.2E+08 TU/ml。 ✅ 完全自主研发，供货稳定，GMP级别， 支持临床申报和商业化。 OptiVitro® 293无血清病毒包装培养基HE03和竞品品牌对比，如图8所示，添加了HA02补料后慢病毒的滴度相对于竞品要高20%以上。 ▲ 图8：OptiVitro® 293无血清病毒包装培养基HE03慢病毒包装对比测试 OptiVitro® 293无血清病毒包装培养基HE03和竞品品牌对比，如图9和图10所示，添加了HA03补料后AAV病毒不仅有更高的滴度，而且空壳率也大大降低了。 ▲ 图9：OptiVitro® 293无血清病毒包装培养基HE03转染后的细胞密度和AAV病毒滴度 ▲ 图10：OptiVitro® 293无血清病毒包装培养基HE03的AAV病毒拷贝数及实心率 OptiVitro® 293细胞无血清培养基HE03专为293细胞悬浮培养而设计，专为293细胞病毒包装而设计，具有高密度生长、高病毒滴度的特点，支持悬浮HEK293T、293F等高效扩增及质粒转染，是病毒包装的生产利器！ 本款产品近期正在进行促销活动，更多详情，请您咨询依科赛销售代表或技术支持。 试用装申请二维码 下期预告 “对于这两种病毒载体的体内CART方法，疗效如何呢?和现在的体外CART疗法对比，有什么不同呢?小编将在下篇为大家进行揭晓，点击关注不迷路。”

说明：欢迎约稿、业务洽谈、媒体合作及行业交流。如需加入行业交流群，或发现内容涉及侵权需修改，请联系小助手微信：Taaslabs18 目前已有多款自体BCMA CAR-T产品（如ide-cel、cilta-cel）在复发/难治性多发性骨髓瘤中显示出深度且持久的疗效。然而，这类传统CAR-T疗法依赖于白细胞分离术、体外细胞工程化改造、清淋化疗等复杂流程，存在制备周期长、患者等待期间疾病进展风险高、可及性差等显著局限。 为突破上述瓶颈，in vivo CAR-T细胞生成技术应运而生。该策略通过直接输注编码CAR的载体，实现患者体内T细胞的原位重编程，理论上可避免体外操作和清淋预处理，极大简化治疗流程、缩短治疗等待时间。 2026 年 3 月 25 日，华中科技大学同济医学院附属同济医院李春蕊教授团队在国际顶尖医学期刊《Nature Medicine》上发表了题为：In vivo generation of anti-BCMA CAR-T cells in relapsed or refractory multiple myeloma: a phase 1 study 的临床研究论文，报道的ESO-T01疗法为2025年阿斯利康收购EsoBiotec公司的临床管线产品，即是一种基于慢病毒载体的体内CAR-T生成平台，其在一项针对复发/难治性多发性骨髓瘤的I期临床试验中首次系统评估了安全性、耐受性及初步疗效。一、ESO-T01的慢病毒载体工程化改造策略 该研究最突出的技术贡献在于对慢病毒载体进行了多层次的工程化改造，以实现高效、特异、安全的体内T细胞靶向。ESO-T01是一种第三代、自我失活、复制缺陷型慢病毒载体，其设计充分体现了“免疫屏蔽”与“T细胞特异性转导”的双重理念。以下从六个关键改造点逐一解读。 ▲ESO-T01 关键特征示意图1. 伪型化：突变VSV-G包膜蛋白 传统慢病毒载体常采用野生型VSV-G包膜，具有广谱嗜性，易转导多种细胞类型，不适合体内T细胞特异性递送。ESO-T01采用了突变型VSV-G包膜蛋白，显著降低了对非靶细胞的转导效率，同时保留了对T细胞的趋向性。这一改造是减少脱靶转导、提升体内安全性的基础。2. 抗TCR纳米抗体介导的T细胞特异性识别 为实现主动靶向，ESO-T01载体表面表达了一种抗TCR（T细胞受体）的纳米抗体（VHH）。该纳米抗体能够特异性识别T细胞表面的TCR/CD3复合物，从而介导载体与T细胞的结合和内化。这一“靶向递送”策略显著提高了载体在体内的T细胞选择性，是区别于传统广谱嗜性慢病毒载体的关键创新点。3. CD47过表达：免疫屏蔽与吞噬逃逸 体内递送慢病毒载体面临的主要挑战之一是单核吞噬细胞系统的清除，尤其是肝脏Kupffer细胞和脾脏巨噬细胞对载体的快速捕获。