Sanofi Pasteur

摘要:登革热是世界上最普遍的蚊媒传播疾病之一，据模型估计，每年约有3.9亿人受到影响。在过去的二十年中，开发安全有效的疫苗以预防登革热病毒（DENV）感染的努力面临了若干挑战，这些挑战大多与进行长期研究以评估疫苗的效力和安全性有关，以排除疫苗诱导的DHS/DSS的风险，特别是在儿童中。至少有七种DENV疫苗已经进行了不同阶段的临床试验；然而，只有三种疫苗（Dengvaxia®，TV003和TAK-003）显示出了有希望的结果，并在本综述中就其分子设计、效力和免疫原性进行了详细讨论。在DENV疫苗开发过程中与安全性相关的挑战也进行了讨论。 关键点:登革热疫苗的开发具有挑战性，因为需要提供针对所有四种登革热血清型的保护，以避免在进一步感染中可能引起抗体依赖性增强。Dengvaxia®是目前唯一获得许可的疫苗，但另外两种疫苗TV-003/TV-005和TAK-003的第三阶段临床试验目前正在进行中，并显示出有希望的结果。 1.引言 登革热对全球公共卫生系统构成了巨大负担，被认为是世界上热带和亚热带地区最普遍的蚊媒传播疾病，由于气候变化、与无控制的城市化相关的森林砍伐、人口过剩以及蚊子对常见杀虫剂的抗性出现等多种因素，每年都在迅速扩大。登革热由登革热病毒（DENV）引起，该病毒属于黄病毒科黄病毒属，由伊蚊属蚊子传播，主要是埃及伊蚊和白纹伊蚊。已报告有四种遗传上不同的DENV血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4）在全球人类中共同循环。登革热的临床表现范围很广，从轻微的发热疾病到严重的登革热，增加了发展为登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS）的风险。第二次DENV感染（例如，暴露于异型血清型）是严重疾病的最大风险因素，因为抗体依赖性增强（ADE）现象。简而言之，首次暴露于DENV血清型后产生的交叉反应性抗体与第二种DENV血清型结合，形成传染性免疫复合物，进入带有Fc受体的细胞。因此，感染的细胞数量和每个细胞产生的病毒量增加。因此，DENV疫苗必须能保护免受所有四种血清型的感染，以避免ADE。 至少有七种基于不同平台的DENV疫苗，包括活减毒病毒、灭活病毒、嵌合活减毒病毒、DNA和重组蛋白，已经开发出来，目前正在进行不同阶段的临床试验（表1）或正在进行临床前研究。在本综述中，我们讨论了三种最先进的DENV疫苗（Dengvaxia®，TV003/TV005和TAK-003）的最新进展（表2），重点讨论了每种疫苗的分子特征（图1）以及它们效力和免疫原性的临床数据。最后，我们强调了与疫苗诱导的DHS/DSS风险相关的安全性挑战。 图1 处于临床开发高级阶段的抗登革热病毒（DENV）疫苗的分子设计。A Dengvaxia®基于黄热病病毒（YFV）的骨架，其中YFV的前膜（prM）和包膜（E）基因已被四种DENV血清型中每一种的同源基因所取代。B TV003/TV005是通过在DENV-4和DENV-1的3′-UTR的TL2茎环中删除30个核苷酸（172-143）（rDEN4∆30和rDEN1∆30）构建的，DENV-2和DENV-3组分是从rDEN4∆30骨架构建的。C Tak-003/DENVax基于一种活减毒的DENV-2株（PDK-53-V），其中YFV的前膜（prM）和包膜（E）基因已被四种DENV血清型中每一种的同源基因所取代。 为了本综述，我们系统地搜索了PubMed、Web of Science和clinicaltrial.gov，以获得有关疫苗、试验以及登革热疫苗安全性和免疫病理学等特定主题的结果。我们为这份文件选择了最合适的参考文献。 2.登革热病毒（DENV）疫苗的开发和临床前评估 2.1.Dengvaxia® 这种疫苗最初由国立卫生研究院（NIH）、圣路易斯大学和Acambis Inc在2000年代初开发，并随后由Sanof Pasteur许可，利用了ChimeriVax™技术。基于黄热病病毒（YFV）的疫苗株（17D），其中YFV的前膜（prM）和包膜（E）基因被来自泰国和印度尼西亚1978年至1988年间获得的DENV分离株的同源基因所取代，这项技术使得产生了四种嵌合的YF-DEN病毒，用于配制四价DENV疫苗（ChimeriVax™ DENV 1-4）。 四价ChimeriVax™ DENV 1-4疫苗的临床前安全性和免疫原性评估显示，与亲本黄热病病毒（YFV）疫苗株（YF-VAX）相比，小鼠的神经毒力降低。此外，在猕猴中进行的神经毒力测试证实，四价ChimeriVax™ DENV 1-4疫苗的神经毒力显著低于亲本YF-VAX株。此外，该疫苗在狨猴中一次给予高剂量或低剂量后，对所有四种DENV血清型产生血清转换和强烈的中和抗体反应，并与亲本DENV株相比，病毒血症有限。有趣的是，挑战研究表明，92%的接种猴子对野生型DENV 1-4的挑战受到保护。 2.2.TV003/TV005 自1996年以来，国家过敏和传染病研究所（NIAID）传染病实验室（LID）开始开发称为TV003/TV005的活减毒DENV疫苗。考虑到非翻译区（UTRs）对DENV基因组复制的重要性，最初的减毒策略集中在从DENV-4的3'-UTR的TL2茎环中删除30个连续核苷酸（172-143）（rDEN4∆30）。同样，也为DENV-1构建了缺乏相同同源基因组区域的突变株（rDEN1∆30）。两种突变株均表现出减毒表型，其感染力降低，并在猕猴中诱导产生强烈的中和抗体反应，与用野生型DENV-1和DENV-4挑战时的保护相关。 为了实现四价DENV疫苗的进一步努力，通过使用rDEN4∆30的骨架生成了减毒DENV-2组分，生成了两个减毒DENV4-DENV2嵌合病毒，其中DENV-4的膜和包膜基因（rDEN2/4 ∆30 (ME)）或衣壳、膜和包膜基因（rDENV2/4 ∆30 (CME)）被DENV-2的同源基因所取代。两种嵌合体的临床前评估表明，它们在SCID-HuH-7小鼠和猕猴中均表现出高度减毒的表型，嵌合和∆30缺失是累加的，使病毒对猴子不具传染性。生成了包含原始30 nt缺失的DENV3-DENV4嵌合病毒（rDEN3 ∆30 (ME)），并通过引入不连续的31 nt缺失（258-228）（rDEN3 ∆30/31）进一步修改。在非人灵长类动物中对突变病毒rDENV3 ∆30/31的临床前评估显示了理想的安全性，病毒血症不可检测，以及强烈的中和抗体反应，足以保护接种的猴子在用野生型DENV-3挑战时。 2.3.TAK‑003 (DENVax) DENVax疫苗的开发始于1980年代末，当时泰国曼谷玛希隆大学的研究人员从患有登革出血热的患者的血清中分离出DENV-2株（DENV-2 16681）。通过在原狗肾细胞（PDK细胞）中进行53次连续传代，获得了DENV-2 PDK-53-V株，与亲本DENV-2 PDK-53株相比，该株在5'UTR和NS1基因中具有与减毒相关的突变，并且在NS3基因中还具有额外的非同义突变。DENV-2 PDK53-V株在乳鼠中显示出降低的神经毒力，在C6/36细胞中的复制率较低，并被进一步用作生成DENVax疫苗的骨架。 用于配制四价DENVax疫苗的DENV-1、DENV-3和DENV-4疫苗株是通过用野生型DENV株的prM和E基因替换DENV-2 PDK53-V株的prM和E基因而生成的。嵌合DENVax病毒在LLC-MK2细胞中复制时显示出“小斑块”和温度敏感表型，与亲本野生型株相反。含有四种DENVax疫苗株（DENV 1-4）的四价配方在新生ICR小鼠中显示出降低的神经毒力，并在AG129基因敲除小鼠中显示出免疫原性，诱导产生针对四种DENV血清型的高滴度中和抗体（1:320–1:2560）。在狨猴（Macaca fascicularis）中对四价DENVax疫苗的临床前评估显示了良好的疫苗安全性概况，并且通过皮下途径给药时耐受性良好，而在用高剂量方案的5:5:5:5配方的每种DENVax株（DENVax 1-4）进行两次免疫后，可诱导对四种DENV血清型的保护（通过保护病毒血症来衡量）。 3.DENV疫苗的临床评估 迄今为止，Dengvaxia®是唯一获得许可的DENV疫苗，但TV-003/TV-005和TAK-003的第三阶段临床试验目前正在进行中，并显示出有希望的结果。然而，正如我们所讨论的，疫苗接种者的年龄和血清状态的差异已被证明直接影响疫苗的效力和安全性。迄今为止，大多数关于DENV疫苗的安全性问题来自第三阶段的儿童临床试验，只有Dengvaxia®和TAK003（DENVax）已在儿童中进行了测试，结果参差不齐（图2）。 图2 拉丁美洲和亚洲儿童中抗登革热病毒（DENV）疫苗的效力试验概述。Dengvaxia和DENVax的III期临床试验结果不一。TV003/TV005目前正在进行III期临床试验。*在II期临床试验中观察到的TV003/TV005的血清转换率如图所示。**图中描绘的效力范围的较低值对应于在泰国进行的IIb期试验中观察到的效力。***DENVax在血清阴性个体中仅对DENV-1和DENV-2有效。 3.1.Dengvaxia® 早期的I期和II期临床试验评估了Dengvaxia®（TDV）四价制剂在健康成年人（18至45岁）中的安全性、免疫原性和反应原性，这些研究在美国、菲律宾、澳大利亚、墨西哥、越南、新加坡和印度进行；其中一些研究还包括了2至18岁的儿童人群。对成年人中Dengvaxia®疫苗的主要安全性评估显示，该疫苗在0、3-4和12个月的三剂接种方案中安全且耐受性良好，引起轻度至中度的短暂局部和全身不良事件，如注射部位疼痛、头痛、不适和低烧等，没有报告与疫苗相关的严重不良事件（SAEs）。对疫苗诱导的细胞反应的评估显示，该疫苗没有诱导促炎细胞因子（IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70）的释放，而诱导了DENV血清型特异性T辅助反应。观察到对用作ChimeriVax™病毒骨架的YFV-17D株的NS3蛋白的CD8反应。