Japanese encephalitis vaccine(Acambis Plc)

摘要: 为了克服传统疫苗的局限性，出现了新的疫苗设计平台，如基于病毒载体和病毒样颗粒（VLPs）的平台。病毒载体疫苗高效且保护作用迅速。许多人类重组疫苗候选基于属于不同科的病毒，如腺病毒科、逆转录病毒科、副黏病毒科、弹状病毒科和细小病毒科。此外，首个获得许可用于人类疫苗接种的病毒载体疫苗是日本脑炎病毒疫苗。此后，已有几种病毒载体获批用于针对拉沙热、埃博拉、乙型肝炎、戊型肝炎、SARS-CoV-2和疟疾病毒的疫苗接种。VLPs是由结构蛋白自组装形成的纳米颗粒，模拟病毒颗粒，基于VLPs的乙型肝炎和戊型肝炎病毒、人乳头瘤病毒以及疟疾的疫苗已经商业化。正如COVID-19疫苗加速生产所证明的，这些新方法对于疫苗学以及针对病原体和新兴大流行威胁的快速响应是重要的工具。 1.引言  疫苗学时代始于1789年，当时爱德华·詹纳开发了第一种针对天花的疫苗。从那时起，疫苗已经预防了数百万人死亡，并且在1978年甚至导致了这种疾病的根除。在19世纪，巴斯德开创了基于病原体灭活或减毒的疫苗发展。在20世纪下半叶，使用细胞培养病毒促进了几种灭活和减毒疫苗的发展。 在20世纪末分子生物学出现之前开发的常规疫苗包括灭活或减毒病原体、类毒素、基于蛋白质的疫苗或细菌多糖。因此，它们的使用减少了如脊髓灰质炎、麻疹、破伤风和白喉等疾病的影响。然而，尽管进行了数十年的深入研究，针对某些人类病原体的有效疫苗尚未开发出来，例如表现出高度遗传变异（如人类免疫缺陷病毒[HIV]和丙型肝炎病毒）、导致持续或潜伏感染（如HIV、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、Epstein-Barr病毒）的病原体，或未能诱导无菌免疫。此外，传统疫苗存在几个缺点，如安全问题，包括减毒活病毒回复致病力的风险、污染活生物体的可能性，以及对免疫系统弱化人群的风险。同时，疫苗生产成本高且耗时长，需要更高水平的生物安全和专业实验室。 近几十年来，新的有希望的疫苗平台出现了，这些平台得到了遗传工程、分子和细胞免疫学、结构生物学、生物信息学、计算生物学、纳米技术和合成生物学的进步的支持，如重组病毒载体、病毒样颗粒（VLPs）、mRNA、合成DNA和细菌载体疫苗的情况。 此外，疫苗设计新技术是疫苗学中的重要工具，用于克服传统技术的限制，促进对新威胁如新出现病原体和大流行爆发的快速和有效响应。在这篇综述中，我们旨在总结病毒工程的最新进展，这些进展导致了对当前流行病原体如流感、埃博拉、艾滋病和COVID-19的安全有效疫苗的开发，特别关注基于病毒载体和VLP的平台。 2.基于病毒载体的疫苗  重组病毒是基因修饰的，并被设计用作针对传染病代理人的疫苗，以及在抗癌和基因疗法中使用。具体来说，病毒载体在基因疗法中的使用始于1990年代。从这一点开始，在遗传工程、重组DNA技术和开发拯救重组病毒的反向遗传技术方面取得的进展促进了基于载体的疫苗平台的发展。病毒载体是通过将外源性抗原或转基因，如感兴趣的免疫原，通过重组DNA工程插入病毒遗传物质构建的。此外，病毒载体被特别修改以根除其固有的致病属性。然后使用新构建的病毒载体将抗原基因传递给宿主，在那里高水平短暂表达以引发强大的免疫反应。此外，构建了多价或多病原体疫苗，以从相同或不同病原体同时表达各种转基因。而且，在被动免疫中，重组病毒携带抗体转基因。 迄今为止，已设计出两种主要类型的病毒载体：复制型和复制缺陷型载体。复制型载体扩增转基因并产生感染性后代，而非复制型载体传递单一转基因副本而不复制，这提高了其安全性。复制型载体通过模仿自然感染产生强烈的免疫反应。复制缺陷型载体在外来启动子的控制下表达免疫原，产生较弱的疫苗反应，可能需要使用佐剂。复制型载体包括腺病毒、逆转录病毒、弹状病毒和副粘病毒载体，而复制缺陷型载体包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒载体（表2）。还有单周期病毒载体可用，它们通过一轮复制增加抗原表达并避免病毒后代的形成。已从腺病毒和弹状病毒开发出单周期载体。病毒载体疫苗通常极其有效，并通过诱导强烈的体液和细胞免疫反应，包括干扰素和炎症细胞因子的产生，提供快速保护。通常不需要使用额外的佐剂，这简化了疫苗的组成和配方过程。表1总结了基于病毒载体的疫苗的主要优点和缺点。 许多基于病毒载体的疫苗已获准用于兽医用途，如犬瘟热病毒、猫白血病病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒（NDV）、传染性法氏囊病病毒和马立克病。例如，基于NDV的流感疫苗保护鸡免受高致病性禽流感的侵害，并在墨西哥和中国用作兽医疫苗。天花病毒是第一个作为疫苗载体针对乙型肝炎开发的。2010年，第一种病毒载体疫苗ChimeriVax-JE（Imojev）针对黄病毒属的日本脑炎病毒获得了用于人类的许可。ChimeriVax-JE是一种使用黄热病病毒17D株构建的减毒活疫苗，通过用日本脑炎病毒的相应序列替换编码前膜和包膜蛋白的序列。这种载体在澳大利亚和亚洲商业化，单剂量可迅速引发免疫反应，并具有良好的安全性。 虽然目前只有少数病毒载体疫苗获批用于人类（表3），但针对SARS-CoV-2的腺病毒载体疫苗的广泛使用已被证明是安全的。因此，目前正在进行许多使用重组病毒载体疫苗的临床试验。 许多人类重组疫苗候选基于属于腺病毒科、逆转录病毒科、痘病毒科、副黏病毒科、弹状病毒科、黄病毒科、披膜病毒科和细小病毒科的病毒，其中腺病毒和逆转录病毒是最广泛使用的载体。然而，选择用于设计疫苗的载体是根据要插入的基因的特性以及与预先存在的免疫力、病毒复制和遗传稳定性相关的安全考虑来决定的。下面总结了五种主要的被选为设计基于病毒的疫苗的病毒载体（表2）。 3.用于疫苗开发的主病毒载体  3.1. 腺病毒载体  腺病毒（Ad）载体已被广泛用作基因治疗的工具，并且是使用最广泛的疫苗平台之一。腺病毒科由非包膜的双链线性DNA病毒组成，长度从26到45 kb不等。基因组包含五个早期转录基因（E1A、E1B、E2、E3和E4）、四个中间转录单元（IX、IVa2、L4中间和E2晚期）、五个晚期单元（L1-L5）以及两端的两个倒置末端重复（ITR）序列。二十面体衣壳由三种主要蛋白质组成：纤维蛋白、五聚体和六聚体，后者是最丰富的蛋白质，含有主要的中和表位。存在100多种不同的人类腺病毒血清型，分为七个不同的物种（A-G）。最初，Ad5和Ad2是最广泛用于构建载体的血清型，因为它们最容易操作，生产和免疫原性高。然而，由于预先存在的免疫力，Ad5已被其他血清流行率较低的血清型所取代，如Ad6、Ad26和Ad35。此外，还开发了针对不同病原体和疾病的源自猿猴的腺病毒载体，包括流感、HIV、埃博拉、SARS-CoV-2和疟疾。使用腺病毒载体的优点包括增加转基因转导能力、广泛的细胞嗜性、能够感染分裂和不分裂的细胞以及抗原呈递细胞，以及它们不整合到宿主基因组中（表2）。此外，重组基因组在连续传代中表现出稳定的维持，这有助于快速和大规模生产，并产生高滴度稳定库存。如上所述，腺病毒载体的主要缺点是预先存在的免疫力和载体本身的免疫原性。这是因为腺病毒具有高度免疫原性，并能引起针对Ad主要衣壳蛋白的高滴度中和抗体。根据病毒基因组编辑，Ad载体被分类为第一代、第二代或第三代载体（图1a）。然而，第一代载体中已去除了负责病毒复制的E1B和E1A基因。此外，通过同源重组插入外源基因以及删除E3基因，使得转基因的大小从5增加到8 kb。同时，删除E3产物促进了免疫，因为它对于抑制宿主的免疫反应至关重要。在第二代Ad载体中，删除E4和E2区域增加了转基因容量并减少了宿主细胞中的毒性。