SYNB-1891

摘要 合成生物学领域的稳步发展，使科学家能够以基因工程细胞而非小分子或生物制剂为基础开发新型疗法。赋予合成基因回路的细胞，可响应特定疾病生物标志物，对治疗作用的定位、时机和剂量进行精准调控，为疾病治疗提供了强大的新型工具。本文阐述了合成生物学方法如何应用于编程细胞以赋予治疗功能，探讨了其相较于传统疗法在灵活性、特异性和可预测性方面的优势，以及开发过程中面临的挑战。我们重点介绍了工程细胞构建的重大进展——这类细胞携带的合成基因回路，能够对细胞内或细胞外生物标志物产生的信号进行生物传感和计算处理。根据细胞载体（人类细胞或微生物细胞）以及工程细胞在人体宿主内发挥治疗作用的部位，对相关研究进展进行分类和描述。利用合成生物学设计细胞疗法是医学领域快速发展的策略，有望为多种人类疾病开发有效的治疗方案。 在过去的一个世纪里，新疗法的开发主要依赖合成化学方法，设计和优化具有药用潜力的生物活性分子。这一过程通常包括先导化合物功能化和筛选的循环迭代，以逐步提升其疗效、安全性和药代动力学特征。尽管这种方法已成功发现并开发出许多改变生命的重要药物，但在众多人类疾病中，仍存在大量未被满足的临床需求，需要超越小分子和蛋白质工程疗法的创新策略。近年来，合成生物学的出现改变了生命科学家和生物工程师设计治疗剂的思路——以活细胞而非化合物为载体开发新型药物。与药物化学方法类似，合成生物学方法通过引入合成基因回路，对多种细胞类型进行功能改造，生成工程化活体疗法（ELTs）（图1）。 图1 赋予生物载体治疗功能 小分子和蛋白质类生物制剂（左）传统上作为开发新型治疗剂的载体。这类分子的内在生物活性通常通过药物化学、蛋白质工程和/或药物递送方法进行增强，以实现治疗效果和安全性。合成生物学的出现及其向细胞中编程新功能的能力，为开发新型疗法提供了机遇。与先导小分子和蛋白质类似，活细胞具有天然生物活性，可用于治疗应用。多种人类细胞类型和人类相关微生物（右）可作为活体载体，构建赋予其治疗功能的遗传程序。药代动力学/药效学（PK/PD）。 合成生物学是本世纪初兴起的一门令人振奋的学科，它结合分子生物学工具与正向工程原理，构建能够编程特定细胞行为的遗传系统。该学科以基因和蛋白质相互作用形成的遗传回路为基础——这些回路支撑着细胞的内在功能以及细胞对环境的响应。遗传回路可拆解为具有明确输入和输出的简单功能单元或模块；例如，翻译过程可视为一个双输入（mRNA和核糖体）、单输出（蛋白质）的功能模块。得益于这种模块化特性，系统的整体行为可表示为一系列相互关联的操作组合（专栏1）。借助这一框架，合成生物学家可利用已表征的遗传元件，独立设计、测试和表征新型功能模块。重要的是，组成这些模块的元件之间的相互作用可通过成熟的数学模型进行描述，从而实现基于模型的设计方法，将功能模块整合为更复杂的合成基因回路。尽管目前已构建的许多合成基因回路仍处于概念验证阶段，但该领域已朝着应用导向设计迈进，有望在新型疗法开发中取得重大突破。 专栏1 遗传逻辑门 为实现预期的细胞响应，可设计布尔逻辑门处理多个输入，并根据数字逻辑规则生成输出。可通过可控输入、运算和输出模块的组合构建生物逻辑门回路，在DNA、RNA和蛋白质水平产生预期结果。作为说明性示例（见图），我们展示了如何将使用小分子调节剂的输入模块与基于转录激活因子或抑制因子的运算模块组合，创建开启（1）或关闭（0）输出模块表达的逻辑门。最简单的运算是“是”门（YES gate），其输出与输入相同。当输入信号的存在抑制控制输出基因的转录抑制因子的表达和/或活性时，可实现这一运算。相反的运算（将信号反转，即“非”门（NOT gate））可在输入的存在激活控制输出的转录抑制因子的表达和/或活性时获得。“是”门和“非”门是单输入布尔运算，已广泛用于控制基因表达，并可分层产生具有多个输入的更复杂逻辑门回路。“与”门（AND gate）需要所有输入存在才能开启输出信号，可通过组合“是”门构建。在我们的示例中，“与”门通过使用两个基于转录抑制因子的“是”门实现，其操纵子序列调节输出模块中单个启动子（P）的活性。另一种用于基因表达稳健控制的有用运算是“或”门（OR gate），仅当所有输入不存在时才关闭输出信号。当置于输出模块上游时，两组独立的转录激活因子及其同源启动子可作为“或”门。此外，可基于上述逻辑组合创建更复杂的逻辑门，例如，将“与”门与“非”门连接可构建“与非”门（NAND gate），将“或”门与“非”门分层可构建“或非”门（NOR gate）。 遗传回路的结构通常可分为三个基本模块。首先是输入模块，负责检测生物或非生物信号，并将其转化为可解读的分子信号。例如，膜相关传感器蛋白与下游响应调节因子的偶联，可将配体结合事件转化为可控的磷酸化信号级联反应。其次是运算模块，对输入模块传递的信号进行计算，并确定相应的细胞行为。最常见的是利用布尔逻辑门处理单个或多个输入，以产生预期的基因表达结果（专栏1）。最后是输出模块，将计算后的信号转化为预期的细胞响应。在治疗应用中，输出模块通常是编码生物效应分子（如酶、细胞因子或细胞受体）的基因。这些模块的组合与整合，能够构建复杂的合成系统，对细胞整体行为进行重编程，以满足预期应用需求（图2）。 要开发动态的活体疗法，工程细胞必须能够感知并响应环境信号——这些信号包含细胞定位、相关疾病状态以及启动适当治疗响应时机的信息。为此，合成基因回路需包含传感元件、信号处理/转导元件和控制元件，以调控预期的动态响应。环境和疾病生物标志物为传感模块提供初始输入，以区分疾病状态和正常状态（图2）。传感模块可能相对简单，例如直接激活转录因子以驱动输出模块中的转录响应。然而，要产生精准响应，先进的传感模块需将复杂的信号转导通路与多个控制元件相结合，对输出信号进行微调。将这些模块分层构建为逻辑门，是调控响应时机、增强信号强度和提高输出模块灵敏度的有效方式（图2）。 图2 利用工程化遗传回路开发活体疗法 导入活细胞的遗传回路组件被组织为具有明确输入和输出的功能模块。这些传感模块的初始输入可能包括环境或疾病生物标志物。识别这些标志物后，输出模块可启动一系列程序化响应，驱动工程细胞的治疗行为。例如，血糖升高可作为输入信号，通过葡萄糖转运蛋白及其信号级联反应被感知，进而驱动胰岛素表达。胰岛素释放后血糖水平下降，通过反馈控制负向调控回路活性。这些传感和处理模块的结构可包含多种逻辑门（专栏1），以明确治疗响应的灵敏度、灵活性、强度和时机。P：启动子。 合成基因回路的应用是细胞疗法的重要特征，这类策略可解决传统疗法的一些显著局限性，即缺乏灵活性、特异性和可预测性（专栏2）。在过去十年中，越来越复杂的遗传设计层出不穷，用于重编程细胞以实现治疗应用。这些研究主要集中在哺乳动物细胞和细菌上——两者遵循相似的基本原理，但工程化策略所依赖的分子工具包有所不同。本文重点介绍采用合成生物学方法编程细胞行为的工程细胞疗法相关研究，聚焦于对细胞内或细胞外生物标志物产生的信号进行生物传感和计算处理，并最终执行明确治疗程序的研究工作。文中案例根据细胞载体的生理特性进行分类——这些载体适用于构建治疗平台，即具有遗传可操作性的人类细胞和人类相关细菌。 专栏2 通过合成生物学解决传统疗法的局限性 灵活性 传统疗法的一个根本局限性在于其僵化的作用机制。小分子和生物制剂通常靶向疾病相关细胞或蛋白质，以调节其活性或可用性，而合成基因回路可使工程化细胞响应各种化学、生物或环境信号，执行多种效应机制。生物学的模块化特性允许重新连接合成系统中的输入-输出关系，提供标准药物无法实现的动态治疗选择。模块化是许多合成生物学设计的基础；体现灵活疗法实用性的合成生物学平台包括将内源性信号通路与用户定义疗法耦合的合成启动子，以及具有可互换抗原结合域的通用嵌合抗原受体（CAR）设计。 特异性 疗法区分健康状态和疾病状态的能力，对于引发安全有效的响应至关重要。传统疗法在很大程度上依赖单一疾病相关特征来驱动效应器响应。然而，许多疾病状态无法仅通过一个元件来定义或识别。合成生物学系统通过整合多个状态相关信号来递送治疗输出，从而实现增强的特异性。利用输入组合来提高治疗特异性的设计包括基于疾病相关细胞内微小RNA、转录因子或细胞表面抗原的双输入“与”门，以及基于疾病组织特性的治疗剂局部产生。 可预测性和可控性 治疗复杂疾病的不可预测结果是一项重大的生物医学挑战。特别是对于治疗指数有限的疗法，当面临患者间和患者内异质性时，很难在个体间和长期内实现疗效和毒性的最佳平衡。合成生物学系统的“感知-响应”能力，使工程化活体疗法（ELTs）能够原位适应扰动并提供定制化响应。适应性基因回路已应用于治疗应用。值得注意的例子包括调节激素和代谢物水平的反馈控制合成基因网络、炎症驱动的免疫调节细胞因子产生、小分子控制的CAR活性，以及基于积累溶菌因子群体感应的自我调节群体控制。 首先，我们将阐述如何运用不同的合成生物学方法，对组织驻留型、可植入型或具有全身循环能力的人类细胞类型进行功能改造。对于循环细胞类型，我们重点关注工程化T细胞——这类细胞携带的合成基因回路，能够为其治疗程序赋予可控性、灵活性和特异性。随后，我们将介绍基于微生物细胞的活体生物疗法构建进展，以及为肠道和肿瘤相关细菌设计的“感知-响应”系统案例。除了呈现合成生物学的研究进展，我们还将探讨工程化细胞疗法在生产和临床开发方面的考量。最后，我们分析了能够提供自主、正交和持久治疗程序的工程细胞的未来发展前景。 人类治疗细胞的编程改造 以人类细胞作为工程基因回路的载体，是生物工程领域的重大进步——通过基因载体，可在原位或体外对细胞进行复杂的治疗性干预。向患者细胞中导入合成构建体可采用病毒或非病毒方法；或者，在体外向人类组织引入基因回路，可在隔离环境中进行精准操作。人类细胞不仅是异物性最低的细胞载体，还能为外源治疗程序提供天然的细胞内环境，促进其与生理相关分子过程（如翻译后修饰）以及与疾病治疗直接相关的生化通路（如致癌信号通路）的整合。以下讨论的合成生物回路已被开发用于治疗癌症和代谢性疾病，并根据细胞载体的定位分为组织驻留型、可植入型和循环型治疗细胞。 组织驻留型工程细胞 对细胞进行重编程以实现治疗用途的早期尝试，源于插入回路以控制目标细胞对预设输入信号的生物活性（图3）。在这些案例中，细胞被编程为检测、整合并响应细胞内微环境中的生物信号。这一概念现已应用于细胞状态的识别和区分，例如恶性与非恶性行为。通常，这需要将合成基因回路的生物分子组进行索引和整合，形成“分类器”，并基于整合结果在宿主细胞中引发适当响应。例如，可实现“若为恶性则触发凋亡通路”的逻辑。区分非恶性细胞与宫颈癌细胞（HeLa细胞）的研究，是细胞分类器概念的早期概念验证。研究人员选择了一组在HeLa细胞中高表达（HeLa高表达）或缺失（HeLa低表达）的微小RNA（miRNAs），并通过在关键回路组件的转录本中编码相应的miRNA结合位点，构建了双反转回路。HeLa低表达的miRNAs直接降解输出基因（凋亡因子BAX）的转录本，而HeLa高表达的miRNAs降解BAX的抑制因子BCL-2，从而允许输出基因表达。由此产生的“分类器”回路根据检测到的细胞状态产生两种截然不同的结果：在存在HeLa高表达标志物的情况下，输出基因（此处为BAX）表达；在不存在这些标志物的情况下，输出基因受到抑制（图3a）。在功能上，当将整个回路导入相应细胞时，这种遗传结构设计使HeLa细胞相较于非恶性HEK293细胞更易发生凋亡。 图3 | 用于体内疾病治疗的细菌疗法。a | 兼性厌氧细菌已被工程化改造，可通过感知缺氧或葡萄糖浓度降低等多种肿瘤特异性信号，定植于肿瘤环境中（其中可能包含肿瘤特异性微生物组群落，以蓝色和绿色矩形表示）。这会触发宿主免疫防御的激活，进而促进肿瘤细胞的破坏（步骤1）。还采用了额外的回路，当细菌密度达到特定水平时特异性触发自溶（步骤2）。这使得组成型表达的效应分子能够在肿瘤微环境中递送。b | 作为治疗由苯丙氨酸代谢酶缺陷引起的苯丙酮尿症的一种潜在方案，大肠杆菌已通过代谢工程改造以增加L-苯丙氨酸（L-Phe）的同化作用，形成反式肉桂酸，在小鼠模型中降低血液L-苯丙氨酸水平。周质相关酶L-氨基酸脱氨酶的表达也可通过将L-苯丙氨酸转化为苯丙酮酸来降低血液L-苯丙氨酸水平。这为一项临床试验奠定了基础，该试验研究了使用工程化细菌治疗苯丙氨酸代谢酶缺陷患者的苯丙酮尿症。c | 在共培养实验中，大肠杆菌Nissle被证实可降低致病性铜绿假单胞菌的存活率，并在小鼠肠道中抑制致病性铜绿假单胞菌的定植。在目标来源的群体感应分子存在时，这种“感知-杀伤”菌株会表达多个受PluxR启动子调控的效应基因。具体而言，DspB可破坏目标生物膜；抗菌剂紫菌素S5在E7裂解蛋白裂解宿主细胞后产生并释放到环境中。为实现生物遏制，由于丙氨酸消旋酶基因alr和dadX的缺失，该工程化菌株的生长需要外源D-丙氨酸。d | 大肠杆菌已被工程化改造，可递送编码RNA引导核酸酶的质粒，以切割肠出血性大肠杆菌中的抗生素抗性基因。在这项特定研究中，使用了II型CRISPR-Cas系统来切割目标DNA序列。AHL=酰基高丝氨酸内酯。 另一种感知细胞内过程的实验策略是调控RNA剪接——只有发生剪接，输出基因才能被翻译。在此策略中，将特定输入蛋白配体结合后可增强剪接的RNA适体，以及编码终止密码子的外显子，插入输出蛋白的外显子之间。当目标蛋白与适体结合时，会产生可翻译输出蛋白的可变剪接转录本。初步概念验证已在肿瘤坏死因子（TNF）-核因子-κB（NF-κB）和β-连环蛋白通路等输入信号中得到证实。在这些研究中，当适体与其同源因子（如NF-κB或β-连环蛋白）结合时，剪接转录本会产生单纯疱疹病毒胸苷激酶，该酶使细胞对前药更昔洛韦敏感。这些回路通过检测输入信号，使细胞产生非天然药物敏感性，可用于诱导表达疾病特异性细胞内蛋白的靶细胞死亡。 上述早期合成基因回路的主要测试领域是癌症研究。真核细胞的恶性转化可通过遗传和表观遗传变化表征——这些变化导致异常转录状态，进而引发不受控制的细胞增殖。此外，癌细胞必须通过破坏和逃避多种免疫通路，逃避免疫监视。这些艰巨的治疗挑战对传统治疗方式构成了巨大障碍，而合成生物学则是一种理想的补充方法。可设计能够区分正常细胞和转化细胞状态的基因回路，并产生治疗分子，通过激活组合抗肿瘤免疫通路特异性杀伤癌细胞。尼斯姆等人描述了一种此类癌症免疫治疗平台，该平台将“分类器”模块与产生治疗性免疫调节蛋白的“效应器”模块相结合。