在预先存在DENV免疫的个体中，该疫苗诱导了更广泛的中和抗体反应，并增强了针对DENV非结构蛋白的特定CD8+反应，特别是NS3，在未接触的个体中不引起反应。尽管大多数评估Dengvaxia®效力的III期临床试验是在儿童（<18岁）中进行的，但在澳大利亚对健康成年人进行的评估疫苗批间一致性的随机III期临床试验显示，尽管未接触的个体在接受一剂疫苗后对所有四种DENV血清型产生了中和抗体，但唯一产生的血清型特异性中和抗体是针对DENV-4的。相反，DENV 1-3被交叉反应性抗体中和，揭示了疫苗中DENV-4组分的免疫优势。此外，在未接触登革热的个体在接受一剂疫苗后，通过RT-PCR观察到每个疫苗组分的不同病毒复制率：DENV-4（44%）、DENV-3（12%）、DENV-1（7%）和DENV-2（0%），这可能使血清阴性个体在感染DENV-2时发展为疫苗增强疾病的风险。关于Dengvaxia®在儿童人群中的效力和安全性的最具信息性的研究是在35,000名2至16岁的儿童中进行的。该研究显示，效力与年龄相关，9岁以上儿童为65%，9岁及以下儿童为45%。令人担忧的是，9岁以下儿童在自然接触病毒后免疫接种后发展为严重登革热的趋势，这种效应特别是在未接触登革热的儿童中观察到。评估Dengvaxia®效力的儿童研究显示，效力在不同DENV血清型和年龄组之间变化。在泰国进行的IIb期试验中，对4002名4至11岁儿童的Dengvaxia®效力进行评估，结果显示针对DENV-4和DENV-3的疫苗效力较高（分别为100%和75.3%），而针对DENV-1和DENV-2的效力较低（分别为55.6%和9.2%）。在五个登革热流行拉丁美洲国家进行的更大规模的儿童III期临床试验中，对20869名9至16岁的健康儿童进行了评估，结果显示针对DENV-3和DENV-4的效力较高（分别为74.0%和77.0%），而针对DENV-1和DENV-2的效力较低（分别为50.3%和42.3%），证实了疫苗效力在血清型之间变化，并且与年龄相关。这一点后来在一项更大的III期临床试验中得到证实，该试验评估了Dengvaxia®在拉丁美洲和亚洲2至16岁健康儿童中的效力。这项研究的结果表明，在25个月的随访期间，9岁以上儿童的临床登革热总效力（65.6%）高于9岁以下儿童（44.6%）。此外，9岁以下儿童因登革热需要住院的相对风险（1.58）高于9岁以上儿童（0.5）。进一步的试验表明，9岁以下儿童因登革热需要住院的观察到的年龄依赖性风险可能与预先存在的抗DENV免疫有关。一项分析了三项不同效力试验数据的队列研究显示，2至16岁血清阴性疫苗接种者的住院率（3.06%）高于血清阴性对照组（1.87%），这种趋势也观察到在9至16岁血清阴性疫苗接种者中（血清阴性个体1.57%，血清阳性个体1.09%）。尽管在不同的临床试验中观察到Dengvaxia®的高疫苗效力，但使用菲律宾超过800,000名儿童接种的数据进行的最新数学模型估计，在接种后4年内，无论是血清阴性还是血清阳性个体，都将有超过1000例因严重登革热住院的病例。这些模型以及在9岁以下儿童中观察到的高住院率，这些儿童被错误地认为是疫苗失败的病例，强调了在批准和部署疫苗之前，在接种Dengvaxia®的儿童中进行增强的IV期监测研究的重要性，以便更好地评估疫苗在登革热流行国家的有效性。 3.2.TV003/TV005 在其临床开发的早期阶段，进行了几项I期临床试验，使用DENVax疫苗候选物的单价制剂评估安全性概况、各个DENVax病毒的复制能力，以及从接种个体到Toxorhynchites splendens蚊子的传播性。 在这些初步研究之后，选择了六种单价DENVax疫苗候选物进行进一步的临床评估，配制成五种四价混合物（TV-001至TV-005）。两种疫苗候选物（TV003和TV005），含有rDEN1D30 rDEN2/4D30, rDEN3D30/31, 和 rDEN4D30，但rDEN2/4D30组分的量不同（TV003为103PFUs/mL，TV005为104PFUs/mL），在诱导针对四种DENV血清型的最平衡的中和抗体反应后被选中进行进一步的临床评估。 在对黄病毒未接触的受试者进行的两项随机安慰剂对照试验中评估了TV003和TV005的安全性和免疫原性，结果表明TV003和TV005均耐受性良好，显示出良好的安全性概况，其中76%的参与者报告了低级别的皮疹作为最常见的不良事件。TV003的单剂量诱导了针对四种DENV血清型的平衡中和抗体反应，血清转换率在64%（DENV-2）到100%（DENV-4）之间，而TV005疫苗在单剂量后对DENV-2的特定反应有所提高（84%）。 TV003接受一剂后对DENV-2产生血清转换的参与者比例较低，导致了使用原始rDEN2D30作为挑战病毒的DENV-2挑战模型的开发，该模型在接种疫苗后6个月使用，因为它诱导的病毒血症比疫苗株（rDEN2/4D30）高100倍。结果显示所有参与者都产生了针对DENV-2的保护性反应，并诱导了针对DENV-2的特定中和抗体。 这些结果导致TV003疫苗被巴西布坦坦研究所授权，以Butantan DV的名称生产，这是一种冻干的四价DENV疫苗，并在18至59岁的155名DENV未接触和145名DENV暴露的健康个体中进行了两步、双盲、随机、安慰剂对照的II期临床试验。该疫苗安全且耐受性良好，并在两种DENV未接触和DENV暴露的参与者中诱导了强劲的平衡中和抗体反应，四种DENV血清型的血清转换频率均高于78%。在接种Butantan-DV疫苗一剂后的第91天，DENV未接触和DENV暴露的参与者中观察到显著的T-CD8反应，这表明与基于结构性DENV蛋白表达的四价疫苗相比，这种疫苗在成人中诱导了更广泛的保护性免疫反应。目前正在巴西进行一项随机、多中心、双盲、安慰剂对照的III期临床试验，以评估Butantan-DV疫苗，共有16,944名参与者，分为三个年龄组（18-59岁，7-17岁，和2-6岁）；这项试验的结果尚未公布。 3.3.TAK‑003 (DENVax) DENVax的临床评估始于武田在哥伦比亚里奥内格罗进行的一项随机、双盲、剂量递增的I期临床试验，旨在评估18至45岁DENV未接触成人通过皮内（ID）或肌肉内（IM）接种两剂DENVax的安全性和针对四种DENV血清型的免疫原性。该疫苗在研究参与者中安全且耐受性良好，诱导了短暂的局部反应原性和轻度系统性不良事件。疫苗接种诱导了针对四种DENV血清型的中和抗体的产生，但参与者中针对DENV-3和DENV-4的抗体滴度较低。由于针对DENV-4的抗体反应较低，DENVax（现在称为TDV）被重新配制以增加DENVax4组分的量，并在一项随机、多中心、Ib期研究中测试了不同的配方和剂量计划，该研究在美国进行，涉及140名18至45岁的DENV未接触个体。研究参与者中观察到的血清转换率分别为84-100%（DENV-1），96-100%（DENV-2），DENV-3：83-100%（DENV-3），和33-77%（DENV-4）。 在波多黎各、哥伦比亚、新加坡和泰国进行的随机、双盲、安慰剂对照的II期临床试验中，评估了TDV疫苗两剂方案（0, 90天）在DENV暴露个体中的安全性和免疫原性，使用了更高滴度的DENVax3和DENVax4组分的“高剂量”疫苗，结果显示无论先前是否接触过DENV，疫苗诱导的针对DENVax4组分的中和抗体反应都较低。 目前正在进行一项大规模的III期临床试验，以评估DENVax在来自拉丁美洲和亚洲登革热流行国家的20,071名4至16岁健康儿童中的效力。接种疫苗后12个月的主要结果显示，根据DENV血清型，效力变化为：DENV-2为97.7%，DENV-1为73.7%，DENV-3为62.6%，而DENV-4的效力结果不确定。有趣的是，基线时血清阴性和血清阳性参与者的总疫苗效力相似（分别为74.9%和82.2%），并且与年龄范围无关。总体疫苗效力针对导致住院的登革热分别为血清阴性个体95.4%和血清阳性个体94.4%。 同一试验在接种疫苗后18个月的数据揭示了血清阳性个体的总疫苗效力为76.1%，血清阴性个体为66.2%，针对不同DENV血清型的总体效力从针对DENV-2的95.1%到针对DENV-3的48.9%不等。针对需要住院治疗的登革热的总体效力为90.4%，针对DHF为85.9%。然而，按年龄组分层时，先前血清阴性的4至5岁儿童的疫苗效力显著较低（59.1%），同样年龄的血清阳性儿童预防住院的效力为51.6%。 DENVax疫苗接种后3年的累积效力数据最近发布，显示针对病毒学确诊登革热（VCD）的总体疫苗效力为62%，显著低于接种后18个月观察到的效力。针对需要住院治疗的登革热的总体效力也从90.4%降低到83.6%。在基线时血清阳性的个体中，针对VCD的疫苗效力在DENV-3为52.3%和DENV-2为83.4%之间变化，然而，在基线时血清阴性的个体中，疫苗只对DENV-1和DENV-2有效（分别为43.5%和91.9%），对DENV-3没有观察到效力。在血清阳性个体中，针对需要住院治疗的登革热的效力保持较高，但在血清阴性个体中则不然，疫苗只对DENV-1和DENV-2有效。有趣的是，观察到的疫苗效力并没有显示出与参与者年龄相关的任何明显模式。 在相隔18个月进行的疫苗效力评估中出现的这些显著变化，应在长期IV期监测试验中进一步分析，以排除观察到的保护效力是由于交叉保护，并可能随着时间而下降，正如在儿童自然感染期间所观察到的那样。 4.登革热疫苗开发的挑战 免疫病理事件是DENV感染的共同特征，有几种潜在的机制，如过度活跃的促炎性免疫反应（细胞因子风暴），其特征是几种促炎性细胞因子的血浆浓度升高，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激生长因子（GM-CSF）、巨噬细胞炎性蛋白1 beta（MIP-1β）、干扰素γ（IFN-γ）和白介素10 IL-10，最终导致血管渗漏、出血和其他一些血栓形成事件。