第三代Ad载体，称为无肠载体或助手依赖型载体，除了包装信号Ψ和对病毒包装至关重要的ITR序列外，大部分结构和功能基因都被删除（图1a）。这些载体可以容纳高达35 kb大小的转基因。助手依赖型载体在保持免疫反应的同时提高了安全性。Ad载体通常是复制缺陷型的。此外，通过删除IIIa衣壳水泥蛋白设计了单周期Ad载体；例如，用于针对埃博拉病毒和SARS-CoV-2[129]的疫苗。使用动物模型进行的几项临床前研究导致了良好的免疫反应，使得单周期Ad载体用于人类疫苗开发非常有前景。已经开发了针对多种病原体的Ad载体技术疫苗（表3）。一些Ad载体疫苗仍在研究中，而针对埃博拉病毒和SARS-CoV-2的疫苗已经被商业化，我们将在以下部分讨论。  图1. 不同基于病毒的载体示意图表示：(a) 腺病毒载体。在第一代载体中，腺病毒基因组的E1A、E1B和E3基因被删除；在第二代载体中，额外删除了E2和E4基因；在第三代载体或无肠载体中，除了包装信号Ψ和ITR序列外，大部分病毒基因被删除。(b) 慢病毒载体。含有转移向量质粒的第三代慢病毒载体（带有被修改为自灭活型的慢病毒5'和3' LTRs和转基因）；包含HIV env或VSG-G的包膜质粒，以假型慢病毒颗粒的形式；以及两个分别编码gag或pol和rev的包装质粒。(c) 副黏病毒载体。展示了NDV载体。T7启动子系统用于从克隆DNA（cDNA）中拯救NDV。NDV，新城疫病毒；T7Pro，T7聚合酶启动子；T7ter，T7末端序列。ITR，倒置末端重复；Ψ，包装信号；LTR*，自灭活长末端重复。使用BioRender.com创建。 3.2. 逆转录病毒载体  在腺病毒之后，慢病毒是第二种最常用的病毒载体设计载体。慢病毒，如HIV-1，属于逆转录病毒科，这是一类包膜的单链RNA病毒。进入宿主细胞后，RNA被逆转录成DNA并整合到染色体DNA中。基因组编码三个必需基因（gag、pol和env）以及几个调节和辅助基因，用于小型六蛋白（tat、rev、vif、vpr、vpu和nef），这些基因对于病毒复制、感染和灭活宿主限制系统至关重要。gag基因编码结构蛋白，pol基因编码蛋白酶、这一组特有的逆转录酶和整合病毒DNA到宿主基因组所需的整合酶。env基因编码包膜（Env）糖蛋白，gp160，它经过蛋白水解裂解产生gp120和gp41跨膜糖蛋白。慢病毒载体在免疫方面具有巨大潜力，因为它们最佳地转导树突细胞并有效刺激T和B淋巴细胞。临床前研究表明，慢病毒载体能够引发强烈且持久的体液和T细胞反应，为许多传染病提供有效保护。其他导致慢病毒载体广泛使用的优点包括它们增强的能力来携带大型转基因（<8 kb），它们整合到宿主基因组中，确保高水平和持久的转基因表达，它们在分裂和非分裂细胞中的高转导效率，以及它们的低遗传毒性和免疫原性，包括低抗载体免疫。然而，慢病毒载体的广泛使用可能受到相对较高的生产成本以及与大规模制造相关的技术挑战的限制。主要缺点源于它们的整合，这可能诱发肿瘤发生（表2），尽管基于慢病毒的基因治疗临床研究表明插入性突变的风险很低。此外，慢病毒的前病毒整合位点不是随机的，而是相对非特异性。对于HIV，位点整合的偏好包括活跃转录的基因，而不是启动子区域。尽管如此，通过突变病毒整合酶已经产生了用于疫苗的非整合慢病毒载体。 大多数慢病毒载体是从HIV中产生的。第一代慢病毒载体是利用三质粒表达系统开发的，包括携带gag和pol基因以及辅助和调节基因的包装质粒；包膜质粒；以及带有被慢病毒长末端重复序列(LTR)包围的转基因盒的转移质粒（图1b）。慢病毒载体的细胞嗜性可以通过假型化来修改，从而相应地增加病毒的嗜性。在假型载体中，病毒受体结合蛋白Env被异源包膜糖蛋白所取代，其中弹状病毒水泡性口炎病毒(VSV-G)的G蛋白是最常用的之一。缺乏对假型慢病毒载体的预先存在的免疫力，加上它们低促炎特性，使它们成为粘膜疫苗策略的合适候选。第二代慢病毒载体通过从包装质粒中删除辅助毒力基因vif、vpr、vpu和nef而变得更安全。目前用于基因传递的第三代慢病毒载体也通过疫苗接种诱导强烈的免疫。在第三代载体中，病毒基因组被分离成三个不同的质粒（gag/pol、rev和env或VSV-G）。为了防止整个HIV基因组的转录，转基因被包含在一个额外的含有用于自我灭活的修改后的慢病毒LTR序列的质粒中（图1b）。慢病毒载体作为癌症疫苗的使用也在研究中，特别是用于黑色素瘤、淋巴瘤和前列腺癌。正如下一节将讨论的，已经设计了许多针对不同病原体的慢病毒载体，如流感病毒、西尼罗河病毒、HIV-1和SARS-CoV-2。 3.3. 腺相关病毒载体 在腺病毒和慢病毒之后，腺相关病毒(AAVs)是第三广泛使用的病毒载体。AAVs是属于细小病毒科的非包膜单链DNA病毒。AAVs是依赖性病毒，因为它们需要辅助病毒，如腺病毒或单纯疱疹病毒，才能复制。大多数AAV载体已用于基因治疗。AAV载体可以感染分裂和不分裂的细胞，并携带高达5 kb大小的转基因。AAV载体主要作为附加体存在，并以较低频率整合到第19号染色体。它们的优点是缺乏致病性、广泛的嗜性、低免疫原性、易于生产，以及建立长期转基因表达的能力。主要缺点是转基因的大小小（表2）。对于构建基于AAV的载体，病毒复制(rep)和结构(cap)基因被转基因表达盒(转基因与启动子和调节元件一起)所取代，两侧是AAV ITRs。已经评估了几种基于AAV载体的疫苗候选，编码针对病原体的抗原，如尼帕病毒、登革病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、HIV、埃博拉病毒(EBOV)、流感病毒和SARS-CoV-2。此外，还开发了许多基于AAV的载体，用于传递中和抗体基因的被动免疫策略。这种策略可以持续表达针对几种病原体的抗体，如HIV、流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)，对于这些病原体，疫苗尚未可用或效果较差。例如，已经证明通过鼻腔给药AAV血清型9载体表达重组单克隆抗体palivizumab可以有效地保护小鼠模型免受RSV挑战。 3.4. 弹状病毒载体 已经进行了大量基于弹状病毒载体的疫苗候选的临床前和临床研究，包括一些商业化的病毒载体疫苗（表3）。然而，与腺病毒、AAV和慢病毒载体相比，进行的研究较少。弹状病毒科包括具有典型子弹形状的包膜病毒，它们具有非分段的负义单链RNA基因组。基因组编码五种结构蛋白：核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大聚合酶(L)。反向遗传学的使用已经允许从克隆DNA中拯救负链RNA病毒。该系统最初是为1994年从cDNA中拯救狂犬病病毒开发的。其基因组的模块化组织便于遗传修饰，并提供了与大多数更复杂的DNA和正义链RNA病毒相比更大的操作性。使用弹状病毒载体的优点包括转基因大小（高达6 kb），这允许表达多价弹状病毒疫苗的多种抗原，细胞质复制，这降低了病毒整合到宿主基因组的可能性，低或缺乏预先存在的免疫力，以及在组织培养中高滴度复制（表2）。基于弹状病毒的疫苗候选主要使用狂犬病病毒和VSV。许多基于弹状病毒的载体是减毒的复制能力，尽管也设计了单周期载体。此外，在基于VSV的假型载体中，G蛋白（对病毒神经嗜性的主要贡献者）被另一种糖蛋白所取代。然而，复制缺陷的弹状病毒载体疫苗的免疫原性较低。已经开发了大量的重组狂犬病病毒，用于作为针对多种病原体的疫苗载体，如HIV、淋巴细胞性脑膜炎病毒、埃博拉和马尔堡病毒、拉沙热病毒、裂谷热病毒和SARS-CoV-2。特别是，表达拉沙热病毒糖蛋白复合物的狂犬病病毒载体疫苗，是一种灭活的双重候选疫苗，用于针对拉沙热病毒和狂犬病病毒。这种载体在小鼠和豚鼠模型中诱导了针对拉沙热病毒和狂犬病病毒的持久体液反应，并提供了针对拉沙热病毒的有效保护。