有效区分肿瘤样细胞和正常细胞对于降低脱靶毒性至关重要（专栏2），因此多输入布尔逻辑门是提高回路特异性的理想工程策略。例如，可设计一个“与”门（AND gate）：输入启动子1（P1）调控编码输出蛋白（或多个蛋白）的自抑制mRNA，而输入启动子2（P2）调控解除自抑制的RNA分子，从而允许输出基因表达。P1和P2由不同的肿瘤相关转录因子激活，当两者共同表达时，足以明确恶性细胞状态。在尼斯姆等人开发的系统中，P1和P2分别由致癌转录因子MYC和E2F1驱动，输出模块包含T细胞衔接子、趋化因子（CC趋化因子配体21（CCL21））、细胞因子（IL-12）和抗程序性死亡蛋白1（PD1）单链可变片段（scFv），有望激活多种抗肿瘤免疫机制。关键在于，细胞中P1和P2必须同时激活才能引发输出反应。因此，通过组合两个在正常细胞中不太可能同时激活的肿瘤相关合成启动子，最大限度地降低了脱靶活性。以高通量方式发现状态特异性合成启动子，将有助于转录调控逻辑门在细胞和基因治疗中的广泛应用。 尼斯姆等人开发的回路结构结合了多种合成生物学方法，在小鼠肿瘤模型中显示出令人鼓舞的疗效。然而，其中一些系统需要向原位细胞递送大型治疗基因回路，这在临床应用中构成了根本性限制。病毒和非病毒基因递送技术的改进，未来可能有助于解决体内回路导入的挑战，相关内容已有详细综述。尽管如此，设计具有实施可行性的合成生物系统仍至关重要。钟等人利用ERBB受体的致癌信号作为癌症特异性特征，设计了与ERBB蛋白上磷酸酪氨酸位点结合的模块。其中一个磷酸化ERBB结合模块与蛋白酶融合，另一个与可切割底物融合。过度活跃的ERBB信号促进两个模块共定位，释放效应蛋白BH3相互作用域死亡激动剂（BID）以诱导凋亡。值得注意的是，其设计的紧凑性使得整个系统可通过腺相关病毒载体递送。与正常细胞（该通路仅短暂激活）相比，该系统更倾向于触发具有组成型激活ERBB信号的癌细胞中促凋亡蛋白BID的表达。基于蛋白酶的回路也已应用于其他系统。 可植入型工程细胞 与原位工程化组织驻留细胞不同，可植入型细胞可在体外进行工程改造——在体外环境中，更多适用的基因递送方法可用于导入复杂回路（图3）。上述部分案例中的工程回路仅能在有限的预设细胞状态之一中发挥作用，无法动态适应不断变化的环境条件。尽管这种设计使系统相对简单，但在不可预测的临床环境中应用时存在实际限制——这是传统疗法共有的局限性（专栏2）。因此，能够响应循环生物分子、药物或代谢产物等外部输入来调控回路活性的设计具有重要吸引力。有人提出了人工基因网络装置的解决方案，适用于疾病状态下目标分子存在于循环系统中的场景。 正常的生理功能通常要求关键代谢或内分泌因子维持在特定的稳态范围内。控制这些关键因子水平的天然正负反馈回路遭到破坏，可能导致疾病（例如，糖尿病是由于胰岛素水平不足以调节血糖所致）。治疗这类疾病需要持续控制目标生理产物的生物利用度。因此，对于给药后独立于生理环境发挥作用的药物而言，实现可预测的治疗效果具有挑战性。如下文所述，多项整合生理反馈回路的合成基因回路，已成功在临床前疾病模型中重建正常稳态。 调节尿酸水平是人工基因网络装置的首批应用之一——这类装置能够感知并响应循环代谢产物。尿酸是嘌呤代谢的终产物，在痛风等高尿酸血症相关疾病中，尿酸过度产生和/或无法有效排泄，导致其积累至致病水平。尿酸还可保护细胞成分免受自由基引起的氧化损伤。因此，与仅降低尿酸水平的传统药物干预相比，合成反馈模块可能提供更动态、更优的调控效果。在该策略中，传感盒包含细菌转录抑制因子HucR，在没有尿酸的情况下，HucR与DNA操纵序列基序hucO结合；当存在尿酸时，HucR与DNA解离，允许下游基因表达。该尿酸传感模块与编码尿酸氧化酶（降解尿酸的酶）的第二个构建体相连。将这两个模块以及人类尿酸转运蛋白转染到HeLa细胞中，随后将细胞微囊化在海藻酸盐-聚L-赖氨酸-海藻酸盐胶囊中，并腹腔注射到尿酸氧化酶缺陷小鼠体内。值得注意的是，这些小鼠体内原本高水平的循环尿酸在长达7天的时间内降至生理水平。 此外，通过合成反馈回路工程改造的可植入细胞，已应用于甲状腺激素和血糖调控，分别有望用于治疗甲亢和糖尿病。通过抗甲状腺药物或甲状腺切除术治疗甲亢，往往会导致甲减。为解决这一问题，萨克塞纳等人利用甲状腺激素结合核受体设计了合成反馈回路——配体结合后，该受体驱动甲状腺激素产生负调控因子的表达。同样，抗糖尿病药物可降低血糖浓度，但可能导致不同严重程度的低血糖。谢等人利用钙响应性活化T细胞核因子（NFAT）驱动的启动子和异位表达的钙通道，在HEK293细胞中设计了血糖传感回路，该回路与细胞系的内源性通路相连。血糖升高通过增加细胞内ATP触发钙内流，进而调控膜电位和电压门控钙通道激活。NFAT启动子驱动胰岛素表达，形成合成反馈回路。在这两个案例中，工程细胞被微囊化并植入小鼠体内，在实验诱导的病理状态下，成功将循环甲状腺激素或血糖恢复至生理水平。 具有反馈功能的合成基因回路还可用于严格调控具有严重毒性的治疗蛋白的表达。肝细胞生长因子（HGF）可刺激肝脏再生，可用于治疗肝损伤。然而，HGF也是一种致癌因子，这限制了其治疗窗口。白等人利用自调控反馈系统，将血清胆汁酸升高与HGF产生相结合，开发了肝损伤疗法。多种肝脏疾病会损害肝脏清除胆汁酸的能力，因此高血清胆汁酸可作为肝功能障碍的指标（图3b）。将胆汁酸的同源G蛋白偶联受体（GPCR）TGR5，以及由GPCR下游效应因子CREB1激活驱动HGF表达的模块，转染到HEK293细胞中。该回路以剂量依赖方式被胆汁酸激活。在体内植入后，该系统仅在实验诱导肝毒性时产生HGF，在胆汁酸稳态水平下不产生；这种工程细胞疗法还改善了诱导的肝损伤。 遵循类似的“感知-响应”策略，合成基因回路已应用于银屑病治疗——该回路将针对两种疾病相关细胞因子（TNF和IL-22）的“与”门传感模块相连。该顺序“与”门通过感知TNF信号的NF-κB驱动启动子表达IL-22受体（IL-22R），同时通过响应IL-22R信号的STAT3驱动启动子产生免疫调节细胞因子IL-4和IL-10。在该系统中，仅当TNF和IL-22同时存在时，才会产生IL-4和IL-10。将转染了合成基因回路的HEK293细胞微囊化在海藻酸盐中并植入小鼠体内，随后通过实验诱导皮肤炎症。在这些条件下，携带植入式合成基因回路的小鼠皮肤炎症减轻，促炎细胞因子水平降低。 这些可植入系统要从实验环境成功转化至临床应用，关键在于植入细胞在特定体腔或靶器官中的持续活性——宿主的异物免疫反应往往会影响其疗效。尽管对异物反应和纤维化的理解尚未完全明确，但目前已知巨噬细胞等先天免疫细胞参与其中，集落刺激因子1受体（CSF1R）是关键的信号介质；血管内皮生长因子（VEGF）也可能是该反应的促成因素之一。有趣的是，尺寸和形状在水凝胶、陶瓷、金属和塑料等多种生物材料中都至关重要——直径≥1.5毫米的球体可在啮齿动物和非人灵长类动物中避免异物反应。值得注意的是，封装在1.5毫米海藻酸盐胶囊中的大鼠胰岛细胞，诱导异物反应和纤维化的能力较弱，能够在糖尿病小鼠体内将循环血糖维持在正常水平长达6个月。通过海藻酸盐的组合化学修饰，已探索了进一步优化植入策略的方法，这可能产生更有效的基质，避免异物反应并改善植入产品的长期性能，以实现临床转化。 循环型工程细胞 在癌症治疗领域，基因重编程细胞疗法提供了一种额外的治疗途径——可在实验室中对细胞进行工程改造，再输注给患者。输注的细胞可迁移至肿瘤部位，以组成型方式、依赖环境信号的上下文依赖方式，或响应外源输入的方式递送工程化载荷。 工程化嵌合抗原受体（CAR）T细胞是该框架的成熟案例，在血液系统恶性肿瘤中已显示出显著的临床活性。尽管CAR-T细胞疗法的治疗益处不容忽视，但诸如毒性缺乏控制、难以适应不断变化的病理状态以及肿瘤特异性不足等问题，限制了其在患者中的应用。由于CAR-T技术已有大量综述，本文重点介绍合成生物学如何通过解决工程化T细胞中的这些挑战，推动下一代产品的开发（专栏2；表1）。 **可控性CAR-T细胞**：目前获批的CAR以组成型方式合成，持续结合靶标，与免疫介导毒性的严重程度无关。因此，能够调控CAR表达和滴定的方法是一项重要进展。在此类设计中，目标蛋白可仅在外源提供的药物配体存在时实现去稳定化（关闭开关）或稳定化（开启开关）。将该策略应用于CAR-T细胞时，在过度激活期间，可通过给药（关闭开关）或停药（开启开关）主动降解CAR，以减弱响应（图4a）。或者，可通过拆分抗原识别结构域和细胞内信号结构域设计开启开关型CAR，添加小分子后可诱导两者二聚化。在基于稳定性和异二聚化的设计中，细胞可长期循环，且可按需开启和关闭，这相较于自杀基因等永久性关闭系统具有明显优势。除了通过小分子控制CAR活性外，还开发了通过热、超声、光和氧气浓度调控CAR表达的替代方法。 图4 携带工程化遗传回路的人类循环CAR-T细胞疗法 循环型工程化嵌合抗原受体（CAR）-T细胞可设计为具有细胞疗法的可控性、灵活性和特异性。a | 可控性CAR-T细胞：外源可溶性配体可通过刺激CAR表达或CAR二聚化，实现CAR-T细胞活性的开启和关闭。通过这种方式，CAR活性通过两种输入得到更好的控制：抗原和小分子配体。与配体诱导降解（LID）结构域序列融合的CAR，是提高可控性的一个案例。b | 灵活性CAR-T细胞：为拓宽CAR-T细胞识别多种肿瘤相关抗原（TAAs）的灵活性，可设计嵌合受体靶向与肿瘤靶向单克隆抗体偶联的适配体分子。c | 选择性CAR-T细胞：为提高CAR-T细胞的特异性并最大限度降低其对健康组织的脱靶效应，可工程化具有多种输入的不同逻辑门，以驱动CAR-T细胞活性。这一方法包括“与”门（同时或顺序）、“非”门和组合模块。在图示案例中，具有多抗原识别“非”门的双CAR-T细胞，表达针对TAA（橙色）的CAR1和针对正常组织抗原（粉色）的CAR2。CAR-T细胞选择性杀伤表达TAA的肿瘤靶细胞，而共表达正常组织抗原的健康脱靶细胞则抑制CAR-T细胞的激活和细胞毒性。 **灵活性CAR-T细胞**：当前的自体细胞疗法生产成本高昂，而在疾病抗原谱不断变化的情况下，无需替换整个细胞载体即可改变其作用机制的设计具有显著优势。为拓宽CAR-T细胞抗原特异性的灵活性，可通过共表达多个CAR，或在单个CAR中连接多个scFv以实现“或”门识别，使细胞能够靶向多个靶标。也可通过肿瘤相关抗原（TAA）特异性单克隆抗体（mAb）引导嵌合受体。这通过模块化设计实现——CAR靶向与肿瘤靶向mAb偶联的适配体分子（图4b）。这些方法具有模块化和通用性，因为通过简单切换引导模块（TAA特异性mAb或TAA特异性scFv），单个通用CAR可用于多种肿瘤靶标。 **选择性CAR-T细胞**：由于大多数TAA并非肿瘤特有，在健康组织中也可能存在，因此脱靶/靶向毒性成为当前工程化T细胞疗法的根本性限制。通过“与”门或“非”门方式靶向多个共表达抗原，可提高特异性（图4c）。有关组合抗原识别的详细讨论，读者可参考其他相关综述。谨慎选择合适的抗原组合，对于两种逻辑门控CAR-T细胞策略都至关重要，而对健康组织和恶性组织中候选抗原表达模式的系统分析，将在靶抗原最优组合的选择中发挥核心作用。除上述肿瘤学应用外，通过逻辑门控合成基因回路工程改造的细胞疗法，还可应用于自身免疫性疾病的治疗——在这类疾病中，单一炎症因子不足以明确病变部位。 **整合可控性、灵活性和选择性的CAR-T细胞**：在上述案例中，合成生物学方法可能分别解决控制、灵活性或特异性方面的不同问题。因此，能够同时改善所有这些特性的CAR系统极具吸引力，且已有初步尝试开发能够动态调谐、切换组合抗原和控制细胞类型响应的系统。 治疗性细菌细胞的编程改造 人类出生后，体内会定植大量微生物，这些微生物将特定人体组织作为主要生态位。在人的一生中，人体与饮食和环境中的微生物持续相互作用，因此人类相关微生物可作为平台，与宿主生理功能相互作用以实现治疗目的。与可植入人类细胞的策略类似，可通过合成生物学方法对微生物细胞进行改造，并递送至人体以预防或治疗疾病。由于微生物具有遗传操作相对简便、代谢简单和稳健性强等特点，已成为合成生物学发展的核心。第一代合成基因回路（如 toggle开关和抑制振荡器）均在细菌中设计、构建和测试，为更复杂系统的开发奠定了基础。值得注意的是，微生物生命的巨大多样性，为合成基因回路的创建提供了源源不断的具有新型功能的遗传元件。这些特性使基于微生物的工程化疗法成为解决未被满足临床需求的热门领域。 用于开发治疗平台的细菌菌株选择通常取决于两个因素：菌株的安全性特征和遗传可操作性。由于乳酸菌（LAB）在人类营养中具有长期安全使用的历史，已被公认为向人体组织递送治疗载荷的无害载体。特别是乳酸乳球菌（常作为发酵乳制品的成分被食用），已被广泛开发为工业和临床应用的基因工程宿主。 同样，多种大肠杆菌菌株（从人类肠道共生菌发展为分子生物学的常用工具）已被广泛应用于活体疗法。值得注意的是，益生菌菌株大肠杆菌Nissle 1917（EcN）已安全使用近100年，作为多种获批药物产品的活性药物成分，其抗炎和抗菌活性已有相关描述。此外，保留天然组织趋向性的减毒病原体，可用于向恶性组织递送治疗或刺激分子。例如，缺乏肌动蛋白组装诱导蛋白或内化素B等毒力因子的单核细胞增生李斯特菌菌株，在肿瘤外生长能力降低，但能够通过在循环免疫细胞内生长引发抗肿瘤反应。同样，脂质转运缺陷或次级信使代谢产物产生缺陷的鼠伤寒沙门氏菌菌株，无法在血液中传播，但全身给药后能够靶向缺氧肿瘤环境。 治疗载荷的体内递送和代谢转化，一直是合成生物学方法将微生物确立为活体治疗剂的核心。近年来，对肠道和肿瘤环境中宿主细胞与微生物相互作用的理解不断深入，揭示了工程化微生物可干预的关键通路，以恢复细胞稳态。以下重点介绍在肠道和肿瘤环境中发挥作用的工程化细菌疗法的关键进展。 肠道相关工程细菌 共生菌和饮食来源细菌与胃肠道黏膜表面相互作用的能力，为开发在肠道内发挥作用的活体疗法提供了平台。口服携带基础生产和分泌模块的细菌，已被证明是向肠道环境递送效应分子的简单有效策略。然而，近年来，稳健的生物组件与回路设计原则的结合，已能够创建能够检测刺激并产生指定响应的细菌系统。合成基因回路复杂性的提升，使治疗性微生物能够在宿主身上实现更精准的定位和定时效应。以下介绍一些值得关注的案例——工程化细菌被用于递送多种免疫调节或抗感染效应分子。随后，我们将讨论更复杂的工程化细菌案例，这些细菌整合了更高水平的合成生物学原理，能够响应肠道生物标志物用于诊断应用，或具有时空感知能力用于治疗肠道代谢性疾病。 **作为效应分子递送载体的工程细菌**：基于细菌的工程化疗法的首批应用之一，是将其用作活体疫苗载体，向人类黏膜递送抗原以引发局部和全身免疫反应。例如，在细胞表面展示沙门氏菌抗原的重组双歧杆菌菌株，可保护小鼠免受鼠伤寒沙门氏菌的致死性攻击。同样，表达幽门螺杆菌Lpp20抗原或艰难梭菌细胞毒素TcdA和TcdB C端受体结合域衍生的无毒重组片段的乳酸乳球菌，能够产生有效的适应性免疫反应，防止病原体在小鼠肠道内定植。在另一个案例中，多种天然乳杆菌菌株表达破伤风毒素C片段，引发血清病原体特异性IgG并增强淋巴样反应。还利用工程化乳酸菌开发了针对HIV等病毒的活体疫苗载体。钱查等人在乳酸乳球菌表面表达了与B族链球菌菌毛蛋白融合的HIV Gag抗原，并表明口服免疫后，该菌株能有效引发小鼠黏膜体液和细胞反应，突显了其作为HIV疫苗平台的潜力。 除了通过黏膜递送抗原引发选择性免疫反应外，工程化细菌细胞还可被编程为表达其他可遗传编码因子，以阻碍病原体定植或解决肠道炎症。受天然微生物竞争的启发，例如，已对细菌菌株进行工程改造，使其表达靶向入侵致病菌的抗菌化合物。在此背景下，福库斯等人对EcN进行工程改造，使其表达并分泌抗菌肽微囊素J25，并表明施用工程化细菌可降低火鸡肠道中沙门氏菌的载量。 也可对细菌进行工程改造，以靶向病原体的毒力而非生存能力。一些细菌（如霍乱病原体霍乱弧菌）可通过基于单个细菌分泌的信号因子（如霍乱自诱导物1（CAI-1））水平的群体感应系统，检测自身群体密度。因此，当细菌群体生长导致这些因子浓度达到特定阈值时，会触发信号通路，抑制毒力因子产生。为防止霍乱弧菌在肠道内繁殖，对EcN进行工程改造，使其表达高水平的CAI-1，用该工程化菌株预处理后，摄入霍乱弧菌的小鼠存活率高达92%。 在炎症性肠病（IBD）的背景下，通过口服给药工程化细菌在肠腔中递送治疗蛋白的理念具有特别的吸引力——这种方法能够在炎症部位（肠道腔室）递送高局部浓度的治疗剂，同时最大限度地减少其全身暴露，从而降低潜在毒性。免疫调节细胞因子的失调被认为在IBD的病理生理学中起着关键作用，因此恢复细胞因子网络的稳态是研究热点。在实验性IBD模型中，向肠道递送工程化细菌以控制炎症的初步尝试，基于鼠源抗炎细胞因子的表达或针对促炎细胞因子的纳米抗体。通过进一步改造EcN，创建了诱导型卷曲纳米纤维展示三叶因子（TFFs），最终在结肠炎症期间促进肠道上皮完整性和恢复上皮屏障功能。通过质粒对EcN进行工程改造，该质粒编码产生嵌合CsgA蛋白的合成卷曲操纵子——CsgA蛋白是大肠杆菌生物膜基质的主要成分。将CsgA蛋白与促进上皮修复的小细胞因子TFF3治疗结构域进行基因融合。合成卷曲操纵子置于阿拉伯糖诱导型启动子（PRAD）的控制之下，可通过向小鼠饮用水中添加阿拉伯糖进行外部激活。 尽管这些研究大多未在“感知-响应”的合成生物学框架内进行，但它们展示了如何将简单的表达模块整合到多种细菌宿主中，以实现治疗剂的有效递送。此外，这些研究表明，简单的合成基因回路在动物研究中具有功能，其中一些已进入进一步的临床开发，并在I期人体临床试验中被证明是安全的。 **肠道生物标志物的细菌活体生物传感器**：理想的生物传感器应能在复杂环境中工作，具有高分辨率检测能力、高信噪比输出范围、信息存储能力，并能有效放大输出信号。这些要求可通过合成生物学原理实现。生物传感器的通用结构包括多个模块：用于在预定阈值下检测多种病理生物分子（输入）的检测模块；整合由用户定义的临床相关生物标志物和/或规则驱动的一组逻辑门的布尔模块；以及产生用户可直接解读的即时信号的放大和/或输出模块。或者，可使用记忆模块将信息稳定存储在生物传感器细胞的DNA中，以便后续检索。原则上，这些概念可应用于任何生物腔室，作为概念验证，库尔贝等人将放大遗传开关和逻辑门整合到海藻酸盐聚合物封装的大肠杆菌中，用于检测和记录糖尿病患者血液和尿液中的病理性葡萄糖水平。尽管体外检测体液中的病理生物标志物具有吸引力，但合成生物传感器的最终目标是持续体内监测，以实现实时诊断。肠道共生菌的工程改造，为肠道炎症的探索提供了一个有吸引力的机会。在大肠杆菌中实现了“触发-记忆”概念，其遗传设计包括控制噬菌体λ阻遏蛋白Cro表达的脱水四环素（aTC）诱导型启动子（Ptet），以及基于λcI/Cro区域的记忆元件。在体内，给小鼠施用工程化细菌和aTC后，该系统能够感知aTC，并在其撤离后“记住”这一信号。用户可通过检测与Cro融合的β-半乳糖苷酶报告基因，interrogate处于Cro开启状态的细菌比例，从而读取该记忆。这种小分子传感器的“触发-记忆”设计的概念验证，可适配用于感知疾病状态（如肠道炎症）中上调的生物标志物。 大肠杆菌已被用于生成四硫酸盐（炎症期间产生的代谢物）的生物传感器（图5）。检测-触发模块通过鼠伤寒沙门氏菌的ttrR/S基因检测四硫酸盐，以通过PtrrBCA启动子驱动Cro蛋白表达。四硫酸盐诱导的Cro产生，导致基于β-半乳糖苷酶的记忆模块激活，一旦触发，即使在没有四硫酸盐的情况下仍保持活性，从而可通过无创粪便检测进行后续信号检索。里格拉等人在多种小鼠肠道炎症模型中验证了这一概念验证。该系统被整合到大肠杆菌的染色体中以提高稳定性，并在体内持续工作长达6个月。基于类似的概念，已在EcN中生成了硫代硫酸盐（另一种肠道炎症相关生物分子）的生物传感器，并证明能够有效感知、记忆和报告小鼠的肠道炎症。 图5 携带工程化遗传回路的细菌细胞疗法 a | 目前在肠道内发挥作用的活体细菌设计可分为三大类：诊断生物传感器，经编程检测疾病状态下出现在肠腔中的肠道炎症相关生物标志物，并有效放大输出信号；经工程化生产免疫调节分子（如三叶因子或抗炎化合物）或消耗肠腔内ATP等促炎分子的细菌；这些响应可由炎症生物标志物控制，并可恢复上皮屏障功能和减轻炎症。第三类是代谢性疾病背景下有毒分子的代谢转化（苯丙酮尿症中有毒苯丙氨酸转化为反式肉桂酸（TCA），或高氨血症中氨转化为精氨酸），可由胃肠道中发现的微环境特征（如低氧分压）控制。b | 目前在肿瘤内发挥作用、支持抗肿瘤免疫反应和肿瘤消除的活体细菌设计。这些设计包括基因振荡器（如群体感应（QS）回路），以控制效应分子（如免疫调节蛋白、促凋亡肽、免疫检查点抑制剂抗体）的局部递送。其他设计在肿瘤驻留抗原呈递细胞（APCs）吞噬工程化细菌后，响应缺氧肿瘤微环境（TME）触发免疫刺激分子的合成。 合成生物学方法已应用于益生菌，作为胃肠道感染的体内诊断工具。毛等人将乳酸菌乳酸乳球菌工程化为活体诊断剂，为霍乱感染提供即时读数。他们利用摄入的乳酸乳球菌与霍乱弧菌的瞬时共定位，在感染早期检测病原体。为此，他们构建了一种混合细胞表面受体，该受体利用霍乱弧菌群体感应系统的组件，检测病原体的同源小分子自诱导物。传感模块激活后，工程化益生菌通过合成磷酸化级联反应计算信号，进而表达和分泌酶促报告基因——该报告基因可通过比色法在粪便样本中轻松检测到。霍乱传感乳酸乳球菌菌株在感染动物模型中的功能验证，为工程化微生物用于胃肠道感染的诊断和监测提供了基础证据。 最近，大肠杆菌工程化生物传感器的一项应用，是将活细菌用作微型可摄入电子设备的组件——该设备在肠道内移动，并与用户进行无线通信。这种可摄入微生物电子设备（IMBED）包含多个腔室，工程化EcN可接触肠道内容物，并产生可电子转换和传输给研究者的输出信号。作为概念验证，米梅等人设计了基于血红素响应转录阻遏物HrtR调控的合成启动子的胃肠道出血传感模块，以及基于luxCDABE盒（产生生物发光）的输出模块。光输出由光电晶体管检测，通过光度计芯片转换为数字代码，并无线传输至体外。IMBED成功在小鼠和猪体内检测并报告了肠道出血。 **代谢性疾病的工程化细菌疗法**：将基于合成生物学的产品转化为人类治疗工具的重要一步，是开发具有类药物特性的细胞系统。这些特性包括可预测的药代动力学、剂量-反应关系、安全性、可生产性和可扩展性。最近，有两项研究在苯丙酮尿症（PKU）和高氨血症两种代谢性疾病的背景下，介绍了口服细菌细胞疗法的这些概念，突显了合成生物学在开发特异性、灵活性和可控性治疗实体中的作用（专栏2）。PKU是一种先天性代谢缺陷病，其特征是苯丙氨酸羟化酶（PAH）缺乏，导致食物来源的氨基酸苯丙氨酸（Phe）无法代谢，在血液中积累至导致神经损伤的水平。伊莎贝拉等人报道了EcN菌株的构建，该菌株通过三个基因回路模块进行工程改造：基于编码Phe转运蛋白pheP的基因模块，由缺氧诱导型启动子Pfursi控制；基于编码苯丙氨酸解氨酶（PAL）stlA的基因模块，同样由Pfursi控制；以及基于编码L-氨基酸脱氨酶（LAAD）pma的基因模块，由阿拉伯糖诱导型启动子ParaC控制。在该工程化EcN菌株（SYNB1618）中，LAAD在发酵和生物量生产期间通过向培养基中添加阿拉伯糖诱导表达，而当细菌遇到哺乳动物胃肠道的缺氧环境时，在体内产生PheP和PAL。在功能上，SYNB1618由Phe和缺氧的组合输入控制，导致Phe转化为反式肉桂酸（TCA）（图5a）。重要的是，TCA在肝脏中转化为马尿酸（HA）并从尿液中排出，作为菌株活性的生物标志物。这种所谓的“合成生物制剂”被证明能在小鼠模型中通过胃肠道有效降低全身Phe水平。重要的是，在人类中，健康志愿者口服SYNB1618后，尿液中生物标志物HA呈剂量依赖性积累（NCT03516487）。 氨是代谢的普遍副产物，因此胃肠道是氨的主要来源。在健康人体内，肠道氨通过尿素循环在肝脏中代谢为尿素，然后从尿液中排出。在患有罕见代谢疾病尿素循环障碍（UCD）或肝损伤（如肝硬化）的个体中，氨在血液中积累，导致高氨血症和神经损伤。因此，从胃肠道捕获氨并防止其进入血液，是口服工程化细菌可能实现的重要应用。在此背景下，最近描述了一种合成生物制剂——对EcN进行重编程，将肠道氨有效引导至精氨酸生物合成途径，从而产生L-精氨酸。这种天然氨基酸常作为膳食补充剂使用，无报告毒性。该工程化策略旨在通过删除该途径的负反馈调节因子（argR），并创建一个带有该途径另一个负调节因子argA的精氨酸抗性突变体的回路（由缺氧诱导型启动子PfnrS控制），将氨有效引导至精氨酸途径。这种设计导致细菌遇到肠道缺氧环境时，持续将有毒氨转化为精氨酸。该菌株（SYNB1020）被证明能在肝损伤动物模型中以剂量依赖性方式降低全身氨水平，并已在健康志愿者中完成I期临床试验（NCT03179878）。 微生物中的大多数合成生物学应用都集中在大肠杆菌上——在过去半个世纪中，已积累了关于大肠杆菌的大量遗传和生化知识。然而，哺乳动物肠道微生物群以其他细菌类群为主，拟杆菌属是最普遍的类群之一。因此，拟杆菌属（尤其是共生菌种多形拟杆菌）作为合成生物学应用的额外载体，正受到越来越多的关注。回路元件（最重要的是可调谐启动子）以及核糖体结合序列文库和其他遗传组件的开发正在快速推进，以构建用于诊断和治疗目的的下一代工程化肠道微生物。 肿瘤相关工程细菌 自19世纪末威廉·科利的开创性研究以来，细菌已被认为是潜在的抗癌剂。科利首次观察到肿瘤区域急性链球菌感染后宫颈肉瘤的消退，这启发他毕生致力于利用细菌激活免疫系统治疗癌症。他的工作被认为是医学史上首个免疫治疗方案。这些早期观察捕捉到两个关键概念：细菌可在肿瘤中存活，且能触发抗肿瘤免疫反应。这些见解构成了利用合成生物学策略，以细菌为基础创建可控、安全和合理设计的抗肿瘤生物疗法的基础。以下介绍工程化细菌用于局部递送抗肿瘤化合物和免疫系统调节剂的显著案例。 多种分类群的细菌优先在肿瘤中积累和增殖，事实上，许多使用致病菌的动物和人类研究已证明其抗肿瘤活性。不幸的是，这些研究也揭示了不可接受的毒性，阻碍了这些制剂作为治疗工具的开发。进一步尝试减毒病原体，产生了安全但无效的疗法，突显了这些方法中毒性和疗效之间的明显权衡。目前，大多数细菌抗肿瘤策略基于非致病载体（如EcN），通过合成生物学工具进行合理工程化，以在肿瘤微环境（TME）中激活免疫系统，实现强大且持久的抗肿瘤活性。合成生物学方法与我们对肿瘤免疫学的快速深入理解相结合，为开发新型癌症细菌细胞疗法提供了有吸引力的机会（图5b）。 改善基于细菌的癌症疗法的一种方法是进一步增强其固有的肿瘤趋向性。一些细菌对肿瘤的天然亲和力，可通过工程化靶向结合预定癌症表达分子（如新生抗原或其他在癌细胞中富集的分子）的合成黏附素来增强。合成黏附素是模块化膜锚定蛋白，具有细胞外免疫球蛋白结构域，可通过文库筛选生成和优化。作为概念验证，皮涅罗-拉姆比亚等人在大肠杆菌中构建了带有靶向绿色荧光蛋白（GFP）的合成黏附素的组成型回路，并证明工程化细菌在体外和体内能有效结合表达GFP的HeLa细胞。关键的是，该工程化菌株的体内静脉递送，能够以比内源性菌株或携带无关黏附素的菌株低100倍的剂量有效定植肿瘤，这表明类似改造的细菌可用于以极低剂量向肿瘤递送治疗载荷，同时最大限度地降低潜在的全身毒性。细菌选择性归巢至肿瘤的能力也已用于诊断目的。达尼诺等人开发了一种生物发光EcN菌株，该菌株还产生酶促报告基因。口服细菌能够通过成像和测量尿液中的报告酶底物，检测小鼠肝脏肿瘤和转移灶。这些研究表明，细菌在肿瘤中至少保持一定程度的代谢活性，足以支持工程化基因回路的运行。 鉴于细菌优先定植于恶性部位，且能天然激活树突状细胞和巨噬细胞等先天免疫细胞，其使用可在TME中提供基线水平的免疫激活。抗PD1和抗PDL1抗体等免疫检查点抑制剂的使用，彻底改变了癌症治疗。然而，只有部分患者能从这种治疗方法中获益。尽管大多数患者缺乏应答的原因仅部分明确，但显然，基线水平的T细胞浸润是检查点抑制剂发挥作用的必要条件——事实上，这些所谓的“热肿瘤”一直表现出良好的预后。相比之下，缺乏T细胞的“冷肿瘤”预后较差，因此成为癌症免疫治疗中一个重要的未被满足的医疗需求。 因此，合成生物学可应用于工程化细菌，以可控方式表达能够激活T细胞免疫反应的代谢物、细胞因子、scFv或任何其他分子。这种工程化功能与细菌细胞中天然存在的免疫激活组件相结合，有望驱动持久的抗肿瘤活性，即使在冷肿瘤中也是如此。最近，通过在EcN中工程化干扰素基因刺激因子（STING）激动剂（SYNB1891），证明了这一概念（图5b）。环二核苷酸对STING的细胞内激活，导致I型干扰素产生，激活先天免疫细胞并促进细胞毒性T细胞启动。莱文索尔等人设计了一个回路，其中来自单核细胞增生李斯特菌的dacA（编码合成cAMP（STING激动剂）的酶）由缺氧诱导型启动子Pfurs控制。