分子模拟涉及E和NS1病毒蛋白，也已被记录激活针对血小板和内皮的交叉反应性抗体，导致严重登革热。此外，自然感染一种DENV血清型的个体，显示低水平的抗DENV抗体（<1:80）在继发感染异型DENV血清型时遭受并发症。在感染期间产生的特异性抗体构成了免疫反应以中和入侵者的重要部分；然而，对于像DENV这样的病原体，在某些条件下，初次接触中产生的抗体可能增强进一步的感染。有趣的是，产生高滴度抗DENV抗体（>1:320）的患者表现出对进一步的有症状DENV感染的保护。 已知登革热中的感染增强过程称为抗体依赖性增强（ADE），但登革热中这一事件的细节仍然难以捉摸。病毒进入已知是通过Fcγ（图3）促进的，介导T细胞激活和TNF-α及其他细胞因子的释放，导致内皮功能障碍。因此，有效的DENV疫苗必须诱导针对所有四种DENV血清型的强烈且高度中和的反应，以避免疫苗诱导的免疫病理事件。证据表明，这一过程可能主要通过抗prM抗体而被增强。prM存在于未成熟病毒颗粒中。像抗prM这样的抗体不仅促进Fc的摄取，而且这些高浓度的抗体也较差地中和病毒。存在不同的IgG亚类（IgG1-4），它们在半衰期、血清水平、补体激活和Fc受体结合方面表现出不同的特性。因此，不仅目标病毒蛋白，而且IgG亚类也可能有助于更好地理解如何倾向于中和/保护而不是ADE/免疫病理。在疫苗接种者中ADE的发生必须考虑不仅IgG亚类，还有糖基化阶段，以区分保护性与免疫病理事件。这是因为糖基化可能改变对Fc受体的亲和力，正如已记录的。 似乎所有针对登革热的活减毒疫苗都显示出诱导针对prM和融合环表位的抗体的能力，导致血清型交叉反应性增加，并增加ADE的风险。一个新的重要问题是，个体将如何对登革热疫苗做出反应，这在受寨卡病毒（ZIKV）影响的地区引起关注。在以前感染过ZIKV的个体中，也报告了ADE。在动物模型中使用活减毒疫苗时，已显示出DENV和ZIKV的这一事件。无效的先天免疫反应随后产生亚中和抗体和超反应性T细胞反应，可能会促成免疫病理事件，无论是在登革热感染的个体还是疫苗接种者中，但这些事件必须在疫苗接种者和自然感染的个体中仔细分析，以评估生物学意义。已在狨猴中开发了针对高度中和抗体的表位图谱；然而，需要在人类中进行类似的研究，并且这些数据必须考虑在未来疫苗开发中。 图3 抗体依赖性增强（ADE）在登革热病毒（DENV）感染中的示意图。针对一种DENV血清型的低水平抗DENV抗体（<1:80）在继发感染异型DENV血清型时促进病毒-免疫复合物的形成。这些病毒-免疫复合物通过Fcγ受体被单核细胞、巨噬细胞和树突细胞内吞，促进病毒释放到细胞质中。病毒-免疫复合物调节先天免疫途径，促进病毒复制和释放。 5.针对登革热疫苗的安全性问题 开发针对登革热的疫苗很重要的一点是，这些疫苗必须能够识别现有的四种血清型；三种更先进的疫苗在设计时已考虑了这一点（表3）。在自然感染中的一个重要考虑因素是，初次感染一种DENV血清型将建立对该特定血清型的长期记忆，但可能对其他血清型产生短期、亚中和和增强的反应。由于以前异型暴露，随后的登革热感染中不同DENV血清型可能会出现增强现象，避免这些事件是登革热疫苗领域的持续关注点。 因此，从一开始，就认识到对所有四种DENV血清型进行四价、同样有效的免疫是设计和开发中最重要的挑战。后来出现了其他关注点，如刺激高滴度中和抗体而不是那些使个体敏感并增强DENV感染的抗体。 Dengvaxia®，登革热疫苗中最先进开发之一，当数据显示未接触疫苗接种者在自然感染暴露时住院风险增加时，引起了严重的安全关注。武田疫苗TAK-003仍在III期试验中，已被证明是安全的，并且在独立于接种个体的血清状态的情况下，对登革热相关住院治疗的保护效力约为75-80%。这种活减毒疫苗仍在全球不同年龄组人群中进行许多II期研究。然而，III期试验仍在进行中，关于这种疫苗的效力、副作用或罕见不良效应的最终结论尚未得出。 关于TV003/TV005，这是国家过敏和传染病研究所开发的另一种活减毒疫苗，数据显示这些疫苗不允许四种血清型中的任何一种表达免疫优势，从而产生理想的免疫反应。此外，初步报告显示，单剂量具有保护作用，并且在首次免疫后6-12个月的第二剂中几乎实现了无菌免疫。这种疫苗已被不同制造商许可，布坦坦研究所开始了III期试验以评估其效力。 其他有希望的发展使用不同疫苗平台的临床试验数据仍然必要，但许多工作正致力于改进现有的疫苗。开发者旨在确保疫苗对所有四种血清型产生广泛且持久的高滴度中和抗体反应。然而，细胞反应也必须在疫苗接种者中得到评估，并与抗体反应一起有效以确保理想的保护。最重要的是，疫苗不应给未接触或以前接触过DENV的个体带来发展严重疾病的风险。因此，科学界仍在努力开发世界需要的安全和通用的登革热疫苗。 6.挑战和机遇 审查当前登革热疫苗的临床数据，显然这些疫苗对开发者构成了独特的挑战，因为必须平等地为所有四种血清型实现保护，而不在随后的DENV接触中引起任何潜在的免疫病理事件。尽管付出了所有努力，登革热流行病的数量和频率都有所增加，并正在影响新的地理区域，因此至关重要的是在登革热区域大大改进控制措施，并开发一种通用且高效的疫苗作为对抗登革热的重要措施之一。由于安全性仍是一个关注点，因此获得一种有效且安全的登革热疫苗的竞赛继续是一个迫切的需要。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

根据广东疾控发布的数据，9月9日至15日，全省新增报告775例登革热病例，较上周增加73例，环比增加10.4%。无新增重症病例、死亡病例。目前，广东省已进入登革热流行季，疫情传播风险逐步增高。2024年8月，广东报告登革热1220例，相比7月（233例）增至近6倍。 实际上，今年以来，全球登革热疫情形势严峻。根据《柳叶刀》发表的一篇社论，2024年是有记录以来登革热感染最严重的一年。WHO已将登革热重新归类为3级紧急事件，需要公共卫生部门采取重大到最大程度的应对措施。所以带大家一起来了解登革热疫苗在研发过程中遇到的一些挑战。 摘要：登革热病毒（DENV）是蚊媒传播病毒中对人类健康构成最大威胁的病毒。登革热病毒有四种血清型（1-4），它们在流行地区共同循环。每种DENV血清型都能单独引起从自限性的登革热到更严重的登革出血热（DHF）或登革休克综合征（DSS）的全谱疾病。根据美国疾病控制与预防中心（CDC）发布的数据，感染登革热的人群中有四分之一会生病。在那些出现症状的人中，症状可以从轻微到严重不等。症状可以从皮疹、眼部疼痛到更严重的登革热表现的更强烈症状。大约每20个生病的人中就有1个会发展成严重登革热，这可能导致休克、内出血和死亡。目前尚无针对登革热的特定治疗方法，仅有一种疫苗（Dengvaxia）在少数几个国家获得9至16岁儿童的许可使用。尽管Dengvaxia获得了临床使用的许可，但在儿童和未感染过登革热的个体中效果不佳，并且关键的是，在年轻的接种者中增加了发展成严重登革热的风险。目前，有多种新策略用于登革热疫苗的开发。在这篇综述中，我们对DENV疫苗领域进行了详细的概述，重点关注了9种处于研发管线中的疫苗，以提供对针对DENV疫苗策略中最先进技术发展的全面概述。 引言 登革热病毒（DENV）是全球近一半人口面临感染风险的节肢动物传播病毒中对人类健康影响最大的。登革热病毒通过感染的埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播。目前，全球范围内尚无针对所有四种DENV血清型（DENV 1-4）的抗病毒治疗或疫苗获得许可。DENV的流行病学是多方面的，临床表现范围广泛，从无症状疾病到危及生命的DHF和DSS。四种DENV血清型中的每一种都能引起全谱疾病。此外，与异源DENV血清型的二次感染可能导致感染增加和疾病加重，这是通过一种称为抗体依赖性增强（ADE）的机制。感染一种DENV血清型会提供对该血清型的长期抗体（体液）和T细胞反应（细胞免疫）保护。在ADE中，随后暴露于不同的DENV血清型会导致预先存在的DENV抗体与新血清型结合，形成病毒-免疫复合物，可以通过Fcγ受体促进进入免疫细胞，导致病毒复制和病毒血症增强。由于ADE现象，开发疫苗或治疗药物时必须单独考虑每种DENV血清型。Dengvaxia已在墨西哥、菲律宾、印度尼西亚、巴西、萨尔瓦多、哥斯达黎加、巴拉圭、危地马拉、秘鲁、泰国和新加坡获得许可，2019年获得FDA许可，并经CDC ACIP批准使用，前提是所有接种者在接种疫苗前都必须显示为登革热血清阳性。尽管Dengvaxia已经商业化，但结果显示严重的副作用和低效。武田生物制品TAK-003疫苗已获得美国食品药品监督管理局的优先审查，用于预防所有四种DENV血清型引起的登革热疾病，适用于4至60岁的人群，将于2023年在印度尼西亚获得许可。因此，全球范围内仍迫切需要一种获得许可且有效的抗DENV疫苗。 登革热疫苗开发 已有多次尝试开发针对DENV的疫苗，包括减毒嵌合重组病毒、减毒活病毒、灭活病毒、重组蛋白和mRNA疫苗。每种疫苗原型在减毒特性、效力和免疫原性方面各不相同。本综述将详细讨论每种登革热疫苗的特点、效力和局限性。 Dengvaxia Sanofi Pasteur的Dengvaxia是第一个也是唯一一个商业许可的登革热疫苗，目前被20个国家推荐和使用。该疫苗是四价配方，由Sanofi Pasteur黄热病疫苗（YFV 17D）骨架组成，DENV的PrM和E蛋白取代了YFV 17D的PrM和E蛋白（图1a, b）。作为针对DENV的先锋疫苗，Dengvaxia的临床试验和现场结果受到了密切监测，特别关注ADE的可能性。在III期临床试验中，9岁以下儿童接种了三剂Dengvaxia，接种间隔为0、6和12个月（图1c）。通过在接种12个月后的25个月监测有症状的登革热感染来监测疫苗的效力。Dengvaxia在9岁以上的儿童中显示出65.6%的效力，在9岁以下的儿童中显示出44.6%的效力。Dengvaxia完成了III期效力试验，结果参差不齐。就住院治疗而言，9岁及以上的儿童住院率为80.75%，而9岁及以下的儿童住院率为55.9%。