与狂犬病不同，VSV会在牛、马和猪中引起疾病，但不会在人类中引起。编码外源蛋白的重组VSV是针对HIV、EBOV、结核病和SARS-CoV-2等的疫苗载体的优秀候选。使用VSV载体进行的首次成功试验之一是使用基于VSV的载体编码流感病毒血凝素抗原对小鼠进行疫苗接种。还开发了针对致命的新兴副黏病毒亨德拉和尼帕病毒的基于弹状病毒的疫苗候选。在许多情况下，受体结合的G糖蛋白被免疫原所取代。如上所述，VSV的G糖蛋白可以被纳入假型慢病毒载体。至少有两种基于重组VSV的疫苗已获准用于人类，即rVSV-ZEBOV和GamEvac-Combi，后者结合了表达EBOV包膜糖蛋白的重组VSV和Ad5（表3）。 3.5. 副黏病毒载体 副黏病毒科由具有负义单链RNA基因组的包膜病毒组成。副黏病毒基因组的组织与弹状病毒相似，编码五种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、附着糖蛋白(HN/G)和大型聚合酶(L)（图1c）。与弹状病毒类似，副黏病毒的模块化基因组便于通过反向遗传学进行操作。麻疹病毒(MV)于1995年首次被拯救，新城疫病毒(NDV)于1999年。许多基于副黏病毒的疫苗载体基于MV、人副流感病毒3型(HPIV3)和NDV。基于副黏病毒的载体提供了几个优点。它们不整合到目标细胞的基因组中，而是专门在细胞质中复制，没有DNA中间体。它们可以容纳6 kb的插入大小，提供高且稳定的异源基因表达，具有粘膜疫苗的潜力，制造简便且成本效益高。在NDV载体疫苗的情况下，它们基于鸡蛋的特性使其适合大规模生产（表2）。由于使用减毒活麻疹病毒取得了巨大成功，因此在病毒载体疫苗学领域很早就开始将其作为疫苗载体。不同的基于麻疹病毒的载体已在针对HIV、RSV、登革热、SARS-CoV、MERS-CoV、基孔肯雅、埃博拉和寨卡病毒、乙型肝炎、西尼罗河和SARS-CoV-2等广泛病原体和病毒的临床前和临床试验中使用。自然发生的无毒力NDV株作为活减毒疫苗在禽业中广泛使用。基于NDV的疫苗也已开发用于兽医用途。此外，由于宿主范围有限且缺乏预先存在的免疫力，基于NDV的载体在人类中使用安全。已设计基于NDV的载体携带来自EBOV、流感病毒、HIV、SARS-CoV和尼帕病毒等的抗原。还描述了使用编码SARS-CoV-2 S蛋白的NDV载体（表3）。基于HPIV3的载体疫苗已针对EBOV、RSV和SARS-CoV开发，包括针对儿童COVID-19疫苗的候选疫苗，但并未达到MV和NDV载体疫苗的程度。 4.类病毒颗粒  VLPs是由病毒结构蛋白自组装形成的纳米颗粒，模仿病毒颗粒。VLPs不含遗传物质，因此是复制无能和非感染性的。这显著提高了它们的安全性，与减毒活疫苗或重组病毒载体相比，因为不会像病毒载体疫苗那样合成更多的免疫原副本。VLPs可分为两类：非包膜和包膜。非包膜VLPs缺乏外部脂质包膜，而包膜VLPs具有来自宿主细胞的膜包膜，允许糖蛋白抗原被纳入脂质膜中。非包膜和包膜VLPs都可以是单层或多层的，由单个或多个蛋白质组装而成。一个简单的非包膜VLP的例子是HPV VLP疫苗，它由单层组成。流感VLPs是一个成熟的包膜VLP的例子。VLPs携带自身或外来抗原（嵌合VLPs）的特定病毒表位，安全地刺激体液和细胞免疫反应，并引发强大的免疫原性。VLPs通常表现出与它们起源的病毒的抗原相似性。它们以有组织和高度重复的方式呈现抗原，从而触发有效的体液和细胞免疫反应，这是由于具有重复表面的颗粒对B细胞的最佳刺激。此外，VLPs具有激活T辅助细胞的能力，因为它们自然编码激活细胞免疫反应的T辅助细胞表位。通过将特定的病原体相关分子模式(PAMPs)如单链RNA或CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODNs)装入VLPs，可以进一步激活免疫系统。这一特性即使在较低剂量下也增强了VLPs的免疫原性。来自35个病毒家族的100多种病毒蛋白，包括包膜和非包膜病毒，已被证明能够组装成VLPs。这解释了为什么使用VLPs提供了一个多功能的新兴平台，用于创建提供替代病毒载体使用的疫苗。由于设计和临床使用的种类繁多，这项技术的应用近年来经历了显著增长。通常，较低剂量的抗原足以诱导与亚单位疫苗相似的保护反应。病毒蛋白自发组装成VLPs确保了快速高效的生产，允许VLPs经济地大规模生产（表2）。除了用于传染病和癌症的疫苗接种，VLPs还可以用作药物、染料或纳米材料的载体，用于纳米医学。VLPs是通过将病毒结构基因分子克隆到表达载体中，然后在表达系统中表达这些基因而开发的。大约30%的VLPs是在细菌中生产的，尽管也使用不同的表达系统，如杆状病毒/昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物。大肠杆菌表达系统以其易用性和成本效益而著称。然而，由于缺乏翻译后修饰(PTM)系统，它在生产非包膜VLP方面的效用有限。在酵母中的生产具有低成本的生产和维护成本，但引入PTMs（例如，糖基化、磷酸化）的能力有限。相反，杆状病毒-昆虫细胞和哺乳动物细胞系统具有引发更完整的PTM修饰的优势，有助于生产包括多蛋白VLP组装在内的包膜和非包膜VLPs。此外，植物表达系统已成为降低蛋白质生产成本的多功能和有前途的平台。 第一个基于VLP的疫苗Recombivax HB于1986年获得许可，用于人类。它是一种在酵母中生产的乙型肝炎VLP疫苗，最早开发于1982年。从那时起，已经商业化了几种基于VLP的疫苗（表3）。Engerix-B是另一种针对乙型肝炎病毒的疫苗，也是在酵母中生产的。Gardasil和Gardasil9是商业化的基于VLP的疫苗的额外例子，它们在酵母中携带HPV的L1蛋白。最近的研究成功生产了携带Gag和p17和p24蛋白的基于HIV的VLPs。最近批准的两种疟疾疫苗RTS, S/AS01(Mosquirix)和R21/Matrix M，利用乙型肝炎表面抗原(HBsAg)VLP作为平台，在酵母中形成的VLP表面展示疟疾表位。Hecolin是唯一可以有效预防戊型肝炎的疫苗。它是在细菌中生产的第一种携带戊型肝炎病毒p239截短衣壳蛋白的VLP疫苗。第三阶段临床试验已确认Hecolin具有高免疫原性和效力，证明了其诱导显著滴度的戊型肝炎病毒抗体的能力。此外，利用大肠杆菌表达系统有助于成本效益生产。Hecolin于2011年在中国获得监管批准。最近，它被批准为第三代乙型肝炎疫苗PreHevBio，该疫苗在哺乳动物细胞中生产。针对疟疾、流感、HPV和西尼罗河病毒的疫苗是其他在细菌中生产的VLP疫苗候选的例子。杆状病毒/昆虫细胞系统是VLP生产的首选系统，因为它有助于高表达具有许多PTMs的多蛋白VLPs。这是Cervarix疫苗的情况，它包含HPV 16和HPV 18的L1衣壳蛋白。针对SARS-CoV-2、流感A、EBOV、腺病毒-7、HPV、HIV-1、乙型肝炎、SARS-CoV、登革热、狂犬病、轮状病毒、诺如病毒和疟疾的不同基于VLP的疫苗最近已获批准或目前正在临床试验中进行测试（表3）。 5.针对主要传染病和病原体的病毒载体疫苗  在本节中，我们将总结一些已获得许可用于预防主要疾病或正在多项临床试验中进行测试的新型疫苗载体。 5.1.埃博拉病毒疫苗  埃博拉是一种由丝状病毒EBOV引起的新兴疾病，已在西非和中非国家引起多次爆发，死亡率在25%到90%之间。迄今为止，已获得许可的埃博拉疫苗基于编码EBV的GP糖蛋白的病毒载体（表3）。Adv5-EBOV是2017年在中国获批的首个EBV疫苗，基于Ad5载体。Ervibo或rVSV-ZEBOV疫苗是一种活减毒重组VSV载体疫苗，其中VSV的G蛋白被EBV扎伊尔物种的GP蛋白所取代。