SYNB1891还被设计为包含两个营养缺陷型（thyA和dapA），分别导致其无法在TME外存活和无法在TME内复制。这种基因回路设计赋予系统显著的特异性（仅在缺氧TME中激活）和可控性（在TME外被清除，且无法在TME内增殖）（专栏2）。在T细胞浸润不良的小鼠肿瘤中，SYNB1891驱动了强大的肿瘤根除，并诱导了长期免疫记忆，使治愈的小鼠能够抵抗肿瘤复发。这些效应依赖于STING和CD8+ T细胞，进一步突显了细菌合成生物学在癌症治疗中的潜力。SYNB1891目前正在多种癌症的I期临床研究中进行评估（NCT04167137）。 除了使细菌系统能够在TME内递送和过表达目标载荷外，合成生物学方法还允许调节预期输出表达的相对强度和持续时间。控制表达时机和持续时间的一种方法是构建可调谐基因振荡器。基因振荡器是工程原理应用于细菌系统的最早例子之一，可通过引入竞争性激活和抑制因子来设计。斯特里克等人在大肠杆菌中构建了一个回路，其中三个基因（araC、lacI和yemGFP（报告基因））由混合启动子Plac/araI控制。这种合成调控元件由araBAD启动子的激活位点和lacZYA启动子的抑制操纵子位点组成。随后，将多个Plac/araI拷贝置于控制回路中三个基因各自转录起始位点的上游和下游。该系统在阿拉伯糖存在时被AraC蛋白激活，在异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）不存在时被LacI蛋白抑制，其振荡可通过荧光（GFP）追踪。重要的是，振荡周期（持续时间）和振幅（幅度）可通过添加到培养基中的阿拉伯糖和IPTG的相对浓度精确控制。这种合成基因网络的结构可转化为治疗回路，实现载荷的周期性递送。 在抗癌细菌中构建基因振荡器的成功策略受到群体感应的启发——在群体感应中，关键扩散因子的积累触发群体中的同步响应。当对临界密度的预定义细胞响应是细胞裂解时，这种方法能够在TME内程序性释放工程化溶瘤因子以及免疫调节蛋白，这些蛋白共同作用，在体内导致癌细胞裂解和肿瘤生长抑制。丁等人设计的遗传回路包含一个共同启动子（PlasI），该启动子驱动自身激活剂（酰基高丝氨酸内酯）以及噬菌体衍生的裂解因子（φX174蛋白E）的表达。当回路开启时，产生φX174 E，扩散到邻近细胞，并在达到临界阈值时触发裂解。少数存活的细胞再次增殖并产生φX174 E，直到达到临界阈值并触发新一轮细菌裂解，完成一个新的周期。这种脉动式同步裂解系统与最多三种载荷（促凋亡肽、趋化因子和溶血素）的输出相连，导致每次群体感应裂解发生时，所有三种载荷在TME中同时释放。这种方法在同基因小鼠肿瘤模型中显示出令人鼓舞的疗效。 还有其他值得注意的例子，展示了将程序性细胞裂解与合成群体感应系统耦合，向肿瘤中释放治疗载荷的效用。乔杜里等人对非致病性大肠杆菌进行工程化，使其带有同步裂解回路，在TME内裂解并释放编码抗吞噬受体CD47（在多种人类癌症中通常过表达）的纳米抗体。古尔巴特里等人在益生菌EcN中构建了类似的裂解回路，整合到EcN-lux基因组的φ80位点，其中plux在单一启动子下驱动luxI和φX174 E基因的转录。回路激活导致靶向PDL1和细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA4）的纳米抗体的受控产生和肿瘤内释放，以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的释放。在这两个例子中，用工程化细菌治疗均导致了强大的肿瘤消退和全身性抗肿瘤免疫。 工程化细胞疗法的前景 随着工程化细胞疗法领域的成熟和扩展，由于细胞尚未被广泛用作体内治疗生产的基本单元，其在生产（专栏3）和临床开发（专栏4）方面将面临前所未有的挑战。合成生物学已在解决当前难以治疗的疾病的治疗策略方面展示了概念上的改进。计算机引导的基因回路构建，可进一步加速治疗平台的设计-构建-测试循环。该领域正在进行令人振奋的发展，以下重点介绍一些将增强合成生物学在工程化活体疗法中变革性力量的额外领域。 专栏3 细胞疗法的创建：生产考量 工程化活体疗法（ELTs）的临床级生产采用与其他已进入临床应用的细胞产品（如临床级益生菌或自体淋巴细胞）类似的生产技术，并遵循相同的规则和法规。然而，一个额外的挑战是包含工程化异源生物回路——这些回路可能在放大培养过程中给细胞带来负担，导致回路和菌株不稳定性。重要的是，在生产过程本身中使用合成生物学方法可提供有效的解决方案，可引入合成基因回路以确保预期的过程控制以及工程化通路的保留。例如，可在生产过程中有效关闭特定细胞中的治疗回路，以确保生物量的可重复和严格控制的生产。对于兼性厌氧细菌，这可通过工程化缺氧控制启动子，并在微生物发酵过程中引入确定的氧气浓度来实现。然而，在某些情况下，可能需要在生产过程中激活合成基因回路，以确保工程化通路在治疗给药时有效。 尽管工程化活体疗法领域仍处于起步阶段，但来自更成熟的工业发酵领域的经验，为生产中的潜在问题提供了有益的见解和可能的解决方案。相关技术挑战包括生产过程中突变的积累，以及由此产生的低效菌株变体——这是由于生产负荷和代谢负担可能使批准批次的一致性生产面临挑战。 专栏4 细胞疗法的创建：临床开发考量 在美国，美国食品药品监督管理局（FDA）通过生物制品评价与研究中心（CBER）监管工程化细胞疗法临床开发的所有方面。由于社会对基因修饰生物普遍存在一定的犹豫，利用合成生物学工具解决关键的未被满足的医疗需求，有助于形成更平衡的患者获益观点。在这方面，监管关注的关键领域集中在化学、生产和控制问题上——在许多方面，这些问题与其他治疗类别（包括小分子、单克隆抗体和疫苗）的候选药物相似。有关生产指南的完整描述可在其他地方获得。 工程化活体疗法领域的一个重要目标是开发药代动力学和药效学工具，以指导候选药物选择和药物开发过程，利用其他治疗方式数十年临床开发的集体知识。工程化活体疗法为构建这些关系提供了新的场景——例如，口服给药制剂的药代动力学本质上可能是生物体在胃肠道中的转运时间。同样，静脉给药的人类细胞疗法（如CAR-T细胞）的药代动力学，可通过给药后不同时间点工程化活体疗法的血液计数来确定。然而，胃肠道内的局部浓度即使不是完全不可行，也难以测量，因此粪便样本常被用于生成特定剂量清除时间的数据。生物工程资源（如人工体外胃肠道系统）将提供重要的新技术，使药物开发者能够从一系列临床前数据外推人类给药方案，为临床试验设计提供剂量选择信息。CAR-T细胞植入也带来了类似的挑战——植入情况指示临床活性，但在表征工程化活体疗法的体内行为时代表了额外的复杂性。毫无疑问，监管机构和医生将期望得到保证，即特定效价的工程化活体疗法剂量将提供预期的治疗益处。迄今为止，工程化活体疗法作为人类疗法的开发经验有限，已获批和正在开发的CAR-T细胞疗法（人类细胞）以及SYNB1618和SYNB1891项目（细菌细胞），为支持候选药物选择和全面开发的工具和策略的开发提供了早期示例。 自主性 如前所述，负反馈控制基因回路能够自主纠正糖尿病和甲亢等复杂疾病中疾病驱动的生理扰动。闭环“感知-响应”治疗系统根据预设设定点自我调节其活性。给药后，这些系统不再需要额外的指令。可能受益于此类设计原则的应用包括减轻细胞疗法的毒性（如CAR-T细胞的细胞因子释放综合征）。 需要用户通过小分子进行外源控制的非自主平台并不理想，因为它们还需要临床上有用的生物标志物，以便实际实施和对患者进行持续监测。对于CAR-T细胞，能够通过感知局部炎症来减弱响应的合成基因回路，有可能作为自主安全开关。调节传感器的灵敏度和输出剂量，对于工程化无需额外用户干预的自调节工程化活体疗法至关重要。 正交性 合成生物学的主要目标之一是编程新的细胞功能，通常使用源自天然生物系统的构建块。这导致合成通路和内源性通路之间可能发生串扰，从而损害预期功能的保真度。在上述例子中，胆汁酸和血糖检测模块下游的CREB1和NFAT活性，分别是许多通路共有的末端转录介质。因此，这些回路的输出可能被其他非特异性信号诱导。将来自进化上不同生物的正交模块（如细菌双组分系统）引入人类细胞，是减轻与内源性过程串扰的一种方法。设计人工蛋白效应器和新型信号转导机制，也是扩展合成生物学工具包和避免与细胞宿主机制发生不良相互作用的有前景的研究领域。 持久性 许多工程化活体疗法的成功应用将依赖于导入细胞在体内的持久性。微生物群代表了一个生态位，在该生态位中，合成工程化共生载体可被诱导定植并无限期持续存在，且具有仅在感知到预定病理信号或信号组合时才响应和激活效应器回路的内在能力。如前所述，针对人类微生物群中主要成员（如拟杆菌属或梭菌属）的合成生物学工具的快速扩展，为此类持久性方法铺平了道路。工程化基因回路的稳健、长期功能也是持久性的重要考量因素。例如，合成构建体中的重复DNA元件可能导致遗传不稳定性和预期活性的丧失。设计非重复组件的努力，将有助于构建日益复杂的回路。 结论 工程化活体疗法领域正处于转折点。传统药物曾经难以解决的重大生物医学挑战，如今正通过生物工程的新前沿方法得到解决。人类和微生物细胞可通过基因修饰来纠正内在缺陷或释放其全部治疗潜力。在这方面，合成生物学原理（如分子逻辑门和反馈控制）为构建下一代工程化活体疗法做出了重大贡献。本文所述创新基因回路的转化工作目前正在进行中。与之前的治疗范式转变一样，在充分实现临床效益之前，下一代工程化活体疗法的研发仍需解决多个障碍。尽管如此，合成生物学与细胞和基因治疗的交叉领域，有望通过扩展我们为复杂疾病创建特异性、灵活性和可控性治疗方案的能力，推动医学进步。

2025年4月23日，由哈尔滨医科大学郑桐森教授团队在《The Innovation》（中科院一区，IF：25.7）杂志上发表一篇题为“Precision targeting of STING: Challenges, innovations, and clinical outlook for cancer therapy”文献综述，阐述STING在癌症治疗中的研究进展。 图形摘要如下： 摘要： 干扰素基因刺激因子（STING）通路在固有免疫应答中发挥关键作用，已成为癌症治疗中极具吸引力的靶点。尽管临床前研究结果令人鼓舞，但STING激动剂的临床试验在很大程度上未能实现持久疗效，目前尚无药物进入III期试验。本综述探讨了癌症治疗中限制STING通路激活的生物学、药理学和临床障碍，分析了STING激动剂的内在局限性，以及由肿瘤异质性、免疫抑制和STING慢性激活引发的宿主相关耐药机制，同时还综述了获得性耐药的相关机制，如免疫检查点上调和效应免疫细胞抑制。药物递送平台、小分子设计和联合治疗策略的最新进展为后续研究提供了潜在方向。本研究重点关注基于人类STING变异体、表观遗传调控和生物标志物驱动的患者分层等精准治疗方法，以改善临床结局。这些研究结果表明，需要优化特定情境下的STING激活策略，从而充分发挥该通路在肿瘤治疗中的全部治疗潜力。 Abstract The stimulator of interferon genes (STING) pathway plays a crucial role in immune responses and has emerged as a compelling target in cancer therapy. Despite promising preclinical studies, clinical trials of STING agonists have largely failed to deliver durable efficacy, with no agents progressing to phase III trials. This review examines the biological, pharmacological, and clinical barriers limiting STING pathway activation in cancer treatment. We discuss the inherent limitations of STING agonists as well as host-related resistance driven by tumor heterogeneity, immune suppression, and chronic STING activation. Mechanisms of acquired resistance, such as immune checkpoint upregulation and suppression of effector immune cells, are also reviewed. Recent advances in delivery platforms, small-molecule design, and combination treatment strategies offer promising paths forward. We highlight precision approaches based on human STING variants, epigenetic modulation, and biomarker-driven patient stratification to improve clinical outcomes. These insights underscore the need for refined, context-specific STING activation strategies to unlock the full therapeutic potential of this pathway in oncology. 引言 干扰素基因刺激因子（STING）是细胞质病原DNA固有免疫应答中的关键蛋白，由环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）合成的环鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）激活。激活后，STING磷酸化TANK结合激酶1（TBK1），进而激活干扰素调节因子3（IRF3），最终诱导I型干扰素（IFNs）和趋化因子的表达。