这些数据表明，Dengvaxia在9岁以下儿童中引起的保护效力较差。此外，Dengvaxia在提供保护方面的能力在四种DENV血清型方面也有所不同，就病毒学确认的有症状登革热而言。Dengvaxia对DENV1的效力为50.3%，对DENV2为42.3%，对DENV3为74.0%，对DENV4为77.4%。 图1. 由Sanofi、NIAID/Butantan、Takeda和美国陆军医疗研究物资司令部开发的减毒活疫苗。(a) Sanofi疫苗的开发。使用黄热病疫苗病毒17D (YFV 17D) 作为嵌合病毒生成的主干。YFV 17D包膜蛋白被野生型DENV血清型替换。(b) 组成Dengvaxia的四种DENV疫苗病毒的遗传构建表示。(c) 基于三剂计划的Dengvaxia免疫方案。(d) NIAID/Butantan疫苗的开发。通过在DENV1 WP、DENV2 NGC和DENV4 814669的3' UTR中引入30个核苷酸缺失，生成减毒活疫苗病毒。对于DENV3 Sleman-78株，在3' UTR中额外引入了31个核苷酸缺失。(e) LATV TV003/TV005的DENV2组分是通过嵌合生成的，其中将DENV2 NGC的prM和E基因引入DENV4Δ30的主干中。(f) 组成NIAID/Butantan LATV TV003和TV005疫苗的四种DENV疫苗构建物的表示。(g) NIAID/Butantan疫苗的接种方案。(h) Takeda减毒重组疫苗的开发。(i) Takeda DENV1、DENV3和DENV4疫苗株是通过将每种DENV血清型的prM和E蛋白引入DENV2 PDK53疫苗病毒而生成的。(j) Takeda疫苗中疫苗病毒的遗传组成的表示。(k) Takeda的免疫接种时间表。(l) TDEN疫苗配方的开发，其中四种DENV株在PDK细胞中连续传代。(m) TDEN疫苗中疫苗病毒的遗传组成的表示。图表是使用Biorender设计的。 疫苗效力因DENV血清型、接种者年龄、血清状态和接种时间而异。重要的是，DENV2的效力在CYD23临床试验中没有达到统计学意义（9.2%；95%CI −75至51.3）或在CYD14试验中（35%；95%CI：−9.2至61）。数据还显示，接种时DENV血清阴性的疫苗接种者的效力显著降低（表1）。 Dengvaxia试验的第一年长期安全性研究结果显示，Dengvaxia对住院治疗的效力是有希望的，但有一个主要的警告，即结果高度依赖于接种时的DENV暴露血清状态以及接种时的年龄。需要进一步研究以了解为什么Dengvaxia在接种时血清阴性的受试者中效力降低，以及为什么在9岁以下儿童中住院风险增加。到目前为止，这些问题仍然不清楚，并且是进一步调查的主题。 总的来说，该疫苗对DENV1和DENV2的保护较低，并且主要产生针对DENV4的抗体反应。因此，Dengvaxia实际上只作为针对DENV4的单价疫苗起作用。数据表明，Dengvaxia引起的感染性和产生的免疫原性可能不平衡。这种不平衡是由需要在12个月内给予三剂疫苗的需求所表明的。大多数通过注射给药的疫苗，包括YFV和日本脑炎病毒（JEV）以及麻疹、腮腺炎、风疹（MMR）等多价疫苗，都是作为单一主要剂量给药的。对于第一剂没有反应的接种者，可以在以后的时间进行复种。使用单一疫苗剂量的主要原因是，主要剂量引入了复制疫苗病毒，引发了能够阻断后续活病毒剂量感染和复制的中和抗体。有趣的是，如果第二剂确实引起了抗体滴度的显著增加，那可能是因为初次反应不足，无法中和疫苗病毒，随后允许在第二剂后复制。最终，一个弱的初次剂量将无法在用活疫苗病毒挑战时保护免受感染。对四种DENV血清型的血清转化频率差异很大；DENV-1为33%，DENV-4为8%，DENV3为80%，DENV4为85%。研究中的一部分接种者进一步检查了接种后病毒血症的水平。在接种后第7天，57.7%的疫苗接种者检测到病毒血症，其中86.7%是由于Dengvaxia的DENV4成分。只有1/25的接种者在单剂后恢复了Dengvaxia的DENV2成分。值得注意的是，没有任何接种者恢复了Dengvaxia的DENV1成分。疫苗中DENV血清型的感染性不平衡可能是疫苗对DENV1和DENV2效力较低的原因，并且可能是在接种时被假定为血清阴性的2-5岁接种者在第三年随访中看到住院风险增加的潜在原因。 最终，Dengvaxia临床试验的结果提出了一个问题，即Dengvaxia是否能有效提供针对DENV的异型保护，并表明仍需要一种更有效的疫苗，能够产生针对所有四种DENV血清型的异型中和抗体。此外，目标年龄组，9岁以下儿童无法接种Dengvaxia，使这一脆弱群体无法得到登革热的保护。 LATV TV003/TV005 美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）在过去15年中一直处于开发减毒四价疫苗（LATV）的前沿。鉴于对DENV的部分免疫可能会增加随后感染更严重疾病结果的风险，评估了多种单价和四价DENV疫苗，以确定具有最佳安全性、感染性和免疫原性特征的候选疫苗，总体目标是开发一种能够通过单剂量诱导对所有四种DENV血清型产生保护的LATV。通过实施重组DNA技术，采用了两种主要的减毒策略来生成疫苗病毒。第一种策略是在3'非翻译区（UTR）中包含缺失，第二种策略是生成结构基因嵌合体（图1d）。原型单价疫苗候选物rDEN4Δ30是通过在3'UTR中引入30个核苷酸（Δ30）缺失而生成的。rDEN4Δ30包含野生型DENV-4的所有结构和非结构蛋白，但通过在3'UTR中引入30个核苷酸缺失而减毒（图1f）。为了生成其他DENV疫苗，采用了类似的减毒机制。对于DENV2疫苗血清型（rDEN2/4Δ30），采用了嵌合策略，将DENV2新几内亚C病毒的prM和E基因引入rDEN4Δ30疫苗候选物（图1e）。总共评估了九种单价疫苗候选物在黄病毒素未暴露的成年志愿者中。在临床研究中评估了五种不同的四价混合制剂。对单价病毒进行的试验提供了对选择疫苗病毒至关重要的信息，这些信息涉及临床、病毒学和免疫学表型。这些信息用于指导LATV疫苗的最终开发。在这些早期研究中，观察到一些重要的发现，其中一个发现是嵌合策略对病毒复制具有高度减毒作用，同时允许一些必要的病毒复制以诱导免疫反应。当作为单价病毒测试时，rDEN2/4Δ30候选病毒在103 pfu剂量下感染了100%的受试者，但在组合成四价配方（rDEN1Δ30, rDEN2/4Δ30, rDEN3Δ30/3Δ31, rDEN4Δ30）时，其感染性最低。 为了确保四价疫苗的所有四个组分都能诱导出对每种DENV血清型的同型抗体，平衡感染性特征至关重要。为了生成更平衡的感染性特征，开发了两种策略。第一种策略是将rDEN2/4Δ30的剂量增加十倍。这种策略在TV005配方中实施。TV003和TV005具有相同的四种单价组分，并且在rDEN2/4Δ30的剂量上有所不同，TV003在103 pfu给药，TV005在104 pfu给药。第二种策略是将血清学评估的时间从接种后42天增加到90天。将rDEN2/4Δ30的剂量增加十倍足以补偿疫苗组分的更高HID50。接种TV005的受试者在接种后血液中可检测到病毒的比例明显高于接种TV003的受试者。血清转化的频率从接受TV003的76%提高到接受TV005的97%。此外，单剂量疫苗后四价抗体反应的总体频率从TV003的74%提高到TV005的90%。 在接种后的抗病毒反应方面，可以定义为“抑制或中和随后感染所接种病毒”的无菌免疫。尽管无菌免疫并不总是实现减少疾病和发病率的最终目标所必需的，但它可以是一个可量化的临床结果，并且是疫苗成功诱导足够免疫反应的指标。如前所述，Dengvaxia需要三剂，并且必须在12个月内给药。在第一剂后观察到病毒血症，特别是在DENV-4成分后，第二剂和第三剂后较少。Dengvaxia的第二剂和第三剂导致DENV-1、DENV-2和DENV-3血清型的抗体滴度增加。这些数据表明，当给登革热血清阴性的个体接种时，Dengvaxia不能诱导对后续感染的无菌免疫。为了确定Dengvaxia观察到的突破性感染是否会发生在LATV中，TV003和TV005的第二剂在第一剂后6个月给药。在TV003的初始剂量后，75%的疫苗接种者血液中产生了可检测水平的疫苗病毒，62%的疫苗接种者出现了登革热感染特征性的皮疹。在第二剂给药后，即在TV003/TV005初始剂量后6个月，没有观察到皮疹或病毒血症。在第二剂后，只有一名受试者在24小时内产生了可检测的病毒水平。在第二剂疫苗后，对四种DENV血清型的抗体滴度平均增加了不到两倍。 在接种后180天测量了对TV003和TV005的中和抗体反应和T细胞反应，并证明足以阻止随后疫苗接种后的增强，如抗体滴度没有进一步增加所测量的。为了评估抗体水平是否能保护自然DENV感染，开发了人类DENV-2挑战模型。在十名健康的黄病毒素未暴露的受试者中评估了挑战株rDEN2Δ30。为了量化TV003对DENV-2感染的保护效力，受试者在接受TV003后6个月接受了rDEN2Δ30挑战。TV003对由rDEN2Δ30引起的病毒血症、中性粒细胞减少和皮疹提供了完全保护，并且也在评估DENV-3挑战模型，结果正在发布过程中。此外，巴西布坦坦研究所与NIAID合作，在登革热流行国家进行TV003的II期和III期临床研究。这些结果对于这种LATV在已经接触过一种或多种DENV血清型的个体中预防登革热的潜力非常令人鼓舞。 TAK-003 TAK-003（TDV）是由武田制药公司生产的减毒四价登革热疫苗，最初由美国疾病控制和预防中心矢量传播疾病司的科学家设计和构建。该疫苗基于减毒病毒和使用重组DNA技术构建的嵌合病毒。TAK-003基于减毒DENV-2病毒，为所有四种疫苗病毒提供遗传骨架。第一个重组疫苗候选物是通过将DENV-1 16 007病毒的prM和E蛋白嵌合到DENV2 PDK-53病毒中生成的。通过结合不同的野生型病毒和PDK减毒疫苗病毒，生成了各种疫苗构建体（图1h-j）。 