rVSV-ZEBOV是2019年获得FDA批准的首个抗EBOV疫苗。临床前研究表明，Ervibo在小鼠和非人灵长类动物中对致命EBOV挑战提供保护，主要由抗GP抗体介导。该疫苗最初由加拿大公共卫生署开发，作为单剂量1毫升给药，并在2018年至2020年的爆发期间已为超过20万人接种。第三种EBOV疫苗是Zabdeno（Ad26.ZEBOV），一种腺病毒载体（Ad26）和Mvabea（MVA-BN-Filo）的两剂量组合，以及编码不同EBOV物种GP蛋白的改良牛痘病毒安卡拉（MVA）载体。GamEvac-Combi是一种异源载体疫苗，已获得紧急使用许可，结合了表达EBOV包膜糖蛋白的重组VSV和Ad5。 此外，许多埃博拉疫苗候选正在进行临床前或临床试验，包括使用副黏病毒载体、VSV和狂犬病病毒载体、巨细胞病毒载体，以及基于VLP的疫苗。 5.2.流感病毒疫苗  流感是由正黏病毒科病毒引起的疾病，影响全球15%的人口，每年导致多达64.5万人死亡。感染人类的三个主要属是流感A、B和C。正黏病毒具有负义、单链、分段的RNA基因组，由于基因突变和基因组重组，经常导致新变种。这一特性使有效疫苗的生产变得复杂。存在于家禽和野生鸟类中的许多禽流感病毒对人类构成人畜共患威胁。除了病毒的不同季节性变种的出现，流感病毒是导致未来大流行的强有力候选者。流感A是重组疫苗开发的主要目标，病毒包膜的血凝素（HA）是主要的抗原靶标。此外，NA、M1、M2、NP和病毒RNA聚合酶复合物免疫原也可以包含在载体中。 基于阿尔法病毒、痘病毒和腺病毒的不同病毒载体流感A疫苗已进入临床试验阶段。此外，已考虑使用副黏病毒、腺相关病毒和疱疹病毒作为疫苗载体。特别是，基于Ad5和Ad4腺病毒以及非人腺病毒载体（黑猩猩AdC7、AdC68和ChadOx1；牛BAdV-3；猪PAV-3）的疫苗正在临床前和临床试验中进行研究。Ad5载体疫苗据报道在单剂量下对流感病毒产生更强、更有效的免疫反应。编码流感病毒NP和M1基因的ChAdOX载体已完成两项I期临床试验。VXA-A1.1是一种基于Ad5载体的流感疫苗，编码HA免疫原，并使用双链RNA作为佐剂进行给药。VXA-A1.1疫苗也已完成II期临床试验。此外，基于MVA载体的几种疫苗已在动物模型和临床试验中进行了研究和测试。例如，表达流感病毒A的NP和M1蛋白的MVA-NP + M1疫苗（VTP-100载体）在I/IIa期临床试验中进行了测试，但未获成功。此外，委内瑞拉马脑炎病毒阿尔法病毒已作为流感疫苗载体进行了测试。慢病毒载体也被设计为流感病毒平台疫苗，并在临床前试验中进行了测试。具体来说，使用无整合酶的慢病毒载体传递了流感病毒的HA和NP抗原。用这种载体免疫的小鼠对流感病毒表面蛋白持续产生功能性抗体，并引发功能性T细胞反应，能够中和病毒的感染性。最后，在I、II和III期的多项临床试验中测试了基于VLP的流感疫苗的有效性，包括流感B疫苗。一项III期试验评估了针对流感病毒的四价植物源性VLP疫苗。该疫苗被配制以包含四种不同毒株的HA蛋白，并使用Nicotiana benthamiana作为生产平台。研究结果突出了这种植物源性VLP流感疫苗的免疫原性和安全性。表达HA和不同NA亚型的VLP衍生疫苗被认为是开发通用流感A疫苗的有前途的平台。 5.3.HIV-1疫苗  HIV是在1980年代首次被确认的，当时它造成了全球公共卫生威胁。该病毒属于逆转录病毒科，如前所述，包含具有单链RNA基因组的包膜病毒，在病毒生命周期中被逆转录为DNA。两种主要的HIV物种感染人类，即HIV-1和HIV-2。主要的抗原蛋白是病毒包膜糖蛋白，Env或gp160，它被蛋白水解激活成受体结合蛋白gp120和融合蛋白gp41。Env蛋白的两个主要特征赋予了它逃避中和抗体和非中和体液和细胞反应的机制。暴露的表位高度变异，具有高突变率，并且蛋白质具有高度的糖基化，使表位无法接触。因此，尽管进行了深入研究，至今仍未商业化有效的HIV疫苗。 已设计了不同的病毒载体用于HIV疫苗。病毒载体HIV疫苗旨在刺激针对Env蛋白（刺激产生中和抗体）或Gag、Pol和Nef蛋白（刺激T细胞反应）的保守表位的体液和细胞免疫反应。此外，腺病毒载体已被广泛使用。例如，STEP和Phambili IIb期试验已测试了编码HIV-1 B亚型gag、pol和nef基因的Ad5衍生疫苗。由于对这些载体的预先存在的免疫力，结果令人沮丧，导致设计了具有不同Ad血清型的载体，如Ad26、Ad35或黑猩猩腺病毒，已在多项临床试验中进行了测试。 除了腺病毒载体外，还设计了几种基于其他类型的载体的HIV疫苗，如慢病毒载体。THV01是一种由第三代慢病毒载体生成的慢病毒疫苗。它是一种复制缺陷型和自灭活载体，编码HIV Gag、Pol和Nef蛋白的片段。I/II期临床试验表明，这种载体具有高度免疫原性。基于NDV副黏病毒载体表达gp160 Env和p55 Gag蛋白已在临床前研究中进行了测试。编码env、gag和pol基因的canarypox ALVAC-HIV载体也在III期RV144试验中进行了测试。在这项研究中，病毒载体与增强剂和重组gp120蛋白疫苗结合使用。这次试验对HIV免疫产生了适度的结果。目前正在进行几项正在进行的有效性试验，以进一步阐明RV144试验的发现，包括对各种佐剂的有效性研究。 5.4.SARS-CoV-2疫苗  SARS-CoV-2是最近COVID-19大流行的病原体，是一种属于冠状病毒科的包膜病毒，具有正义单链RNA。表面刺突S糖蛋白是设计针对SARS-CoV-2疫苗的主要靶标。由于其在亚基S1和S2上的受体结合和融合活性，这种蛋白对病毒进入目标细胞至关重要。 已迅速且成功地开发了针对SARS-CoV-2的安全有效疫苗。此外，目前正在开发大量使用不同平台的SARS-CoV-2疫苗，包括病毒载体和基于VLP的疫苗。 许多疫苗基于复制缺陷型腺病毒载体，编码S蛋白的不同版本或表位，如受体结合域（RBD）。迄今为止，已有四种腺病毒载体疫苗获得批准（表3）。强生公司的Janssen Ad26.COV2–S SARS-CoV-2疫苗是一种复制缺陷型Ad26载体，编码全长S蛋白的预融合构象，该疫苗已于2021年在全球范围内获批使用。Gam-COVID-Vac或Sputnik疫苗由基于Ad26载体的异源方案和Ad5增强剂组成，两者都编码全长S蛋白，该疫苗于2021年春季在俄罗斯作为紧急疫苗获批。牛津/阿斯利康疫苗基于含有编码蛋白S的转基因的黑猩猩腺病毒载体（ChAdOx1 nCov-19）。Convidecia疫苗基于Ad5（Ad5-nCov9），由中国康希诺公司开发。 此外，目前正在进行大量的临床前和临床试验。AdCOVID是一种Ad5载体疫苗，表达S蛋白的RBD区域。这种载体能在小鼠中有效诱导粘膜免疫。第二代Ad载体hAd5-S-Fusion + N-ETDS编码刺突蛋白和N蛋白。该载体旨在免疫并保护可能的新出现的变体，目前正处于I期临床试验。GRAd-COV2是一种第一代大猩猩腺病毒载体，编码稳定在其预融合构象中的S蛋白，已在II期临床试验中进行了测试。 慢病毒载体编码全长、膜锚定形式的刺突S糖蛋白，在临床前动物模型中经鼻内接种后已被证明能对SARS-CoV-2提供保护。基于NDV的载体表达S蛋白，也已针对SARS-CoV-2设计并在I、II、III期临床试验中进行了测试。NDV-HXP-S载体包含一个增强免疫原性的S蛋白版本，维持刺突在稳定的预融合构象。这种疫苗可以高效地以低成本在受精鸡蛋中生产。NDV-HXP-S可作为活疫苗和灭活疫苗使用。I期临床试验表明，通过肌肉注射或鼻内途径给药，NDV-HXP-S载体既安全又具有高度免疫原性。在泰国，灭活的NDV-HXP-S疫苗已获得紧急使用授权。弹状病毒VSV也被用作针对SARS-CoV-2的疫苗载体，利用为设计埃博拉疫苗而发展起来的平台。