该信号级联反应可促进树突状细胞（DC）活化并增强抗原呈递，进一步刺激CD8+T细胞募集和活化，以增强抗肿瘤免疫。由于这些作用，STING日益被认为是癌症免疫治疗中极具潜力的靶点。STING激动剂已得到广泛研发，并在多种恶性肿瘤临床前模型中显示出显著的肿瘤抑制作用，部分甚至实现了肿瘤消退。 近年来，关于STING的研究取得了重大进展，产生了大量突破性发现，为新型STING激动剂的研发提供了强有力的动力。2019年，尚领导的研究团队首次公布了全长STING的冷冻电镜结构。三年后，该团队发现STING跨膜区存在第二个激动剂结合位点，为新型STING靶向药物的研发提供了结构基础。王等人利用自主研发的STING激活纳米颗粒证实，STING激动剂可促进肿瘤血管正常化，改善缺氧微环境，增强内皮细胞黏附分子的表达，并募集更多免疫效应细胞，从而发挥肿瘤生长抑制作用（图1）。 图1 STING开发的时间轴 时间轴描述了自2008年识别以来STING发现的简史以及关于STING生物学和激动剂应用的关键事件。 尽管临床前研究结果令人振奋，但STING激动剂的临床疗效仍有限，其潜在机制尚不明确，这已成为研究成功的主要障碍。此外，STING激动剂的耐药性问题也日益受到关注。探究耐药机制并确定增敏策略，对于解决转化医学面临的挑战至关重要。本综述分析了STING激动剂临床疗效有限的相关因素，既包括STING激动剂的固有特性，也涉及肿瘤的特异性特征（原发性和获得性耐药），同时进一步探讨了旨在克服这些治疗障碍的现有解决方案和未来研究方向。 STING激动剂疗效的限制因素 药物相关挑战 膜通透性有限：STING是一种主要定位于内质网（ER）的跨膜蛋白。天然STING激动剂环二核苷酸（CDNs）由于带有负电荷、极性强且水溶性高，难以穿透细胞膜与STING结合，从而限制了其生物活性。先前的研究已发现特定转运蛋白（如SLC19A1、SLC46A和P2X7R）可促进cGAMP进入细胞内。此外，缝隙连接、容积调节阴离子通道（VRAC）、病毒颗粒和细胞内吞作用等机制也可协助cGAMP穿过脂质双分子层。张及其同事进一步证实，人类宿主防御肽LL-37可作为cGAMP转运蛋白，增强STING介导的固有免疫。然而，cGAMP的摄取效率仍然较低，且cGAMP转运蛋白的表达可能受细胞类型、细胞状态和环境因素的影响。因此，克服膜通透性障碍对于充分发挥STING激动剂的生物学潜力至关重要（图2A）。 图2 限制STING激动剂功效的因素 （A）由于膜渗透性屏障，CDN难以与STING结合，特定的转运蛋白和病毒颗粒等机制可以帮助克服这些屏障，但仍然存在许多限制。 （B）CDN表现出差的稳定性并且容易被ENPP 1水解成免疫抑制代谢物。 （C）DMXAA表现出物种特异性并且不能结合hSTING。STING的构象变化和激活机制仍需进一步探讨。 （D）肿瘤内注射和静脉内施用都缺乏肿瘤和细胞特异性靶向。肿瘤内给药面临着肿瘤内浓度差异的问题，并且肿瘤位置、大小和形态的异质性构成了重大挑战。静脉给药容易引发炎症反应和其他副作用。 稳定性差且代谢产物具有免疫抑制作用：除细胞通透性有限外，CDNs的代谢稳定性较差，静脉给药后半衰期极短。外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶I（ENPP1）可直接水解cGAMP，生成AMP和GMP，同时也可将ATP水解为AMP。两条通路产生的AMP均会被CD73迅速脱磷酸化为腺苷，而腺苷会抑制免疫细胞功能并促进肿瘤转移。这表明ENPP1可将STING激动剂的免疫刺激作用转变为免疫抑制作用（图2B）。 STING激动剂的物种特异性：5,6-二甲基黄嘌呤-4-乙酸（DMXAA，ASA404）是首批非CDN小分子STING激动剂之一，在小鼠模型中显示出抗肿瘤和免疫调节作用。然而，后续临床研究发现，DMXAA可选择性结合小鼠STING（mSTING），但无法结合人类STING（hSTING）。这一发现强调，在STING激动剂的研发过程中，需谨慎考虑物种特异性，并通过临床试验严格验证其结合和激活hSTING的能力（图2C）。 STING激动剂的激活机制具有多样性：目前普遍认为，STING在激活后会从“开放”构象转变为“闭合”构象，这一结构变化与CDN结合相关。然而，另一种STING激动剂diABZI在激活STING时，可使其维持开放构象。这种独特的构象可能代表了一种新型的STING激活机制。进一步研究STING的结构动力学和激活机制，可为STING激动剂的研发提供新的方向（图2C）。 肿瘤内递送面临挑战：尽管STING激动剂的全身给药可能引发细胞因子风暴风险，但肿瘤内注射可实现靶向给药，降低全身暴露。尽管肿瘤内注射在实体瘤治疗中具有潜在应用前景，但CDNs的肿瘤内递送仍面临多项挑战：首先，不同癌症类型和个体患者的肿瘤异质性，导致给药方案难以标准化；其次，肿瘤位置、大小、形态、血管分布和机械特性的差异，以及注射后CDNs的快速扩散，会导致肿瘤内浓度和分布存在显著差异，进而引发不同肿瘤区域的异质性应答，使剂量优化变得复杂；此外，肿瘤内注射需要先进的成像技术进行精准引导，而这并非总能实现；且由于ADU-S100等STING激动剂的半衰期较短（10-20分钟），通常需要多次注射才能达到治疗效果，这在临床实践中面临额外挑战；最后，肿瘤内递送无法解决肿瘤常见的复发和转移问题。因此，要实现STING激动剂肿瘤内给药的临床应用，必须克服重大的技术和生物学障碍（图2D）。 缺乏肿瘤和细胞靶向性：STING的最佳激活理想情况下应发生在肿瘤内，形成局部炎症环境，释放趋化因子以募集T细胞进入肿瘤微环境（TME），同时限制其在血液和其他组织中的激活。STING激动剂全身给药的主要挑战在于缺乏肿瘤和细胞特异性靶向性。全身递送不可避免地会导致正常组织中的脱靶效应，引发全身性炎症反应，可能导致严重的细胞因子释放综合征（CRS），出现疲劳、发热、头痛和多器官功能衰竭等症状。此外，全身激活还可能引发自身免疫性疾病、组织毒性，甚至形成促肿瘤炎症微环境。因此，研发可靶向递送至肿瘤的STING激动剂迫在眉睫，以增强免疫激活并最大限度地减少副作用（图2D）。 肿瘤或宿主相关耐药 hSTING变异体对STING激动剂的应答存在差异：hSTING存在单核苷酸多态性，主要有五种变异体：R232（57.9%）、HAQ（20.4%）、H232（13.7%）、AQ（5.2%）和R293Q（1.5%）。这些变异体对STING激动剂的敏感性各不相同。例如，STING-H232可响应内源性2',3'-cGAMP，但对某些外源性CDNs无应答，而STING-HAQ对外源性和内源性CDNs的应答均降低（图3A）。此外，这些变异体的分布具有地域差异，HAQ变异体在东亚人群中较为常见，但在非洲人群中罕见。这强调在临床试验招募参与者时，需考虑hSTING变异体及其地理分布，以提高研究结果的科学性和普适性。 图3 驱动对STING激动剂的原发性抗性的宿主因素 （A）hSTING存在于对STING激动剂具有不同响应性的五种主要变体中。 （B）肿瘤中的CIN导致慢性STING激活，这可能导致免疫逃避和更差的临床结果。 （C）肿瘤细胞通常抑制cGAS-STING途径以逃避具有表观遗传机制的免疫监视。 （D）STING表达在肿瘤转移期间波动，并且STING激动剂可以在早期转移期间增强免疫应答。 （E）来自TCGA数据库的肿瘤样品和配对正常组织中TMEM 173基因的表达谱。 染色体不稳定性（CIN）高的肿瘤中STING慢性激活降低对STING激动剂的应答：肿瘤内在STING激活在癌症进展中的作用仍存在争议。虽然STING激活通常与抗肿瘤免疫和细胞凋亡相关，但肿瘤中STING的高表达往往预示着多种癌症的预后较好。然而，在接受辅助化疗的乳腺癌和卵巢癌患者中，STING的高表达（尤其是在增殖细胞中）与复发风险增加相关。在晚期和转移性肿瘤中，随着肿瘤进展，染色体不稳定性（CIN）会加剧，导致STING慢性激活，进而驱动IL-6-STAT3信号传导，促进CIN阳性肿瘤细胞存活。小鼠高CIN肿瘤模型显示，通过非经典STING通路激活NF-κB，可促进免疫逃逸和转移，导致更严重的转移和更低的存活率。研究表明，细胞中反复的STING激动剂刺激最初会引发强烈的IFN应答，但随着时间推移，会抑制IFN信号传导，并激活内质网应激和NF-κB相关基因，从而有助于免疫逃逸。因此，STING慢性激活可能导致STING激动剂在晚期或转移性肿瘤患者中的应用效果不佳（图3B）。 肿瘤细胞中cGAS-STING通路受到抑制：肿瘤细胞的DNA损伤应答（DDR）系统通常存在异常，且CIN会增强。DDR是一种高度保守的机制，可保护基因组免受损伤。在肿瘤细胞中，编码DDR成分的基因突变会导致DNA修复缺陷和CIN，包括染色体分离错误，产生非整倍体细胞和微核。在高CIN肿瘤中，微核可能破裂，释放DNA并激活cGAS-STING通路。为了逃避STING介导的免疫监视，肿瘤细胞通常采用表观遗传机制阻断STING激活，以此作为生存策略。 例如，胰腺导管腺癌（PDAC）细胞中STING表达受到抑制，导致免疫冷肿瘤微环境的形成。在胶质母细胞瘤中，肿瘤细胞中STING表达下调，但在肿瘤相关免疫细胞和基质细胞中保持稳定。同样，肝细胞癌（HCC）细胞的STING表达低于非肿瘤组织，这可能与免疫监视功能受损相关。黑色素瘤细胞通过表观遗传沉默cGAS或STING，从而在细胞质DNA暴露后避免产生I型IFN和免疫细胞因子。 从机制上讲，肿瘤细胞中的STING信号传导常因cGAS和STING的启动子突变或高甲基化而受到抑制。STING表达也受组蛋白修饰调控，组蛋白H3Lys4去甲基化酶KDM6B和KDM5C可抑制STING表达。此外，TMEM173基因的内源性启动子区域存在转录因子MYC的结合位点，三阴性乳腺癌中MYC敲除可导致TMEM173上调，增加CXCL10和CCL5的产生，并增强CD8+T细胞浸润。肿瘤细胞还可能通过上调某些稳定基因组并防止微核形成的基因（如单极纺锤体1（MPS1））来抑制STING激活，MPS1在有丝分裂中起关键作用，与多种癌症相关。抑制MPS1可诱导微核形成并直接激活STING。此外，IDH1突变的肿瘤表现出选择性cGAS高甲基化和沉默，抑制mIDH1可重新激活cGAS表达和某些转座元件（图3C）。 肿瘤转移不同阶段STING表达的变化：在肿瘤转移过程中，STING表达会动态波动。在转移的早期休眠阶段，低STING活性使癌细胞能够逃避免疫监视。当休眠细胞脱离休眠状态并开始增殖时，STING活性会增加，使这些细胞更容易受到免疫攻击。存活的癌细胞形成更大的转移灶，再次表现出低STING水平和增强的免疫逃逸能力。从机制上讲，休眠期间高TGF-β表达会抑制STING表达，而在转移爆发时，启动子和增强子甲基化会下调STING表达。 因此，在转移早期增殖的癌细胞中，STING上调可能使这些细胞被免疫识别和抑制，从而限制从休眠到复发的进展（图3D）。临床前研究表明，在转移早期使用STING激动剂可促进自然杀伤（NK）细胞和T细胞募集，增强对转移性癌细胞的细胞毒性，并抑制转移灶的生长。 不同癌症类型中STING表达的差异：STING表达在不同癌症类型中存在显著差异。例如，编码STING的TMEM173基因在结直肠癌、肾透明细胞癌、甲状腺癌和胃腺癌中上调，而在子宫内膜癌、前列腺癌、肺鳞状细胞癌和肺腺癌中下调。这些差异可能意味着不同癌症类型和亚型对STING激动剂的敏感性不同（图3E）。此外，肿瘤内细胞组成和STING表达的异质性使STING激动剂的疗效评估变得复杂。 获得性耐药机制 次级免疫检查点分子过表达：cGAS-STING通路的持续激活与吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）的上调相关，IDO是免疫逃逸和抑制T细胞增殖的关键因素。在Lewis肺癌（LLC）STING敲除小鼠模型中，肿瘤微环境中IDO和髓源性抑制细胞（MDSCs）的水平显著降低。此外，研究表明STING激活可通过上调程序性死亡配体1（PD-L1）促进口腔鳞状细胞癌和肝细胞癌（HCC）等癌症的进展。同样，在子宫内膜癌细胞中，线粒体DNA释放和STING激活会导致PD-L1表达增加，诱导T细胞凋亡。肿瘤内注射STING激动剂后，肿瘤微环境中PD-L1、IDO和COX2的表达会升高，从而降低STING激动剂的抗肿瘤疗效。在用STING激活纳米颗粒治疗的肿瘤中，另一种与免疫逃逸相关的免疫检查点分子B7同源物3（B7-H3/CD276）的表达会增加。STING激动剂ADU-S100可增强小鼠和人类2型常规树突状细胞（cDC2）中T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3（Tim-3）的表达，抑制CD4+T细胞功能，削弱CD4+T细胞驱动的抗肿瘤应答。在Renca肺转移小鼠模型中，使用负载STING激动剂的脂质纳米颗粒治疗可显著增加免疫细胞中淋巴细胞激活基因-3（LAG-3）的表达。这些发现表明，STING激动剂可通过上调IDO、PD-L1、COX2、B7-H3、Tim-3和LAG-3等免疫检查点分子诱导获得性耐药，从而帮助肿瘤实现免疫逃逸（图4A）。 图4 cGAS-STING途径激活介导的获得性耐药机制 （A）cGAS-STING途径激活可导致免疫检查点分子上调。 （B）STING活化可增强TME中免疫抑制细胞的存在。 （C）过度的STING活化可通过减少T和B细胞的增殖、浸润和促进细胞凋亡而导致T和B细胞功能的抑制。 （D）ER应激导致错误折叠蛋白质的积累。 次级免疫抑制细胞和因子的激活：评估STING激动剂的治疗潜力，需要确定是否能够建立富含T细胞的肿瘤微环境以支持cGAS-STING通路激活，因为富含T细胞的肿瘤微环境与STING激动剂的阳性应答和预后改善相关。此外，BATF3依赖性树突状细胞在STING介导的抗肿瘤免疫中起关键作用。值得注意的是，STING在肿瘤微环境中的免疫细胞和非免疫细胞（包括肿瘤细胞和血管内皮细胞）中均有表达。肿瘤微环境中不同细胞类型的STING激活可能产生相反的效果：既可能募集免疫支持细胞以抑制肿瘤生长和转移，也可能吸引免疫抑制细胞，促进肿瘤进展。cGAS-STING通路的激活可增强肿瘤微环境中免疫抑制细胞的表达，包括调节性T细胞（Tregs）、调节性B细胞（Bregs）、癌症相关成纤维细胞（CAFs）和髓源性抑制细胞（MDSCs），形成免疫抑制性肿瘤微环境，促进癌症进展。