九种嵌合病毒是通过引入DENV-1 (16007)、DENV-3 (16562)或DENV-4 (1036)的prM和E蛋白与DENV-2 (16681)以及两种遗传变体(PDK53-E和PDK53-V)来生成的。DENV-2 PDK-53即使联合给药也能均匀复制，据推测能诱导对所有四种血清型的平衡免疫。TAK-003采用0个月和3个月的剂量计划（图1k）。I期和II期研究已经证明TAK-003耐受性良好，能够诱导针对DENV 1-4的体液反应、长期抗体持久性和交叉反应以及多功能细胞反应。武田生物制品TAK-003疫苗已获得美国食品药品监督管理局的优先审查，用于预防所有四种DENV血清型引起的登革热疾病，适用于4至60岁的人群，并将于2023年在印度尼西亚获得许可。采用0-3个月剂量计划进行的临床试验显示，TAK-003在接种前血清阴性的疫苗接种者中总体效力为66.2% (95% CI, 49.1–77.5%)。针对住院登革热的效力为90.4%，针对登革出血热(DHF)的效力为85.9%。在一项探索性分析中，累积效力被分为三个部分进行评估。第一部分在第二剂后12个月进行随访以评估主要终点，第二部分增加6个月以评估次要终点，第三部分是对长期效力和安全性进行持续3年的评估。对DENV-1 (69.0%)、DENV-2 (90.8%)、DENV-3 (51.4%)和DENV-4进行了累积血清型特异性效力分析，后者显示结果不确定。疫苗效力在不同年龄组之间差异很大。在6-11岁的儿童中，效力为75.4%，而在4-5岁的儿童中效力为55.9%。在第一年，TAK-003对病毒学确认的登革热(VCD)的总体效力为80.2% (95 CI, 73.3–85.3%)。在第二年，针对VCD的总体效力下降到56.2%。在第二剂后长达2年的时间里，共报告了15例严重登革热或DHF病例，针对DHF的累积效力为81.2%。在基线血清阴性组中，从9、15和27个月的几何平均抗体滴度分析显示，随时间推移DENV-2的几何平均滴度呈下降趋势(GMT)。DENV-1、-3和-4的GMT在疫苗接种者中保持稳定。血清阳性率在9个月时为91.3%，在27个月时为85.9%。总体而言，在4-16岁的儿童中，在接种疫苗后27个月，TAK-003预防了72.7%的有症状登革热病例、89.2%的住院登革热和81.2%的DHF。在基线血清阴性的疫苗接种者中，累积效力为67%，在血清阳性个体中为74.8%。至关重要的是，针对构成TAK-003基础的DENV-2的效力下降不容忽视，这表明TAK-003可能无法完全复制自然感染所提供的保护。此外，第二年的数据表明，在6-11岁(60.6%)和12-16岁(71.2)的儿童中，与4-5岁(24.5%)的儿童相比，效力更高。 TDEN F17/F19 沃尔特里德陆军研究所(WRAIR)与葛兰素史克公司(GSK)合作开发了一种减毒四价登革热(TDEN)疫苗。该疫苗由四种DENV菌株组成，DENV-1 (45AZ5)、DENV-2 (S16803)、DENV-3 (CH53489)和DENV-4 (341750)（图1l, m），并以6个月间隔给黄病毒素未暴露的成人接种两剂（图1n）。所有四种病毒都是从自然感染中获得的，通过在C6/36细胞中分离并通过在PDK细胞中连续传代而减毒。总共有16种四价配方，其中13和14号配方被选中进行进一步评估。为了优化中和抗体反应，开发了一种新配方F17pre，该配方使用了更高代PDK细胞传代的DENV-1和更低代PDK细胞传代的DENV-4。F17pre被设计为F17配方的前体。F13、F14和F17pre进行了II期临床试验。在初次接种后第10天，分别有75%、31%和31%的受试者出现病毒血症。在接种第二剂疫苗后，没有检测到任何受试者的病毒血症。对配方进行了中和抗体反应测量，分别有36%、40%和63%的接种者在接种两剂13、14和F17后产生了四价中和抗体。在波多黎各进行的一项随机II期临床试验中，F17在第二剂后引发了更高滴度的中和抗体，并在初次接种的受试者中实现了对所有血清型的100%血清转化。为了评估TDEN F17疫苗的安全性和免疫原性特征，在对DENV 1-4和JEV未暴露的6-7岁泰国儿童中进行了一项试点研究。研究结果显示，该疫苗安全且具有免疫原性，因此该研究推进到12-15个月大婴儿的I/II期试验。总共有52.6%的疫苗接种者对四种DENV血清型产生了血清转化。TDEN F17已被证明在12个月至50岁的疫苗接种者中安全且能引发免疫反应，当以两剂方案给药时。TDEN F17目前正在对6至9岁的儿童进行I/II期临床研究，这些儿童之前已接种过该疫苗。5年的随访将评估两剂方案的免疫原性，以及在第二剂后1年接种的第三剂的免疫原性。 DPIV 四价登革热纯化灭活疫苗(DPIV)由沃尔特里德陆军研究所(WRAIR)开发，并由WRAIR试验生物生产设施生产，并由葛兰素史克(GSK)佐剂系统佐剂。该疫苗以28天间隔分两次给药（图2c）。最初的疫苗开发始于DENV-2 S16803菌株，该菌株是从患者身上分离出来的，并在Vero细胞中扩增。这种纯化灭活病毒(PIV)在给小鼠接种时是安全的，小鼠在第二剂后实现了100%的血清转化。PIV随后在恒河猴上进行了测试，结果证明是安全且具有免疫原性的。随后，基于灭活病毒的四价配方被开发出来，使用DENV-1 Westpac 74、DENV-2 S16803、DENV-3 CH53489和TVP360作为DENV-4组分（图1a, b）。病毒在Vero细胞中扩增，经过甲醛灭活，并使用0.01%明矾(氢氧化铝)作为佐剂。免疫接种计划包括一剂TPIV，然后是一剂四价减毒活疫苗(TLAV)的加强剂量。TPIV/TLAV的组合在接种后8个月对DENV-3挑战提供了完全保护。在随后的实验中，用TPIV初免引发了针对所有四种DENV血清型的中和抗体。在对四种DENV血清型中的每一种进行挑战后，接种疫苗的动物没有出现病毒血症。为了找到DPIV的最佳佐剂，疫苗开发商使用了AS01E (3-O-desacyl-单磷脂A)和AS03B (油包水)来克服因灭活引起的免疫原性问题。在一项I期临床试验中，用AS01E/AS03B佐剂的DPIV发现疫苗在登革热血清阴性成人中引发了针对所有四种DENV血清型的中和抗体反应，但这种反应随时间减少。观察到的两剂疫苗接种的体液反应是强大的，但目前尚不清楚DPIV是否能够提供针对DENV的持久免疫。疫苗的灭活性质可能会在非结构蛋白的免疫反应方面产生障碍。 在进行的一项研究中发现，接种DPIV后，免疫系统仅针对包膜和衣壳蛋白。最终，疫苗无法在接种疫苗的恒河猴中进行的挑战试验中控制DENV感染。重要的是，接种DPIV导致接种的猴子出现病毒血症、AST、IL-10、IL-18水平增加。这些数据表明，接种疫苗可能触发了DENV感染的抗体依赖性增强。 TVDV 四价登革热DNA疫苗（TVDV）由美国陆军医疗研究与物资司令部开发[49]。TVDV是一种基于DNA的疫苗，其中prM和E蛋白编码序列克隆在VR1012质粒中，并与VAXFECTIN作为佐剂共同给药（图2d, e），采用三剂免疫方案（图2f）。DENV-1菌株是从西太平洋74菌株生成的，当克隆到VR1012质粒并给恒河猴接种时，被证明在挑战试验中保护猴子并在I期临床试验中被发现具有免疫原性。DENV-2抗原是通过替换原始DENV-2构建物中的DENV-2跨膜和细胞质序列为小鼠溶酶体相关膜蛋白的序列来生成的。DENV-3抗原来源于亚洲病毒株。临床前测试表明，DENV3疫苗株引发了中和抗体，适度水平的特异性IgG并在挑战试验中提供了部分保护。DENV-4的遗传结构与DENV-2相似，但缺乏关于DENV-4组分在其单价形式的临床前测试的报告。Vaxfectin被用作佐剂以提高疫苗的免疫原性。通过将编码DENV 1-4的prM和E基因的各个单价质粒等量结合并克隆到VR1012质粒中来制备疫苗构建物。在接受了两剂疫苗配方的白兔中对TVDV进行了安全性和免疫原性评估。动物显示出对所有四种DENV血清型的血清转化。在最新进行的40名黄病毒素未暴露的疫苗接种者中进行的I期临床试验中，TVDV被证明是安全的并引发了IFN-γ抗DENV T细胞反应。 V180 V180疫苗是一种基于DENV E和prM糖蛋白重组形式的四价疫苗。该疫苗目前处于I期临床试验中，由默克公司生产。每种DENV血清型的遗传构建是通过基于逆转录酶（RT）-PCR扩增编码prM和80% E蛋白（截断E蛋白）的病毒序列，然后克隆到pMttΔXho载体中（图2g, h）。使用的病毒株有DENV1 258 848和DENV1泰国AHF82-80，DENV2株PR159/S1，DENV3株CH53489和D3H87，以及DENV4株H241和多米尼加，疫苗采用三剂计划（图2i）。在一项评估疫苗安全性、耐受性和免疫原性的I期、随机、安慰剂对照、双盲研究中发现，两种未添加佐剂的V180和一种添加了铝佐剂的V180没有引发强烈的免疫反应，而与ISCOMATRIX联合给药的六种V180配方引发了强烈的免疫原性（GMT ≥150）。目前尚不清楚V180引发的抗体滴度水平是否会提供任何临床益处，因为尚未为疫苗定义抵御DENV所需的中和抗体的确切水平。 图2. 沃尔特里德陆军研究所(WRAIR)、美国陆军医疗研究与物资司令部和默克公司开发的减毒活疫苗。(a) DPIV的开发。每种DENV血清型都被纯化并通过甲醛灭活。(b) 产生的病毒粒子的表示。(c) 基于两剂计划的DPIV免疫方案。(d) TVDV疫苗的开发。代表DENV 1-4型的prM和E蛋白编码区域被克隆到VR1012质粒中，并与VAXFECTIN共同给药。(e) 表示产生的四个DENV质粒构建物的图解。(f) TVDV的疫苗方案，包括在第0天开始的三剂方案，第30天和第90天结束。(g) 默克公司V180疫苗的开发。为每种DENV血清型生成了病毒序列的遗传构建物，编码prM和80%的E蛋白。(h) 产生的蛋白被克隆到pMttΔXho载体中，并在果蝇细胞培养中培养，然后进行纯化。