这些载体表达S蛋白，无论是在其天然的未修饰的非稳定构象还是优化的预融合稳定构象，以及核衣壳蛋白。大量的基于MVA的SARS-CoV-2疫苗候选已设计并在临床前和临床试验中进行了测试。此外，源自不同病毒的VLP平台，如流感、NDV和Moloney鼠白血病病毒等，也被用于SARS-CoV-2疫苗开发。基于VLP的SARS-CoV-2疫苗目前正在临床前和临床研究中，Novavax NVX-Cov2373疫苗是唯一商业化的针对SARS-CoV-2的VLP疫苗。最近，加拿大批准了植物源性SARS-CoV-2 VLP疫苗Covifenz。 6.结论  病毒载体最初用于基因治疗，其中第一种疫苗是在1980年代开发的牛痘病毒载体疫苗。从那时起，已为人类疫苗接种设计了许多病毒载体疫苗，并已成为解决传统疫苗局限性的新平台。腺病毒载体在COVID-19疫苗接种中的广泛使用已证明这项技术既安全又有效。此外，病毒载体有助于重新设计新的病毒载体以应对新变体和新出现的病毒，并可用于大规模生产。 腺病毒载体在临床试验和获批疫苗中是最常用的载体。由于Ad5血清流行率，其他较不常见的人类和猿猴血清型被用作载体。然而，由于安全考虑，更倾向于使用复制缺陷型载体。此外，通常去除载体的病毒复制必要基因和防止宿主免疫反应的基因。这一领域的大量研究导致了第三代载体的设计，主要是腺病毒和慢病毒载体，导致转基因大小增加和安全概况改善。 一些病毒载体疫苗已获得人类疫苗接种的许可，然而，使用病毒载体疫苗候选的许多临床前和临床试验仍在进行中。病毒载体疫苗已在单一试验中进行了测试，并对HIV免疫产生了适度结果。因此，开发针对没有有效传统疫苗的病原体的疫苗，如HIV、丙型肝炎病毒和埃博拉病毒等，至关重要。 VLP是一种新兴的多功能疫苗平台，近年来已显著用于生产几种商业化疫苗。从这个意义上说，VLP衍生疫苗被视为对抗新出现的病毒和开发通用流感A疫苗的有希望的解决方案。 利用病毒载体和其他技术，如mRNA和蛋白质亚单位疫苗，为全球疫苗接种迅速开发COVID-19疫苗，突显了这些技术的成功。这一成功强调了拥有基于先前研究的正确平台的重要性，并验证了病毒载体针对新出现的病毒和大流行爆发的有效性。 7.展望  病毒载体和基于VLP的疫苗的巨大潜力推动了新疫苗的持续设计。目前正在开发大量针对重要病原体的疫苗，如流感、HIV、RSV、埃博拉病毒和SARS-CoV-2，有些处于临床前或临床试验阶段。然而，尽管在开发病毒载体和基于VLP的疫苗方面取得了显著进展，但仍需解决许多挑战。具体来说，进一步研究对于提高其安全概况至关重要，解决与预先存在的免疫、可能整合到宿主细胞基因组以及产生致病表型相关的担忧。此外，开发针对主要人类病原体或疾病（如HIV、Epstein-Barr病毒、丙型肝炎病毒和结核病）的有效疫苗至关重要。努力还应集中在创建通用流感疫苗和开发新载体以免疫可能的新出现的变体上。此外，改进多价疫苗、克服扩大病毒载体使用于被动免疫的挑战，以及推进病毒载体在预防性或治疗性癌症疫苗中的应用，是未来研究的关键领域。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 转发分享福利：疫苗研发企业、科研院校和监管机构人员，前30位报名人员转发分享会议信息可免费参会（不含餐饮）报名后，扫描下方二维码加工作人员微信后，发送截图即可。 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 大会日程 已经确定的报告人 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：纯化Vero细胞狂犬病疫苗（purified Vero cell rabies vaccine, PVRV）在狂犬病预防中的应用已历经40余年。对近年来国内外PVRV在狂犬病预防中的相关研究进行综述显示，在简化的Zagreb免疫方案中，PVRV具有与在标准Essen方案中相似的免疫原性和安全性。PVRV与鸡胚细胞纯化疫苗、人二倍体细胞狂犬病疫苗（human diploid cell rabies vaccine, HDCV）具有相似的免疫原性和安全性。在疾病等特殊人群中，PVRV也同样具有良好的免疫原性和安全性。此外，PVRV与吸附无细胞百白破灭活脊髓灰质炎联合疫苗(DTP-IPV 四联苗)等的联合接种并未发现免疫干扰现象，这为儿童在接种免疫规划疫苗同时进行狂犬病疫苗接种提供了可行性。PVRV与马狂犬病免疫球蛋白联合应用也可获得较好的预防效果。PVRV在预防狂犬病方面发挥着重要的作用，其广泛应用将为实现WHO提出的2030年消除犬传人狂犬病目标作出积极贡献。狂犬病是一种严重自然疫源性人畜共患传染病[1]。全球每年约59 000人因狂犬病而死亡[2]，其中99%的死亡发生在非洲和亚洲[3]，由其造成的经济损失估计为每年86亿美元[4]。中国是狂犬病流行较为严重的国家之一，每年约有4 000万人被动物咬伤[5]。接种人用狂犬病疫苗是预防狂犬病的重要手段，其发展经历了脑组织疫苗、禽胚疫苗和细胞疫苗阶段[6]，当前正研发mRNA等新型疫苗。20世纪80年代以来，以Vero细胞为基质生产的狂犬病疫苗开始广泛应用，对狂犬病的预防发挥了重要的作用[4]。我国批签发数据显示，2020年全年共签发1 755万人份人用狂犬病疫苗，其中Vero细胞基质生产的狂犬病疫苗签发量为1 573万人份，占全年狂犬病疫苗签发总量的90%[4]。本文将就纯化Vero细胞狂犬病疫苗（purified Vero cell rabies vaccine, PVRV）在狂犬病预防中的应用进行综述。01PVRV的国内外应用历史采用Vero细胞系生产人用疫苗的开创性工作是法国的Merieux研究所从20世纪80年代初发起的，该细胞系最初用于大规模生产灭活脊髓灰质炎疫苗和狂犬病疫苗，随后用于生产口服脊髓灰质炎减毒疫苗。PVRV（Verorab）由法国Merieux研究所研发成功。世界卫生组织（World Health Organization, WHO）推荐使用Vero细胞大量生产狂犬病疫苗，并于1987年颁发了Vero细胞生产人用纯化狂犬病灭活疫苗规程[7]。1983年，人们开始对PVRV的有效性进行研究 [8]。1985—2019年发表的关于Verorab的数项研究表明：暴露前免疫后2至8周的狂犬病病毒中和抗体（rabies virus neutralizing antibody, RVNA）血清转化率为90%~100%，1年时加强免疫后第14天的血清转化率达100%。暴露后预防接种后第14~28天的血清转化率为99%[9]。中国从美国国家菌种保藏中心引进细胞代次在126~134代的Vero细胞，于20世纪80年代末开始研制人用Vero细胞狂犬病疫苗。经国家药品监督管理局批准的用于生产Vero细胞狂犬病疫苗的毒株有2株，分别为CTN-1株和aG株，由中国药品生物制品检定所建株和保存[7]。CTN株于1956年在山东分离[6]。1989年李宏玲等[10]报道了用CTN株适应Vero细胞的研究。1998年张玉慧等[11]用Vero细胞适应10代以后的CTN毒种制备了Vero细胞狂犬病疫苗。1990年曾蓉芳等[12]进行了aG株在Vero细胞上的适应研究。同时期，长春生物制品研究所的科研人员也开展了狂犬病病毒疫苗株适应Vero细胞的研究[13]。2002年辽宁成大生物股份有限公司引进微载体生物反应器细胞培养技术，利用狂犬病病毒PV2061疫苗株和Vero细胞，开始研发PVRV，2005年获得国家药监局批准使用[4]。02PVRV的免疫原性和安全性2.1 Zagreb与Essen方案的免疫原性和安全性比较2017年，Shi N等[5]报道暴露后接种PVRV具有良好的安全性和免疫原性。