ESO-T01通过过表达CD47（一种“别吃我”信号分子），与宿主巨噬细胞表面的SIRPα受体结合，抑制吞噬作用，从而延长载体在循环中的半衰期，提高T细胞转导效率。这一策略在非人灵长类动物的肝脏基因治疗中已显示出显著效果，本研究首次在人体CAR-T生成中验证了其可行性。4. MHC-I敲除：降低免疫原性 慢病毒载体本身可能引发宿主适应性免疫应答，尤其是针对载体表面MHC-I分子的T细胞或抗体反应，导致载体被清除或疗效下降。ESO-T01通过基因工程敲除了MHC-I分子的表达，减少了载体被宿主免疫系统识别和攻击的风险。这一改造在体内异体基因治疗中具有重要意义，尤其适用于无需清淋预处理的体内CAR-T生成场景。5. 合成T细胞特异性启动子 ESO-T01采用了一种合成的T细胞特异性启动子（SYN），确保CAR基因仅在T细胞中高效表达，而在其他细胞类型（如抗原呈递细胞、肝细胞、内皮细胞等）中保持沉默。这一设计进一步降低了脱靶表达的风险，是提升载体安全性的关键分子开关。6. CAR结构设计 ESO-T01所编码的CAR（PRG1801）为第二代CAR结构，包含：抗BCMA的纳米抗体（VHH）作为抗原识别区；CD8铰链区和跨膜区；4-1BB共刺激域；CD3ζ信号域。该结构已在临床前和临床研究中被验证具有较好的抗肿瘤活性和持久性。值得注意的是，纳米抗体相较于单链可变区具有更小的分子量、更高的稳定性和更低的免疫原性，适合体内递送。二、临床试验设计与关键结果1. 患者人群与给药方案 该研究为单臂、开放标签的I期试验，共纳入5例男性患者，中位年龄52岁，中位既往治疗线数为3线，均为高度预处理的复发/难治性多发性骨髓瘤患者。所有患者接受单次静脉输注ESO-T01，剂量为0.2×10⁹转导单位，未进行白细胞分离术、体外CAR-T制备或清淋化疗。从入组到输注的中位时间仅为8小时37分钟。 ▼入组患者的基线特征 2. 安全性特征 所有患者均发生了≥3级不良事件，但未观察到剂量限制性毒性。细胞因子释放综合征发生率为80%（4/5），其中3级CRS 3例，均在2天内缓解。1例患者出现1级免疫效应细胞相关神经毒性综合征。最常见的毒性反应为一过性血细胞减少（淋巴细胞减少、血小板减少、中性粒细胞减少）和可逆性肝酶升高。值得注意的是，首例患者（1001）在输注后2小时即出现3级CRS，提示存在超急性炎症反应。研究团队随后修订方案，对后续4例患者给予预防性地塞米松（20 mg，输注前1小时），显著减轻了CRS严重程度，且未影响CAR-T细胞扩增。3. 疗效数据 在数据截止时，中位随访时间为6.0个月，客观缓解率达80%（4/5），其中3例达到严格完全缓解，且所有可评估缓解者（4/4）在第60天均达到10⁻⁵水平的微小残留病阴性。中位至缓解时间为15天，显示出快速起效的特点。患者1003因基线存在髓外病变（脊柱受累），在CAR-T扩增高峰期出现脊髓压迫，于第19天死亡，提示髓外病变可能是体内CAR-T治疗的重要风险因素。 ▲ESO-T01输注后的临床疗效和生物标志物动态4. 药代动力学与免疫动力学 CAR-T细胞最早在输注后第6天可检测到，扩增峰值出现在第10–14天，峰值时CAR-T细胞占CD3⁺ T细胞的比例高达10.6%–59.1%，载体拷贝数达77,000–220,000拷贝/μg gDNA。所有患者均在第10天出现B细胞再生障碍，部分患者在2–6个月后出现B细胞恢复。载体DNA在血液中于第2天可检出，第4天完全清除，未在尿液、唾液或粪便中检测到载体序列，提示脱落风险极低。 ▲ESO-T01 CAR-T 细胞的体内扩增动力学和免疫重建 细胞因子谱呈现独特的双相模式：第一相为输注后24小时内的超急性先天性炎症反应（IL-6、IL-8、TNF、铁蛋白显著升高），与CAR-T扩增无关；第二相为第6–14天出现的适应性免疫应答（sIL-2R、IFNγ、IL-10升高），与CAR-T扩增峰值时间一致。这一模式揭示了体内慢病毒载体递送所引发的先天性免疫激活是CRS的重要驱动因素，与传统体外CAR-T治疗的免疫动力学存在本质差异。5. 