(i) V180的疫苗方案，采用三剂方案，第一剂在第0天给药，第二剂在第30天，最后一剂在第90天。图表是使用Biorender设计的。 DSV4 DSV4是一种四价病毒样颗粒疫苗，旨在展示DENV包膜蛋白的域III。DSV4是通过使用所有四种DENV血清型和乙型肝炎表面（S）抗原的EDIII的框内融合而设计的，并与未融合的S抗原共同表达形成镶嵌病毒样颗粒（VLPs），并采用三剂计划（图3d, e）给予。DSV4在小鼠中诱导了针对所有四种DENV血清型的中和抗体水平，并在DENV4挑战中提供了保护。 E80 mRNA疫苗 E80 mRNA疫苗是由中国科学院开发的一种改良的mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）疫苗。疫苗设计包括Cap1 (N7mGpppAm)序列，随后是人IgE的信号肽序列，然后是E80蛋白，3' UTR和3' polyA尾（图3a）。含有改良核苷1-甲基假尿嘧啶-5/-三磷酸的修饰RNA是化学合成的，并包装成LNPs（图3b）。LNP由四种脂质组成：d-Lin-MC3-DMA，DSPC，胆固醇和PEG-脂质，摩尔比为50:10:38.5:1.5。HEK293T细胞对E蛋白表达阳性率为52%。疫苗采用三剂计划（图3c）。E80-mRNA在小鼠中诱导了高水平的中和抗体滴度，平均PRNT50为13,000。E80-mRNA在接种疫苗的免疫能力小鼠中对DENV-2挑战提供了无菌免疫，并在感染DENV-1、DENV-3和DENV-4的K562细胞中引发了降低的ADE活性。 图3. E80-mRNA和DSV4疫苗的开发。(a) E80-mRNA的开发。RNA序列包含一个Cap1 (N7mGpppAm)序列，随后是一个人IgE的信号肽序列，然后是E80蛋白，一个3' UTR和一个3' polyA尾。(b) 修饰RNA包装成LNP的表示。LNP由四种脂质组成，d-Lin-MC3-DMA，DSPC，胆固醇和PEG-脂质。(c) E80-mRNA的接种方案。疫苗采用三剂方案，第一剂在第0天给药，第二剂在第14天，最后一剂在第28天。(d) DSV4疫苗的开发。DSV4是使用每种血清型DENV EDIII的框内融合和乙型肝炎表面（s）抗原设计，与未融合的S抗原共表达形成镶嵌病毒样颗粒(VLPs) (e) DSV4的接种方案。疫苗采用三剂方案，第一剂在第0天给药，第二剂在第30天，第三剂在第90天。 DENV疫苗开发的挑战 开发有效的登革热疫苗取决于疫苗能够针对所有四种抗原不同的DENV血清型有效，同时引发对所有四种血清型的同等水平保护。疫苗无法引发对所有四种血清型的同等水平中和抗体可能导致ADE的诱导。因此，ADE在开发成功的DENV疫苗方面提出了挑战。已有报告称特定范围的DENV抗体滴度与严重登革热疾病的风险相关，但主要风险因素是人类以前感染过异源性DENV血清型。 目前用于研究登革热的动物模型包括非人灵长类动物（NHP）、免疫缺陷小鼠和人源化小鼠。在这些动物模型中，AG129免疫缺陷小鼠是最常用的，它们具有一定的抗病毒免疫能力，但先天免疫反应受到抑制，常用于研究体内病原机制和对DENV挑战的反应。AG129小鼠的一个主要挑战是它们缺乏干扰素（IFN）α/β和γ受体以及抗病毒免疫反应。由于无法发展出完整的免疫反应，AG129小鼠不是验证登革热疫苗效力和疫苗诱导的保护的合适模型，尽管它们在确定疫苗诱导的病毒血症水平方面非常有用。因此，缺乏一种能够重现对登革热病毒免疫反应的经济实惠的动物。 关于登革热疫苗接种期间如何引发抗体反应的关键问题仍然没有答案。除了T细胞反应外，细胞介导免疫（CMI）研究一直是登革热疫苗领域的讨论焦点。在2008年由世界卫生组织（WHO）牵头的咨询会议上，建议进行CMI的探索性研究。然而，对所有登革热疫苗实施单一通用标准以量化保护相关性是具有挑战性的。登革热疫苗之间的根本差异导致了为DENV感染定义适当的保护相关性的困难。例如，灭活疫苗可能与活疫苗相比引发根本不同的抗体反应，即使在两种不同疫苗的个体中实现了相同的中和抗体（nAb）滴度，这两种疫苗的保护功能和抗体反应的质量在体内可能不同。另一个关键区别是，一些DENV疫苗缺乏DENV非结构基因或衣壳蛋白。这一点至关重要，因为CD8+ T细胞主要针对非结构（NS）蛋白。不含DENV NS蛋白的减毒活疫苗在T细胞反应的质量和性质上有所不同。值得注意的是，包含所有DENV蛋白的减毒活疫苗已被证明能引发与自然感染诱导的反应类似的CD8+ T细胞反应。此外，CD4+ T细胞能够发挥细胞毒性功能，这可能在预防严重疾病中发挥关键作用。 最终评论 近几十年来，登革热对全球健康造成的负担急剧增加。对安全有效的登革热疫苗的需求从未如此迫切。在这一期“10Q in virology”特别问题中，我们对登革热疫苗开发的最新技术进行了全面审查，并强调了登革热领域仍然没有答案的最重要问题：每种血清型对DENV感染的严重性和疫苗效力的贡献是什么？理想的疫苗应该提供针对所有四种血清型的长期保护，在所有群体中有效，并能够安全地给无论血清状态如何的个体接种。 根据临床试验的现有数据，NIAID LATV TV003/TV005疫苗是开发中最有希望的疫苗。它在接种者中提供了强大的中和抗体水平，对所有四种血清型进行了血清转化，并且以单剂量给药，使其在发展中国家进行管理具有功能性。鉴于没有单一或通用的保护相关性来评估DENV疫苗的效力，使用挑战模型在评估疫苗效力时变得至关重要，我们建议使用挑战模型成为评估DENV疫苗保护相关性的标准。除了使用挑战模型外，NIAID LATV TV003/TV005还研究了每种单独疫苗成分在血清型背景下的免疫原性。 我们团队目前的研究正在评估每种疫苗血清型在先天免疫原性背景下的贡献。我们团队的成员能够确定定义对挑战病毒反应的先天免疫特征。先天免疫反应介导T细胞和B细胞记忆以及因此保护性免疫反应的质量和数量。DENV因其对抗先天免疫反应的能力而被广泛描述。有趣的是，先天免疫反应在DENV疫苗设计中历来被低估。在先天免疫的背景下，树突状细胞（DCs）在感应病毒病原体和通过刺激T淋巴细胞激活适应性免疫反应中起着关键作用。众所周知，在DENV感染期间，DCs成为感染的主要靶细胞。DENV的非结构（NS）蛋白已被描述为它们通过针对I型干扰素反应的机制（如cGAS-STING途径的拮抗作用等）来对抗人类细胞中的先天免疫反应。鉴于先天免疫反应的诱导对于适应性免疫的诱导是必要的，因此在疫苗设计中应考虑调节先天免疫反应的DENV NS蛋白的作用。除了DENV NS蛋白针对先天免疫系统外，DENV NS蛋白还包含针对CD8+和CD4+ T细胞的关键表位。CD4+ T细胞主要针对衣壳和E蛋白，而CD8+ T细胞主要针对NS3和衣壳。结构和非结构蛋白都诱导T细胞介导的免疫反应，因为T细胞表位分布在结构和非结构蛋白中。已经描述，在DENV疫苗接种期间，最初接种后引发高水平先天免疫细胞因子IP-10的个体在DENV挑战模型中对随后的DENV感染显示出更高水平的保护。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：全球范围内，季节性流感病毒的感染每年导致300万至500万例严重疾病和29万至65万例呼吸道死亡。自20世纪30年代发现流感病毒可以在受精卵中培养以来，已经开发了各种流感疫苗，包括灭活裂解型和亚单位型、重组和减毒活疫苗。然而，这些疫苗提供的保护率相当低，特别是在非常年幼的儿童和老年人中。在这篇综述中，我们描述了流感疫苗开发的历史、疫苗诱导的免疫反应以及应用的佐剂。此外，我们提出了提高所有年龄组流感疫苗有效性的未来发展方向。这包括开发一种基于对免疫系统的理解，诱导平衡的辅助性T细胞1型和2型免疫反应的流感疫苗，以及开发一种广谱流感疫苗，即使在流感病毒特有的抗原漂移和变化的情况下也能提高效果。如果能够实现安全有效的佐剂的开发，可以预见一个更光明的未来。 1.引言 流感病毒属于正黏液病毒科，其基因组由负义RNA片段组成。它们被分为A、B、C和D型，后者于2011年4月从表现出流感样症状的猪中分离出来。在人类中，主要是A型和B型引起疾病，A型比B型引起的疾病更为严重。流感A病毒根据其表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性进一步分类，共有18种HA和11种NA血清型。自20世纪70年代以来，流感B病毒仅分化为两个抗原上可区分的谱系，即山形和维多利亚谱系。目前流行的人类流感病毒主要是A/H1N1和A/H3N2以及B/山形和B/维多利亚谱系。每年，季节性流感在全球造成300万至500万例严重疾病和29万至65万例呼吸道死亡。死亡率和严重病例在65岁以上的老年人和5岁以下的儿童以及免疫抑制人群中更高。用于治疗流感的抗病毒药物包括奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦和巴洛沙韦。然而，疫苗接种被认为是控制流感最有效的方法。通过持续的抗原漂移，即表面抗原的点突变积累，流感病毒可以逃避免疫，这就是为什么每年都需要接种疫苗的原因。自20世纪40年代以来，季节性流感疫苗一直在稳步发展，目前市场上的预防性疫苗在类型（全病毒、裂解、重组和亚单位灭活，以及减毒活疫苗）和生产所用的基质（受精卵或细胞）上有所不同。 美国疾病控制和预防中心的一项疫苗有效性研究表明，尽管与流行株抗原匹配，但它们的保护率仍然很低（40%-60%）。令人关注的是，疫苗在非常年幼的儿童（6-35个月）和老年人（>65岁）中不有效地引发免疫反应，这两个年龄组更容易感染流感病毒，并且死亡率更高。因此，迫切需要为所有年龄段提供有效的流感疫苗。 2.流感疫苗的开发历史和疫苗诱导的免疫反应 2.1.流感疫苗开发的历史 流感病毒的培养方法在20世纪30年代得到发展。1933年，通过将从患者喉洗液中获得的标本通过鼻内滴入的方式，将人类流感病毒传播给雪貂。1935年，威尔逊·史密斯提出了一种在受精卵的卵黄囊膜中培养流感病毒的方法。