这项研究采用Zagreb和Essen两种接种方案，结果显示Zagreb方案（n=4972）在第1次和第2次接种时的不良事件（adverse event, AE）发生率虽高于Essen方案（n=5587）分别为12.7%和8.9%，但两组之间在第3次（9.2% vs. 8.5%）和第4次（5.5% vs. 5.9%）接种时的AE发生率相似。在第14天和42天，所有受试者都产生了足够的RVNA。在第180天和365天，两组抗体水平急剧下降。但是，中和抗体>0.5IU/ml的受试者比例仍然很高，均>75%（第180天）和>50%（第365天）。1年后，经确认的狂犬病暴露受试者均未患狂犬病。对37名暴露于实验室证实的狂犬病病毒感染犬的受试者进行>12个月的随访显示，所有受试者中均未患狂犬病。与第0天测得的RVNA水平（0.12 IU/ml）相比，第14天（22.75 IU/ml，P=0.016）和第42天（16.44 IU/ml，P=0.000）RVNA水平显著增加。2021年一项随机、双盲、阳性对照、III期临床试验比较了Zagreb和Essen方案免疫接种PVRV在中国健康受试者中的免疫原性和安全性[14]。结果显示，Essen方案组的AE发生率显著高于Zagreb方案组（P=0.0248）。首次注射后，Zagreb方案组AE发生率高于Essen方案组，可能是由于Zagreb方案首次注射两剂PVRV，但组间并无显著差异。在疫苗接种前抗体呈阴性的受试者中，Zagreb和Essen方案组在第14、35、42天的抗体血清转化率均为100.0%；Zagreb方案组抗体几何平均滴度（geometric mean titer, GMT）不低于Essen方案组，且均远高于0.5 IU/ml的免疫保护水平。然而，在第7天，Zagreb方案组的抗体血清转化率更高，这表明该方案可更早诱导抗体反应[14]。2021年另一项上市后平行对照临床试验中，比较了Zagreb和Essen方案下PVRV的安全性和免疫原性[15]。研究未观察到严重AE。两种方案的AE总发生率和严重程度无显著差异，抗体GMT和血清转化率亦无差异。第14天，Zagreb组和Essen组受试者的抗体阳转率分别为100%和99.16%。第42天，两组血清转化率均达到100%。在关注的AE中，25例(5.22%, 25/479)局部事件和10例(2.09%, 10/479)全身事件来自Zagreb方案组；Essen方案组发生32例(5.33%, 32/600)局部AE和8例(1.33%, 8/600)全身AE。大部分AE为1级，轻微且短暂，且大多发生在早期接种。研究者显示，对于PVRV，在所有年龄组的患者中，Zagreb方案并不劣于Essen方案[15]。2019年，黄竹航等[16]对狂犬病暴露后使用Zagreb程序接种PVRV的3年免疫持久性及2剂加强免疫效果进行了观察。结果，接种疫苗后1年、2年和3年的GMT分别为1.33 IU/ml、1.04 IU/ml和0.72 IU/ml，血清阳性率分别为77.78%(84/108)、66.67%(70/105)和55.56%(50/90)。2剂加强免疫后1年、2年、3年的抗体GMT分别为16.83 IU/ml、19.37 IU/ml和21.05 IU/ml，加强免疫后抗体GMT 均显著高于加强免疫前。血清阳转率分别为100%(100/100)、99%(99/100)和100%(82/82)。可见，狂犬病暴露后使用Zagreb程序接种具有良好的免疫持久性，3年内2剂次加强免疫后具有较好的免疫应答。2.2 PVRV皮内注射与肌肉注射的免疫原性和安全性比较1987年，Phanuphak等[17]对58名受试者进行了狂犬病暴露后PVRV肌肉注射或皮内注射接种的免疫原性比较。结果显示，1/3剂量2位点皮内注射方案所获得的抗体水平与全剂量肌肉注射方案无显著差异。在一项I期临床研究中，研究者在60名18至50岁成年受试者中评估了一种新的PVRV肌肉注射或皮内注射的免疫原性。与市售PVRV肌肉注射相比，接种后第7天，各组间RVNA≥0.5 IU/ml的受试者比例无显著差异。第21天和第42天，所有受试者RVNA均达到保护水平。接种后第7天和第21天，各组的GMT均相似[18]。2008年，Warrell等[19]将254名受试者随机分为三种不同的皮内注射和标准5剂量肌肉注射方案四组。各皮内注射方案组的PVRV疫苗总剂量相同，且比肌肉注射方案少60%。结果显示，皮内注射方案与经典5针法免疫程序一样具有免疫原性。各皮内注射方案组间的免疫原性相似。接种后第7天，4位点、8位点、2位点皮内注射以及肌肉注射组中抗体>0.3 IU/ml的受试者比例分别为60%、77.6%、86.2%和62.5%。第14天，所有受试者的抗体水平均≥0.5 IU/ml。第90天，各组间GMT水平相似。在1年时，所有皮内注射组受试者抗体水平均>0.3 IU/ml，但肌肉注射组中有两人抗体水平≤0.3 IU/ml。Jaiiaroensup等[20]研究显示，在接受肌肉注射和皮内注射方案的1198名受试者中，注射部位瘙痒是唯一显著的局部AE，在皮内注射组更常见。低热是唯一显著的全身AE，在肌肉注射组更常见。84名（44名接受肌肉注射，40名接受皮内注射）有明确狂犬病动物暴露史者在3年后仍然存活，身体状况良好。2.3 PVRV与人二倍体细胞狂犬病疫苗（human diploid cell rabies vaccine, HDCV）的免疫原性和安全性比较Ajjan等[21]在144名兽医学校学生中比较了PVRV和HDCV应用于狂犬病暴露前预防（第0、7、21天接种疫苗）的安全性和免疫原性。结果显示，接种人群均未出现严重AE。HDCV组局部AE（红晕、硬结和疼痛）发生率显著高于PVRV组，全身AE组间无显著差异。HDCV和PVRV都具有良好的免疫原性，其中，PVRV的GMT显著高于HDCV（接种后5周：30 IU/ml vs. 23 IU/ml，P=0.016；第4.5个月：6 IU/ml vs. 3 IU/ml，P=0.006；第21个月：3 IU/ml vs. 2 IU/ml，P=0.012）。两种疫苗的免疫反应均在首次接种后4个月迅速下降，此后在整个研究期间抗体水平保持稳定。值得注意的是，在首次注射21个月后，两组仍保持>90%的血清转化率。一项在80名肯尼亚健康医学生中进行的研究比较了PVRV和HDCV用于狂犬病暴露前预防（第0、7、28天接种疫苗）的抗体反应。结果显示，两种疫苗均引发了快速抗体反应，两组在接种后第7天的血清转化率分别为34%和17%。接种后第28天，两组受试者血清转化率均为100%。PVRV诱导的抗体GMT高于HDCV，但差异并不显著[22]。Strady等采用相同暴露前预防方案的研究同样证实，PVRV和HDCV免疫原性相似：免疫后14 d血清转化率均为100%，1年后加强免疫后14 d血清转化率均为100%，10年加强免疫后血清转化率分别为96.2%和96.9%[23]。2022年，Quiambao等[24]开展的一项III期、多中心、开放标签、随机对照试验，在570名2~64岁健康受试者中使用HDCV或PVRV进行了为期1周的肌肉或皮内注射暴露前预防，暴露前预防方案包括：第0、7天，HDCV肌肉注射（1组）；第0、7、21天，HDCV肌肉注射（2组）；第0、7天，HDCV皮内注射（3组）；第0、7天，PVRV肌肉注射（4组）；第0、7天，PVRV皮内注射（5组）。1年后进行模拟暴露后预防接种（2剂HDCV或PVRV，间隔3 d）。暴露前预防最后1次接种后14 d，血清转化率均很高（1组、3~5组为96.7%~97.2%，2组为100%）。模拟暴露后预防后，除1名受试者外，其余受试者均实现了快速血清转化（GMT≥0.5 IU/ml）。