在人乳头瘤病毒（HPV）阳性的舌鳞状细胞癌中，STING激活可促进IL-10等免疫抑制细胞因子的产生，从而促进Treg浸润。在胰腺癌小鼠模型中，STING激动剂的全身给药通过STING-IRF3轴诱导Breg扩增，Bregs分泌IL-35和IL-10，抑制NK细胞活性和肿瘤内浸润。阿韦特及其同事发现，CAFs中STING-IRF3通路的激活会降低溶瘤病毒对肿瘤细胞的细胞毒性，影响溶瘤病毒疗法的疗效。辐射暴露后，MC38小鼠结直肠癌中STING依赖性髓源性抑制细胞（MDSCs）的激活会促进巨噬细胞M2极化和Treg增殖。在1型神经纤维瘤病中，STING激活会募集1型常规树突状细胞和T细胞，矛盾的是，这些细胞会促进肿瘤形成，尤其是通过CD8+T细胞。STING激活可上调IL-10和IL-35等免疫调节因子，抑制抗肿瘤免疫细胞活性，形成免疫抑制性肿瘤微环境（图4B）。STING激活的免疫调节作用仍不明确，且目前的STING激动剂对肿瘤内特定细胞类型缺乏特异性。 效应免疫细胞受到抑制：STING过度激活可能抑制T细胞和B细胞增殖，减少其浸润，并促进细胞凋亡。莱莫斯等人发现，STING通过减少肿瘤微环境中CD8+T细胞浸润并增加髓源性抑制细胞（MDSCs）浸润，促进LLC生长。此外，在Sting1S3654/S3654小鼠的肿瘤中，大量T细胞发生STING介导的、不依赖IFN的细胞死亡，加速肿瘤进展和免疫逃逸。拉金等人发现，DMXAA激活T细胞中的应激通路，并上调促凋亡基因（如BAX）的表达，导致T细胞凋亡。在混合骨髓嵌合体模型中，与对照组相比，STING缺陷条件下Ki-67+CD8+记忆T细胞的数量更多。从机制上讲，T细胞表达高水平的STING，但I型IFN应答较低。虽然树突状细胞中STING激活对于肿瘤中T细胞的募集和激活至关重要，但T细胞中STING激活会触发依赖NF-κB而非IFN的转录变化，最终导致T细胞凋亡。此外，T细胞中的LRRC8C转运蛋白可将cGAMP转运至细胞内，激活STING-p53通路，抑制Ca2+内流和细胞因子产生，并抑制T细胞介导的适应性免疫应答。STING激活还会降低B细胞对B细胞受体信号传导的敏感性，并可能诱导凋亡，从而削弱抗体应答（图4C）。 内质网应激：多种遗传和环境因素会损害内质网的蛋白质折叠和修饰功能，导致错误折叠蛋白质积累，这种情况被称为内质网应激。内质网应激是STING激动剂抗肿瘤疗效的已知障碍。在T细胞中，STING的激活（直接激活或通过Ca2+内流激活）会导致未折叠蛋白反应相关基因（尤其是Bip/HSPA5和GADD34）的显著上调。内质网中未折叠或错误折叠蛋白质的积累会引发内质网应激，阻碍蛋白质翻译，增强肿瘤细胞的免疫逃逸能力，使其能够在应激条件下存活并逃避免疫监视（图4D）。 通过药物修饰增强STING激动剂的疗效 提高CDNs的代谢稳定性 合成CDN类似物具有良好的生产潜力，但由于膜通透性有限和代谢不稳定，其药代动力学特性仍有待优化。为了解决这些局限性，研究人员通过核苷酸取代、核糖替换和引入硫代磷酸酯键等策略，开发了具有增强降解抗性的修饰合成CDNs。核苷酸修饰和核糖替换显著提高了I型IFN的产生，而硫代磷酸酯键修饰使CDN类似物对磷酸二酯酶、核酸酶、ENPP1和蛇毒磷酸二酯酶等水解酶具有抗性（图5A）。例如，利奇等人开发了一种带正电荷的多结构域肽水凝胶，能够在15小时内持续释放CDNs，与游离CDNs相比，注射部位的CDN浓度更高。这种方法在MOC2-E6E7口腔癌小鼠模型中显著抑制了肿瘤生长，为CDNs的临床应用提供了潜在策略。 图5 通过药理学修饰增强STING激动剂的功效 器增强STING激动剂的功效涉及解决药代动力学、肿瘤特异性和免疫激活方面的挑战。诸如修饰CDN、开发非CDN激动剂、利用Mn2+佐剂、通过纳米载体和ADC改善靶向递送以及开发ENPP 1抑制剂等策略代表了优化STING激动剂疗法的关键方法，使其在癌症治疗中更有效。 非CDN STING激动剂和cGAS激动剂的研发 第二代STING激动剂主要为非CDN小分子，旨在克服核苷酸类药物的药代动力学局限性。值得关注的例子包括diABZI、MSA-2和SR-717，每种药物都具有独特的优势。静脉给药的diABZI比cGAMP具有更强的固有免疫激活作用，而MSA-2和SR-717由于具有口服生物利用度，因此极具应用前景。MSA-2设计有质子化羧基，在酸性肿瘤微环境中可增强细胞膜通透性，有效促进IFN-β分泌，并在小鼠模型中诱导肿瘤消退。当与抗PD-1疗法联合使用时，MSA-2可显著提高治疗效果，且副作用最小。然而，MSA-2的全身给药可能导致其他组织中STING的脱靶激活，因此需要进一步进行安全性评估。 为了更清晰地说明CDN类与非CDN类STING激动剂的优缺点，表1比较了肿瘤选择性、细胞因子释放谱以及血浆半衰期和hSTING变异体的EC50等临床疗效指标。该对比分析为评估各类药物和指导治疗策略的制定提供了全面框架。 同样，cGAS激动剂因其能够模拟内源性cGAMP激活STING的能力而受到关注。诱导有丝分裂应激或细胞内递送双链DNA等技术为模拟这种自然激活过程提供了潜在途径，为STING通路激活研究提供了新的思路（图5B）。 激活佐剂的应用 Mn2+和Mg2+等金属离子已被证实具有作为STING通路激活佐剂的潜力。这些离子可局部应用，或通过药物平台与STING激动剂一起递送，以增强STING通路激活。其中，Mn2+在cGAS-STING通路激活和抗肿瘤免疫中发挥关键作用。研究表明，小鼠体内Mn2+缺乏会加速肿瘤生长和转移，同时肿瘤浸润CD8+T细胞数量显著减少。在细胞内，Mn2+被隔离在高尔基体和线粒体等膜结合细胞器中，病毒感染后释放到细胞质中。在细胞质中，Mn2+在STING激活中具有多种作用：可独立激活单体cGAS（无需双链DNA）；通过变构相互作用增强cGAS-双链DNA结合；提高cGAS的催化活性以产生更多cGAMP；并可能提高cGAMP对STING的亲和力。此外，Mn2+可独立于STING诱导TBK1磷酸化，促进IFN-β产生。这些特性使Mn2+成为STING激活的重要佐剂。例如，陈及其同事报道，Mn2+-cGAMP纳米疫苗（Mn2+-cGAMPNV）在小鼠黑色素瘤模型中显著增强了抗肿瘤免疫，与抗PD-L1抗体联合使用时，对原发性和远端肿瘤的控制效果更佳（图5C）。 增强STING激动剂的靶向性和递送效率 尽管STING激动剂具有全身给药的潜力，但其缺乏肿瘤特异性可能导致广泛的炎症反应。为了实现最佳治疗效果，STING激动剂必须特异性靶向肿瘤组织，最大限度地提高抗肿瘤疗效，同时最大限度地减少对正常组织的不良影响。这促使研究人员探索肿瘤靶向、稳定的STING激动剂和先进的药物递送系统，以优化STING激动剂的药理学特性和与载体材料的相容性，实现对肿瘤的可控、靶向递送，增强肿瘤内滞留，并减少脱靶效应（图5D）。 通过生化信号靶向肿瘤微环境：肿瘤微环境独特的生化特征（如缺氧、低pH和膜电位改变）为STING激动剂的靶向递送提供了途径。例如，MSA-2在酸性肿瘤微环境中具有更高的细胞膜通透性，有助于在肿瘤内积累并激活STING。 抗体-药物偶联物（ADCs）：抗体-药物偶联物（ADCs）为STING激动剂的靶向递送提供了巨大潜力。通过将生物活性药物与肿瘤特异性单克隆抗体偶联，ADCs能够在肿瘤部位精准释放药物，降低对正常组织的毒性。XMT-2056是一种将diABZI与抗HER2抗体结合的ADC，在体内成功诱导了强大的抗肿瘤免疫，其疗效是diABZI单独使用的100倍。尽管全身细胞因子水平仅轻微升高，但XMT-2056的I期试验在发生5级（致命）严重不良事件后暂停，这强调了创新药物研发中确保安全性的重要性。 纳米载体递送策略：纳米载体已成为极具前景的递送平台，通过细胞吞噬等机制促进STING激动剂的肿瘤靶向递送。其小尺寸和大表面积使其能够高效载药，并通过增强渗透和滞留效应延长循环时间。经过特殊修饰的纳米载体可进一步增强靶向性，甚至能够穿越血脑屏障等生物屏障。例如，戴恩等人巧妙设计了携带CDN-PEG化脂质的脂质纳米盘（LND-CDNs），以增强CDNs的膜通透性和细胞摄取。静脉注射后，LND-CDNs有效激活了肿瘤中的STING通路，引发了强烈的免疫应答。汉森等人利用PEG化脂质纳米颗粒将CDNs递送至引流淋巴结，其效果优于30倍剂量的可溶性CDNs。黄等人设计了一种肿瘤靶向脂质-树状大分子-磷酸钙纳米载体，该载体不仅具有出色的质粒DNA递送能力，还能有效激活STING通路。一种由Mn、STING激动剂（ABZI）和萘酞菁（ONc）配位的纳米颗粒（ONc-Mn-A）与马来酰亚胺修饰的普朗尼克F127（malF127）胶束组成的金属胶束纳米疫苗（ONc-Mn-A-malF），可有效激活STING通路，促进树突状细胞成熟，并最终通过CD8+T细胞和NK细胞清除肿瘤细胞。麦克安德鲁斯等人还设计了外泌体（iExoSTINGa），用于将cGAMP递送至抗原呈递细胞（APCs），与单一STING激动剂相比，其肿瘤抑制效果更优。其他例子包括：纳米颗粒-cGAMP，可增强cGAMP的细胞质释放；纳米颗粒PC7ANP，可引发强烈的细胞毒性T细胞应答，同时最大限度地减少全身细胞因子表达；ZnS@BSA（牛血清白蛋白），可在酸性肿瘤微环境中释放锌离子，显著增强cGAS/STING信号传导；以及cGAS-STING纳米激动剂（BSA-Man@Mn2+-Ft@Lap），可增强体内针对低免疫原性实体瘤的肿瘤特异性T细胞介导的免疫应答。 选择STING激动剂纳米载体递送系统的主要目标包括：最大限度地提高肿瘤特异性靶向性、延长半衰期、确保高效的细胞摄取和细胞质递送，最终在最小化脱靶效应的前提下，在内质网实现有效的STING激活。 ENPP1抑制剂的研发 为了应对CDN的不稳定性，研究人员开发了ENPP1抑制剂，以在肿瘤内局部抑制ENPP1，有效提高细胞外cGAMP浓度，同时减少免疫抑制性腺苷的产生。ENPP1抑制剂通常分为核苷酸类和非核苷酸类。前者虽然合成相对容易，但选择性有限，口服生物利用度低，且由于其与天然底物结构相似，存在脱靶效应风险。相比之下，非核苷酸ENPP1抑制剂（包括聚磺酸盐、多金属化合物、多糖和杂环化合物）正在探索中。尽管非核苷酸ENPP1抑制剂的早期研究面临挑战，但这些化合物为增强癌症治疗中的抗肿瘤免疫提供了一种有前景的新方法（图5E）。 优化STING激动剂的给药剂量和研发策略以改善治疗效果 探索STING激活的分子机制 郑团队最近发现了一种新型质膜结合STING异构体，称为“质膜STING（pmSTING）”。与经典的内质网结合STING（erSTING）不同，pmSTING的C末端位于细胞外，使其能够直接感知细胞外cGAMP，诱导TBK1和IRF3磷酸化，并触发免疫应答。这一发现表明pmSTING的进化在物种间可能具有保守性。传统上，研究主要集中在erSTING上，针对pmSTING的抗肿瘤治疗探索较少。这一研究重点的转变有助于降低药物剂量，提高治疗指数，并最大限度地减少全身毒性和副作用（图6A）。 图6 优化基于STING的免疫疗法的战略框架 （A）分子机制：pmSTING介导的免疫激活的示意图。pmSTING独特的拓扑结构和激活机制突出了其作为替代免疫靶标的潜力。 （B）药物开发：正在研究包括相分离调节和VRAC介导的递送在内的各种策略以增强STING激动剂性能。 （C）剂量-效应关系：钟形剂量-反应曲线表明，剂量不足和过量都会损害治疗效果，强调需要精确优化的给药方案。 （四）临床试验：扩大高质量试验证据对支持系统评价、指导合理临床应用至关重要。 研发STING相分离抑制剂和VRAC通道激动剂 在cGAMP浓度升高时，STING会发生液-液相分离，形成STING相分离器，隔离STING和TBK1，限制I型IFN产生并防止免疫过度激活。微管破坏剂可抑制STING凝聚物的凝胶状转变，为增强STING激活提供了一种新方法。除了传统的STING激动剂外，其他药物（如VRAC通道激动剂）在增强STING信号传导方面显示出潜力，尽管其在癌症免疫治疗中的应用仍有待进一步探索（图6B）。 优化STING激动剂的剂量和给药方式 为了最大限度地提高STING激动剂的抗肿瘤疗效，必须监测其在肿瘤微环境中的半衰期，以便精确控制给药剂量和给药方案。改进现有的纳米颗粒递送系统也可能有益，特别是如果这些载体能够同时递送STING激动剂和其他药物，以发挥协同抗肿瘤作用。简化制备步骤将进一步提高临床可行性。然而，值得注意的是，长时间暴露于高浓度的STING激动剂可能导致T细胞凋亡，从而抵消预期的免疫激活效果。因此，在临床开发之前，必须进行全面的安全性评估，确保治疗效果，同时最大限度地减少免疫毒性，以保护患者安全（图6C）。需要注意的是，优化STING激动剂的剂量和创新给药方式不仅可以提高抗肿瘤疗效，还可以降低与这些药物全身应用相关的细胞因子释放综合征（CRS）风险。此外，监测IL-10、IL-6和铁蛋白等CRS生物标志物，有助于发现CRS的发生。 推进STING激动剂的临床试验 目前已有多种STING激动剂正在进行临床试验，为优化剂量、递送方式和联合治疗提供了宝贵见解。一项临床研究表明，一线免疫治疗患者的客观缓解率（ORR）为16.2%，高于先前接受过免疫治疗的患者（7.2%），这表明在PD-1抑制剂之前使用STING激动剂可以更有效地激活免疫系统。值得注意的是，一名先前未接受过PD-1治疗的三阴性乳腺癌患者，接受200μgMIW815与spartalizumab联合治疗后，经过五个周期的治疗实现了完全缓解，这表明先前未接受过免疫治疗的患者可能特别受益于STING激动剂与PD-1抑制剂的联合治疗。 这些研究正在加速新一代靶向性更强、副作用更小的药物的研发。尽管已有多种STING激动剂进入临床试验，但已发表的临床数据有限，阻碍了对其疗效和安全性的全面了解。扩大临床试验数据将有助于更系统地评估其治疗价值，并指导未来的临床应用，以实现更安全、更有效的治疗（图6D）。 个性化治疗方案：增强STING激动剂疗效的策略和研究方向 不适用于STING激动剂的高CIN肿瘤患者的新策略 由于STING下游通路的快速适应可导致免疫逃逸，因此STING激动剂和抑制剂的分层使用至关重要。