这种方法产生的病毒浓度比以前基于从感染动物的肺部提取病毒的方法要高得多。受精卵至今仍用于生产流感疫苗。此外，自20世纪30年代中期以来，已经开发了使用细胞和培养基的培养方法。随着能够分离和培养流感病毒，流感疫苗的研究开始了。从20世纪30年代中期到40年代初，通过监测抗体产生，研究了从受精卵的羊水或感染动物器官提取物中获得的活化和甲醛灭活的流感病毒在动物和人类中的疫苗效果。发现疫苗与流行株之间的抗原匹配对于保证疫苗效力很重要，而且无论是灭活还是未灭活的病毒，浓缩疫苗比未浓缩疫苗更有效。1942年，在临床研究中评估了由受精卵生产的由PR8型流感A型和Lee型流感B型组成的灭活全病毒双价流感疫苗诱导的免疫反应。1943年，美国武装部队流感委员会进行的更大规模的临床研究表明，包括A型亚型PR8和Weiss株以及B型Lee株的灭活全病毒三价疫苗对流感有保护作用。通过临床试验确定了疫苗剂量，1945年，第一种灭活流感疫苗（IIV）在美国获得许可。 自20世纪40年代在受精鸡卵中开发第一种灭活全病毒疫苗以来，IIV的生产方法不断改进，20世纪50年代，使用受精卵的当前IIV生产过程得以发展。IIV包括全病毒疫苗、通过洗涤剂裂解的病毒和进一步纯化的亚单位疫苗，由表面抗原HA和NA组成。全病毒疫苗，第一种开发的IIV，即使在未预先免疫的个体中也能诱导良好的免疫反应。然而，人们对热原性和不良反应感到担忧。为了克服这些问题，20世纪60年代，通过用乙醚或洗涤剂处理病毒，开发了裂解病毒疫苗，使它们对儿童安全。20世纪70年代，主要基于HA和NA的纯化亚单位流感疫苗得到了发展，进一步提高了安全性并减少了反应原性。 自20世纪30年代以来，通过在雪貂和小鼠或受精卵中连续传代制备的减毒活流感疫苗（LAIV）也得到了研究。这些宿主范围变异疫苗可以保护人类免受流感侵害，而不会引起流感症状。然而，它们有一些缺点，包括低病毒滴度和在保持恒定的减毒和抗原性水平方面的困难。20世纪60年代，采用了一种新的方法，通过在受精卵中连续低温传代来减毒流感病毒，产生了冷适应的、温度敏感的变异株。由于冷适应的温度敏感流感病毒在较低温度下复制得最好，病毒复制在鼻腔而不是在呼吸道进行。这些病毒比以前的减毒方法更安全，并能诱导免疫反应。因此，它们作为LAIV的供体病毒得到了进一步发展。 作为RNA病毒，流感病毒缺乏校对活性，因此遗传上不稳定；因此，抗原突变发生的频率很高。为了提高流感疫苗的保护率，准确预测将流行的流感病毒并生产含有这些毒株的疫苗是很重要的。为此，世界卫生组织（WHO）的全球流感监测和应对系统自1952年以来一直在进行全球流感监测，基于监测结果，WHO每年都会宣布北半球（2月）和南半球（9月）的推荐流感病毒疫苗成分。 最初，世界卫生组织推荐了三种流感病毒株，包括A/H1N1、A/H3N2以及B/维多利亚或B/山形谱系中的任一种，用于三价疫苗；然而，由于两个B谱系的共同循环频率很高，现在建议在四价流感疫苗中同时包含B/维多利亚和B/山形谱系。然而，由于灭活疫苗和减毒活疫苗是使用推荐的候选病毒生产的，如果预测不准确，它们将因抗原不匹配而无效。因此，正在积极研究广谱或通用流感疫苗。这些疫苗类型针对流感病毒的保守区域，如HA的茎部、M2e、M1或核蛋白，而不是免疫显性的、可变的和特定于毒株的HA球形头部（图1）。这些疫苗是通过使用病毒载体、DNA载体、类病毒颗粒（VLP）、纳米颗粒或直接刺激T细胞的肽制备的。其中，纳米颗粒和VLP平台在完成2020年的III期临床试验（NCT04120194、NCT03301051和NCT03739112）时显示出最明显的效果。纳米颗粒（Novavax）和VLP流感疫苗（Medicago）均显示出诱导交叉反应抗体和T细胞反应的结果。 图1 广谱或通用流感疫苗的靶标。广谱或通用流感疫苗针对能够引发广泛交叉免疫反应的抗原。由HA茎部和M2离子通道（M2e）的外域诱导的抗体，这些是高度保守的区域，可以介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。针对HA茎部的抗体具有中和作用；而针对M2e的抗体则没有。M1和NP蛋白拥有保守区域，并且是内部蛋白。因此，它们主要诱导细胞毒性T细胞反应。 2.2.流感疫苗生产的基质 尽管使用受精卵的传统方法仍然在全球范围内主要使用，但它有显著的缺点。基于鸡蛋的疫苗可能会引起对白蛋白的过敏反应，当对受精卵的需求突然增加时，例如在大流行期间，供应可能不足，妨碍及时生产疫苗。最重要的是，特别是在H3N2的情况下，连续在受精卵中传代病毒可能导致抗原位点的鸡蛋适应性突变，从而导致抗原性改变，从而降低疫苗的有效性。为了克服这些缺点，开发了基于细胞培养的疫苗生产技术。使用的细胞系包括Solvay和Seqirus（前身为Novartis）的Madin-Darby犬肾（MDCK）、Sanofi Pasteur（前身为Crucell）的PER.C6、Baxter的Vero以及Protein Science（重组HA）和Novavax（VLP疫苗）的Sf9昆虫细胞与杆状病毒载体相结合。因此，流感疫苗的开发正逐渐从传统的基于鸡蛋的平台转向细胞培养（图2），尽管需要努力提高后者的产量并降低生产成本。 图2 流感疫苗基质从受精卵到细胞的演变。在20世纪30年代，开发了在受精卵中培养流感病毒的方法，直到20世纪50年代，使用受精卵制造流感疫苗的方法不断得到发展。自从20世纪50年代末建立了MDCK细胞系以来，揭示了流感病毒可以在各种细胞如MDCK和Vero细胞中培养的事实，并且逐渐地，制造流感疫苗的基质开始从受精卵转向细胞。MDCK，即Madin-Darby犬肾细胞系。 2.3.FDA批准的流感疫苗及其触发的免疫反应 疫苗触发的免疫反应根据接种物是灭活抗原还是活病毒而有所不同。在灭活病毒疫苗的情况下，通过吞噬作用被抗原呈递细胞（APCs），如树突细胞，吞噬的灭活细胞外抗原。然后在APCs的溶酶体中将抗原降解为肽段，肽段通过主要组织相容性复合体（MHC）II分子呈现在APCs表面。MHC II-抗原复合物被T辅助（Th）细胞识别，也称为CD4+ T细胞，这导致未激活的Th细胞激活。激活的Th细胞进一步分化为T辅助1（Th1）细胞、Th2细胞、Th17细胞、滤泡Th（Tfh）细胞、诱导性调节性T细胞（iTregs）等。 在各种CD4+效应T细胞亚群中，Th1、Th2和Th17细胞在防御病原体方面发挥主要作用。Th1细胞诱导细胞介导的免疫反应，分泌IFN-γ和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），激活巨噬细胞和中性粒细胞，通过增加吞噬作用和炎症来消除细胞内病原体。Th2细胞诱导体液免疫反应，主要分泌IL-4、IL-5和IL-13。最后，Th17细胞分泌IL-17和IL-22，这是促炎细胞因子，以及IL-21，从而刺激对细胞外病原体和真菌的免疫反应。 相比之下，活病毒或减毒活病毒疫苗感染细胞并在感染细胞的细胞质中产生病毒蛋白。病毒蛋白被蛋白酶体降解为肽段，肽段与MHC I分子复合物呈现在感染细胞表面。MHC I-抗原复合物被CD8+ T细胞识别，随后在其他信号和Th细胞帮助下分化为细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。树突细胞不易被病毒感染，但通过交叉呈递在激活CD8+ T细胞中发挥重要作用。在这一途径中，被病毒感染的细胞被树突细胞吞噬，导致病毒抗原在树突细胞的细胞质中释放。从蛋白酶体降解到呈递的后续过程与上述MHC I途径相同。当CTLs识别感染细胞上的MHC I-抗原复合物时，它们释放细胞毒素蛋白、穿孔素和颗粒酶，这些蛋白进入感染细胞并诱导凋亡。CTLs还可以通过CTLs上表达的Fas配体与目标细胞上表达的Fas的相互作用来杀死感染细胞。FDA批准了各种类型的流感疫苗（表1），它们引起不同的免疫反应。根据免疫反应诱导机制，流感疫苗大致分为IIVs和LAIVs，IIVs进一步分为全病毒、裂解和亚单位类型。 由于IIVs的活性物质是三个（三价IIVs）或四个（四价IIVs）灭活抗原，接种的抗原主要通过MHC II途径呈现在APCs表面，因此将主要刺激CD4+ T细胞；然而，IIV接种后的免疫反应尚未完全了解。如上所述，CD4+ T细胞可以分化为几种亚型，但IIV主要刺激Th2免疫反应，诱导体液免疫反应而不是细胞免疫反应。IIV诱导的血凝抑制滴度与流感特异性抗体相关，在成人中提供50%的流感感染保护率。然而，IIV不有效地诱导粘膜免疫和细胞免疫，这在呼吸道病毒感染中起着重要作用。与IIV不同，LAIVs通过鼻内途径给药。它们感染上呼吸道的细胞，并通过MHC I途径更有效地处理，从而诱导粘膜免疫和细胞免疫。此外，LAIVs在CD4+ T细胞的情况下很好地激活Th1免疫反应。尽管LAIV可以被认为是流感的理想疫苗类型，因为它诱导平衡的Th1/Th2免疫反应，但它存在安全问题，不能在非常年幼的儿童和免疫受损的个体中给药。此外，由于禽流感病毒在人类上呼吸道的嗜性大于下呼吸道，因此不易开发针对禽流感病毒的LAIVs。 3.流感疫苗佐剂开发的现状 3.1.流感疫苗佐剂的必要性 佐剂是增强疫苗免疫反应的制剂，通过每剂使用较低量的抗原，诱导更高的抗体产生和更持久的保护，从而减少疫苗生产的负担。 与季节性流感病毒不同，引起大流行的流感病毒是新的重配或变体病毒，人类对其没有预先存在的抗体，因此导致更高的死亡率。非佐剂化的H5N1和H7N9大流行流感疫苗诱导的免疫反应较弱，可能是因为大多数人对这些亚型没有预先存在的免疫力，并且大流行疫苗不是每年接种。因此，大流行流感疫苗通常使用佐剂，特别是因为它们可以改善因慢性病、肥胖、HIV感染或移植治疗而免疫功能低下的个体的免疫反应。此外，与未添加佐剂的IIV不同，添加佐剂的IIV可以提供平衡的Th1/Th2免疫反应和粘膜免疫，从而保护免受流感感染。 3.2.批准的流感疫苗佐剂的免疫机制 目前流感疫苗中使用的佐剂包括磷酸铝（AlPO4）凝胶、氢氧化铝（Al[OH]3）、AS03和MF59。