各组疫苗的耐受性良好，接种部位和全身AE发生率相似。研究期间无死亡、严重AE或导致接种中断的AE。该研究显示，HDCV和PVRV的1周暴露前预防方案在不同年龄组（2~64岁）均提供了有效的免疫保护，能够在模拟暴露后疫苗接种后启动快速而有效的免疫反应。2015年，蔡勇等[25]以1 200名10~60岁高危狂犬病感染的健康人为研究对象，随机分为HDCV组和PVRV组，按照Essen暴露后接种程序，分别于第0、3、7、14和28天经上臂三角肌肌肉注射接种1剂疫苗。结果所有受试者接种疫苗后反应轻微，均未发生Ⅲ级及以上AE，所有AE均在72 h内恢复。两组局部AE总发生率分别为7.67%(46/600)和6.83%(41/600)，全身AE总发生率均为5.00%(30/600)。HDCV组和PVRV组首剂免疫后7、14、42 d的血清转化率分别为28.77%(84/292)、100%(292/292)、100%(292/292)和28.72%(83/289)、98.96%(286/289)、100%(289/289)；抗体GMT分别为0.2748 IU/ml、19.7443 IU/ml、37.5750 IU/ml和0.2474 IU/ml、17.3274 IU/ml、37.7231 IU/ml。在安全性和免疫原性方面，两组间差异均无统计学意义。2022年一项纳入27项研究，共计18 630名受试者的Meta分析显示，与PVRV相比，HDCV在狂犬病暴露后预防的安全性方面表现出优越性，但在免疫原性方面未观察到显著差异。HDCV的总体AE的汇总发生率为3.2%（95%CI: 0.9%~10.9%），PVRV为11.7%（95%CI: 5.2%~ 24.1%）。与PVRV相比，HDCV接种导致局部疼痛、发热和虚弱的发生率较低，分别为PVRV的51%（RR=0.51，95%CI: 0.21~0.98）、20%（RR=0.20，95%CI: 0.03~0.64）和25%（RR=0.25，95%CI: 0.06~0.73）。HDCV的汇总血清转化率为35.7%（95%CI: 8.6%~ 69.3%），PVRV为55.6%（95%CI: 22.6%~86.2%），二者在接种后第7天的血清转化率或第14天的RVNA水平无显著差异[26]。2.4 PVRV在特殊人群中的免疫原性和安全性多种疾病，如先天性免疫缺陷、艾滋病、骨髓移植、恶性肿瘤和癌症（白血病、淋巴瘤）、肾衰竭、糖尿病或肝硬化，以及使用皮质类固醇、抗代谢药物、烷基化剂等治疗也会导致患者免疫功能受损，这可能会抑制机体对疫苗的免疫反应。2015年伊朗一项研究对特殊疾病患者按照Essen方案进行暴露后肌肉注射PVRV的免疫反应进行了评估。受试者所患疾病包括慢性乙型肝炎病毒感染、淋巴瘤、糖尿病、类风湿关节炎和红斑狼疮服用皮质类固醇等导致机体免疫功能受损等。结果显示，特殊疾病患者可成功获得血清转化。接种疫苗后第14天至第35天（接种最后1剂PVRV后1周），所有受试者的抗体滴度均>0.5 IU/ml[27]。Tanisaro等[28]对血液透析患者暴露后皮内注射PVRV后的免疫反应进行了研究。20名血液透析患者接受了标准的泰国红十字会皮内狂犬病疫苗免疫方案。在进行疫苗接种之前，20名患者中有6名患者的RVNA超过0.5 IU/ml的保护水平。接种疫苗后第14天，所有受试者的RVNA均高于0.5 IU/ml。接种疫苗后第90天，14名患者中有13名患者的RVNA高于保护水平，有效率为92.8%。未发现严重AE[28]。Cramer等[29]在2008年报道了8名儿童实体器官移植受者（5名肝脏移植、3名肾脏移植）接受暴露后预防处置（post-exposure prophylaxis, PEP）后均获得充分的免疫应答。患儿均未发生狂犬病或对PEP有任何严重AE，免疫期间未发生同种异体移植排斥反应。根据血清学反应，与接受三联药物治疗相比，接受他克莫司单药治疗患儿的RVNA滴度更高。另有一项研究[30]报道了一名48岁的男性肾移植患者被一只狂犬病犬咬伤，该患者的免疫抑制治疗方案包括环孢素60 mg/d、霉酚酸酯250 mg/d和泼尼松5 mg/d。在伤口护理后的第0、3、7、14和28天，患者接受了5剂PVRV，并于咬伤后注射了人狂犬病免疫球蛋白（human rabies immunoglobulin, HRIG）。在注射第3剂疫苗后，患者即获得足够水平的RVNA。但在第28天检测到抗体滴度下降。遂即调整免疫抑制方案：撤除霉酚酸酯并减少环孢素剂量，并于第38、41、45、52和66天进行加强免疫。在随后的12个月内，患者恢复了足够水平的RVNA。事件发生19个月后，患者仍具有良好的移植肾功能，未发生狂犬病。然而，患者所获得的免疫应答是强化免疫的结果，还是减少免疫抑制的结果，仍有待确定。除伴有基础疾病的患者外，孕妇也是一个特殊的群体。由于关系到胎儿的安危，孕妇接种疫苗的安全性备受关注。早在1989年就有研究者评估了孕妇接种PVRV的安全性[31]。21名孕妇于暴露后接种了PVRV，其中12名严重暴露者同时注射马狂犬病免疫球蛋白（equine rabies immunoglobulin, ERIG）。结果显示，受试者AE轻微、短暂，无需治疗。15%（3/20）的患者报告有副作用，如肌肉痛、不适、注射部位红斑和肿胀、荨麻疹皮疹和轻度局部淋巴结病。随访1年后，母亲或婴儿均未患狂犬病，未发现先天性畸形，所有婴儿的健康状况良好。这与之后Sudarshan等的研究结果一致。在他们的研究中还评估了孕妇暴露后接种PVRV的免疫原性：所有孕妇接种疫苗后第14天到第365天的血清RVNA滴度远远高于最低保护水平0.5IU/ml；部分婴儿（最大为3月龄）的血清中也发现保护性抗体水平[32]。2013年来自中国广州的随访研究评估了妊娠期狂犬病暴露后Essen免疫方案的安全性[33]。接种PVRV后，所有受试者均未出现中度或重度AE。个别受试者表现出轻微的副作用，如疼痛、红斑、发热、头痛和疲劳，无需药物治疗。AE程度并不比其他近期研究结果中的普通人群更严重。所有经阴道或剖腹产分娩的婴儿均发育正常。该研究提示，中国需要采取教育等措施来阻止因担心狂犬病疫苗的接种风险而实施的终止妊娠行为。2.5 PVRV与其他疫苗的联合接种研究目前，有多项研究评估了婴儿PVRV暴露前预防与吸附无细胞百白破灭活脊髓灰质炎联合疫苗(DTP-IPV四联苗)联合接种的可行性。越南一项研究将84名婴儿随机分为两组，分别在2月、3月和4月龄时接种3剂DTP-IPV（n=43），或在2月和4月龄联合接种2剂PVRV（肌肉注射，n=41）。所有婴儿均获得了对白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎的血清免疫。对于各种抗原，两组间的抗体GMT无显著差异。接种PVRV 1个月后RVNA GMT为20.09 IU/ml，所有婴儿的RVNA滴度均高于0.5 IU/ml。未报告严重AE，两组之间的全身反应也无差异。可见，婴儿联合接种PVRV和DTP-IPV是安全的，且具有高度免疫原性[34]。其后，越南另一项研究评估了PVRV暴露前预防（1/5剂量皮内注射）与DTP-IPV联合接种的免疫原性和安全性，并与DTP-IPV联合PVRV肌肉注射进行比较。皮内注射组更多的婴儿出现局部反应，特别是发红，但这些反应通常是轻微和短暂的。两组的全身反应发生率相似。尽管在第3次接种疫苗后1个月，肌肉注射组的RVNA滴度较高（30.6 IU/ml，皮内注射组为12.0 IU/ml），但两组均达到WHO规定的可接受的保护性抗体滴度（≥0.5 IU/ml）。接种疫苗后，两组的白喉抗体水平均显著升高。所有婴儿都具有脊髓灰质炎病毒I型、II型和III型的血清保护性抗体滴度。