必须根据肿瘤分期、基因表达和CIN评分对患者进行分层。确定哪些患者将从STING激活中受益，以及哪些患者可能因肿瘤微环境诱导的应激而需要STING抑制，将有助于优化治疗效果。此外，在STING激动剂治疗期间，监测经典和非经典STING通路中的关键分子至关重要。应密切监测IRF3和NF-κB的激活，可使用荧光素酶报告系统（如ISRE-荧光素酶）反映IRF3活性，而双报告系统（THP-1-dual）可用于评估IRF3和NF-κB的激活（图7A）。 图7量身定制的方法：增强STING激动剂疗效的策略和研究方向 通过个性化的STING激动剂治疗，结合肿瘤特征和微环境因素，可以最大限度地提高抗肿瘤疗效。 （A）用于不适合STING激动剂的CIN高肿瘤患者的新策略。 （B）基于hSTING变体选择STING激动剂以提高功效。 （C）基于肿瘤和微环境生物标志物的分层治疗。 （D）逆转肿瘤细胞cGAS-STING信号传导的抑制。 （E）基于转移阶段优化STING激动剂时机。 （F）基于癌症类型和STING表达的间隔选择方法。 （G）用组合疗法克服对STING激动剂的继发性抗性。 （H）设计基于生物标志物的临床试验。 根据hSTING变异体选择STING激动剂以提高疗效 基于hSTING突变选择STING激动剂，需要通过基因测序鉴定癌症患者的特定hSTING突变，从而选择对这些变异体具有高活性的STING激动剂。然而，hSTING基因变异体的多样性和分布不均给选择带来了挑战。为了解决这一问题，研究人员正在开发广谱STING激动剂，例如新型环二核苷酸类似物c[G(2',5')U(2',5')]，其能够激活所有已知的hSTING变异体，且疗效与cGAMP相当（图7B(1)）。尽管其体内抗肿瘤作用尚未得到验证，但为设计通用STING激动剂提供了重要参考。SR-717的结合模式不受STING等位基因差异的影响，这进一步支持了在不同患者群体中探索此类药物的可能性（图7B(2)）。除了广谱激动剂外，设计特定STING激动剂可选择性调节STING活性。例如，酸响应纳米颗粒（PC7A）可非竞争性结合并激活STING，有效靶向对cGAMP不敏感的hSTING变异体，并产生快速且持续的生物学效应（图7B(3)）。 基于肿瘤和微环境生物标志物的分层治疗 预测STING激动剂疗效的生物标志物对于患者选择至关重要。STING通路中的关键分子（如pTBK1和pIRF3）在pIRF3核转位前的信号转导中必不可少，可作为预测STING激动剂疗效的生物标志物。结合肿瘤微环境中T细胞和BATF3谱系树突状细胞的分析，这些标志物能够更精确地选择患者（图7C(1)）。此外，探索不同肿瘤微环境细胞类型对STING激动剂的应答，对于开发更有效的细胞靶向治疗至关重要。研究不同肿瘤微环境细胞类型对STING激动剂应答的影响及相关因素，可为细胞靶向STING激动剂的研发提供参考（图7C(2)）。 逆转肿瘤细胞cGAS-STING信号传导的抑制 与DNA甲基转移酶抑制剂（DNMTis）联合使用，可通过抑制DNA甲基转移酶活性、重编程表观遗传谱以恢复STING信号传导并提高肿瘤免疫原性，从而增强STING激动剂的疗效（图7D(1)）。同样，研究表明与KDM5抑制剂联合使用可恢复乳腺癌细胞系中的STING蛋白水平，支持IFN应答，其效果与DNMTis相似（图7D(2)）。此外，与MPS1抑制剂（如BAY-1217389）联合使用，可诱导CIN和微核形成，激活STING信号传导。这种重新激活可恢复KRAS-LKB1突变肺癌中的T细胞浸润，克服由于线粒体功能障碍导致的STING沉默（图7D(3)）。 根据转移阶段优化STING激动剂的使用时机 研究人员旨在利用STING通路激活，在转移发生前清除癌细胞或将其维持在休眠状态。在肝内胆管癌小鼠模型中，MSA-2治疗对早期肿瘤具有特异性抑制作用，但对晚期癌症无抑制作用。尽管目前STING激动剂正在晚期癌症患者中进行评估，但由于早期转移阶段STING表达更高，且免疫逃逸肿瘤微环境尚未完全形成，因此在该阶段进行治疗可能更有效（图7E）。 根据癌症类型和STING表达情况选择治疗方案 在临床实践中，考虑不同癌症类型之间的差异至关重要。这种方法包括根据肿瘤微环境中STING和cGAS的表达水平以及CIN评分对患者进行分层，实现STING激动剂的个性化治疗，同时避免对不敏感肿瘤类型进行不必要的治疗（图7F）。 通过联合治疗克服STING激动剂的获得性耐药 为了应对免疫检查点分子上调、免疫抑制细胞激活和免疫效应细胞活性降低等获得性耐药机制，STING激动剂正越来越多地与各种疗法联合使用。这些联合治疗在手术、化疗、放疗、光动力疗法（PDT）、CAR-T和免疫检查点抑制剂（ICIs）等领域均显示出增强的治疗效果。例如，石等人发现，STING激动剂diABZI与IDO抑制剂1-MT的联合治疗显著促进了CD8+T细胞和树突状细胞的募集，同时减少了髓源性抑制细胞（MDSCs）的浸润，产生了显著的抗肿瘤效果。莱莫斯等人发现，STING激动剂环二腺苷酸单磷酸（CDA）与IDO1抑制剂lindrostat的联合治疗在小鼠LLC模型中显著增强了抗肿瘤疗效，从而延长了小鼠的存活时间。宋等人证实，STING激动剂与Toll样受体2激动剂的联合使用降低了肿瘤单核细胞中PD-L1的表达，重塑了肿瘤微环境，并增强了抗肿瘤免疫应答。在头颈部鳞状细胞癌模型中，STING激动剂的局部递送降低了手术切除后的复发风险。此外，在小鼠模型中，5-FU与cGAMP联合使用在增强抗肿瘤效果的同时，最大限度地减少了胃肠道副作用。值得注意的是，电针与抗PD-1疗法的联合治疗也通过激活STING通路，增强了微卫星稳定结直肠癌的抗肿瘤免疫应答（图7G）。 基于生物标志物的临床试验设计 推进STING激动剂治疗的精准性，需要将生物标志物引导的临床试验设计纳入其中。通过利用pTBK1和pIRF3等指示STING通路激活状态的生物标志物，研究人员可以更准确地预测哪些患者可能对STING激动剂产生阳性应答。将这些生物标志物整合到临床试验设计中，有助于最大限度地提高治疗效果，同时最大限度地减少治疗相关不良事件。随着该领域的发展，生物标志物鉴定与临床试验设计之间的协作对于充分发挥STING激动剂在癌症免疫治疗中的潜力至关重要，从而制定出更有效、更安全的治疗方案（图7H）。 临床开发中的STING相关药物 DMXAA mSTING激动剂DMXAA是首个进入临床试验的药物，多项I期和II期临床试验证实了其在多种实体瘤中的安全性和活性（表2）。在日本患者中进行了一项I期临床试验，评估ASA404与多西他赛联合治疗晚期或复发性实体瘤的安全性、耐受性和初步疗效（NCT01285453）。该研究招募了9名患者，结果显示ASA404与多西他赛的联合治疗具有可接受的耐受性，但疗效有限，1名患者（11.1%）达到部分缓解（PR），5名患者（55.6%）达到疾病稳定（SD）。在一项II期临床研究（NCT01057342）中，与单独使用卡铂和紫杉醇相比，添加DMXAA在晚期非小细胞肺癌患者中显示出意想不到的效果。此外，在III期临床试验（NCT00662597）中，由于物种特异性差异，DMXAA在晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的一线治疗中未能显示出疗效，导致试验终止。这一治疗失败凸显了STING蛋白多态性的重要性，并强调了深入了解人类药物-靶点相互作用的必要性。最近，特米佐兹及其同事提出，DMXAA在早期临床结果中的疗效可能与其对STING介导的免疫应答的有益拮抗作用有关，这值得进一步探索。尽管如此，STING激动剂的临床探索已进入hSTING激活剂的研发阶段（图8）。 图8 STING激动剂的临床开发：治疗策略和试验结果 一个时间轴总结了各种STING激动剂的临床开发，每种化合物根据其各自的临床试验阶段进行定位。颜色编码用于指示当前试验状态（例如，已终止、已完成或正在进行中），提供治疗策略和试验结局的清晰概述。 CDN类STING激动剂 由AduroBiotech开发的ADU-S100在过去十年中与诺华合作，积极开展了多项临床试验。尽管该化合物在临床前模型中显示出令人振奋的疗效，但无论是作为单药治疗（NCT02675439）还是与ICIs联合治疗（NCT03172936和NCT03937141），其临床活性均有限。因此，在ADU-S100单药治疗晚期/转移性实体瘤或淋巴瘤的I期试验（NCT02675439）中，该药物通过肿瘤内给药具有良好的耐受性，未出现剂量限制性毒性。然而，受益于该治疗的患者数量较少，仅2.1%的患者（n=1/47）达到PR，38%的患者（n=18/47）达到SD。随后，在一项Ib期研究（NCT03172936）中，ADU-S100与PD-1抑制剂spartalizumab联合使用，与单药治疗相比，应答略有改善。中期数据显示，在23名入组的三阴性乳腺癌（TNBC）患者中，17名可评估疗效，其中1名（4.3%）达到完全缓解，3名（13%）达到PR。 38名黑色素瘤患者中，35名可通过影像学评估疗效，其中3名（7.9%）达到PR，12名（31.6%）达到SD。同样，ADU-S100与抗CTLA4抗体pembrolizumab联合治疗的II期临床试验（NCT03937141）显示出较弱的临床数据，由于AduroBiotech与诺华之间的合作终止，该试验已停止。截至目前，基于令人失望的临床疗效，所有ADU-S100临床试验均已终止（表2）。可能导致这一结果的因素有很多。首先，ADU-S100的药代动力学特性不佳，肿瘤内给药后吸收迅速且半衰期短，这可能限制了药物在靶点部位维持有效浓度的能力。其次，给药途径和给药方案可能未得到优化，无法最大限度地发挥药物的治疗潜力。此外，髓源性抑制细胞（MDSCs）等免疫抑制细胞的诱导可能抵消了STING激动剂的预期免疫激活作用。这些发现强调了在人类中全面评估药物的药代动力学和药效学特性，并相应优化治疗方案的重要性。 默克公司正在开发药物候选物ulevostinag（MK-1454），并在两项人类癌症免疫治疗临床试验中对其进行了测试（表2）。在MK1454单独使用或与pembrolizumab联合使用的I期临床试验（NCT03010176）中，MK-1454单药治疗未显示出疗效，而联合治疗在皮肤或皮下病变患者中的客观缓解率（ORR）高达16.1%。所有入组患者均出现治疗相关不良事件（TRAEs），10.6%的患者（n=18/170）因严重TRAEs而退出试验。这表明联合治疗虽然显示出一定的潜力，但可能未针对患者的安全性和耐受性进行优化。未来的试验应侧重于优化给药方案，并确定更有可能从治疗中受益的患者亚组，同时最大限度地减少不良事件。在其与pembrolizumab联合使用的II期研究（NCT04220866）中，联合治疗组作为转移性或不可切除、复发性头颈部鳞状细胞癌的一线治疗，客观缓解率（ORR）达到50%（n=4/8），而pembrolizumab单独治疗组为10%（n=1/10）。 另一种小分子cGAMP类似物IMSA-101由ImmuneSensorTherapeutics研发，在临床前研究中显示出强大的免疫刺激活性和抗肿瘤疗效（表2）。IMSA-101单独使用或与ICI联合使用的IIa期研究（NCT04020185）最近已完成，I期研究已证实其安全性和耐受性。虽然在单药治疗队列中未观察到实体瘤疗效评价标准（RECIST）定义的应答，但在注射和未注射病变中均观察到显著的肿瘤消退。在联合治疗队列中，1名（5.6%）难治性葡萄膜黑色素瘤患者达到了持久的PR（肿瘤大小减少66%）。目前，IMSA-101正在与PULSAR放疗和ICI免疫治疗联合使用的II期研究中进行积极探索，用于治疗转移性恶性肿瘤患者（NCT05846659和NCT06601296）。迄今为止，IMSA-101的确切化学结构尚未公开。 武田制药公司设计的dazostinag（TAK-676）是一种合成的新型CDNSTING刺激剂，在同源小鼠肿瘤模型中静脉给药后，表现出强烈的STING依赖性抗肿瘤作用，可刺激细胞因子应答并有效激活肿瘤微环境中的免疫细胞。临床前研究已证实TAK-676是一种有前景的治疗候选物，多项临床试验已启动以评估其临床疗效（表2）。TAK-676联合放疗后pembrolizumab的I期研究（NCT04879849）最近已完成，结果有待发表，预计通过增强STING-IFN信号传导，可增强免疫应答以抵抗ICI药物耐药性。另一项正在进行的TAK-676单独使用或与pembrolizumab联合使用的I期和II期研究（NCT04420884）目前正在招募晚期实体瘤患者，预计于2026年完成。目前，中国已注册一项I期临床试验（CTR20234291），以评估TAK-676单独使用或与pembrolizumab联合使用的安全性、耐受性、药代动力学和药效学，但尚未开始招募。 MK-2118是默克公司开发的另一种CDN类似物，其结构尚未公开（表2）。2017年，其I期研究启动，旨在评估MK-2118单独使用或与pembrolizumab联合使用的安全性、耐受性和推荐的2期剂量（RP2D），MK-2118采用肿瘤内给药或皮下给药（NCT03249792）。公布的结果显示，在晚期/转移性实体瘤或淋巴瘤患者中，4.9%的患者（n=7/140）报告出现剂量限制性毒性（DLT），11名患者报告因治疗相关不良事件（TRAEs）而停药。目前，该研究已因商业原因终止。这表明未来的试验必须根据药代动力学和药效学研究结果优化剂量和给药频率，以提高治疗的安全性和有效性。 BMS-986301是下一代CDNSTING激动剂，最初由IFMTherapeutics设计，随后被百时美施贵宝收购（表2）。在小鼠结直肠癌肿瘤模型中，无论是单独使用还是与ICIs联合使用，该药物都能显著抑制肿瘤复发，同时在CT26小鼠模型中诱导免疫记忆。最近，研究人员发现，在PDAC小鼠模型中，肌内注射BMS-986301与肿瘤内给药相比，可实现相当的效应T细胞激活和抗肿瘤疗效，同时有效减轻T细胞耗竭和免疫抑制信号。在小鼠胰腺和肝脏原位模型中也观察到了相同的远隔抗肿瘤活性，这进一步支持了该药物全身给药的临床开发。目前，BMS-986301单独使用或与nivolumab和ipilimumab联合使用的I期研究（NCT03956680）刚刚完成，其目的是评估BMS-986301多种给药途径（肌内注射、肿瘤内注射或静脉注射）的安全性、耐受性和剂量限制性毒性（DLTs）。 