脱靶与整合位点分析 流式细胞术检测显示，在CAR-T扩增峰值时，CD3⁻淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞中CAR阳性细胞比例均<1%，未观察到有临床意义的脱靶转导。整合位点分析未发现CAR基因在肿瘤相关基因附近富集，初步支持其良好的遗传安全性。三、讨论与科学启示1. 体内CAR-T生成的生物学独特性 本研究明确表明，体内CAR-T治疗不仅仅是一种制造流程的简化，更是一个具有独特生物学特征的治疗平台。缺乏清淋预处理、载体介导的先天性免疫激活、无体外分化压力的T细胞体内扩增与记忆分化轨迹，均使得其毒性谱、疗效动力学与传统CAR-T存在显著差异。例如，早期CRS可在CAR-T扩增前数小时内发生，提示临床监测需纳入“先天性反应窗口”。2. 慢病毒载体改造的转化价值 ESO-T01的成功验证了多重工程化改造策略在人体内的可行性与安全性。抗TCR纳米抗体、CD47过表达、MHC-I敲除、突变VSV-G、T细胞特异性启动子等技术的协同应用，使得慢病毒载体首次在不使用清淋化疗的情况下，实现高效、特异的体内T细胞编程。这一策略为未来开发针对其他肿瘤或自身免疫性疾病的体内CAR-T疗法提供了可复用的技术框架。3. 安全性风险与优化方向 尽管总体安全性可控，但患者1001的超急性CRS和患者1003的致命性脊髓压迫事件提示了两类关键风险：一是载体本身引发的先天性炎症风暴，二是基线髓外病变在CAR-T扩增期的炎症性水肿或假性进展风险。未来研究可通过进一步优化载体（如减少CpG基序、引入糖基化修饰以逃逸TLR识别）、调整预防性免疫抑制策略、严格筛选入组患者（如排除活动性髓外病变）来降低风险。4. 研究局限性 该研究样本量小（仅5例），为单中心、早期终止试验，缺乏对照组，疗效和安全性数据的可推广性有限。未进行组织活检以评估CAR在肿瘤微环境中的表达，也未能深入解析先天性免疫激活的细胞与分子机制。此外，长期随访数据尚不充分，无法评估插入突变风险或CAR-T持久性与远期疗效的关系。五、结论与展望 这项研究初步证实了其安全性、可行性和抗肿瘤活性，省去了白细胞分离、体外培养和清淋化疗，将治疗准备时间缩短至数小时，极具临床转化潜力。 从技术层面看，ESO-T01的载体设计代表了当前体内基因递送领域的前沿方向，其“免疫屏蔽+主动靶向”策略为下一代体内细胞治疗平台奠定了重要基础。未来研究应聚焦于载体优化（如进一步降低先天性免疫原性）、剂量探索、髓外病变患者的风险分层管理，以及在大样本、多中心、随机对照试验中验证其长期疗效与安全性。 ►►► CGT创新合作交流群 CGT Aisa 亚洲细胞与基因治疗创新峰会旨在搭建高效合作平台， 促进研究人员、临床医生、企业家与投资人之间的深度对话与实质性合作，深入探讨技术创新与临床转化，破解研发、工艺、产业化难题，汇聚各方力量，加速颠覆性疗法上市，使更多疾病得以治愈与改善。 即刻扫码加入 “CGT创新合作交流群” 免责声明： 本文内容来源于官方网站，旨在为大家提供知识共享，不构成任何专业建议。本资料中含少量AI生成内容，同时所涉及的图片、及文字仅供参考，目的是为了将好的内容分享给更多人，版权依旧归原作者所有，若侵犯肖像权或者著作者权等知识产权，请联系我方删除。 信息来源：公众号Biotech视界 END 近期峰会活动 谈思特别推荐 *谈思生物特色社群* 谈思生物聚焦国内外生物医药产业最新动态，专注为细胞治疗、基因治疗、类器官、核酸、疫苗、医美、神经系统、核药、医药制造等细分领域提供线上线下交流分享的专业平台，赋能中国生物医药产业发展，助力打造全球生物医药产业高地。每年谈思生物举办数十场线上线下品牌活动，拥有数十个生物医药行业精品社群，覆盖Novaris、赛诺菲、复宏汉霖、齐鲁制药、药明康德、辉瑞、阿斯利康、百济神州、赛默飞世尔等百家国内外领先的药企、CRO/CDMO等，已经服务上万名生物医药行业上下游从业者。 专属社群：细胞治疗、基因治疗、医美、类器官、核酸药物、生物医药、RNA疫苗、工艺技术、中枢神经系统、核药、医药制造等，现专题社群仍然开放，入满即止。  演讲/赞助/参展/进群/媒体/直播 133 4168 3667 sara.an@taaslabs.com