最古老和最常用的佐剂是AlPO4和Al(OH)3，通常称为铝佐剂（尽管严格来说，铝佐剂指的是硫酸钾铝钾[KAl[SO4]2]）。含有MF59或AS03的流感疫苗是比铝佐剂更晚开发的油包水乳液佐剂，分别在1997年和2009年获得批准。这些佐剂比铝佐剂在IIVs中更有效。美国FDA批准的三种H5N1大流行流感疫苗中有三种含有AS03或MF59佐剂。第三种疫苗不含佐剂，但含有比含佐剂疫苗多12-24倍的HA（表2）。FDA批准的含MF59的佐剂化季节性流感亚单位疫苗（Seqirus，FluAd®）旨在用于老年人（>65岁），他们的免疫反应比年轻成人差（表2）。 尽管铝佐剂长期以来一直被广泛用作佐剂，但其机制仍然未知。最初，人们认为铝佐剂通过所谓的抗原储存效应，通过缓慢且持续地将抗原暴露给APCs来增强免疫反应。然而，最近的研究表明，铝佐剂还可以招募包括中性粒细胞和单核细胞在内的各种类型的先天免疫细胞到注射部位，从而激活先天免疫反应。有关细胞和分子机制的研究报告称，铝佐剂通过APCs吞噬铝佐剂导致的吞噬体不稳定化，触发NLRP3炎症体的激活，从而分泌促炎细胞因子IL-1β。此外，铝佐剂在注射部位引起坏死，导致损伤相关分子模式的释放，如尿酸和DNA，这些分子激活NLRP3炎症体。铝佐剂可以通过前列腺素E2的产生增强免疫反应，前列腺素E2参与诱导Th2免疫反应，通过ITAM-Syk-PI3Kδ信号传导。这些结果表明，铝佐剂诱导Th2反应而不是Th1反应。 MF59是一种由角鲨烯和两种表面活性剂聚山梨醇酯80（Tween 80）和山梨醇三油酸酯（Span 85）组成的油包水佐剂。自1997年首次在欧洲流感疫苗中应用以来，进行了大量的研究以阐明其免疫增强机制。MF59没有储存效应，这一发现表明，即使在抗原注射前24小时至注射后1小时内注射，它也显示出佐剂效应。相反，MF59在注射部位激活单核细胞、巨噬细胞和粒细胞，导致趋化因子的分泌，随后是免疫细胞的招募，增加抗原摄取，单核细胞分化为未成熟树突细胞，以及增强抗原运输到引流淋巴结。MF59诱导的单核细胞分化为未成熟树突细胞有助于它们迁移到引流淋巴结，在那里它们刺激T细胞和B细胞，从而增强适应性免疫反应，对接种的疫苗抗原产生平衡的Th1/Th2反应。此外，MF59佐剂化的抗原在免疫小鼠的淋巴结的各种细胞上呈现，包括B细胞、单核细胞和中性粒细胞，而铝佐剂化的抗原只在树突细胞上呈现，表明MF59在增强免疫反应方面比铝佐剂更有效。MF59导致注射部位的肌肉细胞释放ATP，并通过MyD88发挥其佐剂功能。在动物模型中，局部施用apyrase水解ATP导致对MF59佐剂化的三价IIV的T细胞反应和血凝抑制滴度降低。因此，ATP在MF59佐剂功能中起着重要作用；然而，确切的信号传导途径需要进一步研究。 AS03是一种由聚山梨醇酯80（Tween 80）和两种可生物降解的油，角鲨烯和α-生育酚组成的油包水佐剂，α-生育酚是维生素E的最可利用形式。饮食中的维生素E补充具有免疫刺激作用。因此，α-生育酚表现出类似佐剂的功能，而MF59组分本身并不具有佐剂效应。在小鼠中进行的研究表明，当抗原与缺乏α-生育酚的AS03一起施用时，免疫反应减弱。与MF59不同，AS03需要与抗原在空间和时间上共定位才能作为佐剂发挥作用。与MF59类似，AS03促进免疫细胞招募到注射部位，以及抗原摄取和运输到引流淋巴结。具体来说，AS03在局部和短暂地增加NF-κB，并增强细胞因子释放和免疫细胞招募。随后，激活的抗原负载的APCs在引流淋巴结中激活CD4+ T细胞，这些细胞直接刺激抗原特异性B细胞。因此，AS03通过诱导大量记忆B细胞和抗体分泌浆细胞来加强免疫反应。 3.3.流感疫苗佐剂的开发现状 佐剂在全球范围内被广泛研究。下面，我们讨论了除铝佐剂、MF59和AS03之外，已经进入临床试验的流感疫苗佐剂的机制和免疫反应，包括TLR配体、细胞因子以及微乳液和纳米乳液。此外，还有一些免疫刺激剂，其作用机制尚不完全清楚。在这些研究中，TLR激动剂和配方是最被研究的（表3）。 TLR通过识别病原体相关分子模式来刺激先天免疫反应。根据其定位，它们被分类为细胞表面TLR和细胞内TLR。细胞表面TLR，包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，主要识别来自微生物膜的成分。细胞内的TLR，定位在内体中，包括TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13，识别自身和非自身核酸。鉴于各种TLR可以识别独特的配体，几种TLR激动剂作为佐剂正在进行临床试验。TLR4激动剂AS01和AS04已获得许可，而其他TLR4激动剂，包括葡萄糖基脂质佐剂、单磷酸脂质（MPLA）和LPS，正在积极研究中。此外，dsRNA、flagellin、imiquimod和CpG分别作为TLR3、TRL5、TLR7和TLR9激动剂正在开发中。 MF59和AS03等乳液颗粒有时与其他物质如皂苷、DNA和MPLA结合。具有不同成分和比例的各种乳液型佐剂正在进行临床试验。其他颗粒类型，如病毒体或VLP，也可能具有佐剂功能。一些作用机制尚不清楚的免疫刺激剂也在研究中。细胞因子在小鼠中刺激Th1免疫反应和B淋巴细胞分化，但在I期临床试验中未显示出佐剂效应。因此，开发一个能够准确预测佐剂效应的非临床系统非常重要。在最近的一项研究中，一种与单链RNA佐剂配制的IIV诱导了对异源流感病毒感染和粘膜免疫反应的交叉保护。其详细机制和安全性方面还有待研究。 4.流感疫苗开发的发展方向 4.1.流感疫苗的现状和相关不良事件 目前市场上的流感疫苗可以用于非常年幼的儿童（≥6个月大），尽管每种产品的推荐接种年龄不同，而且它们大多数是灭活疫苗。它们主要诱导Th2免疫反应，并导致对接种的流感病毒株产生特异性抗体，从而提供免疫保护。然而，过去十年调查的流感疫苗的有效性并不高，平均保护率为42%（范围，19%-60%），并且在幼儿和老年人中通常更低。 为了克服幼儿和老年人的低抗体产生率，疫苗制造商已经将儿童（≥6个月大；Flulaval Trivalent/Quadrivalent, Fluarix Quadrivalent, Fluzone Quadrivalent）的季节性流感疫苗的标准HA抗原含量提高了两倍，老年人（≥65岁；Fluzone High-Dose）提高了四倍，或者使用了佐剂（仅适用于老年人；FLUAD）。这些产品已获得FDA许可，并且已经证明了改进的效力或有效性。然而，增加抗原生产的需要可能会给制造商带来负担，特别是在大流行等紧急情况下。 或者，如前所述，可以通过接种LAIV而不是IIV来增强对流感疫苗的免疫反应，或者采用新策略，例如使用皮内途径而不是注射（Sanofi Pasteur的Fluzone® Intradermal流感疫苗），因为皮肤富含APCs。尽管是相同的IIV，皮内途径与肌肉注射途径相比，使用更少的HA抗原（每株9微克）诱导了非劣的保护性免疫反应。然而，使用这些方法的FDA许可产品也尚未适用于幼儿或老年人。LAIV FluMist适用于2-49岁的人群，而Fluzone intradermal是皮内注射的，适用于18-64岁的人群。 与流感疫苗相关的不良事件从轻微症状，如注射部位的红斑、头痛、发烧、恶心和肌肉痛，到不寻常的事件，如严重过敏反应、格林-巴利综合征和眼呼吸道综合征。大多数与流感疫苗相关的不良事件都是轻微的，容易恢复。然而，针对2009年H1N1流感大流行的Pandemrix疫苗被认为与嗜睡症有关，这种由Pandemrix引起的嗜睡症与自身免疫疾病有关，但机制仍然未知。 4.2.流感疫苗开发的发展方向 对于流感疫苗，血清保护、血清转换和几何平均滴度比是考虑作为商业产品获得批准的标准。在评估疫苗的有效性时，重点是Th2免疫反应，而不是Th1免疫反应。然而，Th1和粘膜免疫反应在防御呼吸道病毒（如流感病毒）方面也起着重要作用。因此，一种在所有年龄组，包括婴儿和老年人中诱导平衡的Th1/Th2免疫反应的流感疫苗，包括细胞介导和抗体反应以及涉及分泌型IgA的粘膜免疫反应，可以显著降低流感的死亡率和发病率。 如前所述，已经尝试使用各种平台（包括病毒载体、DNA载体、VLP或肽疫苗）来提高流感疫苗的效力，这些平台预计将克服当前流感疫苗的局限性，例如通过诱导更强的Th1反应和记忆反应。此外，考虑到流感疫苗株的抗原性几乎每年都会变化，并且由于抗原转移和漂移，各种流感亚型都可能引起爆发，因此正在积极研究通用流感疫苗。一种候选疫苗，包含来自流感A和B的九个保守表位的重组蛋白M-001，目前正在进行III期临床试验，预计将在2020年12月完成。基于mRNA的疫苗在SARS-CoV-2大流行期间证明了它们的潜力；因此，它们也值得考虑用于流感大流行。基于mRNA的流感病毒疫苗在小鼠中显示出保护效果，在人类临床试验中显示出免疫原性反应和安全性，并通过诱导流感病毒HA茎部特异性抗体产生交叉保护效果。AS03和MF59等佐剂已经应用于流感疫苗。然而，由于流感疫苗每年接种，因此应该大力开发新的佐剂，这些佐剂具有良好的安全性，适用于重复接种和效力，如基于RNA的佐剂。这些佐剂容易降解，如TLR3或TLR7/8配体，并且与其他在体内长时间停留的佐剂相比相对安全。 5.结论 流感疫苗相当复杂。它们根据疫苗类型（如IIV与LAIV）、接种年龄以及诱导免疫反应的机制不同而诱导不同的免疫反应，这些机制尚未完全阐明。大多数许可的疫苗主要诱导Th2型免疫反应，在幼儿和老年人中诱导的免疫反应比成人弱。因此，需要努力开发能够诱导更强大和更平衡的Th1/Th2免疫反应的流感疫苗，这基于我们对随年龄变化的免疫系统的理解。 目前对流感疫苗的批准标准，侧重于Th2反应，将需要相应修改，以包括确认T细胞介导的保护。通过使用佐剂也可以实现更好的免疫反应，因此，应该开发更安全、更有效的佐剂。最后，用于预测疫苗和佐剂免疫反应的有效和可靠的工具将极大地有助于提高对流感病毒感染的保护率，不仅在成人中，而且在幼儿和老年人中也是如此。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。