BI-1387446（也称为BI-STING）是勃林格殷格翰设计的一种优化CDNSTING激动剂，据报道与STING蛋白的天然配体具有相似性（表2）。其对所有主要hSTING基因型均表现出优异的活性和选择性，即使在低剂量肿瘤内给药后，也能诱导持久的肿瘤抑制和免疫记忆。BI-1387446单独使用或与ezabenlimab（BI-754091）联合使用的I期首次人体研究刚刚在实体瘤患者中完成，结果有待发表（NCT04147234）。 E7766是一种新型大环桥联STING激动剂，是一种泛基因型STING激动剂，对四种主要hSTING变异体具有强大的结合亲和力。在小鼠CT26肝转移肿瘤模型中，肿瘤内给药E7766表现出高疗效和持久的免疫记忆应答（表2）。此外，在对BCG不敏感且对抗PD-1药物耐药的非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）模型中，膀胱内灌注E7766显示出强大的抗肿瘤活性，同时伴有STING-IFN通路的有效激活和下游细胞因子的诱导。这些令人鼓舞的结果推动了E7766作为单药在BCG无应答NMIBC患者中进行膀胱内给药的I期研究（NCT04109092），但该研究在未招募参与者的情况下撤回。另一项E7766单独使用在晚期实体瘤或淋巴瘤患者中进行肿瘤内给药的I期研究（NCT04144140）由于申办者的战略决策（与安全性无关）而终止，因此剂量扩展部分未招募参与者。根据剂量递增部分公布的部分结果，600μg和780μg组的剂量限制性毒性（DLTs）发生率分别为18.2%（n=2/11）和16.7%（n=1/6）。所有参与者均至少经历了一次治疗相关不良事件（TRAEs），并报告了8起严重不良事件。E7766的临床试验必须进一步研究最佳剂量和给药方案，以提高治疗的安全性和有效性。 此外，SB11285（NCT04096638）、DN-015089（CTR20212462）、TSN222（NCT05842785）和ONM-501（NCT06022029）等CDN类STING激动剂也已进入晚期实体瘤患者的临床试验（表2）（图8）。 工程细菌载体 基于细菌的STING激活剂SYNB1891是一种工程化的大肠杆菌Nissle菌株，能够在缺氧条件下将ATP转化为CDA，从而激活STING。利用APC对细菌的主动吞噬作用，SYNB-1891可精确减少“脱靶”效应，并有效驱动肿瘤微环境中吞噬性APC的STING-IFN通路激活，同时通过模式识别受体激活互补的固有免疫通路。临床前研究已证实其在B16.F10荷瘤小鼠中具有有效的抗肿瘤活性和建立免疫记忆的能力。此外，体外研究证实，这种新型激动剂可触发多种hSTING等位基因的激活。令人信服的初步结果推动了SYNB1891在难治性晚期实体瘤或淋巴瘤患者中的I期临床试验（NCT04167137）的开展（表2）。根据公布的结果，SYNB1891单独使用或与atezolizumab联合使用通过肿瘤内给药具有安全性和耐受性，并观察到血清细胞因子（如TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL1RA）的剂量依赖性诱导。所有患者均观察到治疗相关不良事件（TRAEs），32名患者中仅报告了1起剂量限制性毒性（DLT）。36%的患者（n=9/25）达到疾病稳定（SD），其中4名患者先前对抗PD-1/L1治疗无效，其余64%可评估的参与者出现疾病进展（PD）。尽管32名患者中有11名报告了严重不良事件，但未观察到与EcN相关的感染性毒性。然而，由于研究申办者的公司重心转向非肿瘤领域，其首次人体研究已提前终止，因此该试验在招募完成前被申办者终止（图8）。 ADC类STING激动剂 ADC已被广泛探索用于STING激动剂的全身靶向递送。利用针对肿瘤特异性抗原的抗体，STING激动剂ADC可将STING激动剂精确导向癌细胞，降低毒性和脱靶效应。与未偶联（游离）激动剂相比，STING激动剂ADC在体外试验中诱导的细胞因子和IFN水平高出100倍，并增强了肿瘤细胞死亡。多项临床前小鼠研究也证实了其依赖靶点的抗肿瘤免疫，肿瘤局部炎症细胞因子和免疫细胞浸润显著增加，而全身细胞因子水平出人意料地保持较低（图8）。 XMT-2056是Mersana Therapeutics开发的一种优化STING激动剂ADC，基于专门设计的Immunosynthen平台，靶向新型HER2表位。初步数据证实，无论是单独使用还是与其他HER2靶向药物和ICIs联合使用，其在体内均具有抗肿瘤活性。此外，XMT-2056在非人灵长类动物中即使在高剂量下也表现出良好的药代动力学和耐受性。此外，XMT-2056还显示出抗体依赖性细胞介导的细胞毒性功能，与STING激活协同作用，增强癌细胞杀伤效果（表2）。基于这些临床前结果，Mersana Therapeutics启动了XMT-2056单独使用在HER2阳性复发或转移性实体瘤患者中的I期临床试验（NCT05514717）。不幸的是，2023年3月，在剂量递增部分发生了一起5级（致命）严重不良事件，第二名入组患者（初始剂量水平）死亡，导致研究暂时暂停。其根本原因尚未公开，这引起了人们对ADC激动剂靶向STING的安全性和生物学平衡的关注。2023年底，美国食品和药物管理局同意继续进行该试验，但起始剂量较低。目前，该研究正在积极招募患者，预计于2027年完成。 另一种免疫刺激抗体偶联物（ISAC）STING激动剂TAK-500由武田基于TAK-676和IgG1抗半胱氨酸-半胱氨酸趋化因子受体2（CCR2）抗体开发。这种新型ISAC旨在通过将STING激动剂靶向递送至肿瘤浸润性CCR2表达髓系细胞（包括肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）），克服肿瘤对ICIs的耐药性（表2）。临床前小鼠模型已证实其通过诱导肿瘤微环境中CD8+效应T细胞的积累和激活，增强抗肿瘤免疫，从而提高存活率。TAK-500的作用机制包括三个方面：激活IFN信号传导、将表达CCR2的髓系细胞重编程为炎症表型，以及阻断抑制性TAM募集。TAK-500单独使用或与pembrolizumab联合使用在成人选择性局部晚期或转移性实体瘤患者中的I期研究（NCT05070247）目前正在招募患者，预计于2026年完成。 聚ADP核糖聚合酶7抑制剂RBN-2397 RBN-2397是一种选择性聚ADP核糖聚合酶7（PARP7）抑制剂，通过逆转PARP7对I型IFN应答的负调控，间接激活STING，从而恢复T细胞介导的抗肿瘤免疫并抑制肿瘤免疫逃逸。临床前小鼠肿瘤模型已证实，口服RBN-2397通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导持久免疫，以I型IFN依赖性方式诱导肿瘤特异性适应性免疫记忆和完全肿瘤消退（表2）。此外，另一种PARP7抑制剂JAB-26766在2024年美国癌症研究协会（AACR）年会上公布了临床前研究数据，阐明其与STING激动剂联合使用可协同激活STING通路。佩德雷蒂等人研究了STING激动剂diABZI与PARP抑制剂奥拉帕利在同源重组缺陷乳腺癌中的联合抗肿瘤作用，发现该联合治疗显著增强了免疫细胞浸润（尤其是NK细胞），并显示出优异的抗肿瘤疗效。RBN-2397单药治疗实体瘤患者的I期研究显示出良好的耐受性和临床活性，1名HR+HER2乳腺癌患者在100mg剂量下达到确认的PR，8名患者观察到SD持续超过18周（NCT04053673）。2022年启动了另一项RBN-2397与pembrolizumab联合使用在肺鳞状细胞癌（SCCL）患者中的Ib/II期试验，旨在探索RBN-2397在先前接受过PD-1/L1抑制剂治疗且观察到应答后疾病进展的SCCL患者中恢复对ICIs应答的能力（NCT05127590）（图8）。 SNX281 SNX281是一种新型小分子STING激动剂，具有良好的药代动力学特性，可通过静脉注射进行全身给药。在临床前研究中，SNX281在小鼠模型中显示出显著的抗肿瘤活性，能够有效根除某些肿瘤并诱导免疫记忆（表2）。目前，SNX281正在进行I期临床试验（NCT04609579），以评估其在晚期实体瘤和淋巴瘤患者中作为单药治疗和与pembrolizumab联合治疗的安全性和有效性。最终结果尚未发表（图8）。 STING抑制剂 虽然STING激动剂已进入癌症免疫治疗的临床试验，但STING抑制剂的作用主要集中在自身炎症性疾病和自身免疫性疾病的治疗中。这些抑制剂主要通过三种机制发挥作用：阻断棕榈酰化、与内源性配体竞争结合位点，或促进STING降解。Cys88和Cys91的棕榈酰化对于STING激活至关重要。C-176、C-178和H-151等共价抑制剂通过不可逆地修饰这些残基来阻止激活。内源性硝基脂肪酸（如10-NO2-OA）和衣康酸衍生物（如4-OI）通过烷基化Cys-91发挥类似作用。10-硝基油酸（CXA-10）是一种硝基脂肪酸，可与STING的半胱氨酸残基反应，阻止STING的棕榈酰化。CXA-10的临床试验已进入II期，其中三项已终止，一项已完成。其他化合物（包括AstinC、化合物18和SN-011）靶向C末端配体结合口袋，竞争性抑制cGAMP诱导的信号传导。最近开发的抑制剂（如BB-Cl-amidine和LB244）通过共价结合其他半胱氨酸（Cys-148或Cys-292），阻断寡聚化。此外，钩吻素甲等天然产物通过K48连接的泛素化促进STING降解。 值得注意的是，最近的研究发现，CDK4/6抑制剂哌柏西利也具有STING抑制剂的功能。其作用机制独特，可直接靶向STING的Y167位点，阻止二聚化，从而抑制其激活。此外，哌柏西利还可通过G166位点阻断STING-TBK1复合物的形成，进一步阻碍其激活。在DSS诱导的结肠炎和Trex1−/−介导的自身炎症性疾病模型中，哌柏西利已被证实可减少STING介导的炎症和组织损伤。这表明哌柏西利在STING抑制方面具有潜在的治疗应用价值，为自身炎症性疾病的治疗提供了新的见解和可能的药物选择。 尽管大多数STING抑制剂仍处于临床前开发阶段，但这些抑制剂具有令人信服的治疗潜力，值得进一步开展临床研究。 未来展望 作为癌症免疫治疗中一个新兴靶点，STING在抗肿瘤免疫周期的每个阶段都发挥着关键作用。最近，徐及其同事证实，cGAS-STING通路可独立于蛋白激酶TBK1激活转录因子EB，增加溶酶体生物发生并改善病原体清除。这一发现表明，STING激活不仅可增强免疫应答，还可影响自噬过程，这可能对癌症治疗具有重要意义。尽管STING激动剂在多种肿瘤的临床前模型中显示出显著疗效，但作为单药治疗的临床疗效仍然有限，且其机制尚不明确，这给临床应用带来了巨大挑战。本综述深入分析了STING激动剂临床应用面临的挑战及潜在解决方案。 首先，针对STING激动剂存在的细胞摄取不足、代谢稳定性差、靶向能力有限和肿瘤内递送困难等固有问题，研究人员提出了多种策略。目前的研究进展包括提高CDNs的代谢稳定性、开发非CDN类STING激动剂和ENPP1抑制剂、加入佐剂，以及采用ADC和纳米颗粒等靶向递送平台，以提高靶向特异性和递送效率。展望未来，临床试验将优先优化现有STING激动剂的给药方案和给药途径、开发新型稳定的STING激动剂，以及完善递送策略。同时，新的研究方向（如开发STING相分离抑制剂和VRAC通道激动剂）也在探索中。值得注意的是，进一步探索STING构象变化与激活之间的关系，以及pmSTING的机制作用，有望为STING激动剂的优化策略提供新的思路。 其次，肿瘤细胞的原发性耐药是导致STING激动剂无效的重要原因。目前，研究人员正在开发广谱STING激动剂，以适应不同的hSTING突变。此外，不同癌症类型的STING表达水平、肿瘤微环境的细胞组成、肿瘤细胞的STING抑制、表达水平的改变以及慢性激活导致的免疫逃逸等因素，均会影响治疗效果。这些因素强调了在使用STING激动剂时，需仔细评估治疗的适用性。研究人员还在研究DNMTis和MPS1抑制剂等药物，以恢复STING表达，并探索基于肿瘤生物学特征、分期、基因表达、CIN评分和STING下游分子激活状态的患者分层策略。 最后，获得性耐药是另一个重大障碍，涉及多个因素，如次级免疫检查点分子上调、免疫抑制细胞激活、免疫效应细胞抑制和免疫抑制因子增加。为了应对这些机制，STING激动剂正与其他疗法联合使用，包括手术、化疗、放疗、PDT、CAR-T、ICIs和靶向免疫抑制因子的抗体，旨在克服耐药性。 总之，下一代STING靶向策略的发展需要复杂且多方面的方法。这包括利用先进的筛选方法、基于基因组变异的精准选择、基于肿瘤和微环境生物标志物的分层，以及逆转抑制机制。展望未来，优化STING激动剂给药的时机和间隔、通过协同联合治疗克服耐药性，以及设计基于生物标志物的临床试验，将至关重要。这些协调一致的努力不仅将加深我们对STING激动剂的理解，还将为癌症治疗开辟更加个性化和有效的道路。通过将这些策略与正在进行的研究工作和临床试验和谐整合，我们可以展望STING基疗法成为癌症患者希望的灯塔。 临床前模型中机制研究的不断推进、临床试验的持续开展，以及激活STING的物理、化学和分子策略的发展，正在加速我们对STING激动剂原理和应用的理解。我们有信心，这些努力将带来更有效的STING基疗法，为癌症患者带来新的希望。 来源： Jiaqi Shi, Yingying Zhang, Na Zhao, Ekihiro Seki, Li Ma, Gordana Kocic, Xiaobo Li, Janoš Terzić, Tongsen Zheng,.Precision targeting of STING: Challenges, innovations, and clinical outlook for cancer therapy,The Innovation,2025,101074,https://doi.org/10.1016/j.xinn.2025.101074. 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