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点击蓝字，关注我们 毛细管电泳法分析美珀珠单抗纯度 张文华①,于蒙蒙①,杨天一②, 唐 浩②,刘 炬①,倪 明①    作者单位： ①联勤保障部队药品仪器监督检验总站 ②江苏太平洋美诺克生物药业股份有限公司 [摘 要] 目的  验证 CE-SDS 毛细管电泳方法用于美珀珠单抗纯度分析。方法  使用毛细管电泳仪二极管阵列检测器，在还原和非还原条件下对该方法的专属性、重复性、准确性、线性、耐用性进行考察。结果  该方法主峰和面积比的重复性 RSD＜2%，准确性回收率在 90%~110%，峰面积线性回归的相关系数 r＞0.99，专属性和耐用性良好。结论  该方法测量结果可靠，适用于美珀珠单抗的纯度分析；也可为单抗药纯度质控方法的建立和验证提供参考。 [关键词] 毛细管电泳；美珀珠单抗；纯度分析 [中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1008-9926(2026)1-0043-04 [DOI] 10.3969/j.issn.1008-9926.2026.01.010 单克隆抗体（以下简称单抗）药物近年来发展迅速，具有特异性高、作用机制明确、效果显著、不良反应小等优势，广泛应用于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病和器官移植排斥等重大疾病治疗。 美珀珠单抗是抗 CD147 分子的人源化 IgG2 型单抗，可通过阻断 CD147 分子与新型冠状病毒刺突蛋白的相互作用而阻断病毒入侵宿主细胞［1］，是用于治疗重型、危重型新型冠状病毒肺炎(COVID-19)成年患者的潜在候选药物。 纯度是单抗药物关键质量属性的分析重点，对确保抗体药物的安全性和有效性至关重要。十二烷基硫酸钠毛细管电泳(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulface, CE-SDS)在还原和非还原条件下，依据分子量大小，定量测定抗体药物纯度，在抗体药物的质量控制分析中应用日趋广泛［2-4］。CE-SDS 在分辨率、定量准确性及自动化程度等方面有优势，并且可以对单抗非糖基化重链进行准确定量［5］。本研究依据《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）（2020 年版通则 9101）分析方法验证指导原则利用 CE-SDS 方法对美珀珠单抗纯度进行了方法验证［6］。 1 仪器与试药 1.1  仪器   CESI 8000 Plus 毛细管电泳仪〔二极管阵列(PDA)检测器，SCIEX 公司〕，熔融石英毛细管（338451，SCIEX 公司）；SO300D 干式恒温器（赛欧华创公司）。 1.2  试药   注射用美珀珠单抗、参比品（江苏太平洋美诺克生物药业股份有限公司）；碘乙酰胺（I6125-10G，Sigma 公司），β-巯基乙醇（63689-25ML-F，Sigma 公司），SDS-MW Gel Buffer（M305683，SCIEX 公司），10 ku Standard kit（M307631，SCIEX 公司）。 2 方法与结果 2.1  测定方法 2.1.1  溶液配制   SDS-MW 样品缓冲液：称取 1.21 g 的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加水 90 ml，溶解混匀，并用盐酸调 pH 至 9.0；再称取 1.00 g 十二烷基硫酸钠(SDS)加入上述溶液中，溶解混匀，加水至 100 ml，过滤，配制成含 1% SDS 的 0.1 mol·L-1 Tris-HCl 溶液。 酸性冲洗液 0.1 mol·L-1 HCl：取 0.86 ml 浓盐酸加入加有少量超纯水的 100 ml 量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀过滤。 碱性冲洗液 0.1 mol·L-1 NaOH：称取 4 g 氢氧化钠，加超纯水 80 ml，溶解混匀，转移至 100 ml 量瓶，加超纯水稀释至刻度，过滤。 2.1.2  样品制备   采用超纯水将 100 μg 单抗稀释到 30 μl，再加入 65 μl SDS-MW 样品缓冲液，2 μl 10 ku 内参标准品，250 mmol·L-1 碘乙酰胺（非还原条件）或 β-巯基乙醇（还原条件）5 μl，盖紧盖口，充分混匀，6 000✕g 离心 1 min；70 ℃水浴 3 min（非还原条件）或 15 min（还原条件）；取出，冷却至室温，12 000✕g 离心 2 min，取 90 μl 待检测。 2.1.3  电泳条件   毛细管总长 30.2 cm，有效长度 20 cm，内径 50 μm。5 kV 进样 20 s，15 kV 分离 35 min，在波长 220 nm 下进行检测。 2.2  方法验证 2.2.1  专属性   分别采用非还原条件和还原条件处理空白对照（超纯水）、供试品和参比品，并进行电泳。结果显示，空白对照在出现 10 ku Marker 峰之后无明显干扰峰，供试品电泳图谱与参比品电泳图谱一致。美珀珠单抗为 IgG2 型单抗，有 2 个主峰，两种结构均有活性。非还原条件参比品迁移时间分别为 28.083 min（主峰 1）、28.558 min（主峰 2），供试品迁移时间为 27.950 min（主峰 1）和 28.425 min（主峰 2）。还原条件参比品轻链、重链出峰时间分别为 16.417、 20.500 min，供试品轻链、重链出峰时间分别为 15.842、19.833 min。