以上结果表明，DTP-IPV和PVRV之间不存在免疫干扰，且低剂量PVRV皮内注射接种对婴儿安全且具有免疫原性。因此，PVRV与免疫规划疫苗联合接种，可在不影响疫苗的安全性或免疫原性的情况下，将与狂犬病接种相关的成本降至最低[35]。暴露前PVRV与DTP-IPV联合接种还可为儿童提供长期的保护作用。越南一项长达5年的随访研究中，追踪了两组儿童，分别在2、3、4月龄和1岁时接种DTP-IPV，或在2、4月龄和1岁时联合接种3剂PVRV。5年后，两组分别有96.7%和93.8%的儿童血清保护性白喉抗体滴度≥0.01 IU/ml；所有儿童均具有血清抗脊髓灰质炎（I型、II型和III型）抗体保护性滴度（≥5 1:dil）；超过60%的儿童仍然具有保护性RVNA（≥0.5 IU/ml）。可见，PVRV与DTP-IPV联合接种可诱导对所有抗原的保护性抗体滴度持续至少5年。在狂犬病流行率高的国家，如越南，在免疫规划同时考虑暴露前狂犬病疫苗接种是一个现实可行的方案，可以为大多数狂犬病感染风险高危人群，即儿童，提供长期的狂犬病预防保护[36]。除与DTP-IPV联合接种外，PVRV与破伤风、乙型脑炎（Japanese encephalitis, JE）等疫苗联合接种亦表现出良好的安全性和免疫原性。研究发现，在Zagreb免疫程序中，铝佐剂破伤风疫苗与PVRV在同一注射器中联合接种对PVRV具有免疫增强作用。破伤风抗体水平未受影响，无论是否存在氢氧化铝，接种1剂破伤风类毒素3周后，破伤风抗体水平增加100倍以上。在第21天接种另一剂破伤风类毒素后，破伤风抗体水平进一步增加。虽然联合破伤风类毒素组更易出现局部疼痛和肿胀，但组间并无显著差异。所有副作用均轻微且短暂、耐受性好，且主要在首次接种后出现[37]。近期，泰国学者对儿童同时接种嵌合乙脑减毒活疫苗（Japanese encephalitis chimeric virus vaccine, JE-CV）和PVRV（暴露前两位点皮内注射接种）的免疫原性和安全性进行了研究。49名12~16月龄血清阴性儿童按2:1随机分为两组：A组受试者于第0、28天在两个位点皮内注射0.1 ml PVRV，B组受试者在第0、7、28天肌肉注射0.5ml PVRV。两组均在第0、365天皮下接种1剂JE-CV。结果显示，所有儿童在第42天的RVNA均＞0.5 IU/ml，两组抗体GMT无显著差异。在第365天，两组均有92.3%的儿童RVNA持续超过0.5 IU/ml。两组在接种JE-CV后第42天的血清转化率和抗体GMT均无显著差异。初次免疫后1年，两组均保持高血清阳性率和抗体GMT。两种疫苗联合接种后30 min内均未出现速发反应或疫苗相关的严重AE。注射部位AE均轻微。在被咬伤后长达12个月的随访中，未报告狂犬病相关的发病或死亡。由此可见，暴露前PVRV两位点皮内注射免疫与JE-CV联合接种对学步期儿童具有免疫原性和安全性，二者之间不存在免疫干扰，这可能是亚洲儿童预防狂犬病和JE的一种新的具有成本效益的策略，也可能有助于在幼儿期进行暴露前狂犬病疫苗接种[38]。2.6 PVRV联合免疫球蛋白的应用研究有研究显示，免疫球蛋白对PVRV的免疫原性具有抑制作用，其中HRIG的作用较ERIG更明显。该研究按照2-1-1暴露后免疫程序，将受试者分为3组，第一组只接种PVRV，第二组和第三组接种PVRV的同时，接受ERIG或HRIG。结果显示，在接受免疫球蛋白治疗的两组中，第28天的血清转化率未达到100%，分别为94.4%（34/36）和90.7%（49/54），抗体GMT较低。第一组的抗体滴度显著高于其他两组，这种显著差异在第90天持续存在[39]。但也有研究发现，在III级暴露患者中，PVRV联合HRIG免疫后7 d，血清转化率即达到100%[40]。泰国红十字会对100名确认被狂犬病动物严重咬伤的泰国暴露者进行了暴露后皮内注射免疫的前瞻性评估。分别在第0、3、7天在两个部位皮内注射PVRV。第0天，96名暴露者接受ERIG。暴露后随访1年，无死亡病例发生。根据历史对照，如果不治疗，约有14名暴露者预计会死亡。因此，该方案的有效率为100%。3名暴露者在第6天和第7天出现与ERIG相关的轻度迟发过敏反应，但经抗组胺药和止痛药治疗后获得缓解，无需改变治疗计划。1名暴露者有轻微的迟发过敏反应，再次注射PVRV后病情加重，因此被认为非ERIG所致。10名暴露者出现无痛暂时性局部淋巴结病，3名出现可能由于疫苗、同时接种破伤风类毒素、抗生素或传统治疗而引起的轻度发热、不适或头痛。随机选择的10名暴露者均获得了血清转化。免疫后14、90和360 d，所有患者的抗体滴度均保持在0.50 IU/ml以上[41]。我国一项研究报道，在III级暴露者中，联合使用PVRV和ERIG的全身反应发生率为7.6%（13/171），PVRV和ERIG的局部反应发生率分别为1.3%（11针次/849针次）和10.53%（18/171）。接种第14、28天的血清转化率均达到100%，抗体GMT均大于0.5 IU/ml[42]。Lang等[43]研究了PVRV Essen免疫程序与一种新的高纯度热处理ERIG（PHT-Erig）联合使用的安全性和免疫原性。研究未报告严重AE，特别是未观察到速发或迟发过敏反应。第14天，所有受试者均获得保护性抗体滴度。在28 d的随访期内，PHT-Erig与市售ERIG组均可产生足够的抗体反应，抗体GMT无显著差异。在儿童和孕妇群体中，PVRV联合ERIG亦具有良好的安全性。研究人员对1 494名＜15岁的III级暴露儿童进行了研究。暴露儿童在第0、3、7、28天在两个部位皮下注射0.1 ml PVRV。第0天给予ERIG。对ERIG的皮肤试验呈阳性反应的儿童在口服抗组胺药（左旋西嗪）后给予ERIG。未发生严重的全身副作用，低热和不适是观察到的唯一全身副作用。所有儿童均无过敏反应或局部淋巴结病。第5天和第7天，仅3%的儿童出现轻微的血清病样症状，口服止痛药和抗组胺药后症状消失[44]。另一项研究对接受Essen方案狂犬病暴露后预防的14名孕妇进行随访。其中8名接受了ERIG治疗。研究未报告疫苗或ERIG的任何AE。所有孕妇均安全行阴道分娩，母亲和婴儿均健康无异常[45]。03总结目前，狂犬病疫情形势与实现WHO提出的2030年消除犬传人狂犬病目标还有差距，需要全社会的共同努力。在具有良好安全性与免疫效果的情况下，PVRV，尤其是采用Zagreb免疫程序接种，以及与DTP-IPV等疫苗的联合接种对于推广狂犬病疫苗的使用具有重要的实际意义。现阶段我国批准使用的狂犬病疫苗免疫程序有两种：Essen方案和Zagreb方案。Zagreb方案在我国于2010年获得批准，于2016年列入《狂犬病预防控制技术指南》[2]。WHO在1992年就推荐使用Zagreb方案，因为Zagreb和Essen方案相比，具有早期RVNA阳转率更高、依从性高和经济负担少的优点[2]。与 Essen方案相比，Zagreb方案可减少1剂次疫苗的接种费用和2次就诊，提高疫苗的全程接种率[46]。狂犬疫苗接种的依从性是治疗有效性的有力保障。Zagreb程序接种PVRV的不良反应并未增加，但接种的依从性更高[46]，经济成本更低[47]，值得在临床上进一步推广和应用。虽然目前对PVRV的研究已比较深入，但仍有一些问题有待进一步研究。第一，PVRV的抗体水平一般维持1~2年，之后应加强注射，因此，更长免疫持久性的PVRV是以后的研究方向；第二，随着Zagreb免疫程序的推广，能否以此为切入点，使该程序更简化，降低国家及个人经济成本是未来新的方向。参考文献上下滑动阅读更多内容[1]WHO. 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