结果表明，本方法专属性良好，见图 1。 2.2.2  重复性   采用 6 份 100%浓度水平的样品检测结果进行评价，考察重复性。在还原和非还原条件下，相对标准偏差均小于 2.0%，重复性良好。见表 1。 2.2.3  准确性   分别制备 50%、100%和 150%水平的供试品样品，每个样品检测 3 次，分析回收率。以 100%供试品水平下的峰面积结果作为基准，则 50%和 150%水平的供试品理论峰面积应分别为 100%水平下的 50%和 150%，用检测值除以该理论峰面积即为回收率。非还原条件下回收率在 97.7%~109.2%，还原条件下回收率在 94.8%~108.5%，准确性良好。见表 2、表 3。 2.2.4  线性   分别制备 50%、75%、100%、125%、150%水平的供试品样品各 2 份，以峰面积和供试品含量水平进行线性回归，采用 Graphpad 进行线性拟合，非还原条件下主峰 1、主峰 2、峰面积和线性拟合后的 R2 分别为 0.998、0.997、0.998。还原条件下轻链、重链、轻链和重链峰面积和线性拟合后的 R2 分别为 0.999、0.997、0.998。R2 均大于 0.99，说明本方法在使用范围内线性良好，见图 2。 2.2.5  耐用性   为考察方法的耐用性，重点对样品处理温度微小变动的影响进行了分析。在 65、70、75 ℃ 3 种处理温度下主峰面积和相对标准偏差为 0.3%，轻重链峰面积和百分比的相对标准偏差为 0.6%，见表 4、表 5。 2.2.6  样品测定   取 3 个批号的注射用美珀珠单抗供试品（批号：G202112001，G202201001，G202201002），按 2.1 项下方法进行测定，结果见表 6。 3 讨论 人 IgG 抗体从结构分，主要有 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 等，人血清中含量最高的抗体是 IgG1，其次是 IgG2、IgG3 和 IgG4。对于 IgG2，由于在 Fab 和 hinge 结构域中存在不同的二硫键，因此存在两种异构体(IgG2A/B)，这决定了与抗原结合时 Fab 结构域的刚性［7］。美珀珠单抗属于 IgG2 型单抗，有 2 个主峰，纯度结果两个主峰面积百分比的和相对稳定，两个主峰各自的面积百分比随着浓度、处理温度不同，比例有所变化，可能是两种异构体有所转换。 目前，单抗药纯度的测定方法主要有高效液相色谱(HPLC)法、凝胶电泳法、毛细管电泳法等。传统的凝胶电泳法准确性和自动化方面存在不足，HPLC 法技术成熟，但样品和溶剂消耗大，毛细管电泳技术以其分辨率高、模式多、低消耗、速度快等优势，该法逐渐成为单抗药物纯度分析的优选方法，被越来越多的药企采用，也被包括我国在内的多国药典认可［8］。 IgG2 型抗体因其独特的结构，在纯度分析上面临特异性挑战。监管机构（如 FDA，EMA）推荐使用正交方法进行单抗纯度鉴定，CE 与 HPLC 的分离机理不同，能够发现 HPLC 可能无法检测到的杂质，为 IgG2 型抗体质量属性提供更全面的支持。本研究对使用 CE 研究方法进行 IgG2 型抗体质量控制提供参考。毛细管电泳技术不仅应用于单抗药的纯度、等电点及电荷异质性、糖型等分析中，而且随着蛋白药物、细胞/基因治疗药物以及新型疫苗等生物制品的不断发展，将会有更大的应用空间，提高生物制品的有效性和安全性［9］。 参考文献 ［1］尉 丁, 张 征, 郑朝辉, 等. 美珀珠单抗治疗新型冠状病毒感染的多中心、双盲、随机、安慰剂对照的加载Ⅱ/Ⅲ期临床试验［J］. 空军军医大学学报, 2023, 44(7): 589-601. ［2］黄碧君, 黄 艳, 胡红琴, 等. 毛细管电泳法测定重组人源化 IgG2 抗体的纯度［J］. 中国生物制品学杂志, 2018, 31(3): 287-293, 298. ［3］麻 旭, 屈 晨, 田 橙, 等. 毛细管电泳法检测含聚乙二醇的曲妥珠单抗的纯度［J］. 河南师范大学学报(自然科学版), 2021, 49(3): 72-77. ［4］段 颖, 谭澄莹, 李国柱, 等. 毛细管电泳法分析 IgG4  型生物类似药纯度［J］. 工业微生物, 2023, 53(5): 122-124. ［5］LI M, YU C, WANG W, et al. Interlaboratory method validation of capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate (CE-SDS) methodology for analysis of mAbs［J］. Electrophoresis, 2021, 42(19): 1900-1913.  ［6］国家药典委员会. 中华人民共和国药典（四部）［S］. 北京：中国医药科技出版社, 2020: 480-483. ［7］TAEYE S W D, RISPENS T, VIDARSSON G. The ligands for human igg and their effector functions［J］. Antibodies, 2019, 8(2): 30.  ［8］陈泓序, 屈 锋. 毛细管电泳技术在单克隆抗体药物分析中的应用［J］. 色谱, 2018, 36(3): 195-208. ［9］沈 娟, 刘 炬, 于蒙蒙, 等. 抗体偶联药物组成及质量控制概述［J］. 解放军药学学报, 2025, 38(2): 209-215. 欢迎点击关注 解放军药学学报 END